CN105924494B - 一类呋甾皂苷类化合物及其应用 - Google Patents
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07J—STEROIDS
- C07J71/00—Steroids in which the cyclopenta(a)hydrophenanthrene skeleton is condensed with a heterocyclic ring
- C07J71/0005—Oxygen-containing hetero ring
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
Abstract
本发明公开了一类呋甾皂苷类化合物及其应用。所述呋甾皂苷类化合物从开口箭根茎中提取分离得到，经过实验研究发现本发明所获得的10种呋甾皂苷类化合物在防治癌症、抗炎方面具有很好的作用，对咽鳞癌、咽头癌等都具有一定的抑制作用。且该类化合物从植物中提取获得具有高效、低毒的优点，有望开发为新的抗癌药物及保健食品。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一类呋甾皂苷类化合物及其应用。
背景技术
肿瘤是人体器官组织的细胞在外来和内在有害因素的长期作用下所产生的一种以细胞过度增殖为主要特点的新生物，在医学上可分为良性肿瘤和恶性肿瘤两大类。良性肿瘤对人体健康影响较小，而恶性肿瘤(又称癌症)则严重威胁着人类的健康。根据世界卫生组织和美国癌症协会的最新统计数据，癌症已成为人类死亡的首要病因，2008年全世界约有1270万新诊断癌症病例和760万癌症死亡病例(约占所有死亡人数的13％)，且大约有70％的癌症死亡病例发生在中低收入国家。预计到2030年，癌症年诊断和死亡病例将分别高达2140万和1320万。
天然药物尤其是来源于植物的药物具有化学结构多样性和生物活性多样性，一直是人类预防和治疗疾病的主要来源。临床上应用的许多药物都直接或间接来源于天然产物，天然产物不仅可以作为药物半合成的前体物，而且可以作为药物化学合成的的模板，为新药设计提供新思路。天然产物已成为发现新药物或先导化合物的主要源泉之一。
开口箭(Tupistra Chinensis)为百合科(Liliaceae)铃兰族(Convallarieae)开口箭属(Tupistra)植物。主要分布于我国中部和西南部，主产于湖北三峡库区及神龙架林区。开口箭在土家族医药中享有极高声誉,为神农架四大名药之一药用部位为其根状茎。开口箭味甘微苦，性寒，具有清热解毒、益气活血、散瘀止痛等多种功效，民间用于咽喉肿痛、劳热咳嗽、跌打损伤、风湿痹痛、月经不调等症。使用方便,疗效显著,已有数百年的应用历史。临床上，开口箭饮片治疗慢性咽炎效果良好。
开口箭根茎的主要活性成分为甾体皂苷类成分。现代药理实验研究表明开口箭具有较强的抗肿瘤、抗炎、抑菌等活性。现有研究对开口箭化学成分研究仍不够彻底，因而开口箭中甾体类化学成分值得进一步研究和开发利用。
发明内容
本发明的目的在于提供一类呋甾皂苷类化合物。
本发明的另一目的在于提供上述呋甾皂苷类化合物的应用。
本发明所采取的技术方案是：
呋甾皂苷类化合物，其结构式分别为：
化合物1：化合物2：
化合物3：化合物4：
化合物5：
化合物6：
化合物7：
化合物8：
化合物9：
化合物10：
上述呋甾皂苷类化合物在制备防治癌症药物中的应用。
进一步的，上述癌症为咽鳞癌、咽头癌、鼻咽鳞癌、肝癌、慢性骨髓性白血病、肺腺癌。
上述呋甾皂苷类化合物在制备抗炎药物中的应用。
本发明的有益效果是：
本发明通过长期研究，从开口箭根茎中分离鉴定了一类新型呋甾类皂苷类化合物1～10。通过研究发现该化合物1～10在防治癌症、抗炎方面具有很好的作用。该类化合物从植物中提取获得，具有高效、低毒的优点，有望开发为新的抗癌药物及保健食品。
附图说明
图1为本发明化合物(50μM)对不同肿瘤细胞的抑制作用；
图2为本发明化合物(50μM)对Raw 264.7细胞释放炎症介质NO的抑制作用；ctl-：空白对照；ctl+：模型组；**p<0.001。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
实施例1呋甾皂苷类化合物的提取和鉴定
一、呋甾皂苷类化合物的提取
取开口箭根茎17kg，用60％乙醇加热回流提取4次，每次4小时，合并提取液减压回收溶剂，得总浸膏，将总浸膏用水混悬，用乙酸乙酯等体积萃取4次，除去脂溶性杂质，水层经D101大孔树脂柱层析分离，分别以水、20％乙醇，60％乙醇，80％乙醇、95％乙醇进行洗脱，得到5个馏分TA、TB、TC、TD、TE。取馏分TC(60％乙醇洗脱部分)200g，采用硅胶柱色谱、ODS中低压柱色谱、反相高效液相色谱等分离方法，分离得到本发明化合物1、2和6。采用同样的分离手段从馏分TD(80％乙醇洗脱部分)中分离得到本发明化合物3、4和7，从馏分TB(20％乙醇洗脱部分)中分离得到本发明化合物5和8-10。