WO2022131130A1 - プレニルフラボノイド配糖化酵素、それをコードするポリヌクレオチド及びプレニルフラボノイド配糖体の製造方法 - Google Patents

プレニルフラボノイド配糖化酵素、それをコードするポリヌクレオチド及びプレニルフラボノイド配糖体の製造方法 Download PDF

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amino acid
acid sequence
protein
seq
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栄一郎 小埜
美佐 落合
基成 高木
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サントリーホールディングス株式会社
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    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C12P17/06—Oxygen as only ring hetero atoms containing a six-membered hetero ring, e.g. fluorescein

Definitions

  • the present invention relates to a protein having the activity of transferring hexose to prenylflavonoid, a polynucleotide encoding the same, a vector containing the same, and a transformant.
  • the present invention also relates to a method for producing a prenylflavonoid glycoside and the like.
  • Xanthohumol contained in the female flower of hop (Humulus lupurus) and isoxanthohumol isomerized from the xanthohumol are a kind of prenylflavonoid having a prenyl group.
  • Prenylflavonoids are known to have useful biological activity.
  • isoxanthohumol and xanthohumol have extremely low polarity and are hardly dissolved in water, the amount of addition may be limited, for example, when blended in a beverage.
  • Rhizopus is a type of zygomycota and is a useful food microorganism used for saccharification and proteolysis in the production of tempeh, which is a fermented soybean food in Indonesia, Shaoxing wine and white liquor in China, and Maccoli in South Korea. .. Although some strains of Rhizopus have had their genomes decoded, it is not easy to identify the prenylflavonoid saccharifying enzyme gene because the enzyme genes expected to have genome duplication and glucosyllation activity are multiplexed.
  • UGT59A1 which is one of the UDP sugar-dependent glycosyltransferases (UDP-sugar patent glycosyltransferases: UGT) of Rhizopus japonicus, reacts with glucosyllation of small molecule compounds having several phenol groups. (Non-Patent Document 3).
  • UGT59A1 is particularly highly reactive with a type of lignan called magnolol, but its reactivity with extremely low-polarity water-insoluble prenylflavonoids such as isoxanthohumol has not been clarified.
  • the present inventors have found an enzyme capable of transferring sugars from Rhizospus bacteria to prenylflavonoids to produce glycosides.
  • an enzyme capable of transferring sugars from Rhizospus bacteria to prenylflavonoids to produce glycosides.
  • sugar By adding sugar to the poorly water-soluble prenylflavonoid, for example, its water solubility can be improved.
  • this enzyme gene it becomes possible to saccharify a similar compound in a heterologous cell line such as yeast without using Rhizopus.
  • a variety of sparingly soluble functional substances can be saccharified to improve water solubility through enzymatic modification.
  • the present invention relates to, but is not limited to, the following polynucleotides, vectors, transformants, methods for producing prenylflavonoid glycosides, and the like.
  • the polynucleotide according to any one of the following (a1) to (a5).
  • Nucleotide encoding a protein having an activity to transfer to (a3) A polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (a4) 1 to 9 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 of the polynucleotide (a5) which consists of an amino acid sequence in which the amino acid of is deleted, substituted, inserted and / or added, and which encodes a protein having an activity of transferring a hex source to a prenylflavonoid.
  • Polynucleotide. (B1) Nucleotide consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 (b2) Consisting of a base sequence having 98% or more identity with the base sequence represented by SEQ ID NO: 3, and hexsource to prenylflavonoid.
  • Nucleotide encoding a protein having an activity to transfer to (b3) A polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 (b4) 1 to 5 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 of the polynucleotide (b5) which consists of an amino acid sequence in which the amino acid of the above is deleted, substituted, inserted and / or added, and which encodes a protein having an activity of transferring a hex source to a prenylflavonoid.
  • a polynucleotide encoding a protein having an amino acid sequence having 99% or more identity with respect to and having an activity of transferring a hexsource to a prenylflavonoid [3]
  • the hexsource is glucose [1] or [2].
  • the polynucleotide described in. [4] The polynucleotide according to any one of the above [1] to [3], wherein the prenylflavonoid is at least one selected from the group consisting of xanthohumol, isoxanthohumol and prenylnaringenin.
  • the prenylflavonoid is at least one selected from the group consisting of xanthohumol, isoxanthohumol and prenylnaringenin.
  • a method for producing a prenylflavonoid glycoside which comprises a step of culturing the transformant according to the above [6] in the presence of prenylflavonoid.
  • a method for producing a prenylflavonoid glycoside using at least one protein selected from the group consisting of the following (A1) to (A3) and (B1) to (B3), prenylflavonoid and UDP.
  • a method for producing a prenylflavonoid glycoside which comprises a step of producing a prenylflavonoid glycoside from a hex sauce.
  • A1 Protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2
  • A2) An amino acid sequence in which 1 to 9 amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • Protein (B1) protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4
  • B2 In the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, 1 to 5 amino acids are deleted, substituted, inserted and / Or an amino acid sequence consisting of an added amino acid sequence and having 99% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 of the protein (B3) having the activity of transferring hexose to prenylflavonoid.
  • the present invention it is possible to provide a protein having an activity of transferring hexose to prenylflavonoid and a polynucleotide encoding the same.
  • a transformant useful for producing a prenylflavonoid glycoside can be obtained.
  • a method for producing a prenylflavonoid glycoside and the like it is possible to provide.
  • FIG. 1 is a molecular phylogenetic tree of lysopath UGT prepared by neighbor-joining method (NJ method) based on the full-length DNA sequences of each UGT gene of RoUGT15176_i1, RoUGT15176, RjUGT59A1, RoUGT15176_i14 and RoUGT15176_i9 (bootstrap). ..
  • FIG. 2 shows the results of HPLC analysis of the culture supernatant obtained by culturing the transformed yeast (control) expressing the empty vector pYE22m in a medium containing isoxanthohumol (detection: 280 nm).
  • FIG. 1 is a molecular phylogenetic tree of lysopath UGT prepared by neighbor-joining method (NJ method) based on the full-length DNA sequences of each UGT gene of RoUGT15176_i1, RoUGT15176, RjUGT59A1, RoUGT15176_i14 and RoUGT
  • FIG. 3 shows the results of HPLC analysis of the culture supernatant obtained by culturing the transformed yeast expressing RoUGT15176_i14 in a medium containing isoxanthohumol (detection: 280 nm).
  • FIG. 4 shows the results of HPLC analysis of the culture supernatant obtained by culturing the transformed yeast expressing RoUGT15176_i1 in a medium containing isoxanthohumol (detection: 280 nm).
  • FIG. 5 shows the results of HPLC analysis of the culture supernatant obtained by culturing the transformed yeast expressing RjUGT59A1 in a medium containing isoxanthohumol (detection: 280 nm).
  • FIG. 6 shows the results of HPLC analysis of the culture supernatant obtained by culturing the transformed yeast (control) expressing the empty vector pYE22m in a medium containing xanthohumol (detection: 320 nm).
  • FIG. 7 shows the results of HPLC analysis of the culture supernatant obtained by culturing the transformed yeast expressing RoUGT15176_i14 in a medium containing xanthohumol (detection: 320 nm).
  • FIG. 8 shows the results of HPLC analysis of the culture supernatant obtained by culturing the transformed yeast expressing RoUGT15176_i1 in a medium containing xanthohumol (detection: 320 nm).
  • FIG. 9 shows the results of HPLC analysis of the culture supernatant obtained by culturing the transformed yeast expressing RjUGT59A1 in a medium containing xanthohumol (detection: 320
  • the polynucleotide according to the first aspect of the present invention is the polynucleotide according to any one of the following (a1) to (a5).
  • (A1) Polynucleotide consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 (a2) Consisting of a base sequence having 90% or more identity with the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 and hex source to prenylflavonoid.
  • Nucleotide encoding a protein having an activity to transfer to (a3)
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 of the polynucleotide (a5) which consists of an amino acid sequence in which the amino acid of is deleted, substituted, inserted and / or added, and which encodes a protein having an activity of transferring a hex source to a prenylflavonoid.
  • the identity (also referred to as sequence identity) with respect to the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 is preferably 92% or more, more preferably 95% or more, 96% or more, or 97% or more. It is more preferably 98% or more, and particularly preferably 99% or more.
  • the identity of the amino acid sequence and the base sequence can be calculated by the default parameters using, for example, analysis software such as BLAST and FASTA.
  • the number of amino acids deleted, substituted, inserted and / or added is preferably 1 to 8, 1 to 7 or 1 to 6, more preferably 1 to 5, and even more preferably.
  • one or more amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence of a protein at any position in the same sequence and at any position in one or more amino acid sequences.
  • amino acid sequence identity with respect to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is preferably 92% or more, more preferably 95% or more, 96% or more or 97% or more, and further. It is preferably 98% or more, and particularly preferably 99% or more.
  • polynucleotide described in (a1) above is preferable.
  • the polynucleotide of the second aspect of the present invention is the polynucleotide according to any one of the following (b1) to (b5).
  • (B1) Nucleotide consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 3
  • (b2) Consisting of a base sequence having 98% or more identity with the base sequence represented by SEQ ID NO: 3, and hexsource to prenylflavonoid.
  • Nucleotide encoding a protein having an activity to transfer to (b3)
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 of the polynucleotide (b5) which consists of an amino acid sequence in which the amino acid of the above is deleted, substituted, inserted and / or added, and which encodes a protein having an activity of transferring a hex source to a prenylflavonoid.
  • the identity (also referred to as sequence identity) with respect to the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 is preferably 99% or more, more preferably 99.5% or more.
  • the number of amino acids deleted, substituted, inserted and / or added is preferably 1 to 4, more preferably 1 to 3, still more preferably 1 or 2, and particularly preferably 1. It is an individual.
  • the amino acid sequence identity (sequence identity) with respect to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 is preferably 99.5% or more.
  • the polynucleotide described in (b1) is preferable.
  • polynucleotide of the first aspect and the polynucleotide of the second aspect of the present invention are hereinafter collectively referred to as the polynucleotide of the present invention.
  • polynucleotide means DNA or RNA.
  • the polynucleotide of the present invention is preferably DNA.
  • the polynucleotide of the present invention can be obtained, for example, by a known genetic engineering method or synthetic method.
  • the polynucleotides of the invention encode proteins that have the activity of transferring hexoses to prenylflavonoids.
  • the activity of transferring hexose to prenylflavonoid means the activity of transferring hexose (hexose residue) from a sugar donor to the hydroxyl group of prenylflavonoid to produce a prenylflavonoid glycoside.
  • Glycosyl donors are usually UDP-hexoses such as uridine diphosphate (UDP) -glucose.
  • the glycosyl donor is preferably UDP-glucose.
  • Transferring hexose from the sugar donor UDP-hexose to prenylflavonoid yields a prenylflavonoid glycoside and UDP in which hexose (hexose residue) is bound to prenylflavonoid.
  • the protein encoded by the polynucleotide of the present invention has an activity of transferring hexose to prenylflavonoid, it can also be referred to as prenylflavonoid glycosylating enzyme.
  • the polynucleotide of the present invention can also be expressed as a prenylflavonoid saccharifying enzyme gene.
  • a protein has the activity of transferring hexose to prenylflavonoid is determined by, for example, reacting UDP-hexose and prenylflavonoid in the presence of the protein to be evaluated, and analyzing the obtained reaction product by HPLC or the like. You can check.
  • the activity of transferring hexose to prenylflavonoids is preferably the activity of transferring hexose to at least one selected from the group consisting of isoxanthohumol, xanthohumol and prenylnaringenin.
  • prenylnaringenin examples include 8-prenylnaringenin and 6-prenylnaringenin.
  • the above activity is more preferably an activity of transferring hexose to isoxanthohumol and / or xanthohumol, and even more preferably an activity of transferring hexose to isoxanthohumol and xanthohumol.
  • the prenylflavonoid is particularly preferably isoxanthohumol. In one embodiment, the prenylflavonoid is preferably xanthohumol.
  • Isoxanthohumol and 8-prenylnaringenin are compounds represented by the following general formula (1A).
  • Xanthohumol is a compound represented by the following formula (2A).
  • R 1 represents a methyl group or a hydrogen atom.
  • the prenylflavonoid represented by the general formula (1A) is isoxanthohumol.
  • R 1 is a hydrogen atom
  • the prenylflavonoid represented by the general formula (1A) is 8-prenylnaringenin.
  • the activity of transferring hexose to isoxanthohumol is usually the activity of transferring hexose (hexose residue) to the 7-position (more specifically, the hydroxyl group at the 7-position) of isoxanthohumol.
  • This reaction usually produces an isoxanthohumol glycoside in which hexose (hexose residue) is bound to the 7-position (hydroxyl group) of isoxanthohumol.
  • the activity of transferring hexose to xanthohumol is usually the 4'and / or 4'position of xanthohumol (more specifically, the hydroxyl groups at the 4'and / or 4'positions), preferably the 4'position. It is an activity that transfers hexose to.
  • This reaction usually produces a xanthohumol glycoside in which a hexose (hexose residue) is bound to the 4'-position and / or the 4-position (hydroxyl group) of xanthohumol.
  • the activity of transferring hexose to xanthohumol is preferably the activity of transferring hexose to the 4'position of xanthohumol.
  • the activity of transferring hexose to prenylnaringenin is usually the activity of transferring hexose to the 7-position (more specifically, the hydroxyl group at the 7-position) of prenylnaringenin.
  • This reaction produces a prenylnaringenin glycoside in which hexose (hexose residue) is bound to the 7-position (hydroxyl group) of prenylnaringenin such as 8-prenylnaringenin and 6-prenylnaringenin.
  • the number of hexoses transferred to prenylflavonoids may be one, two or more, but preferably one.
  • the activity of transferring hexose (hexose residue) can also be said to be the activity of adding hexose (hexose residue).
  • the isoxanthohumol glycoside to which hexose is bound to the 7-position of isoxanthohumol is a compound represented by the following general formula (1B).
  • the 8-prenylnaringenin glycoside in which hexose is bound to the 7-position of 8-prenylnaringenin is a compound represented by the following general formula (1B).
  • R 1 represents a methyl group or a hydrogen atom.
  • X 1 represents a hexose residue.
  • the compound in which R 1 is a methyl group is an isoxanthohumol glycoside.
  • the compound in which R 1 is a hydrogen atom is an 8-prenyl naringenin glycoside.
  • the xanthohumol glycoside in which hexose is bound to the 4'-position and / or the 4-position of xanthohumol is a compound represented by the following general formula (2B).
  • X 2 and X 3 represent the same or different hydrogen atom or hexose residue. However, at least one of X 2 and X 3 represents a hexose residue.
  • the compound in which X 2 is a hexose residue and X 3 is a hydrogen atom is a xanthohumol glycoside in which hexose is bound to the 4'position of xanthohumol.
  • the compound in which X 2 is a hydrogen atom and X 3 is a hexose residue is a xanthohumol glycoside in which hexose is bound to the 4-position of xanthohumol.
  • the compound in which X 2 and X 3 are hexose residues is a xanthohumol glycoside in which hexose is bound to the 4'-position and 4-position of xanthohumol. If X 2 and X 3 represent hexose residues, the hexose residues may be the same or different.
  • the hexose examples include glucose, galactose, rhamnose, fructose, glucuronic acid and the like. Among them, glucose and galactose are preferable as the hexose, and glucose is more preferable.
  • the hexose is preferably D-form. D-glucose is preferred as the hexose in the present invention.
  • the activity of transferring hexose to prenylflavonoid is preferably the activity of transferring glucose to prenylflavonoid.
  • the polynucleotide of the present invention can be suitably used, for example, for the production of a vector or a transformant expressing the polypeptide of the present invention, the production of a prenylflavonoid glycoside, and the like.
  • the polynucleotide of the present invention is preferably introduced into, for example, a host.
  • a host for example, production of a prenylflavonoid glycoside, production of a protein having an activity of transferring hexose to prenylflavonoid, and expression of a protein having an activity of transferring hexose to prenylflavonoid.
  • the host is not particularly limited, and examples thereof include microorganisms (for example, yeast, Escherichia coli, filamentous fungi, etc.), plants, or parts thereof.
  • the polynucleotide of the invention is preferably introduced into the host in the state of being inserted into a suitable expression vector. For example, it is preferable to introduce the polynucleotide into the host by the expression vector of the present invention as described later.
  • the present invention also provides a protein encoded by the above-mentioned polynucleotide of the present invention.
  • the protein of a certain aspect of the present invention is the protein according to any one of the following (A1) to (A3).
