CN117844777A - 珠芽艾麻中黄酮糖苷类糖基转移酶LbUGT71BX2及其编码基因与应用 - Google Patents

珠芽艾麻中黄酮糖苷类糖基转移酶LbUGT71BX2及其编码基因与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了珠芽艾麻中黄酮糖苷类糖基转移酶LbUGT71BX2及其编码基因与应用。所述黄酮糖苷类糖基转移酶LbUGT71BX2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。所述黄酮糖苷类糖基转移酶LbUGT71BX2的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明基于珠芽艾麻二代转录组和三代全长转录组测序的相关结果，用反向遗传学的方法筛选并鉴定珠芽艾麻中黄酮糖苷合成的最后一步关键酶LbUGT71BX2，填补了珠芽艾麻中黄酮糖苷生物合成途径的终端空白。

Description

珠芽艾麻中黄酮糖苷类糖基转移酶LbUGT71BX2及其编码基因 与应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别地涉及珠芽艾麻中黄酮糖苷类糖基转移酶LbUGT71BX2及其编码基因与应用。
背景技术
珠芽艾麻(Laportea bulbifera)是荨麻科艾麻属植物，主产于贵州等地，其新鲜或者干燥全草(又称红禾麻)是当地苗族和布依族等少数民族用药，用于治疗风湿痹痛、肢体麻木、跌打损伤等疾病。以红禾麻为主要原料的润燥止痒胶囊疗效良好，在2018年中药大品种科技竞争力排行榜的皮肤肛肠科领域排名第三。目前珠芽艾麻的临床应用主要依赖于其野生资源的挖掘，随着红禾麻药材及其制剂的广泛应用，其野生资源日益匮乏，严重制约珠芽艾麻产业的发展。
黄酮类成分广泛存在于植物、药物和人类饮食中，现代研究表明黄酮具有抗炎、抗氧化等生物活性，同时对于植物抵抗生物与非生物胁迫具有重要作用。珠芽艾麻生长于高盐且干旱的喀斯特地区，黄酮及其糖苷类是珠芽艾麻中主要化学成分之一，然而其生物合成途径及其关键酶研究仍处于空白。
黄酮糖苷类成分生物合成途径中糖基化反应由尿苷二磷酸活化的糖基转移酶(UDP-glycosyltransferase,UGT)家族参与完成。目前已有较多UGT基因被鉴定和报道具有黄酮醇糖基转移酶活性，如杨梅(Morella rubra)中的MrUGT78R1和MrUGT78W1可分别催化杨梅素3-O-鼠李糖和3-O-半乳糖加成。草莓(Fragaria x ananassa)中可以催化黄酮醇的3-O-葡萄糖基化。然而被子植物中UGT的数量和功能多样性也因为串联重复的发生而不断变化，仍需进一步开展UGT的功能及催化机制研究，为黄酮类成分的代谢工程研究奠定基础。
图1为山奈酚、杨梅素、棉花素、槲皮万寿菊素、山奈酚-3-O-葡萄糖苷/半乳糖苷、杨梅素-3-O-葡萄糖苷/半乳糖苷、杨梅素-7-O-葡萄糖苷、棉花素-3-O-葡萄糖苷和槲皮万寿菊素-3/7-O-葡萄糖苷的分子结构式。
发明内容
有鉴于此，本发明提出珠芽艾麻中黄酮糖苷类糖基转移酶LbUGT71BX2及其编码基因与应用，填补了珠芽艾麻中黄酮糖苷生物合成途径的终端空白。
本发明的技术方案如下：
一种蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明还提供了所述蛋白的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
将该基因命名为LbUGT71BX2，将其编码的蛋白命名为LbUGT71BX2。具体信息如下：LbUGT71BX2基因序列如序列表中序列1所示，序列1含有1446个核苷酸，其编码序列表中序列2所示的蛋白，序列2由481个氨基酸组成。
含有所述编码基因的表达盒、重组表达载体或重组菌也属于本发明的保护范围。