通过理化常数和现代波谱学手段(HRESIMS,1D-NMR,2D-NMR)鉴定以上10个化合物的结构，化合物1为(25S)-furost-1β,3α,5β,22α,26-pentol-26-O-β-D-glucopyranoside，化合物2为(25S)-furost-1β,3β,5β,22α,26-pentol-26-O-β-D-glucopyranoside，化合物3为(25S)-26-O-β-D-glucopyranosyl-furost-3β,5β,22α,26-tetrol-5-O-β-D-glucopyranoside，化合物4为26-O-β-D-glucopyranosyl-furost-25(27)-ene-3β,5β,22α,26-tetrol-5-O-β-D-glucopyranoside，化合物5为26-O-β-D-glucopyranosyl-furost-25(27)-ene-3β,4β,5β,22α,26-pentol-5-O-β-D-glucopyranoside,化合物6为(25R)-26-O-β-D-glucopyranosyl-22α-methoxyl-furost-5(6)-en-3β,26-diol-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-galactopyranoside，化合物7为(25S)-26-O-β-D-glucopyranosyl-furost-5(6)-ene-3β,22α,26-triol-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-galactopyranoside，化合物8为26-O-β-D-glucopyranosyl-5β-furost-25(27)-en-3β,22α,26-triol-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranoside，化合物9为(25R)-26-O-β-D-glucopyranosyl-5β-furost-1β,3α,22α,26-tetrol-3-O-β-D-glucopyranoside，化合物10为(25S)-26-O-β-D-glucopyranosyl-5β-furost-1β,3β,22α,26-tetrol-1-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-xylopyranoside。上述所获得的化合物1～10的结构以表1所示的结构式为准。
表1本发明10个呋甾皂苷类化合物的结构
二、呋甾皂苷类化合物的鉴定
化合物1-10的结构鉴定过程如下：
化合物1的鉴定
(25S)-furost-1β,3α,5β,22α,26-pentol-26-O-β-D-glucopyranoside(化合物1):白色无定形粉末，红外谱图中显示强的多羟基吸收峰3411cm-1，对Anisaldehyde(A试剂)反应显黄色，对Ehrlish(E试剂)显粉红色，酸水解检出D-葡萄糖，提示该化合物为呋甾皂苷类化合物。HRESIMS(positive)给出准分子离子峰[M+H]+m/z611.3830(calcd.for C33H55O10 611.3795)，提示其分子量为610，结合1H-NMR和13C-NMR(DEPT)可确定其分子式为C33H54O10。
在1H-NMR谱中，高场区给出甾体皂苷元上四个甲基的特征信号，其中两个角甲基为单峰，另外两个为双峰，分别位于δ0.91(3H,s,Me-18)、1.49(3H,s,Me-19)、1.34(3H,d,J＝6.9Hz,Me-21)及1.03(3H,d,J＝6.7Hz,Me-27)。在糖端基氢区给出一个糖端基氢信号δ4.82(1H,d,J＝7.8Hz)，提示该化合物为含有一个β-D-葡萄糖的呋甾皂苷。另外，由于27位甲基的化学位移大于1.00ppm且26位两个质子的化学位移之差(0.60ppm)大于0.57ppm，说明该化合物为25S呋甾皂苷。
13C-NMR(126MHz，pyridine-d5)显示出33个碳信号，其中δ111.0为呋甾皂苷C-22特征信号，δ105.5为糖端基碳信号。通过1H-NMR、13C-NMR(DEPT)、HSQC、HMBC及1H-1H COSY谱并结合文献可以对该化合物的碳及氢信号进行全面归属。在1H-1H COSY谱中，两个亚甲基质子信号δ2.12(H-2α)和2.59(H-2β)与两个连氧碳上的质子信号δ4.31(H-1)和5.12(H-3)相关,质子信号δ5.12(H-3)与另外两个亚甲基质子信号δ2.25(H-4β)和2.60(H-4α)相关，说明化合物的C-1和C-3位连有羟基。在HMBC谱中，19-Me与季碳δ77.4(C-5)相关，说明化合物C-5位连有羟基。通过NOESY谱，A环上羟基相对构型得到确定：H-4α与H-7α和H-9α相关，H-2α与H-9α相关，说明A、B环为顺式连接，因此C-5位羟基为β取向；H-1α与Me-19和H-11相关,说明C-1位羟基为β取向；H-3β与H-2β和H-4β相关,说明C-3位羟基为α取向。在HMBC谱中，葡萄糖端基质子信号δ4.82(1H,d,J＝7.8Hz)与苷元C-26(δ75.7)相关，从而确定葡萄糖连接在化合物1的C-26位。综合以上信息，化合物1鉴定为(25S)-furost-1β,3α,5β,22α,26-pentol-26-O-β-D-glucopyranoside。化合物1的1H-NMR和13C-NMR数据见表2，化合物1的结构见表1。
