CN114292826B

CN114292826B - 花生糖基转移酶AhUGT4在糖基化白藜芦醇中的应用

Info

Publication number: CN114292826B
Application number: CN202111524954.9A
Authority: CN
Inventors: 王欣; 廖伯寿; 雷永; 姜慧芳; 韩忠奎; 刘月; 晏立英; 陈玉宁; 淮东欣; 王志慧; 康彦平
Original assignee: Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Current assignee: Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Priority date: 2021-12-14
Filing date: 2021-12-14
Publication date: 2023-04-07
Anticipated expiration: 2041-12-14
Also published as: CN114292826A

Abstract

本发明涉及花生糖基转移酶AhUGT4在将白藜芦醇转化为白藜芦醇糖苷中的应用、在提高植物体内白藜芦醇当量中的应用；还涉及一种获得白藜芦醇糖苷的方法以及一种提高植物体内白藜芦醇当量的方法。AhUGT4可高效糖基化白藜芦醇生成相应的白藜芦醇糖苷类物质，尤其是该酶具有催化合成白藜芦醇双糖基化合物(白藜芦醇‑3,5‑O‑双葡糖糖苷)的活性，这在其他植物中尚未见到相关报道。构建的AhUGT4基因超表达框可提高植物体内的白藜芦醇当量。此外，AhUGT4还为在植物或微生物中异源合成白藜芦醇糖苷类化合物提供有用的基因资源，对推动白藜芦醇生物合成的产业化和促进人类健康具有重大意义。

Description

花生糖基转移酶AhUGT4在糖基化白藜芦醇中的应用

技术领域

本发明涉及分子生物学和植物育种领域，更特别地，涉及花生糖基转移酶AhUGT4在将白藜芦醇转化为白藜芦醇苷中的应用、在提高植物体内白藜芦醇或白藜芦醇当量中的应用以及作为筛选高白藜芦醇当量的花生品种的分子标记中的应用。

背景技术

白藜芦醇(Resveratrol)是一种多酚类物质，主要存在于葡萄、莓果、花生等果实中，其结构式见式I。

研究表明，白藜芦醇具有较好的抗氧化，抗衰老和防治心血管疾病等生物活性，因而有着较好的商业预期。天然的白藜芦醇主要从植物果实中提取，由于其含量较低，阻碍了其产业化。因此，我们需要找到一种提高细胞内白藜芦醇含量的方法。

糖基转移酶能够将糖基配体转移到一些小分子物质上，如植物激素、多肽、蛋白质和次生代谢产物等。当这些小分子受体发生糖基化修饰后，可以改变它们的水溶性，稳定性和生物活性。研究表明，白藜芦醇-3-O-葡萄糖苷(虎杖苷)的稳定性和生物活性高于白藜芦醇。如果能通过糖基转移酶将白藜芦醇转化成白藜芦醇糖苷，或许可以提高白藜芦醇及其糖苷在植物中的积累。目前尚未在花生中鉴定到具有将白藜芦醇转化成白藜芦醇糖苷活性的糖基转移酶。

发明内容

本发明首次鉴定了一个的花生糖基转移酶基因AhUGT4。AhUGT4蛋白可高效糖基化白藜芦醇生成相应的白藜芦醇糖苷类物质，尤其是该酶具有催化生成白藜芦醇双糖基化合物(白藜芦醇-3，5-O-双葡萄糖苷)的活性，这在其他植物中尚未见到相关报道。

基于以上发现，本发明提供了花生糖基转移酶AhUGT4在将白藜芦醇转化为白藜芦醇苷中的应用。

在一个具体实施方案中，所述白藜芦醇苷为单糖基白藜芦醇苷和/或双糖基白藜芦醇苷。

本发明提供了一种获得白藜芦醇苷的方法，包括将花生糖基转移酶AhUGT4与白藜芦醇和糖一起孵育的步骤。

在一个具体实施方案中，所述糖为葡萄糖。

在一个具体实施方案中，孵育温度为25-35℃

本发明还提供了花生糖基转移酶AhUGT4在提高植物体内白藜芦醇或白藜芦醇当量中的应用，所述白藜芦醇当量为白藜芦醇与白藜芦醇苷的总量。

本发明还提供了一种提高植物体内白藜芦醇或白藜芦醇当量的方法，包括将花生糖基转移酶AhUGT4表达框转入所述植物基因组中的步骤。

本发明还提供了花生糖基转移酶AhUGT4基因作为筛选高白藜芦醇当量的花生品种的分子标记的应用，所述白藜芦醇当量为白藜芦醇与白藜芦醇苷的总量

本发明首次鉴定出一种可糖基化白藜芦醇的花生糖基转移酶基因AhUGT4。AhUGT4可高效糖基化白藜芦醇苷，其构建的基因超表达框可提高植物体内的白藜芦醇当量，为在植物或微生物中异源合成白藜芦醇糖苷类化合物提供有用的基因资源，对推动白藜芦醇生物合成的产业化和促进人类健康具有重大意义。

