CN105753929A - 甾体皂苷类化合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一类新的甾体皂苷类化合物及其应用，所述的甾体皂苷类化合物通过溶剂提取，提取液经大孔树脂富集得到总甾体皂苷。总皂苷经过硅胶、ODS柱层析，反相HPLC制备得到甾体皂苷类化合物，本发明的甾体皂苷类化合物具有很好的抗癌作用，肝癌、肺癌、鼻咽癌、胃癌、乳腺癌等具有一定的作用，该类化合物具有高效、低毒的优点，有望开发为新的抗癌药物及保健食品。

Description

甾体皂苷类化合物及其应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一类新的甾体皂苷类化合物及其应用。

背景技术

癌症是全球一个主要死亡原因，在2012年造成820万人死亡，估计在未来20年中，每年癌症病例将由2012年的1400万上升到2200万，成为威胁人类健康的常见疾病。如何攻克癌症是全世界共同关注的问题。

天然药物尤其是来源于植物的药物具有化学结构多样性和生物活性多样性，一直是人类预防和治疗疾病的主要来源。临床上应用的许多药物都直接或间接来源于天然产物，天然产物不仅可作为药物半合成的前体物，而且可以作为药物化学合成的模板，为新药设计提供新颖的思路。近年来全世界对于天然药物的治疗作用越发关注，天然产物已成为发现新的抗癌药物或先导化合物的主要源泉之一。

薤(AlliumchinenseG.Don)又名藠头，为百合科葱属植物，主产于长江流域及其以南各省，始载于《神农本草经》，被2010年版《中国药典》收载，与其同属植物小根蒜(AlliummacrostemonBunge)作为中药薤白的主要来源。薤白具有温中通阳、理气宽胸、还阳散结之功效，中医临床用于治疗胸痹、心痛彻背等。现代研究表明薤具有抗肿瘤、抑制血小板聚集、降血脂、降糖等多种药理活性，甾体皂苷类化合物是其主要活性成分之一。我们对薤中甾体皂苷类化学成分进行了系统的研究，成功分离得到了多个新的甾体皂苷类化合物，然后进一步对这些化合物进行了体外抗癌活性研究。本专利报道了一类新甾体皂苷类化合物及其制备方法和抗癌活性。

发明内容

本发明的目的在于提供一类甾体皂苷类化合物及其应用。

本发明所采取的技术方案是：

甾体皂苷类化合物，其结构通式选自以下5个结构通式：

式中R、R1为H或糖基，糖基的数目为1–5；

R₂为H或OH；

R₃为α-CH₃、β-CH₃或碳碳双键；

R₄为糖基，糖基的数目为1–5。

进一步的，上述糖基选自葡萄糖基、半乳糖基、阿拉伯糖基、木糖基中的至少一种；糖基的连接方式选自1→2位连接，1→3位连接，1→4位连接和1→6位连接中的至少一种。

进一步的，上述甾体皂苷类化合物的结构式选自以下9个结构式之一：

结构式1：

结构式2：

结构式3：

结构式4：

结构式5：

结构式6：

结构式7：

结构式8

结构式9：

上述甾体皂苷类化合物在制备防治癌症药物中的应用。

进一步的，上述癌症为肝癌、肺癌、鼻咽癌、胃癌、乳腺癌。

上述甾体皂苷类化合物在制备防治癌症保健食品中的应用。

进一步的，上述癌症为肝癌、肺癌、鼻咽癌、胃癌、乳腺癌。

本发明的有益效果是：

本发明的甾体皂苷类化合物具有很好的抗癌作用，对肝癌、肺癌、鼻咽癌、胃癌、乳腺癌等具有一定的防治作用，该类化合物具有高效、低毒的优点，有望开发为新的抗癌药物。

附图说明

图1为本发明化合物1的IR图谱；

图2为本发明化合物1的HR-ESI-MS图谱；

图3为本发明化合物1的¹H-NMR图谱；

图4为本发明化合物1的¹³C-NMR图谱。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

实施例1

一、提取分离甾体皂苷类化合物

取薤鳞茎123Kg，用三倍量的60％甲醇提取三次，提取物浓缩后用水溶解经D101大孔吸附树脂吸附，用不同浓度的甲醇/水洗脱，得到总甾体皂苷部分152.1g。总皂苷部分经硅胶柱层析(200-300目)，氯仿/甲醇梯度洗脱、TLC检测合并后得到14个组分(F1～F14)。F10(4.19g)经ODS中低压柱色谱分离、反相高效液相色谱制备得到本发明化合物1(42.6mg)，化合物5(4.0mg)和化合物8(12.0mg)。F11(4.40g)经ODS中低压柱色谱、反相高效液相色谱，分离得到本发明化合物4(3.3mg)，F12(9.18g)经ODS中低压柱色谱、反相高效液相色谱分离，得到本发明化合物3(19.7mg)，化合物6(54.0mg)，化合物7(10.3mg)，化合物9(30.0mg)，F13(8.5g)经ODS中低压柱色谱、反相高效液相色谱，分离得到本发明化合物2(4.5mg)。