扩增所述编码基因全长的引物对也属于本发明的保护范围，所述引物对中，一条引物序列如SEQ ID NO:3所示，另一条引物序列如SEQ ID NO:4所示。
所述蛋白在作为糖基转移酶中的应用也属于本发明的保护范围。
所述糖基转移酶为具有如下任一功能的酶：
(1)当以UDP-半乳糖为糖供体时，催化底物山奈酚生成山奈酚-3-O-半乳糖苷；
(2)当以UDP-葡萄糖为糖供体时，催化底物山奈酚生成山奈酚-3-O-葡萄糖苷；
(3)当以UDP-半乳糖为糖供体时，催化底物杨梅素生成杨梅素-3-O-半乳糖苷；
(4)当以UDP-葡萄糖为糖供体时，催化底物杨梅素生成杨梅素-3-O-葡萄糖苷；
(5)当以UDP-葡萄糖为糖供体时，催化底物棉花素生成棉花素-3-O-葡萄糖苷；
(6)当以UDP-葡萄糖为糖供体时，催化底物槲皮万寿菊素生成槲皮万寿菊素-3-O-葡萄糖苷或槲皮万寿菊素-7-O-葡萄糖苷。
所述蛋白在如下任一中的应用也属于本发明的保护范围：
(1)当以UDP-半乳糖为糖供体时，催化底物山奈酚生成山奈酚-3-O-半乳糖苷；
(2)当以UDP-葡萄糖为糖供体时，催化底物山奈酚生成山奈酚-3-O-葡萄糖苷；
(3)当以UDP-半乳糖为糖供体时，催化底物杨梅素生成杨梅素-3-O-半乳糖苷；
(4)当以UDP-葡萄糖为糖供体时，催化底物杨梅素生成杨梅素-3-O-葡萄糖苷；
(5)当以UDP-葡萄糖为糖供体时，催化底物棉花素生成棉花素-3-O-葡萄糖苷；
(6)当以UDP-葡萄糖为糖供体时，催化底物槲皮万寿菊素生成槲皮万寿菊素-3-O-葡萄糖苷或槲皮万寿菊素-7-O-葡萄糖苷。
所述的编码基因在如下任一中的应用也属于本发明的保护范围：
(1)当以UDP-半乳糖为糖供体时，催化底物山奈酚生成山奈酚-3-O-半乳糖苷；
(2)当以UDP-葡萄糖为糖供体时，催化底物山奈酚生成山奈酚-3-O-葡萄糖苷；
(3)当以UDP-半乳糖为糖供体时，催化底物杨梅素生成杨梅素-3-O-半乳糖苷；
(4)当以UDP-葡萄糖为糖供体时，催化底物杨梅素生成杨梅素-3-O-葡萄糖苷；
(5)当以UDP-葡萄糖为糖供体时，催化底物棉花素生成棉花素-3-O-葡萄糖苷；
(6)当以UDP-葡萄糖为糖供体时，催化底物槲皮万寿菊素生成槲皮万寿菊素-3-O-葡萄糖苷或槲皮万寿菊素-7-O-葡萄糖苷。
本发明基于珠芽艾麻的二代转录组和三代全长转录组测序的相关结果，用反向遗传学的方法鉴定山奈酚-3-O-葡萄糖苷/半乳糖苷、杨梅素-3-O-葡萄糖苷/半乳糖苷、杨梅素-7-O-葡萄糖苷、棉花素-3-O-葡萄糖苷和槲皮万寿菊素-3/7-O-葡萄糖苷合成的最后一步关键酶LbUGT71BX2，填补珠芽艾麻中黄酮苷类成分生物合成途径的空白，为进一步生物合成山奈酚-3-O-葡萄糖苷/半乳糖苷、杨梅素-3-O-葡萄糖苷/半乳糖苷、杨梅素-7-O-葡萄糖苷、棉花素-3-O-葡萄糖苷和槲皮万寿菊素-3/7-O-葡萄糖苷提供了糖基转移酶蛋白及其编码序列。
本发明挖掘并鉴定出珠芽艾麻中参与黄酮苷类活性成分生物合成的关键UGT，对于理解珠芽艾麻的品质形成具有重要意义，同时为黄酮类成分的合成生物学研究提供关键元件。
附图说明
为了说明而非限制的目的，现在将根据本发明的优选实施例、特别是参考附图来描述本发明，其中：
图1为山奈酚、杨梅素、棉花素、槲皮万寿菊素、山奈酚-3-O-葡萄糖苷/半乳糖苷、杨梅素-3-O-葡萄糖苷/半乳糖苷、杨梅素-7-O-葡萄糖苷、棉花素-3-O-葡萄糖苷和槲皮万寿菊素-3/7-O-葡萄糖苷的分子结构式。
图2为LbUGT71BX2基因在珠芽艾麻不同组织的表达情况。B：珠芽；F：花；L：叶；R：根；S：茎。
图3为LbUGT71BX2基因克隆和载体构建的琼脂糖凝胶电泳图。左侧图泳道4号为LbUGT71BX2基因克隆的结果，右侧图15-21号为pMAL-c2X-LbUGT71BX2载体构建结果。其余泳道为同批克隆的其他基因克隆结果。
图4为LbUGT71BX2基因的重组质粒成果转入BL21(DE3)大肠杆菌的琼脂糖凝胶电泳图，其中泳道7号和8号为LbUGT71BX2。其余泳道为同时所转化的其他基因的结果。