此外，AhUGT4还可作为分子标记，用于培育和筛选具有高白藜芦醇当量的植物，为含有高白藜芦醇或白藜芦醇苷的花生或其他植物的种质资源的选择和获取提供了一种新的途径，也为相关品质改良育种奠定了理论和实践基础，对我国花生产业和人类健康具有重大意义。

附图说明

图1.AhUGT4纯化蛋白的SDS-PAGE电泳图。

图2.HLPC检测分析AhUGT4体外酶活反应产物。

图3.野生型和超表达AhUGT4拟南芥植株中白藜芦醇和白藜芦醇糖苷含量的测定。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

1.花生糖基转移酶AhUGT4的发现与克隆表达

以花生苗期的叶片cDNA为模板进行PCR扩增，获得糖基转移酶基因AhUGT4编码区片段(1380bp)，引物序列如下：

AhUGT4-Ba-F：GAACGGATCCATGAAGAACGACGCCATTCT(SEQ ID NO:3)；

AhUGT4-Xh-R：GAACCTCGAGTCAAGTTGACTTCCAAAGTTG(SEQ ID NO:4)。

将该编码区片段克隆到载体pGEX-4T-1的多克隆位点处，得到原核表达质粒AhUGT4-pGEX-4T-1。测序表明质粒中AhUGT4基因编码区序列如SEQ ID NO:2所示，根据核苷酸序列推测其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

将质粒AhUGT4-pGEX-4T-1转化BL21大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性转化子作为表达菌株用于AhUGT4蛋白表达。从细菌培养物中纯化蛋白，然后进行SDS-PAGE电泳，结果如图1所示。得到纯化蛋白AhUGT4的分子量大小约80kD，与预期吻合。

2.AhUGT4蛋白体外酶活分析

AhUGT4酶活实验：在100μl反应体系中，加入10μg的AhUGT4纯化蛋白，白藜芦醇反应终浓度为200μM，尿苷二磷酸葡萄糖反应终浓度为500μM，Tris-HCl终浓度为50mM，反应液混匀后于30℃孵育1小时，然后加入等体积100μl甲醇终止反应，最后进行反应产物进行HPLC分析。色谱柱为Agilent C18反相色谱柱(250mm×4.6mm)。流动相为乙腈-水(30:70)，流速大小1.0mL/min，检测波长300nm，柱温30℃。

结果如图2所示，图2A为只加白藜芦醇不加酶的对照组(Res(CK))在300nm波长的吸光检测峰及其保留时间；图2B为另一种花生糖基转移酶AhUGT2与白藜芦醇孵育后的混合物(AhUGT2+Res)在300nm波长的吸光检测峰及其保留时间；图2C为P-AhUGT4与白藜芦醇孵育后的混合物(AhUGT4+Res)在300nm波长的吸光检测峰及其保留时间；图2D为白藜芦醇-3-O-葡萄糖苷(虎杖苷，结构式II)在300nm波长的吸光检测峰及其保留时间。

上述峰图中，峰1是白藜芦醇，峰2是白藜芦醇-3-O-葡萄糖苷(虎杖苷，结构式II)，峰3是白藜芦醇-3,5-O-双葡萄糖苷(结构式III)。

HPLC分析结果表明，AhUGT2与白藜芦醇孵育两小时后其含量几乎没有什么变化，仅能催化生成少量白藜芦醇-3-O-葡萄糖苷。相比而言，AhUGT4能够催化白藜芦醇生成白藜芦醇-3-O-葡萄糖苷和白藜芦醇-3,5-O-双葡萄糖苷，并且效率非常高，孵育两小时后，几乎检测不到白藜芦醇底物。

虽然上述实验使用的是30℃孵育温度，但在摸索条件的过程中，发现温度在25-35℃的范围内都能得到较好的效果。

3.体内实验

为验证AhUGT4在植物体内的活性，将AhUGT4基因克隆于pCambia1300-35S质粒中，使其置于强启动子CaMV35S下游，获得超表达pCambia1300-35S-AhUGT4质粒。将该质粒转化根癌农杆菌GV3101感受态中，挑选阳性转化菌株侵染拟南芥。在拟南芥T1代植株中筛选阳性转化苗。将野生型和AhUGT4阳性转化植株同时播种于MS培养基平板上(添加1mM白藜芦醇)，生长2周后，检测植株体内白藜芦醇及白藜芦醇糖苷的含量。

