KR20110093442A

KR20110093442A - 항균 활성을 갖는 신규한 환형 펩타이드계 화합물 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20110093442A
Application number: KR1020100013495A
Authority: KR
Inventors: 안종석; 김보연; 장재혁; 오현철; 손재학
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2010-02-12
Filing date: 2010-02-12
Publication date: 2011-08-18
Also published as: KR101268170B1

Abstract

본 발명은 해양 퇴적물에서 분리한 곰팡이 알터나리아 속 (Alternaria sp.) SF-5016으로부터 분리 정제한 환형 뎁시펩타이드계 화합물 및 이를 유효성분으로 하는 항균 조성물에 관한 것이다. 상기 신규한 환형 펩타이드계 화합물은 고초균 또는 황색포도상구균에 대하여 항균활성을 갖는다.

Description

항균 활성을 갖는 신규한 환형 펩타이드계 화합물 및 이의 용도{Novel cyclic peptide-based compound having anitmicrobial activity and uses thereof}

본 발명은 해양에서 분리한 곰팡이 유래의 항균 활성 펩타이드계 화합물, 상기 화합물을 유효성분으로 포함하는 항균용 약학 조성물 또는 화장료 조성물, 상기 화합물의 분리 방법 및 상기 화합물을 생산하는 알터나리아 속 (Alternaria sp.) SF-5016 균주에 관한 것이다.

항생제의 고전적 의미는 미생물에 의해 생산되는 2차 대사 산물로서, 매우 낮은 농도에서 미생물을 죽이거나 성장을 저해하는 물질을 말한다. 항생제라는 용어는 1940년대 왁스만(Waksman)에 의해 처음 사용되기 시작한 것으로, 초기에는 당시에 주로 사용되던 합성물질 설폰아미드류(sulfonamide)와 페니실린 곰팡이(Penicillium sp.)에 의해 생산되는 페니실린(Penicillin)을 구별하기 위해 사용되었다. 그 후 항균활성 (antimicrobial activity)을 나타내는 많은 물질들이 발견되고 합성됨에 따라 항생제의 의미를 일의적으로 정의하는 것이 어려워지고 있는데, 현재는 일반적으로 항생제가 낮은 농도에서 효과적으로 항생활성을 갖는 천연, 반합성 또는 합성의 화합물을 의미하는 것으로 받아들여지고 있다.

천연물의 탐색과 이용에 관한 연구는 바로 유기체의 생합성 능력을 탐색하고 이용하는 것으로서, 지금까지 주로 식물과 미생물이 그 대상의 주종을 이루어 왔다. 특히 미생물은 종의 다양성과 함께 독특하고 흥미로운 생리활성 물질을 생산하는 예가 많고 세대기간이 짧으며 대량생산이 용이하고 산업적 이용 가능성이 높아서 매력있는 생리활성물질의 탐색원이 되어왔다.

미생물이 생산하는 유용물질탐색은 주로 육상미생물을 중심으로 활발하게 진행되어 그 중에는 발효공업과 의약 등에서 유용성이 확립된 것도 많이 존재한다. 이제까지 실질적으로 의약분야에 응용되어 온 화합물은 육상으로부터 분리된 미생물에 의해 생산된 것으로, 많은 연구가 진행됨과 함께 신규화합물이 얻어질 확률이 현저히 저하되고 있는 실정이다.

한편, 해양은 육상보다 방대한 면적으로써 풍부한 생태학적 변화에 의해 육상의 몇 배의 미생물이 미지의 상태로 생육하고 있다고 보여진다. 따라서 이들 해양미생물은 생물학적 성상 및 대사경로도 육상미생물과 달라 새로운 화합물을 생산할 가능성이 시사되었다. 최근, 분리 및 배양이 곤란하다는 이유로 연구가 뒤처져 있던 해양미생물이 새로운 미생물자원으로써 주목을 받게 됨에 따라 해양미생물의 배양물을 이용한 탐색에 의해 이제까지 없던 새로운 의약 리드 화합물의 발견이 기대되고 있다. 더욱이, 의약 이외에도 화장품소재, 건강식품 등에의 이용도 금후 늘어날 전망으로 보고 있다.

