JP4023539B2 - 有効物質の抽出方法および精製方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、疎水基含有水溶性有機化合物を含む水溶液（例えば、動物または植物由来の抽出物ならびに酵素反応液）から疎水基含有水溶性有機化合物を高純度でかつ高収率で抽出する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生薬抽出物に代表されるように、さまざまな生理活性を持った天然化合物が数多く知られている。これらの天然化合物は、生理活性物質とも呼ばれる。多くの生理活性物質は、一般に、生理活性物質を含む材料と水、お湯または低濃度のアルコール水溶液とを用いて抽出操作を行って抽出液を得て、その後、抽出液を濃縮し、濃縮された抽出液をカラムクロマトグラフィーにかけることによって精製される。しかしながら、この精製方法によって生理活性物質を大量に生産するためには、大きなカラムおよびそれに付随する設備が必要である。また、小さいカラムでは効率が非常に悪い。そのため、精製された生理活性物質は非常に高価である。
【０００３】
生理活性物質を溶媒抽出方法によって精製することも試みられている。しかし、酢酸エチル、ブタノール、クロロホルム等の本来水と混ざらない有機溶媒を水溶液に添加し、攪拌し、静置して水相と有機溶媒相との２相を得たのち、有機溶媒相に移動した生理活性物質を回収する方法は、安全性の問題上食品に使用することはできない。生理活性物質を食品以外の用途に用いる場合であっても、有機溶媒相にあまり移動しないため、有機溶媒による抽出が非効率的である生理活性物質も存在する。エタノール、アセトン等の、食品に使用できる有機溶媒は水と混ざってしまうので、これらの有機溶媒を用いて生理活性物質を水溶液から抽出および精製することはできない。
【０００４】
オレンジ果汁に含まれる代表的なフラボノイド類の一つにヘスペリジンがある。ヘスペリジンを代表とするフラボノイド類は、例えば、以下のような生理作用を有することが知られている。ヘスペリジンおよびルチンは、以前はビタミンＰと呼ばれ、血圧を下げる作用が古くから知られている（神谷真太郎、新ビタミン学、（日本ビタミン学会）１９６９、ｐ４３９）。ヘスペリジンはまた、以下の生理作用を有することも報告されている：抗炎症作用、抗痛み作用（Ｅ，Ｍ．Ｇａｌａｔｉ ｅｔ ａｌ．， Ｉｌ Ｆａｒｍａｃｏ，４９，７０９−７１２（１９９４））、抗アレルギー作用（松田英秋ｅｔ ａｌ．；薬学雑誌、１１１、１９３−１９８（１９９１）、Ｊ．Ａ．Ｄａ Ｓｉｌｖａ Ｅｍｉｍ ｅｔ ａｌ．；Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，４６，１１８−７１２（１９９４））、ＬＤＬ−コレステロールを減少させ血中コレステロール値を改善する作用（Ｍ．Ｔ．Ｍｏｎｆｏｒｔｅ ｅｔ ａｌ．；Ｉｌ Ｆａｒｍａｃｏ，５０，５９５−５９９（１９９５））、抗癌作用（Ｔ．Ｔａｎａｋａ，ｅｔ ａｌ．；Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５４，４６５３−４６５９（１９９４）、Ｔ．Ｔａｎａｋａ，ｅｔ ａｌ．；Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５７，２４６−２５２（１９９７）、Ｔ．Ｔａｎａｋａ，ｅｔ ａｌ．；Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，１８，７６１−７６９（１９９７）、Ｔ．Ｔａｎａｋａ，ｅｔ ａｌ．；Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，１８，９５７−９６５（１９９７））。さらに、最近の研究では、ヘスペリジンは前駆脂肪細胞の分化を促進し、糖尿病などの症状を改善する作用も有することが期待されている。ディオスミンは強い抗酸化活性を有する。
【０００５】
ディオスミンおよびヘスペリジンを含有する薬剤は、静脈不全、痔疾などの治療薬として利用されている（Ｃ．Ｌａｂｒｉｄ；Ａｎｇｉｏｌｏｇｙ，４５，５２４−５３０（１９９４））。さらに、ヘスペリジン単独、ディオスミン単独およびヘスペリジンとディオスミンとの混合物が口腔ガン、食道ガン、大腸ガンなどを抑制することも報告されている（Ｔ．Ｔａｎａｋａ，ｅｔ ａｌ．；Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５４，４６５３−４６５９（１９９４）、Ｔ．Ｔａｎａｋａ，ｅｔ ａｌ．；Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５７，２４６−２５２（１９９７）、Ｔ．Ｔａｎａｋａ，ｅｔ ａｌ．；Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，１８， ７６１−７６９（１９９７）、Ｔ．Ｔａｎａｋａ，ｅｔ ａｌ．；Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，１８，９５７−９６５（１９９７））。
【０００６】
ナリンジンおよびネオヘスペリジンは柑橘類の苦味物質として知られており、苦味の付与を目的に食品および飲料に用いられている。
【０００７】
さらに最近では、イソフラボンが骨密度の向上に有効であること、乳ガンの発生を抑制することなどが明らかにされてきている（戸田ｅｔ ａｌ．；ＦＯＯＤＳ ａｎｄ ＩＮＧＲＥＤＩＥＮＴＳ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＪＡＰＡＮ，Ｎｏ．１７２，８３−８９（１９９７））。
【０００８】
ヘスペリジンおよびルチンは本来アセトンに溶解しない。
【０００９】
一方、ヘスペリジン、ナリンジン、ネオヘスペリジン、ルチンなどのフラボノイド類は水に難溶である。この難溶性という欠点を克服する目的で、これらの難溶性化合物を効率よく可溶化する試みがなされている。例えば、ヘスペリジン、ナリンジン、ネオヘスペリジン、ルチンなどのフラボノイド類を酵素的に配糖化し、溶解性を高める方法が知られている（日本国特許公開平７−１０７９７２）。
【００１０】
上記フラボノイド以外でもカテキン、コーヒー酸、コウジ酸、ハイドロキノン、カテコール、レゾルシノール、プロトカテキュー酸、没食子酸、バニリン、ダイゼイン、ゲニステイン、α−レゾルシル酸およびフロログルシノールを同様の目的の為に酵素的に配糖化し、溶解性を高める方法が知られている（日本国特許公告平７−３６７５８およびＴ．Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ著、Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．，７８（１９９４）ｐ３７）。
【００１１】
しかしながら、配糖体自身の水溶性が向上しているため水と混ざらない溶媒では効率的に抽出できなかったり、配糖化を行った酵素反応液から生成した配糖体を精製するためには、安全性上の問題から、吸着クロマトグラフィーなどのカラムクロマトグラフィーを行う必要がある。
【００１２】
従来の精製法では、部分精製されたフラボノイド類、カテキン類、フェノール類およびこれらの配糖体を天然の材料から得るためには、天然の材料およびアルカリ性水溶液、有機溶媒、熱水などを用いて抽出を行った後、抽出液をカラムクロマトグラフィーで精製する方法がとられている。しかし、これらの物質を高収率で安価に大量に得るためには食品に使用できる安全な有機溶媒による抽出を行い精製する必要がある。しかしながら、食品に利用できるアセトンは水と混ざってしまうので、アセトンでこれらの物質を抽出することはできない。また食品および薬品の分野で有効な生理活性物質の多くは、水、エタノール、アセトン等の極性の高い溶媒に溶けやすく、極性の低い溶媒に溶けにくい性質を持っている。そのため、極性の低い溶媒では効率的に抽出することができない。
【００１３】
【特許文献１】
特開平７−１０７９７２号公報
【特許文献２】
特公平７−３６７５８号公報
【特許文献３】
特開平８−８０１７７号公報
【特許文献４】
特開平６−２７７０５３号公報
【００１４】
【非特許文献１】
神谷真太郎，「新ビタミン学」，（日本ビタミン学会）１９６９年，ｐ．４３９
【非特許文献２】
Ｅ，Ｍ．Ｇａｌａｔｉ ｅｔ ａｌ．，「Ｉｌ Ｆａｒｍａｃｏ」，１９９４年，４９，ｐ．７０９−７１２
【非特許文献３】
松田英秋ｅｔ ａｌ．，「薬学雑誌」、１９９１年，１１１，ｐ．１９３−１９８
【非特許文献４】
Ｊ．Ａ．Ｄａ Ｓｉｌｖａ Ｅｍｉｍ ｅｔ ａｌ．，「Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．」，１９９４年，４６，ｐ．１１８−７１２
【非特許文献５】
Ｍ．Ｔ．Ｍｏｎｆｏｒｔｅ ｅｔ ａｌ．，「Ｉｌ Ｆａｒｍａｃｏ」，１９９５年，５０，５９５−５９９
【非特許文献６】
Ｔ．Ｔａｎａｋａ，ｅｔ ａｌ．，「Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」，１９９４年，５４，ｐ．４６５３−４６５９
【非特許文献７】
Ｔ．Ｔａｎａｋａ，ｅｔ ａｌ．，「Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」，１９９７年，５７，ｐ．２４６−２５２
【非特許文献８】
Ｔ．Ｔａｎａｋａ，ｅｔ ａｌ．，「Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ」，１９９７，１８，ｐ．７６１−７６９
【非特許文献９】
Ｔ．Ｔａｎａｋａ，ｅｔ ａｌ．，「Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ」，１９９７年，１８，ｐ．９５７−９６５
【非特許文献１０】
Ｃ．Ｌａｂｒｉｄ，「Ａｎｇｉｏｌｏｇｙ」，１９９４年，４５，ｐ．５２４−５３０
【非特許文献１１】
戸田ｅｔ ａｌ．，「ＦＯＯＤＳ ＡＮＤ ＩＮＧＲＥＤＩＥＮＴＳＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＪＡＰＡＮ」，１９９７年，Ｎｏ．１７２，ｐ．８３−８９
【非特許文献１２】
Ｔ．Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，「Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．」，１９９４年，７８，ｐ．３７
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】
生理活性物質を簡便かつ安価に精製するための方法を提供すること。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは鋭意研究を行った結果、本来水またはお湯に混ぜた際に水相と分離しにくい有機溶媒であっても、生理活性物質を含有する水溶液中に糖質などの保水性の性質をもつ物質が存在することにより、この水溶液と有機溶媒とを混合し、攪拌した後に水相と有機相とを容易に分離できることを見出し、さらに有機相に生理活性物質が移動することを見出した。本発明者らはさらに、塩化ナトリウムおよびクエン酸ナトリウムなどの塩、または有機酸をこの水溶液に添加して、この水溶液のイオン強度を上げることにより、糖質が存在しても水相から分離されない、あるいは分離されにくい有機溶媒を用いた場合であっても水相から分離され、生理活性物質を有機溶媒相に効率的に移動させることができることを見出した。本発明者らは、これらの知見に基づいて本発明を完成させた。
【００１７】
本発明の方法は、疎水基含有水溶性有機化合物の抽出方法であって、該疎水基含有水溶性有機化合物および糖質を含有する水溶液と、極性有機溶媒とを接触させて、水相と有機相とを得、該疎水基含有水溶性有機化合物を該有機相に移動させる工程を包含する。
【００１８】
１つの実施形態では、上記水溶液中の糖質の濃度は、該水溶液１００ｍｌあたり１２ｇ以上であり得る。
【００１９】
１つの実施形態では、上記疎水基含有水溶性有機化合物は、水溶性芳香族化合物であり得る。
【００２０】
１つの実施形態では、上記疎水基含有水溶性有機化合物は、フェノール誘導体およびそれらの配糖体からなる群より選択され得る。
【００２１】
１つの実施形態では、上記疎水基含有水溶性有機化合物は、ハイドロキノン配糖体、カテキン、サリシン、ヘスペリジン、ヘスペリジン配糖体、コーヒー酸、サリシルアルコールおよびエラジタンニンからなる群より選択され得る。
【００２２】
１つの実施形態では、上記水溶液は相分離補助剤をさらに含有し得る。
【００２３】
１つの実施形態では、上記相分離補助剤は、塩または有機酸であり得る。
【００２４】
１つの実施形態では、上記相分離補助剤は、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、硫酸マグネシウムおよび硫酸アンモニウムからなる群より選択され得る。
【００２５】
１つの実施形態では、上記極性有機溶媒は、テトラヒドロフランまたはアセトニトリルであり得る。
【００２６】
１つの実施形態では、上記極性有機溶媒は、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、アセトンまたはイソプロピルアルコールであり得る。
【００２７】
１つの実施形態では、上記疎水基含有水溶性有機化合物は、酵素反応溶液に由来し得る。
【００２８】
１つの実施形態では、上記酵素反応溶液は、配糖化反応溶液であり得る。
【００２９】
１つの実施形態では、上記配糖化反応溶液は、ヘスペリジンまたはハイドロキノンの配糖化反応溶液であり得る。
【００３０】
１つの実施形態では、上記疎水基含有水溶性有機化合物は、動物または植物から選択される生物に由来し得る。
【００３１】
１つの実施形態では、上記疎水基含有水溶性有機化合物は、果汁に由来し得る。
【００３２】
１つの実施形態では、上記水溶液は、上記疎水基含有水溶性有機化合物および糖質を含有する酵素反応溶液を濃縮することにより調製され得る。
【００３３】
１つの実施形態では、上記酵素反応溶液は、配糖化反応溶液であり得る。
【００３４】
１つの実施形態では、上記配糖化反応溶液は、ヘスペリジンまたはハイドロキノンの配糖化反応溶液であり得る。
【００３５】
１つの実施形態では、上記水溶液は、上記疎水基含有水溶性有機化合物および糖質を含有する生物抽出物を濃縮または希釈することにより調製され得、ここで該生物が動物または植物であり得る。
【００３６】
１つの実施形態では、上記水溶液は、果汁を濃縮することにより調製され得る。
【００３７】
１つの実施形態では、上記水溶液は、上記疎水基含有水溶性有機化合物および糖質を含有する酵素反応溶液またはその濃縮液に上記相分離補助剤を添加することにより調製され得る。
【００３８】
１つの実施形態では、上記酵素反応溶液は、配糖化反応溶液であり得る。
【００３９】
１つの実施形態では、上記配糖化反応溶液は、ヘスペリジンまたはハイドロキノンの配糖化反応溶液であり得る。
【００４０】
１つの実施形態では、上記水溶液は、上記疎水基含有水溶性有機化合物および糖質を含有する生物抽出物またはそれらの濃縮物もしくは希釈物に上記相分離補助剤を添加することにより調製され得、ここで該生物が動物または植物であり得る。
【００４１】
１つの実施形態では、上記水溶液は、果汁またはその濃縮物に上記相分離補助剤を添加することにより調製され得る。
【００４２】
本発明の精製方法は、フェノール誘導体配糖体の精製方法であって、フェノール誘導体、フェノール誘導体配糖体および糖質を含有する第１の水溶液と、極性有機溶媒とを接触させて、第１の水相と少量の水を含む有機相とを得、該フェノール誘導体およびフェノール誘導体配糖体を該有機相に移動させる工程；該少量の水を含む有機相を分取する工程；該少量の水を含む有機相から該極性有機溶媒を除去して、該フェノール誘導体およびフェノール誘導体配糖体を含有する第２の水溶液を得る工程；該第２の水溶液と酢酸エチルとを接触させて、第２の水相と酢酸エチル相とを得、該フェノール誘導体を該酢酸エチル相に移動させる工程；該第２の水相を分取する工程；および該第２の水相を濃縮し、そして冷却することにより、該フェノール誘導体配糖体を沈殿させる工程を包含する。
【００４３】
１つの実施形態では、上記フェノール誘導体およびフェノール誘導体配糖体は、該フェノール誘導体の配糖化酵素反応溶液に由来し得る。
【００４４】
１つの実施形態では、上記配糖化反応溶液は、ヘスペリジンまたはハイドロキノンの配糖化反応溶液であり得る。
【００４５】
１つの実施形態では、上記第１の水溶液は、相分離補助剤をさらに含有し得る。
【００４６】
１つの実施形態では、上記配糖化反応溶液は、ヘスペリジンまたはハイドロキノンの配糖化反応溶液であり得る。
【００４７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。本明細書において、特にことわらない限り、濃度は、溶液１００立方センチメートルあたりのグラム数で表される。例えば、「１０％塩化ナトリウム水溶液」とは、溶液１００立方センチメートル当たり１０ｇの塩化ナトリウムが溶解している塩化ナトリウム水溶液をいう。
【００４８】
本発明の方法は、疎水基含有水溶性有機化合物の抽出方法である。本発明の方法は、疎水基含有水溶性有機化合物および糖質を含有する水溶液と、極性有機溶媒とを接触させて、水相と有機相とを得、疎水基含有水溶性有機化合物を有機相に移動させる工程を包含する。
【００４９】
（１）疎水基含有水溶性有機化合物
本明細書中では、「疎水基含有水溶性有機化合物」とは、疎水基を含有し、水に溶ける、有機化合物をいう。
【００５０】
「水溶性」化合物とは、本明細書中では、２０℃の水１リットルに０．０１ｇ以上溶解し得る化合物をいう。疎水基含有水溶性有機化合物は、２０℃の水１リットルに好ましくは０．１ｇ以上、より好ましくは１ｇ以上、さらに好ましくは５ｇ以上、最も好ましくは１０ｇ以上溶解する。溶解度に上限は特にないが、好ましくは２０℃の水１リットルに３００ｇ以下である。より好ましくは溶解度は２０℃の水１リットルに１００ｇ以下である。
【００５１】
疎水基は、好ましくは炭素原子を３個以上含む疎水基であり、より好ましくは芳香族残基である。疎水基含有水溶性有機化合物の例としては、フラボノイド類、イソフラボン類、フェノール性化合物、フラボノイド配糖体、イソフラボン配糖体、フェノール性化合物配糖体、ハイドロキノン配糖体、アントラセン配糖体、カルコン配糖体などの水溶性芳香族化合物、テルペン配糖体、ステロイド配糖体、トリテルペノイド配糖体、アルカロイド配糖体、およびＣ−配糖体が挙げられる。疎水基含有水溶性有機化合物は、好ましくは水溶性芳香族化合物である。
【００５２】
本明細書中では、「水溶性芳香族化合物」とは、水に溶ける化合物であって、芳香族基を有する化合物をいう。
【００５３】
水溶性芳香族化合物は、好ましくはフェノール誘導体およびそれらの配糖体からなる群より選択される。
【００５４】
「フェノール誘導体」とは、フェノール骨格（すなわち、ベンゼン環）またはフラボノイド骨格を含む化合物であって、フェノール骨格またはフラボノイド骨格に結合している水酸基を有する化合物、フェノールおよびコウジ酸をいう。フェノール誘導体の例としては、単一のフェノール骨格またはフラボノイド骨格上に１つのフェノール性水酸基を有する化合物、および単一のフェノール骨格またはフラボノイド骨格上に２つ以上のフェノール性水酸基を有する化合物が挙げられる。以下、本明細書中では便宜上、１つのフェノール性水酸基を単一のフェノール骨格またはフラボノイド骨格上に有する化合物をモノフェノール系（ｍｏｎｏ−ｐｈｅｎｏｌ ｔｙｐｅ）化合物と呼び、２つ以上のフェノール性水酸基を単一のフェノール骨格またはフラボノイド骨格上に有する化合物をポリフェノール系（ｐｏｌｙ−ｐｈｅｎｏｌ ｔｙｐｅ）化合物と呼ぶ。
【００５５】
２つのフェノール性水酸基を単一のフェノール骨格またはフラボノイド骨格上に有する化合物をジフェノール化合物と呼ぶ。
【００５６】
フェノール性水酸基を有するフェノール誘導体配糖体は、フェノール誘導体に含まれる。
【００５７】
単一のフェノール骨格またはフラボノイド骨格上に１つのフェノール性水酸基を有するモノフェノール系化合物の例としては、フェノール、サリシルアルコール、コウジ酸、ジメトキシフェノール、アセトアミノフェン、バニリン、およびダイゼインが挙げられる。
【００５８】
モノフェノール化合物の例としてはまた、モノフェノール系フラボノイド系化合物が挙げられる。モノフェノール系フラボノイド系化合物の例としては、モノフェノール系フラボン系化合物、モノフェノール系イソフラボン系化合物、モノフェノール系フラボノール系化合物、モノフェノール系フラバノン系化合物、モノフェノール系フラバノノール系化合物、モノフェノール系カテキン系化合物、モノフェノール系オーロン系化合物、モノフェノール系カルコン系化合物およびモノフェノール系ジヒドロカルコン系化合物が挙げられる。
【００５９】
ジメトキシフェノールの例としては、２，３−ジメトキシフェノール、２，４−ジメトキシフェノール、２，５−ジメトキシフェノール、２，６−ジメトキシフェノール、３，４−ジメトキシフェノールおよび３，５−ジメトキシフェノールが挙げられる。３，４−ジメトキシフェノールおよび３，５−ジメトキシフェノールが好ましい。
【００６０】
単一のフェノール骨格またはフラボノイド骨格上に２つ以上のフェノール性水酸基を有するポリフェノール系化合物の例としては、ハイドロキノン、ヘスペレチン、エピガロカテキン、エピカテキンガレート、アントシアニジン系化合物、アントシアニン系化合物、コーヒー酸、カテコール、レゾルシノール、プロトカテキュー酸、没食子酸、ゲニステイン、β‐レゾルシル酸、およびフロログルシノールが挙げられる。
【００６１】
ジフェノール化合物の例としてはまた、ジフェノール系フラボノイド系化合物が挙げられる。ジフェノール系フラボノイド系化合物の例としては、ジフェノール系フラボン系化合物、ジフェノール系イソフラボン系化合物、ジフェノール系フラボノール系化合物、ジフェノール系フラバノン系化合物、ジフェノール系フラバノノール系化合物、ジフェノール系カテキン系化合物、ジフェノール系オーロン系化合物、ジフェノール系カルコン系化合物およびジフェノール系ジヒドロカルコン系化合物が挙げられる。
【００６２】
レゾルシル酸の例としては、α−レゾルシル酸、β−レゾルシル酸、およびγ−レゾルシル酸が挙げられる。本発明では、β−レゾルシル酸が好ましい。
【００６３】
本明細書中では、「フェノール誘導体配糖体」とは、フェノール誘導体部分と、１以上の糖部分とがグリコシド結合によって結ばれた物質である。フェノール誘導体配糖体は、ハイドロキノン−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシド、サリシン、コーヒー酸−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシド、３，４−ジメトキシフェノール−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシド、カテキン−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシドのようなモノグルコピラノシドであってもよいし、上記のモノグルコピラノシドにさらに糖部分が結合したジグルコピラノシド（例えば、ヘスペリジン誘導体）、トリグルコピラノシドなどであってもよい。
【００６４】
本明細書中では、配糖体とは、アグリコンと１以上の糖部分とがグリコシド結合によって結ばれた物質である。糖部分の重合度は、好ましくは１〜１０であり、より好ましくは１〜５であり、さらに好ましくは１〜３である。糖部分は、単糖部分であってもよく、２糖部分であってもよい。本明細書中では、グルコシドは配糖体の定義に含まれる。グルコシドは、１以上のグルコース部分がアグリコンに結合した配糖体である。