二、甾体皂苷类化合物的结构鉴定

通过理化常数和波谱学手段(IR,ESIMS,1D-NMR,2D-NMR)鉴定以上9个新化合物的结构。以化合物1为例，阐述鉴定过程，化合物1–9的波谱数据见表1–3。化合物1–9的结构如下：

化合物1(25R)-5α-spirostan3-O-{O-(4-O-acetyl-α-L-arabinopyranosyl)-(1→6)-β-D-glucopyranoside}

白色无定形粉末；IRν_max(KBr)cm^-1:3405(OH),2950(CH),1735(C＝O),1708(C＝O),1453,1430,1376,1242,1174,1019,983,920,900,866,800,782(吸收强度920<900)；¹HNMR(500MHz,pyridine-d₅)和¹³CNMR(125MHz,pyridine-d₅)数据见表1和表2；HR-ESI-Q-TOF-MS(positive)m/z789.4011[M+Na]⁺,calcd.forC₄₀H₆₂O₁₄Na789.4037.

化合物1为白色无定型粉末，对Anisaldehyde(A试剂)反应显黄色，对Ehrlish(E试剂)不显色。将1用2MHCl完全水解，所得糖部分经氯化羟胺和乙酸酐衍生化后GC分析，检出D-葡萄糖和L-阿拉伯糖，提示该化合物为甾体皂苷类化合物。化合物1的HR-ESI-MS图谱见图2，HR-ESI-Q-TOF-MS(positive)给出[M+Na]⁺峰m/z789.4011(calcd.789.4030007)，结合¹³C和¹H-NMR可以确定化合物1的分子式为C₄₀H₆₂O₁₄。

化合物1的IR图谱见图1，IR(KBr)中，3405cm^-1处为多羟基的吸收峰，1708cm^-1和1735cm^-1处为羰基吸收信号，在1000-800cm^-1之间有螺缩酮结构的特征吸收(983cm^-1,920cm^-1,900cm^-1,866cm^-1)，而且信号强度920cm^-1<900cm^-1(B<C)说明该化合物的25位碳为R构型。

化合物1的¹H-NMR图谱见图3，¹H-NMR(500MHz,pyridine-d₅)除给出甾体皂苷元上的四个甲基上的质子信号δ1.13(d,J＝6.9Hz,3H)、0.76(s,3H)、0.67(d,J＝5.9Hz,3H)、0.61(s,3H)，在δ1.96(s,3H)处还有一个甲基信号。两个糖的端基质子信号分别位于δ4.97(d,J＝7.7Hz,1H)、4.94(d,J＝7.3Hz,1H)，说明葡萄糖为β构型，阿拉伯糖为α构型。化合物1的¹³C-NMR图谱见图4，¹³C-NMR(126MHz,pyridine-d₅)中共有40个碳信号。其中δ210.0、171.1为两个羰基碳信号，δ109.5为甾体皂苷22位碳的特征吸收信号，糖端基信号区给出葡萄糖和阿拉伯糖的端基碳信号δ102.5、106.0。在高场区给出五个甲基信号δ21.3、17.6、16.7、15.2、13.3。该化合物的碳谱数据与化合物Laxogenin3-O-{α-L-arabinopyranosyl(1→6)-β-D-glucopyranoside}非常相近，除了糖链部分阿拉伯糖的C-3、4、5位有差别外，糖链其他部分以及苷元部分数据基本一致，结合该化合物多出δ171.1和δ21.3两个碳信号，以及HR-ESI-MS的结果说明该化合物为3的一个羟基被乙酰化后的产物。比较化合物1和3可以发现，1中阿拉伯糖的C-4向低场位移+3.1ppm，出现在72.5ppm，C-3(δ74.7)和C-5(66.8)分别向高场位移至δ72.8(-1.9ppm)和δ64.6(-2.2ppm)，说明乙酰基连接在阿拉伯糖的C-4位。在HMBC谱中，阿拉伯糖的H-4(δ5.56,m)与δ171.1(Ac-)、72.8(Ara，C-3)相关，H-5a与δ106.0(Ara,C-1)、72.8(Ara，C-3)相关，进一步确定了乙酰基连接在阿拉伯糖的C-4位。利用DEPT、HMQC、HMBC谱可以将化合物的信号进行归属。