  • (A1) Protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2
  • A2) An amino acid sequence in which 1 to 9 amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • Proteins having the activity of transferring the above-mentioned proteins (A1) to (A3) are also referred to as proteins of the first aspect of the present invention.
  • the number of amino acids deleted, substituted, inserted and / or added is preferably 1 to 8, 1 to 7 or 1 to 6, more preferably 1 to 5, and even more preferably.
  • the identity of the amino acid sequence with respect to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is preferably 92% or more, more preferably 95% or more, 96% or more or 97% or more, still more preferably 98% or more. , Especially preferably 99% or more.
  • the protein according to the first aspect of the present invention is preferably the protein according to (A1) above.
  • the protein of still another aspect of the present invention is the protein according to any one of the following (B1) to (B3).
  • (B1) Protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4
  • (B2) Amino acid sequence in which 1 to 5 amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4.
  • Proteins having the activity of transferring the above-mentioned proteins (B1) to (B3) are also referred to as proteins of the second aspect of the present invention.
  • the number of amino acids deleted, substituted, inserted and / or added is preferably 1 to 4, more preferably 1 to 3, still more preferably 1 or 2, and particularly preferably 1. It is an individual.
  • amino acid sequence identity with respect to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 is preferably 99.5% or more.
  • the protein according to the second aspect of the present invention is preferably the protein according to (B1) above.
  • the protein of the first aspect of the present invention and the protein of the second aspect of the present invention are collectively referred to as the protein of the present invention.
  • the protein of the present invention is a protein having an activity of transferring hexose to prenylflavonoid, and can also be referred to as a prenylflavonoid glycosylating enzyme.
  • the activity of transferring hexose to prenylflavonoids is as described above.
  • the hexose and its preferred embodiment are the same as described above, and glucose and galactose are preferable as the hexose, and glucose is more preferable.
  • the proteins of the invention can be used, for example, to transfer hexoses to at least one prenylflavonoid selected from the group consisting of isoxanthohumol, xanthohumol and prenylnaringenin.
  • prenylflavonoids selected from the group consisting of isoxanthohumol, xanthohumol and prenylnaringenin.
  • the proteins (A1) to (A3) have the activity of transferring hexose to isoxanthohumol and xanthohumol.
  • the proteins (B1) to (B3) have the activity of transferring hexose to isoxanthohumol and xanthohumol.
  • the proteins (A1)-(A3) and (B1)-(B3) can be preferably used to transfer the hexose to isoxanthohumol and / or xanthohumol.
  • the proteins (A1) to (A3) have a higher affinity for isoxanthohumol than for other prenylflavonoids (eg, xanthohumol).
  • the proteins (A1) to (A3) can be suitably used for obtaining, for example, isoxanthohumol glycosides.
  • the proteins (A1) to (A3) show stronger hexose transfer activity when the prenylflavonoid is isoxanthohumol as compared with other prenylflavonoids (eg, xanthohumol).
  • the protein of the present invention can be produced, for example, by using the transformant described later.
  • the expression vector of the present invention is an expression vector containing the above-mentioned polynucleotide of the present invention.
  • the expression vector of the present invention contains the polynucleotide according to any one of (a1) to (a5) and (b1) to (b5) above.
  • the expression vector of the present invention may contain any of the above polynucleotides (a1) to (a5).
  • the expression vector of the present invention may contain any of the polynucleotides (b1) to (b5) above.
  • the expression vector of the present invention is preferably the polynucleotide of any one of (a1) to (a5) and (b1) above, and more preferably the polynucleotide of any of the above (a1) to (a5). , More preferably, it contains the polynucleotide of (a1) above.
  • the expression vector of the present invention for example, the polynucleotide of the present invention can be easily introduced into a host.
  • the expression of the polynucleotide of the present invention in the host can be easily controlled.
  • the use of the expression vector of the present invention is not particularly limited, and is the same as the above-mentioned polynucleotide of the present invention.
  • the expression vector of the present invention may contain, for example, the polynucleotide so as to be able to express a protein having an activity of transferring a hex source to the prenylflavonoid encoded by the polynucleotide of the present invention in the host to be introduced.
  • Other configurations are not particularly limited.
  • the host is not particularly limited, and may be appropriately selected depending on the purpose of use of the expression vector.
  • the expression vector of the present invention is, for example, a vector serving as a skeleton (hereinafter, also referred to as a “basic vector”) and a polynucleotide of the present invention (any of the above (a1) to (a5) and (b1) to (b5). It can be prepared by inserting the polynucleotide of the above.
  • the type of the vector is not particularly limited, and may be appropriately selected depending on, for example, the type of host to be introduced.
  • yeast expression vectors When transforming yeast, for example, as a vector, pYE22m (Biosci.Biotech.Biochem., 59,1221-1228, 1995) and the like can be mentioned, and pYES (Invitrogen), pESC (Stratagene) and the like can be mentioned. Commercially available yeast expression vectors can also be used.
  • examples of the vector include a pET vector (Merck), a pCold vector (Takara Bio Co., Ltd.), and a PQE vector (QIAGEN).
  • the expression vector of the present invention preferably has, for example, a regulatory sequence that regulates the expression of the above-mentioned polynucleotide and the expression of a protein having an activity of transferring a hex source to the prenylflavonoid encoded by the polynucleotide.
  • a regulatory sequence include a promoter, a terminator, an enhancer, a polyadenylation signal sequence, an origin of replication sequence (ori), and the like.
  • promoter of the expression vector for bacteria a conventional promoter (for example, trc promoter, tac promoter, lac promoter, etc.) can be used, and as the promoter for yeast, for example, glyceraldehyde triphosphate dehydrogenase can be used.
  • promoters for example, trc promoter, tac promoter, lac promoter, etc.
  • yeast for example, glyceraldehyde triphosphate dehydrogenase
  • promoters include promoters, PH05 promoters and the like
  • promoters for filamentous fungi include amylases, trpC and the like.
  • promoters for expressing the target gene in plant cells are derived from agrobacterium.
  • promoters for animal cell hosts include viral promoters (eg, SV40 early promoter, SV40 late promoter, etc.).
  • the arrangement of regulatory sequences is not particularly limited.
  • the regulatory sequence may be arranged, for example, so as to functionally regulate the expression of the polynucleotide of the present invention and the protein having the activity of transferring hexose to the prenylflavonoid encoded by the polynucleotide, as long as it is a known method. Can be placed based on.
  • the regulatory sequence may be appropriately selected according to the type of host to be introduced.
  • a sequence provided in advance in the basic vector may be used, a regulatory sequence may be further inserted into the basic vector, or the regulatory sequence contained in the basic vector may be replaced with another regulatory sequence. You may.
  • the expression vector relates to (i) a promoter transcribed in a host cell; (ii) a polynucleotide of the invention bound to the promoter; and (iii) transcription termination and polyadenylation of an RNA molecule. It is preferably configured to include an expression cassette containing a signal that functions in the host cell as a component.
  • the expression vector of the present invention may further have, for example, one or more coding sequences of selectable markers.
  • selectable marker include a drug resistance marker, a fluorescent protein marker, an enzyme marker, a cell surface receptor marker and the like.
  • methods for producing an expression vector include, but are not limited to, a method using a plasmid, phage, cosmid, or the like.
  • the method for introducing the expression vector of the present invention into the host is not particularly limited, and a known method can be used.
  • the introduction method can be appropriately determined depending on, for example, the type of host, the type of expression vector, and the like.
  • a transformant into which the polynucleotide of the present invention or the vector of the present invention has been introduced is also one of the present inventions.
  • the transformant of the present invention is introduced with the polynucleotide of the present invention (for example, the polynucleotide according to any one of (a1) to (a5) and (b1) to (b5) above) or the expression vector of the present invention. It is a transformant. Preferably, it is a transformant into which the expression vector of the present invention has been introduced.
  • introduction of the polynucleotide of the present invention also includes the meaning of "introduction of the expression vector of the present invention” unless otherwise specified.
  • the transformant may be one into which the polynucleotide according to any one of (a1) to (a5) above (preferably the polynucleotide of (a1)) or an expression vector containing the polynucleotide is introduced.
  • the transformant may be one into which the polynucleotide described in any one of (b1) to (b5) above (preferably the polynucleotide of (b1)) or an expression vector containing the polynucleotide is introduced.
  • the transformant of the present invention may generally be a non-human host into which the polynucleotide of the present invention has been introduced expressively, and other configurations are not particularly limited.
  • Polynucleotide can be expressed includes the meaning that the protein encoded by the polynucleotide can be expressed.
  • the method for producing the transformant is not particularly limited, and examples thereof include a method in which the above-mentioned expression vector is introduced into a host for transformation.
  • the host used here is a non-human host.
  • the host (host cell) is not particularly limited, and various conventionally known cells can be preferably used. Examples of the host include microorganisms, plants or parts thereof, animal cells, insect cells, cultured cells thereof and the like. In one embodiment, it is preferable to use a microorganism as a host. In yet another embodiment, it is preferable to use a plant or a portion thereof as a host.
  • a plant containing prenylflavonoid or a glycoside thereof is preferable, and for example, a plant such as hop (Humulus lupus), soybean (Glycine max), and epimedium (Epimedium grandiflorum var. Tumbergianum) is preferable.
  • microorganisms include prokaryotes and eukaryotes.
  • the protozoa include the genus Escherichia such as Escherichia coli; the genus Bacillus such as Bacillus subtilis; the genus Pseudomonas such as Pseudomonas putida; the genus Rhizobium; Bacteria such as the genus Rhizobium can be mentioned. ⁇ (Saccharomyces cerevisiae) ⁇ (Schizosaccharomyces pombe) ⁇ ; ⁇ (Aspergillus oryzae ⁇ Aspergillus sojae ⁇ ) ⁇ (Penicillium camemberti ⁇ ) ⁇ (Rhizopus oryzae , Rhizopus, oligosporus, etc.) and the like.
  • animal cells include COS cells, CHO cells and the like
  • insect cells include Sf9, Sf21 and the like.
  • yeast or filamentous fungus is preferred as the non-human host, such as Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus oryzae, Aspergillus sojae, Rhizopus, Rhizopus, Rhizopus. preferable. Suitable culture media and conditions for the above host cells are well known in the art.
  • the method for introducing the above-mentioned polynucleotide or expression vector into the host is not particularly limited, and a known transformation method can be used.
  • the introduction method may be appropriately selected according to the type of host and the like.
  • an electroporation method, a particle delivery method, a spheroplast method, a lithium acetate method, a CRISPR-Cas method for example, Woo et al., Nature Biotechnology 33, 1162-1164 (2015)
  • a CRISPR-Cas method for example, Woo et al., Nature Biotechnology 33, 1162-1164 (2015)
  • the transformant can be a plant transformant.
  • a plant transformant can be obtained by introducing an expression vector containing the polynucleotide of the present invention into a plant so that the polynucleotide can be expressed.
  • the expression vector used for transformation of a plant is not particularly limited as long as it is a vector capable of expressing the polynucleotide according to the present invention in the plant. Examples of such a vector include a vector having a promoter that constitutively expresses a polynucleotide in a plant cell (for example, the 35S promoter of cauliflower mosaic virus) or a promoter that is inducibly activated by an external stimulus. Examples include the vector having.
  • the plant to be transformed includes the whole plant body, plant organs (for example, leaves, petals, stems, roots, seeds, etc.), plant tissues (for example, epidermis, master, soft tissue, wood, tube bundle, etc.). It means either palisade tissue, spongy tissue, etc.) or plant cultured cells, or various forms of plant cells (eg, suspended cultured cells), protoplasts, leaf sections, curls, and the like.
  • the plant used for transformation is not particularly limited, and may be either a monocotyledonous plant or a dicotyledonous plant.
  • a transformation method known to those skilled in the art for example, Agrobacterium method, gene gun, PEG method, electroporation method, etc.
  • methods via Agrobacterium and methods of direct introduction into plant cells are well known.
  • a binary vector such as pBI121 or pPZP202
  • an electroporation method and a gene gun method are known.
  • the plant body, plant organ, or plant tissue itself may be used as it is, may be used after preparing a section, or a protoplast may be prepared and used.
  • the cells or plant tissues into which the gene has been introduced are first selected for drug resistance such as hygromycin resistance, and then regenerated into plants by a conventional method. Regeneration of plants from transformed cells can be performed by a method known to those skilled in the art depending on the type of plant cells.
  • the transformation introduces the expression vector into the cultured cell by a gene gun, an electroporation method, or the like. Callus, shoots, hairy roots, etc.
  • obtained as a result of transformation can be used as they are for cell culture, tissue culture, or organ culture, or by using a conventionally known plant tissue culture method and having an appropriate concentration. It can be regenerated into plants by administration of plant hormones (auxin, cytokinin, diberelin, absidic acid, ethylene, brushnolide, etc.).
  • plant hormones auxin, cytokinin, diberelin, absidic acid, ethylene, brushnolide, etc.
  • the present invention also includes a plant into which the polynucleotide according to the present invention is expressively introduced, a progeny of the plant having the same properties as the plant, or a tissue derived from these. Transformation methods for various plants have already been reported. Examples of the transformant plant according to the present invention include, but are not limited to, hops, soybeans, epimedium, and the like. According to one aspect of the present invention, the transformed plant is a plant for functional food materials.
  • Whether or not the polynucleotide of the present invention has been introduced into the host can be confirmed by a PCR method, a Southern hybridization method, a Northern hybridization method, or the like.
  • DNA is prepared from a transformant, a DNA-specific primer is designed, and PCR is performed.
  • Agarose gel electrophoresis, polyacrylamide gel electrophoresis, capillary electrophoresis, etc. are performed on the amplified product obtained by PCR, and the product is stained with ethidium bromide, SYBR Green solution, etc., and the amplified product is detected as a single band. Can be confirmed to have been transformed.
  • amplification product it is also possible to detect the amplification product by performing PCR using a primer labeled in advance with a fluorescent dye or the like. Further, a method of binding the amplification product to a solid phase such as a microplate and confirming the amplification product by fluorescence, an enzymatic reaction or the like can also be adopted.
  • the introduced polynucleotide of the present invention expresses a protein having an activity of transferring a hex source to prenylflavonoid.
  • the above-mentioned protein of the present invention can be produced, for example, by using the above-mentioned transformant.
  • the protein of the present invention can be obtained by separating and purifying the protein of the present invention from the culture of the above transformant.
  • the culture means any of a culture solution, a cultured cell or a cultured cell, or a cultured cell or a crushed product of the cultured cell. Separation and purification of the protein of the present invention can be carried out according to a usual method.
  • the protein of the present invention When the protein of the present invention is accumulated in cultured cells or cells, after culturing, the cells or cells are disrupted by a usual method (for example, ultrasonic wave, lysozyme, freeze-thaw, etc.), and then the usual method is used.
  • a crude extract of the protein of the present invention can be obtained by a method (for example, centrifugation, filtration, etc.).
  • the present invention is carried out by separating the cells or cells from the culture supernatant by a usual method (for example, centrifugation, filtration, etc.) after the completion of the culture.
  • a culture supernatant containing the protein of can be obtained.
  • Purification of the protein of the present invention contained in the extract or culture supernatant thus obtained can be carried out according to a usual separation or purification method.
  • a separation or purification method for example, ammonium sulfate precipitation, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, reverse phase high performance liquid chromatography, dialysis method, ultrafiltration method and the like are used alone or in combination as appropriate. be able to.
  • the protein of the present invention can also be produced by a chemical synthesis method such as the Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) and the tBoc method (t-butyloxycarbonyl method). It can also be chemically synthesized using a peptide synthesizer.
  • the present invention also includes a method for producing a prenylflavonoid glycoside.
  • the present invention also includes a method for producing a prenylflavonoid glycoside, which comprises a step of culturing the transformant of the present invention described above in the presence of prenylflavonoid.
  • the method for producing a prenylflavonoid glycoside including the step of culturing the above-mentioned transformant also referred to as a transformant culturing step
  • a production method of the first aspect of the present invention is also referred to as a production method of the first aspect of the present invention.
  • the transformant used in the production method of the first aspect of the present invention is the polynucleotide of any of (a1) to (a5) and (b1) to (b5) described above, or a vector containing the polynucleotide. Is an introduced transformant.
  • the transformant and its preferred embodiment are the same as described above.
  • a transformant using a microorganism as a host is preferable, and a yeast transformant is more preferable.
  • the above transformant is cultured in the presence of prenylflavonoid to add hexose (hexsource residue) to prenylflavonoid (more specifically, the hydroxyl group of prenylflavonoid). It can translocate to produce prenylflavonoid glycosides.
  • a protein having the activity of transferring hexose to prenylflavonoid expressed by a transformant can produce a prenylflavonoid glycoside.