【００６５】
疎水基含有水溶性有機化合物は、好ましくは、サリシン、コニフェリン、アルブチン、センノシド、ステビオサイド、ルブソサイド、ルチン、ヘスペリジン、ナリンジン、ダイゼイン、ゲニスチン、バルバロイン、バニリン、サポニン、ベルベリン、ケンフェロール、バイカリン、カピラリン、カテキン、コリダリン、エスクレチン、エピカテキン、ジンゲロール、グリチルリチン、ディオスミン、ネオヘスペリジン、コーヒー酸、サリシルアルコール、エラジタンニンおよびハイドロキノンからなる群より選択される。疎水基含有水溶性有機化合物は、より好ましくは、ハイドロキノン配糖体、カテキン、サリシン、ヘスペリジン、ヘスペリジン配糖体、コーヒー酸、サリシルアルコールおよびエラジタンニンからなる群より選択される。
【００６６】
疎水基含有水溶性有機化合物は、水溶液中に任意の濃度で存在し得る。疎水基含有水溶性有機化合物の濃度は、好ましくは０．０１％〜５０％、より好ましくは０．１％〜４０％、さらに好ましくは０．５％〜３０％であり、さらに好ましくは１％〜２０％であり、最も好ましくは５％〜１５％である。水溶液中に存在する疎水基含有水溶性有機化合物の濃度が低すぎると、精製の効率が悪い場合がある。水溶液中に存在する疎水基含有水溶性有機化合物の濃度が高すぎると、疎水基含有水溶性有機化合物が沈殿する場合がある。疎水基含有水溶性有機化合物が沈殿しない濃度が好ましい。
【００６７】
疎水基含有水溶性有機化合物は、疎水基含有水溶性有機化合物を含有する酵素反応溶液に由来し得る。本明細書において酵素反応溶液とは、任意の出発物質を酵素反応に供することにより得られる溶液をいう。このような酵素反応溶液の例としては、疎水基含有水溶性有機化合物の配糖化反応溶液、加水分解反応溶液、転移反応溶液および縮合反応溶液が挙げられる。酵素反応溶液は好ましくは、糖質を含む。酵素反応溶液は通常、反応が進行して、反応生成物が産生された後の反応溶液である。
【００６８】
配糖化反応の例としては、代表的には、サイクロデキストリングルカノトランスフェラーゼによって触媒される、糖転移受容体に対する糖転移反応がある。このような糖転移受容体の例としては、糖を構造中に含むフラボノイド、構造中に糖を含まないフラボノイド、フェノール化合物およびフェノール性化合物配糖体が挙げられる。代表的な糖転移受容体の例としては、ヘスペリジン、ナリンジン、ネオヘスペリジンおよびルチンが挙げられる。
【００６９】
配糖化反応の別の例は、転移型アミラーゼによって触媒される、糖転移受容体に対する糖転移反応がある。このような糖転移受容体の例としては、カテキン、コーヒー酸、コウジ酸、ハイドロキノン、カテコール、レゾルシノール、プロトカテキュー酸、没食子酸、バニリン、ダイゼイン、ゲニステイン、α−レゾルシル酸およびフロログルシノールが挙げられる。
【００７０】
配糖化反応溶液は、好ましくはヘスペリジンまたはハイドロキノンの配糖化反応溶液である。
【００７１】
酵素反応を触媒する酵素の例としては、サイクロデキストリングルカノトランスフェラーゼおよび転移型アミラーゼ以外に、α−アミラーゼ、プルラナーゼ、アミロマルターゼ、Ｄ−酵素、ネオプルラナーゼ、サイクロデキストリナーゼ、α−グルコシダーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼおよびβ−ガラクトシダーゼが挙げられる。
【００７２】
疎水基含有水溶性有機化合物を含有する酵素反応溶液は、当業者に公知の方法によって設計および入手され得る。
【００７３】
疎水基含有水溶性有機化合物はまた、疎水基含有水溶性有機化合物を含有する任意の天然材料に由来し得る。疎水基含有水溶性有機化合物は例えば、生物（例えば、動物または植物）に由来し得る。あるいは、動物抽出物または植物抽出物を用いることもできる。動物抽出物とは、動物から抽出される任意の物質をいい、植物抽出物とは、植物から抽出される任意の物質をいう。例えば、植物の葉、茎、根、花、実などから得られる任意の疎水基含有水溶性有機化合物が使用可能である。植物材料の例としては、大豆、大豆加工品、ナマコ、五倍子、黄ごん、アロエ、地黄、薬用人参、芍薬、クチナシ、甘草、柴胡、大黄、ドクダミ、クマコケモモ、茶、甜茶および柑橘類（例えば、オレンジの実）が挙げられる。また、動物の体内に存在する任意の疎水基含有水溶性有機化合物が使用可能である。
【００７４】
（２）糖質
本明細書中では、糖質とは、Ｃｎ（Ｈ２Ｏ）ｍという一般式を有する化合物をいう。糖質は、構成要素である糖単位の数によって単糖、オリゴ糖、および多糖に分けられる。本発明では、単糖およびオリゴ糖が好ましい。本発明では、水に溶解する糖質または水に溶解しないが保水性を有する糖質が好ましい。
【００７５】
単糖の例としては、Ｄ−グルコース、ガラクトース、フルクトース、アラビノース、キシロース、ラムノースが挙げられる。単糖は、Ｄ−グルコースであることが好ましい。
【００７６】
オリゴ糖とは、本明細書中では、２〜１０個の単糖が脱水縮合して生じた物質をいう。オリゴ糖は、好ましくは２〜９個の糖単位、より好ましくは２〜８個の糖単位、さらに好ましくは２〜７個の糖単位を有する。オリゴ糖の例としては、スクロース、ラクトース、マルトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、ラクトオリゴ糖およびフルクトオリゴ糖が挙げられる。マルトオリゴ糖の例としては、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース、マルトオクタオース、マルトノナオースおよびマルトデカオースが挙げられる。オリゴ糖は、直鎖状のオリゴ糖であってもよいし、分枝状のオリゴ糖であってもよい。オリゴ糖は、その分子内に、環状部分を有し得る。
【００７７】
多糖とは、本明細書中では、１１個以上の単糖が脱水縮合して生じた物質をいう。多糖は、好ましくは少なくとも１つのα−１，４結合を有する。多糖の例としては、デキストリン、アミロース、アミロペクチン、デンプン、デキストランおよびセルロースが挙げられる。
【００７８】
デキストリンとは、デンプンを化学的または酵素的方法で低分子化した物質をいう。デキストリンの例としては、ブリティシュガム、黄色デキストリン、白色デキストリン、パインデクス（松谷化学工業株式会社）、サンデック（三和澱粉株式会社）、テトラップ（林原商事株式会社）が挙げられる。
【００７９】
アミロースとは、α−１，４結合によって連結されたグルコース単位から構成される直鎖分子である。アミロースは、天然のデンプン中に含まれる。
【００８０】
アミロペクチンとは、α−１，４結合によって連結されたグルコース単位に、α−１，６結合でグルコース単位が連結された、分枝状分子である。アミロペクチンは天然のデンプン中に含まれる。アミロペクチンとしては、例えば、アミロペクチン１００％からなるワキシーコーンスターチが用いられ得る。
【００８１】
デンプンは、アミロースとアミロペクチンとの混合物である。デンプンとしては、通常市販されているデンプンであればどのようなデンプンでも用いられ得る。デンプンに含まれるアミロースとアミロペクチンとの比率は、デンプンを生産する植物の種類によって異なる。モチゴメ、モチトウモロコシなどに含まれるデンプンは、そのほとんどがアミロペクチンである。デンプンは、天然のデンプン、デンプン分解物および化工デンプンに区分される。
【００８２】
天然のデンプンは、原料により、いも類デンプンおよび穀類デンプンに分けられる。いも類デンプンの例としては、馬鈴薯デンプン、タピオカデンプン、甘藷デンプン、くずデンプン、およびわらびデンプンなどが挙げられる。穀類デンプンの例としては、コーンスターチ、小麦デンプン、および米デンプンなどが挙げられる。
【００８３】
化工デンプンは、天然のデンプンに加水分解、エステル化、またはα化などの処理を施して、より利用しやすい性質を持たせたデンプンである。糊化開始温度、糊の粘度、糊の透明度、老化安定性などを様々な組み合わせで有する幅広い種類の化工デンプンが入手可能である。化工デンプンの種類には種々ある。このようなデンプンの例は、デンプンの糊化温度以下においてデンプン粒子を酸に浸漬することにより得られる、デンプン分子は切断するが、デンプン粒子は破壊していないデンプンである。
【００８４】
デンプン分解物は、デンプンに酵素処理または加水分解などの処理を施して得られる、処理前よりも分子量が小さいオリゴ糖もしくは多糖である。デンプン分解物の例としては、デンプン枝切り酵素分解物、デンプンホスホリラーゼ分解物およびデンプン部分加水分解物が挙げられる。
【００８５】
デンプン枝切り酵素分解物は、デンプンに枝切り酵素を作用させることによって得られる。枝切り酵素の作用時間を種々に変更することによって、任意の程度に分岐部分（すなわち、α−１，６−グルコシド結合）が切断されたデンプン枝切り酵素分解物が得られ得る。デンプン枝切り酵素分解物の例としては、糖単位数４〜１００００のうちα−１，６−グルコシド結合を１個〜２０個有する分解物、糖単位数３〜５００のα−１，６−グルコシド結合を全く有さない分解物、マルトオリゴ糖およびアミロースが挙げられる。デンプン枝切り酵素分解物の場合、分解されたデンプンの種類によって得られる分解物の分子量の分布が異なり得る。デンプン枝切り酵素分解物は、種々の長さの糖鎖の混合物であり得る。
【００８６】
デキストリンおよびデンプン部分加水分解物は、デンプンを、酸、アルカリ、酵素などの作用によって部分的に分解して得られる分解物をいう。本発明では、デキストリンおよびデンプン部分加水分解物の有する糖単位数は、好ましくは約１０〜約１００，０００、より好ましくは約５０〜約５０，０００、さらにより好ましくは約１００〜約１０，０００である。デキストリンおよびデンプン部分加水分解物の場合、分解されたデンプンの種類によって得られる分解産物の分子量の分布が異なり得る。デキストリンおよびデンプン部分加水分解物は、種々の長さを持つ糖鎖の混合物であり得る。
【００８７】
デキストランとは、α−１，６−グルカンをいう。
【００８８】
セルロースとは、β−１，４−グルコシド結合によって連結されたグルコース単位から構成される直鎖分子である。
【００８９】
糖質は１種類の化合物であってもよいし、複数種の化合物の混合物であってもよい。
【００９０】
糖質は、疎水基含有水溶性有機化合物を含有する水溶液中にもともと含まれていてもよいし、疎水基含有水溶性有機化合物を含有する水溶液に添加されてもよい。疎水基含有水溶性有機化合物を含有する水溶液中に糖質がもともと含まれていることが好ましい。このような水溶液の例としては、上記に列挙したような配糖化反応溶液および果汁が挙げられる。
【００９１】
糖質は低分子であることが好ましい。配糖化反応溶液のように、比較的高分子量の多糖を含有する溶液は、グルコアミラーゼのような、糖鎖を切断する酵素をその溶液に添加して反応させることによって、多糖を単糖またはオリゴ糖まで分解し得る。水溶液中の多糖は、有機溶媒との接触前に単糖またはオリゴ糖に分解されることが好ましい。糖質は、水溶液中にすべて溶解していることが好ましい。しかし、水溶液と有機溶媒との分離を妨げない限り、糖質は水溶液中に一部懸濁していてもよい。
【００９２】
水溶液中の糖質の濃度は、任意の濃度であり得る。水溶液中の糖質の濃度は、好ましくは１２％以上、より好ましくは２０％以上、さらに好ましくは３０％以上、さらに好ましくは４０％以上であり、最も好ましくは５０％以上である。糖質の濃度の上限は、糖質および疎水基含有水溶性有機化合物が沈殿しなければ任意の濃度であり得る。例えば、上限は、９０％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下または５５％以下である。
【００９３】
水溶液中の糖質の濃度は、当該分野で公知の方法によって測定され得る。例えば、簡便な方法としては、ブリックス糖度計による測定方法がある。ブリックス糖度計による測定方法は、簡便ではあるが、各種糖質を区別して測定することができない。各種糖質について区別して測定するためには、例えば、糖質を含有する水溶液を水：アセトニトリル＝２５：７５（ｖ／ｖ）の溶液を移動相として用いて、カラムＬｉＣｈｒｏｓｏｒｂ ＮＨ２（Ｍｅｒｃｋ製；４．０×２５０ｍｍ)を用いたＨＰＬＣにかけ、溶出液をＲＩ検出器を用いて測定することにより測定が可能である。
【００９４】
水溶液のｐＨは、好ましくは２〜１１であり、より好ましくは３〜９であり、さらに好ましくは４〜８である。
【００９５】
（３）極性有機溶媒
本明細書中では、「極性有機溶媒」とは、アルミナに対する溶媒強度（ε０）が０．４以上であり、蒸留水と混ざる有機溶媒をいう。極性有機溶媒の溶媒強度は、好ましくは０．４２〜０．９８であり、より好ましくは０．４４〜０．９５であり、最も好ましくは０．４４〜０．９０である。極性有機溶媒は、２０℃での誘電率が７．０以上の有機溶媒であってもよい。極性有機溶媒は、２０℃での誘電率が好ましくは７．３〜４０．０であり、より好ましくは７．４〜３９．０であり、最も好ましくは７．５〜３８．０である。
【００９６】
アルミナに対する溶媒強度の例を表１に示す。誘電率の例を表２に示す。本発明で使用される極性有機溶媒の例としては、以下の表１および表２に示され、上記範囲に溶媒強度または誘電率を有する極性有機溶媒が挙げられる。
【００９７】
【表１】
【００９８】
【表２】
極性有機溶媒は、好ましくはテトラヒドロフラン、イソプロパノール、アセトニトリル、アセトン、エタノール、メタノール、プロパノール、ピリジンまたはジメトキシスルホキシドであり、より好ましくはテトラヒドロフラン、イソプロパノール、アセトニトリルまたはアセトンであり、最も好ましくはテトラヒドロフランまたはアセトニトリルである。水溶液が相分離補助剤をさらに含む場合、極性有機溶媒は、好ましくはテトラヒドロフラン、アセトニトリル、アセトンまたはイソプロピルアルコールであり、より好ましくはアセトンまたはイソプロピルアルコールである。
【００９９】
極性有機溶媒は、１種類の化合物であることが好ましい。しかし、有機相が２相に分離しない限り、２種類以上の極性有機溶媒を混合して用い得る。当業者は、水溶液からの疎水基含有水溶性有機化合物の抽出のために適切な種類の極性有機溶媒を必要に応じて選択し得る。
【０１００】
水溶液と接触させる極性有機溶媒の量は、代表的には水溶液の容積の０．１倍〜１０倍であり、より好ましくは０．２倍〜２倍である。
【０１０１】
（４）相分離補助剤
水溶液は、相分離補助剤をさらに含有し得る。本明細書中では、「相分離補助剤」とは、水溶液と極性有機溶媒との混合物が水相と有機相とに分離するのを補助する物質をいう。ただし、相分離を補助する作用を有していても、糖質および疎水基含有水溶性有機化合物は相分離補助剤ではない。相分離補助剤は、例えば、塩析効果のある塩およびイオン強度を高めることが可能な水溶性物質であり得る。相分離補助剤は、塩または有機酸であり得る。相分離補助剤の例としては、硫安、硫酸マグネシウム等の硫酸塩、塩化ナトリウム、亜硫酸ナトリウム等のナトリウム塩、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、リン酸マグネシウム、リン酸アンモニウム等のリン酸塩、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム等の酢酸塩、乳酸ナトリウム、乳酸マグネシウム、乳酸カルシウム等の乳酸塩、クエン酸、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸、アスコルビン酸ナトリウム、リンゴ酸等の有機酸、塩化アンモニウムが挙げられるがこれらに限定されない。相分離補助剤は、好ましくは塩であり、より好ましくは塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、硫酸マグネシウムおよび硫酸アンモニウムからなる群より選択される。
【０１０２】
相分離補助剤は、相分離補助能を発揮するに十分な量で水溶液に含有され得る。このような量は当業者に公知である。相分離補助剤は、水溶液中に好ましくは５％以上、より好ましくは１０％以上、さらに好ましくは１５％以上、最も好ましくは２０％以上含有される。相分離補助剤の量の上限は特にないが、好ましくは５０％以下であり、より好ましくは４０％以下である。
【０１０３】
相分離補助剤は、予め水溶液に含有させることが好ましい。しかし、水溶液と極性有機溶媒とを接触させている間に相分離補助剤を添加することも可能である。
【０１０４】
（疎水基含有水溶性有機化合物および糖質を含有する水溶液の調製）
疎水基含有水溶性有機化合物および糖質を含有する水溶液は、当業者に公知の方法によって調製され得る。このような水溶液は、酵素反応をさせた後、何の処理も施していない酵素反応溶液であってもよいし、酵素反応後に濃縮、希釈、濾過、ｐＨ調整などを行った酵素反応溶液であってもよい。特に、酵素反応溶液の粘度が高すぎて攪拌できない場合は希釈することが好ましい。水溶液はまた、疎水基含有水溶性有機化合物および糖質を含有する酵素反応溶液またはその濃縮液に相分離補助剤を添加することにより調製されてもよい。
【０１０５】
水溶液はまた、疎水基含有水溶性有機化合物を含有する、動物または植物から選択される生物の抽出物であり得る。このような抽出物は、疎水基含有水溶性有機化合物を含有する、動物材料または植物材料を、当該分野で公知の方法によって抽出することにより調製され得る。代表的な抽出方法は、疎水基含有水溶性有機化合物を含有する、動物材料または植物材料を、水（例えば、０℃より高く、４０℃未満の水）、温水（例えば、４０℃以上６０℃未満の水）、熱水（例えば、６０℃以上１００℃未満の水）、アルコール、ピリジン、酢酸エチルまたはこれらの混合物のような抽出溶媒中に入れ、動物材料または植物材料からこれらの抽出溶媒へと疎水基含有水溶性有機化合物を移動させ、抽出溶媒から動物材料および植物材料を除去して抽出液を得て、そして必要に応じてこの抽出液を濃縮または乾固することを含む。抽出物は有機溶媒を含まないことが好ましい。抽出溶媒が有機溶媒である場合、抽出液を濃縮することによって、有機溶媒を除去することが好ましい。抽出物は、液体であっても、固体であってもよい。なお、本明細書中では、動物材料または植物材料の搾汁も、抽出物の定義に含まれる。水溶液は好ましくは、果汁である。動物材料は、動物全体であってもよいし、動物のうちの任意の器官または組織であってもよい。植物材料は、植物全体であってもよいし、植物のうちの任意の器官（例えば、花、果実、種子、根、茎および葉）または組織であってもよい。抽出に使用される動物材料および植物材料は、生の状態でも乾燥状態でもよい。抽出物が水溶液であれば、そのまま本発明で使用され得る。水溶液はまた、抽出物から、濃縮、希釈などによって調製され得る。特に、抽出物の粘度が高すぎて攪拌できない場合は希釈することが好ましい。なお、本発明の方法で使用される水溶液には、目的とする疎水基含有水溶性有機化合物が溶解している限り、他の任意の成分が懸濁していてもよい。水溶液はまた、疎水基含有水溶性有機化合物および糖質を含有する動物抽出物に、疎水基含有水溶性有機化合物および糖質を含有する植物抽出物に、またはこれらの抽出物の濃縮物もしくは希釈物に、相分離補助剤を添加することにより調製されてもよい。例えば、水溶液は、果汁またはその濃縮物に相分離補助剤を添加することにより調製されてもよい。
【０１０６】
抽出液には、サリシン、コニフェリン、アルブチン、センノシド、ステビオサイド、ルブソサイド、ルチン、ヘスペリジン、ナリンジン、ダイゼイン、ゲニスチン、バルバロイン、バニリン、サポニン、ベルベリン、ケンフェロール、バイカリン、カピラリン、カテキン、コリダリン、エスクレチン、エピカテキン、ジンゲロールおよびグリチルリチンからなる群より選択される有効成分が溶解していることが好ましい。
【０１０７】
（疎水基含有水溶性有機化合物の抽出）
本発明の方法では、疎水基含有水溶性有機化合物および糖質を含有する水溶液と、極性有機溶媒とを接触させて、水相と有機相とを得、それによって疎水基含有水溶性有機化合物を有機相に移動させる。
【０１０８】
水溶液と極性有機溶媒とは、例えば、水溶液と極性有機溶媒とを混合することによって接触され得る。水溶液と極性有機溶媒とを接触させることを、抽出するともいう。水溶液と極性有機溶媒とを接触させるときの温度は、好ましくは１０℃〜５０℃、より好ましくは２５℃〜４５℃、さらに好ましくは２０℃〜４０℃、最も好ましくは２５℃〜３５℃である。
【０１０９】
水溶液と極性有機溶媒とを混合および攪拌した後に静置することにより、水相と有機相とに分離する。一般的には、水相および有機相がそれぞれ層を形成し、水層および有機層となる。一般的には、比重の大きい溶媒層が下層となる。水よりも軽い比重の有機溶媒が使用される場合、通常、下層が水層となり、上層が有機層となる。
【０１１０】
通常、水相には少量の極性有機溶媒が含まれており、有機相には少量の水が含まれている。例えば、疎水基含有水溶性有機化合物（例えば、ヘスペリジンおよびルチン）を含む水溶液または懸濁液にアセトンを添加し、攪拌し、そして静置することによって水相と有機相（アセトン相）とが分離した場合、アセトン相には水が少量溶解しているために、有機相に水が含まれない場合と比較して疎水基含有水溶性有機化合物の溶解度が増し、アセトン中に疎水基含有水溶性有機化合物が効率的に溶解する。
【０１１１】
水溶液と極性有機溶媒とを混合して接触させている際には、その混合液を攪拌することが好ましい。攪拌の方法の例としては、回転、振とうおよびこれらの併用が挙げられるがこれらに限定されない。疎水基含有水溶性有機化合物を効率的に抽出および精製するためには、多段式向流分配装置（連続式液々抽出装置ともいう）を使用することが可能である。
【０１１２】
（フェノール誘導体配糖体の精製）
本発明の方法は、フェノール誘導体配糖体を精製する場合に特に有用である。フェノール誘導体配糖体の精製の場合を例にしてより詳細に説明する。
【０１１３】
フェノール誘導体配糖体は、例えば、糖質(例えば、マルトオリゴ糖またはデンプン)とフェノール誘導体とを酵素の存在下で反応させることによって形成され得る。通常、この反応は、ある段階で平衡化してそれ以上反応が進まなくなる。それゆえ、この酵素反応溶液中には、フェノール誘導体、フェノール誘導体配糖体および糖質が存在する。この酵素反応溶液が多糖またはオリゴ糖を含む場合、グルコアミラーゼのような糖分解酵素をこの酵素反応溶液に添加してインキュベートすることにより、酵素反応溶液中の多糖またはオリゴ糖を単糖に分解し得る。多糖またはオリゴ糖を単糖に分解すると、糖質の合計重量は変化しなくてもモル数が増加し、つまり、モル濃度が上昇して、その結果、水相と有機相との分離がより促進される。酵素反応溶液を極性有機溶媒と接触させて、第１の水相と少量の水を含む有機相とを得ると、この有機相には、フェノール誘導体およびフェノール誘導体配糖体が移動する。上記のように、相の分離を促進するために、水相中に相分離補助剤を添加して、相分離補助剤を含有する水溶液を得て、この水溶液を極性有機溶媒と接触させてもよい。
【０１１４】
次いで、この少量の水を含む有機相を分取する。フェノール誘導体およびフェノール誘導体配糖体は、疎水性部分を含むので糖質よりも有機相との親和性が高い。そのため、フェノール誘導体およびフェノール誘導体配糖体は有機相に効率的に移動するが、糖質は有機相にあまり移動しない。そのため、分取された有機相の中には、フェノール誘導体およびフェノール誘導体配糖体が抽出される。一般に、全体として同じ量の極性有機溶媒を用いて分配抽出を行う場合、全量を水溶液に１回に接触させて抽出を行うよりも、全量をいくつかのアリコートに分割して水溶液の抽出を複数回行う方が抽出効率が上がる。そのため、有機相を分取した後残った水相に極性有機溶媒を接触させて、水相と少量の水を含む有機相とを再度得て、この有機相を分取する工程を２回以上行ってもよい。有機相の分取を２回以上行った場合、得られた有機相を合わせて次の工程に用い得る。