化合物2的鉴定
(25S)-furost-1β,3β,5β,22α,26-pentol-26-O-β-D-glucopyranoside(化合物2):白色无定形粉末，红外谱图中显示强的多羟基吸收峰3411cm-1，对Anisaldehyde(A试剂)反应显黄色，对Ehrlish(E试剂)显粉红色，酸水解检出D-葡萄糖，提示该化合物为呋甾皂苷类化合物。HRESIMS(positive)给出准分子离子峰[M+H]+m/z611.3821(calcd.for C33H55O10 611.3795)，提示其分子量为610，结合1H-NMR和13C-NMR(DEPT)可确定其分子式为C33H54O10。
在1H-NMR谱中，高场区给出甾体皂苷元上四个特征的甲基信号，其中两个角甲基为单峰，另外两个为双峰，分别位于δ0.91(3H,s,Me-18)、1.55(3H,s,Me-19)、1.33(3H,d,J＝6.9Hz,Me-21)及1.03(3H,d,J＝6.7Hz,Me-27)。在糖端基氢信号区给出一个糖端基氢信号δ4.81(1H,d,J＝7.8Hz)，提示该化合物为含有一个β-D-葡萄糖的呋甾皂苷。另外，由于27位甲基的化学位移大于1.00ppm且26位两个质子的化学位移之差(0.60ppm)大于0.57ppm，说明该化合物为25S呋甾皂苷。
13C-NMR(126MHz，pyridine-d5)显示出33个碳信号，其中δ111.0为呋甾皂苷C-22特征信号，δ105.4为糖端基碳信号。该化合物苷元部分与糖链部分的碳谱数据与化合物1极其相似，仅A环上的数据有较小的差异，推测这两个化合物有相同的平面结构，只是取代基相对构型不同而已。该化合物苷元部分碳谱数据与已知化合物(25S)-26-O-β-D-glucopyranosyl-furost-1β,3β,5β,22α,26-pentaol-3-O-β-D-glucopyranoside)基本一致，只是在A环的C-1、C-2、C-3化学位移有差别。与化合物(25S)-26-O-β-D-glucopyranosyl-furost-1β,3β,5β,22α,26-pentaol-3-O-β-D-glucopyranoside)相比，该化合物的C-3向高场位移，C-1和C-2向低场位移，提示化合物2的C-3位羟基游离。综合以上信息，化合物2鉴定为(25S)-furost-1β,3β,5β,22α,26-pentol-26-O-β-D-glucopyranoside。通过1H-NMR、13C-NMR(DEPT)、HSQC、HMBC和1H-1H COSY谱可以对该化合物的碳及氢信号进行全面归属，化合物2的1H-NMR和13C-NMR数据见表2。化合物2的结构见表1。
化合物3的鉴定
(25S)-26-O-β-D-glucopyranosyl-furost-3β,5β,22α,26-tetrol-5-O-β-D-glucopyranoside(化合物3):白色无定形粉末，红外谱图中显示强的多羟基吸收峰3459cm-1，对Anisaldehyde(A试剂)反应显黄色，对Ehrlish(E试剂)显粉红色，酸水解检出D-葡萄糖，提示该化合物为呋甾皂苷类化合物。HRESIMS(positive)给出准分子离子峰[M+H]+m/z 757.4398(calcd.for C39H65O14 757.4374)，提示其分子量为756，结合1H-NMR和13C-NMR(DEPT)可确定其分子式为C39H64O14。
在1H-NMR谱中，高场区给出甾体皂苷元上四个特征的甲基信号，其中两个角甲基为单峰，位于δ0.89(3H,s,Me-18)和1.24(3H,s,Me-19)，另外两个为双峰，位于1.34(3H,d,J＝6.9Hz,Me-21)和1.03(3H,d,J＝6.6Hz,Me-27)。在糖端基氢信号区给出两个糖端基氢信号δ4.81(1H,d,J＝7.7Hz)和5.14(1H,d,J＝7.7Hz)，结合这些糖端基氢信号的J值与酸水解分析结果，说明该化合物为含有两个β-D-葡萄糖的甾体皂苷。另外，由于27位甲基的化学位移大于1.00ppm且26位两个质子的化学位移之差(0.60ppm)大于0.57ppm，说明该化合物为25S呋甾皂苷。
13C-NMR(126MHz，pyridine-d5)显示出39个碳信号，其中δ111.1为呋甾皂苷C-22特征信号，δ97.6和105.4为糖端基碳信号。该化合物苷元部分与糖链部分的碳谱数据与已知化合物reinocarnoside B碳谱数据比较，除了多出六个糖信号和F环有差别外，其余基本一致，提示该化合物为reinocarnoside B的F环开环后形成的产物。
在HMBC谱中，葡萄糖端基质子信号δ4.81(1H,d,J＝7.7Hz)与苷元C-26(δ75.7)相关，另一端基质子δ5.14(1H,d,J＝7.7Hz)与苷元C-5(δ81.5)相关，从而确定两个葡萄糖分别连接在化合物的C-26和C-5位。通过1H-NMR、13C-NMR(DEPT)、HSQC、HMBC及1H-1H COSY谱可以对该化合物的碳及氢信号进行全面归属。综合以上信息，化合物3鉴定为(25S)-26-O-β-D-glucopyranosyl-furost-3β,5β,22α,26-tetrol-5-O-β-D-glucopyranoside。化合物3的1H-NMR和13C-NMR数据见表3。化合物3的结构见表1。
