CN100509841C - 甾体皂苷类化合物及其在制备抗肿瘤药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明属中药制药领域，涉及式1的甾体皂苷类化合物及其在制备抗肿瘤药物中的新用途。本发明从百合科天门冬属植物小百部(Asparagus filicinus Buch.-Ham)中总皂苷部位提取活性物质甾体皂苷类化合物并通过体外抗肿瘤活性筛选试验证实其有显著抗肿瘤活性。所述化合物对人肺癌(A549)和乳腺癌(MCF-7)两种肿瘤细胞株的EC₅₀值分别为2.3和3.6μg/ml。

Description

甾体皂苷类化合物及其在制备抗肿瘤药物中的用途

技术领域

本发明属中药制药领域，涉及小百部中的甾体皂苷及其在制备抗肿瘤药物中的新用途。

背景技术

抗肿瘤药物研究多年来一直是世界药学研究的热点和重点。抗肿瘤化学药物因毒副作用大，而使其临床应用受到很大限制，因此近年来从天然来源中寻找新的具有抗肿瘤活性的药物受到人们越来越多的关注。国内外的学者从包括海洋生物在内的天然产物中分离得到大量的具有生物活性的单体化合物，为抗肿瘤药物的研究与开发提供了广阔的前景。百合科(Liliaceae)天门冬属(Asparagus L.)植物作为药用植物有着悠久的历史，《神农本草经》将天门冬列为上品，其后历代本草均有收载，现为常用中药之一。本属植物化学成分复杂，国内外已报道的同属其他植物中含有皂苷、多糖、黄酮以及氨基酸等成分，其中皂苷类为主要成分并具有多种生物活性，如抑菌抗病毒、抗炎、细胞毒、免疫促进等。

小百部为天门冬属(Asparagus L.)植物(Asparagus filicinus Buell.-Ham)的干燥根，味甘、微苦，性寒，用于润肺止咳。近年来对小百部的研究仅集中在化学成分的分离及结构鉴定上，从中分离得到了一些甾体皂苷类化合物，但是迄今为止尚未见关于这些化合物生物活性的报道。

发明内容

本发明的目的是提供新的抗肿瘤活性物质，具体涉及小百部中的甾体皂苷类化合物，特别涉及其中的化合物菝葜皂苷元-3-O-[β-D-吡喃木糖基(1→2)]-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)]-β-D-吡喃葡萄糖苷(称为：小百部皂苷甲)，菝葜皂苷元-3-O-[α-L-吡喃阿拉伯糖基(1→6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷(小百部皂苷乙)和小百部甙B。

本发明的进一步目的是提供上述小百部中的甾体皂苷类化合物在制备抗肿瘤药物中的用途。

本发明应用现代药理筛选方法，对植物药中抗肿瘤活性物质进行研究，从百合科天门冬属植物小百部(Asparagus filicinus Buch.-Ham)中总皂苷部位提取活性物质甾体皂苷类化合物并证实其有抗肿瘤活性。

本发明的活性甾体皂苷类化合物具有式I的化学结构：

其中，R₁＝β-D-Xylose，R₂＝α-L-Rhamnose，R₃＝H；或，

R₁＝H，R₂＝H，R₃＝α-L-Arabinose；或，

R₁＝H，R₂＝β-D-Xylose，R₃＝α-L-Arabinose。

上述的甾体皂苷类化合物，当R₁＝β-D-Xylose，R₂＝α-L-Rhamnose，R₃＝H时，化合物为菝葜皂苷元-3-O-[β-D-吡喃木糖基(1→2)]-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)]-β-D-吡喃葡萄糖苷(1)(称：小百部皂苷甲)；当R₁＝H，R₂＝H，R₃＝α-L-Arabinose时，化合物为菝葜皂苷元-3-O-[α-L-吡喃阿拉伯糖基(1→6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷(2)(称小百部皂苷乙)；当R₁＝H，R₂＝β-D-Xylose，R₃＝α-L-Arabinose时，化合物为小百部甙B(3)。

本发明所述的甾体皂苷类化合物通过下述方法制备：

取小百部根茎粗粉6kg，用乙醇室温冷浸(20L×3次)，合并提取液浓缩至无醇味，提取液加水稀释至2L，正丁醇萃取(2L×3次)，合并正丁醇萃取液浓缩至干即得总皂苷170g。总皂苷150g干法上样进行硅胶柱层析，以氯仿、氯仿-甲醇、甲醇梯度洗脱，所得流分以不同洗脱剂进行反复硅胶柱层析、MCI和RP-18柱层析，分离得到化合物小百部皂苷甲(1)、小百部皂苷乙(2)和小百部甙B(3)。