图5为LbUGT71BX2重组纯化蛋白SDS-Page胶图，其中泳道4号为LbUGT71BX2。其余泳道为同时所做的其他纯化酶的结果。
图6为LC-Q-TOF-MS鉴定重组蛋白LbUGT71BX2对山奈酚的催化产物的鉴定结果。
图7为LC-Q-TOF-MS鉴定重组蛋白LbUGT71BX2对杨梅素的催化产物的鉴定结果。
图8为LC-Q-TOF-MS鉴定重组蛋白LbUGT71BX2对棉花素的催化产物的鉴定结果。
图9为LC-Q-TOF-MS鉴定重组蛋白LbUGT71BX2对槲皮万寿菊素的催化产物的鉴定结果。
具体实施方式
以下结合实例详细说明本发明。实施例是为更好的理解本发明，但不限定于本发明。以下实施方法中的实验方法均为常规方法，所涉及的实验试剂均为常规生化试剂。
实施例1、基于珠芽艾麻全长转录组和二代转录组数据UGTs基因的筛选
1.1实验方法
珠芽艾麻(Laportea bulbifera)(记载过珠芽艾麻(Laportea bulbifera)的非专利文献是：Wang,W.,Wang,X.,Shi,Y.et al.Identification of Laportea bulbiferausing the complete chloroplast genome as a potentially effective super-barcode.J Appl Genetics 64,231–245(2023).https://doi.org/10.1007/s13353-022-00746-4)采集自贵州省黔东南雷公山，将其分为根、茎、叶、花、珠芽五个部位，借助Illumina平台和PacBio平台进行二代和三代测序。
从拟南芥数据库(https://www.arabidopsis.org/)下载拟南芥的UGT蛋白序列，将其与珠芽艾麻的全长转录组学数据库进行Blast同源比对分析，从Pfam(http://pfam-legacy.xfam.org/)下载UGT蛋白的隐马尔可夫(HM M)模型文件，使用HMMER(http://hmmer.janelia.org/static/binaries/hmme r3.0)软件搜索含UDPGT.HMM(PF00201)结构域的蛋白序列。将Blast同源比对分析结果和HMMER结构域搜索结构结果合并，筛除相似度小于30％，e值小于10-5，长度小于300个氨基酸的序列。将上述转录本提交至NCBI-CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi)用于验证UGT的保守结构域，使用TBtools软件对结果进行可视化，筛除不含UGT保守结构域的蛋白序列。使用Motif网站(https://meme-suite.org/meme/)对上述转录本进行保守结构域搜索，仅保留具有PSPG-box特异结构域的蛋白序列。将经上述步骤筛选得到的蛋白序列确定为珠芽艾麻的UGT基因家族成员(LbUGTs)。
使用三代全长转录本为参考，利用HiSAT2将二代转录组获得的Clean Reads与三代转录本进行序列比对，获取转录本位置信息。利用RSEM软件对转录本在不同组织部位表达水平进行定量分析，计算FPKM值。采用DESeq2软件进行差异表达分析，进一步筛选出表达量较高的LbUGTs基因。
1.2结果与分析
基于珠芽艾麻三代全长转录组数据，共筛选出了114条UGTs序列具有PSPG-box的保守结构域，基于二代转录组差异表达分析，发现LbUGT71BX2在珠芽艾麻的叶部位较高表达(图2)，推测可能具有糖基转移酶活性。
实施例2、珠芽艾麻中候选LbUGT71BX2基因的克隆与表达载体的构建
2.1实验方法
利用同源重组法获得pMAL-c2X-LbUGT71BX2表达载体设计引物序列(如表1)，以珠芽艾麻的珠芽部位cDNA为模板，利用KOD高保真酶克隆LbUGT71BX2基因片段(KOD高保真酶PCR体系总体积为50μL：25μL KOD OneTM PCR Master Mix，1.5μL引物(10mM)，1μL模板和21μL水，程序如表2)。