化合物4的鉴定
26-O-β-D-glucopyranosyl-furost-25(27)-ene-3β,5β,22α,26-tetrol-5-O-β-D-glucopyranoside(化合物4):白色无定形粉末，红外谱图中显示强的多羟基吸收峰3444cm-1，对Anisaldehyde(A试剂)反应显黄色，对Ehrlish(E试剂)显粉红色，酸水解检出D-葡萄糖，提示该化合物为呋甾皂苷类化合物。HRESIMS(positive)给出准分子离子峰[M+H]+m/z 773.4368(calcd.for C39H65O15 773.4323)，提示其分子量为772，结合1H-NMR和13C-NMR(DEPT)可确定其分子式为C39H64O15。
在1H-NMR谱中，高场区给出三个特征的甲基信号，其中两个角甲基为单峰，位于δ0.89(3H,s,Me-18)和1.24(3H,s,Me-19)，另外一个为双峰，位于δ1.34(3H,d,J＝6.8Hz,Me-21)。在低场区给出两个末端双键上的质子信号δ5.35(1H，s)和5.07(1H，s)。在糖端基氢信号区给出两个糖端基氢信号δ4.91(1H,d,J＝7.8Hz)和5.15(1H,overlapping)，说明该化合物为含有两个葡萄糖的甾体皂苷。
13C-NMR(126MHz，pyridine-d5)显示出39个碳信号，其中δ110.7为呋甾皂苷C-22特征信号，δ97.6和104.3为糖端基碳信号。最低场处147.6ppm的季碳信号及111.1ppm的亚甲基信号提示这两个碳是一个末端双键信号，分别归属为25位和27位。该化合物碳谱数据与化合物3非常相似，只是F环发生变化，推测可能是化合物3的25位与27位碳形成末端双键的缘故，其二维图谱也证明了上述推测。通过1H-NMR、13C-NMR(DEPT)、HSQC、HMBC及1H-1H COSY谱可以对该化合物的碳及氢信号进行全面归属。综合以上信息，化合物4鉴定为26-O-β-D-glucopyranosyl-furost-25(27)-ene-3β,5β,22α,26-tetrol-5-O-β-D-glucopyranoside。化合物4的1H-NMR和13C-NMR数据见表4。化合物4的结构见表1
化合物5的鉴定
26-O-β-D-glucopyranosyl-furost-25(27)-ene-3β,4β,5β,22α,26-pentol-5-O-β-D-glucopyranosid e(化合物5):白色无定形粉末，红外谱图中显示强的多羟基吸收峰3422cm-1，对Anisaldehyde(A试剂)反应显黄色，对Ehrlish(E试剂)显粉红色，酸水解检出D-葡萄糖，提示该化合物为呋甾皂苷类化合物。HRESIMS(positive)给出准分子离子峰[M+H]+m/z 789.4219(calcd.for C39H65O16 789.4273)，提示其分子量为788，结合1H-NMR和13C-NMR(DEPT)可确定其分子式为C39H64O16。
在1H-NMR谱中，高场区给出三个特征的甲基信号，其中两个角甲基为单峰，位于δ0.90(3H,s,Me-18)和1.37(3H,s,Me-19)，另外一个为双峰，位于δ1.34(3H,d,J＝6.9Hz,Me-21)。在低场区给出两个末端双键上的质子信号δ5.35(1H，s)和5.06(1H，s)。在糖端基氢信号区给出两个糖端基氢信号δ4.91(1H,d,J＝7.8Hz)和5.23(1H,d,J＝7.7Hz)，说明该化合物为含有两个β-D-葡萄糖的甾体皂苷。
13C-NMR(126MHz，pyridine-d5)显示出39个碳信号，其中δ110.7为呋甾皂苷C-22特征信号，δ97.4和104.3为糖端基碳信号。最低场处147.6ppm的季碳信号及111.0ppm的亚甲基信号提示这两个碳是一个末端双键信号，分别归属为25位和27位。该化合物碳谱数据与化合物4非常相似，只是A环发生变化。结合分子中的氧数，可知苷元部分较化合物4多一个羟基。由于该化合物的3位及5位较化合物4向低场发生了较大位移，分别为5.2ppm及6.0ppm，而6位碳却向高场位移了6.4ppm，故可知在该化合物的4位存在一个羟基，这样3位和5位位于4位羟基的β位，移向低场，6位处于γ位，受γ-效应的影响向高场发生较大位移。其二维图谱也证明了上述推测。综合以上信息，化合物5鉴定为26-O-β-D-glucopyranosyl-furost-25(27)-ene-3β,4β,5β,22α,26-pentol-5-O-β-D-glucopyranoside。通过1H-NMR、13C-NMR(DEPT)、HSQC、HMBC及1H-1H COSY谱可以对该化合物的碳及氢信号进行全面归属，化合物5的1H-NMR和13C-NMR数据见表4。化合物5的结构见表1。
化合物6的鉴定
