JP6832670B2 - セサミノール2糖又は3糖配糖体の製造方法、および新規セサミノール配糖体 - Google Patents
セサミノール2糖又は3糖配糖体の製造方法、および新規セサミノール配糖体 Download PDFInfo
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Description
(P1−1)配列番号1又は2のアミノ酸配列からなるタンパク質
(P1−2)配列番号1又は2のアミノ酸配列に1個又は数個のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、下記一般式(1)で示されるセサミノール1糖又は2糖配糖体のヘキソース残基へのβ−1→2結合の糖転移活性を有するタンパク質
(P1−3)配列番号1又は2のアミノ酸配列に対して、90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、下記一般式(1)で示されるセサミノール1糖又は2糖配糖体のヘキソース残基へのβ−1→2結合の糖転移活性を有するタンパク質
(P1−4)配列番号3又は4のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、下記一般式(1)で示されるセサミノール1糖又は2糖配糖体のヘキソース残基へのβ−1→2結合の糖転移活性を有するタンパク質
なお、本明細書中、β−1→2結合、及び、β−1→6結合は、O−グリコシド結合である。
(P2−11)配列番号5のアミノ酸配列からなるタンパク質
(P2−12)配列番号5のアミノ酸配列に1個又は数個のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、セサミノール2’−O−β−D−グルコシル(1→12)−β−D−グルコシドの1つ目のグルコース残基へのβ−1→6結合のグルコース転移活性を有するタンパク質
(P2−13)配列番号5のアミノ酸配列に対して、90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、SG2(2)の1つ目のグルコース残基へのβ−1→6結合のグルコース転移活性を有するタンパク質
(P2−14)配列番号6のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、SG2(2)の1つ目のグルコース残基へのβ−1→6結合のグルコース転移活性を有するタンパク質
(P2−15)配列番号7のアミノ酸配列からなるタンパク質
(P2−16)配列番号7のアミノ酸配列に1個又は数個のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、SG2(2)の1つ目のグルコース残基へのβ−1→6結合のグルコース転移活性を有するタンパク質
(P2−17)配列番号7のアミノ酸配列に対して、90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、SG2(2)の1つ目のグルコース残基へのβ−1→6結合のグルコース転移活性を有するタンパク質
(P2−18)配列番号8のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、SG2(2)の1つ目のグルコース残基へのβ−1→6結合のグルコース転移活性を有するタンパク質
本発明のポリヌクレオチドは、配列番号4のヌクレオチド配列を含むことを特徴とする。
本発明の発現ベクターは、上記本発明のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする。
(N1−1)配列番号3又は4のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
(N1−2)配列番号3又は4のヌクレオチド配列に1個又は数個のヌクレオチドが欠失、置換及び/又は付加されたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドであり、かつ、上記一般式(1)で示されるセサミノール1糖又は2糖配糖体の1つ目のヘキソース残基へのβ−1→2結合の糖転移活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(N1−3)配列番号3又は4のヌクレオチド配列に対して、90%以上の同一性を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドであり、かつ、上記一般式(1)で示されるセサミノール1糖又は2糖配糖体の1つ目のヘキソース残基へのβ−1→2結合の糖転移活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(N1−4)配列番号3又は4のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドからなり、かつ、上記一般式(1)で示されるセサミノール1糖又は2糖配糖体の1つ目のヘキソース残基へのβ−1→2結合の糖転移活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(N2−1)配列番号6のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
(N2−2)配列番号6のヌクレオチド配列に1個又は数個のヌクレオチドが欠失、置換及び/又は付加されたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドであり、かつ、上記一般式(1)で示されるセサミノール1糖又は2糖配糖体の1つ目のヘキソース残基へのβ−1→6結合の糖転移活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(N2−3)配列番号6のヌクレオチド配列に対して、90%以上の同一性を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドであり、かつ、上記一般式(1)で示されるセサミノール1糖又は2糖配糖体の1つ目のヘキソース残基へのβ−1→6結合の糖転移活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(N2−4)配列番号6のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドからなり、かつ、上記一般式(1)で示されるセサミノール1糖又は2糖配糖体の1つ目のヘキソース残基へのβ−1→6結合の糖転移活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
また、本発明によれば、新規なセサミノール3糖配糖体を提供することができる。
nは、ヘキソース残基(S1)の数であり、1又は2である。
工程(i)の基質である一般式(1)で示されるセサミノール1糖又は2糖配糖体は、1種又は2種以上用いることができる。
セサミノール配糖体(1)として、SG1、SG2(2)及びSG2(6)からなる群より選択される少なくとも1種を用いることが好ましい。