해양미생물의 항생물질 생산능에 대해서는 1947년에 첫 보고가 된 바 있으나, 실질적인 화합물의 분리 보고는 1966년의 보고가 처음이기도 하다(Fenical, W. Chem . Rev., 93, 1753 (1993)). 해양세균에 관한 연구는 1990년대 전반부터, 해양진균의 경우는 1994년부터 성황을 이루어, 그후로 지속적인 성과가 도출되고 있다. 이에 해양미생물자원은 새로운 생리활성물질 탐색에 있어서 새로운 제공원으로써 중요성은 크다고 볼 수 있다. 현재의 기술로서는 배양가능한 해양미생물은 약 1% 이하라고 알려져 있으며 연구자에 따라 0.1%도 되지 않는다는 의견이 있다. 특히, 공생계의 미생물에 있어서는 배양가능한 미생물은 극히 제한되어 있는 실정이다. 해양미생물 중 배양 가능한 균의 생합성유전자의 이용이라는 연구분야가 진행되어 있지만, 배지나 배양조건 등의 배양기술 개발을 통하여 난배양미생물의 자원화 또한 중요한 연구 분야의 하나이기도 하다. 이러한 해양미생물로부터 분리된 신규화합물 중에는 생리활성이 밝혀지지 않은 화합물들이 반수에 가깝고, 이는 생리활성검정법의 범위가 한정되어 있다는 것이 가장 큰 이유로 들 수 있다. 또한 화합물을 분리하기 위해 설정한 생물활성과는 다른 특이한 활성이 분리 후에 밝혀지는 경우도 늘고 있는 실정이다. 이에 생리활성이 보고되어 있지 않은 화합물 중에도 독특한 구조를 가진 화합물이 존재하기에 폭넓은 약리활성 검토가 반드시 필요하다고 사료된다.

또한, 최근 기존의 항생제에 내성을 보여 약효가 듣지 않는 항생제 내성세균이 출현하고 있으며, 후천성 면역 결핍증(AIDS)과 같은 새로운 질병이 증가하면서, 기존 항생제를 대체할 수 있는 새로운 약제의 개발이 시급히 요구되고 있다. 기존에 개발된 항생제로는 베타-락탐계 항생제(beta-lactam class of antibiotics)로 분류되는 것으로, 페니실린보다 효과가 탁월한 것으로 인정되는 메티실린(methicillin) 또는 상기 메티실린에 대해 내성을 갖게 된 세균, 구체적으로 메티실린 내성 황색 포도상구균(methicilline resistance staphyllococus aureus, MRSA)에 대한 항균효과를 갖는 것으로 개발된 반코마이신(vancomycin) 등이 있다. 그러나, 최근에는 슈퍼박테리아라고 불리우는 반코마이신 내성 황색 포도상구균(vancomycin resistance staphyllococus aureus, VRSA) 등 기존 항생물질에 대한 내성균이 증가하면서, 기존에 보고된 항생제에 대한 내성을 갖는 물질 또는 약제의 개발 필요성이 더욱 강조되고 있는 실정이다.

이에 따라 최근에는 기존 항생제를 대체할 수 있는 새로운 작용 메카니즘을 가진 약제의 개발에 관심이 집중되고 있다. 따라서 새로운 활성물질의 개발을 위해서는 표적 특이적인 탐색방법 및 새로운 자원의 확보가 요구되고 있다.

이에 본 발명자들은 항균활성이 우수한 물질에 대해 해양미생물의 대사산물로부터 탐색하던 중, 해양 퇴적물로부터 항균활성이 우수한 물질을 생산하는 곰팡이 균주를 선별하였고, 이로부터 새로운 구조의 환형 펩타이드계 화합물을 순수하게 분리, 정제하였으며, 상기 환형 펩타이드계 화합물이 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 및 고초균 (Bacillus subtilis)과 같은 그람양성세균에 대하여 항균활성을 나타냄을 확인하고 본 발명을 완성하였다. 따라서 본 발명의 목적은 신규한 구조의 환형 펩타이드계 화합물을 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 화학식 1로 표시되는 해양에서 분리한 곰팡이 유래의 항균 활성 펩타이드계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 화합물을 유효성분으로 포함하는 항균용 약학 조성물 또는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 화합물의 분리 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 화합물을 생산하는 알터나리아 속 (Alternaria sp.) SF-5016 균주를 제공한다.