(25R)-26-O-β-D-glucopyranosyl-22α-methoxyl-furost-5(6)-en-3β,26-diol-3-O-α-L-rhamnopyr anosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-galactopyranoside(化合物6)：白色无定形粉末，红外谱图中显示强的多羟基吸收峰3400cm-1，对Anisaldehyde(A试剂)反应显黄色，对Ehrlish(E试剂)显粉红色，酸水解检出D-葡萄糖、D-半乳糖及L-鼠李糖，提示该化合物为呋甾皂苷类化合物。HRESIMS(negative)给出准分子离子峰[M-H]-m/z 1077.5535(calcd.for C52H85O231077.5482)，提示其分子量为1078，结合1H-NMR和13C-NMR(DEPT)可确定其分子式为C52H86O23。
在1H-NMR谱中，高场区给出五个特征的甲基信号，其中四个为甾体皂苷元上特征的甲基信号，两个角甲基为单峰，位于δ0.79(3H,s,Me-18)和0.86(3H,s,Me-19)，另外两个为双峰，位于δ1.18(3H,d,J＝6.8Hz,Me-21)和0.98(3H,d,J＝6.7Hz,Me-27)；另一个处于最低场的甲基δ1.75(3H,d,J＝6.2Hz)为鼠李糖甲基的特征信号，提示分子中含有一个鼠李糖基。在较低场区给出一个甲氧基质子信号δ3.25(3H，s)。在糖端基氢信号区给出四个糖端基氢信号δ4.84(1H,d,J＝7.5Hz)、4.85(1H,d,J＝6.8Hz)、5.39(1H,d,J＝7.5Hz)和6.29(1H,brs)，说明该化合物为四糖呋甾皂苷。另外，由于27位甲基的化学位移小于1.00ppm且26位两个质子的化学位移之差(0.38ppm)小于0.48ppm，说明该化合物为25R呋甾皂苷。
13C-NMR(DEPT)显示出52个碳信号。由呋甾皂苷C-22特征信号δ112.9可知22位连接有甲氧基(如果22位连接羟基，C-22化学位移会向高场位移到111.0左右)。最低场处141.3ppm的季碳信号及121.9ppm的次甲基信号及氢谱中不饱和质子信号δ5.30(1H,d,J＝4.2Hz,H-6)提示这个化合物5位与6位形成双键。δ105.2、103.5、104.8和102.7为四个糖端基碳信号。该化合物的碳谱数据与文献报道的methyl protodioscin非常相似，只是3位糖链信号有差异，提示二者具有相同的苷元。
根据TOCSY谱，结合1H-1H COSY、HSQC谱的分析结果，由3-O-Gal的端基质子出发可以找到并归属该半乳糖基上的H-4信号，而从3-O-Gal的4位质子出发可以找到并归属该半乳糖残基上的H-2、H-3、H-5和H-6信号；同法由3-O-Gal-(4-1)-Glc和3-O-Gal-(4-1)-Glc-(2-1)-Rha的端基质子出发，可以将各自糖残基上的信号进行归属。结合HMBC谱，可以进一步验证糖残基的信号归属。在HMBC谱中，鼠李糖端基质子信号δ6.29(1H,brs)与内侧葡萄糖的C-2(δ79.2)相关，说明鼠李糖连接在葡萄糖的2位，另外该葡萄糖的端基质子信号δ5.39(1H,d,J＝7.5Hz)与半乳糖的C-4(δ77.5)相关，说明该葡萄糖连接在半乳糖的4位，而半乳糖的端基质子信号δ4.85(1H,d,J＝6.8Hz)与苷元C-3(δ78.6)相关,从而确定该化合物3位的糖链为3-O-Gal-(4-1)-Glc-(2-1)-Rha，经CA查证，该糖链为一未见文献报道的新糖链。综合以上信息，化合物6鉴定为(25R)-26-O-β-D-glucopyranosyl-22α-methoxyl-furost-5(6)-en-3β,26-diol-3-O-α-L-rhamnopyranos yl-(1→2)-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-galactopyranoside。通过1H-NMR、13C-NMR(DEPT)、HSQC、HMBC、1H-1H COSY及TOCSY谱可以对该化合物的碳及氢信号进行全面归属，化合物6的1H-NMR和13C-NMR数据见表5。化合物6的结构见表1。
化合物7的鉴定
(25S)-26-O-β-D-glucopyranosyl-furost-5(6)-ene-3β,22α,26-triol-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-galactopyranoside(化合物7):白色无定形粉末， 红外谱图中显示强的多羟基吸收峰3425cm-1，对Anisaldehyde(A试剂)反应显黄色，对Ehrlish(E试剂)显粉红色，酸水解检出D-葡萄糖、D-半乳糖及L-鼠李糖，提示该化合物为呋甾皂苷类化合物。HRESIMS(negative)给出准分子离子峰[M-H]-m/z 1063.5386(calcd.for C51H83O23 1063.5325)，提示其分子量为1064，结合1H-NMR和13C-NMR(DEPT)可确定其分子式为C51H84O23。