また、このようなセサミノール1糖又は2糖配糖体としては、市販品を利用することもできる。このような市販品としては、例えば、製品番号:NS185201、製造元:長良サイエンス株式会社(SG2(2)の市販品)、製品番号:NS185301、製造元:長良サイエンス株式会社(SG2(6)の市販品)等があげられる。
UDP−ペントースとしては、UDP−アラビノース、UDP−キシロース等があげられる。
UDP−ヘキソースとしては、UDP−グルコース、UDP−アロース、UDP−アルトロース、UDP−マンノース、UDP−グロース、UDP−イドース、UDP−ガラクトース、UDP−タロース等があげられる。
UDP−ヘプトースとしてはUDP−セドヘプツロース等があげられる。
これらの中では、UDP−ヘキソースであることが好ましく、UDP−グルコースであることがさらに好ましい。
UDP−糖が、UDP−グルコースであると、本発明におけるタンパク質(P1)との基質特異性が高く、タンパク質(P1)によるセサミノール2糖又は3糖配糖体の合成速度が速くなり、効率的にセサミノール2糖又は3糖配糖体を製造することができる。
具体的には、本発明におけるタンパク質(P1)は、以下のタンパク質(P1−1)〜(P1−4)からなる群より選択される少なくとも1種である。これらは、単独で用いてもよく、2種以上を併用してもよい。
(P1−2)配列番号1又は2のアミノ酸配列に1個又は数個のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、上記一般式(1)で示されるセサミノール1糖又は2糖配糖体のヘキソース残基へのβ−1→2結合の糖転移活性を有するタンパク質
(P1−3)配列番号1又は2のアミノ酸配列に対して、90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、上記一般式(1)で示されるセサミノール1糖又は2糖配糖体のヘキソース残基へのβ−1→2結合の糖転移活性を有するタンパク質
(P1−4)配列番号3又は4のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、上記一般式(1)で示されるセサミノール1糖又は2糖配糖体のヘキソース残基へのβ−1→2結合の糖転移活性を有するタンパク質
本発明において、セサミノール配糖体に転移される糖は、上述したUDP−糖における糖と同じであり、ペントース、ヘキソース、ヘプトースが挙げられ、好ましくはヘキソースであり、より好ましくはグルコースである。
一般式(1)で示されるセサミノール1糖又は2糖配糖体のヘキソース残基へのβ−1→2結合の糖転移活性は、SG1のグルコース残基へのβ−1→2結合のグルコース転移活性(I)、SG2(6)の1つ目のグルコース残基へのβ−1→2結合のグルコース転移活性(II)、及び、SG2(2)の2つ目のグルコース残基へのβ−1→2結合のグルコース転移活性(III)のいずれか1つ又は2以上の活性であることが好ましく、(I)〜(III)の全ての活性であることがより好ましい。
このような欠失、置換及び/又は付加されたアミノ酸の数として、1又は数個は、1〜30個であることが好ましく、1〜20個であることがより好ましく、1〜10個であることがさらに好ましく、1〜5であることが特に好ましい。
「低ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5%SDS、50%ホルムアミド、32℃の条件である。「中ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5%SDS、50%ホルムアミド、42℃又は5×SSC、1% SDS、50mM Tris−HCl(pH7.5)、50%ホルムアミド、42℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5%SDS、50%ホルムアミド、50℃又は0.2×SSC、0.1% SDS、65℃の条件である。これらの条件において、温度を上げるほど高い同一性を有するポリヌクレオチドが効率的に得られることが期待できる。ただし、ストリンジェンシーに影響する要素としては、温度、塩濃度、プローブの濃度及び長さ、イオン強度、時間等の複数の要素が考えられ、当業者であれば、これらの要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
「ストリンジェントな条件」は、例えば、前述したSambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor, Laboratory Press 2001等に記載の条件を採用することもできる。
なお、本明細書において、以下、配列番号1のアミノ酸配列からなるタンパク質を「タンパク質SiGGT21842」と、配列番号2のアミノ酸配列からなるタンパク質を「タンパク質SiGGT21842R229Q」とも記載する。
セサミノール配糖体(1)の1つ目のヘキソース残基へのβ−1→6結合の糖転移活性は、SG1のグルコース残基へのβ−1→6結合のグルコース転移活性(IV)、及び、SG2(2)の1つ目のグルコース残基へのβ−1→6結合のグルコース転移活性(V)のいずれか1つ又は2つの活性であることが好ましく、(IV)及び(V)の両方の活性であることがより好ましい。
(P2−1)配列番号5のアミノ酸配列からなるタンパク質
(P2−2)配列番号5のアミノ酸配列に1個又は数個のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、セサミノール配糖体(1)の1つ目のヘキソース残基の6位に、糖をβ−1→6結合する糖転移活性を有するタンパク質
(P2−3)配列番号5のアミノ酸配列に対して、90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、セサミノール配糖体(1)の1つ目のヘキソース残基の6位に、糖をβ−1→6結合する糖転移活性を有するタンパク質
(P2−4)配列番号6のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、セサミノール配糖体(1)の1つ目のヘキソース残基の6位に、糖をβ−1→6結合する糖転移活性を有するタンパク質
(P2−5)配列番号7のアミノ酸配列からなるタンパク質
(P2−6)配列番号7のアミノ酸配列に1個又は数個のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、セサミノール配糖体(1)の1つ目のヘキソース残基の6位に、糖をβ−1→6結合する糖転移活性を有するタンパク質
(P2−7)配列番号7のアミノ酸配列に対して、90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、セサミノール配糖体(1)の1つ目のヘキソース残基の6位に、糖をβ−1→6結合する糖転移活性を有するタンパク質
(P2−8)配列番号8のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、セサミノール配糖体(1)の1つ目のヘキソース残基の6位に、糖をβ−1→6結合する糖転移活性を有するタンパク質
なお、本明細書において、以下、配列番号5のアミノ酸配列からなるタンパク質を「タンパク質SiGGT21646」と、配列番号7のアミノ酸配列からなるタンパク質を「UGT94D1」とも記載する。