表1克隆LbUGT71BX2基因所用引物序列
表2KOD高保真酶PCR反应程序
使用ClonExpressⅡOne Step Cloning Kit试剂盒(购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司，产品目录号为C112)将目的基因构建至pMAL-c2X载体(购自New EnglandBiolabs.，产品目录号为E8200S)，酶切位点为BamHI和SalⅠ。根据说明书得该反应体系中最佳的克隆载体和插入片段使用量摩尔比为1:2，最适使用量使用如下公式计算：
最适克隆载体使用量＝[0.02×克隆载体碱基对数]ng(0.03pmol)
最适插入片段使用量＝[0.04×插入片段碱基对数]ng(0.06pmol)
经计算，本反应体系组成如表3所示：
表3同源重组反应体系组成
所有组分添加完成后，轻柔吸打以便混匀反应液，随后瞬时离心，于37℃孵育30分钟后即得到pMAL-c2X-LbUGT71BX2重组产物。
重组产物的转化步骤如下：(1)取Trans1-T1感受态细胞(购自北京全式金生物技术有限公司，产品目录号为CD501-02)于冰上解冻。取50μL解冻后的Trans1-T1感受态细胞分装于提前预冷的1.5mL离心管中。(2)向离心管中加入5μL重组产物，轻轻混匀，冰浴30分钟。(3)42℃水浴热激30秒后，快速转移至冰浴中2分钟，过程中不摇动离心管。(4)吸取50μL已转化的感受态细胞，均匀涂于氨苄抗性的LB琼脂培养基上，倒置平板于37℃培养箱中培养12-16小时。
阳性克隆的筛选步骤如下：(1)挑取7个LbUGT重组平板上生长的单克隆于含200μLLB液体培养基(氨苄抗性)中，37℃摇床中培养2小时(200rpm)。(2)使用2×Taq Mix DNA聚合酶(购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司，产品目录号为P131-01)进行菌落PCR鉴定。使用Primer 6.0设计的扩增引物序列为：pMAL-c2X-F:GTCGTCAGACTGTCGATGAAG；pMAL-c2X-R:GATGTGCTGCAAGGCGATT。常规PCR反应体系如表4所示。常规PCR反应程序如表5所示。(3)取5μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，参照DNA Marker(购自北京全式金生物技术有限公司，产品目录号为BM111-01)位置，挑取条带位置合理的菌液送至北京诺赛基因组研究中心有限公司进行检测。与RNAseq序列比对，从而获得最终序列信息。
表4常规PCR反应体系组成
表5常规PCR反应程序
2.2实验结果
利用表1引物克隆得到LbUGT71BX2，使用琼脂糖凝胶电泳检测结果如图3所示。经测序得到其序列，Blast比对发现核苷酸序列与原数据99％相似度，以实际测序结果为准。实际测序结果如序列1所示，含有1446个核苷酸，其编码序列表中序列2所示的蛋白由481个氨基酸组成。将该基因命名为LbUGT71BX2，将其编码的蛋白命名为LbUGT71BX2。
实施例3、候选LbUGT71BX2基因的功能验证
3.1实验方法
重组质粒的转化步骤如下：(1)取BL21(DE3)感受态细胞(购自天根生化科技(北京)有限公司，产品目录号为CB105-02)于冰上解冻。取50μL解冻后的BL21(DE3)感受态细胞分装于提前预冷的1.5mL离心管中。(2)向离心管中加入5μL pMAL-c2X-LbUGT71BX2重组质粒，轻轻混匀，冰浴30分钟。(3)42℃水浴热激90秒后，快速转移至冰浴中2分钟，过程中不摇动离心管。(4)吸取50μL已转化的感受态细胞，均匀涂于氨苄抗性的LB琼脂培养基上，倒置平板于37℃培养箱中培养12-16小时。