综合以上实验结果，可得出化合物1的结构式为：

化合物2(25R)-3β-hydroxy-5α-spirostan-6-one3-O-{[O-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-O-β-D-xylopyranosyl]-(1→4)-O-[α-L-arabinopyranosyl-(1→6)]}-β-D-glucopyranoside

白色无定形粉末；IRν_max(KBr)cm^-1:3322(OH),2950(CH),1709(C＝O),1455,1380,1242,1167,1059,984,920,900,866,783(吸收强度920<900)；¹HNMR(500MHz,pyridine-d₅)和¹³CNMR(125MHz,pyridine-d₅)数据见表1和表2；HR-ESI-Q-TOF-MSm/z1041.4944[M+Na]⁺,calcd.forC₄₉H₇₈O₂₂Na1041.4882。化合物2的具体鉴定过程与化合物1类似，最终获得化合物2的结构式为：

化合物3(25R)-3β-hydroxy-5β-spirostan-6-one3-O-β-D-xylopyranosyl(1→4)-[α-L-arabinopyranosyl-(1→6)]-β-D-glucopyranoside

白色无定形粉末；IRν_max(KBr)cm^-1:3322(OH),2931(CH),1701(C＝O),1456,1379,1242,1158,1054,1010,983,920,900,866,781(吸收强度920<900)；¹HNMR(500MHz,pyridine-d₅)和¹³CNMR(125MHz,pyridine-d₅)数据见表1和表2；HR-ESI-Q-TOF-MSm/z879.4326[M+Na]⁺,calcd.forC₄₃H₆₈O₁₇Na879.4354。化合物3的具体鉴定过程与化合物1类似，最终获得化合物3的结构式为：

化合物4(25S)-24-O-β-D-glucopyranosyl-3β,24β-dihydroxy-5α-spirostan-6-one

白色无定形粉末；IRν_max(KBr)cm^-1:3420(OH),2955(CH),1700(C＝O),1455,1382,1242,1187,1075,993,965,900,871；¹HNMR(500MHz,pyridine-d₅)和¹³CNMR(125MHz,pyridine-d₅)数据见表1和表2；HR-ESI-Q-TOF-MSm/z631.3436[M+Na]⁺,calcd.forC₃₃H₅₂O₁₀Na631.3458。化合物4的具体鉴定过程与化合物1类似，最终获得化合物4的结构式为：

化合物5(25S)-3β,24β-dihydroxy-5α-spirostan-6-one3-O-[α-L-arabinopyranosyl(1→6)]-β-D-glucopyranoside

白色无定形粉末；IRν_max(KBr)cm^-1:3347(OH),2955(CH),1705(C＝O),1452,1382,1188,1075,994,965,900；¹HNMR(500MHz,pyridine-d₅)和¹³CNMR(125MHz,pyridine-d₅)数据见表1和表2；HR-ESI-Q-TOF-MSm/z763.3859[M+Na]⁺,calcd.forC₃₈H₆₀O₁₄Na763.3881。化合物5的具体鉴定过程与化合物1类似，最终获得化合物5的结构式为：

化合物6(25R)-5α-spirostan-3β-yl3-O-acetylO-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-O-[β-D-glucopyranosyl-(1→3)]-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-galactopyranoside

白色无定形粉末；IRν_max(KBr)cm^-1:3348(OH),2931(CH),1735,1451,1374,1244,1160,1075,984,922,900,865(吸收强度922<900)；¹HNMR(500MHz,pyridine-d₅)和¹³CNMR(125MHz,pyridine-d₅)数据见表1和表2；HR-ESI-Q-TOF-MSm/z1129.5430[M+Na]⁺,calcd.forC₃₈H₆₀O₁₄Na1129.5407。化合物6的具体鉴定过程与化合物1类似，最终获得化合物6的结构式为：

化合物75α-spirostane25(27)-ene-2α,3β-diol-3-O-{O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-galactopyranoside}

白色无定形粉末；IRν_max(KBr)cm^-1:3357(OH),2929(CH),1648(C＝C),1451,1378,1230,1171,1076,1045,955,924,900,880,792；¹HNMR(500MHz,pyridine-d₅)和¹³CNMR(125MHz,pyridine-d₅)数据见表1和表2；HR-ESI-Q-TOF-MSm/z939.4606[M+Na]⁺,calcd.forC₄₅H₇₂O₁₉Na939.4566。化合物7的具体鉴定过程与化合物1类似，最终获得化合物7的结构式为：