  • the transformant can be cultured using a medium containing prenylflavonoid under the culture conditions that can be used for the host cells used to prepare the transformant.
  • the medium the host cells can be cultured, and a medium containing prenylflavonoid can be used.
  • the medium is preferably a liquid medium.
  • the prenylflavonoid is the same as described above.
  • At least one selected from the group consisting of isoxanthohumol, xanthohumol and 8-prenylnaringenin is preferable, isoxanthohumol and / or xanthohumol is preferable, and isoxanthohumol and xanthohumol are preferable. Mole or isoxanthohumol is more preferable, and isoxanthohumol is particularly preferable. In one embodiment, xanthohumol is preferred as the prenylflavonoid.
  • any of the above-mentioned polynucleotides (a1) to (a5) or a transformant into which a vector containing the polynucleotide is introduced may be used, and the above-mentioned (b1) to (b1) to ( A transformant into which any of the polynucleotides of b5) or a vector containing the polynucleotide may be introduced may be used.
  • a transformant into which any of the above polynucleotides (a1) to (a5) or a vector containing the polynucleotide is introduced is used.
  • polynucleotide (a1) it is preferable to use the above-mentioned polynucleotide (a1) or a transformant into which a vector containing the polynucleotide is introduced. This is because the protein encoded by the polynucleotide of (a1) above has a higher affinity for isoxanthohumol than for other prenylflavonoids (eg, xanthohumol).
  • the concentration of prenylflavonoid in the medium is not particularly limited and may be, for example, 1 mg / L to 10 g / L. In one embodiment, the concentration of prenylflavonoid may be the above concentration at the start of culture. Prenylflavonoid may be added to the medium at one time, or may be added to the medium in multiple portions during the culture. Prenylflavonoid can be added to the medium by dissolving it in a solvent such as ethanol, N, N-dimethylformamide (DMF), dimethyl sulfoxide (DMSO) and the like.
  • a solvent such as ethanol, N, N-dimethylformamide (DMF), dimethyl sulfoxide (DMSO) and the like.
  • Culturing of the transformant can be carried out in the presence of a hexose source that is a source of hexose residues of prenylflavonoid glycosides.
  • the culture of the transformant may be, for example, culture in the presence of prenylflavonoids and hexose sources.
  • the transformant may be cultivated in the presence of a hexose source prior to culturing in the presence of prenylflavonoids.
  • the transformant in the transformant culturing step, is cultured in the presence of prenylflavonoid and hexose, or the transformant cultured in the presence of a hexsource source is cultured in the presence of prenylflavonoid. It is preferable to do so.
  • the hexose source When cultured in the presence of a hexose source, the hexose source is usually taken up into the cells of the transformant and used for the production of prenylflavonoid glycosides.
  • a hexose or a carbon source containing a hexose unit as a hexose source can be used.
  • the hexose source may be, for example, hexose added to the medium or a carbon source containing hexose units as the hexose source.
  • carbon sources that can be used as such a hex source source include sucrose, lactose, dextrin, cyclodextrin ( ⁇ -cyclodextrin, ⁇ -cyclodextrin, ⁇ -cyclodextrin), amylose, amylopectin, starch and the like.
  • the hexose include those mentioned above.
  • Glucose sources include glucose, carbon sources containing glucose units (eg, sucrose, lactose, dextrin, cyclodextrin, amylose, amylopectin, starch).
  • glucose sources include glucose, carbon sources containing glucose units (eg, sucrose, lactose, dextrin, cyclodextrin, amylose, amylopectin, starch).
  • the hexose source preferably comprises hexose, more preferably glucose.
  • the concentration of the hexose source in the medium is preferably 0.1 to 20% by weight, more preferably 0.2 to 10% by weight. In one embodiment, the concentration of the hexose source may be the above concentration at the start of the culture.
  • the hexose source may be added to the medium at one time, or may be added in multiple portions during the culture.
  • the medium may contain nitrogen sources (eg, various peptones (potato peptone, etc.), various extracts, ammonium sulfate, urea, etc.), inorganic substances (dipotassium hydrogen phosphate, potassium phosphate, magnesium sulfate, zinc sulfate, iron, etc.), if necessary. , Manganese, molybdenum, sodium chloride, potassium chloride, magnesium chloride, etc.) may be added. In addition to the hexose source, a carbon source may be added to the medium. In the production method of the first aspect of the present invention, for example, a potato dextrose medium (PD medium) or the like can be used as the medium.
  • PD medium potato dextrose medium
  • the method of adding the transformant to the medium is not particularly limited, and can be appropriately selected depending on the type of the transformant.
  • a microorganism such as yeast
  • it can be grown by inoculating a small amount of cells directly into the medium.
  • the culture time of the transformant can be, for example, 0.5 to 120 hours.
  • the culture temperature can be, for example, 10 to 40 ° C, preferably 20 to 30 ° C.
  • the culture time of the yeast transformant can be, for example, 12 to 48 hours, preferably 24 to 36 hours.
  • the culture time in the presence of prenylflavonoids is preferably in the above range.
  • the culture time when the transformant is cultured in the presence of a hexose source before the culture in the presence of prenylflavonoid can be the same as described above.
  • the culture is preferably aerobic in a liquid medium.
  • the method for performing aerobic culture is not particularly limited, and the liquid medium inoculated with the transformant may be, for example, shake-cultured or stirred-cultured. Bubbling may also be performed with sterilized air or oxygen, if desired.
  • the culture type may be batch culture, fed-batch culture, or continuous culture, but batch culture is preferable. In the production method of the present invention, static culture may be performed.
  • an immobilized bacterial cell in which a transformant is immobilized on a carrier can also be used.
  • the method for preparing the immobilized cells is not particularly limited, and a known method can be adopted.
  • a bead-shaped gel on which the transformant is immobilized can be obtained by adding the transformant to an aqueous solution of sodium alginate, stirring and suspending the mixture, and then dropping the transformant into a calcium chloride solution. ..
  • Immobilized cells can be obtained by culturing this bead-shaped gel in the medium and culture conditions used when culturing the transformant.
  • the immobilized cells of the transformant may be cultured in the presence of prenylflavonoids. Immobilized cells of the transformant may also be cultured in the presence of prenylflavonoid and hexose sources.
  • prenylflavonoid glycosides are produced and accumulated in the medium.
  • the method for separating the transformant and the culture supernatant containing the prenylflavonoid glycoside is not particularly limited, and can be performed by, for example, filtration, centrifugation or the like.
  • the method for separating or purifying the prenylflavonoid glycoside from the culture supernatant is not particularly limited, and for example, a method such as ion exchange chromatography can be used.
  • Another aspect of the method for producing a prenylflavonoid glycoside of the present invention comprises the step of producing prenylflavonoid from prenylflavonoid and UDP-hexose using the above-mentioned protein of the present invention. It is a manufacturing method. 2. Also referred to as a manufacturing method according to the above embodiment.
  • the production method of the second aspect of the present invention comprises prenylflavonoid and UDP-hexose by at least one protein selected from the group consisting of (A1) to (A3) and (B1) to (B3) described above. From the above, the step of producing a prenylflavonoid glycoside is included.
  • the glycosylation enzyme reaction step is carried out by using at least one protein (preferably the protein of (A1)) selected from the group consisting of (A1) to (A3) above, from prenylflavonoids and UDP-hexsource. It may be a step of producing prenylflavonoids.
  • the glycosylation enzyme reaction step comprises prenylflavonoids and UDP by at least one protein (preferably the protein of (B1)) selected from the group consisting of (B1) to (B3) above.
  • -It may be a step of producing prenylflavonoid from a hex sauce.
  • UDP-hexose examples include those described above.
  • the UDP-hexose is preferably UDP-glucose.
  • the hexose is preferably glucose.
  • Prenylflavonoid and its preferred embodiment are the same as the above-mentioned method for producing the first aspect of the present invention.
  • the above-mentioned proteins (A1) to (A3) and (B1) to (B3) are not limited in their origin or production method.
  • the degree of purification of the proteins (A1) to (A3) and (B1) to (B3) is not particularly limited as long as they have the activity of transferring hexose to prenylflavonoids. As long as the effect of the present invention is exhibited, the above-mentioned cultures and crude proteins can be used.
  • prenylflavonoid and UDP-hexose can be reacted with the protein of the present invention as a catalyst to produce a prenylflavonoid glycoside.
  • the above reaction is preferably carried out in a liquid (reaction liquid), for example, in an aqueous medium such as water or a buffer solution.
  • the pH of the reaction solution can be, for example, 6 to 8, preferably 7 to 8, and more preferably 7.2 to 7.7.
  • the reaction temperature can be 20 to 50 ° C, preferably 25 ° C to 40 ° C, more preferably 28 to 37 ° C.
  • the reaction time may be set as appropriate.
  • the pH is the pH at 25 ° C.
  • the pH can be measured with a commercially available pH meter.
  • the initial concentration of prenylflavonoid in the reaction solution may be, for example, 0.1 to 50 mM.
  • Prenylflavonoid can be added to the reaction solution by dissolving it in a solvent such as ethanol, DMF, dimethyl sulfoxide (DMSO) and the like.
  • the initial concentration of UDP-hexose in the reaction solution is preferably 5 to 20 times, more preferably 5 to 15 times, the molar ratio with respect to prenylflavonoid.
  • the prenylflavonoid glycoside can be separated or purified from the reaction solution by a known method. Specifically, for example, ammonium sulfate precipitation, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, reverse phase high performance liquid chromatography, dialysis method, ultrafiltration method, etc. may be used alone or in combination as appropriate. can.
  • a prenylflavonoid glycoside in which hexose (hexose residue) is bound to prenylflavonoid can be produced by the above-mentioned transformant culture step or glycosyllating enzyme reaction step.
  • prenylflavonoid glycoside produced by the transformant culturing step or the glycosyllating enzyme reaction step prenylflavonoid and hexose residue are usually bound to O-glycosid.
  • the number of hexose residues may be one or two or more, but one is preferable.
  • the hexose is as described above, preferably glucose.
  • the resulting glycoside is usually an isoxanthohumol glycoside in which hexose is bound to the 7-position of isoxanthohumol.
  • the resulting glycoside is usually a xanthohumol glycoside with a hexose bound to the 4'and / or 4'(preferably 4') position of xanthohumol.
  • the body is usually a xanthohumol glycoside with a hexose bound to the 4'and / or 4'(preferably 4') position of xanthohumol.
  • the obtained glycoside is usually a prenylnaringenin glycoside in which a hex sauce is bound to the 7-position of prenylnaringenin.
  • the prenylflavonoid glycoside obtained by the production method of the present invention may be one kind, or may be a mixture of two or more kinds of glycosides having different types of aglycone and / or hexose.
  • the prenylflavonoid glycoside obtained by the above-mentioned production method has, for example, improved water solubility as compared with prenylflavonoid which is an aglycone.
  • the prenylflavonoid glycoside thus obtained is useful as a raw material for foods and drinks, pharmaceuticals, quasi-drugs, cosmetics, feeds and the like.
  • the prenylflavonoid used in the production method of the present invention is not limited to the production method or the like.
  • Isoxanthohumol can be prepared, for example, from a hop extract through a process such as heating. By heating the hop extract, isoxanthohumol can be produced in the extract. Purification of the hop extract for preparing isoxanthohumol is carried out by known methods. Examples of the purification method include the use of HPLC, an adsorption column, and the like, and methods such as precipitation utilizing a change in solubility. Isoxanthohumol can also be produced by heating xanthohumol.
  • Xanthohumol and 8-prenylnaringenin are prenylflavonoids contained in hops and the like.
  • Xanthohumol and 8-prenylnaringenin can be prepared, for example, by purifying from a hop extract by a known method.
  • Commercially available products can also be used for prenylflavonoids.
  • purified prenylflavonoids may be used, or plant-derived raw materials rich in prenylflavonoids may be used as long as the effects of the present invention are exhibited.
  • Example 1 Production of isoxanthohumol glycoside by glucosylation reaction of isoxanthohumol (hereinafter, also referred to as IX) by a plant enzyme
  • Rhizopus oryzae Rhizopus was cultured under the eight culture conditions (samples S1 to S8) shown in Table 1 below.
  • Total RNA was extracted from the cells using the RNeasy kit (Qiagen) according to the method recommended by the manufacturer.
  • the PD culture medium, PP and Glc in Table 1 are as follows.
  • PD culture 2.4% Potato Dextrose Broth (BD)
  • PP Potato Peptone CP (Far East Pharmaceutical Industry Co., Ltd.)
  • Glc For the sample in which the addition of glucose IX was "+”, IX was added so as to be 0.1 g / L. No IX was added to the sample in which the addition of IX was "-" (IX concentration in the medium was 0% by weight).
  • IX concentration in the medium was 0% by weight.
  • % % by weight.
  • Glc represents a medium containing 0.2% by weight of potato peptone CP and 0.2% by weight of glucose.
  • RNA The extracted 8 kinds of total RNA were reverse-transcribed mRNA with oligo dT primer, and a cDNA library was constructed by the method recommended by the manufacturer using the Ribo-Zero kit (Illumina) excluding ribosomal RNA. Sequencing was performed with NovaSEQ manufactured by Illumina. Using the obtained short leads, assembly was performed according to the following procedure.
  • mapping Create an index for mapping for the contig of the Trinity output result.
  • 4 Map the short read of each stage with reference to the contig of the Trinity output result (tool: hisat2, input file: fastq, output file: sam).
  • TPM transcripts per million expression level calculation 8: Calculate the number of reads per 1,000 bp of transcript length. Assuming that Yt is the read count mapped to the transcript t and Lt is the length of the transcript t, the number of reads (Tt) per 1,000 bp of the transcript t can be calculated by the following equation 1.
  • RoUGT15176_i1 and RoUGT15176_i14 showed 91% and 85% sequence identity with Rhizopus japonicus (R. japonicus) UGT59A1 at the amino acid level, respectively.
  • R. RoUGT15176 which shows 97% sequence identity at the DNA level with UGT59A1 from Japanicus, was also obtained.
  • the DNA sequence of RoUGT15176 is shown in SEQ ID NO: 3, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 4.
  • FIG. 1 shows a molecular phylogenetic tree of lysopath UGT prepared by a neighbor-joining method (NJ method) based on the full-length DNA sequence of the UGT gene (bootstrap value: 100).
  • RoUGT15176 (SEQ ID NO: 3) is based on sequence homology and molecular phylogenetic relationship. It was considered to be a gene corresponding to UGT59A1 in oryzae (Fig. 1).
  • KOD Plus NEO polymerase (TOYOBO) was used using 1 ⁇ L of cDNA of sample S1 in Table 1 as a template and the above gene-specific primers.
  • the PCR reaction was carried out at 94 ° C. for 3 minutes, followed by amplification at 94 ° C. for 15 seconds, 55 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 1 minute for a total of 35 cycles.
  • the PCR product was electrophoresed on a 0.8% agarose gel and stained with ethidium bromide, and as a result, an amplified band was obtained in a size of about 1.6 kb estimated from the cDNA length.
  • This PCR product was incorporated into the EcoRI and KpnI sites of the yeast expression vector pYE22m by using the restriction enzyme sites of EcoRI and KpnI added to the primer by GeneArt Semilesss Cloning and Assembury Enzyme Mix (Thermo Fisher).
  • the UGT gene inserted by the GAPDH promoter upstream of this vector EcoRI site is designed to be constitutively expressed.
  • DNA Sequencer model 3100 (Applied Biosystems) was used, and it was confirmed by sequencing that the inserted fragment was the target UGT gene by a primer walking method using a synthetic oligonucleotide primer.
  • the nucleotide sequence of the cDNA of RoUGT15176_i1 inserted into the vector is shown in SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequence of the protein encoded by the DNA is shown in SEQ ID NO: 2.
  • the activity was examined by expressing the protein encoded by the DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 obtained here in yeast.
  • the nucleotide sequence of the cDNA of RoUGT15176 inserted into the vector is shown in SEQ ID NO: 3, and the amino acid sequence of the protein encoded by the DNA is shown in SEQ ID NO: 4.
  • the nucleotide sequence of the cDNA of RoUGT15176_i14 inserted into the vector is shown in SEQ ID NO: 14.
  • This yeast expression vector is transformed into a laboratory yeast Saccharomyces cerevisiae INVSc strain (Invitrogen) by a conventional method, and Sc-Trp (1 L, Yeast nitrogen base w / o amino acids (DIFCO) 6.7 g, glucose). And amino acid powder (1.25 g of adenine sulfate, 0.6 g of arginine, 3 g of aspartic acid, 3 g of glutamic acid, 0.6 g of histidine, 1.8 g of leucine, 0.9 g of lysine, 0.6 g of methionine, 1.5 g of phenylalanine, 11 of serine.