セサミノール1糖又は2糖配糖体及びUDP−糖に、タンパク質(P2)を作用させる工程を行うことにより、β−1→6結合を分子内に1個含むセサミノール2糖又は3糖配糖体を得ることができる。UDP−糖及びその好ましい態様は、上述した通りである。
この場合、形質転換体の宿主としては、植物、好ましくはゴマ属植物(より好ましくはゴマ);大腸菌、酵母、麹菌等の微生物を用いることが好ましい。
本発明のセサミノール2糖又は3糖配糖体の製造方法によりセサミノール3糖配糖体を製造する場合、該セサミノール3糖配糖体は、上記式(5)で示されるSG3(2,2)、又は、上記式(4)で示されるSG3(2,6)であることが好ましい。
本発明のセサミノール2糖又は3糖配糖体の製造方法は、これらのセサミノール2糖又は3糖配糖体の製造方法として好適である。
SG2(2)の製造方法は、SG1及びUDP−グルコースにタンパク質(P1)を作用させる工程(i)を含む。この工程を行う前にSG1を準備する工程を行ってもよい。
SG1を準備する方法としては、特に限定されない。例えば、上述したように、特許文献1又は非特許文献1に記載のUGT71A9を、セサミノール及びUDP−グルコースに作用させることにより得ることができる。
また、ゴマ種子等から抽出、精製を行いSG1を準備してもよい。
SG1及びUDP−グルコースにタンパク質(P1)を作用させることにより、SG1のグルコース残基へのβ−1→2結合のグルコース転移によりSG2(2)を合成する。
上記では、タンパク質(P1)は、SG1のグルコース残基へのβ−1→2結合のグルコース転移活性(I)を有するセサミノールGGTとして機能する。
上記第一の方法において、タンパク質(P2)は、上記糖転移活性として、SG1のグルコース残基へのβ−1→6結合のグルコース転移活性(IV)を有することが好ましい。このようなタンパク質(P2)として、以下タンパク質(P2−11)〜(P2−18)からなる群より選択される少なくとも1種であることが好ましい。これらは、単独で用いてもよく、2種以上を併用してもよい。
(P2−12)配列番号5のアミノ酸配列に1個又は数個のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、SG2(2)の1つ目のグルコース残基へのβ−1→6結合のグルコース転移活性を有するタンパク質
(P2−13)配列番号5のアミノ酸配列に対して、90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、SG2(2)の1つ目のグルコース残基へのβ−1→6結合のグルコース転移活性を有するタンパク質
(P2−14)配列番号6のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、SG2(2)の1つ目のグルコース残基へのβ−1→6結合のグルコース転移活性を有するタンパク質
(P2−15)配列番号7のアミノ酸配列からなるタンパク質
(P2−16)配列番号7のアミノ酸配列に1個又は数個のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、SG2(2)の1つ目のグルコース残基へのβ−1→6結合のグルコース転移活性を有するタンパク質
(P2−17)配列番号7のアミノ酸配列に対して、90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、SG2(2)の1つ目のグルコース残基へのβ−1→6結合のグルコース転移活性を有するタンパク質
(P2−18)配列番号8のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、SG2(2)の1つ目のグルコース残基へのβ−1→6結合のグルコース転移活性を有するタンパク質
タンパク質(P2−11)及び(P2−15)は、タンパク質(P2−1)及び(P2−5)と同じである。タンパク質(P2−12)〜(P2−14)及び(P2−16)〜(P2−18)は、タンパク質(P2−2)〜(P2−4)及び(P2−6)〜(P2−8)の好ましい態様の一例であり、アミノ酸の同一性等の好ましい態様は、タンパク質(P2−2)〜(P2−4)及び(P2−6)〜(P2−8)と同じである。
本工程では、タンパク質(P2)を用いることにより、SG2(2)と、UDP−グルコースとを反応させ、SG2(2)の1つ目のグルコース残基へのβ−1→6結合のグルコース転移によりSG3(2,6)を合成する。反応は、水溶液中で行うことが好ましい。この工程における反応条件は、特に限定されないが、10〜50℃、pH5〜8であることが好ましい。反応温度は、30〜40℃とすることがより好ましい。基質とタンパク質(P2)の割合は適宜設定すればよい。
反応条件は、特に限定されず、上記のタンパク質(P2)を用いる反応と同じとすればよい。
本工程では、タンパク質(P2)を用いることにより、SG1と、UDP−グルコースとを反応させ、SG2(6)を合成する。
なお、好ましい反応条件は、上記のタンパク質(P2)を使用する際と同様である。
タンパク質(P1)用いることにより、SG2(6)と、UDP−グルコースとを反応させ、SG2(6)の1つ目のグルコース残基へのβ−1→2結合のグルコース転移によりSG3(2,6)を合成する。
上記において、タンパク質(P1)は、SG2(6)の1つ目のグルコース残基へのβ−1→2結合のグルコース転移活性(II)を有するタンパク質として機能する。
SG3(2,2)を製造する方法は、SG2(2)及びUDP−グルコースにタンパク質(P1)を作用させる工程(i)を含む。SG2(2)は、上述したSG1及びUDP−グルコースにタンパク質(P1)を作用させる工程(i)を行って製造してもよい。この場合、製造方法は、SG1のグルコース残基へのβ−1→2結合のグルコース転移によりSG2(2)を生成させる工程(i)、及び、該SG2(2)及びUDP−グルコースに上記タンパク質(P1)を作用させ、SG3(2,2)を生成させる工程を含む。また、上記のSG1を準備する工程を含んでいてもよい。
本工程では、タンパク質(P1)を用いることにより、SG1とUDP−グルコースとを反応させ、SG1のグルコース残基へのβ−1→2結合のグルコース転移によりSG2(2)を合成する。
タンパク質(P1)を用いることにより、SG2(2)と、UDP−グルコースとを反応させ、SG2(2)の2つ目のグルコース残基へのβ−1→2結合のグルコース転移によりSG3(2,2)を合成する。
上記において、タンパク質(P1)は、SG2(2)の2つ目のグルコース残基へのβ−1→2結合のグルコース転移活性(III)を有するタンパク質として機能する。
そのため、SG3(2,2)を製造する方法の反応系には、タンパク質(P2)が存在していないことが好ましい。
図1に示すように、タンパク質(P1)及び所望によりタンパク質(P2)を用い、セサミノール1糖又は2糖配糖体を原料としてセサミノール2糖又は3糖配糖体を製造することができる。
これらの各反応は、別々の反応系で行ってもよく、同一の反応系で行ってもよい。
現在まで、配列番号1及び2のアミノ酸配列からなるタンパク質の機能は知られていなかった。
すなわち、これらタンパク質は、SG1のグルコース残基へのβ−1→2結合のグルコース転移活性(I)、SG2(6)の1つ目のグルコース残基へのβ−1→2結合のグルコース転移活性(II)、及び、SG2(2)の2つ目のグルコース残基へのβ−1→2結合のグルコース転移活性(III)を有する。上述したようにタンパク質(P1)はUDP−糖特異的糖転移酵素である。