化合物826-O-β-D-glucopyranosyl3β,22α,26-trihydroxy-25(R)-5α-furostan-6-one

白色无定形粉末；IRν_max(KBr)cm^-1:3426(OH),2937(CH),1706(C＝O),1058,¹HNMR(500MHz,pyridine-d₅)和¹³CNMR(125MHz,pyridine-d₅)数据见表3；HR-ESI-Q-TOF-MS(positive)m/z633.3634[M+Na]⁺,calcd.forC₃₃H₅₄O₁₀Na633.3615。化合物8的具体鉴定过程与化合物1类似，最终获得化合物8的结构式为：

化合物926-O-β-D-glucopyranosyl3β,22α,26-trihydroxy-25(R)-5α-furostan-6-one3-O-β-D-glucopyranoside

白色无定形粉末；IRν_max(KBr)cm^-1:3343(OH),2941(CH),1708(C＝O),1076；¹HNMR(500MHz,pyridine-d₅)和¹³CNMR(125MHz,pyridine-d₅)数据见表3；HR-ESI-Q-TOF-MSm/z795.4170[M+Na]⁺,calcd.forC₃₉H₆₄O₁₅Na795.4143。化合物9的具体鉴定过程与化合物1类似，最终获得化合物9的结构式为：

表1.化合物1–7的¹HNMR(500MHz,inC₅D₅N)数据

o表示信号重叠。

表2.化合物1–7的¹³CNMR(125MHz,inC₅D₅N)数据

^a,b表示信号归属在列内可以互换。

表3.化合物8和化合物9的¹H(500MHz,inC₅D₅N)和¹³CNMR(125MHz,inC₅D₅N)数据

^a表示信号归属在列内可以互换，

o表示信号重叠。

三、抗癌活性测试

(1)试验方法(MTT法)

在96孔细胞培养板中每孔加入200μl(含有2.5×10⁴个肿瘤细胞)细胞悬液，置37℃5％CO₂培养箱中培养12h后，实验组分别加入不高于100μM本发明提取的化合物(此处以化合物2、6和7为代表)，阴性对照组加入等体积溶剂，阳性对照组加入顺铂，每组4孔。置37℃，5％CO₂培养箱培养48h后，弃去上清液，加入200μl/孔新配制的含50mg/mlMTT的无血清培养液，于37℃继续培养4h。弃去上清液，加入200μlDMSO，混匀后，在酶标仪上测定波长492nm的OD值，计算出IC₅₀。每个样品重复测定3次。

按下式计算药物对肿瘤细胞生长得抑制率：

(2)实验结果

表4本发明化合物对肿瘤细胞的抑制作用

上述实验结果如表4所示，从中可以看出，本发明化合物2对人肝癌细胞HepG2有很强的抑制作用，化合物6和化合物7对人肝癌细胞HepG2、人肺腺癌细胞A549、人鼻咽癌细胞CNE-1、人胃癌细胞MCG-803及人乳腺癌细胞MDA-MB231等增殖具有很强的抑制作用。对其他本发明化合物进行同样的实验检测，也发现具有与化合物6和化合物7相似的作用。

上述结果说明，本发明甾体皂苷类化合物对癌症具有很好的防治效果，尤其是在肝癌、肺癌、鼻咽癌、胃癌、乳腺癌的防治方面。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.甾体皂苷类化合物，其结构通式选自以下5个结构通式：

式中R、R1为H或糖基，糖基的数目为1–5；

R₂为H或OH；

R₃为α-CH₃、β-CH₃或碳碳双键；

R₄为糖基，糖基的数目为1–5。

2.根据权利要求1所述的甾体皂苷类化合物，其特征在于：所述糖基选自葡萄糖基、半乳糖基、阿拉伯糖基、木糖基中的至少一种；糖基的连接方式选自1→2位连接，1→3位连接，1→4位连接和1→6位连接中的至少一种。

3.根据权利要求1所述的甾体皂苷类化合物，其特征在于：甾体皂苷类化合物的结构式选自以下9个结构式之一：

结构式1：

结构式2：

结构式3：

结构式4：

结构式5：

结构式6：

结构式7：

结构式8：

结构式9：

4.权利要求1～3任一所述的甾体皂苷类化合物在制备防治癌症药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述癌症为肝癌、肺癌、鼻咽癌、胃癌、乳腺癌。

6.权利要求1～3任一所述的甾体皂苷类化合物在制备防治癌症保健食品中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述癌症为肝癌、肺癌、鼻咽癌、胃癌、乳腺癌。