  • Sc-Trp (1 L, Yeast nitrogen base w / o amino acids (DIFCO) 6.7 g, glucose).
  • amino acid powder (1.25 g of adenine sulfate, 0.6 g of arginine, 3 g of aspartic acid, 3 g of gluta
  • Transformants were selected on the basis of being able to grow on a 2% agar medium (containing 1.3 g of a mixture of .25 g, 0.9 g of tyrosine, 4.5 g of valine, 6 g of threonine, and 0.6 g of uracil).
  • a 2% agar medium containing 1.3 g of a mixture of .25 g, 0.9 g of tyrosine, 4.5 g of valine, 6 g of threonine, and 0.6 g of uracil.
  • the empty vector pYE22m was transformed. These transformed yeasts were pre-cultured overnight (30 ° C., 110 rpm) with 10 mL of Sc-Trp.
  • a yeast expressing the empty vector pYE22m was used as a control, and a yeast expressing a vector obtained by cloning the above-mentioned RjUGT59A1 (accession number: KX610761) (SEQ ID NO: 15) into pYE22m was used.
  • the HPLC analysis conditions are as follows. Column: COSMOSIL 5C18-AR-II 4.6 mm I. D. ⁇ 250 mm (manufactured by Nacalai Tesque Co., Ltd.) Liquid A: 0.1% TFA 2: 8 (v / v) CH 3 CN: H 2 O Liquid B: 0.1% TFA 8: 2 (v / v) CH 3 CN: H 2 O Flow velocity: 0.6 mL / min Gradient program (B solution concentration (%) is vol%): B solution 0% ⁇ 85% (15 min), B solution 85% (10 min), B solution 85% ⁇ 0% (0.5 min), B solution 0% (15.5 min) Detection: IX: 280 nm, XN: 320 nm Sample injection volume: 10 ⁇ L
  • FIG. 3 and FIG. 5 are HPLC analysis results (chromatogram of absorption spectrum at 280 nm) of the culture supernatant of the transformed yeast cultured with the addition of isoxanthohumol.
  • FIGS. 6, 7, 8 and 9 are HPLC analysis results (chromatogram of absorption spectrum at 320 nm) of the culture supernatant of the transformed yeast cultured with the addition of xanthohumol.
  • 2 and 6 are culture supernatants of transformed yeast (control) expressing the empty vector pYE22m.
  • 3 and 7 are culture supernatants of transformed yeast expressing RoUGT15176_i14.
  • 4 and 8 are culture supernatants of transformed yeast expressing RoUGT15176_i1.
  • IX refers to isoxanthohumol
  • IXG refers to an isoxanthohumol glycoside (IX7-position glucoside) in which glucose is bound to the 7-position of isoxanthohumol. ..
  • XN is a xanthohumol
  • XNG is a xanthohumol glycoside (glucoside at the 4'position of XN) in which glucose is bound to the 4'position of xanthohumol. Point to.
  • the ratio of the glucosyllation activity to IX to the glucosylation activity to XN was determined by the following method.
  • the ratio of the IXG peak area (detection: 280 nm) to the XNG peak area (detection: 320 nm) of the HPLC chromatogram was determined (IXG peak area / XNG peak area). This area ratio was taken as the ratio of the glucosyllation activity to IX to the glucosylation activity to XN (relative activity (IXG / XNG)).
  • a large relative activity indicates a high affinity for IX.
  • This relative activity (IXG / XNG) is shown in Table 2.
  • the standardized relative activity (vs i1) is the ratio of the relative activity (IXG / XNG) to the relative activity (IXG / XNG) of RoUGT15176_i1.
  • RoUGT15176_i1 and RoUGT15176 have higher affinity for IX than RjUGT59A1, and in particular, RoUGT15176_i1 is a UGT enzyme having a higher affinity for IX.
  • RoUGT15176_i1 could be identified as a UGT enzyme showing high specificity for IX, which is a prenylflavonoid, from the UGT genes found by the expression gene analysis (RNA-SEQ) of oryzae. Through characterization and expression / functional modification of this enzyme, it is expected that the poorly water-soluble functional substance can be saccharified more efficiently and the clarity and stability can be improved. All academic and patent documents described herein are incorporated herein by reference.
  • the present invention is useful in the field of food and drink.

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Abstract

本発明は、下記（ａ１）～（ａ５）のいずれかに記載のポリヌクレオチドに関する。 （ａ１）配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド （ａ２）配列番号１で表される塩基配列に対して９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、プレニルフラボノイドにヘキソースを転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド （ａ３）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド （ａ４）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１～９個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、プレニルフラボノイドにヘキソースを転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド （ａ５）配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、プレニルフラボノイドにヘキソースを転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド

Description

プレニルフラボノイド配糖化酵素、それをコードするポリヌクレオチド及びプレニルフラボノイド配糖体の製造方法
本発明は、プレニルフラボノイドにヘキソースを転移する活性を有するタンパク質、それをコードするポリヌクレオチド、それを含むベクター及び形質転換体に関する。また、本発明は、プレニルフラボノイド配糖体の製造方法などに関する。
ホップ（Ｈｕｍｕｌｕｓ　ｌｕｐｕｌｕｓ）の雌花に含まれるキサントフモールや、それが異性化したイソキサントフモールは、プレニル基を有するプレニルフラボノイドの一種である。プレニルフラボノイドは有用な生物活性を有することが知られている。一方、イソキサントフモール及びキサントフモールは極めて極性が低くほとんど水に溶解しないため、例えば飲料に配合する場合に添加量が制限される場合があった。
クモノスカビ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）は接合菌の一種であり、インドネシアのダイズ発酵食品であるテンペ、中国の紹興酒や白酒、韓国のマッコリの製造においても糖化及びタンパク質分解反応に利用されている有用食品用微生物である。Ｒｈｉｚｏｐｕｓ菌はゲノムが解読されている株もあるものの、ゲノム重複やグルコシル化活性を有すると期待される酵素遺伝子が多重化しているためにプレニルフラボノイド配糖化酵素遺伝子を特定することは容易ではない（非特許文献１及び２）。リゾパス・ジャポニクス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）のＵＤＰ糖依存的配糖化酵素（ＵＤＰ－ｓｕｇａｒ　ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ：ＵＧＴ）の一つであるＵＧＴ５９Ａ１はいくつかのフェノール基を持つ低分子化合物をグルコシル化反応することが報告されている（非特許文献３）。
Ｍａ　ＬＪ　ｅｔ　ａｌ．，　ＰＬｏＳ　Ｇｅｎｅｔ．　２００９　Ｊｕｌ；５（７）：ｅ１０００５４９．　ｄｏｉ：　１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｇｅｎ．１０００５４９．　Ｅｐｕｂ　２００９　Ｊｕｌ　３． Ｇｒｙｇａｎｓｋｙｉ　ＡＰ．　Ｅｔ　ａｌ，　Ｇ３　（Ｂｅｔｈｅｓｄａ）．　２０１８　Ｍａｙ　３１；８（６）：２００７－２０１８．　ｄｏｉ：　１０．１５３４／ｇ３．１１８．２００２３５． Ｋｅｂｏ　Ｘｉｅ　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｐｐｌ　Ｅｎｖｉｒｏｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　２０１７　Ｍａｒ　３１；８３（８）：ｅ０３１０３－１６．
ＵＧＴ５９Ａ１は特にマグノロールと呼ばれるリグナンの一種と反応性が高いことが報告されているが、イソキサントフモール等の極めて極性が低い難水溶性プレニルフラボノイドなどに対する反応性は明らかにされていない。
本発明は、プレニルフラボノイドにヘキソースを転移する活性を有するタンパク質及びそれをコードするポリヌクレオチドを提供することを目的とする。また、本発明は、プレニルフラボノイド配糖体の製造方法等を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、リゾパス（Ｒｈｉｚｏｓｐｕｓ）菌から、プレニルフラボノイドに糖を転移して配糖体を生成することができる酵素を見出した。難水溶性のプレニルフラボノイドに糖を付加することで、例えば、その水溶性を向上させることができる。また、この酵素遺伝子を利用することで、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ菌を用いなくとも、酵母などの異種細胞系で同様の化合物を配糖化することが可能となる。さらに、酵素改変を通じて、さらに多様な難溶性機能性物質を配糖化して、水溶性を向上させることができることが期待される。
すなわち、これに限定されるものではないが、本発明は以下のポリヌクレオチド、ベクター、形質転換体、プレニルフラボノイド配糖体の製造方法などに関する。
〔１〕下記（ａ１）～（ａ５）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（ａ１）配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ａ２）配列番号１で表される塩基配列に対して９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、プレニルフラボノイドにヘキソースを転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ａ３）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ａ４）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１～９個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、プレニルフラボノイドにヘキソースを転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ａ５）配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、プレニルフラボノイドにヘキソースを転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
〔２〕下記（ｂ１）～（ｂ５）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（ｂ１）配列番号３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ２）配列番号３で表される塩基配列に対して９８％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、プレニルフラボノイドにヘキソースを転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｂ３）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｂ４）配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１～５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、プレニルフラボノイドにヘキソースを転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｂ５）配列番号４で表されるアミノ酸配列に対して９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、プレニルフラボノイドにヘキソースを転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
〔３〕ヘキソースがグルコースである上記〔１〕又は〔２〕に記載のポリヌクレオチド。
〔４〕プレニルフラボノイドが、キサントフモール、イソキサントフモール及びプレニルナリンゲニンからなる群より選択される少なくとも１種である上記〔１〕～〔３〕のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
〔５〕上記〔１〕～〔４〕のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
〔６〕上記〔１〕～〔４〕のいずれかに記載のポリヌクレオチド又は上記〔５〕に記載のベクターが導入された形質転換体。
〔７〕下記（Ａ１）～（Ａ３）のいずれかに記載のタンパク質。
（Ａ１）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ａ２）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１～９個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、プレニルフラボノイドにヘキソースを転移する活性を有するタンパク質
（Ａ３）配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、プレニルフラボノイドにヘキソースを転移する活性を有するタンパク質
〔８〕下記（Ｂ１）～（Ｂ３）のいずれかに記載のタンパク質。
（Ｂ１）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ２）配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１～５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、プレニルフラボノイドにヘキソースを転移する活性を有するタンパク質
（Ｂ３）配列番号４で表されるアミノ酸配列に対して９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、プレニルフラボノイドにヘキソースを転移する活性を有するタンパク質
〔９〕ヘキソースがグルコースである上記〔７〕又は〔８〕に記載のタンパク質。
〔１０〕プレニルフラボノイドが、キサントフモール、イソキサントフモール及びプレニルナリンゲニンからなる群より選択される少なくとも１種である上記〔７〕～〔９〕のいずれかに記載のタンパク質。
〔１１〕プレニルフラボノイド配糖体の製造方法であって、上記〔６〕に記載の形質転換体を、プレニルフラボノイドの存在下で培養する工程を含む、プレニルフラボノイド配糖体の製造方法。
〔１２〕上記形質転換体を、プレニルフラボノイド及びヘキソース源の存在下で培養する、上記〔１１〕に記載の製造方法。
〔１３〕プレニルフラボノイド配糖体の製造方法であって、下記（Ａ１）～（Ａ３）及び（Ｂ１）～（Ｂ３）からなる群より選択される少なくとも１種のタンパク質により、プレニルフラボノイドと、ＵＤＰ－ヘキソースとから、プレニルフラボノイド配糖体を生成させる工程を含む、プレニルフラボノイド配糖体の製造方法。
（Ａ１）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ａ２）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１～９個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、プレニルフラボノイドにヘキソースを転移する活性を有するタンパク質
（Ａ３）配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、プレニルフラボノイドにヘキソースを転移する活性を有するタンパク質