配列番号2のアミノ酸配列は新規なアミノ酸配列である。すなわち、タンパク質SiGGT21842R229Qは新規なタンパク質である。配列番号2のアミノ酸配列からなるタンパク質も、本発明の1つである。
配列番号4のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドも、本発明の1つである。
これらタンパク質の製造方法としては、以下の方法があげられる。
例えば、配列番号3又は4のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドをベクターに組み込んで発現ベクターを作製する。上記発現ベクターを宿主に導入し、宿主の形質転換を行い形質転換体とする。形質転換体及びその製造方法は後述する。
そして、該形質転換体にタンパク質を発現させ、タンパク質を精製することにより上記タンパク質(P1)を得ることができる。
これらの中では、ゴマ属植物が好ましく、ゴマの植物体又はその部分であることが好ましい。
宿主の培養方法及びタンパク質の発現方法は、宿主の種類に応じた公知の方法を適用することができる。
このような方法により、タンパク質(P1−1)を製造することができる。
(N1−2)配列番号3又は4のヌクレオチド配列に1個又は数個のヌクレオチドが欠失、置換及び/又は付加されたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドであり、かつ、上記一般式(1)で示されるセサミノール1糖又は2糖配糖体のヘキソース残基へのβ−1→2結合の糖転移活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(N1−3)配列番号3又は4のヌクレオチド配列に対して、90%以上の同一性を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドであり、かつ、上記一般式(1)で示されるセサミノール1糖又は2糖配糖体のヘキソース残基へのβ−1→2結合の糖転移活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(N1−4)配列番号3又は4のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドからなり、かつ、上記一般式(1)で示されるセサミノール1糖又は2糖配糖体のヘキソース残基へのβ−1→2結合の糖転移活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
タンパク質(P2−5)は、配列番号7のアミノ酸配列からなるタンパク質である。
現在まで、配列番号5のアミノ酸配列からなるタンパク質の機能は知られていなかった。
すなわち、これらタンパク質は、SG1のグルコース残基へのβ−1→6結合のグルコース転移活性(IV)、及び、SG2(2)の1つ目のグルコース残基へのβ−1→6結合のグルコース転移活性(V)を有する。上述したようにタンパク質(P2)はUDP−糖特異的糖転移酵素である。
上記タンパク質(P1)を製造する方法において、配列番号3又は4のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの代わりに、以下のポリヌクレオチド(N2−1)〜(N2−8)のいずれか又は2以上をベクターに組み込んで発現ベクターを作製することにより、タンパク質(P2−1)(タンパク質SiGGT21646)等のタンパク質(P2)を製造することができる。
(N2−1)配列番号6のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
(N2−2)配列番号6のヌクレオチド配列に1個又は数個のヌクレオチドが欠失、置換及び/又は付加されたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドであり、かつ、上記一般式(1)で示されるセサミノール1糖又は2糖配糖体の1つ目のヘキソース残基へのβ−1→6結合の糖転移活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(N2−3)配列番号6のヌクレオチド配列に対して、90%以上の同一性を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドであり、かつ、上記一般式(1)で示されるセサミノール1糖又は2糖配糖体の1つ目のヘキソース残基へのβ−1→6結合の糖転移活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(N2−4)配列番号6のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドからなり、かつ、上記一般式(1)で示されるセサミノール1糖又は2糖配糖体の1つ目のヘキソース残基へのβ−1→6結合の糖転移活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(N2−5)配列番号8のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
(N2−6)配列番号8のヌクレオチド配列に1個又は数個のヌクレオチドが欠失、置換及び/又は付加されたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドであり、かつ、上記一般式(1)で示されるセサミノール1糖又は2糖配糖体の1つ目のヘキソース残基へのβ−1→6結合の糖転移活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(N2−7)配列番号8のヌクレオチド配列に対して、90%以上の同一性を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドであり、かつ、上記一般式(1)で示されるセサミノール1糖又は2糖配糖体の1つ目のヘキソース残基へのβ−1→6結合の糖転移活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(N2−8)配列番号8のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドからなり、かつ、上記一般式(1)で示されるセサミノール1糖又は2糖配糖体の1つ目のヘキソース残基へのβ−1→6結合の糖転移活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
好ましくは、ポリヌクレオチド(N1−1)〜(N1−4)からなる群より選択される少なくとも1つのポリヌクレオチドを含む発現ベクターが導入された非ヒト宿主である形質転換体であり、この形質転換体に、さらに、ポリヌクレオチド(N2−1)〜(N2−4)からなる群より選択される少なくとも1つのポリヌクレオチドを含む発現ベクターが導入されていてもよい。
この他に、例えば、ゴマ種子からタンパク質(P1)及び(P2)を抽出、精製することにより、タンパク質(P1)及び(P2)を得てもよい。
セサミノール2糖又は3糖配糖体合成能が異なる植物体としては、例えば、既存品種と比較してセサミノール2糖又は3糖配当体合成能が高い、又は、低い植物体があげられる。