其中，小百部皂苷甲(菝葜皂苷元-3-O-[β-D-吡喃木糖基(1→2)]-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)]-β-D-吡喃葡萄糖苷)(1)：白色无定形粉末， ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{22}=-60.5$ (c＝0.20mg/m1，甲醇)；分子量：856；IR(KBr)ν_max：3442(OH)，2934(CH)，1449(OH)，1048(OH)，984，914，890，865cm^-1；ESI-MS：m/z 725[M+H-132]⁺，579[M+H-132-146]⁺，417[M+H-132-146-162]⁺；¹H(400MHz，in pyridine-d₅)和¹³CNMR(100MHz，in pyridine-d₅)数据，见表1和2。

其中，小百部皂苷乙(菝葜皂苷元-3-O-[α-L-阿拉伯吡喃糖基(1→6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷)(2)：白色无定形粉末，

(c＝0.22mg/ml，甲醇)；IR(KBr)ν_max 3417(OH)，2935(CH)，1450(OH)，1068(OH)，986，918，897，850cm^-1；¹H(400MHz，in pyridine-d₅)和¹³C NMR(100MHz，in pyridine-d₅)数据，见表1和2。

其中，小百部甙B(3)：白色无定形粉末，

(c＝1.37，甲醇-氯仿)；IR(KBr)ν_max：3440，2935，1440，985，920，895，850cm^-1；ESI-MS：m/z：881[M+K]⁺，843[M+H]⁺，711[M-132-H]⁺，579[M-132-132+H]⁺，417[M-132-132-162+H]⁺；¹HNMR(400MHz，in pyridine-d₅)数据：δ ppm：0.79(3H，s，18-Me)，0.82(3H，s，19-Me)，1.05(3H，d，J＝7.04，27-Me)，1.14(3H，d，J＝7.04，21-Me)，4.83(1H，d，J＝7.82，glu-H-1)，5.07(1H，d，J＝7.43，Ara-H-1)，5.52(1H，d，J＝7.83，Xyl-H-1)。¹³C NMR(100MHz，inpyridine-d₅)数据：δ ppm：δ 30.3(C-1)，27.4(C-2)，74.4(C-3)，30.8(C-4)，36.8(C-5)，26.8(C-6)，26.6(C-7)，35.4(C-8)，40.1(C-9)，35.1(C-10)，21.0(C-11)，40.1(C-12)，40.7(C-13)，56.3(C-14)，32.0(C-15)，81.2(C-16)，62.8(C-17)，16.5(C-18)，23.7(C-19)，42.3(C-20)，14.8(C-21)，109.6(C-22)，26.2(C-23)，26.1(C-24)，27.4(C-25)，64.9(C-26)，16.1(C-27)，102.8(Glu-C-1)，74.7(Glu-C-2)，76.2(Glu-C-3)，79.8(Glu-C-4)，74.9(Glu-C-5)，68.0(Glu-C-6)，105.0(Xyl-C-1)，74.4(Xyl-C-2)，78.4(Xyl-C-3)，70.9(Xyl-C-4)，67.3(Xyl-C-5)，105.6(Ara-C-1)，72.4(Ara-C-2)，74.4(Ara-C-3)，69.7(Ara-C-4)，67.2(Ara-C-5)。

上述甾体皂苷经体外SRB法抗肿瘤活性筛选试验，结果证实所述化合物对人肺癌(A549)和乳腺癌(MCF-7)两种肿瘤细胞株具有显著细胞毒活性。(表3)。其中，小百部皂苷甲活性最强，对A549和MCF-7两种肿瘤细胞株的EC₅₀值分别为2.3和3.0μg/ml。小百部皂苷乙对A549细胞株的细胞毒活性显著，EC₅₀值为2.4μg/ml，对MCF-7细胞株的活性，EC₅₀值为10.3μg/ml。小百部甙B对A549和MCF-7两种肿瘤细胞株显示中等强度的细胞毒活性，其EC₅₀值分别为7.6μg/ml和10.4μg/ml。