상기와 같이 본 발명의 환형 펩타이드계 화합물인 신규 알터나라미드 화합물을 유효성분으로 함유하는 조성물은 그람양성세균에 대한 저해활성을 나타내어 세균 감염성 질병의 치료를 위한 항균 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 본 발명에서 분리한 알터나라미드 화합물의 ¹H NMR 스펙트럼 (400MHz,CDCl₃)을 보여준다.
도 2는 본 발명에서 분리한 알터나라미드 화합물의 ¹³C NMR 스펙트럼(100MHz,CDCl₃)을 보여준다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 신규한 환형 펩타이드계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다:

본 발명의 신규한 환형 뎁시펩타이드계 화합물은 해양 유래 곰팡이, 바람직하게는 알터나리아 속 (Alternaria sp.), 더욱 바람직하게는 알터나리아 속 (Alternaria sp.) SF-5016 균주로부터 분리한 화합물로서 기존에 알려지지 않은 화학구조를 가지는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 환형 뎁시펩타이드계 화합물은 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 사용될 수 있으며, 통상의 방법에 의해 제조되는 모든 염, 수화물, 용매화물 및 이성질체를 포함한다.

본 발명은 또한, 상기 환형 펩타이드계 화합물을 유효성분으로 포함하는 항균용 약학 조성물을 제공한다. 본 발명의 신규한 환형 뎁시펩타이드계 화합물을 함유하는 항균성 약학 조성물은 세포독성을 가지지 않으면서 그람양성세균에 대해 항균활성을 보였다. 상기 그람 양성세균은 바람직하게는 바실러스 속(Bacillus sp.) 또는 스타필로코커스 속(Staphylococcus sp.) 세균일 수 있다. 또한, 상기 바실러스 속(Bacillus sp.) 또는 스타필로코커스 속(Staphylococcus sp.) 세균은 바람직하게는 각각 고초균 (Bacillus subtilis) 또는 황색포도상구균 (Staphylococcus aureus)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 화합물은 일반적으로, 본 발명의 활성 화합물을 포함하고 약학적 조제물에서 사용하기에 적합한, 약학적으로 허용가능한 담체 또는 운반체를 포함하는 약학 조성물의 형태로 투여된다.

일반적으로, 본 발명의 화합물은 약학적으로 유효한 양으로 투여된다. 실제로 투여되는 본 화합물의 양은, 대개는, 대상 질환, 선택된 투여 경로, 실제 투여되는 화합물, 나이, 체중 및 개별 환자의 반응, 증상의 심함 정도 등을 포함한 관련된 정황들을 고려하여 의사에 의해 결정될 것이다. 투여량은 1일 1회 또는 수회 투여로 10mg에서 500mg까지 이다.

본 발명의 약학 조성물은 구강, 직장, 경피, 피하, 정맥, 근육 내 및 비강을 포함한 다양한 경로로 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 의도한 전달 경로에 따라 주사용 또는 경구용 조성물 중 하나로 조제되는 것이 바람직하다.

경구 투여용 조성물은 원액 유동성 희석액(bulk liquid dilutions) 또는 현탁액, 또는 원액 분말(bulk powders)의 형태를 취할 수 있다. 그러나, 좀 더 일반적으로는, 정확한 투약을 용이하게 하기 위해 단위 투여량 형태로 제공된다. "단위 투여량 형태(unit dosage forms)"라는 용어는 환자 및 다른 포유동물에 투여할 한번의 투여량으로 적합한, 완전히 분리된 단위를 지칭하는데, 각 단위에는 원하는 치료적 효과를 내도록 계산되어 미리 결정된 양의 활성 물질이 적절한 약학적 부형제와 결합된 형태로 들어 있다. 일반적인 단위 투여량 형태는 액상 조성물이 미리 채워지고 측정되어 있는 앰풀(ampule) 또는 주사기, 또는 고체 조성물의 경우 환약(pill), 정제(tablet), 캡슐 등의 형태를 포함한다.