【０１１５】
次いで、少量の水を含む有機相から極性有機溶媒が除去される。有機相から極性有機溶媒を除去する方法は、当業者に公知の任意の方法であり得る。このような方法の例としては、エバポレーターおよびエバポールによる濃縮が挙げられる。極性有機溶媒は、完全に除去されてもよく、この次の工程を妨害しない限り、少量残存していてもよい。極性有機溶媒を除去すると、極性有機溶媒中に含まれていた少量の水の中にフェノール誘導体およびフェノール誘導体配糖体が残る。この除去の工程では、水をあまり除去しないことが好ましい。この除去の工程では、フェノール誘導体およびフェノール誘導体配糖体が沈殿しないことが好ましい。沈殿してしまった場合、水を加えてフェノール誘導体およびフェノール誘導体配糖体を再度溶解することが好ましい。このようにして、フェノール誘導体およびフェノール誘導体配糖体を含有する第２の水溶液が得られる。
【０１１６】
次いで、第２の水溶液と酢酸エチルとを接触させて、第２の水相と酢酸エチル相とを得ることにより、フェノール誘導体を酢酸エチル相に移動する。
【０１１７】
次いで、第２の水相を分取する。フェノール誘導体は配糖体部分を含まないので、フェノール誘導体配糖体よりも酢酸エチル相との親和性が高い。そのため、フェノール誘導体は酢酸エチル相に効率的に移動するが、フェノール誘導体配糖体は酢酸エチル相にあまり移動しない。そのため、分取された水相の中には、フェノール誘導体配糖体が残存する。また、上記の第２の溶液中に糖質が微量に残存していた場合、この糖質はこの水相中に残存する。水溶液と極性有機溶媒との接触工程および有機相の分取工程と同様に、酢酸エチル相を分取した後残った水相に酢酸エチルを接触させて、水相と酢酸エチル相とを再度得て、第２の水相を分取する工程を２回以上行ってもよい。
【０１１８】
なお、本明細書中では、水溶液と極性有機溶媒との接触工程および有機相の分取工程の後に有機相と酢酸エチルとの接触を行う方法を記載したが、水溶液と酢酸エチルとを接触させて水相を分取した後に、この水相と極性有機溶媒との接触を行ってもよい。
【０１１９】
次いで、この第２の水相を濃縮し、そして冷却することにより、フェノール誘導体配糖体を沈殿させる。第２の水相中のフェノール誘導体配糖体の濃度が１０％以上になるまでこの第２の水相を濃縮することが好ましい。好ましくは１５％以上、より好ましくは２０％以上、そして最も好ましくは２５％以上になるまで濃縮する。これは、糖質の水中飽和濃度よりもフェノール誘導体配糖体の水中飽和濃度の方が低いことを利用している。例えば、糖質がグルコースであり、フェノール誘導体配糖体がハイドロキノン配糖体である場合、グルコースの水中飽和濃度が約１８％であり、ハイドロキノン配糖体の水中飽和濃度が約１０％であることを利用している。
【０１２０】
【実施例】
次に実施例を示して本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれらにより何ら制限されない。
【０１２１】
＜実験例１：相分離に対する糖の影響＞
各種糖質の代表としてグルコース、スクロースおよびフルクトースを用い、水溶液と極性有機溶媒との相の分離に及ぼす影響を検討した。
【０１２２】
詳細には、グルコース、スクロースまたはフルクトースをそれぞれ水に溶解して、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％および５０％水溶液を作製した。これらの糖の水溶液１０ｍｌに、アセトニトリルまたはテトラヒドロフランを１０ｍｌ添加した後、分液ロートにより５分間激しく攪拌した。アセトニトリルおよびテトラヒドロフランはいずれも、水と混和する極性有機溶媒であり、水と混合した場合には水相と有機相には分離しない。攪拌終了後、混合物を３０分間静置し、水相と有機相との２相に分離するかどうかを観察した。テトラヒドロフランまたはアセトニトリルを各種水溶液に添加した場合の結果を表３〜５に示す。表中ＴＨＦとはテトラヒドロフラン、ＡｃＣＮとはアセトニトリルを指す。
【０１２３】
【表３】
【０１２４】
【表４】
【０１２５】
【表５】
表３〜５に示すように、アセトニトリルまたはテトラヒドロフランを糖の水溶液と混合した場合、ある程度の量の糖が存在することによって、相が分離することがわかった。
【０１２６】
これらの結果から、水溶液中に含まれる糖質の種類および濃度を調整すれば相を分離させることが容易になり、例えば、１２％程度以上の濃度に糖を調整することが好ましいことがわかった。
【０１２７】
＜実験例２：相分離に対する塩の影響＞
次に、相分離に対する塩の影響について検討を行った。
【０１２８】
詳細には、グルコース濃度が２５％または５０％のグルコース水溶液に、それぞれ２０％または１０％となるように塩化ナトリウムを添加して、塩化ナトリウム含有グルコース水溶液を作製した。これらの水溶液１０ｍｌに、極性有機溶媒であるアセトンまたはイソプロパノールを１０ｍｌ添加した後、分液ロートにより５分間激しく攪拌した。攪拌終了後、混合物を３０分間静置し、２相に分離するかどうかを観察した。結果を表６に示す。
【０１２９】
【表６】
デキストリン濃度が２５％の水溶液に、２０％となるようにクエン酸ナトリウムを添加して、クエン酸ナトリウム含有デキストリン水溶液を作製した。なお、デキストリンは、ＤＥが７〜９の松谷化学社製のパインデックス＃１であった。本明細書中では、「ＤＥ」とは、デンプンの分解程度を示す指標であって、固形分中のグルコースに換算した直接還元糖百分率である。また、グルコース濃度が２５％の水溶液に、１０％となるように硫酸マグネシウムを添加して、硫酸マグネシウム含有グルコース水溶液を作製した。これらの水溶液１０ｍｌに、それぞれ、極性有機溶媒であるアセトンを１０ｍｌ添加した後、分液ロートにより５分間激しく攪拌した。攪拌終了後、混合物を３０分間静置し、混合物が２相に分離するかどうかを観察した。結果を表７に示す。
【０１３０】
【表７】
表６および表７に示すように、塩化ナトリウム含有グルコース水溶液、クエン酸ナトリウム含有デキストリン水溶液および硫酸マグネシウム含有グルコース水溶液の各々とアセトンまたはイソプロパノールとを混合した場合、相が分離した。５０％糖水溶液では相が分離しなかった極性有機溶媒であっても、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、硫酸マグネシウムなどの塩を添加することによって相が分離した。この結果、塩化ナトリウムのような塩が相分離補助剤として作用することがわかった。塩は、水溶液に溶解した際に水溶液のイオン強度を上昇させることによって相分離補助剤として作用すると考えられるので、イオン強度を高めるものであれば相分離補助剤として使用できると考えられる。
【０１３１】
（実施例１：カテキン類の抽出）
（実施例１ａ）
カテキン類混合物（サンフェノン；太陽化学社製）１ｇを３０％のグルコースを含む水溶液１００ｍｌに溶解して試料水溶液を得た。この試料水溶液の２８０ｎｍの吸光度を測定した。この試料水溶液１０ｍｌに、テトラヒドロフランを１０ｍｌ添加し、分液ロートにより５分間激しく攪拌した後、混合物を３０分間静置した。その結果、混合物は２相に分離した。下相（水相）を分取し、その容量および２８０ｎｍの吸光度を測定した。上相（極性有機溶媒相）に抽出されたカテキン類の量を、下相の２８０ｎｍの吸光度の減少および下相の溶液量から算出した。その結果、１回の抽出でテトラヒドロフラン相に出発物質の全量の９４．１％のカテキン類が抽出されたことが解った。
【０１３２】
（実施例１ｂ）
テトラヒドロフラン１０ｍｌに代えてアセトニトリル１０ｍｌを用いた以外は実施例１ａと同様の操作を行った。その結果、１回の抽出でアセトニトリル相に出発物質の全量の８４．４％のカテキン類が抽出されたことが解った。
【０１３３】
（実施例２：カテキン類の抽出）
（実施例２ａ）
カテキン類混合物（サンフェノン；太陽化学社製）１ｇを３０％のグルコースおよび１０％の塩化ナトリウムを含む水溶液１００ｍｌに溶解して試料水溶液を得た。この試料水溶液の２８０ｎｍの吸光度を測定した。この試料水溶液１０ｍｌに、アセトンを１０ｍｌ添加し、分液ロートにより５分間激しく攪拌した後、混合物を３０分間静置した。その結果、混合物は２相に分離した。下相（水相）を分取し、その容量および２８０ｎｍの吸光度を測定した。上相（極性有機溶媒相）に抽出されたカテキン類の量を、下相の２８０ｎｍの吸光度の減少および下相の溶液量から算出した。その結果、１回の抽出でアセトン相に出発物質の全量の９１．８％のカテキン類が抽出されたことが解った。
【０１３４】
（実施例２ｂ）
アセトン１０ｍｌに代えてイソプロパノール１０ｍｌを用いた以外は実施例２ａと同様の操作を行った。その結果、１回の抽出でイソプロパノール相に出発物質の全量の９３．２％のカテキン類が抽出されたことが解った。
【０１３５】
（実施例３：ヘスペリジン配糖体の抽出）
（実施例３ａ）
ヘスペリジン配糖体（東洋精糖社製）１ｇを３０％のグルコースを含む水溶液１００ｍｌに溶解して試料水溶液を得た。この試料水溶液の２８０ｎｍの吸光度を測定した。この試料水溶液１０ｍｌに、テトラヒドロフランを１０ｍｌ添加し、分液ロートにより５分間激しく攪拌した後、混合物を３０分間静置した。その結果、混合物は２相に分離した。下相（水相）を分取し、その容量および２８０ｎｍの吸光度を測定した。上相（極性有機溶媒相）に抽出されたヘスペリジン配糖体の量を、下相の２８０ｎｍの吸光度の減少および下相の溶液量から算出した。その結果、１回の抽出でテトラヒドロフラン相に出発物質の全量の５０．０％のヘスペリジン配糖体が抽出されたことが解った。さらにテトラヒドロフラン抽出後に分取した水相に５ｍｌのテトラヒドロフランを添加し同様の操作および測定を再度行ったところ、合計８０．０％のヘスペリジン配糖体が抽出されたことが解った。
【０１３６】
（実施例３ｂ）
テトラヒドロフラン１０ｍｌに代えてアセトニトリル１０ｍｌを用いた以外は実施例３ａと同様の操作を行った。その結果、１回の抽出でアセトニトリル相に出発物質の全量の２７．６％のヘスペリジン配糖体が抽出されたことが解った。
【０１３７】
（実施例４：ヘスペリジン配糖体の抽出）
（実施例４ａ）
ヘスペリジン配糖体（東洋精糖社製）１ｇを３０％のグルコースおよび１０％の塩化ナトリウムを含む水溶液１００ｍｌに溶解して試料水溶液を得た。この試料水溶液の２８０ｎｍの吸光度を測定した。この試料水溶液１０ｍｌに、アセトンを１０ｍｌ添加し、分液ロートにより５分間激しく攪拌した後、混合物を３０分間静置した。その結果、混合物は２相に分離した。下相（水相）を分取し、その容量および２８０ｎｍの吸光度を測定した。上相（極性有機溶媒相）に抽出されたヘスペリジン配糖体の量を、下相の２８０ｎｍの吸光度の減少および下相の溶液量から算出した。その結果、１回の抽出でアセトン相に出発物質の全量の４３．５％のヘスペリジン配糖体が抽出されたことが解った。さらにアセトン抽出後に分取した水相に５ｍｌのアセトンを添加し同様の操作および測定を２回行ったところ、合計９０．０％のヘスペリジン配糖体が抽出されたことが解った。
【０１３８】
（実施例４ｂ）
アセトン１０ｍｌに代えてイソプロパノール１０ｍｌを用いた以外は実施例４ａと同様の操作を行った。その結果、１回の抽出でイソプロパノール相に出発物質の全量の３２．０％のヘスペリジン配糖体が抽出されたことが解った。
【０１３９】
（実施例５：サリシンの抽出）
（実施例５ａ）
サリシン１ｇを３０％のグルコースを含む水溶液１００ｍｌに溶解して試料水溶液を得た。この試料水溶液の２８０ｎｍの吸光度を測定した。この試料水溶液１０ｍｌに、テトラヒドロフランを１０ｍｌ添加し、分液ロートにより５分間激しく攪拌した後、混合物を３０分間静置した。その結果、混合物は２相に分離した。下相（水相）を分取し、その容量および２８０ｎｍの吸光度を測定した。上相（極性有機溶媒相）に抽出されたサリシンの量を、下相の２８０ｎｍの吸光度の減少および下相の溶液量から算出した。その結果、１回の抽出でテトラヒドロフラン相に出発物質の全量の９６．５％のサリシンが抽出されたことが解った。
【０１４０】
（実施例５ｂ）
テトラヒドロフラン１０ｍｌに代えてアセトニトリル１０ｍｌを用いた以外は実施例５ａと同様の操作を行った。その結果、１回の抽出でアセトニトリル相に出発物質の全量の９８．１％のサリシンが抽出されたことが解った。
【０１４１】
（実施例６：サリシンの抽出）
（実施例６ａ）
サリシン１ｇを３０％のグルコースおよび１０％の塩化ナトリウムを含む水溶液１００ｍｌに溶解して試料水溶液を得た。この試料水溶液の２８０ｎｍの吸光度を測定した。この試料水溶液１０ｍｌに、アセトンを１０ｍｌ添加し、分液ロートにより５分間激しく攪拌した後、混合物を３０分間静置した。その結果、混合物は２相に分離した。下相（水相）を分取し、その容量および２８０ｎｍの吸光度を測定した。上相（極性有機溶媒相）に抽出されたサリシンの量を、下相の２８０ｎｍの吸光度の減少および下相の溶液量から算出した。その結果、１回の抽出でアセトン相に出発物質の全量の５８．０％のサリシンが抽出されたことが解った。
【０１４２】
（実施例６ｂ）
アセトン１０ｍｌに代えてイソプロパノール１０ｍｌを用いた以外は実施例６ａと同様の操作を行った。その結果、１回の抽出でイソプロパノール相に出発物質の全量の９７．０％のサリシンが抽出されたことが解った。
【０１４３】
（実施例７：コーヒー酸の抽出）
（実施例７ａ）
コーヒー酸１ｇを３０％のグルコースを含む水溶液１００ｍｌに溶解して試料水溶液を得た。この試料水溶液の２８０ｎｍの吸光度を測定した。この試料水溶液１０ｍｌに、テトラヒドロフランを１０ｍｌ添加し、分液ロートにより５分間激しく攪拌した後、混合物を３０分間静置した。その結果、混合物は２相に分離した。下相（水相）を分取し、その容量および２８０ｎｍの吸光度を測定した。上相（極性有機溶媒相）に抽出されたコーヒー酸の量を、下相の２８０ｎｍの吸光度の減少および下相の溶液量から算出した。その結果、１回の抽出でテトラヒドロフラン相に出発物質の全量の８８．６％のコーヒー酸が抽出されたことが解った。
【０１４４】
（実施例７ｂ）
テトラヒドロフラン１０ｍｌに代えてアセトニトリル１０ｍｌを用いた以外は実施例７ａと同様の操作を行った。その結果、１回の抽出でアセトニトリル相に出発物質の全量の７６．２％のコーヒー酸が抽出されたことが解った。
【０１４５】
（実施例８：コーヒー酸の抽出）
（実施例８ａ）
コーヒー酸１ｇを３０％のグルコースおよび１０％の塩化ナトリウムを含む水溶液１００ｍｌに溶解して試料水溶液を得た。この試料水溶液の２８０ｎｍの吸光度を測定した。この試料水溶液１０ｍｌに、アセトンを１０ｍｌ添加し、分液ロートにより５分間激しく攪拌した後、混合物を３０分間静置した。その結果、混合物は２相に分離した。下相（水相）を分取し、その容量および２８０ｎｍの吸光度を測定した。上相（極性有機溶媒相）に抽出されたコーヒー酸の量を、下相の２８０ｎｍの吸光度の減少および下相の溶液量から算出した。その結果、１回の抽出でアセトン相に出発物質の全量の７８．２％のコーヒー酸が抽出されたことが解った。
【０１４６】
（実施例８ｂ）
アセトン１０ｍｌに代えてイソプロパノール１０ｍｌを用いた以外は実施例８ａと同様の操作を行った。その結果、１回の抽出でイソプロパノール相に出発物質の全量の８７．２％のコーヒー酸が抽出されたことが解った。
【０１４７】
（実施例９：サリシルアルコールの抽出）
（実施例９ａ）
サリシルアルコール１ｇを３０％のグルコースを含む水溶液１００ｍｌに溶解して試料水溶液を得た。この試料水溶液の２８０ｎｍの吸光度を測定した。この試料水溶液１０ｍｌに、テトラヒドロフランを１０ｍｌ添加し、分液ロートにより５分間激しく攪拌した後、混合物を３０分間静置した。その結果、混合物は２相に分離した。下相（水相）を分取し、その容量および２８０ｎｍの吸光度を測定した。上相（極性有機溶媒相）に抽出されたサリシルアルコールの量を、下相の２８０ｎｍの吸光度の減少および下相の溶液量から算出した。その結果、１回の抽出でテトラヒドロフラン相に出発物質の全量の９８．７％のサリシルアルコールが抽出されたことが解った。
【０１４８】
（実施例９ｂ）
テトラヒドロフラン１０ｍｌに代えてアセトニトリル１０ｍｌを用いた以外は実施例９ａと同様の操作を行った。その結果、１回の抽出でアセトニトリル相に出発物質の全量の９８．２％のサリシルアルコールが抽出されたことが解った。
【０１４９】
（実施例１０：サリシルアルコールの抽出）
（実施例１０ａ）
サリシルアルコール１ｇを３０％のグルコースおよび１０％の塩化ナトリウムを含む水溶液１００ｍｌに溶解して試料水溶液を得た。この試料水溶液の２８０ｎｍの吸光度を測定した。この試料水溶液１０ｍｌに、アセトンを１０ｍｌ添加し、分液ロートにより５分間激しく攪拌した後、混合物を３０分間静置した。その結果、混合物は２相に分離した。下相（水相）を分取し、その容量および２８０ｎｍの吸光度を測定した。上相（極性有機溶媒相）に抽出されたサリシルアルコールの量を、下相の２８０ｎｍの吸光度の減少および下相の溶液量から算出した。その結果、１回の抽出でアセトン相に出発物質の全量の８７．７％のサリシルアルコールが抽出されたことが解った。
【０１５０】
（実施例１０ｂ）
アセトン１０ｍｌに代えてイソプロパノール１０ｍｌを用いた以外は実施例１０ａと同様の操作を行った。その結果、１回の抽出でイソプロパノール相に出発物質の全量の９８．７％のサリシルアルコールが抽出されたことが解った。
【０１５１】
（実施例１１：エラジタンニンおよびその重合物の抽出）
（実施例１１ａ）
甜茶抽出物水溶液（サン甜茶；サントリー社製）を水で２倍希釈して２倍希釈液を得た。この２倍希釈液にグルコースを１０％、塩化ナトリウムを１０％となるように添加し溶解して水溶液を得た。この水溶液の２８０ｎｍの吸光度を測定した。この水溶液２０ｍｌに、アセトン２０ｍｌを添加し、分液ロートにより５分間激しく攪拌した後、混合物を３０分間静置した。その結果、混合物は２相に分離した。下相（水相）を分取し、その容量および２８０ｎｍの吸光度を測定した。上相（極性有機溶媒相）に抽出された有効成分（エラジタンニンおよびその重合物が有効成分である）の量を、下相の２８０ｎｍの吸光度の減少および下相の溶液量から算出した。その結果、１回の抽出でアセトン相に４３．１％の有効成分が抽出されたことが解った。さらに着色のレベルはアセトン相の方が水相の３分の１程度となっていた。このことから、抽出によって、有効成分が抽出され、そして脱色効果が得られたことがわかった。
【０１５２】
（実施例１２：果汁からのヘスペリジンの抽出）
カリフォルニアオレンジ果汁濃縮液（５倍濃縮液）１０ｍｌに１５％の塩化ナトリウム水を１０ｍｌ添加し、均一になるように攪拌して水溶液を得た。使用したカリフォルニアオレンジ果汁濃縮液中のヘスペリジンの量を、カラムＯＤＳを用い、移動相をアセトニトリル：水＝２０：８０とし、流速０．５ｍｌ／分でカラム温度４０℃でＨＰＬＣを行い、溶出液の吸光度を２８０ｎｍで検出することにより測定した。ヘスペリジン量の詳細な検出方法は、日本国特許公開平８−８０１７７号公報に記載される。得られた水溶液２０ｍｌに、アセトン２０ｍｌを添加し、分液ロートにより５分間激しく攪拌した後、混合物を３０分間静置した。その結果、混合物は２相に分離した。上相（極性有機溶媒相）を分取し、その容量を測定し、そしてヘスペリジンの量を、上記のようにＨＰＬＣにより測定した。その結果、１回の抽出でアセトン相に７５％のヘスペリジンが抽出されていた。
【０１５３】
（実施例１３：配糖化反応溶液からのヘスペリジンの抽出）
可溶性デンプン（メルク社製）５％およびヘスペリジン０．５％が溶解している水溶液を塩酸によりｐＨ９．０に調整し、アルカリ耐性のＣＧＴａｓｅ（日本国特許公開平７−１０７９７２号公報に記載のＣＧＴａｓｅ）を５ユニット／ｍｌの濃度になるようにこの水溶液に添加し、次いで３７℃で１６時間酵素反応させた。酵素反応終了後、酵素反応溶液の一部を採取して、ＨＰＬＣ分析方法によってヘスペリジンおよびヘスペリジン配糖体の量を測定した。ＨＰＬＣ分析方法においては、ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ １００ＲＰ１８（Ｍｅｒｃｋ；４．０×２５０ｍｍ）のカラムを用い、移動相はアセトニトリル：水＝２０：８０（ｖ／ｖ）であり、流速は０．５ｍｌ／分であり、カラム温度は４０℃であり、溶出液の吸光度を２８０ｎｍで検出した。ヘスペリジンおよびヘスペリジン配糖体の分析方法は、日本国特許公開平８−８０１７７号号公報に記載される。その結果、酵素反応により、反応開始時に投入したヘスペリジンの約８０％がヘスペリジン配糖体となったことがわかった。
【０１５４】
次いで、この酵素反応終了後の酵素反応溶液にグルコースを２０％および塩化ナトリウムを１０％となるように添加し、溶解してグルコースおよび塩化ナトリウムを含有する酵素反応溶液を得た。グルコースおよび塩化ナトリウムを含有する酵素反応溶液に、等容量のアセトンを添加した。分液ロートにより５分間激しく攪拌した後、混合物を３０分間静置した。その結果、混合物は２相に分離した。上相のアセトン相を分取し、その容量を測定し、そしてアセトン相に溶解しているヘスペリジン配糖体の量を、上記のようにＨＰＬＣにより測定した。その結果、酵素反応終了後の酵素反応溶液中に存在したヘスペリジン配糖体のうちの約４５％のヘスペリジン配糖体がアセトン相中に抽出されていた。さらに、下相の水相に、酵素反応溶液の容量の半分量のアセトンを添加し、攪拌し、静置し、上相を分取するという、同様の抽出操作を３回行った結果、ヘスペリジン配糖体を全量回収することができた。
【０１５５】
（実施例１４：配糖化反応溶液からのハイドロキノン配糖体の抽出）
デキストリン（ＤＥが７〜９のパインデックス＃１；松谷化学社製）３５％およびハイドロキノン１５％が溶解している水溶液を５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ６．５に調整し、配糖化酵素（日本国特許公開平６−２７７０５３号公報に記載のアミラーゼＸ−２３）を２０ユニット／ｍｌの濃度になるようにこの水溶液に添加し、次いで４５℃で４０時間インキュベートしてハイドロキノンへの配糖化反応をおこなった。酵素反応終了後、酵素反応溶液の一部を採取して、ＨＰＬＣ分析方法によってハイドロキノンおよびハイドロキノン配糖体の量を測定した。このＨＰＬＣ分析方法においては、ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ １００ＲＰ１８（Ｍｅｒｃｋ；４．０×２５０ｍｍ）のカラムを用い、移動相は水：メタノール：リン酸＝８０：１９．７：０．３（ｖ／ｖ）であり、流速は０．５ｍｌ／分であり、カラム温度は４０℃であり、溶出液中のハイドロキノンおよびハイドロキノン配糖体の量を紫外分光法によって検出した。この酵素反応溶液を用いて、ＨＰＬＣ分析方法によって生成物グルコースおよびマルトオリゴ糖の量を測定した。このＨＰＬＣ分析方法においては、ＬｉＣｈｒｏｓｏｒｂ ＮＨ２（Ｍｅｒｃｋ；４．０×２５０ｍｍ）のカラムを用い、移動相は水：アセトニトリル＝２５：７５（ｖ／ｖ）であり、流速は１．０ｍｌ／分であり、カラム温度は４０℃であり、溶出液中のマルトオリゴ糖をＲＩ検出器によって検出した。その結果、この酵素反応によりハイドロキノンの約３５％がハイドロキノン配糖体となっており、デキストリンはグルコースおよびマルトオリゴ糖に分解されていることがわかった。さらに、酵素反応終了後の酵素反応溶液に、グルコアミラーゼ（ナガセケムテックス社製；商品名ＸＬ−４）を８．８ユニット／ｍｌの濃度になるように添加して４５℃で３時間インキュベートすることによって、酵素反応溶液中のオリゴ糖をグルコースに分解した。
【０１５６】