在1H-NMR谱中，高场区给出五个特征的甲基信号，其中四个为甾体皂苷元上特征的甲基信号，两个角甲基为单峰，位于δ0.88(3H,s,Me-18)和0.88(3H,s,Me-19)，另外两个为双峰，位于δ1.32(3H,d,J＝6.7Hz,Me-21)和1.03(3H,d,J＝6.6Hz,Me-27)；另一个处于最低场的甲基δ1.77(3H,d,J＝6.1Hz)为鼠李糖甲基的特征信号，提示分子中含有一个鼠李糖基。在糖端基氢信号区给出四个糖端基氢信号δ4.84(1H,d,J＝7.5Hz)、4.85(1H,d,J＝6.8Hz)、5.41(1H,d,J＝7.5Hz)和6.31(1H,brs)，说明该化合物为四糖呋甾皂苷。另外，由于27位甲基的化学位移大于1.00ppm且26位两个质子的化学位移之差(0.59ppm)大于0.57ppm，说明该化合物为25S呋甾皂苷。
13C-NMR(DEPT)显示出51个碳信号。由呋甾皂苷C-22特征信号δ111.0可知22位连接有羟基(如果22位连接甲氧基，C-22化学位移会向低场位移到112.9左右)[107]。最低场处141.3ppm的季碳信号及122.0ppm的次甲基信号及氢谱中不饱和质子信号δ5.30(1H,d,J＝4.2Hz,H-6)提示这个化合物5位与6位形成双键。δ105.5、103.6、104.9和102.8为四个糖端基碳信号。该化合物核磁数据与化合物6(25R)非常相似，仅F环信号有差异，这与前面分析的化合物7的25位为S构型一致。与化合物6相比，该化合物缺少一个甲氧基的信号，进一步证明该化合物22位连接的是羟基而非甲氧基。
综合以上信息，化合物7鉴定为(25S)-26-O-β-D-glucopyranosyl-furost-5(6)-ene-3β,22α,26-triol-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-galactopyranosi de。化合物7的1H-NMR和13C-NMR数据见表5。化合物7的结构见表1。
化合物8的鉴定
26-O-β-D-glucopyranosyl-5β-furost-25(27)-en-3β,22α,26-triol-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranoside(化合物8):白色无定形粉末，红外谱图中显示强的多羟基吸收峰3418cm-1，对Anisaldehyde(A试剂)反应显黄色，对Ehrlish(E试剂)显粉红色，酸水解检出D-葡萄糖，提示该化合物为呋甾皂苷类化合物。HRESIMS(negative)给出准分子离子峰[M-H]-m/z 917.4794(calcd.forC45H73O19 917.4746)，提示其分子量为918，结合1H-NMR和13C-NMR(DEPT)可确定其分子式为C45H74O19。
在1H-NMR谱中，高场区给出三个特征的甲基信号，其中两个角甲基为单峰，位于δ0.86(3H,s,Me-18)和0.84(3H,s,Me-19)，另外一个为双峰，位于δ1.32(3H,d,J＝6.9Hz,Me-21)。在低场区给出两个末端双键上的质子信号δ5.33(1H，s)和5.04(1H，s)。在糖端基氢信号区给出三个糖端基氢信号δ4.88(1H,d,J＝7.8Hz)、4.89(1H,d,J＝7.8Hz)和5.21(1H,d,J＝7.9Hz)，说明该化合物为含有三个β-D-葡萄糖的甾体皂苷。
13C-NMR(126MHz，pyridine-d5)显示出39个碳信号，其中δ110.6为呋甾皂苷C-22特征信号，δ103.2、104.3和105.3为糖端基碳信号。最低场处147.5ppm的季碳信号及111.0ppm的亚甲基信号提示这两个碳是一个末端双键信号，分别归属为25位和27位。该化合物碳谱数据与已知化合物chamaedrosides E非常相似，只是F环发生变化，推测可能是化合物8的25位与27位碳形成末端双键的缘故，其二维图谱也证明了上述推测。综合以上信息，化合物8鉴定为26-O-β-D-glucopyranosyl-5β-furost-25(27)-en-3β,22α,26-triol-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranoside，为一未见文献报道的新化合物。通过1H-NMR、13C-NMR(DEPT)、HSQC、HMBC及1H-1H COSY谱可以对该化合物的碳及氢信号进行全面归属，化合物8的1H-NMR和13C-NMR数据见表6。化合物8的结构见表1。
化合物9的鉴定
(25R)-26-O-β-D-glucopyranosyl-5β-furost-1β,3α,22α,26-tetrol-3-O-β-D-glucopyranoside(化合物9):白色无定形粉末，红外谱图中显示强的多羟基吸收峰3420cm-1，对Anisaldehyde(A试剂)反应显黄色，对Ehrlish(E试剂)显粉红色，酸水解检出D-葡萄糖，提示该化合物为呋甾皂苷类化合物。HRESIMS(positive)给出准分子离子峰[M+H]+m/z 757.4398(calcd.for C39H65O14 757.4374)，提示其分子量为756，结合1H-NMR和13C-NMR(DEPT)可确定其分子式为C39H64O14。