경구 투여에 적합한 액상 형태에는 완충액, 현탁 및 분산제, 착색제, 향신료 등과 함께 적절한 수액성 또는 비수액성 운반체가 포함될 수 있다. 고형의 조제물에는, 예를 들면 다음의 성분들 또는 그와 유사한 성상의 화합물이 포함될 수 있다: 미세결정셀룰로오스(microcrystalline cellulose), 트래거캔스 고무(gum tragacanth) 또는 젤라틴 등의 결합제; 전분 또는 유당(lactose) 등의 부형제; 알긴산(alginic acid), 프리모겔(Primogel) 또는 옥수수 전분 등의 분해제(disintegrating agent); 마그네슘 스테아레이트(magnesium stearate) 등의 윤활제; 교질성 이산화규소(colloidal silicon dioxide) 등의 활택제(glidant); 자당(sucrose) 또는 사카린(saccharin) 등의 감미제; 또는, 박하, 살리실산메틸(메틸 salicylate) 또는 오렌지 향(orange flavoring) 등의 향신제.

주사용 조성물은 일반적으로 주사용 멸균 식염수나 PBS(phosphate-buffered saline) 또는 기타 당업계에 알려진 주사용 담체에 기초한다. 상기에서와 같이, 이런 조성물 내의 본 화합물은 일반적으로 소수 성분이며 보통 주사용 담체 등의 잔여물을 합친 중량의 약 0.05 내지 10%를 차지한다.

경구 투여용 또는 주사용 조성물에 대한 상기 성분들은 단지 대표적인 것들일 뿐이다. 기타의 물질 및 처리 방법 등은 레밍턴즈 파마슈티칼 사이언스(Remington's Pharmaceutical Sciences)에 개시되어 있다(참조: Part 8 of Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th edition, 1985, Mack Publishing Company, Easton, Pa.).

본 발명의 화합물은 또한 서방형(sustained release form) 또는 서방성 약물전달시스템(sustained release drug delivery system)으로 투여될 수 있다. 대표적인 서방형 물질은 레밍턴즈 파마슈티칼 사이언스의 첨가 물질란에 개시되어 있다.

본 발명은 또한, 상기 화학식 1의 화합물을 포함하는 화장료 조성물을 제공한다. 본 발명의 화장료 조성물은 상기 화학식 1의 화합물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명은 또한,

1) 알터나리아 속 (Alternaria sp.) SF-5016 균주를 배양하는 단계,

2) 상기 1) 단계에서 얻어진 균주 배양물을 에틸아세테이트로 추출하는 단계, 및

3) 상기 2) 단계에서 얻어진 에틸아세테이트 추출물을 컬럼 크로마토그래피로 분리하는 단계를 포함하는, 본 발명의 환형 펩타이드계 화합물의 분리 방법을 제공한다.

상기 1) 단계는 곰팡이 알터나리아 속 (Alternaria sp.) SF-5016 균주를 배양하는 단계로서, 균주 배양은 통상의 미생물이 사용할 수 있는 영양원을 함유하는 배지에서 배양한다. 영양원으로는 종래 곰팡이의 배양에 이용되고 있는 공지의 영양원을 사용한다. 예를 들어, 탄소원으로는 글루코오스, 물엿, 덱스트린, 전분, 당밀, 동물유, 식물유 등을 사용할 수 있으며, 질소원으로는 밀기울, 대두박, 소맥, 맥아, 면실박, 어박, 콘스팁리커, 육즙, 효모 추출물, 황산암모늄, 질산소다, 요소 등을 사용할 수 있다. 필요에 따라, 식염, 칼륨, 마그네슘, 코발트, 염소, 인산, 황산 및 기타 이온생성을 촉진하는 무기염류를 첨가하면 매우 효과적이다. 배양방법으로는 호기적 조건에서는 진탕 배양 혹은 정치배양이 가능하다.