（Ｂ１）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ２）配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１～５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、プレニルフラボノイドにヘキソースを転移する活性を有するタンパク質
（Ｂ３）配列番号４で表されるアミノ酸配列に対して９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、プレニルフラボノイドにヘキソースを転移する活性を有するタンパク質
〔１４〕ヘキソースがグルコースである上記〔１２〕又は〔１３〕に記載の製造方法。
〔１５〕プレニルフラボノイドが、キサントフモール、イソキサントフモール及びプレニルナリンゲニンからなる群より選択される少なくとも１種である上記〔１１〕～〔１４〕のいずれかに記載の製造方法。
本発明によれば、プレニルフラボノイドにヘキソースを転移する活性を有するタンパク質及びそれをコードするポリヌクレオチドを提供することができる。本発明のポリヌクレオチドを、例えば、酵母等の宿主に導入することによって、プレニルフラボノイド配糖体の製造に有用な形質転換体を得ることができる。また、本発明によれば、プレニルフラボノイド配糖体の製造方法等を提供することができる。
図１は、ＲｏＵＧＴ１５１７６＿ｉ１、ＲｏＵＧＴ１５１７６、ＲｊＵＧＴ５９Ａ１、ＲｏＵＧＴ１５１７６＿ｉ１４及びＲｏＵＧＴ１５１７６＿ｉ９の各ＵＧＴ遺伝子の完全長ＤＮＡ配列を基に近隣結合法（ＮＪ法）で作成したリゾパスＵＧＴの分子系統樹である（ブートストラップ値：１００）。 図２は、空ベクターのｐＹＥ２２ｍを発現させた形質転換酵母（コントロール）を、イソキサントフモールを含む培地で培養した培養上清のＨＰＬＣ分析結果である（検出：２８０ｎｍ）。 図３は、ＲｏＵＧＴ１５１７６＿ｉ１４を発現させた形質転換酵母を、イソキサントフモールを含む培地で培養した培養上清のＨＰＬＣ分析結果である（検出：２８０ｎｍ）。 図４は、ＲｏＵＧＴ１５１７６＿ｉ１を発現させた形質転換酵母を、イソキサントフモールを含む培地で培養した培養上清のＨＰＬＣ分析結果である（検出：２８０ｎｍ）。 図５は、ＲｊＵＧＴ５９Ａ１を発現させた形質転換酵母を、イソキサントフモールを含む培地で培養した培養上清のＨＰＬＣ分析結果である（検出：２８０ｎｍ）。 図６は、空ベクターのｐＹＥ２２ｍを発現させた形質転換酵母（コントロール）を、キサントフモールを含む培地で培養した培養上清のＨＰＬＣ分析結果である（検出：３２０ｎｍ）。 図７は、ＲｏＵＧＴ１５１７６＿ｉ１４を発現させた形質転換酵母を、キサントフモールを含む培地で培養した培養上清のＨＰＬＣ分析結果である（検出：３２０ｎｍ）。 図８は、ＲｏＵＧＴ１５１７６＿ｉ１を発現させた形質転換酵母を、キサントフモールを含む培地で培養した培養上清のＨＰＬＣ分析結果である（検出：３２０ｎｍ）。 図９は、ＲｊＵＧＴ５９Ａ１を発現させた形質転換酵母を、キサントフモールを含む培地で培養した培養上清のＨＰＬＣ分析結果である（検出：３２０ｎｍ）。
＜ポリヌクレオチド＞
本発明の第一の態様のポリヌクレオチドは、下記（ａ１）～（ａ５）のいずれかに記載のポリヌクレオチドである。
（ａ１）配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ａ２）配列番号１で表される塩基配列に対して９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、プレニルフラボノイドにヘキソースを転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ａ３）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ａ４）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１～９個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、プレニルフラボノイドにヘキソースを転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ａ５）配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、プレニルフラボノイドにヘキソースを転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
上記（ａ２）において、配列番号１で表される塩基配列に対する同一性（配列同一性とも称される）は、好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、９６％以上又は９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上である。
アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等の解析ソフトウェアを用いて、デフォルトのパラメータにより算出することができる。
上記（ａ４）において、欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸の数は、好ましくは１～８個、１～７個又は１～６個、より好ましくは１～５個、さらに好ましくは１～４個、特に好ましくは１～３個、特に好ましくは１又は２個、最も好ましくは１個である。
本明細書中、タンパク質のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたとは、同一配列中の任意かつ１若しくは複数のアミノ酸配列中の位置において、１若しくは複数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入及び／又は付加があることを意味し、欠失、置換、挿入及び付加のうち２種以上が同時に生じていてもよい。
上記（ａ５）において、配列番号２で表されるアミノ酸配列に対するアミノ酸配列の同一性（配列同一性）は、好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、９６％以上又は９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上である。
本発明の第一の態様のポリヌクレオチドの中で、上記（ａ１）に記載のポリヌクレオチドが好ましい。
本発明の第二の態様のポリヌクレオチドは、下記（ｂ１）～（ｂ５）のいずれかに記載のポリヌクレオチドである。
（ｂ１）配列番号３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ２）配列番号３で表される塩基配列に対して９８％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、プレニルフラボノイドにヘキソースを転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｂ３）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｂ４）配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１～５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、プレニルフラボノイドにヘキソースを転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｂ５）配列番号４で表されるアミノ酸配列に対して９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、プレニルフラボノイドにヘキソースを転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
上記（ｂ２）において、配列番号３で表される塩基配列に対する同一性（配列同一性とも称される）は、好ましくは９９％以上、より好ましくは９９．５％以上である。
上記（ｂ４）において、欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸の数は、好ましくは１～４個、より好ましくは１～３個、さらに好ましくは１又は２個、特に好ましくは１個である。
上記（ｂ５）において、配列番号４で表されるアミノ酸配列に対するアミノ酸配列の同一性（配列同一性）は、好ましくは９９．５％以上である。
本発明の第二の態様のポリヌクレオチドの中で、（ｂ１）に記載のポリヌクレオチドが好ましい。
本発明の第一の態様のポリヌクレオチド及び第二の態様のポリヌクレオチドを、以下、まとめて本発明のポリヌクレオチドともいう。
本明細書中、ポリヌクレオチドとは、ＤＮＡ又はＲＮＡを意味する。本発明のポリヌクレオチドは、好ましくはＤＮＡである。
本発明のポリヌクレオチドは、例えば、公知の遺伝子工学的手法又は合成手法によって取得することができる。
本発明のポリヌクレオチドは、プレニルフラボノイドにヘキソースを転移する活性を有するタンパク質をコードする。本発明において、プレニルフラボノイドにヘキソースを転移する活性とは、プレニルフラボノイドの水酸基に、糖供与体からヘキソース（ヘキソース残基）を転移し、プレニルフラボノイド配糖体を生成させる活性をいう。糖供与体は、通常、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）－グルコース等のＵＤＰ－ヘキソースである。上記糖供与体は、好ましくはＵＤＰ－グルコースである。プレニルフラボノイドに、糖供与体のＵＤＰ－ヘキソースからヘキソースを転移すると、プレニルフラボノイドにヘキソース（ヘキソース残基）が結合したプレニルフラボノイド配糖体とＵＤＰとを生じる。
本発明のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質は、プレニルフラボノイドにヘキソースを転移する活性を有することから、プレニルフラボノイド配糖化酵素と表わすこともできる。本発明のポリヌクレオチドは、プレニルフラボノイド配糖化酵素遺伝子と表わすこともできる。
タンパク質がプレニルフラボノイドにヘキソースを転移する活性を有することは、例えば、ＵＤＰ－ヘキソースとプレニルフラボノイドとを、評価対象となるタンパク質の存在下で反応させ、得られる反応物をＨＰＬＣ等で分析することによって確認することができる。
本発明におけるプレニルフラボノイドとして、イソキサントフモール、キサントフモール、プレニルナリンゲニン等が好ましい。一態様において、プレニルフラボノイドにヘキソースを転移する活性は、イソキサントフモール、キサントフモール及びプレニルナリンゲニンからなる群より選択される少なくとも１種にヘキソースを転移する活性であることが好ましい。プレニルナリンゲニンとして、８－プレニルナリンゲニン、６－プレニルナリンゲニン等が挙げられる。上記活性は、より好ましくは、イソキサントフモール及び／又はキサントフモールにヘキソースを転移する活性であり、さらに好ましくは、イソキサントフモール及びキサントフモールにヘキソースを転移する活性である。一態様において、プレニルフラボノイドは特に好ましくはイソキサントフモールである。一態様において、プレニルフラボノイドは、好ましくはキサントフモールである。
イソキサントフモール及び８－プレニルナリンゲニンは、下記一般式（１Ａ）で表される化合物である。キサントフモールは、下記式（２Ａ）で表される化合物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
上記一般式（１Ａ）中、Ｒ１は、メチル基又は水素原子を表す。
Ｒ１が、メチル基である場合、一般式（１Ａ）で表されるプレニルフラボノイドはイソキサントフモールである。Ｒ１が、水素原子である場合、一般式（１Ａ）で表されるプレニルフラボノイドは、８－プレニルナリンゲニンである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
イソキサントフモールにヘキソースを転移する活性とは、通常、イソキサントフモールの７位（より具体的には、７位の水酸基）にヘキソース（ヘキソース残基）を転移する活性である。この反応により、通常、イソキサントフモールの７位（の水酸基）にヘキソース（ヘキソース残基）が結合しているイソキサントフモール配糖体が生成する。
キサントフモールにヘキソースを転移する活性とは、通常、キサントフモールの４´位及び／又は４位（より具体的には、４´位及び／又は４位の水酸基）、好ましくは４´位にヘキソースを転移する活性である。この反応により、通常、キサントフモールの４´位及び／又は４位（の水酸基）にヘキソース（ヘキソース残基）が結合しているキサントフモール配糖体が生成する。一態様においては、キサントフモールにヘキソースを転移する活性は、好ましくは、キサントフモールの４´位にヘキソースを転移する活性である。
プレニルナリンゲニンにヘキソースを転移する活性とは、通常、プレニルナリンゲニンの７位（より具体的には、７位の水酸基）にヘキソースを転移する活性である。この反応により、８－プレニルナリンゲニン、６－プレニルナリンゲニン等のプレニルナリンゲニンの７位（の水酸基）にヘキソース（ヘキソース残基）が結合しているプレニルナリンゲニン配糖体が生成する。
プレニルフラボノイドに転移するヘキソースの数は、１つでもよく、２つ以上でもよいが、１つであることが好ましい。ヘキソース（ヘキソース残基）を転移する活性は、ヘキソース（ヘキソース残基）を付加する活性ということもできる。
イソキサントフモールの７位にヘキソースが結合しているイソキサントフモール配糖体は、下記一般式（１Ｂ）で表される化合物である。８－プレニルナリンゲニンの７位にヘキソースが結合している８－プレニルナリンゲニン配糖体は、下記一般式（１Ｂ）で表される化合物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
一般式（１Ｂ）中、Ｒ１は、メチル基又は水素原子を表す。Ｘ１は、ヘキソース残基を表す。
上記一般式（１Ｂ）において、Ｒ１がメチル基である化合物は、イソキサントフモール配糖体である。Ｒ１が水素原子である化合物は、８－プレニルナリンゲニン配糖体である。
キサントフモールの４´位及び／又は４位にヘキソースが結合しているキサントフモール配糖体は、下記一般式（２Ｂ）で表される化合物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
一般式（２Ｂ）中、Ｘ２及びＸ３は、同一又は異なって、水素原子又はヘキソース残基を表す。但し、Ｘ２及びＸ３の少なくとも１つはヘキソース残基を表す。
一般式（２Ｂ）において、Ｘ２がヘキソース残基であり、Ｘ３が水素原子である化合物は、キサントフモールの４´位にヘキソースが結合しているキサントフモール配糖体である。一般式（２Ｂ）において、Ｘ２が水素原子であり、Ｘ３がヘキソース残基である化合物は、キサントフモールの４位にヘキソースが結合しているキサントフモール配糖体である。一般式（２Ｂ）において、Ｘ２及びＸ３がヘキソース残基である化合物は、キサントフモールの４´位及び４位にヘキソースが結合しているキサントフモール配糖体である。Ｘ２及びＸ３がヘキソース残基を表す場合、ヘキソース残基は同じであってもよく、異なっていてもよい、
ヘキソースとして、グルコース、ガラクトース、ラムノース、フルクトース、グルクロン酸等が挙げられる。中でも、ヘキソースとして、グルコース、ガラクトースが好ましく、グルコースがより好ましい。本明細書中、ヘキソースは、好ましくはＤ体である。本発明におけるヘキソースとして、Ｄ－グルコースが好ましい。
本発明の一態様において、プレニルフラボノイドにヘキソースを転移する活性は、好ましくは、プレニルフラボノイドにグルコースを転移する活性である。
本発明のポリヌクレオチドは、例えば、本発明のポリペプチドを発現するベクター又は形質転換体の製造、プレニルフラボノイド配糖体の製造等に好適に使用することができる。本発明のポリヌクレオチドは、例えば、宿主に導入することが好ましい。宿主に本発明のポリヌクレオチドを導入することで、例えば、プレニルフラボノイド配糖体の製造、プレニルフラボノイドにヘキソースを転移する活性を有するタンパク質の製造、プレニルフラボノイドにヘキソースを転移する活性を有するタンパク質を発現する形質転換体の製造等が可能である。上記宿主は特に限定されず、微生物（例えば、酵母、大腸菌、糸状菌等）、植物体又はその部分等が挙げられる。
本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは、適切な発現ベクターに挿入された状態で宿主に導入される。例えば、後述するような本発明の発現ベクターにより、ポリヌクレオチドを上記宿主に導入することが好ましい。
＜プレニルフラボノイドにヘキソースを転移する活性を有するタンパク質＞
本発明は、上記の本発明のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質も提供する。
本発明のある態様のタンパク質は、下記（Ａ１）～（Ａ３）のいずれかに記載のタンパク質である。
（Ａ１）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ａ２）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１～９個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、プレニルフラボノイドにヘキソースを転移する活性を有するタンパク質
（Ａ３）配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、プレニルフラボノイドにヘキソースを転移する活性を有するタンパク質
上記（Ａ１）～（Ａ３）のタンパク質を、本発明の第一の態様のタンパク質ともいう。
上記（Ａ２）において、欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸の数は、好ましくは１～８個、１～７個又は１～６個、より好ましくは１～５個、さらに好ましくは１～４個、特に好ましくは１～３個、特に好ましくは１又は２個、最も好ましくは１個である。
上記（Ａ３）において、配列番号２で表されるアミノ酸配列に対するアミノ酸配列の同一性は、好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、９６％以上又は９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上である。
本発明の第一の態様のタンパク質は、好ましくは上記（Ａ１）に記載のタンパク質である。
本発明のさらに別の態様のタンパク質は、下記（Ｂ１）～（Ｂ３）のいずれかに記載のタンパク質である。
（Ｂ１）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ２）配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１～５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、プレニルフラボノイドにヘキソースを転移する活性を有するタンパク質
（Ｂ３）配列番号４で表されるアミノ酸配列に対して９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、プレニルフラボノイドにヘキソースを転移する活性を有するタンパク質
上記（Ｂ１）～（Ｂ３）のタンパク質を、本発明の第二の態様のタンパク質ともいう。
上記（Ｂ２）において、欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸の数は、好ましくは１～４個、より好ましくは１～３個、さらに好ましくは１又は２個、特に好ましくは１個である。
上記（Ｂ３）において、配列番号４で表されるアミノ酸配列に対するアミノ酸配列の同一性（配列同一性）は、好ましくは９９．５％以上である。
本発明の第二の態様のタンパク質は、好ましくは上記（Ｂ１）に記載のタンパク質である。
本発明の第一の態様のタンパク質及び本発明の第二の態様のタンパク質を、まとめて本発明のタンパク質ともいう。
本発明のタンパク質は、プレニルフラボノイドにヘキソースを転移する活性を有するタンパク質であり、プレニルフラボノイド配糖化酵素ということもできる。プレニルフラボノイドにヘキソースを転移する活性は、上述した通りである。ヘキソース及びその好ましい態様は上記と同じであり、ヘキソースとして、グルコース、ガラクトースが好ましく、グルコースがより好ましい。