セサミノール2糖又は3糖配糖体としては、上述した製造方法により製造されるセサミノール2糖又は3糖配糖体が挙げられ、好ましくは、SG2(2)、SG3(2,6)、SG3(2,2)、及び、SG2(6)からなる群より選択される1種又は2種以上である。
各工程について以下に詳述する。
まず、植物体又はその部分からDNA又はRNAであるポリヌクレオチドを抽出する。
抽出したポリヌクレオチドがRNAである場合、RNAを逆転写してcDNAを合成する。
ポリヌクレオチドの抽出、及び、cDNAの合成は公知の方法を用いることができる。
DNA又はRNAを抽出する被検植物の部位は特に限定されないが、例えば、ゴマの植物体を選別する場合には、ゴマの種子等が好ましい。
次に、DNA又はcDNAから配列番号3、4又は6のヌクレオチド配列の少なくとも一部の配列を含むポリヌクレオチドを増幅し、増幅DNA断片を作製する。
ポリヌクレオチドを増幅する方法としては、特に限定されないが、例えばPCRを用いることができる。
DNAの増幅方法や、PCRで用いるプライマーの設計及び合成は、当該技術分野において周知であり、当業者であれば配列に基づき容易に実施可能である。
次に、増幅DNA断片のヌクレオチド配列と配列番号3、4又は6のヌクレオチド配列とを比較することにより、セサミノールGGTの活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の遺伝的変異を特定し、遺伝的変異を含む遺伝子を有する変異植物体を選別する。
なお、本明細書において、「遺伝的変異」とは、突然変異及び/又は遺伝子多型のことを意味する。
次に、変異植物体における遺伝的変異を含む遺伝子の発現量、又は、遺伝的変異を含む遺伝子がコードするタンパク質のセサミノールGGTの活性と、既存品種の配列番号3、4又は6のヌクレオチド配列を含む遺伝子の発現量、又は、配列番号3、4又は6のヌクレオチド配列を含む遺伝子がコードするタンパク質のセサミノールGGTの活性とを比較する。
また、変異植物体における遺伝的変異を含む遺伝子の発現量が、既存品種の配列番号3、4又は6のヌクレオチド配列を含む遺伝子の発現量よりも少ない場合や、遺伝的変異を含む遺伝子がコードするタンパク質のセサミノールGGTの活性が、配列番号3、4又は6のヌクレオチド配列を含む遺伝子がコードするタンパク質のセサミノールGGTの活性よりも低い場合、このような変異植物体は、既存品種と比較してセサミノール2糖又は3糖配糖体合成能が低い植物体であると選別することができる。
本発明の植物体の選別方法の第2例は、配列番号3、4又は6のヌクレオチド配列の少なくとも一部の配列を含むポリヌクレオチドの発現量を測定する工程を含み、該発現量を指標として、セサミノール2糖又は3糖配糖体合成能が異なる植物体を選別する。
ポリヌクレオチドは、配列番号3、4又は6のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであり、より好ましくは配列番号3、4又は6のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドである。本発明においては、配列番号3、4又は6のヌクレオチド配列のポリヌクレオチドの発現量を指標とすることが好ましい。これらの2以上のヌクレオチド配列の発現を指標として用いてもよい。本発明のポリヌクレオチドの発現量の測定方法は特に限定されず、上述した方法により植物体又はその部分からRNAを抽出し、上記ポリヌクレオチドのmRNAを定量すればよい。
配列番号3、4又は6のヌクレオチド配列を有する遺伝子の発現量が多い植物体は、タンパク質SiGGT21842、タンパク質SiGGT21842R229Q、又は、タンパク質SiGGT21646の発現量が多いことになる。
そのため、配列番号3、4又は6のヌクレオチド配列を有する遺伝子の発現量が多い植物体を、セサミノール2糖又は3糖配糖体合成能が高い植物体であると選別することができる。
また、配列番号3、4又は6のヌクレオチド配列を有する遺伝子の発現量が少ない植物体は、タンパク質SiGGT21842、タンパク質SiGGT21842R229Q、又は、タンパク質SiGGT21646の発現量が少ないことになる。
そのため、配列番号3、4又は6のヌクレオチド配列を有する遺伝子の発現量が少ない植物体を、セサミノール2糖又は3糖配糖体合成能が低い植物体であると選別することができる。
セサミノール2糖又は3糖配糖体合成能が高い植物体は、好ましくは、その植物の種に含まれる既存品種に対してセサミノール2糖又は3糖配糖体合成能が高い植物体である。例えば、ある植物体(被検植物体)と既存品種の植物体との間で上記ポリヌクレオチドの発現量を比較し、既存品種よりも該発現量が多い植物体を選別することにより、既存品種に対してセサミノール2糖又は3糖配糖体合成能が高い植物体を選別することができる。
また、例えば、被検植物体と既存品種の植物体との間で上記ポリヌクレオチドの発現量を比較し、既存品種よりも該発現量が少ない植物体を選別することにより、既存品種に対してセサミノール2糖又は3糖配糖体合成能が低い植物体を選別することができる。
SG1 :セサミノール2’−O−β−D−グルコシド
Epi−SG1 :セサミノール2’−O−β−D−グルコシドのエピマー
SG2(2) :セサミノール2’−O−β−D−グルコシル(1→2)−β
−D−グルコシド
SG2(6) :セサミノール2’−O−β−D−グルコシル(1→6)−β
−D−グルコシド
Epi−SG2(6) :セサミノール2’−O−β−D−グルコシル(1→6)−β
−D−グルコシドのエピマー
SG3(2,2) :セサミノール2’−O−β−D−グルコシル(1→2)−O
−[β−D−グルコシル(1→2)]−β−D−グルコシド
SG3(2,6) :セサミノール2’−O−β−D−グルコシル(1→2)−O
−[β−D−グルコシル(1→6)]−β−D−グルコシド
Epi−SG3(2,6):セサミノール2’−O−β−D−グルコシル(1→2)−O
−[β−D−グルコシル(1→6)]−β−D−グルコシド
のエピマー
本明細書において用いる分子生物学的手法は、他で詳述しない限り、Molecular Cloning(Sambrookら, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 2001)に記載の方法に従った。
ゴマ種子のExpressed Tag Seq(EST)の中から先行技術文献(非特許文献1)の配糖体化酵素遺伝子(UGT)とは異なるUGT様配列を相同性検索により探索を行った。その結果、配列番号7のアミノ酸配列からなるUGT94D1とDNAレベルで54%、アミノ酸レベルで42%の配列同一性を示す配列番号1のアミノ酸配列からなるタンパク質SiGGT21842と、DNAレベルで56%、アミノ酸レベルで45%の配列同一性を示す配列番号5のアミノ酸配列からなるタンパク質SiGGT21646を見出した。なお、これらタンパク質を「SiGGTタンパク質」とも記載し、これらのタンパク質をコードする遺伝子を以下「SiGGT遺伝子」とも記載する。
これらのSiGGT遺伝子は両者とも約1400bpのヌクレオチド長を有し、完全長オープンリーディングフレーム(ORF)を含むと考えられたため、下記のプライマーセット(配列番号9及び10、並びに、配列番号11及び12)でゴマ種子から調製したcDNAを鋳型にPCRによる増幅を行った。