表1是化合物1和2的苷元部分¹H和¹³C NMR数据。

表2是化合物1和2的糖部分¹H和¹³C NMR数据。

表3是本发明甾体皂苷类化合物对A549(人肺癌)和MCF-7(乳腺癌)两种肿瘤细胞株体外细胞毒性实验结果(EC₅₀inμg/ml)。

附图说明：

图1是小百部总皂苷部位提取分离流程图。

具体实施方式

实施例1  制备总皂苷

取小百部根茎粗粉6kg，用乙醇室温冷浸(20L×3次)，合并提取液浓缩至无醇味，提取液加水稀释至2L，正丁醇萃取(2L×3次)，合并正丁醇萃取液浓缩至干即得总皂苷170g。取总皂苷150g干法上样进行硅胶柱层析，以氯仿、氯仿-甲醇、甲醇梯度洗脱，具体步骤如下：

1、氯仿-甲醇(7:3)洗脱所得流份，氯仿-甲醇-水(4:1:0.2)进行反复硅胶柱层析，再经RP-18柱(60～90％甲醇)得到白色无定形粉末20mg，即小百部皂苷甲(1)。采用波谱学和化学方法分析，其结构确定为菝葜皂苷元-3-O-[β-D-吡喃木糖基(1→2)]-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)]-β-D-吡喃葡萄糖苷。

2、氯仿-甲醇(7:3)洗脱所得流份，氯仿-甲醇-水(4:1:0.2)进行反复硅胶柱层析，再经MCI柱(70～90％甲醇)得到白色无定形粉末4mg，即小百部皂苷乙(2)。采用波谱学和化学方法分析，其结构确定为菝葜皂苷元-3-O-[α-L-吡喃阿拉伯糖基(1→6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷。

3、氯仿-甲醇(6:4)洗脱所得流份，氯仿-甲醇-水(7:3:0.5)进行反复硅胶柱层析，得到白色无定形粉末130mg，即小百部甙B(3)。

实施例2体外抗肿瘤试验(SRB法)

A549和MCF-7两种肿瘤细胞株在含25mM HEPES、0.2％(w/v)碳酸氢钠和100μg/ml卡那霉素的10％小牛血清RPMI1640培养液4ml的T-25烧瓶中，37℃，5％ CO₂的条件下培养。经胰蛋白酶消化后的细胞悬浮液加入96孔板中，细胞浓度为0.25-1×10⁴/孔。肿瘤细胞加入不同浓度的待测组分在37℃培养72小时后，用冰冷的50％三氯乙酸固定并用0.4％的(SRB)染色，待染料溶解后，562nm下测定吸收值。细胞半数生长抑制时的药物浓度EC₅₀按照量效数据进行换算。每个实验重复三次，吸收值差异小于5％，EC₅₀差异小于30％。

本发明实验采用的试剂、细胞株均为本领域公知技术，可市购。

表1

表2

表3

Claims (7)

1、式1的甾体皂苷类化合物，

其中，R₁＝β-D-Xylose，R₂＝α-L-rhamnose，R₃＝H；或，

R₁＝H，R₂＝H，R₃＝α-L-Arabinose。

2、按权利要求1所述的甾体皂苷类化合物，其特征是所述的化合物是菝葜皂苷元-3-O-[β-D-吡喃木糖基(1→2)]-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)]-β-D-吡喃葡萄糖苷。

3、按权利要求1所述的甾体皂苷类化合物，其特征是所述的化合物是菝葜皂苷元-3-O-[α-L-吡喃阿拉伯糖基(1→6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷。

4、权利要求1所述的甾体皂苷类化合物在制备抗肿瘤药物中的用途。

5、按权利要求4的用途，其中所述的肿瘤是肺癌。

6、按权利要求4的用途，其中所述的肿瘤是乳腺癌。

7、按权利要求1所述的甾体皂苷类化合物的制备方法，其特征是通过下述步骤：

①取小百部根茎粗粉，用50％乙醇室温冷浸，合并提取液浓缩至无醇味，提取液加水稀释，正丁醇萃取，合并正丁醇萃取液浓缩至干即得总皂苷；

②总皂苷干法上样进行硅胶柱层析，以氯仿、氯仿-甲醇、甲醇梯度洗脱，所得流分以不同洗脱剂进行反复硅胶柱层析、MCI和RP-18柱层析，分离得到所述的化合物。