本発明のタンパク質は、例えば、イソキサントフモール、キサントフモール及びプレニルナリンゲニンからなる群より選択される少なくとも１種のプレニルフラボノイドにヘキソースを転移するために使用することができる。プレニルフラボノイドにヘキソースを転移することで、プレニルフラボノイドの水溶性を向上させることができる。これにより、液体の清澄性を高めることができる。また、プレニルフラボノイドにヘキソースを転移すると、プレニルフラボノイドの呈味改善、熱安定性向上、ｐＨ安定性向上等の効果も得られる。
例えば、上記（Ａ１）～（Ａ３）のタンパク質は、イソキサントフモール及びキサントフモールにヘキソースを転移する活性を有する。上記（Ｂ１）～（Ｂ３）のタンパク質は、イソキサントフモール及びキサントフモールにヘキソースを転移する活性を有する。一態様において、上記（Ａ１）～（Ａ３）及び（Ｂ１）～（Ｂ３）のタンパク質は、イソキサントフモール及び／又はキサントフモールにヘキソースを転移するために好ましく使用することができる。上記（Ａ１）～（Ａ３）のタンパク質は、イソキサントフモールに対する親和性が、他のプレニルフラボノイド（例えば、キサントフモール）に対する親和性よりも高い。このため上記（Ａ１）～（Ａ３）のタンパク質は、例えば、イソキサントフモール配糖体を得るために好適に使用することができる。上記（Ａ１）～（Ａ３）のタンパク質は、プレニルフラボノイドがイソキサントフモールの場合に、他のプレニルフラボノイド（例えば、キサントフモール）と比較して強いヘキソース転移活性を示す。
本発明のタンパク質は、例えば、後記の形質転換体を用いて製造することができる。
＜発現ベクター＞
本発明の発現ベクターは、上記の本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターである。本発明の発現ベクターは、上記（ａ１）～（ａ５）及び（ｂ１）～（ｂ５）のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む。一態様において、本発明の発現ベクターは、上記（ａ１）～（ａ５）のいずれかのポリヌクレオチドを含むものであってよい。さらに別の態様において、本発明の発現ベクターは、上記（ｂ１）～（ｂ５）のいずれかのポリヌクレオチドを含むものであってよい。一態様において、本発明の発現ベクターは、好ましくは、上記（ａ１）～（ａ５）及び（ｂ１）のいずれかのポリヌクレオチド、より好ましくは上記（ａ１）～（ａ５）のいずれかのポリヌクレオチド、さらに好ましくは、上記（ａ１）のポリヌクレオチドを含む。
本発明の発現ベクターを用いると、例えば、本発明のポリヌクレオチドを容易に宿主へ導入することができる。また、宿主における本発明のポリヌクレオチドの発現を、容易に制御することができる。本発明の発現ベクターの用途等は特に限定されず、上述した本発明のポリヌクレオチドと同様である。
本発明の発現ベクターは、例えば、導入される宿主において、本発明のポリヌクレオチドがコードするプレニルフラボノイドにヘキソースを転移する活性を有するタンパク質を発現可能なように、該ポリヌクレオチドを含んでいればよく、その他の構成は特に限定されない。上記宿主は特に限定されず、発現ベクターの使用目的に応じて、適宜選択すればよい。
本発明の発現ベクターは、例えば、骨格となるベクター（以下、「基本ベクター」ともいう）に、本発明のポリヌクレオチド（上記（ａ１）～（ａ５）及び（ｂ１）～（ｂ５）のいずれかのポリヌクレオチド）を挿入することにより作製することができる。上記ベクターの種類は特に限定されず、例えば、導入する宿主の種類に応じて、適宜選択すればよい。酵母に形質転換を行う場合、例えば、ベクターとして、ｐＹＥ２２ｍ（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５９，１２２１－１２２８，１９９５）等が挙げられ、また、ｐＹＥＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＥＳＣ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）等の市販の酵母発現用ベクターを用いることもできる。大腸菌等の細菌に形質転換を行う場合、ベクターとして、例えば、ｐＥＴベクター（Ｍｅｒｃｋ社）、ｐＣｏｌｄベクター（タカラバイオ株式会社）、ＰＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ社）等が挙げられる。
本発明の発現ベクターは、例えば、上記ポリヌクレオチドの発現及び該ポリヌクレオチドがコードするプレニルフラボノイドにヘキソースを転移する活性を有するタンパク質の発現を調節する、調節配列を有することが好ましい。調節配列としては、例えば、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル配列、複製起点配列（ｏｒｉ）等が挙げられる。
例えば、細菌用発現ベクターのプロモーターとしては、慣用的なプロモーター（例えば、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター等）を使用することができ、酵母用プロモーターとしては、例えば、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、ＰＨ０５プロモーター等が挙げられ、糸状菌用プロモーターとしては、例えば、アミラーゼ、ｔｒｐＣ等が挙げられる。また、植物細胞内で目的遺伝子を発現させるためのプロモーターの例としては、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓ　ＲＮＡプロモーター、ｒｄ２９Ａ遺伝子プロモーター、ｒｂｃＳプロモーター、上記カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓ　ＲＮＡプロモーターのエンハンサー配列をアグロバクテリウム由来のマンノピン合成酵素プロモーター配列の５’側に付加したｍａｃ－１プロモーター等が挙げられる。動物細胞宿主用プロモーターとしては、ウイルス性プロモーター（例えば、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター等）が挙げられる。
本発明の発現ベクターにおいて、調節配列の配置は特に限定されない。上記調節配列は、例えば、本発明のポリヌクレオチドの発現及びこれがコードするプレニルフラボノイドにヘキソースを転移する活性を有するタンパク質の発現を、機能的に調節できるように配置されていればよく、公知の方法に基づいて配置できる。また、調節配列は、導入されるべき宿主の種類に応じて適宜選択すればよい。調節配列は、例えば、基本ベクターが予め備える配列を利用してもよいし、基本ベクターに、さらに、調節配列を挿入してもよいし、基本ベクターが備える調節配列を、他の調節配列に置き換えてもよい。
一態様においては、発現ベクターは、（ｉ）宿主細胞内で転写可能なプロモーター；（ｉｉ）該プロモーターに結合した、本発明のポリヌクレオチド；及び（ｉｉｉ）ＲＮＡ分子の転写終結及びポリアデニル化に関し、宿主細胞内で機能するシグナルを構成要素として含む発現カセットを含むように構成されることが好ましい。
本発明の発現ベクターは、例えば、さらに、選択マーカーのコード配列を１又は２以上有してもよい。選択マーカーとしては、例えば、薬剤耐性マーカー、蛍光タンパク質マーカー、酵素マーカー、細胞表面レセプターマーカー等が挙げられる。
発現ベクターの作製方法としては、プラスミド、ファージ又はコスミドなどを用いる方法が挙げられるが特に限定されない。
本発明の発現ベクターを宿主に導入する方法は特に限定されず、公知の方法により行うことができる。上記導入方法は、例えば、宿主の種類、発現ベクターの種類等に応じて、適宜決定できる。
＜形質転換体等＞
本発明のポリヌクレオチド又は本発明のベクターが導入された形質転換体も、本発明の一つである。
本発明の形質転換体は、本発明のポリヌクレオチド（例えば、上記（ａ１）～（ａ５）及び（ｂ１）～（ｂ５）のいずれかに記載のポリヌクレオチド）又は本発明の発現ベクターが導入された形質転換体である。好ましくは、本発明の発現ベクターが導入された形質転換体である。以下、「本発明のポリヌクレオチドの導入」は、特に示さない限り、「本発明の発現ベクターの導入」の意味も含む。
形質転換体は、上記（ａ１）～（ａ５）のいずれかに記載のポリヌクレオチド（好ましくは（ａ１）のポリヌクレオチド）又は当該ポリヌクレオチドを含む発現ベクターが導入されたものであってよい。形質転換体は、上記（ｂ１）～（ｂ５）のいずれかに記載のポリヌクレオチド（好ましくは（ｂ１）のポリヌクレオチド）又は当該ポリヌクレオチドを含む発現ベクターが導入されたものであってよい。
本発明の形質転換体は、通常、本発明のポリヌクレオチドが発現可能に導入された非ヒト宿主であればよく、その他の構成は特に限定されない。「ポリヌクレオチドが発現可能」は、上記ポリヌクレオチドがコードするタンパク質が発現可能であるとの意味を含む。
形質転換体の作製方法（生産方法）は特に限定されないが、例えば、上述した発現ベクターを宿主に導入して形質転換する方法が挙げられる。ここで用いられる宿主は、非ヒト宿主である。宿主（宿主細胞）は、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。宿主として、微生物、植物体又はその部分、動物細胞、昆虫細胞、これらの培養細胞等が挙げられる。一態様においては、微生物を宿主とすることが好ましい。また別の一態様においては、植物体又はその部分を宿主とすることが好ましい。宿主とする植物としては、プレニルフラボノイド又はその配糖体を含む植物が好ましく、例えば、ホップ（Ｈｕｍｕｌｕｓ　ｌｕｐｕｌｕｓ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ　ｍａｘ）、イカリソウ（Ｅｐｉｍｅｄｉｕｍ　ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ　ｖａｒ．　ｔｈｕｎｂｅｒｇｉａｎｕｍ）等の植物が好ましい。
微生物としては、例えば、原核生物及び真核生物等が挙げられる。原核生物としては、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）等のエッシェリヒア属；バシラス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバシラス属；シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属；リゾビウム・メリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｍｅｌｉｌｏｔｉ）等のリゾビウム属等の細菌が挙げられる。真核生物としては、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）等の酵母；コウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓｏｊａｅ等）、シロカビ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉ等）、クモノスカビ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｏｒｙｚａｅ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｏｌｉｇｏｓｐｏｒｕｓ等）等の糸状菌等が挙げられる。動物細胞としては、例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等が挙げられ、昆虫細胞としては、例えば、Ｓｆ９、Ｓｆ２１等が挙げられる。一態様において、非ヒト宿主としては、酵母又は糸状菌が好ましく、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、コウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓｏｊａｅ）、シロカビ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉ）、クモノスカビ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｏｒｙｚａｅ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｏｌｉｇｏｓｐｏｒｕｓ）がより好ましい。上記の宿主細胞のための適切な培養培地及び条件は当分野で周知である。
上記ポリヌクレオチド又は発現ベクターを宿主に導入する方法は特に限定されず、公知の形質転換方法を使用することができる。導入方法は、宿主の種類等に応じて適宜選択すればよい。例えば、エレクトロポレーション法、パーティクルデリバリー法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ法（例えば、Ｗｏｏ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　３３，　１１６２－１１６４　（２０１５））等を用いることができるが、これらに限定されない。
本発明の一態様において、形質転換体は、植物形質転換体であり得る。植物形質転換体は、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを、当該ポリヌクレオチドが発現可能なように植物に導入することによって得ることができる。
発現ベクターを用いる場合、植物体の形質転換に用いられる発現ベクターは、当該植物内で本発明に係るポリヌクレオチドを発現させることが可能なベクターであれば特に限定されない。このようなベクターとしては、例えば、植物細胞内でポリヌクレオチドを構成的に発現させるプロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター）を有するベクター又は外的な刺激によって誘導性に活性化されるプロモーターを有するベクターが挙げられる。
本発明において形質転換の対象となる植物は、植物体全体、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、種子など）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織など）又は植物培養細胞、あるいは種々の形態の植物細胞（例えば、懸濁培養細胞）、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどのいずれをも意味する。形質転換に用いられる植物としては、特に限定されず、単子葉植物綱又は双子葉植物綱に属する植物のいずれでもよい。
植物への遺伝子の導入には、当業者に公知の形質転換方法（例えば、アグロバクテリウム法、遺伝子銃、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法など）が用いられる。例えば、アグロバクテリウムを介する方法と直接植物細胞に導入する方法が周知である。アグロバクテリウム法を用いて形質転換を行う場合には、バイナリーベクター（ｐＢＩ１２１又はｐＰＺＰ２０２など）を使用することができる。また、遺伝子を直接植物細胞又は植物組織に導入する方法としては、エレクトロポレーション法、遺伝子銃法が知られている。遺伝子銃を用いる場合は、植物体、植物器官、植物組織自体をそのまま使用してもよく、切片を調製した後に使用してもよく、プロトプラストを調製して使用してもよい。
遺伝子が導入された細胞又は植物組織は、まずハイグロマイシン耐性などの薬剤耐性で選択され、次いで定法によって植物体に再生される。形質転換細胞から植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である。
植物培養細胞を宿主として用いる場合は、形質転換は、発現ベクターを遺伝子銃、エレクトロポレーション法などで培養細胞に導入する。形質転換の結果得られるカルスやシュート、毛状根などは、そのまま細胞培養、組織培養又は器官培養に用いることが可能であり、また従来知られている植物組織培養法を用い、適当な濃度の植物ホルモン（オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸、エチレン、ブラシノライドなど）の投与などによって植物体に再生させることができる。
本発明に係るポリヌクレオチドがゲノム内に組み込まれた形質転換植物体が一旦取得されれば、当該植物体の有性生殖又は無性生殖によって子孫を得ることができる。また、当該植物体又はその子孫、あるいはこれらのクローンから、例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラストなどを得て、それらを基に当該植物体を量産することができる。従って、本発明には、本発明に係るポリヌクレオチドが発現可能に導入された植物体、若しくは当該植物体と同一の性質を有する当該植物体の子孫、又はこれら由来の組織も含まれる。
種々の植物に対する形質転換方法が既に報告されている。本発明に係る形質転換体植物としては、例えば、ホップ、ダイズ、イカリソウなどが挙げられるがこれらに限定されない。本発明の一態様によれば、形質転換体植物は機能性食品材料用植物体である。
本発明のポリヌクレオチドが宿主に導入されたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等によって行うことができる。例えば、形質転換体からＤＮＡを調製し、ＤＮＡ特異的プライマーを設計してＰＣＲを行う。ＰＣＲにより得られた増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ液等によって染色し、そして増幅産物を１本のバンドとして検出することによって、形質転換されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素等によって標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光又は酵素反応等によって増幅産物を確認する方法も採用することができる。
本発明の形質転換体では、導入された本発明のポリヌクレオチドにより、プレニルフラボノイドにヘキソースを転移する活性を有するタンパク質が発現されていることが好ましい。
＜本発明のタンパク質の製造方法＞
上記の本発明のタンパク質は、例えば、上記の形質転換体を用いて製造することができる。例えば、上記の形質転換体の培養物から、本発明のタンパク質を分離及び精製することによって、本発明のタンパク質を得ることができる。ここで、培養物とは、培養液、培養菌体若しくは培養細胞、又は培養菌体若しくは培養細胞の破砕物のいずれをも意味する。本発明のタンパク質の分離及び精製は、通常の方法に従って行うことができる。
本発明のタンパク質が培養菌体内又は培養細胞内に蓄積される場合には、培養後、通常の方法（例えば、超音波、リゾチーム、凍結融解など）で菌体又は細胞を破砕した後、通常の方法（例えば、遠心分離、ろ過など）により本発明のタンパク質の粗抽出液を得ることができる。本発明のタンパク質が培養液中に蓄積される場合には、培養終了後、通常の方法（例えば、遠心分離、ろ過など）により菌体又は細胞と培養上清とを分離することにより、本発明のタンパク質を含む培養上清を得ることができる。このようにして得られた抽出液又は培養上清中に含まれる本発明のタンパク質の精製は、通常の分離又は精製方法に従って行うことができる。分離又は精製方法としては、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、透析法、限外ろ過法等を、単独で又は適宜組み合わせて用いることができる。
本発明のタンパク質は、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ－ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、ペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
＜プレニルフラボノイド配糖体の製造方法＞
本発明は、プレニルフラボノイド配糖体の製造方法も包含する。
上述した本発明の形質転換体を、プレニルフラボノイドの存在下で培養する工程を含む、プレニルフラボノイド配糖体の製造方法も本発明に包含される。
上記の形質転換体を培養する工程（形質転換体培養工程ともいう）を含むプレニルフラボノイド配糖体の製造方法を、本発明の第一の態様の製造方法ともいう。
本発明の第一の態様の製造方法で使用する形質転換体は、上記の（ａ１）～（ａ５）及び（ｂ１）～（ｂ５）のいずれかのポリヌクレオチド、又は、当該ポリヌクレオチドを含むベクターが導入された形質転換体である。形質転換体及びその好ましい態様は、上記と同じである。好ましくは、微生物を宿主に用いた形質転換体であり、酵母形質転換体がより好ましい。
本発明の第一の態様の製造方法では、上記形質転換体を、プレニルフラボノイドの存在下で培養することにより、プレニルフラボノイド（より詳細には、プレニルフラボノイドの水酸基）にヘキソース（ヘキソース残基）を転移して、プレニルフラボノイド配糖体を生成することができる。形質転換体により発現されるプレニルフラボノイドにヘキソースを転移する活性を有するタンパク質によって、プレニルフラボノイド配糖体を生成することができる。