なお、ゴマ種子cDNAについてはゴマ種子からRNeasy Plant Miniキット(QIAGEN)を用いて総RNAを抽出し、そのうち0.5μgをRandom Oligo−dTプライマーで逆転写(RT)反応することによって得た。
5’−TGCCGCGCGGCAGCCATATGGAGAAAAAAGAAGCTAAATTCAG−3’(配列番号9)
タンパク質SiGGT21842用リバースプライマー(SiGGT−21842−pET−RV):
5’−GTTAGCAGCCGGATCCTCACTTTTCACTGCCTAATCTG−3’(配列番号10)
5’−TGCCGCGCGGCAGCCATATGGGTTCAGACAAAGAGTGC−3’(配列番号11)
タンパク質SiGGT21646用リバースプライマー(BamHI−SiGGT−21646−pET−RV):
5’−GTTAGCAGCCGGATCCTTAATTCCCACAAATTTGTGCTAACTTG−3’(配列番号12)
図2の(a)は、ゴマ種子cDNAを鋳型として、タンパク質SiGGT21842用フォワードプライマー及びタンパク質SiGGT21842用リバースプライマーを用いて得られたPCR産物のアガロースゲル電気泳動の写真であり、(b)は、ゴマ種子cDNAを鋳型として、タンパク質SiGGT21646用フォワードプライマー及びタンパク質SiGGT21646用リバースプライマーを用いて得られたPCR産物のアガロースゲル電気泳動の写真である。
図2の(a)中、Aのレーンは、タンパク質SiGGT21842用プライマーを用いたPCR産物であり、図2の(b)中、Bのレーンは、タンパク質SiGGT21646用プライマーを用いたPCR産物であり、図2(a)及び(b)中のMはマーカーである。
また、図2(a)及び(b)の1400bp付近のバンドを矢印で示す。
なお、図2中、Mは、サイズマーカーである。
次に、PCR産物をGeneArt Seamless Cloning and Assembly Enzyme Mix(Thermo Fisher Scientific)を用いて製造業者が推奨する方法で大腸菌発現ベクターpET15b(Novagene)にサブクローニングした。本ベクターのNdeIサイト上流にあるHisタグをコードするサイトとSiGGT遺伝子のORFが合っており、SiGGTタンパク質のN末端にHisタグが融合されたキメラタンパク質として発現するよう設計した。
また、各発現ベクターの接続部分にエラーがないことも確認した。
SiGGT21842発現ベクター、SiGGT21646発現ベクター及びネガティブコントロールとして発現ベクターpET15b(空のpET15bベクター)を用い、定法に従って大腸菌BL21(DE3)株を形質転換した。
得られた各形質転換体を、50μg/mLのアンピシリンを含むLB培地(10g/L typtone pepton, 5g/L yeast extract, 1g/L NaCl)4mLにて、37℃で一晩振盪培養した。静止期に達した培養液2mLを同組成の培地98mLに接種し、Overnight Express Autoinduction System 1(Novagen社)を用いて25℃で20時間振盪培養した。
培養した形質転換体を遠心分離(5,000×g、10min)にて集菌し、Buffer S[20mM HEPESバッファー(pH7.5)、20mM imidazol、 14mM β−メルカプトエタノール]を1mL/g cellとなるように添加して懸濁した。
続いて、超音波破砕(15sec×8回)を行い、遠心分離(15,000×g、15min)を行った。得られた上清を粗酵素液として回収した。
粗酵素液をBuffer Sにて平衡化したHis SpinTrap(GE Healthcare社)に負荷し、遠心分離(70×g、30sec)した。
Buffer Sで洗浄後、100mM、及び、500mMのイミダゾールを含むBuffer S 各5mLにて、カラムに結合したタンパク質を段階的に溶出した。
各溶出画分をMicrocon YM−30(Amicon社)を用いて20mM HEPESバッファー(pH7.5)、14mM β−メルカプトエタノールにバッファー置換した。このバッファー置換した生成酵素溶液を以下の反応に用いた。
SiGGT21842発現ベクター及びSiGGT21646発現ベクターを用いて得られた粗酵素液から得られた500mM イミダゾール溶出画分において、HisTag融合SiGGTタンパク質の推定分子質量である分子質量50kDa付近の位置にタンパク質のバンドが観察された。
SiGGT21842発現ベクター及びSiGGT21646発現ベクターを用いて得られた各粗酵素液から得られた500mM イミダゾール溶出画分において、分子質量約50kDa付近にタンパク質が検出された。一方、発現ベクターpET15bを用いて得られた粗酵素液から得られた溶出画分(以下、「ネガティブコントロール画分」とも記載する)には、上記分子質量約50kDaのタンパク質が検出されなかった。
以下のに示す方法で、タンパク質SiGGT21842とSG1との反応を解析した。
装置名:LCMS−IT−TOF(製造元:島津製作所:Prominence LC20シリーズ)
カラム:Waters Sunfire C18 3.5um 2.0mm I.D.×20mm
移動相:A:10mM 酢酸アンモニウム水溶液 B: アセトニトリル
流速:0.4mL/min
カラムオーブン:40℃
グラジエント:B(v/v%):20%(0min)−80%(6min)−80%(8min)−20%(8.1min)−20%(12min)
本条件では、セサミノール2糖配糖体のSG2(2)のピークは保持時間3.91分、SG2(6)のピークは保持時間3.77分であり、これらは分離される。
ESI (negative mode)
Selected ion monitoring:m/z 317,479,641,687,803及び849
図3の(a)は、SG1及び精製タンパク質SiGGT21842溶液を用いた反応液の逆相LC−MS分析のチャートであり、図3の(b)は、SG2(2)の標準品の逆相LC−MS分析のチャートであり、図3の(c)は、SG1及びネガティブコントロール画分を用いた反応液の逆相LC−MS分析のチャートである。
すなわち、図3の(a)は、実施例1の反応液の逆相LC−MS分析のチャートであり、図3の(b)は、実施例1のポジティブコントロールとして標準品のSG2(2)を用いた逆相LC−MS分析のチャートであり、図3の(c)は、実施例1のネガティブコントロールの反応液の逆相LC−MS分析のチャートである。
なお、図3(c)に示す保持時間4.39分のピークは、SG1であり、保持時間4.46分のピークは、Epi−SG1のピークであると考えられる。
以下に示す方法で、タンパク質SiGGT21842とSG2(2)との反応を解析した。
図4の(a)は、SG2(2)及び精製タンパク質SiGGT21842溶液を用いた反応液の逆相LC−MS分析のチャートであり、図4の(b)は、SG2(2)及びネガティブコントロール画分を用いた反応液の逆相LC−MS分析のチャートである。
すなわち、図4の(a)は、実施例2の反応液の逆相LC−MS分析のチャートであり、図4の(b)は、実施例2のネガティブコントロールの反応液の逆相LC−MS分析のチャートである。