배양온도는 상기의 각 조건들에서 배양할 경우 조건에 따라 약간씩 상이하기는 하나, 보통 20~37℃에서 배양하는 것이 적당하며, 대부분의 경우에는 25~30℃에서 배양한다.

상기 2) 단계는 상기 1) 단계에서 얻어진 균주 배양물을 에틸아세테이트로 추출하는 단계로, 환형 뎁시펩타이드계 화합물은 균주의 배양액뿐만 아니라 균사체 부분에도 존재한다. 따라서, 균주의 배양액 및 균사체에 에틸아세테이트 등의 유기용매를 가하여 배양액 및 균사체로부터 유효성분을 추출한 후 수득된 추출액을 감압증발 방법으로 농축한다.

상기 3) 단계는 본 발명의 화합물을 분리하는 단계로, 상기 2) 단계에서 얻은 에틸아세테이트 농축액을 메탄올:물 혼합용매를 이용하여 플래쉬 컬럼 크로마토그래피를 실시한 후, 고속액체크로마토그래피로 정제하여 화합물 1을 분리한다.

본 발명은 또한, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 생산하는 알터나리아 속 (Alternaria sp.) SF-5016 균주 (수탁번호: KCTC 18187P)를 제공한다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

1. 알터나리아 속 ( Alternaria sp .) SF -5016 균주의 분리

본 균주는 2006년 1월 마산만 인근 해안의 해양퇴적물로부터 분리하였다. 채집한 퇴적물은 채집 즉시 멸균된 플라스틱 백에 넣어, 실험에 사용하기까지 냉동보관하였다. 퇴적물 시료는 멸균된 해수를 이용하여 10배 희석하였다. 희석액 1ml를 포테이토 덱스트로스 아가(potato dextrose agar) 배지에 도말하여 25℃에서 14일간 배양하여 나타난 집락을 순수분리 하였다.

2. 균주의 동정 및 명명

본 균주의 rRNA 서열 분석을 통하여 얻어진 염기서열의 GenBank 검색 결과, 알터나리아 알터네이트(Alternaria alternate)(DQ678082)에 99.51%, 알터나리아 탈릭트리게나(Alternaria thalictrigena)(EU040211)에 99.51%, 알터나리아 말로룸(Alternaria malorum)(AY251081)에 99.14%의 상동성을 보였다. 이에 본 균주를 알터나리아 속으로 동정하였고 이를 알터나리아 속 (Alternaria sp.) SF-5016(수탁번호: KCTC 18187P)로 명명하였다.

3. 알터나리아 속 ( Alternaria sp .) SF -5016 균주의 배양

본 곰팡이 균주를 배양하기 위하여, 통상적으로 미생물이 이용하는 영양원을 함유하는 배지를 준비하였다. 곰팡이 균주의 조배지 및 생산 배지로서 0.4% (w/v) 포테이토 스타치, 2%(w/v) 덱스트로스, 3% (w/v) 염화나트륨, 1.5%(w/v) 아가가 함유된 포테이토 덱스트로스 아가 배지를 사용하였다.

상기 종배지 20ml이 담긴 100ml 용량의 삼각플라스크를 121℃에서 20분간 멸균한 후, 알터나리아 속 (Alternaria sp.) SF-5016 균주의 사면배양 시험관으로부터 백금이 접종하여 4일간 진탕배양하여 종배양으로 하였다. 생산배지 20ml로 만든 평판배지 10개에 각각 종배양액 2ml을 접종하여 25℃에서 14일간 정치배양 하였다.