形質転換体の培養は、形質転換体の作製に用いた宿主細胞に使用可能な培養条件で、プレニルフラボノイドを含む培地を用いて行うことができる。培地には、上記宿主細胞を培養可能であり、プレニルフラボノイド含む培地を使用することができる。培地は、好ましくは液体培地である。
本発明の製造方法において、プレニルフラボノイドは、上記と同じである。プレニルフラボノイドとして、イソキサントフモール、キサントフモール及び８－プレニルナリンゲニンからなる群より選択される少なくとも１種が好ましく、イソキサントフモール及び／又はキサントフモールが好ましく、イソキサントフモール及びキサントフモール、又は、イソキサントフモールがさらに好ましく、イソキサントフモールが特に好ましい。一態様において、プレニルフラボノイドとしてキサントフモールが好ましい。
本発明の製造方法においては、上記の（ａ１）～（ａ５）のいずれかのポリヌクレオチド又は当該ポリヌクレオチドを含むベクターが導入された形質転換体を用いてもよく、上記の（ｂ１）～（ｂ５）のいずれかのポリヌクレオチド又は当該ポリヌクレオチドを含むベクターが導入された形質転換体を用いてもよい。
一態様において、例えばイソキサントフモール配糖体を得る場合には、上記の（ａ１）～（ａ５）のいずれかのポリヌクレオチド又は当該ポリヌクレオチドを含むベクターが導入された形質転換体を使用することが好ましく、上記の（ａ１）のポリヌクレオチド又は当該ポリヌクレオチドを含むベクターが導入された形質転換体を使用することがより好ましい。上記（ａ１）のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質は、イソキサントフモールに対する親和性が、他のプレニルフラボノイド（例えば、キサントフモール）に対する親和性よりも高いためである。
培地中のプレニルフラボノイドの濃度は特に限定されず、例えば、１ｍｇ／Ｌ～１０ｇ／Ｌであってよい。一態様において、プレニルフラボノイドの濃度は、培養開始時に上記濃度であればよい。プレニルフラボノイドは、培地に一度に添加してもよく、培養中に複数回に分けて培地に添加してもよい。プレニルフラボノイドは、例えば、エタノール、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等の溶媒に溶解させて培地に添加することができる。
上記形質転換体の培養は、プレニルフラボノイド配糖体のヘキソース残基の供給源となるヘキソース源の存在下で行うことができる。上記形質転換体の培養は、例えば、プレニルフラボノイド及びヘキソース源の存在下での培養であってよい。また、例えば、プレニルフラボノイドの存在下での培養の前に、形質転換体を、ヘキソース源の存在下で培養してもよい。一態様において、形質転換体培養工程においては、形質転換体を、プレニルフラボノイド及びヘキソースの存在下で培養する、又は、ヘキソース源の存在下で培養した形質転換体を、プレニルフラボノイドの存在下で培養することが好ましい。ヘキソース源の存在下で培養すると、通常、形質転換体の細胞内にヘキソース源が取り込まれ、プレニルフラボノイド配糖体の製造に利用される。
ヘキソース源として、ヘキソース、ヘキソース供給源となるヘキソース単位を含む炭素源を使用することができる。ヘキソース源は１種使用してもよく、２種以上を組み合わせて使用してもよい。
ヘキソース源の存在下での培養においては、ヘキソース源として、例えば、培地にヘキソースを添加してもよく、ヘキソース供給源となるヘキソース単位を含む炭素源を添加してもよい。このようなヘキソース源として使用できる炭素源として、スクロース、ラクトース、デキストリン、シクロデキストリン（α－シクロデキストリン、β－シクロデキストリン、γ－シクロデキストリン）、アミロース、アミロペクチン、デンプン等が挙げられる。ヘキソースとして、上述したものが挙げられる。一態様において、ヘキソース源として、グルコース源を用いることが好ましい。グルコース源として、グルコース、グルコース単位を含む炭素源（例えば、スクロース、ラクトース、デキストリン、シクロデキストリン、アミロース、アミロペクチン、デンプン）が挙げられる。グルコース源は１種又は２種以上を用いることができる。一態様において、ヘキソース源はヘキソースを含むことが好ましく、グルコースを含むことがより好ましい。
培地中のヘキソース源の濃度は、０．１～２０重量％が好ましく、０．２～１０重量％がより好ましい。一態様において、ヘキソース源の濃度は、培養開始時に上記濃度であればよい。ヘキソース源は、培地に一度に添加してもよく、培養中に複数回に分けて添加してもよい。
培地には、必要に応じて、窒素源（例えば、各種ペプトン（ポテトペプトン等）、各種エキス、硫酸アンモニウム、尿素等）、無機質（リン酸水素二カリウム、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸亜鉛、鉄、マンガン、モリブデン、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム等）等を添加してもよい。ヘキソース源以外に炭素源を培地に添加してもよい。
本発明の第一の態様の製造方法において、培地として、例えば、ポテトデキストロース培地（ＰＤ培地）等を使用することができる。
形質転換体の培地ヘの添加方法は特に限定されず、形質転換体の種類に応じて適宜選択することができる。例えば、酵母などの微生物の場合は、培地に直接少量の菌体を接種することで増殖させることができる。
形質転換体の培養時間は、例えば、０．５～１２０時間とすることができる。
一態様において、酵母形質転換体の場合、培養温度は、例えば、１０～４０℃とすることができ、２０～３０℃が好ましい。酵母形質転換体の培養時間は、例えば、１２～４８時間とすることができ、２４～３６時間が好ましい。
プレニルフラボノイドの存在下での培養時間は、上記の範囲であることが好ましい。また、プレニルフラボノイドの存在下での培養の前に形質転換体をヘキソース源の存在下で培養する場合の培養時間も、上記と同じとすることができる。
培養は、液体培地中で好気培養することが好ましい。好気培養を行う方法は特に限定されず、形質転換体を接種した液体培地を、例えば、振盪培養又は攪拌培養すればよい。また、所望により滅菌された空気又は酸素でバブリングを行ってもよい。また、培養形式は、回分培養、流加培養、連続培養のいずれでもよいが、回分培養が好ましい。本発明の製造方法においては、静置培養を行ってもよい。
本発明の第一の態様の製造方法では、形質転換体を担体に固定化した固定化菌体を使用することもできる。固定化菌体の調製方法は特に限定されず、公知の方法を採用することができる。一例として、形質転換体を、アルギン酸ナトリウム水溶液に添加して攪拌して懸濁したものを、塩化カルシウム溶液に滴下することで、形質転換体が固定化されたビーズ状のゲルを得ることができる。このビーズ状のゲルを、形質転換体を培養する際に使用される培地及び培養条件で培養することによって、固定化菌体を得ることができる。本発明の一態様においては、形質転換体の固定化菌体を、プレニルフラボノイドの存在下で培養してもよい。また、形質転換体の固定化菌体を、プレニルフラボノイド及びヘキソース源の存在下で培養してもよい。
上記形質転換体を、プレニルフラボノイドの存在下で培養することにより、プレニルフラボノイド配糖体が生成し、培地中に蓄積する。
形質転換体と、プレニルフラボノイド配糖体を含む培養上清とを分離する方法は特に限定されず、例えば、濾過、遠心分離等により行うことができる。培養上清からプレニルフラボノイド配糖体を分離又は精製する方法は特に限定されず、例えば、イオン交換クロマトグラフィー等の方法を使用することができる。
本発明のプレニルフラボノイド配糖体の製造方法の別の態様は、上述した本発明のタンパク質により、プレニルフラボノイドと、ＵＤＰ－ヘキソースとから、プレニルフラボノイドを生成させる工程を含む、プレニルフラボノイド配糖体の製造方法である。
上記の本発明のタンパク質により、プレニルフラボノイドと、ＵＤＰ－ヘキソースとから、プレニルフラボノイドを生成させる工程（配糖化酵素反応工程ともいう）を含むプレニルフラボノイド配糖体の製造方法を、本発明の第二の態様の製造方法ともいう。
本発明の第二の態様の製造方法は、上記の（Ａ１）～（Ａ３）及び（Ｂ１）～（Ｂ３）からなる群より選択される少なくとも１種のタンパク質により、プレニルフラボノイドと、ＵＤＰ－ヘキソースとから、プレニルフラボノイド配糖体を生成させる工程を含む。
配糖化酵素反応工程は、上記の（Ａ１）～（Ａ３）からなる群より選択される少なくとも１種のタンパク質（好ましくは、（Ａ１）のタンパク質）により、プレニルフラボノイドと、ＵＤＰ－ヘキソースとから、プレニルフラボノイドを生成させる工程であってよい。
別の態様において、配糖化酵素反応工程は、上記の（Ｂ１）～（Ｂ３）からなる群より選択される少なくとも１種のタンパク質（好ましくは、（Ｂ１）のタンパク質）により、プレニルフラボノイドと、ＵＤＰ－ヘキソースとから、プレニルフラボノイドを生成させる工程であってよい。
ＵＤＰ－ヘキソースにおけるヘキソースとして、上述したものが挙げられる。ＵＤＰ－ヘキソースは、好ましくはＵＤＰ－グルコースである。ヘキソースは、好ましくはグルコースである。プレニルフラボノイド及びその好ましい態様は、上記の本発明の第一の態様の製造方法と同じである。
上記の（Ａ１）～（Ａ３）及び（Ｂ１）～（Ｂ３）のタンパク質は、その由来や製造方法に制限されない。上記（Ａ１）～（Ａ３）及び（Ｂ１）～（Ｂ３）のタンパク質は、プレニルフラボノイドにヘキソースを転移する活性を有するものであれば、その精製度も特に制限されない。本発明の効果を奏することになる限り、上記の培養物や、タンパク質の粗精製物を使用することもできる。
本発明の第二の態様の製造方法においては、本発明のタンパク質を触媒として、プレニルフラボノイド及びＵＤＰ－ヘキソースを反応させて、プレニルフラボノイド配糖体を生成させることができる。
上記の反応は、好ましくは液（反応液）中、例えば水、緩衝液等の水性媒体中で行うことが好ましい。反応液のｐＨは、例えば、６～８とすることができ、好ましくは７～８とすることができ、より好ましくは７．２～７．７である。反応温度は、２０～５０℃とすることができ、好ましくは２５℃～４０℃とすることができ、より好ましくは２８～３７℃である。反応時間は適宜設定すればよい。ｐＨは、２５℃におけるｐＨである。ｐＨは市販のｐＨメーターで測定することができる。
反応液中のプレニルフラボノイドの初期濃度は、例えば、０．１～５０ｍＭであってよい。プレニルフラボノイドは、例えば、エタノール、ＤＭＦ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等の溶媒に溶解させて反応液に添加することができる。
反応液中のＵＤＰ－ヘキソースの初期濃度は、プレニルフラボノイドに対して、モル比で５～２０倍であることが好ましく、５～１５倍であることがより好ましい。
プレニルフラボノイド配糖体は、反応液から公知の方法により分離又は精製することができる。具体的には、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、透析法、限外ろ過法などを単独で、または適宜組み合わせて用いることができる。
本発明の第一の態様の製造方法及び第二の態様の製造方法を、以下では本発明の製造方法という。
本発明の製造方法では、上記の形質転換体培養工程又は配糖化酵素反応工程により、プレニルフラボノイドにヘキソース（ヘキソース残基）が結合しているプレニルフラボノイド配糖体を生成させることができる。上記形質転換体培養工程又は配糖化酵素反応工程により生成するプレニルフラボノイド配糖体においては、通常、プレニルフラボノイドとヘキソース残基がＯ－グリコシド結合している。ヘキソース残基の数は１つでもよく、２つ以上でもよいが、１つであることが好ましい。ヘキソースは上記の通りであり、好ましくはグルコースである。プレニルフラボノイドがイソキサントフモールの場合は、得られる配糖体は、通常、イソキサントフモールの７位にヘキソースが結合しているイソキサントフモール配糖体である。プレニルフラボノイドがキサントフモールの場合は、得られる配糖体は、通常、キサントフモールの４´位及び／又は４位（好ましくは４´位）にヘキソースが結合しているキサントフモール配糖体である。プレニルフラボノイドが８－プレニルナリンゲニン、６－プレニルナリンゲニン等のプレニルナリンゲニンの場合は、得られる配糖体は、通常、プレニルナリンゲニンの７位にヘキソースが結合しているプレニルナリンゲニン配糖体である。
所望の配糖体が得られたことは、公知の方法（例えば、質量分析、核磁気共鳴分光法（ＮＭＲ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等）で確認することができる。
本発明の製造方法で得られるプレニルフラボノイド配糖体は、１種であってもよく、アグリコン及び／又はヘキソースの種類が異なる２種以上の配糖体の混合物であってもよい。
上記の製造方法により得られるプレニルフラボノイド配糖体は、アグリコンであるプレニルフラボノイドと比較して、例えば、水溶性が向上している。このように得られたプレニルフラボノイド配糖体は、飲食品、医薬品、医薬部外品、化粧料、飼料等の原料等として有用である。
本発明の製造方法で使用されるプレニルフラボノイドは、その製造方法等に何ら制限されない。イソキサントフモールは、例えば、ホップ抽出物から加熱等のプロセスを経て調製することができる。ホップ抽出物を加熱することにより、該抽出物中にイソキサントフモールを生成させることができる。イソキサントフモールを調製するためのホップ抽出物の精製は、公知の方法で実施される。精製方法として、例えば、ＨＰＬＣや吸着カラム等の使用や、溶解度の変化を利用した析出などの方法が挙げられる。また、イソキサントフモールは、キサントフモールを加熱することによって製造することもできる。
キサントフモール及び８－プレニルナリンゲニンは、ホップ等に含まれるプレニルフラボノイドである。キサントフモール及び８－プレニルナリンゲニンは、例えば、ホップ抽出物から公知の方法で精製して調製することができる。プレニルフラボノイドは、市販品を使用することもできる。本発明においては、本発明の効果を奏することになる限り、精製されたプレニルフラボノイドを使用してもよく、プレニルフラボノイドを豊富に含む植物由来原料等を使用してもよい。
以下、本発明を実施例に基づいてより具体的に説明する。尚、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
特に断りがない限り、分子生物学的手法はＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　２００１）に記載の方法に従った。
＜実施例１＞
植物酵素によるイソキサントフモール（以下、ＩＸとも記載する）のグルコシル化反応によるイソキサントフモール配糖体の生産
（ＲＮＡ－ＳＥＱによる遺伝子探索）
ＩＸをグルコシル化するグルコシル化酵素の遺伝子を取得するために、下記の表１にある８つの培養条件（サンプルＳ１～Ｓ８）でＲｈｉｚｏｐｕｓ菌のＲｈｉｚｏｐｕｓ　ｏｒｙｚａｅ（Ｒ．ｏｒｙｚａｅ）の培養を行った。菌体からＲＮｅａｓｙキット（キアゲン社）を使って、製造業者が推奨する方法に従ってトータルＲＮＡを抽出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
表１中のＰＤ培養液、ＰＰ及びＧｌｃは、以下の通りである。
ＰＤ培養液：２．４％　Ｐｏｔａｔｏ　Ｄｅｘｔｒｏｓｅ　Ｂｒｏｔｈ（ＢＤ）
ＰＰ：ポテトペプトンＣＰ（極東製薬工業（株））
Ｇｌｃ：グルコース
ＩＸの添加が「＋」のサンプルには、ＩＸを０．１ｇ／Ｌになるように添加した。ＩＸの添加が「－」のサンプルには、ＩＸを添加しなかった（培地中のＩＸ濃度は０重量％）。
表１中、％は重量％である。例えば、ＰＰ（０．２％）Ｇｌｃ（０．２％）は、ポテトペプトンＣＰを０．２重量％、グルコースを０．２重量％含む培地を示す。
抽出された８種のトータルＲＮＡをオリゴｄＴプライマーでｍＲＮＡを逆転写し、リボゾーマルＲＮＡを除くＲｉｂｏ－Ｚｅｒｏ　キット（イルミナ社）を用いて製造業者が推奨する方法でｃＤＮＡライブラリーを構築した。イルミナ社製のＮｏｖａＳＥＱでシークエンスを行った。得られたショートリードを用いて、下記の手順でアセンブルを行った。
（デノボアセンブル）
１：ＦＡＳＴＱにあるショートリードのアダプター配列を除去する（ツール：ｐｌａｔａｎｕｓ＿ｔｒｉｍ）。
２：Ｔｒｉｎｉｔｙに全８ステージのＦＡＳＴＱをインプットしてコンティグを作成する（出力：Ｔｒｉｎｉｔｙ．ｆａｓｔａ）。
（マッピング）
３：Ｔｒｉｎｉｔｙ出力結果のコンティグに対して、マッピング用のインデックスを作成する。
４：Ｔｒｉｎｉｔｙ出力結果のコンティグをリファレンスにして、各ステージのショートリードをマッピングする（ツール：ｈｉｓａｔ２、入力ファイル：ｆａｓｔｑ、出力ファイル：ｓａｍ）。
（リードカウント）
５：マッピング結果をソートする（入力ファイル：ｓａｍ、出力ファイル：ｂａｍ）。
６：ソート結果をテキストデータに逆変換する（入力ファイル：ｂａｍ、出力ファイル：ｓａｍ）。
７：コンティグ単位でショートリード数をカウントする。
（ＴＰＭ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ　ｐｅｒ　ｍｉｌｌｉｏｎ）発現量計算）
８：転写産物の長さが１，０００ｂｐあたりリード数を計算する。Ｙｔを転写産物ｔにマッピングされたリードカウントとし、Ｌｔを転写産物ｔの長さとすると、転写産物ｔの１，０００ｂｐあたりのリード数（Ｔｔ）は次の式１のように計算できる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000006
９：転写産物長による補正後の総リードカウントが１００万となるように補正する。このとき、転写産物ｔのＴＰＭｔは次の式２のように計算できる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000007
得られたリードのインデックス配列をトリミングした後、Ｔｒｉｎｉｔｙ（Ｇｒａｂｈｅｒｒ，　Ｍ．Ｇ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｎａｔ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　２９，　６４４－６５２　（２０１１）．）を用いてデフォルトのセッティングでデノボアセンブルを行い、ＲＮＡコンティグを構築した。結果的に、６６，５１０コンティグが形成された。
次にこれらのコンティグ配列を基に、ＵＤＰ－ｇｌｕｃｏｒｏｎｏｓｙｌ　ａｎｄ　ＵＤＰ－ｇｌｕｃｏｓｙｌ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＵＤＰＧＴ／ＵＧＴ：アクセッションＰＦ００２０１）と相同性のある遺伝子検索を行い、２種類の新規グルコシル化酵素様遺伝子（ＲｏＵＧＴ１５１７６＿ｉ１とＲｏＵＧＴ１５１７６＿ｉ１４）の配列を得た。このＲｏＵＧＴ１５１７６＿ｉ１のＤＮＡ配列とアミノ酸配列を、それぞれ配列番号５及び６に示す。ＲｏＵＧＴ１５１７６＿ｉ１４のＤＮＡ配列とアミノ酸配列を、それぞれ配列番号７及び８に示す。これらはＤＮＡレベルで８３％、アミノ酸レベルで７９％と高い相同性を示した。また、ＲｏＵＧＴ１５１７６＿ｉ１とＲｏＵＧＴ１５１７６＿ｉ１４はそれぞれアミノ酸レベルで、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｊａｐｏｎｉｃｕｓ（Ｒ．ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）のＵＧＴ５９Ａ１に対して９１％および８５％の配列同一性を示した。また、Ｒ．ｊａｐｏｎｉｃｕｓのＵＧＴ５９Ａ１とＤＮＡレベルで９７％の配列同一性を示すＲｏＵＧＴ１５１７６も得られた。ＲｏＵＧＴ１５１７６のＤＮＡ配列を配列番号３に、アミノ酸配列を配列番号４に示す。
図１に、ＵＧＴ遺伝子の完全長ＤＮＡ配列を基に近隣結合法（ＮＪ法）で作成したリゾパスＵＧＴの分子系統樹を示す（ブートストラップ値：１００）。ＲｏＵＧＴ１５１７６（配列番号３）は配列相同性と分子系統関係からＲ．ｏｒｙｚａｅ菌におけるＵＧＴ５９Ａ１に相当する遺伝子と思われた（図１）。
ＲｏＵＧＴ１５１７６＿ｉ１とＲｏＵＧＴ１５１７６＿ｉ１４の両ＵＧＴタンパク質はＨＭＭ－ＴＭＳｅｒｖｅｒ　ｖ．　２．０を使った膜貫通ドメイン解析（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴＭＨＭＭ／）によりそれぞれ５１３－５３３番目と５１２－５３１番目に膜貫通ドメインが推定され、膜タンパク質であることが示唆された。