次いで、このオリゴ糖分解後の酵素反応溶液に、酵素反応溶液と等容量のテトラヒドロフランを添加した。分液ロートにより５分間激しく攪拌した後、混合物を３０分間静置した。その結果、混合物は２相に分離した。上相のテトラヒドロフラン相を分取し、その容量を測定し、そしてテトラヒドロフラン相に溶解しているハイドロキノン配糖体の量を、上記のようにＨＰＬＣにより分析した。その結果、酵素反応終了後の酵素反応溶液中に存在したハイドロキノン配糖体のうちの約６５％のハイドロキノン配糖体がテトラヒドロフラン相中に抽出されていた。さらに、下相の水相に、酵素反応溶液の容量の半分量のテトラヒドロフランを添加し、攪拌し、静置し、上相を分取するという、同様の抽出操作を３回行った結果、ハイドロキノン配糖体を全量回収することができた。
【０１５７】
（実施例１５：配糖化反応溶液からのハイドロキノン配糖体の抽出）
デキストリン（ＤＥが７〜９のパインデックス＃１；松谷化学社製）３５％およびハイドロキノン１５％が溶解している水溶液を５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ６．５に調整し、配糖化酵素（日本国特許公開平６−２７７０５３号公報に記載のアミラーゼＸ−２３）を２０ユニット／ｍｌの濃度になるように添加し、次いで４５℃で４０時間インキュベートしてハイドロキノンへの配糖化反応をおこなった。酵素反応終了後、酵素反応溶液の一部を採取して、ＨＰＬＣ分析方法によってハイドロキノンおよびハイドロキノン配糖体の量を測定した。このＨＰＬＣ分析方法においては、ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ １００ＲＰ１８（Ｍｅｒｃｋ；４．０×２５０ｍｍ）のカラムを用い、移動相は水：メタノール：リン酸＝８０：１９．７：０．３（ｖ／ｖ）であり、流速は０．５ｍｌ／分であり、カラム温度は４０℃であり、溶出液中のハイドロキノンおよびハイドロキノン配糖体の量を紫外分光法によって検出した。この酵素反応溶液を用いて、ＨＰＬＣ分析方法によって生成物グルコースおよびマルトオリゴ糖の量を測定した。このＨＰＬＣ分析方法においては、ＬｉＣｈｒｏｓｏｒｂ ＮＨ２（Ｍｅｒｃｋ；４．０×２５０ｍｍ）のカラムを用い、移動相は水：アセトニトリル＝２５：７５であり、流速は１．０ｍｌ／分であり、カラム温度は４０℃であり、溶出液中のマルトオリゴ糖をＲＩ検出器によって検出した。その結果、この酵素反応によりハイドロキノンの約３５％がハイドロキノン配糖体となっており、デキストリンはグルコースおよびマルトオリゴ糖に分解されていることがわかった。さらに、酵素反応終了後の酵素反応溶液に、グルコアミラーゼ（ナガセケムテックス社製；商品名ＸＬ−４）を８．８ユニット／ｍｌの濃度になるように添加して４５℃で３時間インキュベートすることによって、酵素反応溶液中のオリゴ糖をグルコースに分解した。
【０１５８】
次いで、このオリゴ糖分解後の酵素反応液をエバポレーターを用いて、約１．４倍に減圧濃縮した。この濃縮液に対して２０％となるよう硫酸アンモニウムを添加して、硫酸アンモニウム含有濃縮液を得た。この硫酸アンモニウム含有濃縮液に対して、この濃縮液と等容量のアセトンを添加した。分液ロートにより５分間激しく攪拌した後、混合物を３０分間静置した。その結果、混合物は２相に分離した。上相のアセトン相を分取し、その容量を測定し、そしてアセトン相に溶解しているハイドロキノン配糖体量を上記のようにＨＰＬＣにより分析した。その結果、酵素反応終了後の酵素反応溶液中に存在したハイドロキノン配糖体のうちの約６０％のハイドロキノン配糖体がアセトン相中に抽出されていた。さらに、下相の水相に、濃縮液の容量の０．８容量のアセトンを添加し、攪拌し、静置し、上相を分取するという、同様の抽出操作を３回行った結果、ハイドロキノン配糖体を全量回収することができた。
【０１５９】
（実施例１６：配糖化反応溶液からのハイドロキノン配糖体の抽出）
デキストリン（ＤＥが７〜９のパインデックス＃１；松谷化学社製）３５％およびハイドロキノン１５％が溶解している水溶液を５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ６．５に調整し、配糖化酵素（日本国特許公開平６−２７７０５３号公報に記載のアミラーゼＸ−２３）を２０ユニット／ｍｌの濃度になるように添加し、次いで４５℃で４０時間インキュベートしてハイドロキノンへの配糖化反応をおこなった。酵素反応終了後、酵素反応溶液の一部を採取して、ＨＰＬＣ分析方法によってハイドロキノンおよびハイドロキノン配糖体の量を測定した。このＨＰＬＣ分析方法においては、ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ １００ＲＰ１８（Ｍｅｒｃｋ；４．０×２５０ｍｍ）のカラムを用い、移動相は水：メタノール：リン酸＝８０：１９．７：０．３（ｖ／ｖ）であり、流速は０．５ｍｌ／分であり、カラム温度は４０℃であり、溶出液中のハイドロキノンおよびハイドロキノン配糖体の量を紫外分光法によって検出した。この酵素反応溶液を用いて、ＨＰＬＣ分析方法によって生成物グルコースおよびマルトオリゴ糖の量を測定した。このＨＰＬＣ分析方法においては、ＬｉＣｈｒｏｓｏｒｂ ＮＨ２（Ｍｅｒｃｋ；４．０×２５０ｍｍ）のカラムを用い、移動相は水：アセトニトリル＝２５：７５（ｖ／ｖ）であり、流速は１．０ｍｌ／分であり、カラム温度は４０℃であり、溶出液中のマルトオリゴ糖をＲＩ検出器によって検出した。その結果、この酵素反応によりハイドロキノンの約３５％がハイドロキノン配糖体となっており、デキストリンはグルコースおよびマルトオリゴ糖に分解されていることがわかった。さらに、酵素反応終了後の酵素反応溶液に、グルコアミラーゼ（ナガセケムテックス社製；商品名ＸＬ−４）を８．８ユニット／ｍｌの濃度になるように添加して４５℃で３時間インキュベートすることによって、酵素反応溶液中のオリゴ糖をグルコースに分解した。
【０１６０】
次いで、このオリゴ糖分解後の酵素反応液に、この酵素反応液と等容量のアセトニトリルを添加した。分液ロートにより５分間激しく攪拌した後、混合物を１時間静置した。その結果、混合物は２相に分離した。上相のアセトニトリル相を分取し、その容量を測定し、そしてアセトニトリル相に溶解しているハイドロキノン配糖体量を上記のようにＨＰＬＣにより分析した。その結果、酵素反応終了後の酵素反応溶液中に存在したハイドロキノン配糖体のうちの約３０％のハイドロキノン配糖体がアセトニトリル相に抽出されていた。さらに、下相の水相に、酵素反応溶液と等容量のアセトニトリルを添加し、攪拌し、静置し、上相を分取するという、同様の抽出操作を５回行った結果、酵素反応終了後の酵素反応溶液中に存在したハイドロキノン配糖体のうちの約９０％のハイドロキノン配糖体を回収することができた。
【０１６１】
（実施例１７：グルコアミラーゼ処理条件の検討）
出発物質としてデキストリンまたはデンプンを用いて配糖化酵素反応を行った場合、反応終了後の酵素反応溶液中には出発物質よりも低分子量の多量のグルコースおよびデキストリンが存在する。糖質全体の濃度が同じであっても、モル数が高い方が、有機相への糖の移動が少なくなる。そこで、配糖化酵素反応後に残存するデキストリンを効率的にグルコースへと分解するために、デキストリン分解反応の条件を検討した。
【０１６２】
デキストリン（ＤＥが７〜９のパインデックス＃１；松谷化学社製）３５％およびハイドロキノン１５％が溶解している水溶液を５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ６．５に調整し、配糖化酵素（日本国特許公開平６−２７７０５３号公報に記載のアミラーゼＸ−２３）を２０ユニット／ｍｌの濃度になるように添加し、次いで４５℃で４０時間インキュベートしてハイドロキノンへの配糖化反応をおこなった。
【０１６３】
この反応終了後の配糖化反応溶液１ｍｌに対して、１．４μｌ（１倍量）、２．１μｌ（１．５倍量）または２．８μｌ（２倍量）のグルコアミラーゼ（ナガセケムテックス社製；商品名ＸＬ−４）を加えた。この後、４５℃で３時間または４時間インキュベートした。インキュベート終了後、ＨＰＬＣ分析方法によってこの溶液中のグルコースおよびマルトースの含量を確認した。このＨＰＬＣ分析方法においては、ＬｉＣｈｒｏｓｏｒｂ ＮＨ２（Ｍｅｒｃｋ；４．０×２５０ｍｍ）のカラムを用い、移動相は水：アセトニトリル＝２５：７５（ｖ／ｖ）であり、流速は１．０ｍｌ／分であり、カラム温度は４０℃であり、溶出液中のグルコースおよびマルトースをＲＩ検出器によって検出した。また、ＨＰＬＣ分析方法によって溶出液中のハイドロキノンおよびハイドロキノン配糖体の量を測定した。このＨＰＬＣ分析方法においては、ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ １００ＲＰ１８（Ｍｅｒｃｋ；４．０×２５０ｍｍ）のカラムを用い、移動相は水：メタノール：リン酸＝８０：１９．７：０．３（ｖ／ｖ）であり、流速は０．５ｍｌ／分であり、カラム温度は４０℃であり、溶出液中のハイドロキノンおよびハイドロキノン配糖体の量を紫外分光法によって検出した。得られたハイドロキノンおよびハイドロキノン配糖体（ＨＱＧ）の量から、ハイドロキノン配糖化率を算出した。結果を以下の表８に示す。
【０１６４】
【表８】
１倍量のグルコアミラーゼを用いて糖の分解を３時間または４時間行っても、グルコアミラーゼを添加する前の酵素反応溶液と糖組成がほぼ同じであった。このことから、グルコアミラーゼが１倍量である場合、反応を１、２時間延長した程度ではマルトース量は劇的には減量しない可能性が示唆された。
【０１６５】
また、グルコアミラーゼを増量しても配糖化率はほとんど変わらなかった。このことは、目的の生成物であるハイドロキノン配糖体を分解することなく、グルコアミラーゼがデキストリンを分解できることを示す。それゆえ、デキストリンの分解を促進するためには、分解反応の時間を延長するよりも、グルコアミラーゼを増量するほうが効果的であることがわかった。
【０１６６】
次いで、このグルコアミラーゼ処理の違いがＴＨＦ処理に及ぼす影響を調べた。上記で得られた（ＸＬ−４）処理液１ｍｌとＴＨＦ１ｍｌとを混合し、分液ロートにより１分間激しく振盪し、混合物を振盪後１時間静置した。その結果、混合物は２相に分離した。水相を分取し、この水相に水を加えて１ｍｌにした。この水相を用いて、ＨＰＬＣ分析方法によってグルコースおよびマルトースの量を測定した。このＨＰＬＣ分析方法においては、ＬｉＣｈｒｏｓｏｒｂ ＮＨ２（Ｍｅｒｃｋ；４．０×２５０ｍｍ）のカラムを用い、移動相は水：アセトニトリル＝２５：７５（ｖ／ｖ）であり、流速は１．０ｍｌ／分であり、カラム温度は４０℃であり、溶出液中のグルコースおよびマルトースをＲＩ検出器によって検出した。また、ＨＰＬＣ分析方法によってハイドロキノンおよびハイドロキノン配糖体の量を測定した。このＨＰＬＣ分析方法においては、ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ １００ＲＰ１８（Ｍｅｒｃｋ；４．０×２５０ｍｍ）のカラムを用い、移動相は水：メタノール：リン酸＝８０：１９．７：０．３（ｖ／ｖ）であり、流速は０．５ｍｌ／分であり、カラム温度は４０℃であり、溶出液中のハイドロキノンおよびハイドロキノン配糖体の量を紫外分光法によって測定した。得られた結果と、ＴＨＦでの抽出前の上記のグルコース濃度、マルトース濃度およびＨＱＧ濃度とに基づいて、ＴＨＦ相への抽出率を計算した。結果を以下の表９に示す。
【０１６７】
【表９】
この結果、グルコアミラーゼ処理を行ってグルコース濃度が上昇するほど、ＴＨＦ相へのグルコースの抽出が抑えられる傾向が確認された。
【０１６８】
グルコアミラーゼ添加量が多いサンプルほど、ＴＨＦとの振盪、分液後の水相の液量が少なくなる（ＴＨＦ相への水の流入が少なくなる）傾向もまた確認された。
【０１６９】
（実施例１８：テトラヒドロフラン相への抽出に対する糖質濃度の影響）
テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）相への抽出に対する、水溶液中のグルコース濃度の影響を検討した。
【０１７０】
まず、４２％グルコースおよび９％ハイドロキノン配糖体を含む水溶液を調製した。この水溶液を水で段階的に希釈することによって、グルコース濃度が４０％〜２０％の水溶液を作製した。当然、水溶液を希釈することによって、グルコースだけでなく、ハイドロキノン配糖体も希釈されている。このようにして調製された水溶液５ｍｌに５ｍｌのＴＨＦを加え、３０℃にて５分間ミキサーで攪拌し、攪拌終了後、混合物を３０００ｒｐｍにて５分間遠心分離を行った。上相を分取した。グルコース濃度が低くなるに従ってＴＨＦ相が少なくなっていき、２０％では１回目抽出で相が分離しなかった。下相に再度５ｍｌのＴＨＦを加え、同様にして上相を分取した。各水溶液について得られた２つの上相をそれぞれ合わせた。ＨＰＬＣ分析方法によってこの溶液中のグルコースおよびマルトースの含量を測定した。このＨＰＬＣ分析方法においては、ＬｉＣｈｒｏｓｏｒｂ ＮＨ２（Ｍｅｒｃｋ；４．０×２５０ｍｍ）のカラムを用い、移動相は水：アセトニトリル＝２５：７５であり、流速は１．０ｍｌ／分であり、カラム温度は４０℃であり、溶出液中のグルコースおよびマルトースをＲＩ検出器によって検出した。また、ＨＰＬＣ分析方法によってハイドロキノンおよびハイドロキノン配糖体の量を測定した。このＨＰＬＣ分析方法においては、ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ１００ＲＰ１８（Ｍｅｒｃｋ；４．０×２５０ｍｍ）のカラムを用い、移動相は水：メタノール：リン酸＝８０：１９．７：０．３（ｖ／ｖ）であり、流速は０．５ｍｌ／分であり、カラム温度は４０℃であり、溶出液中のハイドロキノンおよびハイドロキノン配糖体の量を紫外分光法によって測定した。
【０１７１】
結果を図１に示す。図１からわかるように、ハイドロキノン配糖体の移動率はグルコース濃度にそれほど依存しなかった。しかし、グルコースの移動率は、グルコース濃度が高くなるにしたがって低くなった。このことから、抽出に用いる水溶液中の糖質濃度を高めれば、疎水基含有水溶性有機化合物と比較して糖の極性有機溶媒相への移動が少なくなり、高純度の疎水基含有水溶性有機化合物が得られることがわかった。
【０１７２】
（実施例１９：ハイドロキノン配糖体の抽出に対する、配糖化反応溶液の濃縮の影響）
上記実施例１８に示すように、水溶液中の糖質の濃度を高めれば、有機相への糖質の移動が抑制されて、疎水基含有水溶性有機化合物が有機相に効率よく移動することがわかった。それゆえ、疎水基含有水溶性有機化合物を含む酵素反応溶液を濃縮することによって、有機相への糖質の移動が抑えられ、疎水基含有水溶性有機化合物の抽出効率が上がるかどうかを確認した。
【０１７３】
まず、デキストリン（ＤＥが７〜９のパインデックス＃１；松谷化学社製）３５％およびハイドロキノン１５％が溶解している水溶液を５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ６．５に調整し、配糖化酵素（日本国特許公開平６−２７７０５３号公報に記載のアミラーゼＸ−２３）を２０ユニット／ｍｌの濃度になるように添加し、次いで４５℃で４０時間インキュベートしてハイドロキノンへの配糖化反応をおこなった。この反応終了後の配糖化反応溶液１ｍｌあたり２．１μｌ（１．５倍量）のグルコアミラーゼ（ナガセケムテックス社製；商品名ＸＬ−４）を加えた。この後、４５℃で４時間グルコアミラーゼ処理を行い、反応溶液を得た。
【０１７４】
この反応溶液５ｍｌを、エバポレーターによって濃縮して、容積が８０％（４．０ｍｌ）または７０％（３．５ｍｌ）になるように濃縮した。未濃縮の反応溶液、８０％の濃縮液または７０％の濃縮液に、ＴＨＦを等容量加えて、ミキサーにより１分間激しく振盪し、３０℃の条件下で抽出を行い、混合物を１時間静置したところ、混合物は２相に分離した。上相のＴＨＦ相を分取した。得られたＴＨＦ相を、上記のようにＨＰＬＣによってグルコース、マルトースおよびハイドロキノン配糖体の含量について分析した。下相の水相に、水相の容量の０．５倍の容量のＴＨＦを再度加え、振盪し、抽出し、上相のＴＨＦ相を分取することをさらに２回繰り返した。得られたＴＨＦ相を合わせた。なお、濃縮液では分液時に中間層が発生したが、中間層は水相に加えた。結果を以下の表１０〜１２に示す。
【０１７５】
【表１０】
【０１７６】
【表１１】
【０１７７】
【表１２】
この結果、予想した通り、グルコアミラーゼ処理後の反応液を濃縮してからＴＨＦ抽出を行うことにより、ＴＨＦ相へのグルコース抽出量を、未濃縮の場合の５０％〜６０％程度に抑制することができた。
【０１７８】
（実施例２０：相の分離に対する疎水基含有水溶性有機化合物の影響）
実施例１７に記載されるように、配糖化反応溶液をＴＨＦで抽出する場合、グルコース濃度が２０％以下でも水相と有機相とは完全に分離し、ＴＨＦ相の方が水相よりも大きくなった。一方、上記実施例１８では、４２％グルコースおよび９％ハイドロキノン配糖体を含有する溶液（この溶液には、ハイドロキノンがほとんど入っていない）を、グルコース濃度が２０％になるように水で希釈した場合、ＴＨＦを添加しても相が分離しなかった。そこで、相の分離に対する疎水基含有水溶性有機化合物の影響を調べた。
【０１７９】
上記実施例１８で調製した２０％グルコース含有希釈液に、１０％となるようにハイドロキノンを添加して水溶液を得た。この水溶液に、等容量のＴＨＦを添加して、ミキサーにより５分間攪拌し、そして１時間静置した。その結果、ＴＨＦ相と水相とに完全に分離した。また、ＴＨＦ相に水が混入して、ＴＨＦ相の方が水相よりも大きくなった。ＴＨＦ相を分取し、ＴＨＦ中のハイドロキノン配糖体の含量を上記のようにＨＰＬＣによって測定した。その結果、ハイドロキノンを添加しない場合よりも多量のハイドロキノン配糖体が抽出されたことがわかった。これは、ハイドロキノンのようなＴＨＦ相に良く溶ける物質を水相に加えることでＴＨＦが水相に移動しなくなるため、分離がよくなったうえ、高濃度のハイドロキノンがＴＨＦに溶解することでハイドロキノンが配糖体の移行を促進したためと考えられる。
【０１８０】
（実施例２１：テトラヒドロフラン相への抽出に対する温度の影響）
テトラヒドロフラン相への抽出に対する温度の影響を調べた。
【０１８１】
まず、デキストリン（ＤＥが７〜９のパインデックス＃１；松谷化学社製）３５％およびハイドロキノン１５％が溶解している水溶液を５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ６．５に調整し、配糖化酵素（日本国特許公開平６−２７７０５３号公報に記載のアミラーゼＸ−２３）を２０ユニット／ｍｌの濃度になるように添加し、次いで４５℃で４０時間インキュベートしてハイドロキノンへの配糖化反応をおこなった。この反応終了後の配糖化反応溶液１ｍｌあたり２．１μｌ（１．５倍量）のグルコアミラーゼ（ナガセケムテックス社製；商品名ＸＬ−４）を加えた。この後、混合物を４５℃で４時間インキュベートして、グルコアミラーゼ処理後反応溶液を得た。
【０１８２】
５ｍｌのグルコアミラーゼ処理後反応溶液に５ｍｌのＴＨＦを加え、各温度（３、１０、２２、または４５℃）にてミキサーを用いて５分間攪拌した後、混合物を３０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。その結果、混合物は２相に分離した。水相を分取し、この水相に水を加えて５ｍｌに調整して水溶液を得た。この調整後の水溶液を、上記のようにＨＰＬＣにてハイドロキノン、ハイドロキノン配糖体およびグルコースの濃度を測定した。
【０１８３】
結果を以下の表１３に示す。
【０１８４】
【表１３】
表１３の結果にもとづいてハイドロキノン配糖体およびグルコースの移動率を算出した。移動率のグラフを図２に示す。
【０１８５】
表１３および図２からわかるように、抽出温度が低い場合、ＴＨＦ相への糖の移動が多かった。温度の上昇に従って、ハイドロキノン、ハイドロキノン配糖体およびグルコースのＴＨＦ相への移動率は下がった。これは、温度の上昇に従ってＨＱＧおよびグルコースの水相への溶解度が上がって、ＴＨＦ相への移動が減少したものと考えられる。また、温度が高いほど、ハイドロキノン配糖体とグルコースとの移動率の差が広がるので、なるべく高い温度で抽出することにより、ハイドロキノン配糖体の純度をより高めることができることがわかった。
【０１８６】
【発明の効果】
本発明により、疎水基含有水溶性有機化合物の抽出方法が提供される。本発明の抽出方法および精製方法は、各種動物および植物の有効成分を抽出および精製する手法として、あるいは各種酵素反応溶液から有効成分を抽出および精製する手法として用いることが可能である。本発明の方法により、疎水基含有水溶性有機化合物を容易でかつ安価に分離および精製することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、テトラヒドロフラン抽出に対するグルコース濃度の影響を示すグラフである。
【図２】図２は、ハイドロキノン配糖体およびグルコースのテトラヒドラフラン相への移動率を示すグラフである。
【発明の属する技術分野】
本発明は、疎水基含有水溶性有機化合物を含む水溶液（例えば、動物または植物由来の抽出物ならびに酵素反応液）から疎水基含有水溶性有機化合物を高純度でかつ高収率で抽出する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生薬抽出物に代表されるように、さまざまな生理活性を持った天然化合物が数多く知られている。これらの天然化合物は、生理活性物質とも呼ばれる。多くの生理活性物質は、一般に、生理活性物質を含む材料と水、お湯または低濃度のアルコール水溶液とを用いて抽出操作を行って抽出液を得て、その後、抽出液を濃縮し、濃縮された抽出液をカラムクロマトグラフィーにかけることによって精製される。しかしながら、この精製方法によって生理活性物質を大量に生産するためには、大きなカラムおよびそれに付随する設備が必要である。また、小さいカラムでは効率が非常に悪い。そのため、精製された生理活性物質は非常に高価である。
【０００３】
生理活性物質を溶媒抽出方法によって精製することも試みられている。しかし、酢酸エチル、ブタノール、クロロホルム等の本来水と混ざらない有機溶媒を水溶液に添加し、攪拌し、静置して水相と有機溶媒相との２相を得たのち、有機溶媒相に移動した生理活性物質を回収する方法は、安全性の問題上食品に使用することはできない。生理活性物質を食品以外の用途に用いる場合であっても、有機溶媒相にあまり移動しないため、有機溶媒による抽出が非効率的である生理活性物質も存在する。エタノール、アセトン等の、食品に使用できる有機溶媒は水と混ざってしまうので、これらの有機溶媒を用いて生理活性物質を水溶液から抽出および精製することはできない。
【０００４】