4. 알터나리아 속 ( Alternaria sp .) SF -5016 균주로부터 환형 펩타이드계 화합물의 분리 및 정제

상기 3에서 배양한 알터나리아 속 (Alternaria sp.) SF-5016 균주의 배양물을 에틸아세테이트(1L)로 추출하고, 수득된 추출액을 감압건조기를 이용하여 감암증발 방법으로 농축하였다. 이 농축액을 오디에스 알피 18에 흡착시켜 오디에스 알피 18 플래쉬 컬럼그로마토그래피(ODS RP-18 flash column chromatography)를 실시하였으며, 이때 메탄올/물(8:2-10/0, v/v)을 혼합용매로 하여 단계적으로 메탄올 농도를 증가시키면서 용출하였다. 이때 화합물 1을 함유한 활성분획은 80% 메탄올과 100% 메탄올에서 용출하였다. 이 두 활성분획을 모아 감압농축한 후, 화합물 1을 함유한 분획을 고속액체크로마토그래피(칼럼: Shiseido Capcell Pak C18, 길이 25mm, 직경 1mm)를 이용하여 용매로 0.1% formic acid를 함유한 아세토나이트릴과 물을 65:35 - 80:20 농도 구배로 용출 유속 2ml/min 조건으로 용출하여 210 nm의 UV 흡수 피크를 35분에서 보이는 화합물 1을 분리하였다.

5. 알터나리아 속 ( Alternaria sp .) SF -5016 균주로부터 환형 펩타이드계 화합물의 구조 분석

상기 곰팡이 Alternaria sp. SF-5016의 배양액으로부터 분리한 화합물 1은 ESI 질량분석기(Electrospray Ionization mass spectrometer)를 사용하여 분자량 및 분자식을 결정하였다. 또한 핵자기공명(NMR) 분석(JEOL JNM ECP-400)을 통하여 ¹H NMR, ¹³C NMR, COSY(Correlation Spectroscopy), HMQC (1H-Detected heteronuclear Multiple-Quantum Coherence), HMBC (Heteronuclear Multiple-Bond Coherence), DEPT(Distortionless Enhancement by Polarization), NOESY (Nuclear Overhauser effect spectroscopy) 스펙트럼을 얻고, 화합물의 분자구조를 결정하였다.

측정 결과는 하기와 같으며, 상기 알터나리아 속 (Alternaria sp.) SF-5016 균주의 배양액으로부터 분리한 물질은, 하기 화학식을 갖는 신규한 환형 뎁시펩타이드 화합물로 동정하였으며 알터나라미드(Alternaramide) (화합물 1)로 명명하였다.

Alternaramide (화합물 1): 흰색 분말; [α]_D -6 (c 0.53, MeOH); UV(MeOH) λ_max (log ε) 208 (4.1); IR (neat) ν _max 3298, 3008, 2930, 1742, 1674, 1634, 1525, 1450, 1236, 750 cm^-1; ¹H, ¹³C NMR 데이타는 하기 표 1에 나타내었음; HRESIMS m/z 589.3024 [M+H]⁺ (calcd for C₃₃H₄₁N₄O₆, 589.3026).

[화학식 1]

실험예 1: 본 발명의 Alternaramide 화합물의 항균활성 측정

한국 유전자은행(KCTC)의 축적 배양 컬렉션에서 얻어진 다음 균주들이 항균활성평가 연구에 사용되었다 : Candida albicans (KCTC 7965), Filobasidiella neoformans (KCTC 7003), Staphylococcus aureus (KCTC 1928), Bacillus subtilis (KCTC 1021), Proteus vulgaris (KACC 12674). 활성평가의 대조군으로서는 Gentamicin을 사용하였으며, 그 활성은 Staphylococcus aureus (KCTC 1928)와 Bacillus subtilis (KCTC1021)에 대하여 각각 13mm (50 ㎍/disk의 농도), 16 mm (5 ㎍/disk의 농도)의 항균활성을 보였다.

항균활성 검사는 페이퍼 디스크법(paper disc method)을 이용하였다. 각 시험균액이 첨가된 아가 배지를 페트리 디쉬에 붓고 평판 배지를 만든 다음, 화합물 1을 멸균된 페이퍼 디스크 (paper disc)에 400㎍ 씩 흡수시킨 후, 준비된 활성평가용 평판 배지에 올려놓고, 25℃의 정치배양기에서 48시간 배양하여 디스크 주변의 클리어존(clear zone, mm)을 측정하였다.