更に、ＳｉｇｎａｌＰ５．０（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／）を使ってシグナル配列を予測した（ＳｉｇｎａｌＰ　５．０　ｉｍｐｒｏｖｅｓ　ｓｉｇｎａｌ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｓ　ｕｓｉｎｇ　ｄｅｅｐ　ｎｅｕｒａｌ　ｎｅｔｗｏｒｋｓ．　Ａｌｍａｇｒｏ　Ａｒｍｅｎｔｅｒｏｓ　ＪＪ，　　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　２０１９　Ａｐｒ；３７（４）：４２０－４２３．　ｄｏｉ：　１０．１０３８／ｓ４１５８７－０１９－００３６－ｚ．　Ｅｐｕｂ　２０１９　Ｆｅｂ　１８．ＰＭＩＤ：３０７７８２３３）。その結果、それぞれＮ末から２０アミノ酸と２３アミノ酸に分泌シグナルが高く予想された。したがって、両ＵＤＰＧＴ遺伝子は膜結合型のグルコシル化酵素であることが示唆された。
以上のように、ＲｏＵＧＴ１５１７６＿ｉ１、ＲｏＵＧＴ１５１７６＿ｉ１４及びＲｏＵＧＴ１５１７６の３種の機能未知の新規ＵＧＴ遺伝子が取得できた。
（酵母における異所発現による活性評価）
次にＲｏＵＧＴ１５１７６＿ｉ１及びＲｏＵＧＴ１５１７６＿ｉ１４の酵素活性を評価するために、両遺伝子をそれぞれ配列番号９と１０、および配列番号１０と１１で示す特異的なプライマーセットで、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｏｒｙｚａｅ　ｓｔｒａｉｎ１４４１のｃＤＮＡからＲＴ－ＰＣＲでクローニングを行った。ＲｏＵＧＴ１５１７６の酵素活性を評価するため、配列番号１２及び配列番号１３のプライマーセットで、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｏｒｙｚａｅ　ｓｔｒａｉｎ１４３５のｃＤＮＡからＲＴ－ＰＣＲでクローニングを行った。
配列番号９：ＲｏＵＧＴ１５１７６＿ｉ１－ｓｔｒ－ｐＹＥ－Ｆｗ１
AAACACACATAAACAGAATTCATGAAGCTCTCGACCCTATCA
配列番号１０：ＲｏＵＧＴ１５１７６－ｓｔｒ－ｐＹＥ－Ｒｖ
GGATCCCCGGGTACCTCAAGCAGACTTCACCTTCTTTG
配列番号１１：ＲｏＵＧＴ１５１７６＿ｉ１４－ｓｔｒ－ｐＹＥ－Ｆｗ３
AAACACACATAAACAGAATTCATGAAGCTTTCAACACTATCCTTTG
配列番号１２：ＲｏＵＧＴ１５１７６－１４３５－Ｆｗ
AAACACACATAAACAGAATTCATGAAGCTTTCGACCCTATCCT
配列番号１３：ＲｏＵＧＴ１５１７６－１４３５－Ｒｖ
GGATCCCCGGGTACCTCAAGCAGACTTTACCTTCTTTG
ＰＣＲ反応には、表１のサンプルＳ１のｃＤＮＡ　１μＬを鋳型に上記の各遺伝子特異的なプライマーを用いてＫＯＤ　Ｐｌｕｓ　ＮＥＯ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いた。ＰＣＲ反応は、９４℃で３分間反応させた後、９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分間の反応を計３５サイクルの増幅を行った。ＰＣＲ産物を０．８％アガロースゲルにより電気泳動し、エチジウムブロマイド染色した結果、ｃＤＮＡ長から推定される約１．６ｋｂのサイズに増幅バンドが得られた。
このＰＣＲ産物を、プライマーに付加したＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩの制限酵素部位を利用して、酵母発現ベクターｐＹＥ２２ｍのＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩサイトへＧｅｎｅＡｒｔ　Ｓｅａｍｌｅｓｓ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　Ａｓｓｅｍｂｌｙ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）により組み込んだ。本ベクターＥｃｏＲＩサイト上流にあるＧＡＰＤＨプロモーターによって挿入されたＵＧＴ遺伝子は構成的に発現するようにデザインされている。得られた発現ベクターはＤＮＡ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ　ｍｏｄｅｌ　３１００（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用い、合成オリゴヌクレオチドプライマーによるプライマーウォーキング法によって挿入断片が目的のＵＧＴ遺伝子であることをシークエンスにより確認した。ベクターに挿入したＲｏＵＧＴ１５１７６＿ｉ１のｃＤＮＡの塩基配列を配列番号１に、当該ＤＮＡにコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２に示す。ＲｏＵＧＴ１５１７６＿ｉ１については、ここで得られた配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡにコードされるタンパク質を酵母で発現させて活性を調べた。ベクターに挿入したＲｏＵＧＴ１５１７６のｃＤＮＡの塩基配列を配列番号３に、当該ＤＮＡにコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号４示す。ベクターに挿入したＲｏＵＧＴ１５１７６＿ｉ１４のｃＤＮＡの塩基配列を配列番号１４に示す。
この酵母発現ベクターを定法により、実験室酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＩＮＶＳｃ株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に形質転換を行い、Ｓｃ－Ｔｒｐ（１Ｌあたり、Ｙｅａｓｔ　ｎｉｔｒｏｇｅｎ　ｂａｓｅ　ｗ／ｏ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ（ＤＩＦＣＯ）６．７ｇ、グルコース２０ｇ、およびアミノ酸パウダー（アデニン硫酸塩１．２５ｇ、アルギニン０．６ｇ、アスパラギン酸３ｇ、グルタミン酸３ｇ、ヒスチジン０．６ｇ、ロイシン１．８ｇ、リジン０．９ｇ、メチオニン０．６ｇ、フェニルアラニン１．５ｇ、セリン１１．２５ｇ、チロシン０．９ｇ、バリン４．５ｇ、スレオニン６ｇ、ウラシル０．６ｇを混合したもの）１．３ｇを含む）２％寒天培地で生育できることを指標に、形質転換体を選抜した。ネガティブコントロールには空ベクターのｐＹＥ２２ｍを形質転換した。これらの形質転換酵母についてＳｃ－Ｔｒｐ１０ｍＬで終夜前培養（３０℃、１１０ｒｐｍ）を行った。その前培養液の１／１０量（１ｍＬ）を、新たなＳｃ－Ｔｒｐ培地（９ｍＬ）に植え継ぎ、その培地にバイオコンバージョンアッセイの基質であるイソキサントフモール（ＩＸ）又はキサントフモール（ＸＮ）を終濃度０．１μｇ／ｍＬで加えて同条件で本培養（３０℃、１１０ｒｐｍ、終夜）を行った。コントロールに空ベクターのｐＹＥ２２ｍを発現させた酵母、前述のＲｊＵＧＴ５９Ａ１（アクセッション番号：ＫＸ６１０７６１）（配列番号１５）をｐＹＥ２２ｍにクローニングしたベクターを発現させた酵母を用いた。
（生成物のＨＰＬＣ分析）
酵母の３日間の振とう培養後（１１０ｒｐｍ）、培養液を遠心分離（５０００ｒｐｍ、１０分、４℃）により集菌し、上清の培地を回収し、その培養上清とアセトニトリルを１：１で混和し、ＧＬクロマトディスク　４Ｐ　０．４５μｍ（ジーエルサイエンス（株）製）でろ過し、培養上清のＨＰＬＣ分析サンプルとした。
ＨＰＬＣ分析条件は下記の通りである。
カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ　５Ｃ１８－ＡＲ－ＩＩ　４．６ｍｍＩ．Ｄ．×２５０ｍｍ（ナカライテスク（株）製）
Ａ液：０．１％ＴＦＡ　２：８（ｖ／ｖ）ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ
Ｂ液：０．１％ＴＦＡ　８：２（ｖ／ｖ）ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ
流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ
グラジエントプログラム（Ｂ液濃度（％）はｖｏｌ％）：Ｂ液０％→８５％（１５ｍｉｎ）、Ｂ液８５％（１０ｍｉｎ）、Ｂ液８５％→０％（０．５ｍｉｎ）、Ｂ液０％（１５．５ｍｉｎ）
検出：ＩＸ：２８０ｎｍ、ＸＮ：３２０ｎｍ
サンプル注入量：１０μＬ
（活性測定）
図２、図３、図４及び図５は、イソキサントフモールを添加して培養を行った形質転換酵母の培養上清のＨＰＬＣ分析結果（２８０ｎｍの吸収スペクトルのクロマトグラム）である。図６、図７、図８及び図９は、キサントフモールを添加して培養を行った形質転換酵母の培養上清のＨＰＬＣ分析結果（３２０ｎｍの吸収スペクトルのクロマトグラム）である。
図２及び図６は、空ベクターのｐＹＥ２２ｍを発現させた形質転換酵母（コントロール）の培養上清である。図３及び図７は、ＲｏＵＧＴ１５１７６＿ｉ１４を発現させた形質転換酵母の培養上清である。図４及び図８は、ＲｏＵＧＴ１５１７６＿ｉ１を発現させた形質転換酵母の培養上清である。図５及び図９は、ＲｊＵＧＴ５９Ａ１を発現させた形質転換酵母の培養上清である。図２、図３、図４及び図５中、ＩＸはイソキサントフモールを、ＩＸＧは、イソキサントフモールの７位にグルコースが結合したイソキサントフモール配糖体（ＩＸ７位グルコシド）を指す。図６、図７、図８及び図９中、ＸＮはキサントフモールを、ＸＮＧは、キサントフモールの４´位にグルコースが結合したキサントフモール配糖体（ＸＮの４´位グルコシド）を指す。
培養３日後の培養液のＨＰＬＣ分析の結果、空ベクターのｐＹＥ２２ｍで形質転換した酵母（図２及び図５）と、ＲｏＵＧＴ１５１７６＿ｉ１４を発現させた酵母（図３及び図６）については生成物が確認できなかったのに対して、ＲｏＵＧＴ１５１７６＿ｉ１を発現させた酵母についてはＩＸおよびＸＮに対して生成物が観察され、保持時間より、ＩＸ７位グルコシド（図４）又はＸＮの４´位グルコシド（図８）であることが確認された。以上の結果から、本酵素は、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ菌が触媒するＩＸおよびＸＮに対するグルコシル化反応（非特許文献１）に対応するものであることが示された。
またＲｊＵＧＴ５９Ａ１に対してもＩＸ及びＸＮに対する反応性を確認したところ、両基質に対して活性が確認された（図５及び図９）。ＲｏＵＧＴ１５１７６を発現させた酵母についても、ＩＸ及びＸＮに対して生成物が観察され、保持時間より、生成物はそれぞれＩＸ７位グルコシド及びＸＮの４´位グルコシドであることが確認された。
基質（ＩＸ又はＸＮ）が完全消費されていないことを前提として、下記の方法でＸＮに対するグルコシル化活性に対するＩＸに対するグルコシル化活性の比を求めた。
ＲｏＵＧＴ１５１７６、ＲｏＵＧＴ１５１７６＿ｉ１及びＲｊＵＧＴ５９Ａ１について、ＨＰＬＣクロマトグラムのＸＮＧのピーク面積（検出：３２０ｎｍ）に対するＩＸＧのピーク面積（検出：２８０ｎｍ）の比（ＩＸＧのピーク面積／ＸＮＧのピーク面積）を求めた。この面積比を、ＸＮに対するグルコシル化活性に対するＩＸに対するグルコシル化活性の比（相対活性（ＩＸＧ／ＸＮＧ））とした。この相対活性（ＩＸＧ／ＸＮＧ）が大きいと、ＩＸに対する親和性が高いことを示す。この相対活性（ＩＸＧ／ＸＮＧ）を表２に示す。標準化相対活性（ｖｓ　ｉ１）は、ＲｏＵＧＴ１５１７６＿ｉ１の相対活性（ＩＸＧ／ＸＮＧ）に対する、相対活性（ＩＸＧ／ＸＮＧ）の比である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
ＲｏＵＧＴ１５１７６＿ｉ１及びＲｏＵＧＴ１５１７６は、ＲｊＵＧＴ５９Ａ１よりもＩＸに対して親和性が高く、特にＲｏＵＧＴ１５１７６＿ｉ１はＩＸに対して親和性が高いＵＧＴ酵素であることが示された。
（遺伝子発現解析）
表１に記載のＲＮＡ－ＳＥＱから抽出したＲｏＵＧＴ１５１７６＿ｉ１の発現プロファイルを調べた。今回の８条件（Ｓ１～Ｓ８）のいずれの条件でも遺伝子発現が確認できた。ＰＤ培地とＰＰ培地（０．５％）において、ＩＸに応答して遺伝子発現が顕著に向上することが確認された。
ＩＸ処理を施したＲ．ｏｒｙｚａｅの発現遺伝子解析（ＲＮＡ－ＳＥＱ）より見出したＵＧＴ遺伝子の中から、プレニルフラボノイドであるＩＸに高い特異性を示すＵＧＴ酵素としてＲｏＵＧＴ１５１７６＿ｉ１を同定することができた。この酵素の特性評価および発現・機能改変を通じてさらに効率的に難水溶性の機能性物質を配糖化し、清澄性や安定性を高めることができると期待される。
なお、本明細書中に記載された学術文献及び特許文献の全ては、参照として本明細書に組み入れられる。
本発明は、飲食品分野等において有用である。

Claims (15)

  1. 下記（ａ１）～（ａ５）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
    （ａ１）配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド
    （ａ２）配列番号１で表される塩基配列に対して９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、プレニルフラボノイドにヘキソースを転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
    （ａ３）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド
    （ａ４）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１～９個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、プレニルフラボノイドにヘキソースを転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
    （ａ５）配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、プレニルフラボノイドにヘキソースを転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
  2. 下記（ｂ１）～（ｂ５）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
    （ｂ１）配列番号３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド
    （ｂ２）配列番号３で表される塩基配列に対して９８％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、プレニルフラボノイドにヘキソースを転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
    （ｂ３）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド
    （ｂ４）配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１～５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、プレニルフラボノイドにヘキソースを転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
    （ｂ５）配列番号４で表されるアミノ酸配列に対して９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、プレニルフラボノイドにヘキソースを転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
  3. ヘキソースがグルコースである請求項１又は２に記載のポリヌクレオチド。
  4. プレニルフラボノイドが、キサントフモール、イソキサントフモール及びプレニルナリンゲニンからなる群より選択される少なくとも１種である請求項１～３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  5. 請求項１～４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
  6. 請求項１～４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド又は請求項５に記載のベクターが導入された形質転換体。
  7. 下記（Ａ１）～（Ａ３）のいずれかに記載のタンパク質。
    （Ａ１）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
    （Ａ２）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１～９個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、プレニルフラボノイドにヘキソースを転移する活性を有するタンパク質
    （Ａ３）配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、プレニルフラボノイドにヘキソースを転移する活性を有するタンパク質
  8. 下記（Ｂ１）～（Ｂ３）のいずれかに記載のタンパク質。
    （Ｂ１）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
    （Ｂ２）配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１～５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、プレニルフラボノイドにヘキソースを転移する活性を有するタンパク質
    （Ｂ３）配列番号４で表されるアミノ酸配列に対して９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、プレニルフラボノイドにヘキソースを転移する活性を有するタンパク質
  9. ヘキソースがグルコースである請求項７又は８に記載のタンパク質。
  10. プレニルフラボノイドが、キサントフモール、イソキサントフモール及びプレニルナリンゲニンからなる群より選択される少なくとも１種である請求項７～９のいずれか一項に記載のタンパク質。
  11. プレニルフラボノイド配糖体の製造方法であって、
    請求項６に記載の形質転換体を、プレニルフラボノイドの存在下で培養する工程を含む、
    プレニルフラボノイド配糖体の製造方法。
  12. 前記形質転換体を、プレニルフラボノイド及びヘキソース源の存在下で培養する、請求項１１に記載の製造方法。
  13. プレニルフラボノイド配糖体の製造方法であって、下記（Ａ１）～（Ａ３）及び（Ｂ１）～（Ｂ３）からなる群より選択される少なくとも１種のタンパク質により、プレニルフラボノイドと、ＵＤＰ－ヘキソースとから、プレニルフラボノイド配糖体を生成させる工程を含む、プレニルフラボノイド配糖体の製造方法。
    （Ａ１）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
    （Ａ２）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１～９個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、プレニルフラボノイドにヘキソースを転移する活性を有するタンパク質
    （Ａ３）配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、プレニルフラボノイドにヘキソースを転移する活性を有するタンパク質
    （Ｂ１）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
    （Ｂ２）配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１～５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、プレニルフラボノイドにヘキソースを転移する活性を有するタンパク質
    （Ｂ３）配列番号４で表されるアミノ酸配列に対して９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、プレニルフラボノイドにヘキソースを転移する活性を有するタンパク質
  14. ヘキソースがグルコースである請求項１２又は１３に記載の製造方法。
  15. プレニルフラボノイドが、キサントフモール、イソキサントフモール及びプレニルナリンゲニンからなる群より選択される少なくとも１種である請求項１１～１４のいずれか一項に記載の製造方法。

     
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