オレンジ果汁に含まれる代表的なフラボノイド類の一つにヘスペリジンがある。ヘスペリジンを代表とするフラボノイド類は、例えば、以下のような生理作用を有することが知られている。ヘスペリジンおよびルチンは、以前はビタミンＰと呼ばれ、血圧を下げる作用が古くから知られている（神谷真太郎、新ビタミン学、（日本ビタミン学会）１９６９、ｐ４３９）。ヘスペリジンはまた、以下の生理作用を有することも報告されている：抗炎症作用、抗痛み作用（Ｅ，Ｍ．Ｇａｌａｔｉ ｅｔ ａｌ．， Ｉｌ Ｆａｒｍａｃｏ，４９，７０９−７１２（１９９４））、抗アレルギー作用（松田英秋ｅｔ ａｌ．；薬学雑誌、１１１、１９３−１９８（１９９１）、Ｊ．Ａ．Ｄａ Ｓｉｌｖａ Ｅｍｉｍ ｅｔ ａｌ．；Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，４６，１１８−７１２（１９９４））、ＬＤＬ−コレステロールを減少させ血中コレステロール値を改善する作用（Ｍ．Ｔ．Ｍｏｎｆｏｒｔｅ ｅｔ ａｌ．；Ｉｌ Ｆａｒｍａｃｏ，５０，５９５−５９９（１９９５））、抗癌作用（Ｔ．Ｔａｎａｋａ，ｅｔ ａｌ．；Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５４，４６５３−４６５９（１９９４）、Ｔ．Ｔａｎａｋａ，ｅｔ ａｌ．；Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５７，２４６−２５２（１９９７）、Ｔ．Ｔａｎａｋａ，ｅｔ ａｌ．；Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，１８，７６１−７６９（１９９７）、Ｔ．Ｔａｎａｋａ，ｅｔ ａｌ．；Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，１８，９５７−９６５（１９９７））。さらに、最近の研究では、ヘスペリジンは前駆脂肪細胞の分化を促進し、糖尿病などの症状を改善する作用も有することが期待されている。ディオスミンは強い抗酸化活性を有する。
【０００５】
ディオスミンおよびヘスペリジンを含有する薬剤は、静脈不全、痔疾などの治療薬として利用されている（Ｃ．Ｌａｂｒｉｄ；Ａｎｇｉｏｌｏｇｙ，４５，５２４−５３０（１９９４））。さらに、ヘスペリジン単独、ディオスミン単独およびヘスペリジンとディオスミンとの混合物が口腔ガン、食道ガン、大腸ガンなどを抑制することも報告されている（Ｔ．Ｔａｎａｋａ，ｅｔ ａｌ．；Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５４，４６５３−４６５９（１９９４）、Ｔ．Ｔａｎａｋａ，ｅｔ ａｌ．；Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５７，２４６−２５２（１９９７）、Ｔ．Ｔａｎａｋａ，ｅｔ ａｌ．；Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，１８， ７６１−７６９（１９９７）、Ｔ．Ｔａｎａｋａ，ｅｔ ａｌ．；Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，１８，９５７−９６５（１９９７））。
【０００６】
ナリンジンおよびネオヘスペリジンは柑橘類の苦味物質として知られており、苦味の付与を目的に食品および飲料に用いられている。
【０００７】
さらに最近では、イソフラボンが骨密度の向上に有効であること、乳ガンの発生を抑制することなどが明らかにされてきている（戸田ｅｔ ａｌ．；ＦＯＯＤＳ ａｎｄ ＩＮＧＲＥＤＩＥＮＴＳ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＪＡＰＡＮ，Ｎｏ．１７２，８３−８９（１９９７））。
【０００８】
ヘスペリジンおよびルチンは本来アセトンに溶解しない。
【０００９】
一方、ヘスペリジン、ナリンジン、ネオヘスペリジン、ルチンなどのフラボノイド類は水に難溶である。この難溶性という欠点を克服する目的で、これらの難溶性化合物を効率よく可溶化する試みがなされている。例えば、ヘスペリジン、ナリンジン、ネオヘスペリジン、ルチンなどのフラボノイド類を酵素的に配糖化し、溶解性を高める方法が知られている（日本国特許公開平７−１０７９７２）。
【００１０】
上記フラボノイド以外でもカテキン、コーヒー酸、コウジ酸、ハイドロキノン、カテコール、レゾルシノール、プロトカテキュー酸、没食子酸、バニリン、ダイゼイン、ゲニステイン、α−レゾルシル酸およびフロログルシノールを同様の目的の為に酵素的に配糖化し、溶解性を高める方法が知られている（日本国特許公告平７−３６７５８およびＴ．Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ著、Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．，７８（１９９４）ｐ３７）。
【００１１】
しかしながら、配糖体自身の水溶性が向上しているため水と混ざらない溶媒では効率的に抽出できなかったり、配糖化を行った酵素反応液から生成した配糖体を精製するためには、安全性上の問題から、吸着クロマトグラフィーなどのカラムクロマトグラフィーを行う必要がある。
【００１２】
従来の精製法では、部分精製されたフラボノイド類、カテキン類、フェノール類およびこれらの配糖体を天然の材料から得るためには、天然の材料およびアルカリ性水溶液、有機溶媒、熱水などを用いて抽出を行った後、抽出液をカラムクロマトグラフィーで精製する方法がとられている。しかし、これらの物質を高収率で安価に大量に得るためには食品に使用できる安全な有機溶媒による抽出を行い精製する必要がある。しかしながら、食品に利用できるアセトンは水と混ざってしまうので、アセトンでこれらの物質を抽出することはできない。また食品および薬品の分野で有効な生理活性物質の多くは、水、エタノール、アセトン等の極性の高い溶媒に溶けやすく、極性の低い溶媒に溶けにくい性質を持っている。そのため、極性の低い溶媒では効率的に抽出することができない。
【００１３】
【特許文献１】
特開平７−１０７９７２号公報
【特許文献２】
特公平７−３６７５８号公報
【特許文献３】
特開平８−８０１７７号公報
【特許文献４】
特開平６−２７７０５３号公報
【００１４】
【非特許文献１】
神谷真太郎，「新ビタミン学」，（日本ビタミン学会）１９６９年，ｐ．４３９
【非特許文献２】
Ｅ，Ｍ．Ｇａｌａｔｉ ｅｔ ａｌ．，「Ｉｌ Ｆａｒｍａｃｏ」，１９９４年，４９，ｐ．７０９−７１２
【非特許文献３】
松田英秋ｅｔ ａｌ．，「薬学雑誌」、１９９１年，１１１，ｐ．１９３−１９８
【非特許文献４】
Ｊ．Ａ．Ｄａ Ｓｉｌｖａ Ｅｍｉｍ ｅｔ ａｌ．，「Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．」，１９９４年，４６，ｐ．１１８−７１２
【非特許文献５】
Ｍ．Ｔ．Ｍｏｎｆｏｒｔｅ ｅｔ ａｌ．，「Ｉｌ Ｆａｒｍａｃｏ」，１９９５年，５０，５９５−５９９
【非特許文献６】
Ｔ．Ｔａｎａｋａ，ｅｔ ａｌ．，「Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」，１９９４年，５４，ｐ．４６５３−４６５９
【非特許文献７】
Ｔ．Ｔａｎａｋａ，ｅｔ ａｌ．，「Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」，１９９７年，５７，ｐ．２４６−２５２
【非特許文献８】
Ｔ．Ｔａｎａｋａ，ｅｔ ａｌ．，「Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ」，１９９７，１８，ｐ．７６１−７６９
【非特許文献９】
Ｔ．Ｔａｎａｋａ，ｅｔ ａｌ．，「Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ」，１９９７年，１８，ｐ．９５７−９６５
【非特許文献１０】
Ｃ．Ｌａｂｒｉｄ，「Ａｎｇｉｏｌｏｇｙ」，１９９４年，４５，ｐ．５２４−５３０
【非特許文献１１】
戸田ｅｔ ａｌ．，「ＦＯＯＤＳ ＡＮＤ ＩＮＧＲＥＤＩＥＮＴＳＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＪＡＰＡＮ」，１９９７年，Ｎｏ．１７２，ｐ．８３−８９
【非特許文献１２】
Ｔ．Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，「Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．」，１９９４年，７８，ｐ．３７
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】
生理活性物質を簡便かつ安価に精製するための方法を提供すること。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは鋭意研究を行った結果、本来水またはお湯に混ぜた際に水相と分離しにくい有機溶媒であっても、生理活性物質を含有する水溶液中に糖質などの保水性の性質をもつ物質が存在することにより、この水溶液と有機溶媒とを混合し、攪拌した後に水相と有機相とを容易に分離できることを見出し、さらに有機相に生理活性物質が移動することを見出した。本発明者らはさらに、塩化ナトリウムおよびクエン酸ナトリウムなどの塩、または有機酸をこの水溶液に添加して、この水溶液のイオン強度を上げることにより、糖質が存在しても水相から分離されない、あるいは分離されにくい有機溶媒を用いた場合であっても水相から分離され、生理活性物質を有機溶媒相に効率的に移動させることができることを見出した。本発明者らは、これらの知見に基づいて本発明を完成させた。
【００１７】
本発明の方法は、疎水基含有水溶性有機化合物の抽出方法であって、該疎水基含有水溶性有機化合物および糖質を含有する水溶液と、極性有機溶媒とを接触させて、水相と有機相とを得、該疎水基含有水溶性有機化合物を該有機相に移動させる工程を包含する。
【００１８】
１つの実施形態では、上記水溶液中の糖質の濃度は、該水溶液１００ｍｌあたり１２ｇ以上であり得る。
【００１９】
１つの実施形態では、上記疎水基含有水溶性有機化合物は、水溶性芳香族化合物であり得る。
【００２０】
１つの実施形態では、上記疎水基含有水溶性有機化合物は、フェノール誘導体およびそれらの配糖体からなる群より選択され得る。
【００２１】
１つの実施形態では、上記疎水基含有水溶性有機化合物は、ハイドロキノン配糖体、カテキン、サリシン、ヘスペリジン、ヘスペリジン配糖体、コーヒー酸、サリシルアルコールおよびエラジタンニンからなる群より選択され得る。
【００２２】
１つの実施形態では、上記水溶液は相分離補助剤をさらに含有し得る。
【００２３】
１つの実施形態では、上記相分離補助剤は、塩または有機酸であり得る。
【００２４】
１つの実施形態では、上記相分離補助剤は、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、硫酸マグネシウムおよび硫酸アンモニウムからなる群より選択され得る。
【００２５】
１つの実施形態では、上記極性有機溶媒は、テトラヒドロフランまたはアセトニトリルであり得る。
【００２６】
１つの実施形態では、上記極性有機溶媒は、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、アセトンまたはイソプロピルアルコールであり得る。
【００２７】
１つの実施形態では、上記疎水基含有水溶性有機化合物は、酵素反応溶液に由来し得る。
【００２８】
１つの実施形態では、上記酵素反応溶液は、配糖化反応溶液であり得る。
【００２９】
１つの実施形態では、上記配糖化反応溶液は、ヘスペリジンまたはハイドロキノンの配糖化反応溶液であり得る。
【００３０】
１つの実施形態では、上記疎水基含有水溶性有機化合物は、動物または植物から選択される生物に由来し得る。
【００３１】
１つの実施形態では、上記疎水基含有水溶性有機化合物は、果汁に由来し得る。
【００３２】
１つの実施形態では、上記水溶液は、上記疎水基含有水溶性有機化合物および糖質を含有する酵素反応溶液を濃縮することにより調製され得る。
【００３３】
１つの実施形態では、上記酵素反応溶液は、配糖化反応溶液であり得る。
【００３４】
１つの実施形態では、上記配糖化反応溶液は、ヘスペリジンまたはハイドロキノンの配糖化反応溶液であり得る。
【００３５】
１つの実施形態では、上記水溶液は、上記疎水基含有水溶性有機化合物および糖質を含有する生物抽出物を濃縮または希釈することにより調製され得、ここで該生物が動物または植物であり得る。
【００３６】
１つの実施形態では、上記水溶液は、果汁を濃縮することにより調製され得る。
【００３７】
１つの実施形態では、上記水溶液は、上記疎水基含有水溶性有機化合物および糖質を含有する酵素反応溶液またはその濃縮液に上記相分離補助剤を添加することにより調製され得る。
【００３８】
１つの実施形態では、上記酵素反応溶液は、配糖化反応溶液であり得る。
【００３９】
１つの実施形態では、上記配糖化反応溶液は、ヘスペリジンまたはハイドロキノンの配糖化反応溶液であり得る。
【００４０】
１つの実施形態では、上記水溶液は、上記疎水基含有水溶性有機化合物および糖質を含有する生物抽出物またはそれらの濃縮物もしくは希釈物に上記相分離補助剤を添加することにより調製され得、ここで該生物が動物または植物であり得る。
【００４１】
１つの実施形態では、上記水溶液は、果汁またはその濃縮物に上記相分離補助剤を添加することにより調製され得る。
【００４２】
本発明の精製方法は、フェノール誘導体配糖体の精製方法であって、フェノール誘導体、フェノール誘導体配糖体および糖質を含有する第１の水溶液と、極性有機溶媒とを接触させて、第１の水相と少量の水を含む有機相とを得、該フェノール誘導体およびフェノール誘導体配糖体を該有機相に移動させる工程；該少量の水を含む有機相を分取する工程；該少量の水を含む有機相から該極性有機溶媒を除去して、該フェノール誘導体およびフェノール誘導体配糖体を含有する第２の水溶液を得る工程；該第２の水溶液と酢酸エチルとを接触させて、第２の水相と酢酸エチル相とを得、該フェノール誘導体を該酢酸エチル相に移動させる工程；該第２の水相を分取する工程；および該第２の水相を濃縮し、そして冷却することにより、該フェノール誘導体配糖体を沈殿させる工程を包含する。
【００４３】
１つの実施形態では、上記フェノール誘導体およびフェノール誘導体配糖体は、該フェノール誘導体の配糖化酵素反応溶液に由来し得る。
【００４４】
１つの実施形態では、上記配糖化反応溶液は、ヘスペリジンまたはハイドロキノンの配糖化反応溶液であり得る。
【００４５】
１つの実施形態では、上記第１の水溶液は、相分離補助剤をさらに含有し得る。
【００４６】
１つの実施形態では、上記配糖化反応溶液は、ヘスペリジンまたはハイドロキノンの配糖化反応溶液であり得る。
【００４７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。本明細書において、特にことわらない限り、濃度は、溶液１００立方センチメートルあたりのグラム数で表される。例えば、「１０％塩化ナトリウム水溶液」とは、溶液１００立方センチメートル当たり１０ｇの塩化ナトリウムが溶解している塩化ナトリウム水溶液をいう。
【００４８】
本発明の方法は、疎水基含有水溶性有機化合物の抽出方法である。本発明の方法は、疎水基含有水溶性有機化合物および糖質を含有する水溶液と、極性有機溶媒とを接触させて、水相と有機相とを得、疎水基含有水溶性有機化合物を有機相に移動させる工程を包含する。
【００４９】
（１）疎水基含有水溶性有機化合物
本明細書中では、「疎水基含有水溶性有機化合物」とは、疎水基を含有し、水に溶ける、有機化合物をいう。
【００５０】
「水溶性」化合物とは、本明細書中では、２０℃の水１リットルに０．０１ｇ以上溶解し得る化合物をいう。疎水基含有水溶性有機化合物は、２０℃の水１リットルに好ましくは０．１ｇ以上、より好ましくは１ｇ以上、さらに好ましくは５ｇ以上、最も好ましくは１０ｇ以上溶解する。溶解度に上限は特にないが、好ましくは２０℃の水１リットルに３００ｇ以下である。より好ましくは溶解度は２０℃の水１リットルに１００ｇ以下である。
【００５１】
疎水基は、好ましくは炭素原子を３個以上含む疎水基であり、より好ましくは芳香族残基である。疎水基含有水溶性有機化合物の例としては、フラボノイド類、イソフラボン類、フェノール性化合物、フラボノイド配糖体、イソフラボン配糖体、フェノール性化合物配糖体、ハイドロキノン配糖体、アントラセン配糖体、カルコン配糖体などの水溶性芳香族化合物、テルペン配糖体、ステロイド配糖体、トリテルペノイド配糖体、アルカロイド配糖体、およびＣ−配糖体が挙げられる。疎水基含有水溶性有機化合物は、好ましくは水溶性芳香族化合物である。
【００５２】
本明細書中では、「水溶性芳香族化合物」とは、水に溶ける化合物であって、芳香族基を有する化合物をいう。
【００５３】
水溶性芳香族化合物は、好ましくはフェノール誘導体およびそれらの配糖体からなる群より選択される。
【００５４】
「フェノール誘導体」とは、フェノール骨格（すなわち、ベンゼン環）またはフラボノイド骨格を含む化合物であって、フェノール骨格またはフラボノイド骨格に結合している水酸基を有する化合物、フェノールおよびコウジ酸をいう。フェノール誘導体の例としては、単一のフェノール骨格またはフラボノイド骨格上に１つのフェノール性水酸基を有する化合物、および単一のフェノール骨格またはフラボノイド骨格上に２つ以上のフェノール性水酸基を有する化合物が挙げられる。以下、本明細書中では便宜上、１つのフェノール性水酸基を単一のフェノール骨格またはフラボノイド骨格上に有する化合物をモノフェノール系（ｍｏｎｏ−ｐｈｅｎｏｌ ｔｙｐｅ）化合物と呼び、２つ以上のフェノール性水酸基を単一のフェノール骨格またはフラボノイド骨格上に有する化合物をポリフェノール系（ｐｏｌｙ−ｐｈｅｎｏｌ ｔｙｐｅ）化合物と呼ぶ。
【００５５】
２つのフェノール性水酸基を単一のフェノール骨格またはフラボノイド骨格上に有する化合物をジフェノール化合物と呼ぶ。
【００５６】
フェノール性水酸基を有するフェノール誘導体配糖体は、フェノール誘導体に含まれる。
【００５７】
単一のフェノール骨格またはフラボノイド骨格上に１つのフェノール性水酸基を有するモノフェノール系化合物の例としては、フェノール、サリシルアルコール、コウジ酸、ジメトキシフェノール、アセトアミノフェン、バニリン、およびダイゼインが挙げられる。
【００５８】
モノフェノール化合物の例としてはまた、モノフェノール系フラボノイド系化合物が挙げられる。モノフェノール系フラボノイド系化合物の例としては、モノフェノール系フラボン系化合物、モノフェノール系イソフラボン系化合物、モノフェノール系フラボノール系化合物、モノフェノール系フラバノン系化合物、モノフェノール系フラバノノール系化合物、モノフェノール系カテキン系化合物、モノフェノール系オーロン系化合物、モノフェノール系カルコン系化合物およびモノフェノール系ジヒドロカルコン系化合物が挙げられる。
【００５９】
ジメトキシフェノールの例としては、２，３−ジメトキシフェノール、２，４−ジメトキシフェノール、２，５−ジメトキシフェノール、２，６−ジメトキシフェノール、３，４−ジメトキシフェノールおよび３，５−ジメトキシフェノールが挙げられる。３，４−ジメトキシフェノールおよび３，５−ジメトキシフェノールが好ましい。
【００６０】
単一のフェノール骨格またはフラボノイド骨格上に２つ以上のフェノール性水酸基を有するポリフェノール系化合物の例としては、ハイドロキノン、ヘスペレチン、エピガロカテキン、エピカテキンガレート、アントシアニジン系化合物、アントシアニン系化合物、コーヒー酸、カテコール、レゾルシノール、プロトカテキュー酸、没食子酸、ゲニステイン、β‐レゾルシル酸、およびフロログルシノールが挙げられる。
【００６１】
ジフェノール化合物の例としてはまた、ジフェノール系フラボノイド系化合物が挙げられる。ジフェノール系フラボノイド系化合物の例としては、ジフェノール系フラボン系化合物、ジフェノール系イソフラボン系化合物、ジフェノール系フラボノール系化合物、ジフェノール系フラバノン系化合物、ジフェノール系フラバノノール系化合物、ジフェノール系カテキン系化合物、ジフェノール系オーロン系化合物、ジフェノール系カルコン系化合物およびジフェノール系ジヒドロカルコン系化合物が挙げられる。
【００６２】
レゾルシル酸の例としては、α−レゾルシル酸、β−レゾルシル酸、およびγ−レゾルシル酸が挙げられる。本発明では、β−レゾルシル酸が好ましい。
【００６３】
本明細書中では、「フェノール誘導体配糖体」とは、フェノール誘導体部分と、１以上の糖部分とがグリコシド結合によって結ばれた物質である。フェノール誘導体配糖体は、ハイドロキノン−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシド、サリシン、コーヒー酸−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシド、３，４−ジメトキシフェノール−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシド、カテキン−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシドのようなモノグルコピラノシドであってもよいし、上記のモノグルコピラノシドにさらに糖部分が結合したジグルコピラノシド（例えば、ヘスペリジン誘導体）、トリグルコピラノシドなどであってもよい。
【００６４】
本明細書中では、配糖体とは、アグリコンと１以上の糖部分とがグリコシド結合によって結ばれた物質である。糖部分の重合度は、好ましくは１〜１０であり、より好ましくは１〜５であり、さらに好ましくは１〜３である。糖部分は、単糖部分であってもよく、２糖部分であってもよい。本明細書中では、グルコシドは配糖体の定義に含まれる。グルコシドは、１以上のグルコース部分がアグリコンに結合した配糖体である。
【００６５】
疎水基含有水溶性有機化合物は、好ましくは、サリシン、コニフェリン、アルブチン、センノシド、ステビオサイド、ルブソサイド、ルチン、ヘスペリジン、ナリンジン、ダイゼイン、ゲニスチン、バルバロイン、バニリン、サポニン、ベルベリン、ケンフェロール、バイカリン、カピラリン、カテキン、コリダリン、エスクレチン、エピカテキン、ジンゲロール、グリチルリチン、ディオスミン、ネオヘスペリジン、コーヒー酸、サリシルアルコール、エラジタンニンおよびハイドロキノンからなる群より選択される。疎水基含有水溶性有機化合物は、より好ましくは、ハイドロキノン配糖体、カテキン、サリシン、ヘスペリジン、ヘスペリジン配糖体、コーヒー酸、サリシルアルコールおよびエラジタンニンからなる群より選択される。
【００６６】
疎水基含有水溶性有機化合物は、水溶液中に任意の濃度で存在し得る。疎水基含有水溶性有機化合物の濃度は、好ましくは０．０１％〜５０％、より好ましくは０．１％〜４０％、さらに好ましくは０．５％〜３０％であり、さらに好ましくは１％〜２０％であり、最も好ましくは５％〜１５％である。水溶液中に存在する疎水基含有水溶性有機化合物の濃度が低すぎると、精製の効率が悪い場合がある。水溶液中に存在する疎水基含有水溶性有機化合物の濃度が高すぎると、疎水基含有水溶性有機化合物が沈殿する場合がある。疎水基含有水溶性有機化合物が沈殿しない濃度が好ましい。
【００６７】
疎水基含有水溶性有機化合物は、疎水基含有水溶性有機化合物を含有する酵素反応溶液に由来し得る。本明細書において酵素反応溶液とは、任意の出発物質を酵素反応に供することにより得られる溶液をいう。このような酵素反応溶液の例としては、疎水基含有水溶性有機化合物の配糖化反応溶液、加水分解反応溶液、転移反応溶液および縮合反応溶液が挙げられる。酵素反応溶液は好ましくは、糖質を含む。酵素反応溶液は通常、反応が進行して、反応生成物が産生された後の反応溶液である。
【００６８】
配糖化反応の例としては、代表的には、サイクロデキストリングルカノトランスフェラーゼによって触媒される、糖転移受容体に対する糖転移反応がある。このような糖転移受容体の例としては、糖を構造中に含むフラボノイド、構造中に糖を含まないフラボノイド、フェノール化合物およびフェノール性化合物配糖体が挙げられる。代表的な糖転移受容体の例としては、ヘスペリジン、ナリンジン、ネオヘスペリジンおよびルチンが挙げられる。
【００６９】
配糖化反応の別の例は、転移型アミラーゼによって触媒される、糖転移受容体に対する糖転移反応がある。このような糖転移受容体の例としては、カテキン、コーヒー酸、コウジ酸、ハイドロキノン、カテコール、レゾルシノール、プロトカテキュー酸、没食子酸、バニリン、ダイゼイン、ゲニステイン、α−レゾルシル酸およびフロログルシノールが挙げられる。