항균실험에 사용된 균주 및 배지의 목록

테스트용 미생물	사용된 배지
Candida albicans KCTC 7965	YMA, MEA
Filobasidiella neoformans KCTC 7003	YMA, MEA
Staphylococcus aureus KCTC 1928	NA
Bacillus subtilis KCTC 1021	NA
Proteus vulgaris KACC 12674 (-)	NA

- NA(Nutrient Agar): [0.3% (w/v) beef extract, 0.5% (w/v) peptone, 1.5% (w/v) agar]

- YMA(Yeast Mold Agar): [0.3% (w/v) yeast extract, 0.3% (w/v) malt extract, 0.5% (w/v) peptone, 1% (w/v) dextrose, 2% (w/v) agar]

- MEA(Malt Extract Agar): [1.275% (w/v) maltose, 0.275% (w/v) dextrin, 0.235% (w/v) glycerol, 0.078% (w/v) peptone, 1.5% (w/v) agar]

화합물 1의 항균활성

테스트용 미생물	클리어존 (mm)
Candida albicans KCTC 7965	-
Filobasidiella neoformans KCTC 7003	-
Staphylococcus aureus KCTC 1928	13
Bacillus subtilis KCTC 1021	8
Proteus vulgaris KACC 12674 (-)	-

하기에 본 발명의 조성물을 위한 제제예를 예시한다.

제제예 1: 산제의 제조

본 발명의 환형 펩타이드계 화합물 0.1 g

유당 1.5 g

탈크 0.5 g

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

제제예 2: 정제의 제조

본 발명의 환형 펩타이드계 화합물 0.1 g

결정성 셀룰로오스 1.5 g

스테아린산 마그네슘 0.5 g

상기의 성분들을 혼합한 후 직타법(direct tableting method)으로 정제를 제조하였다.

제제예 3: 캡슐제의 제조

본 발명의 환형 펩타이드계 화합물 0.1 g

옥수수전분 5 g

카르복시 셀룰로오스 4.9 g

상기의 성분들을 혼합하여 분말을 제조한 후, 상기 분말을 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라 경질 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

제제예 4: 주사제의 제조

본 발명의 환형 펩타이드계 화합물 0.1 g

주사용 멸균 증류수 적량

pH 조절제 적량

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플 당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조하였다.

제제예 5: 액제의 제조

본 발명의 환형 펩타이드계 화합물 0.1 g

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고, 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합하였다. 그 다음 정제수를 가하여 전체 100 ㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조하였다.

한국생명공학연구원

KCTC18187

20100208

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 환형 펩타이드계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:
[화학식 1]
제1항에 있어서, 상기 환형 펩타이드계 화합물은 알터나리아 속 (Alternaria sp.)으로부터 분리된 것을 특징으로 하는 화합물.
제1항의 화합물을 유효성분으로 포함하는 항균용 약학 조성물.
제3항에 있어서, 상기 환형 펩타이드계 화합물은 그람 양성세균에 대해 항균 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 항균용 약학 조성물.
제4항에 있어서, 상기 그람 양성세균은 바실러스 속(Bacillus sp.) 또는 스타필로코커스 속(Staphylococcus sp.) 세균인 것을 특징으로 하는 항균용 약학 조성물.
제5항에 있어서, 상기 바실러스 속(Bacillus sp.) 또는 스타필로코커스 속(Staphylococcus sp.) 세균은 각각 고초균 (Bacillus subtilis) 또는 황색포도상구균 (Staphylococcus aureus)인 것을 특징으로 하는 항균용 약학 조성물.
제1항의 화합물을 유효성분으로 포함하는 항균용 화장료 조성물.
1) 알터나리아 속 (Alternaria sp.) SF-5016 균주를 배양하는 단계,
2) 상기 1) 단계에서 얻어진 균주 배양물을 에틸아세테이트로 추출하는 단계, 및
3) 상기 2) 단계에서 얻어진 에틸아세테이트 추출물을 컬럼 크로마토그래피로 분리하는 단계를 포함하는, 제1항의 환형 펩타이드계 화합물의 분리 방법.
제1항의 화합물을 생산하는 알터나리아 속 (Alternaria sp.) SF-5016 균주 (수탁번호: KCTC 18187P).