在1H-NMR谱中，高场区给出甾体皂苷元上四个特征的甲基信号，其中两个角甲基为单峰，另外两个为双峰，分别位于δ0.90(3H,s,Me-18)、1.27(3H,s,Me-19)、1.36(3H,d,J＝6.9Hz,Me-21)和0.99(3H,d,J＝6.7Hz,Me-27)。在糖端基氢区给出两个糖端基氢信号δ4.82(1H,d,J＝7.8Hz)和5.04(1H,d,J＝7.7Hz)，提示该化合物为含有两个β-D-葡萄糖的呋甾皂苷。另外，由于27位甲基的化学位移小于1.00ppm且26位两个质子的化学位移之差(0.32ppm)小于0.48ppm，说明该化合物为25R呋甾皂苷。
13C-NMR(126MHz，pyridine-d5)显示出39个碳信号，其中δ111.0为呋甾皂苷C-22特征信号，δ103.0和105.3为糖端基碳信号。该化合物苷元部分与糖链部分的碳谱数据与化合物(25R)-5β-spirostan-1β,3α-diol-3-O-β-D-glucopyranoside碳谱数据比较，除了多出六个糖信号和F环有差别外，其余基本一致，提示该化合物为化合物(25R)-5β-spirostan-1β,3α-diol-3-O-β-D-glucopyranoside的F环开环后形成的产物。
在HMBC谱中，葡萄糖端基质子信号δ4.82(1H,d,J＝7.8Hz)与苷元C-26(δ75.6)相关，另一端基质子δ5.04(1H,d,J＝7.7Hz)与苷元C-3(δ74.8)相关，从而确定两个葡萄糖分别连接在化合物的C-26和C-3位。通过1H-NMR、13C-NMR(DEPT)、HSQC、HMBC及1H-1H COSY谱可以对该化合物的碳及氢信号进行全面归属。综合以上信息，化合物9鉴定为(25R)-26-O-β-D-glucopyranosyl-5β-furost-1β,3α,22α,26-tetrol-3-O-β-D-glucopyranoside。化合物9的1H-NMR和13C-NMR数据见表7。化合物9的结构见表1。
化合物10的鉴定
(25S)-26-O-β-D-glucopyranosyl-5β-furost-1β,3β,22α,26-tetrol-1-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-xylopyranoside(化合物10):白色无定形粉末，红外谱图中显示强的多羟基吸收峰3406cm-1，对Anisaldehyde(A试剂)反应显黄色，对Ehrlish(E试剂)显粉红色，酸水解检出D-葡萄糖、D-木糖和L-鼠李糖，提示该化合物为呋甾皂苷类化合物。HRESIMS(positive)给出准分子离子峰[M+H]+m/z873.4908(calcd.for C44H73O17873.4848)，提示其分子量为872，结合1H-NMR和13C-NMR(DEPT)可确定其分子式为C44H72O17。
在1H-NMR谱中，高场区给出五个特征的甲基信号，除去甾体皂苷元上四个甲基信号δ0.88(3H,s,Me-18)、1.32(3H,s,Me-19)、1.30(3H,d,J＝6.9Hz,Me-21)及1.02(3H,d,J＝6.7Hz,Me-27)外，在最低场处甲基信号δ1.73(3H,d,J＝6.1Hz)为鼠李糖甲基的特征信号，提示该化合物含有一分子鼠李糖。在糖端基氢区给出三个糖端基氢信号δ4.79(1H,overlapping)、5.07(1H,d,J＝7.2Hz)和6.57(1H,d,J＝1.1Hz)，结合酸水解结果，说明该化合物含有一分子鼠李糖，一分子葡萄糖和一分子木糖。另外，由于27位甲基的化学位移大于1.00ppm且26位两个质子的化学位移之差(0.60ppm)大于0.57ppm，说明该化合物为25S呋甾皂苷。
13C-NMR(126MHz，pyridine-d5)显示出44个碳信号，其中δ110.9为呋甾皂苷C-22特征信号，δ98.4、102.2和105.4为三个糖端基碳信号。该化合物苷元部分碳谱数据与文献报道的rhodeasapogenin碳谱数据相比，除了C-1位及F环有差别外，其余基本一致，提示该化合物为rhodeasapogenin的F环开环后形成的产物。与rhodeasapogenin相比，化合物10的C-1位向低场发生较大位移，而C-2位向高场位移，说明该化合物C-1位成苷。
在HMBC谱中，鼠李糖的端基氢δ6.57(1H,d,J＝1.1Hz)与木糖C-2(δ77.2)相关，而木糖的端基氢δ5.07(1H,d,J＝7.2Hz)与苷元C-1(δ76.2)相关，由此确定苷元1位的糖链为1-O-Xyl-(2-1)-Rha。葡萄糖的端基氢δ4.79(1H,overlapping)与苷元C-26位(δ75.6)相关，由此确定葡萄糖连接在苷元的26位。
综合以上信息，化合物10鉴定为(25S)-26-O-β-D-glucopyranosyl-5β-furost-1β,3β,22α,26-tetrol-1-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-xylopyranoside。通过1H-NMR、13C-NMR(DEPT)、HSQC、HMBC及1H-1H COSY谱可以对该化合物的碳及氢信号进行全面归属，化合物10的1H-NMR和13C-NMR数据见表8。化合物10的结构见表1。