【００７０】
配糖化反応溶液は、好ましくはヘスペリジンまたはハイドロキノンの配糖化反応溶液である。
【００７１】
酵素反応を触媒する酵素の例としては、サイクロデキストリングルカノトランスフェラーゼおよび転移型アミラーゼ以外に、α−アミラーゼ、プルラナーゼ、アミロマルターゼ、Ｄ−酵素、ネオプルラナーゼ、サイクロデキストリナーゼ、α−グルコシダーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼおよびβ−ガラクトシダーゼが挙げられる。
【００７２】
疎水基含有水溶性有機化合物を含有する酵素反応溶液は、当業者に公知の方法によって設計および入手され得る。
【００７３】
疎水基含有水溶性有機化合物はまた、疎水基含有水溶性有機化合物を含有する任意の天然材料に由来し得る。疎水基含有水溶性有機化合物は例えば、生物（例えば、動物または植物）に由来し得る。あるいは、動物抽出物または植物抽出物を用いることもできる。動物抽出物とは、動物から抽出される任意の物質をいい、植物抽出物とは、植物から抽出される任意の物質をいう。例えば、植物の葉、茎、根、花、実などから得られる任意の疎水基含有水溶性有機化合物が使用可能である。植物材料の例としては、大豆、大豆加工品、ナマコ、五倍子、黄ごん、アロエ、地黄、薬用人参、芍薬、クチナシ、甘草、柴胡、大黄、ドクダミ、クマコケモモ、茶、甜茶および柑橘類（例えば、オレンジの実）が挙げられる。また、動物の体内に存在する任意の疎水基含有水溶性有機化合物が使用可能である。
【００７４】
（２）糖質
本明細書中では、糖質とは、Ｃｎ（Ｈ２Ｏ）ｍという一般式を有する化合物をいう。糖質は、構成要素である糖単位の数によって単糖、オリゴ糖、および多糖に分けられる。本発明では、単糖およびオリゴ糖が好ましい。本発明では、水に溶解する糖質または水に溶解しないが保水性を有する糖質が好ましい。
【００７５】
単糖の例としては、Ｄ−グルコース、ガラクトース、フルクトース、アラビノース、キシロース、ラムノースが挙げられる。単糖は、Ｄ−グルコースであることが好ましい。
【００７６】
オリゴ糖とは、本明細書中では、２〜１０個の単糖が脱水縮合して生じた物質をいう。オリゴ糖は、好ましくは２〜９個の糖単位、より好ましくは２〜８個の糖単位、さらに好ましくは２〜７個の糖単位を有する。オリゴ糖の例としては、スクロース、ラクトース、マルトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、ラクトオリゴ糖およびフルクトオリゴ糖が挙げられる。マルトオリゴ糖の例としては、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース、マルトオクタオース、マルトノナオースおよびマルトデカオースが挙げられる。オリゴ糖は、直鎖状のオリゴ糖であってもよいし、分枝状のオリゴ糖であってもよい。オリゴ糖は、その分子内に、環状部分を有し得る。
【００７７】
多糖とは、本明細書中では、１１個以上の単糖が脱水縮合して生じた物質をいう。多糖は、好ましくは少なくとも１つのα−１，４結合を有する。多糖の例としては、デキストリン、アミロース、アミロペクチン、デンプン、デキストランおよびセルロースが挙げられる。
【００７８】
デキストリンとは、デンプンを化学的または酵素的方法で低分子化した物質をいう。デキストリンの例としては、ブリティシュガム、黄色デキストリン、白色デキストリン、パインデクス（松谷化学工業株式会社）、サンデック（三和澱粉株式会社）、テトラップ（林原商事株式会社）が挙げられる。
【００７９】
アミロースとは、α−１，４結合によって連結されたグルコース単位から構成される直鎖分子である。アミロースは、天然のデンプン中に含まれる。
【００８０】
アミロペクチンとは、α−１，４結合によって連結されたグルコース単位に、α−１，６結合でグルコース単位が連結された、分枝状分子である。アミロペクチンは天然のデンプン中に含まれる。アミロペクチンとしては、例えば、アミロペクチン１００％からなるワキシーコーンスターチが用いられ得る。
【００８１】
デンプンは、アミロースとアミロペクチンとの混合物である。デンプンとしては、通常市販されているデンプンであればどのようなデンプンでも用いられ得る。デンプンに含まれるアミロースとアミロペクチンとの比率は、デンプンを生産する植物の種類によって異なる。モチゴメ、モチトウモロコシなどに含まれるデンプンは、そのほとんどがアミロペクチンである。デンプンは、天然のデンプン、デンプン分解物および化工デンプンに区分される。
【００８２】
天然のデンプンは、原料により、いも類デンプンおよび穀類デンプンに分けられる。いも類デンプンの例としては、馬鈴薯デンプン、タピオカデンプン、甘藷デンプン、くずデンプン、およびわらびデンプンなどが挙げられる。穀類デンプンの例としては、コーンスターチ、小麦デンプン、および米デンプンなどが挙げられる。
【００８３】
化工デンプンは、天然のデンプンに加水分解、エステル化、またはα化などの処理を施して、より利用しやすい性質を持たせたデンプンである。糊化開始温度、糊の粘度、糊の透明度、老化安定性などを様々な組み合わせで有する幅広い種類の化工デンプンが入手可能である。化工デンプンの種類には種々ある。このようなデンプンの例は、デンプンの糊化温度以下においてデンプン粒子を酸に浸漬することにより得られる、デンプン分子は切断するが、デンプン粒子は破壊していないデンプンである。
【００８４】
デンプン分解物は、デンプンに酵素処理または加水分解などの処理を施して得られる、処理前よりも分子量が小さいオリゴ糖もしくは多糖である。デンプン分解物の例としては、デンプン枝切り酵素分解物、デンプンホスホリラーゼ分解物およびデンプン部分加水分解物が挙げられる。
【００８５】
デンプン枝切り酵素分解物は、デンプンに枝切り酵素を作用させることによって得られる。枝切り酵素の作用時間を種々に変更することによって、任意の程度に分岐部分（すなわち、α−１，６−グルコシド結合）が切断されたデンプン枝切り酵素分解物が得られ得る。デンプン枝切り酵素分解物の例としては、糖単位数４〜１００００のうちα−１，６−グルコシド結合を１個〜２０個有する分解物、糖単位数３〜５００のα−１，６−グルコシド結合を全く有さない分解物、マルトオリゴ糖およびアミロースが挙げられる。デンプン枝切り酵素分解物の場合、分解されたデンプンの種類によって得られる分解物の分子量の分布が異なり得る。デンプン枝切り酵素分解物は、種々の長さの糖鎖の混合物であり得る。
【００８６】
デキストリンおよびデンプン部分加水分解物は、デンプンを、酸、アルカリ、酵素などの作用によって部分的に分解して得られる分解物をいう。本発明では、デキストリンおよびデンプン部分加水分解物の有する糖単位数は、好ましくは約１０〜約１００，０００、より好ましくは約５０〜約５０，０００、さらにより好ましくは約１００〜約１０，０００である。デキストリンおよびデンプン部分加水分解物の場合、分解されたデンプンの種類によって得られる分解産物の分子量の分布が異なり得る。デキストリンおよびデンプン部分加水分解物は、種々の長さを持つ糖鎖の混合物であり得る。
【００８７】
デキストランとは、α−１，６−グルカンをいう。
【００８８】
セルロースとは、β−１，４−グルコシド結合によって連結されたグルコース単位から構成される直鎖分子である。
【００８９】
糖質は１種類の化合物であってもよいし、複数種の化合物の混合物であってもよい。
【００９０】
糖質は、疎水基含有水溶性有機化合物を含有する水溶液中にもともと含まれていてもよいし、疎水基含有水溶性有機化合物を含有する水溶液に添加されてもよい。疎水基含有水溶性有機化合物を含有する水溶液中に糖質がもともと含まれていることが好ましい。このような水溶液の例としては、上記に列挙したような配糖化反応溶液および果汁が挙げられる。
【００９１】
糖質は低分子であることが好ましい。配糖化反応溶液のように、比較的高分子量の多糖を含有する溶液は、グルコアミラーゼのような、糖鎖を切断する酵素をその溶液に添加して反応させることによって、多糖を単糖またはオリゴ糖まで分解し得る。水溶液中の多糖は、有機溶媒との接触前に単糖またはオリゴ糖に分解されることが好ましい。糖質は、水溶液中にすべて溶解していることが好ましい。しかし、水溶液と有機溶媒との分離を妨げない限り、糖質は水溶液中に一部懸濁していてもよい。
【００９２】
水溶液中の糖質の濃度は、任意の濃度であり得る。水溶液中の糖質の濃度は、好ましくは１２％以上、より好ましくは２０％以上、さらに好ましくは３０％以上、さらに好ましくは４０％以上であり、最も好ましくは５０％以上である。糖質の濃度の上限は、糖質および疎水基含有水溶性有機化合物が沈殿しなければ任意の濃度であり得る。例えば、上限は、９０％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下または５５％以下である。
【００９３】
水溶液中の糖質の濃度は、当該分野で公知の方法によって測定され得る。例えば、簡便な方法としては、ブリックス糖度計による測定方法がある。ブリックス糖度計による測定方法は、簡便ではあるが、各種糖質を区別して測定することができない。各種糖質について区別して測定するためには、例えば、糖質を含有する水溶液を水：アセトニトリル＝２５：７５（ｖ／ｖ）の溶液を移動相として用いて、カラムＬｉＣｈｒｏｓｏｒｂ ＮＨ２（Ｍｅｒｃｋ製；４．０×２５０ｍｍ)を用いたＨＰＬＣにかけ、溶出液をＲＩ検出器を用いて測定することにより測定が可能である。
【００９４】
水溶液のｐＨは、好ましくは２〜１１であり、より好ましくは３〜９であり、さらに好ましくは４〜８である。
【００９５】
（３）極性有機溶媒
本明細書中では、「極性有機溶媒」とは、アルミナに対する溶媒強度（ε０）が０．４以上であり、蒸留水と混ざる有機溶媒をいう。極性有機溶媒の溶媒強度は、好ましくは０．４２〜０．９８であり、より好ましくは０．４４〜０．９５であり、最も好ましくは０．４４〜０．９０である。極性有機溶媒は、２０℃での誘電率が７．０以上の有機溶媒であってもよい。極性有機溶媒は、２０℃での誘電率が好ましくは７．３〜４０．０であり、より好ましくは７．４〜３９．０であり、最も好ましくは７．５〜３８．０である。
【００９６】
アルミナに対する溶媒強度の例を表１に示す。誘電率の例を表２に示す。本発明で使用される極性有機溶媒の例としては、以下の表１および表２に示され、上記範囲に溶媒強度または誘電率を有する極性有機溶媒が挙げられる。
【００９７】
【表１】
【表２】
【００９９】
極性有機溶媒は、１種類の化合物であることが好ましい。しかし、有機相が２相に分離しない限り、２種類以上の極性有機溶媒を混合して用い得る。当業者は、水溶液からの疎水基含有水溶性有機化合物の抽出のために適切な種類の極性有機溶媒を必要に応じて選択し得る。
【０１００】
水溶液と接触させる極性有機溶媒の量は、代表的には水溶液の容積の０．１倍〜１０倍であり、より好ましくは０．２倍〜２倍である。
【０１０１】
（４）相分離補助剤
水溶液は、相分離補助剤をさらに含有し得る。本明細書中では、「相分離補助剤」とは、水溶液と極性有機溶媒との混合物が水相と有機相とに分離するのを補助する物質をいう。ただし、相分離を補助する作用を有していても、糖質および疎水基含有水溶性有機化合物は相分離補助剤ではない。相分離補助剤は、例えば、塩析効果のある塩およびイオン強度を高めることが可能な水溶性物質であり得る。相分離補助剤は、塩または有機酸であり得る。相分離補助剤の例としては、硫安、硫酸マグネシウム等の硫酸塩、塩化ナトリウム、亜硫酸ナトリウム等のナトリウム塩、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、リン酸マグネシウム、リン酸アンモニウム等のリン酸塩、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム等の酢酸塩、乳酸ナトリウム、乳酸マグネシウム、乳酸カルシウム等の乳酸塩、クエン酸、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸、アスコルビン酸ナトリウム、リンゴ酸等の有機酸、塩化アンモニウムが挙げられるがこれらに限定されない。相分離補助剤は、好ましくは塩であり、より好ましくは塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、硫酸マグネシウムおよび硫酸アンモニウムからなる群より選択される。
【０１０２】
相分離補助剤は、相分離補助能を発揮するに十分な量で水溶液に含有され得る。このような量は当業者に公知である。相分離補助剤は、水溶液中に好ましくは５％以上、より好ましくは１０％以上、さらに好ましくは１５％以上、最も好ましくは２０％以上含有される。相分離補助剤の量の上限は特にないが、好ましくは５０％以下であり、より好ましくは４０％以下である。
【０１０３】
相分離補助剤は、予め水溶液に含有させることが好ましい。しかし、水溶液と極性有機溶媒とを接触させている間に相分離補助剤を添加することも可能である。
【０１０４】
（疎水基含有水溶性有機化合物および糖質を含有する水溶液の調製）
疎水基含有水溶性有機化合物および糖質を含有する水溶液は、当業者に公知の方法によって調製され得る。このような水溶液は、酵素反応をさせた後、何の処理も施していない酵素反応溶液であってもよいし、酵素反応後に濃縮、希釈、濾過、ｐＨ調整などを行った酵素反応溶液であってもよい。特に、酵素反応溶液の粘度が高すぎて攪拌できない場合は希釈することが好ましい。水溶液はまた、疎水基含有水溶性有機化合物および糖質を含有する酵素反応溶液またはその濃縮液に相分離補助剤を添加することにより調製されてもよい。
【０１０５】
水溶液はまた、疎水基含有水溶性有機化合物を含有する、動物または植物から選択される生物の抽出物であり得る。このような抽出物は、疎水基含有水溶性有機化合物を含有する、動物材料または植物材料を、当該分野で公知の方法によって抽出することにより調製され得る。代表的な抽出方法は、疎水基含有水溶性有機化合物を含有する、動物材料または植物材料を、水（例えば、０℃より高く、４０℃未満の水）、温水（例えば、４０℃以上６０℃未満の水）、熱水（例えば、６０℃以上１００℃未満の水）、アルコール、ピリジン、酢酸エチルまたはこれらの混合物のような抽出溶媒中に入れ、動物材料または植物材料からこれらの抽出溶媒へと疎水基含有水溶性有機化合物を移動させ、抽出溶媒から動物材料および植物材料を除去して抽出液を得て、そして必要に応じてこの抽出液を濃縮または乾固することを含む。抽出物は有機溶媒を含まないことが好ましい。抽出溶媒が有機溶媒である場合、抽出液を濃縮することによって、有機溶媒を除去することが好ましい。抽出物は、液体であっても、固体であってもよい。なお、本明細書中では、動物材料または植物材料の搾汁も、抽出物の定義に含まれる。水溶液は好ましくは、果汁である。動物材料は、動物全体であってもよいし、動物のうちの任意の器官または組織であってもよい。植物材料は、植物全体であってもよいし、植物のうちの任意の器官（例えば、花、果実、種子、根、茎および葉）または組織であってもよい。抽出に使用される動物材料および植物材料は、生の状態でも乾燥状態でもよい。抽出物が水溶液であれば、そのまま本発明で使用され得る。水溶液はまた、抽出物から、濃縮、希釈などによって調製され得る。特に、抽出物の粘度が高すぎて攪拌できない場合は希釈することが好ましい。なお、本発明の方法で使用される水溶液には、目的とする疎水基含有水溶性有機化合物が溶解している限り、他の任意の成分が懸濁していてもよい。水溶液はまた、疎水基含有水溶性有機化合物および糖質を含有する動物抽出物に、疎水基含有水溶性有機化合物および糖質を含有する植物抽出物に、またはこれらの抽出物の濃縮物もしくは希釈物に、相分離補助剤を添加することにより調製されてもよい。例えば、水溶液は、果汁またはその濃縮物に相分離補助剤を添加することにより調製されてもよい。
【０１０６】
抽出液には、サリシン、コニフェリン、アルブチン、センノシド、ステビオサイド、ルブソサイド、ルチン、ヘスペリジン、ナリンジン、ダイゼイン、ゲニスチン、バルバロイン、バニリン、サポニン、ベルベリン、ケンフェロール、バイカリン、カピラリン、カテキン、コリダリン、エスクレチン、エピカテキン、ジンゲロールおよびグリチルリチンからなる群より選択される有効成分が溶解していることが好ましい。
【０１０７】
（疎水基含有水溶性有機化合物の抽出）
本発明の方法では、疎水基含有水溶性有機化合物および糖質を含有する水溶液と、極性有機溶媒とを接触させて、水相と有機相とを得、それによって疎水基含有水溶性有機化合物を有機相に移動させる。
【０１０８】
水溶液と極性有機溶媒とは、例えば、水溶液と極性有機溶媒とを混合することによって接触され得る。水溶液と極性有機溶媒とを接触させることを、抽出するともいう。水溶液と極性有機溶媒とを接触させるときの温度は、好ましくは１０℃〜５０℃、より好ましくは２５℃〜４５℃、さらに好ましくは２０℃〜４０℃、最も好ましくは２５℃〜３５℃である。
【０１０９】
水溶液と極性有機溶媒とを混合および攪拌した後に静置することにより、水相と有機相とに分離する。一般的には、水相および有機相がそれぞれ層を形成し、水層および有機層となる。一般的には、比重の大きい溶媒層が下層となる。水よりも軽い比重の有機溶媒が使用される場合、通常、下層が水層となり、上層が有機層となる。
【０１１０】
通常、水相には少量の極性有機溶媒が含まれており、有機相には少量の水が含まれている。例えば、疎水基含有水溶性有機化合物（例えば、ヘスペリジンおよびルチン）を含む水溶液または懸濁液にアセトンを添加し、攪拌し、そして静置することによって水相と有機相（アセトン相）とが分離した場合、アセトン相には水が少量溶解しているために、有機相に水が含まれない場合と比較して疎水基含有水溶性有機化合物の溶解度が増し、アセトン中に疎水基含有水溶性有機化合物が効率的に溶解する。
【０１１１】
水溶液と極性有機溶媒とを混合して接触させている際には、その混合液を攪拌することが好ましい。攪拌の方法の例としては、回転、振とうおよびこれらの併用が挙げられるがこれらに限定されない。疎水基含有水溶性有機化合物を効率的に抽出および精製するためには、多段式向流分配装置（連続式液々抽出装置ともいう）を使用することが可能である。
【０１１２】
（フェノール誘導体配糖体の精製）
本発明の方法は、フェノール誘導体配糖体を精製する場合に特に有用である。フェノール誘導体配糖体の精製の場合を例にしてより詳細に説明する。
【０１１３】
フェノール誘導体配糖体は、例えば、糖質(例えば、マルトオリゴ糖またはデンプン)とフェノール誘導体とを酵素の存在下で反応させることによって形成され得る。通常、この反応は、ある段階で平衡化してそれ以上反応が進まなくなる。それゆえ、この酵素反応溶液中には、フェノール誘導体、フェノール誘導体配糖体および糖質が存在する。この酵素反応溶液が多糖またはオリゴ糖を含む場合、グルコアミラーゼのような糖分解酵素をこの酵素反応溶液に添加してインキュベートすることにより、酵素反応溶液中の多糖またはオリゴ糖を単糖に分解し得る。多糖またはオリゴ糖を単糖に分解すると、糖質の合計重量は変化しなくてもモル数が増加し、つまり、モル濃度が上昇して、その結果、水相と有機相との分離がより促進される。酵素反応溶液を極性有機溶媒と接触させて、第１の水相と少量の水を含む有機相とを得ると、この有機相には、フェノール誘導体およびフェノール誘導体配糖体が移動する。上記のように、相の分離を促進するために、水相中に相分離補助剤を添加して、相分離補助剤を含有する水溶液を得て、この水溶液を極性有機溶媒と接触させてもよい。
【０１１４】
次いで、この少量の水を含む有機相を分取する。フェノール誘導体およびフェノール誘導体配糖体は、疎水性部分を含むので糖質よりも有機相との親和性が高い。そのため、フェノール誘導体およびフェノール誘導体配糖体は有機相に効率的に移動するが、糖質は有機相にあまり移動しない。そのため、分取された有機相の中には、フェノール誘導体およびフェノール誘導体配糖体が抽出される。一般に、全体として同じ量の極性有機溶媒を用いて分配抽出を行う場合、全量を水溶液に１回に接触させて抽出を行うよりも、全量をいくつかのアリコートに分割して水溶液の抽出を複数回行う方が抽出効率が上がる。そのため、有機相を分取した後残った水相に極性有機溶媒を接触させて、水相と少量の水を含む有機相とを再度得て、この有機相を分取する工程を２回以上行ってもよい。有機相の分取を２回以上行った場合、得られた有機相を合わせて次の工程に用い得る。
【０１１５】
次いで、少量の水を含む有機相から極性有機溶媒が除去される。有機相から極性有機溶媒を除去する方法は、当業者に公知の任意の方法であり得る。このような方法の例としては、エバポレーターおよびエバポールによる濃縮が挙げられる。極性有機溶媒は、完全に除去されてもよく、この次の工程を妨害しない限り、少量残存していてもよい。極性有機溶媒を除去すると、極性有機溶媒中に含まれていた少量の水の中にフェノール誘導体およびフェノール誘導体配糖体が残る。この除去の工程では、水をあまり除去しないことが好ましい。この除去の工程では、フェノール誘導体およびフェノール誘導体配糖体が沈殿しないことが好ましい。沈殿してしまった場合、水を加えてフェノール誘導体およびフェノール誘導体配糖体を再度溶解することが好ましい。このようにして、フェノール誘導体およびフェノール誘導体配糖体を含有する第２の水溶液が得られる。
【０１１６】
次いで、第２の水溶液と酢酸エチルとを接触させて、第２の水相と酢酸エチル相とを得ることにより、フェノール誘導体を酢酸エチル相に移動する。
【０１１７】
次いで、第２の水相を分取する。フェノール誘導体は配糖体部分を含まないので、フェノール誘導体配糖体よりも酢酸エチル相との親和性が高い。そのため、フェノール誘導体は酢酸エチル相に効率的に移動するが、フェノール誘導体配糖体は酢酸エチル相にあまり移動しない。そのため、分取された水相の中には、フェノール誘導体配糖体が残存する。また、上記の第２の溶液中に糖質が微量に残存していた場合、この糖質はこの水相中に残存する。水溶液と極性有機溶媒との接触工程および有機相の分取工程と同様に、酢酸エチル相を分取した後残った水相に酢酸エチルを接触させて、水相と酢酸エチル相とを再度得て、第２の水相を分取する工程を２回以上行ってもよい。
【０１１８】
なお、本明細書中では、水溶液と極性有機溶媒との接触工程および有機相の分取工程の後に有機相と酢酸エチルとの接触を行う方法を記載したが、水溶液と酢酸エチルとを接触させて水相を分取した後に、この水相と極性有機溶媒との接触を行ってもよい。
【０１１９】
次いで、この第２の水相を濃縮し、そして冷却することにより、フェノール誘導体配糖体を沈殿させる。第２の水相中のフェノール誘導体配糖体の濃度が１０％以上になるまでこの第２の水相を濃縮することが好ましい。好ましくは１５％以上、より好ましくは２０％以上、そして最も好ましくは２５％以上になるまで濃縮する。これは、糖質の水中飽和濃度よりもフェノール誘導体配糖体の水中飽和濃度の方が低いことを利用している。例えば、糖質がグルコースであり、フェノール誘導体配糖体がハイドロキノン配糖体である場合、グルコースの水中飽和濃度が約１８％であり、ハイドロキノン配糖体の水中飽和濃度が約１０％であることを利用している。
【０１２０】
【実施例】
次に実施例を示して本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれらにより何ら制限されない。
【０１２１】
＜実験例１：相分離に対する糖の影響＞
各種糖質の代表としてグルコース、スクロースおよびフルクトースを用い、水溶液と極性有機溶媒との相の分離に及ぼす影響を検討した。
【０１２２】