结果如图3所示，在AhUGT4阳性转化植株中白藜芦醇的相对含量是野生型拟南芥的2倍以上，同时白藜芦醇-3,5-O-双葡萄糖苷的含量是野生型的20倍以上。因此，将AhUGT4基因超表达框导入拟南芥基因组中，不仅提高了体内游离白藜芦醇的含量，而且还积累了大量白藜芦醇糖苷类物质，最终使植株中白藜芦醇当量大幅提高。

将上述超表达框转入花生等植物，在普通土壤中种植中也得到了类似的提高效果。由此可见，将AhUGT4基因超表达框可以通过提高白藜芦醇的糖基化程度来提高植物细胞中的白藜芦醇当量。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国农业科学院油料作物研究所

<120> 花生糖基转移酶AhUGT4在糖基化白藜芦醇中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 459

<212> PRT

<213> Arachis hypogaea

<400> 1

Met Lys Asn Asp Ala Ile Leu Leu Tyr Pro Ala Leu Asp Arg Gly His

1 5 10 15

Phe Leu Ser Met Leu Glu Leu Ala Asn Leu Ile Ala Thr His His Pro

20 25 30

Ser Leu Ser Ile Ile Phe Leu Ile Ser Thr Pro Pro Thr Pro Thr Thr

35 40 45

Ile Gln Lys Gln Cys Leu Ser Ala Leu Ser Thr Ala Ala Pro Ser Ile

50 55 60

Thr Phe Leu His Leu Pro Pro Val Thr Leu Pro Ala Asp Leu His Pro

65 70 75 80

His Ile Leu Cys Ile Glu Leu Ser Arg Arg Ser Asn His Asn Leu His

85 90 95

Gln Leu Leu His Ser Ile Ser Lys Thr Ser Asn Ile Lys Ala Ile Val

100 105 110

Leu Asp Phe Met Asn Ser Thr Ala Ala Thr Gln Val Thr Asn Arg Leu

115 120 125

Asn Ile Pro Thr Tyr Phe Tyr Phe Thr Ser Cys Ala Ser Ser Leu Ser

130 135 140

Thr Ile Leu His Phe Pro Thr Leu His Glu Thr Thr Thr Thr Ser Phe

145 150 155 160

Lys Asp Phe Pro Met Gln Ile Gln Ile Pro Gly Leu Pro Arg Met Ser

165 170 175

Thr Asp Asp Tyr Pro Asp Leu Thr Lys Asp Arg Glu Ser Ser Ile Tyr

180 185 190

Arg Val Phe Leu Asp Ile Ser Lys Thr Met Arg Asp Ser Asp Gly Ile

195 200 205

Ile Val Asn Thr Cys Asp Ala Ile Glu Ala Arg Ala Ile Arg Ala Leu

210 215 220

Ser Asn Lys Glu Met Asn Asn Lys Thr Pro Glu Leu Phe Cys Ile Gly

225 230 235 240

Pro Met Ile Ser Asn Thr Cys Glu Asn Asp Glu Lys Gly Cys Leu Ser

245 250 255

Trp Leu Asp Ser Gln Pro Ser Gln Ser Val Val Leu Leu Ser Phe Gly

260 265 270

Ser Leu Gly Thr Phe Ser Lys Lys Gln Leu Lys Glu Ile Ala Met Gly

275 280 285

Leu Glu Lys Ser Lys Gln Arg Phe Leu Trp Val Val Arg Ala Glu Ala

290 295 300

Glu Ser Asp Asn Ser Glu Pro Ser Leu Asn Glu Leu Leu Pro Glu Gly

305 310 315 320

Phe Leu Glu Arg Thr Lys Glu Lys Gly Met Val Val Lys Asp Trp Ala

325 330 335

Pro Gln Ala Ala Ile Leu Ser His Asp Ser Val Gly Gly Phe Val Thr

340 345 350

His Cys Gly Trp Asn Ser Ile Leu Glu Ala Val Cys Glu Gly Val Pro

355 360 365

Met Val Ala Trp Pro Leu Tyr Ala Glu Gln Lys Met Asn Arg Val Ile

370 375 380

Met Val Arg Glu Met Lys Val Gly Leu Glu Val Lys Glu Asp Lys Asp

385 390 395 400

Gly Leu Val Ser Ala Ser Glu Leu Glu Glu Arg Val Asn Glu Leu Met

405 410 415

Asp Ser Glu Arg Gly Lys Glu Ile Arg Gln Arg Ile Phe Lys Met Arg

420 425 430

Ile Gly Ala Val Glu Ala Lys Asp Glu Gly Gly Ser Ser Arg Leu Ala

435 440 445

Leu Asn Arg Leu Val Gln Leu Trp Lys Ser Thr