表2本发明化合物1和化合物2的1H-NMR和13C-NMR谱数据(pyridine-d5)
表3本发明化合物3的1H-NMR和13C-NMR谱数据(pyridine-d5)
表4本发明化合物4和化合物5的1H-NMR和13C-NMR谱数据(pyridine-d5)
表5本发明化合物6和化合物7的1H-NMR和13C-NMR谱数据(pyridine-d5)
表6本发明化合物8的1H-NMR和13C-NMR谱数据(pyridine-d5)
表7本发明化合物9的1H-NMR和13C-NMR谱数据(pyridine-d5)
表8本发明化合物10的1H-NMR和13C-NMR谱数据(pyridine-d5)
实施例2抑瘤试验：
本发明化合物对人体2个瘤株的体外抑瘤活性实验，这2个瘤株为FaDu(人咽鳞癌细胞)、Detroit 562(人咽头癌胸水转移细胞)。顺铂作为阳性对照。
抑制肿瘤细胞增殖(MTT法)
将肿瘤细胞接种于96孔板中，培养24h后加入待测试样品，再培养48h后用MTT法测定样品对肿瘤细胞增殖的抑制率。细胞增殖抑制率按下述公式计算，并用CalcuSyn软件计算被测试样品的半数抑制浓度(IC50)。
细胞增殖抑制率＝(阴性对照组OD值平均值-样品组OD值平均值)÷(阴性对照组OD值平均值-空白对照组OD值平均值)×100％
实验结果见表9和图1。
表9本发明化合物对不同肿瘤细胞的抑制作用
从表9和图1的实验数据可知，化合物1和8对以上两种肿瘤细胞的增殖均具有很好的抑制作用(见表9)，其余化合物在浓度为50μM时对FaDu和Detroit 562这两种细胞也有不同程度的抑制作用(见图1)。
实施例3抗炎试验：
本发明化合物对体外抗炎活性实验，采用LPS(脂多糖)诱导的Raw 264.7(小鼠巨噬细胞)细胞，建立体外炎症模型。采用MTT和Griess实验，考察本发明化合物对经脂多糖诱导后的Raw 264.7细胞释放炎症介质NO的影响。抗炎药Indomethacin(吲哚美辛)作为阳性对照。
1)MTT实验
Raw 264.7细胞接种于96孔板中，培养24小时后，加入待测供试品，再培养24h后用MTT法测定样品对肿瘤细胞增殖的抑制率。细胞增殖抑制率按下述公式计算，并用CalcuSyn软件计算被测试样品的半数抑制浓度(IC50)。
细胞增殖抑制率＝(阴性对照组OD值平均值-样品组OD值平均值)÷(阴性对照组OD值平均值-空白对照组OD值平均值)×100％
2)Griess实验
Raw 264.7细胞接种于96孔板中，培养24小时后，加入待测供试品，再培养24h后，吸取各孔培养液50μL，加入50μL Griess A试剂和50μL Griess B试剂混匀，用酶标仪于546nm处测定OD值，按如下公式计算对NO产生的抑制率，并用CalcuSyn软件计算被测试样品的半数抑制浓度(IC50)。
NO抑制率＝(模型对照组OD值平均值-样品组OD值平均值)÷(模型对照组OD值平均值-阴性对照组OD值平均值)×100％
实验结果见表10和图2。
表10本发明化合物对Raw 264.7细胞释放炎症介质NO的抑制作用
从表10和图2的实验数据可知，化合物5和8具有很好的体外抗炎活性(见表10)，其他化合物在浓度为50μM时对LPS诱导的Raw 264.7细胞释放炎症介质NO也有不同程度的抑制作用(见图2)。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.呋甾皂苷类化合物，其结构式分别为：
化合物1：化合物2：
化合物3：化合物4：
化合物5：
化合物6：
化合物7：
化合物8：
化合物9：
化合物10：
2.权利要求1所述呋甾皂苷类化合物在制备防治癌症药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述癌症为咽鳞癌、咽头癌、鼻咽鳞癌、肝癌、慢性骨髓性白血病、肺腺癌。
4.权利要求1所述呋甾皂苷类化合物在制备抗炎药物中的应用。
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Address after: 510006 Guangdong City, Guangzhou province outside the University of East Ring Road, No. 280 Applicant after: GUANGDONG PHARMACEUTICAL University Address before: 510006 Guangdong City, Guangzhou province outside the University of East Ring Road, No. 280 Applicant before: Guangdong Pharmaceutical University |
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
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Granted publication date: 20171212 |