詳細には、グルコース、スクロースまたはフルクトースをそれぞれ水に溶解して、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％および５０％水溶液を作製した。これらの糖の水溶液１０ｍｌに、アセトニトリルまたはテトラヒドロフランを１０ｍｌ添加した後、分液ロートにより５分間激しく攪拌した。アセトニトリルおよびテトラヒドロフランはいずれも、水と混和する極性有機溶媒であり、水と混合した場合には水相と有機相には分離しない。攪拌終了後、混合物を３０分間静置し、水相と有機相との２相に分離するかどうかを観察した。テトラヒドロフランまたはアセトニトリルを各種水溶液に添加した場合の結果を表３〜５に示す。表中ＴＨＦとはテトラヒドロフラン、ＡｃＣＮとはアセトニトリルを指す。
【０１２３】
【表３】
【表４】
【表５】
【０１２６】
これらの結果から、水溶液中に含まれる糖質の種類および濃度を調整すれば相を分離させることが容易になり、例えば、１２％程度以上の濃度に糖を調整することが好ましいことがわかった。
【０１２７】
＜実験例２：相分離に対する塩の影響＞
次に、相分離に対する塩の影響について検討を行った。
【０１２８】
詳細には、グルコース濃度が２５％または５０％のグルコース水溶液に、それぞれ２０％または１０％となるように塩化ナトリウムを添加して、塩化ナトリウム含有グルコース水溶液を作製した。これらの水溶液１０ｍｌに、極性有機溶媒であるアセトンまたはイソプロパノールを１０ｍｌ添加した後、分液ロートにより５分間激しく攪拌した。攪拌終了後、混合物を３０分間静置し、２相に分離するかどうかを観察した。結果を表６に示す。
【０１２９】
【表６】
【０１３０】
【表７】
【０１３１】
（実施例１：カテキン類の抽出）
（実施例１ａ）
カテキン類混合物（サンフェノン；太陽化学社製）１ｇを３０％のグルコースを含む水溶液１００ｍｌに溶解して試料水溶液を得た。この試料水溶液の２８０ｎｍの吸光度を測定した。この試料水溶液１０ｍｌに、テトラヒドロフランを１０ｍｌ添加し、分液ロートにより５分間激しく攪拌した後、混合物を３０分間静置した。その結果、混合物は２相に分離した。下相（水相）を分取し、その容量および２８０ｎｍの吸光度を測定した。上相（極性有機溶媒相）に抽出されたカテキン類の量を、下相の２８０ｎｍの吸光度の減少および下相の溶液量から算出した。その結果、１回の抽出でテトラヒドロフラン相に出発物質の全量の９４．１％のカテキン類が抽出されたことが解った。
【０１３２】
（実施例１ｂ）
テトラヒドロフラン１０ｍｌに代えてアセトニトリル１０ｍｌを用いた以外は実施例１ａと同様の操作を行った。その結果、１回の抽出でアセトニトリル相に出発物質の全量の８４．４％のカテキン類が抽出されたことが解った。
【０１３３】
（実施例２：カテキン類の抽出）
（実施例２ａ）
カテキン類混合物（サンフェノン；太陽化学社製）１ｇを３０％のグルコースおよび１０％の塩化ナトリウムを含む水溶液１００ｍｌに溶解して試料水溶液を得た。この試料水溶液の２８０ｎｍの吸光度を測定した。この試料水溶液１０ｍｌに、アセトンを１０ｍｌ添加し、分液ロートにより５分間激しく攪拌した後、混合物を３０分間静置した。その結果、混合物は２相に分離した。下相（水相）を分取し、その容量および２８０ｎｍの吸光度を測定した。上相（極性有機溶媒相）に抽出されたカテキン類の量を、下相の２８０ｎｍの吸光度の減少および下相の溶液量から算出した。その結果、１回の抽出でアセトン相に出発物質の全量の９１．８％のカテキン類が抽出されたことが解った。
【０１３４】
（実施例２ｂ）
アセトン１０ｍｌに代えてイソプロパノール１０ｍｌを用いた以外は実施例２ａと同様の操作を行った。その結果、１回の抽出でイソプロパノール相に出発物質の全量の９３．２％のカテキン類が抽出されたことが解った。
【０１３５】
（実施例３：ヘスペリジン配糖体の抽出）
（実施例３ａ）
ヘスペリジン配糖体（東洋精糖社製）１ｇを３０％のグルコースを含む水溶液１００ｍｌに溶解して試料水溶液を得た。この試料水溶液の２８０ｎｍの吸光度を測定した。この試料水溶液１０ｍｌに、テトラヒドロフランを１０ｍｌ添加し、分液ロートにより５分間激しく攪拌した後、混合物を３０分間静置した。その結果、混合物は２相に分離した。下相（水相）を分取し、その容量および２８０ｎｍの吸光度を測定した。上相（極性有機溶媒相）に抽出されたヘスペリジン配糖体の量を、下相の２８０ｎｍの吸光度の減少および下相の溶液量から算出した。その結果、１回の抽出でテトラヒドロフラン相に出発物質の全量の５０．０％のヘスペリジン配糖体が抽出されたことが解った。さらにテトラヒドロフラン抽出後に分取した水相に５ｍｌのテトラヒドロフランを添加し同様の操作および測定を再度行ったところ、合計８０．０％のヘスペリジン配糖体が抽出されたことが解った。
【０１３６】
（実施例３ｂ）
テトラヒドロフラン１０ｍｌに代えてアセトニトリル１０ｍｌを用いた以外は実施例３ａと同様の操作を行った。その結果、１回の抽出でアセトニトリル相に出発物質の全量の２７．６％のヘスペリジン配糖体が抽出されたことが解った。
【０１３７】
（実施例４：ヘスペリジン配糖体の抽出）
（実施例４ａ）
ヘスペリジン配糖体（東洋精糖社製）１ｇを３０％のグルコースおよび１０％の塩化ナトリウムを含む水溶液１００ｍｌに溶解して試料水溶液を得た。この試料水溶液の２８０ｎｍの吸光度を測定した。この試料水溶液１０ｍｌに、アセトンを１０ｍｌ添加し、分液ロートにより５分間激しく攪拌した後、混合物を３０分間静置した。その結果、混合物は２相に分離した。下相（水相）を分取し、その容量および２８０ｎｍの吸光度を測定した。上相（極性有機溶媒相）に抽出されたヘスペリジン配糖体の量を、下相の２８０ｎｍの吸光度の減少および下相の溶液量から算出した。その結果、１回の抽出でアセトン相に出発物質の全量の４３．５％のヘスペリジン配糖体が抽出されたことが解った。さらにアセトン抽出後に分取した水相に５ｍｌのアセトンを添加し同様の操作および測定を２回行ったところ、合計９０．０％のヘスペリジン配糖体が抽出されたことが解った。
【０１３８】
（実施例４ｂ）
アセトン１０ｍｌに代えてイソプロパノール１０ｍｌを用いた以外は実施例４ａと同様の操作を行った。その結果、１回の抽出でイソプロパノール相に出発物質の全量の３２．０％のヘスペリジン配糖体が抽出されたことが解った。
【０１３９】
（実施例５：サリシンの抽出）
（実施例５ａ）
サリシン１ｇを３０％のグルコースを含む水溶液１００ｍｌに溶解して試料水溶液を得た。この試料水溶液の２８０ｎｍの吸光度を測定した。この試料水溶液１０ｍｌに、テトラヒドロフランを１０ｍｌ添加し、分液ロートにより５分間激しく攪拌した後、混合物を３０分間静置した。その結果、混合物は２相に分離した。下相（水相）を分取し、その容量および２８０ｎｍの吸光度を測定した。上相（極性有機溶媒相）に抽出されたサリシンの量を、下相の２８０ｎｍの吸光度の減少および下相の溶液量から算出した。その結果、１回の抽出でテトラヒドロフラン相に出発物質の全量の９６．５％のサリシンが抽出されたことが解った。
【０１４０】
（実施例５ｂ）
テトラヒドロフラン１０ｍｌに代えてアセトニトリル１０ｍｌを用いた以外は実施例５ａと同様の操作を行った。その結果、１回の抽出でアセトニトリル相に出発物質の全量の９８．１％のサリシンが抽出されたことが解った。
【０１４１】
（実施例６：サリシンの抽出）
（実施例６ａ）
サリシン１ｇを３０％のグルコースおよび１０％の塩化ナトリウムを含む水溶液１００ｍｌに溶解して試料水溶液を得た。この試料水溶液の２８０ｎｍの吸光度を測定した。この試料水溶液１０ｍｌに、アセトンを１０ｍｌ添加し、分液ロートにより５分間激しく攪拌した後、混合物を３０分間静置した。その結果、混合物は２相に分離した。下相（水相）を分取し、その容量および２８０ｎｍの吸光度を測定した。上相（極性有機溶媒相）に抽出されたサリシンの量を、下相の２８０ｎｍの吸光度の減少および下相の溶液量から算出した。その結果、１回の抽出でアセトン相に出発物質の全量の５８．０％のサリシンが抽出されたことが解った。
【０１４２】
（実施例６ｂ）
アセトン１０ｍｌに代えてイソプロパノール１０ｍｌを用いた以外は実施例６ａと同様の操作を行った。その結果、１回の抽出でイソプロパノール相に出発物質の全量の９７．０％のサリシンが抽出されたことが解った。
【０１４３】
（実施例７：コーヒー酸の抽出）
（実施例７ａ）
コーヒー酸１ｇを３０％のグルコースを含む水溶液１００ｍｌに溶解して試料水溶液を得た。この試料水溶液の２８０ｎｍの吸光度を測定した。この試料水溶液１０ｍｌに、テトラヒドロフランを１０ｍｌ添加し、分液ロートにより５分間激しく攪拌した後、混合物を３０分間静置した。その結果、混合物は２相に分離した。下相（水相）を分取し、その容量および２８０ｎｍの吸光度を測定した。上相（極性有機溶媒相）に抽出されたコーヒー酸の量を、下相の２８０ｎｍの吸光度の減少および下相の溶液量から算出した。その結果、１回の抽出でテトラヒドロフラン相に出発物質の全量の８８．６％のコーヒー酸が抽出されたことが解った。
【０１４４】
（実施例７ｂ）
テトラヒドロフラン１０ｍｌに代えてアセトニトリル１０ｍｌを用いた以外は実施例７ａと同様の操作を行った。その結果、１回の抽出でアセトニトリル相に出発物質の全量の７６．２％のコーヒー酸が抽出されたことが解った。
【０１４５】
（実施例８：コーヒー酸の抽出）
（実施例８ａ）
コーヒー酸１ｇを３０％のグルコースおよび１０％の塩化ナトリウムを含む水溶液１００ｍｌに溶解して試料水溶液を得た。この試料水溶液の２８０ｎｍの吸光度を測定した。この試料水溶液１０ｍｌに、アセトンを１０ｍｌ添加し、分液ロートにより５分間激しく攪拌した後、混合物を３０分間静置した。その結果、混合物は２相に分離した。下相（水相）を分取し、その容量および２８０ｎｍの吸光度を測定した。上相（極性有機溶媒相）に抽出されたコーヒー酸の量を、下相の２８０ｎｍの吸光度の減少および下相の溶液量から算出した。その結果、１回の抽出でアセトン相に出発物質の全量の７８．２％のコーヒー酸が抽出されたことが解った。
【０１４６】
（実施例８ｂ）
アセトン１０ｍｌに代えてイソプロパノール１０ｍｌを用いた以外は実施例８ａと同様の操作を行った。その結果、１回の抽出でイソプロパノール相に出発物質の全量の８７．２％のコーヒー酸が抽出されたことが解った。
【０１４７】
（実施例９：サリシルアルコールの抽出）
（実施例９ａ）
サリシルアルコール１ｇを３０％のグルコースを含む水溶液１００ｍｌに溶解して試料水溶液を得た。この試料水溶液の２８０ｎｍの吸光度を測定した。この試料水溶液１０ｍｌに、テトラヒドロフランを１０ｍｌ添加し、分液ロートにより５分間激しく攪拌した後、混合物を３０分間静置した。その結果、混合物は２相に分離した。下相（水相）を分取し、その容量および２８０ｎｍの吸光度を測定した。上相（極性有機溶媒相）に抽出されたサリシルアルコールの量を、下相の２８０ｎｍの吸光度の減少および下相の溶液量から算出した。その結果、１回の抽出でテトラヒドロフラン相に出発物質の全量の９８．７％のサリシルアルコールが抽出されたことが解った。
【０１４８】
（実施例９ｂ）
テトラヒドロフラン１０ｍｌに代えてアセトニトリル１０ｍｌを用いた以外は実施例９ａと同様の操作を行った。その結果、１回の抽出でアセトニトリル相に出発物質の全量の９８．２％のサリシルアルコールが抽出されたことが解った。
【０１４９】
（実施例１０：サリシルアルコールの抽出）
（実施例１０ａ）
サリシルアルコール１ｇを３０％のグルコースおよび１０％の塩化ナトリウムを含む水溶液１００ｍｌに溶解して試料水溶液を得た。この試料水溶液の２８０ｎｍの吸光度を測定した。この試料水溶液１０ｍｌに、アセトンを１０ｍｌ添加し、分液ロートにより５分間激しく攪拌した後、混合物を３０分間静置した。その結果、混合物は２相に分離した。下相（水相）を分取し、その容量および２８０ｎｍの吸光度を測定した。上相（極性有機溶媒相）に抽出されたサリシルアルコールの量を、下相の２８０ｎｍの吸光度の減少および下相の溶液量から算出した。その結果、１回の抽出でアセトン相に出発物質の全量の８７．７％のサリシルアルコールが抽出されたことが解った。
【０１５０】
（実施例１０ｂ）
アセトン１０ｍｌに代えてイソプロパノール１０ｍｌを用いた以外は実施例１０ａと同様の操作を行った。その結果、１回の抽出でイソプロパノール相に出発物質の全量の９８．７％のサリシルアルコールが抽出されたことが解った。
【０１５１】
（実施例１１：エラジタンニンおよびその重合物の抽出）
（実施例１１ａ）
甜茶抽出物水溶液（サン甜茶；サントリー社製）を水で２倍希釈して２倍希釈液を得た。この２倍希釈液にグルコースを１０％、塩化ナトリウムを１０％となるように添加し溶解して水溶液を得た。この水溶液の２８０ｎｍの吸光度を測定した。この水溶液２０ｍｌに、アセトン２０ｍｌを添加し、分液ロートにより５分間激しく攪拌した後、混合物を３０分間静置した。その結果、混合物は２相に分離した。下相（水相）を分取し、その容量および２８０ｎｍの吸光度を測定した。上相（極性有機溶媒相）に抽出された有効成分（エラジタンニンおよびその重合物が有効成分である）の量を、下相の２８０ｎｍの吸光度の減少および下相の溶液量から算出した。その結果、１回の抽出でアセトン相に４３．１％の有効成分が抽出されたことが解った。さらに着色のレベルはアセトン相の方が水相の３分の１程度となっていた。このことから、抽出によって、有効成分が抽出され、そして脱色効果が得られたことがわかった。
【０１５２】
（実施例１２：果汁からのヘスペリジンの抽出）
カリフォルニアオレンジ果汁濃縮液（５倍濃縮液）１０ｍｌに１５％の塩化ナトリウム水を１０ｍｌ添加し、均一になるように攪拌して水溶液を得た。使用したカリフォルニアオレンジ果汁濃縮液中のヘスペリジンの量を、カラムＯＤＳを用い、移動相をアセトニトリル：水＝２０：８０とし、流速０．５ｍｌ／分でカラム温度４０℃でＨＰＬＣを行い、溶出液の吸光度を２８０ｎｍで検出することにより測定した。ヘスペリジン量の詳細な検出方法は、日本国特許公開平８−８０１７７号公報に記載される。得られた水溶液２０ｍｌに、アセトン２０ｍｌを添加し、分液ロートにより５分間激しく攪拌した後、混合物を３０分間静置した。その結果、混合物は２相に分離した。上相（極性有機溶媒相）を分取し、その容量を測定し、そしてヘスペリジンの量を、上記のようにＨＰＬＣにより測定した。その結果、１回の抽出でアセトン相に７５％のヘスペリジンが抽出されていた。
【０１５３】
（実施例１３：配糖化反応溶液からのヘスペリジンの抽出）
可溶性デンプン（メルク社製）５％およびヘスペリジン０．５％が溶解している水溶液を塩酸によりｐＨ９．０に調整し、アルカリ耐性のＣＧＴａｓｅ（日本国特許公開平７−１０７９７２号公報に記載のＣＧＴａｓｅ）を５ユニット／ｍｌの濃度になるようにこの水溶液に添加し、次いで３７℃で１６時間酵素反応させた。酵素反応終了後、酵素反応溶液の一部を採取して、ＨＰＬＣ分析方法によってヘスペリジンおよびヘスペリジン配糖体の量を測定した。ＨＰＬＣ分析方法においては、ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ １００ＲＰ１８（Ｍｅｒｃｋ；４．０×２５０ｍｍ）のカラムを用い、移動相はアセトニトリル：水＝２０：８０（ｖ／ｖ）であり、流速は０．５ｍｌ／分であり、カラム温度は４０℃であり、溶出液の吸光度を２８０ｎｍで検出した。ヘスペリジンおよびヘスペリジン配糖体の分析方法は、日本国特許公開平８−８０１７７号号公報に記載される。その結果、酵素反応により、反応開始時に投入したヘスペリジンの約８０％がヘスペリジン配糖体となったことがわかった。
【０１５４】
次いで、この酵素反応終了後の酵素反応溶液にグルコースを２０％および塩化ナトリウムを１０％となるように添加し、溶解してグルコースおよび塩化ナトリウムを含有する酵素反応溶液を得た。グルコースおよび塩化ナトリウムを含有する酵素反応溶液に、等容量のアセトンを添加した。分液ロートにより５分間激しく攪拌した後、混合物を３０分間静置した。その結果、混合物は２相に分離した。上相のアセトン相を分取し、その容量を測定し、そしてアセトン相に溶解しているヘスペリジン配糖体の量を、上記のようにＨＰＬＣにより測定した。その結果、酵素反応終了後の酵素反応溶液中に存在したヘスペリジン配糖体のうちの約４５％のヘスペリジン配糖体がアセトン相中に抽出されていた。さらに、下相の水相に、酵素反応溶液の容量の半分量のアセトンを添加し、攪拌し、静置し、上相を分取するという、同様の抽出操作を３回行った結果、ヘスペリジン配糖体を全量回収することができた。
【０１５５】
（実施例１４：配糖化反応溶液からのハイドロキノン配糖体の抽出）
デキストリン（ＤＥが７〜９のパインデックス＃１；松谷化学社製）３５％およびハイドロキノン１５％が溶解している水溶液を５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ６．５に調整し、配糖化酵素（日本国特許公開平６−２７７０５３号公報に記載のアミラーゼＸ−２３）を２０ユニット／ｍｌの濃度になるようにこの水溶液に添加し、次いで４５℃で４０時間インキュベートしてハイドロキノンへの配糖化反応をおこなった。酵素反応終了後、酵素反応溶液の一部を採取して、ＨＰＬＣ分析方法によってハイドロキノンおよびハイドロキノン配糖体の量を測定した。このＨＰＬＣ分析方法においては、ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ １００ＲＰ１８（Ｍｅｒｃｋ；４．０×２５０ｍｍ）のカラムを用い、移動相は水：メタノール：リン酸＝８０：１９．７：０．３（ｖ／ｖ）であり、流速は０．５ｍｌ／分であり、カラム温度は４０℃であり、溶出液中のハイドロキノンおよびハイドロキノン配糖体の量を紫外分光法によって検出した。この酵素反応溶液を用いて、ＨＰＬＣ分析方法によって生成物グルコースおよびマルトオリゴ糖の量を測定した。このＨＰＬＣ分析方法においては、ＬｉＣｈｒｏｓｏｒｂ ＮＨ２（Ｍｅｒｃｋ；４．０×２５０ｍｍ）のカラムを用い、移動相は水：アセトニトリル＝２５：７５（ｖ／ｖ）であり、流速は１．０ｍｌ／分であり、カラム温度は４０℃であり、溶出液中のマルトオリゴ糖をＲＩ検出器によって検出した。その結果、この酵素反応によりハイドロキノンの約３５％がハイドロキノン配糖体となっており、デキストリンはグルコースおよびマルトオリゴ糖に分解されていることがわかった。さらに、酵素反応終了後の酵素反応溶液に、グルコアミラーゼ（ナガセケムテックス社製；商品名ＸＬ−４）を８．８ユニット／ｍｌの濃度になるように添加して４５℃で３時間インキュベートすることによって、酵素反応溶液中のオリゴ糖をグルコースに分解した。
【０１５６】
次いで、このオリゴ糖分解後の酵素反応溶液に、酵素反応溶液と等容量のテトラヒドロフランを添加した。分液ロートにより５分間激しく攪拌した後、混合物を３０分間静置した。その結果、混合物は２相に分離した。上相のテトラヒドロフラン相を分取し、その容量を測定し、そしてテトラヒドロフラン相に溶解しているハイドロキノン配糖体の量を、上記のようにＨＰＬＣにより分析した。その結果、酵素反応終了後の酵素反応溶液中に存在したハイドロキノン配糖体のうちの約６５％のハイドロキノン配糖体がテトラヒドロフラン相中に抽出されていた。さらに、下相の水相に、酵素反応溶液の容量の半分量のテトラヒドロフランを添加し、攪拌し、静置し、上相を分取するという、同様の抽出操作を３回行った結果、ハイドロキノン配糖体を全量回収することができた。
【０１５７】
（実施例１５：配糖化反応溶液からのハイドロキノン配糖体の抽出）
デキストリン（ＤＥが７〜９のパインデックス＃１；松谷化学社製）３５％およびハイドロキノン１５％が溶解している水溶液を５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ６．５に調整し、配糖化酵素（日本国特許公開平６−２７７０５３号公報に記載のアミラーゼＸ−２３）を２０ユニット／ｍｌの濃度になるように添加し、次いで４５℃で４０時間インキュベートしてハイドロキノンへの配糖化反応をおこなった。酵素反応終了後、酵素反応溶液の一部を採取して、ＨＰＬＣ分析方法によってハイドロキノンおよびハイドロキノン配糖体の量を測定した。このＨＰＬＣ分析方法においては、ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ １００ＲＰ１８（Ｍｅｒｃｋ；４．０×２５０ｍｍ）のカラムを用い、移動相は水：メタノール：リン酸＝８０：１９．７：０．３（ｖ／ｖ）であり、流速は０．５ｍｌ／分であり、カラム温度は４０℃であり、溶出液中のハイドロキノンおよびハイドロキノン配糖体の量を紫外分光法によって検出した。この酵素反応溶液を用いて、ＨＰＬＣ分析方法によって生成物グルコースおよびマルトオリゴ糖の量を測定した。このＨＰＬＣ分析方法においては、ＬｉＣｈｒｏｓｏｒｂ ＮＨ２（Ｍｅｒｃｋ；４．０×２５０ｍｍ）のカラムを用い、移動相は水：アセトニトリル＝２５：７５であり、流速は１．０ｍｌ／分であり、カラム温度は４０℃であり、溶出液中のマルトオリゴ糖をＲＩ検出器によって検出した。その結果、この酵素反応によりハイドロキノンの約３５％がハイドロキノン配糖体となっており、デキストリンはグルコースおよびマルトオリゴ糖に分解されていることがわかった。さらに、酵素反応終了後の酵素反応溶液に、グルコアミラーゼ（ナガセケムテックス社製；商品名ＸＬ−４）を８．８ユニット／ｍｌの濃度になるように添加して４５℃で３時間インキュベートすることによって、酵素反応溶液中のオリゴ糖をグルコースに分解した。
【０１５８】
次いで、このオリゴ糖分解後の酵素反応液をエバポレーターを用いて、約１．４倍に減圧濃縮した。この濃縮液に対して２０％となるよう硫酸アンモニウムを添加して、硫酸アンモニウム含有濃縮液を得た。この硫酸アンモニウム含有濃縮液に対して、この濃縮液と等容量のアセトンを添加した。分液ロートにより５分間激しく攪拌した後、混合物を３０分間静置した。その結果、混合物は２相に分離した。上相のアセトン相を分取し、その容量を測定し、そしてアセトン相に溶解しているハイドロキノン配糖体量を上記のようにＨＰＬＣにより分析した。その結果、酵素反応終了後の酵素反応溶液中に存在したハイドロキノン配糖体のうちの約６０％のハイドロキノン配糖体がアセトン相中に抽出されていた。さらに、下相の水相に、濃縮液の容量の０．８容量のアセトンを添加し、攪拌し、静置し、上相を分取するという、同様の抽出操作を３回行った結果、ハイドロキノン配糖体を全量回収することができた。
【０１５９】
（実施例１６：配糖化反応溶液からのハイドロキノン配糖体の抽出）
デキストリン（ＤＥが７〜９のパインデックス＃１；松谷化学社製）３５％およびハイドロキノン１５％が溶解している水溶液を５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ６．５に調整し、配糖化酵素（日本国特許公開平６−２７７０５３号公報に記載のアミラーゼＸ−２３）を２０ユニット／ｍｌの濃度になるように添加し、次いで４５℃で４０時間インキュベートしてハイドロキノンへの配糖化反応をおこなった。酵素反応終了後、酵素反応溶液の一部を採取して、ＨＰＬＣ分析方法によってハイドロキノンおよびハイドロキノン配糖体の量を測定した。このＨＰＬＣ分析方法においては、ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ １００ＲＰ１８（Ｍｅｒｃｋ；４．０×２５０ｍｍ）のカラムを用い、移動相は水：メタノール：リン酸＝８０：１９．７：０．３（ｖ／ｖ）であり、流速は０．５ｍｌ／分であり、カラム温度は４０℃であり、溶出液中のハイドロキノンおよびハイドロキノン配糖体の量を紫外分光法によって検出した。この酵素反応溶液を用いて、ＨＰＬＣ分析方法によって生成物グルコースおよびマルトオリゴ糖の量を測定した。このＨＰＬＣ分析方法においては、ＬｉＣｈｒｏｓｏｒｂ ＮＨ２（Ｍｅｒｃｋ；４．０×２５０ｍｍ）のカラムを用い、移動相は水：アセトニトリル＝２５：７５（ｖ／ｖ）であり、流速は１．０ｍｌ／分であり、カラム温度は４０℃であり、溶出液中のマルトオリゴ糖をＲＩ検出器によって検出した。その結果、この酵素反応によりハイドロキノンの約３５％がハイドロキノン配糖体となっており、デキストリンはグルコースおよびマルトオリゴ糖に分解されていることがわかった。さらに、酵素反応終了後の酵素反応溶液に、グルコアミラーゼ（ナガセケムテックス社製；商品名ＸＬ−４）を８．８ユニット／ｍｌの濃度になるように添加して４５℃で３時間インキュベートすることによって、酵素反応溶液中のオリゴ糖をグルコースに分解した。