なお、図4(a)において保持時間3.90分のピークは、SG2(2)のピークである。
また、図4(b)に示す、保持時間3.89分のピークは、SG2(2)のピークである。
以下に示す方法で、タンパク質SiGGT21842とSG2(6)との反応を解析した。
図5の(a)は、SG2(6)及び精製タンパク質SiGGT21842溶液を用いた反応液の逆相LC−MS分析のチャートであり、図5の(b)は、SG3(2,6)及びネガティブコントロール画分を用いた反応液の逆相LC−MS分析のチャートであり、図5の(c)は、SG2(6)及びネガティブコントロール画分を用いた反応液の逆相LC−MS分析のチャートである。
すなわち、図5の(a)は、実施例3の反応液の逆相LC−MS分析のチャートであり、図5の(b)は、実施例3のポジティブコントロールの反応液の逆相LC−MS分析のチャートであり、図5の(c)は、実施例3のネガティブコントロールの反応液の逆相LC−MS分析のチャートである。
なお、図5(b)において保持時間3.30分のピークは、SG3(2,6)のピークである。
なお、図5(c)において保持時間3.80分のピークは、SG2(6)のピークである。
以下に示す方法で、セサミノールを出発物質としてSG3(2,6)を製造する方法を検討した。
反応液(2mM UDP−グルコース,糖受容体基質として0.1mM セサミノール,100mM リン酸カリウムバッファー(pH7.5),ネガティブコントロール画分25μLを蒸留水で50μLに調製)を、30℃、1時間反応させた。反応後の反応液5μLについて上記条件で逆相LC−MS分析を行った。結果を図6(a)に示す。
図6の(a)は、実施例4のネガティブコントロールの反応液の逆相LC−MS分析のチャートである。
反応液(2mM UDP−グルコース,糖受容体基質として0.1mM セサミノール,100mM リン酸カリウムバッファー(pH7.5),UGT71A9,UGT94D1を蒸留水で50μLに調整)を、30℃、1時間反応させた。反応後の反応液5μLについて上記条件で逆相LC−MS分析を行った。結果を図6(b)に示す。
図6の(b)は、実施例4の第1反応の反応液の逆相LC−MS分析のチャートである。
なお、UGT71A9及びUGT94D1は、非特許文献1に記載の方法で準備した。
反応液(2mM UDP−グルコース,糖受容体基質として0.1mM セサミノール,100mM リン酸カリウムバッファー(pH7.5),UGT71A9、UGT94D1,精製タンパク質SiGGT21842溶液25μLを蒸留水で50μLに調製し、30℃、1時間反応させた。反応後の反応液5μLについて上記条件で逆相LC−MS分析を行った。結果を図6(c)に示す。
図6の(c)は、実施例4の第2反応の反応液の逆相LC−MS分析のチャートである。
図6(b)では、保持時間3.77分、及び、保持時間3.85分の位置にピークが認められた。
図6(c)では、保持時間3.30分、及び、保持時間3.40分の位置にピークが認められた。
この結果より、UGT71A9及びUGT94D1により、SG2(6)が生成することが確認された。またこれらの酵素は、エピマーを厳密に区別していないことが示唆された。
つまり、第1反応として、UGT71A9及びUGT94D1とセサミノールとが反応し、
SG2(6)が生成し、第2反応として、タンパク質SiGGT21842とSG2(6)とが反応しSG3(2,6)が生成することが確認できた。
また、タンパク質SiGGT21842は、エピマーを厳密に区別していないことが示唆された。
タンパク質SiGGT21842の代わりにタンパク質SiGGT21842R229Qを用いて上記(タンパク質SiGGT21842の機能解析1)〜(タンパク質SiGGT21842の機能解析4)と同様の試験を行ったところ、タンパク質SiGGT21842R229Qはタンパク質SiGGT21842と同じ機能を有していることが判明した。
以下の試験例1〜7に示す方法で、タンパク質SiGGT21646の機能を解析した。
糖受容体基質及び酵素の組み合わせを表2に示すようにして試験例1〜7の反応液を準備した。
各反応液は、2mM UDP−グルコース,0.1mM 糖受容体基質、100mM リン酸カリウムバッファー(pH7.5)、酵素溶液又はネガティブコントロール画分を25μL含み、蒸留水で50μLに調製された。
すなわち、試験例1の反応液は、糖受容体基質としてセサミノールを含み、酵素としてタンパク質SiGGT21646を含む。
試験例2の反応液は、糖受容体基質としてSG2(2)を含み、酵素としてタンパク質SiGGT21646を含む。
試験例3の反応液は、糖受容体基質としてセサミノールを含み、酵素としてUGT71A9及びタンパク質SiGGT21646を含む。
試験例4の反応液は、糖受容体基質としてSG2(2)を含み、酵素としてUGT94D1を含む。
試験例5の反応液は、糖受容体基質としてセサミノールを含み、酵素としてUGT71A9及びUGT94D1を含む。
試験例6の反応液は、糖受容体基質としてSG2(6)を含み、酵素としてタンパク質SiGGT21646を含む。
試験例7の反応液は、糖受容体基質としてSG2(6)を含み、酵素としてUGT94D1を含む。
図7は、試験例1の反応液の逆相LC−MS分析のチャートである。
図8は、試験例2の反応液の逆相LC−MS分析のチャートである。
図9は、試験例3の反応液の逆相LC−MS分析のチャートである。
図10は、試験例4の反応液の逆相LC−MS分析のチャートである。
図11は、試験例5の反応液の逆相LC−MS分析のチャートである。
図12は、試験例6の反応液の逆相LC−MS分析のチャートである。
図13は、試験例7の反応液の逆相LC−MS分析のチャートである。
一方、図8に示すようにタンパク質SiGGT21646をSG2(2)と反応させたところグルコースが1分子付加されたピークが認められ、これは保持時間からセサミノSG3(2,6)と同定された。
また、図9に示すように、UGT71A9及びタンパク質SiGGT21646をセサミノールと反応させたところ、グルコースが2分子付加されたピークが認められ、これは保持時間からセサミノールSG2(6)と同定された。
図10及び図11に示すようにこれらの反応はUGT94D1でも同様にみられることと、及び、図12及び図13に示すようにこれらタンパク質はSG2(6)をグルコシル化する活性がほとんどないことから、タンパク質SiGGT21646はUGT94D1と同じように、SG1のグルコース残基の6位、及び、SG2(2)の一つ目のグルコース残基の6位をグルコシル化する糖特異的糖転移酵素であることが示された。
さらにタンパク質(P1)を利用して、SG2(2)の2つ目のグルコース残基の2位をグルコシル化することができ、SG3(2,2)を製造することができる。
今回、タンパク質(P1)に含まれるタンパク質SiGGT21842及びタンパク質SiGGT21842R229Qの機能を解析することにより、セサミノールからSG3(2,6)までの生合成経路の全容が明らかになった。そのため、植物のみならず微生物において水溶性リグナン配糖体であるセサミノール3糖配糖体、その他類縁化合物を生産させるための育種マーカーおよび分子ツールを与えうる。
Claims (14)
- セサミノール2糖又は3糖配糖体の製造方法であって、