450 455

<210> 2

<211> 1380

<212> DNA

<213> Arachis hypogaea

<400> 2

atgaagaacg acgccattct tctttaccca gctctcgata gaggccattt cctttccatg 60

cttgagcttg caaacctcat tgccactcac cacccttccc tctccatcat cttcctcatt 120

tctactccac ctacacccac caccatccaa aaacaatgtc tctccgccct ctccaccgcc 180

gcgccctcca tcaccttcct ccacctccct ccagtcactc tccccgccga cctccaccca 240

cacatcctct gcatcgaact ctctcgccgc agcaaccaca accttcacca actcctccac 300

tccatttcca aaacctccaa catcaaagcc attgttttgg acttcatgaa ctccaccgcc 360

gctacacaag tcaccaacag gctcaatatc cctacctact tttacttcac ttcatgtgct 420

tcctctctct ccactatcct tcattttcca actcttcacg aaaccaccac aacatccttc 480

aaggattttc ccatgcagat tcaaattcct gggctaccca gaatgtccac cgatgattac 540

cccgatttaa ctaaggatcg tgagagtagc atttaccgtg ttttccttga catatccaag 600

accatgagag acagcgatgg gatcatcgtc aacacctgtg acgccattga agcaagagct 660

ataagagctt tgagtaacaa agaaatgaat aacaagacac cagaactatt ctgcatcgga 720

cccatgattt cgaacacgtg cgagaatgac gagaaagggt gcctgagttg gctcgactcg 780

cagccgagtc agagcgtggt gctgctgagt tttggaagct tgggaacgtt ctccaagaag 840

cagttgaagg agatagctat ggggttggag aagagcaagc agagattctt gtgggtggtg 900

agggctgaag ctgagtcaga taactcggaa ccgagtctga acgagttgtt gccggaaggg 960

ttcttggaga gaacgaagga gaagggaatg gtggttaagg attgggcccc acaggcagcg 1020

atactgagtc atgactcggt gggtgggttt gtgactcact gcggttggaa ctcgatcttg 1080

gaggctgttt gtgaaggagt gccaatggta gcgtggcctc tctatgcaga gcaaaagatg 1140

aacagagtga ttatggtgcg agaaatgaag gttggtttgg aggtgaagga ggataaagat 1200

gggttggtga gtgcaagtga gttggaggag cgagttaatg agttgatgga ctcggagaga 1260

gggaaagaga ttcgacagag aatcttcaag atgagaatcg gtgctgtgga agcaaaagat 1320

gaaggtggat cttctcgtct tgctttgaac aggttggttc aactttggaa gtcaacttga 1380

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gaacggatcc atgaagaacg acgccattct 30

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gaacctcgag tcaagttgac ttccaaagtt g 31

Claims

1.花生糖基转移酶AhUGT4在将白藜芦醇转化为白藜芦醇苷中的应用,所述花生糖基转移酶AhUGT4的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述白藜芦醇苷为白藜芦醇-3-O-葡萄糖苷和白藜芦醇-3, 5-O-双葡萄糖苷。

3. 一种获得白藜芦醇苷的方法，其特征在于，包括将花生糖基转移酶AhUGT4与白藜芦醇和尿苷二磷酸葡萄糖一起孵育的步骤，所述花生糖基转移酶AhUGT4的氨基酸序列如SEQID NO:1所示。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，孵育温度为25-35℃。

5.花生糖基转移酶AhUGT4在提高植物体内白藜芦醇含量或白藜芦醇当量中的应用，所述白藜芦醇当量为白藜芦醇与白藜芦醇苷的总量，所述花生糖基转移酶AhUGT4的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述植物为拟南芥或花生。

6.一种提高植物体内白藜芦醇含量或白藜芦醇当量的方法，其特征在于，包括将花生糖基转移酶AhUGT4表达框转入所述植物基因组中的步骤，所述白藜芦醇当量为白藜芦醇与白藜芦醇苷的总量，所述花生糖基转移酶AhUGT4的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述植物为拟南芥或花生。

7.花生糖基转移酶AhUGT4基因作为筛选高白藜芦醇当量的花生品种的分子标记中的应用，所述白藜芦醇当量为白藜芦醇与白藜芦醇苷的总量，所述花生糖基转移酶AhUGT4的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。