【０１６０】
次いで、このオリゴ糖分解後の酵素反応液に、この酵素反応液と等容量のアセトニトリルを添加した。分液ロートにより５分間激しく攪拌した後、混合物を１時間静置した。その結果、混合物は２相に分離した。上相のアセトニトリル相を分取し、その容量を測定し、そしてアセトニトリル相に溶解しているハイドロキノン配糖体量を上記のようにＨＰＬＣにより分析した。その結果、酵素反応終了後の酵素反応溶液中に存在したハイドロキノン配糖体のうちの約３０％のハイドロキノン配糖体がアセトニトリル相に抽出されていた。さらに、下相の水相に、酵素反応溶液と等容量のアセトニトリルを添加し、攪拌し、静置し、上相を分取するという、同様の抽出操作を５回行った結果、酵素反応終了後の酵素反応溶液中に存在したハイドロキノン配糖体のうちの約９０％のハイドロキノン配糖体を回収することができた。
【０１６１】
（実施例１７：グルコアミラーゼ処理条件の検討）
出発物質としてデキストリンまたはデンプンを用いて配糖化酵素反応を行った場合、反応終了後の酵素反応溶液中には出発物質よりも低分子量の多量のグルコースおよびデキストリンが存在する。糖質全体の濃度が同じであっても、モル数が高い方が、有機相への糖の移動が少なくなる。そこで、配糖化酵素反応後に残存するデキストリンを効率的にグルコースへと分解するために、デキストリン分解反応の条件を検討した。
【０１６２】
デキストリン（ＤＥが７〜９のパインデックス＃１；松谷化学社製）３５％およびハイドロキノン１５％が溶解している水溶液を５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ６．５に調整し、配糖化酵素（日本国特許公開平６−２７７０５３号公報に記載のアミラーゼＸ−２３）を２０ユニット／ｍｌの濃度になるように添加し、次いで４５℃で４０時間インキュベートしてハイドロキノンへの配糖化反応をおこなった。
【０１６３】
この反応終了後の配糖化反応溶液１ｍｌに対して、１．４μｌ（１倍量）、２．１μｌ（１．５倍量）または２．８μｌ（２倍量）のグルコアミラーゼ（ナガセケムテックス社製；商品名ＸＬ−４）を加えた。この後、４５℃で３時間または４時間インキュベートした。インキュベート終了後、ＨＰＬＣ分析方法によってこの溶液中のグルコースおよびマルトースの含量を確認した。このＨＰＬＣ分析方法においては、ＬｉＣｈｒｏｓｏｒｂ ＮＨ２（Ｍｅｒｃｋ；４．０×２５０ｍｍ）のカラムを用い、移動相は水：アセトニトリル＝２５：７５（ｖ／ｖ）であり、流速は１．０ｍｌ／分であり、カラム温度は４０℃であり、溶出液中のグルコースおよびマルトースをＲＩ検出器によって検出した。また、ＨＰＬＣ分析方法によって溶出液中のハイドロキノンおよびハイドロキノン配糖体の量を測定した。このＨＰＬＣ分析方法においては、ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ １００ＲＰ１８（Ｍｅｒｃｋ；４．０×２５０ｍｍ）のカラムを用い、移動相は水：メタノール：リン酸＝８０：１９．７：０．３（ｖ／ｖ）であり、流速は０．５ｍｌ／分であり、カラム温度は４０℃であり、溶出液中のハイドロキノンおよびハイドロキノン配糖体の量を紫外分光法によって検出した。得られたハイドロキノンおよびハイドロキノン配糖体（ＨＱＧ）の量から、ハイドロキノン配糖化率を算出した。結果を以下の表８に示す。
【０１６４】
【表８】
【０１６５】
また、グルコアミラーゼを増量しても配糖化率はほとんど変わらなかった。このことは、目的の生成物であるハイドロキノン配糖体を分解することなく、グルコアミラーゼがデキストリンを分解できることを示す。それゆえ、デキストリンの分解を促進するためには、分解反応の時間を延長するよりも、グルコアミラーゼを増量するほうが効果的であることがわかった。
【０１６６】
次いで、このグルコアミラーゼ処理の違いがＴＨＦ処理に及ぼす影響を調べた。上記で得られた（ＸＬ−４）処理液１ｍｌとＴＨＦ１ｍｌとを混合し、分液ロートにより１分間激しく振盪し、混合物を振盪後１時間静置した。その結果、混合物は２相に分離した。水相を分取し、この水相に水を加えて１ｍｌにした。この水相を用いて、ＨＰＬＣ分析方法によってグルコースおよびマルトースの量を測定した。このＨＰＬＣ分析方法においては、ＬｉＣｈｒｏｓｏｒｂ ＮＨ２（Ｍｅｒｃｋ；４．０×２５０ｍｍ）のカラムを用い、移動相は水：アセトニトリル＝２５：７５（ｖ／ｖ）であり、流速は１．０ｍｌ／分であり、カラム温度は４０℃であり、溶出液中のグルコースおよびマルトースをＲＩ検出器によって検出した。また、ＨＰＬＣ分析方法によってハイドロキノンおよびハイドロキノン配糖体の量を測定した。このＨＰＬＣ分析方法においては、ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ １００ＲＰ１８（Ｍｅｒｃｋ；４．０×２５０ｍｍ）のカラムを用い、移動相は水：メタノール：リン酸＝８０：１９．７：０．３（ｖ／ｖ）であり、流速は０．５ｍｌ／分であり、カラム温度は４０℃であり、溶出液中のハイドロキノンおよびハイドロキノン配糖体の量を紫外分光法によって測定した。得られた結果と、ＴＨＦでの抽出前の上記のグルコース濃度、マルトース濃度およびＨＱＧ濃度とに基づいて、ＴＨＦ相への抽出率を計算した。結果を以下の表９に示す。
【０１６７】
【表９】
【０１６８】
グルコアミラーゼ添加量が多いサンプルほど、ＴＨＦとの振盪、分液後の水相の液量が少なくなる（ＴＨＦ相への水の流入が少なくなる）傾向もまた確認された。
【０１６９】
（実施例１８：テトラヒドロフラン相への抽出に対する糖質濃度の影響）
テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）相への抽出に対する、水溶液中のグルコース濃度の影響を検討した。
【０１７０】
まず、４２％グルコースおよび９％ハイドロキノン配糖体を含む水溶液を調製した。この水溶液を水で段階的に希釈することによって、グルコース濃度が４０％〜２０％の水溶液を作製した。当然、水溶液を希釈することによって、グルコースだけでなく、ハイドロキノン配糖体も希釈されている。このようにして調製された水溶液５ｍｌに５ｍｌのＴＨＦを加え、３０℃にて５分間ミキサーで攪拌し、攪拌終了後、混合物を３０００ｒｐｍにて５分間遠心分離を行った。上相を分取した。グルコース濃度が低くなるに従ってＴＨＦ相が少なくなっていき、２０％では１回目抽出で相が分離しなかった。下相に再度５ｍｌのＴＨＦを加え、同様にして上相を分取した。各水溶液について得られた２つの上相をそれぞれ合わせた。ＨＰＬＣ分析方法によってこの溶液中のグルコースおよびマルトースの含量を測定した。このＨＰＬＣ分析方法においては、ＬｉＣｈｒｏｓｏｒｂ ＮＨ２（Ｍｅｒｃｋ；４．０×２５０ｍｍ）のカラムを用い、移動相は水：アセトニトリル＝２５：７５であり、流速は１．０ｍｌ／分であり、カラム温度は４０℃であり、溶出液中のグルコースおよびマルトースをＲＩ検出器によって検出した。また、ＨＰＬＣ分析方法によってハイドロキノンおよびハイドロキノン配糖体の量を測定した。このＨＰＬＣ分析方法においては、ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ１００ＲＰ１８（Ｍｅｒｃｋ；４．０×２５０ｍｍ）のカラムを用い、移動相は水：メタノール：リン酸＝８０：１９．７：０．３（ｖ／ｖ）であり、流速は０．５ｍｌ／分であり、カラム温度は４０℃であり、溶出液中のハイドロキノンおよびハイドロキノン配糖体の量を紫外分光法によって測定した。
【０１７１】
結果を図１に示す。図１からわかるように、ハイドロキノン配糖体の移動率はグルコース濃度にそれほど依存しなかった。しかし、グルコースの移動率は、グルコース濃度が高くなるにしたがって低くなった。このことから、抽出に用いる水溶液中の糖質濃度を高めれば、疎水基含有水溶性有機化合物と比較して糖の極性有機溶媒相への移動が少なくなり、高純度の疎水基含有水溶性有機化合物が得られることがわかった。
【０１７２】
（実施例１９：ハイドロキノン配糖体の抽出に対する、配糖化反応溶液の濃縮の影響）
上記実施例１８に示すように、水溶液中の糖質の濃度を高めれば、有機相への糖質の移動が抑制されて、疎水基含有水溶性有機化合物が有機相に効率よく移動することがわかった。それゆえ、疎水基含有水溶性有機化合物を含む酵素反応溶液を濃縮することによって、有機相への糖質の移動が抑えられ、疎水基含有水溶性有機化合物の抽出効率が上がるかどうかを確認した。
【０１７３】
まず、デキストリン（ＤＥが７〜９のパインデックス＃１；松谷化学社製）３５％およびハイドロキノン１５％が溶解している水溶液を５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ６．５に調整し、配糖化酵素（日本国特許公開平６−２７７０５３号公報に記載のアミラーゼＸ−２３）を２０ユニット／ｍｌの濃度になるように添加し、次いで４５℃で４０時間インキュベートしてハイドロキノンへの配糖化反応をおこなった。この反応終了後の配糖化反応溶液１ｍｌあたり２．１μｌ（１．５倍量）のグルコアミラーゼ（ナガセケムテックス社製；商品名ＸＬ−４）を加えた。この後、４５℃で４時間グルコアミラーゼ処理を行い、反応溶液を得た。
【０１７４】
この反応溶液５ｍｌを、エバポレーターによって濃縮して、容積が８０％（４．０ｍｌ）または７０％（３．５ｍｌ）になるように濃縮した。未濃縮の反応溶液、８０％の濃縮液または７０％の濃縮液に、ＴＨＦを等容量加えて、ミキサーにより１分間激しく振盪し、３０℃の条件下で抽出を行い、混合物を１時間静置したところ、混合物は２相に分離した。上相のＴＨＦ相を分取した。得られたＴＨＦ相を、上記のようにＨＰＬＣによってグルコース、マルトースおよびハイドロキノン配糖体の含量について分析した。下相の水相に、水相の容量の０．５倍の容量のＴＨＦを再度加え、振盪し、抽出し、上相のＴＨＦ相を分取することをさらに２回繰り返した。得られたＴＨＦ相を合わせた。なお、濃縮液では分液時に中間層が発生したが、中間層は水相に加えた。結果を以下の表１０〜１２に示す。
【０１７５】
【表１０】
【表１１】
【表１２】
【０１７８】
（実施例２０：相の分離に対する疎水基含有水溶性有機化合物の影響）
実施例１７に記載されるように、配糖化反応溶液をＴＨＦで抽出する場合、グルコース濃度が２０％以下でも水相と有機相とは完全に分離し、ＴＨＦ相の方が水相よりも大きくなった。一方、上記実施例１８では、４２％グルコースおよび９％ハイドロキノン配糖体を含有する溶液（この溶液には、ハイドロキノンがほとんど入っていない）を、グルコース濃度が２０％になるように水で希釈した場合、ＴＨＦを添加しても相が分離しなかった。そこで、相の分離に対する疎水基含有水溶性有機化合物の影響を調べた。
【０１７９】
上記実施例１８で調製した２０％グルコース含有希釈液に、１０％となるようにハイドロキノンを添加して水溶液を得た。この水溶液に、等容量のＴＨＦを添加して、ミキサーにより５分間攪拌し、そして１時間静置した。その結果、ＴＨＦ相と水相とに完全に分離した。また、ＴＨＦ相に水が混入して、ＴＨＦ相の方が水相よりも大きくなった。ＴＨＦ相を分取し、ＴＨＦ中のハイドロキノン配糖体の含量を上記のようにＨＰＬＣによって測定した。その結果、ハイドロキノンを添加しない場合よりも多量のハイドロキノン配糖体が抽出されたことがわかった。これは、ハイドロキノンのようなＴＨＦ相に良く溶ける物質を水相に加えることでＴＨＦが水相に移動しなくなるため、分離がよくなったうえ、高濃度のハイドロキノンがＴＨＦに溶解することでハイドロキノンが配糖体の移行を促進したためと考えられる。
【０１８０】
（実施例２１：テトラヒドロフラン相への抽出に対する温度の影響）
テトラヒドロフラン相への抽出に対する温度の影響を調べた。
【０１８１】
まず、デキストリン（ＤＥが７〜９のパインデックス＃１；松谷化学社製）３５％およびハイドロキノン１５％が溶解している水溶液を５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ６．５に調整し、配糖化酵素（日本国特許公開平６−２７７０５３号公報に記載のアミラーゼＸ−２３）を２０ユニット／ｍｌの濃度になるように添加し、次いで４５℃で４０時間インキュベートしてハイドロキノンへの配糖化反応をおこなった。この反応終了後の配糖化反応溶液１ｍｌあたり２．１μｌ（１．５倍量）のグルコアミラーゼ（ナガセケムテックス社製；商品名ＸＬ−４）を加えた。この後、混合物を４５℃で４時間インキュベートして、グルコアミラーゼ処理後反応溶液を得た。
【０１８２】
５ｍｌのグルコアミラーゼ処理後反応溶液に５ｍｌのＴＨＦを加え、各温度（３、１０、２２、または４５℃）にてミキサーを用いて５分間攪拌した後、混合物を３０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。その結果、混合物は２相に分離した。水相を分取し、この水相に水を加えて５ｍｌに調整して水溶液を得た。この調整後の水溶液を、上記のようにＨＰＬＣにてハイドロキノン、ハイドロキノン配糖体およびグルコースの濃度を測定した。
【０１８３】
結果を以下の表１３に示す。
【０１８４】
【表１３】
【０１８５】
表１３および図２からわかるように、抽出温度が低い場合、ＴＨＦ相への糖の移動が多かった。温度の上昇に従って、ハイドロキノン、ハイドロキノン配糖体およびグルコースのＴＨＦ相への移動率は下がった。これは、温度の上昇に従ってＨＱＧおよびグルコースの水相への溶解度が上がって、ＴＨＦ相への移動が減少したものと考えられる。また、温度が高いほど、ハイドロキノン配糖体とグルコースとの移動率の差が広がるので、なるべく高い温度で抽出することにより、ハイドロキノン配糖体の純度をより高めることができることがわかった。
【０１８６】
【発明の効果】
本発明により、疎水基含有水溶性有機化合物の抽出方法が提供される。本発明の抽出方法および精製方法は、各種動物および植物の有効成分を抽出および精製する手法として、あるいは各種酵素反応溶液から有効成分を抽出および精製する手法として用いることが可能である。本発明の方法により、疎水基含有水溶性有機化合物を容易でかつ安価に分離および精製することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、テトラヒドロフラン抽出に対するグルコース濃度の影響を示すグラフである。
【図２】図２は、ハイドロキノン配糖体およびグルコースのテトラヒドラフラン相への移動率を示すグラフである。
Claims (19)
- 疎水基含有水溶性有機化合物の抽出方法であって、
該疎水基含有水溶性有機化合物および糖質を含有する水溶液と、極性有機溶媒とを接触させて、水相と有機相とを得、それにより該疎水基含有水溶性有機化合物を該有機相に移動させる工程
を包含し、
ここで、該疎水基含有水溶性有機化合物は、ハイドロキノン配糖体、カテキン、ヘスペリジン、ヘスペリジン配糖体、コーヒー酸、サリシルアルコールおよびエラジタンニンからなる群より選択され、そして
ここで、該極性有機溶媒は、テトラヒドロフランまたはアセトニトリルであり、該水溶液中の該糖質の濃度は、２０％〜９０％である、方法。 - 疎水基含有水溶性有機化合物の抽出方法であって、
該疎水基含有水溶性有機化合物および糖質を含有する水溶液と、極性有機溶媒とを接触させて、水相と有機相とを得、それにより該疎水基含有水溶性有機化合物を該有機相に移動させる工程
を包含し、
ここで、該疎水基含有水溶性有機化合物は、ハイドロキノン配糖体、カテキン、ヘスペリジン、ヘスペリジン配糖体、コーヒー酸、サリシルアルコールおよびエラジタンニンからなる群より選択され、そして
ここで、該極性有機溶媒は、アセトニトリルであり、該糖質は、グルコースであり、該水溶液中の該糖質の濃度は、１５％〜９０％である、方法。 - 疎水基含有水溶性有機化合物の抽出方法であって、
該疎水基含有水溶性有機化合物および糖質を含有する水溶液と、極性有機溶媒とを接触させて、水相と有機相とを得、それにより該疎水基含有水溶性有機化合物を該有機相に移動させる工程
を包含し、
ここで、該疎水基含有水溶性有機化合物は、ハイドロキノン配糖体、カテキン、ヘスペリジン、ヘスペリジン配糖体、コーヒー酸、サリシルアルコールおよびエラジタンニンからなる群より選択され、そして
ここで、該極性有機溶媒は、テトラヒドロフランであり、該水溶液がグルコースおよびマルトースを含み、該水溶液中の糖質の濃度が９０％以下であり、
（ａ）該水溶液中のグルコース濃度が１２．２％以上であり、かつ該水溶液中のマルトース濃度が４．９％以上であるか；
（ｂ）該水溶液中のグルコース濃度が１４．７％以上であり、かつ該水溶液中のマルトース濃度が３．７％以上であるか；または
（ｃ）該水溶液中のグルコース濃度が１５．８％以上であり、かつ該水溶液中のマルトース濃度が２．６％以上である、
方法。 - 前記極性有機溶媒の量が、前記水溶液の容積の０．２倍〜２倍である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
- 前記疎水基含有水溶性有機化合物が、酵素反応溶液に由来する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
- 前記酵素反応溶液が、配糖化反応溶液である、請求項５に記載の方法。
- 前記配糖化反応溶液が、ヘスペリジンまたはハイドロキノンの配糖化反応溶液である、請求項６に記載の方法。
- 前記疎水基含有水溶性有機化合物が、動物または植物から選択される生物に由来する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
- 前記疎水基含有水溶性有機化合物が、果汁に由来する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
- 前記水溶液が、前記疎水基含有水溶性有機化合物および糖質を含有する酵素反応溶液を濃縮することにより調製される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
- 前記酵素反応溶液が、配糖化反応溶液である、請求項１０に記載の方法。
- 前記配糖化反応溶液が、ヘスペリジンまたはハイドロキノンの配糖化反応溶液である、請求項１１に記載の方法。
- 前記水溶液が、前記疎水基含有水溶性有機化合物および糖質を含有する生物抽出物を濃縮または希釈することにより調製され、ここで該生物が動物または植物である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
- 前記水溶液が、果汁を濃縮することにより調製される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
- フェノール誘導体配糖体の精製方法であって、
フェノール誘導体、フェノール誘導体配糖体および糖質を含有する第１の水溶液と、極性有機溶媒とを接触させて、第１の水相と少量の水を含む有機相とを得、それにより該フェノール誘導体およびフェノール誘導体配糖体を該有機相に移動させる工程；
該少量の水を含む有機相を分取する工程；
該少量の水を含む有機相から該極性有機溶媒を除去して、該フェノール誘導体およびフェノール誘導体配糖体を含有する第２の水溶液を得る工程；
該第２の水溶液と酢酸エチルとを接触させて、第２の水相と酢酸エチル相とを得、それにより該フェノール誘導体を該酢酸エチル相に移動させる工程；
該第２の水相を分取する工程；および
該第２の水相を濃縮し、そして冷却することにより、該フェノール誘導体配糖体を沈殿させる工程
を包含し、
ここで、該フェノール誘導体およびフェノール誘導体配糖体は、該フェノール誘導体の配糖化反応溶液に由来し、該配糖化反応溶液が、ヘスペリジンまたはハイドロキノンの配糖化反応溶液であり、そして
ここで、該極性有機溶媒は、テトラヒドロフランまたはアセトニトリルであり、該第１の水溶液中の該糖質の濃度は、２０％〜９０％である、
方法。 - フェノール誘導体配糖体の精製方法であって、
フェノール誘導体、フェノール誘導体配糖体および糖質を含有する第１の水溶液と、極性有機溶媒とを接触させて、第１の水相と少量の水を含む有機相とを得、それにより該フェノール誘導体およびフェノール誘導体配糖体を該有機相に移動させる工程；
該少量の水を含む有機相を分取する工程；
該少量の水を含む有機相から該極性有機溶媒を除去して、該フェノール誘導体およびフ ェノール誘導体配糖体を含有する第２の水溶液を得る工程；
該第２の水溶液と酢酸エチルとを接触させて、第２の水相と酢酸エチル相とを得、それにより該フェノール誘導体を該酢酸エチル相に移動させる工程；
該第２の水相を分取する工程；および
該第２の水相を濃縮し、そして冷却することにより、該フェノール誘導体配糖体を沈殿させる工程
を包含し、
ここで、該フェノール誘導体およびフェノール誘導体配糖体は、該フェノール誘導体の配糖化反応溶液に由来し、該配糖化反応溶液が、ヘスペリジンまたはハイドロキノンの配糖化反応溶液であり、そして
ここで、該極性有機溶媒は、アセトニトリルであり、該糖質は、グルコースであり、該第１の水溶液中の該糖質の濃度は、１５％〜９０％である、方法。 - フェノール誘導体配糖体の精製方法であって、
フェノール誘導体、フェノール誘導体配糖体および糖質を含有する第１の水溶液と、極性有機溶媒とを接触させて、第１の水相と少量の水を含む有機相とを得、それにより該フェノール誘導体およびフェノール誘導体配糖体を該有機相に移動させる工程；
該少量の水を含む有機相を分取する工程；
該少量の水を含む有機相から該極性有機溶媒を除去して、該フェノール誘導体およびフェノール誘導体配糖体を含有する第２の水溶液を得る工程；
該第２の水溶液と酢酸エチルとを接触させて、第２の水相と酢酸エチル相とを得、それにより該フェノール誘導体を該酢酸エチル相に移動させる工程；
該第２の水相を分取する工程；および
該第２の水相を濃縮し、そして冷却することにより、該フェノール誘導体配糖体を沈殿させる工程
を包含し、
ここで、該フェノール誘導体およびフェノール誘導体配糖体は、該フェノール誘導体の配糖化反応溶液に由来し、該配糖化反応溶液が、ヘスペリジンまたはハイドロキノンの配糖化反応溶液であり、そして
ここで、該極性有機溶媒は、テトラヒドロフランであり、該第１の水溶液がグルコースおよびマルトースを含み、該第１の水溶液中の糖質の濃度が９０％以下であり、
（ａ）該第１の水溶液中のグルコース濃度が１２．２％以上であり、かつ該第１の水溶液中のマルトース濃度が４．９％以上であるか；
（ｂ）該第１の水溶液中のグルコース濃度が１４．７％以上であり、かつ該第１の水溶液中のマルトース濃度が３．７％以上であるか；または
（ｃ）該第１の水溶液中のグルコース濃度が１５．８％以上であり、かつ該第１の水溶液中のマルトース濃度が２．６％以上である、
方法。 - 前記極性有機溶媒の量が、前記水溶液の容積の０．２倍〜２倍である、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
- 前記配糖化反応溶液が、ハイドロキノンの配糖化反応溶液である、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
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