下記一般式(1)で示されるセサミノール1糖又は2糖配糖体及びUDP−グルコースに、下記タンパク質(P1−1)〜(P1−3)からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質(P1)を作用させる工程(i)を含むことを特徴とするセサミノール2糖又は3糖配糖体の製造方法。
(P1−1)配列番号1又は2のアミノ酸配列からなるタンパク質
(P1−2)配列番号1又は2のアミノ酸配列に1個又は数個のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、下記一般式(1)で示されるセサミノール1糖又は2糖配糖体のグルコース残基へのβ−1→2結合のグルコース転移活性を有するタンパク質
(P1−3)配列番号1又は2のアミノ酸配列に対して、90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、下記一般式(1)で示されるセサミノール1糖又は2糖配糖体のグルコース残基へのβ−1→2結合のグルコース転移活性を有するタンパク質
- 前記一般式(1)で示されるセサミノール1糖又は2糖配糖体のグルコース残基へのβ−1→2結合のグルコース転移活性が、
セサミノール2’−O−β−D−グルコシドのグルコース残基へのβ−1→2結合のグルコース転移活性(I)、
セサミノール2’−O−β−D−グルコシル(1→6)−β−D−グルコシドの1つ目のグルコース残基へのβ−1→2結合のグルコース転移活性(II)、及び、
セサミノール2’−O−β−D−グルコシル(1→2)−β−D−グルコシドの2つ目のグルコース残基へのβ−1→2結合のグルコース転移活性(III)のいずれか1つ又は2以上である請求項1に記載のセサミノール2糖又は3糖配糖体の製造方法。 - 前記式(3)に示されるセサミノール2’−O−β−D−グルコシル(1→2)−β−D−グルコシド及びUDP−グルコースに下記タンパク質(P2−11)〜(P2−13)及び(P2−15)〜(P2−17)からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質(P2)を作用させ、下記式(4)に示されるセサミノール2’−O−β−D−グルコシル(1→2)−O−[β−D−グルコシル(1→6)]−β−D−グルコシドを生成させる工程(ii)を含む請求項3に記載のセサミノール2糖又は3糖配糖体の製造方法。
(P2−11)配列番号5のアミノ酸配列からなるタンパク質
(P2−12)配列番号5のアミノ酸配列に1個又は数個のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、セサミノール2’−O−β−D−グルコシル(1→2)−β−D−グルコシドの1つ目のグルコース残基へのβ−1→6結合のグルコース転移活性を有するタンパク質
(P2−13)配列番号5のアミノ酸配列に対して、90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、セサミノール2’−O−β−D−グルコシル(1→2)−β−D−グルコシドの1つ目のグルコース残基へのβ−1→6結合のグルコース転移活性を有するタンパク質
(P2−15)配列番号7のアミノ酸配列からなるタンパク質
(P2−16)配列番号7のアミノ酸配列に1個又は数個のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、セサミノール2’−O−β−D−グルコシル(1→2)−β−D−グルコシドの1つ目のグルコース残基へのβ−1→6結合のグルコース転移活性を有するタンパク質
(P2−17)配列番号7のアミノ酸配列に対して、90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、セサミノール2’−O−β−D−グルコシル(1→2)−β−D−グルコシドの1つ目のグルコース残基へのβ−1→6結合のグルコース転移活性を有するタンパク質
- 配列番号2のアミノ酸配列からなることを特徴とするタンパク質。
- 配列番号4のヌクレオチド配列を含むことを特徴とするポリヌクレオチド。
- 請求項9に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする発現ベクター。
- 発現ベクターが導入された非ヒト宿主である形質転換体であって、
前記発現ベクターは、下記ポリヌクレオチド(N1−1)〜(N1−3)及びポリヌクレオチド(N2−1)〜(N2−3)からなる群より選択される少なくとも1つのポリヌクレオチドを含むことを特徴とする形質転換体。
(N1−1)配列番号3又は4のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
(N1−2)配列番号3又は4のヌクレオチド配列に1個又は数個のヌクレオチドが欠失、置換及び/又は付加されたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドであり、かつ、下記一般式(1)で示されるセサミノール1糖又は2糖配糖体の1つ目のグルコース残基へのβ−1→2結合のグルコース転移活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(N1−3)配列番号3又は4のヌクレオチド配列に対して、90%以上の同一性を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドであり、かつ、下記一般式(1)で示されるセサミノール1糖又は2糖配糖体の1つ目のグルコース残基へのβ−1→2結合のグルコース転移活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(N2−1)配列番号6のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
(N2−2)配列番号6のヌクレオチド配列に1個又は数個のヌクレオチドが欠失、置換及び/又は付加されたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドであり、かつ、下記一般式(1)で示されるセサミノール1糖又は2糖配糖体の1つ目のグルコース残基へのβ−1→6結合のグルコース転移活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(N2−3)配列番号6のヌクレオチド配列に対して、90%以上の同一性を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドであり、かつ、下記一般式(1)で示されるセサミノール1糖又は2糖配糖体の1つ目のグルコース残基へのβ−1→6結合のグルコース転移活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
- 前記非ヒト宿主が、植物体又はその部分である、請求項11に記載の形質転換体。
- 前記非ヒト宿主が、ゴマの植物体又はその部分である、請求項11又は12に記載の形質転換体。
- 請求項11〜13のいずれかに記載の形質転換体を栽培又は培養する工程を含むことを特徴とするセサミノール2糖又は3糖配糖体の製造方法。
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