诱导表达步骤如下：(1)挑取转化的LB固体培养基上的单克隆，进行菌落常规PCR验证，方法同上。(2)吸取80μL阳性克隆菌液于20mL LB液体培养基(氨苄抗性)中过夜培养(37℃，200rpm)。(3)吸取2mL过夜培养的菌液转接至40mL LB液体培养基(氨苄抗性)中，以37℃，200rpm的条件培养至菌液OD600为0.8(约2小时)。(4)加入15μL IPTG
(1M，异丙基-β-D-硫代半乳苷)于菌液中，摇匀，以16℃，110rpm条件诱导培养16-24小时。
蛋白纯化步骤如下：收集诱导后的菌液，4℃，7800rpm离心5分钟，弃上清；使用3mL预冷后的Tris-HCl(pH 7.5)洗涤菌沉淀，4℃，7800rpm离心3分钟，弃上清。加入1.5mLTris-HCl(pH 7.5)缓冲液重悬菌体，并转移至2mL离心管中。使用超声细胞破碎仪(30Hz，工作5秒，停止5秒)破碎重悬菌液20分钟，颜色由乳白色变为半透明色，整个过程置于冰上进行。破碎后的重悬菌液于4℃，12000rpm离心30分钟，上清即为粗酶溶液。
蛋白纯化过程参照PurKineTM麦芽糖结合蛋白标签蛋白纯化试剂盒(购自亚科因生物技术有限公司，产品目录为KTP2020)说明书，整个过程置于4℃冰箱进行，具体过程如下：(1)固定重力柱，取下两端塞子，流干保护液；(2)向柱中加入2mL洗涤液(Binding buffer)平衡树脂，流干后再重复3次；(3)粗酶溶液和等体积洗涤液混合制成蛋白样本。将蛋白样本加入柱中孵育，收集流穿液，重复5次；(4)向柱中加入2mL洗涤液，去除非特异性蛋白，重复6次，过程中使用考马斯亮蓝溶液检测蛋白的含量。(5)向柱中加入2mL洗脱液(ElutionBuffer)，洗脱特异性蛋白(含麦芽糖标签)，重复5次，过程中使用考马斯亮蓝溶液检测蛋白的含量。此步骤收集的洗脱液即为纯化蛋白溶液。(6)脱盐和浓缩处理：将纯化蛋白溶液加入到超滤管(30kDa)中，4℃，3800×g离心30分钟后，分批共补充10mL蛋白置换液(50mMTris-HCl(pH 7.5)，10mM DTT)于管中，再次离心。吸取管中剩余的溶液，即为脱盐后的纯化酶溶液。(7)使用Easy Protein Quantitative Kit(Bradford)蛋白浓度测定试剂盒(购自北京全式金生物股份有限公司，产品目录为DQ101-01)，建立蛋白浓度标准曲线，参照其使用说明对浓缩后的蛋白浓度进行测定。(8)SDS-PAGE蛋白胶检测：取80μL纯化酶溶液加入20μL 5×蛋白上样缓冲液，混匀后煮沸5分钟，12000rpm离心5分钟。取40μL上清上样，电泳条件为150V，时间为40-50分钟，直至溴酚蓝指示带到达硅胶底部，即可结束电泳。染色30分钟后，置于脱色液中1小时，随后更换脱色液进行过夜脱色。次日将蛋白凝胶置于扫描仪中成像。
体外酶活性检测步骤如下：50μL反应体系中包含1μL黄酮底物(40mM)(山奈酚或杨梅素或棉花素或槲皮万寿菊素)，1μL UDP-糖供体(100mM)(UDP-半乳糖或UDP-葡萄糖)和10μg纯化酶，Tris-HCl(pH7.5)缓冲液被用于补足体系。以含有pMAL-c2X空载的粗酶催化体系为阴性对照，将反应体系置于37℃反应1小时，加入等体积甲醇终止反应。将上述混合液真空浓缩，加入100μL甲醇复溶。使用0.22μm微孔滤膜进行过滤，样品转移至液相小瓶中用于检测分析。使用Agilent 1290Infinity II-6430Q-TOF对样品进行检测，具体液相条件为：(1)色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18 1.7μm 2.1×100mm；(2)流动相：A相为0.1％纯水，B相为色谱乙腈；(3)流速：0.3mL/分钟(4)柱温：40℃；(5)进样量：1.0μL；(6)洗脱条件如表6所示。质谱条件为：离子模式为负离子，扫描范围为100-3000；模式为Automated MS/MS；离子碎片碰撞能量为20V；源温度350℃；雾化器压力设为30psi。
表6LC-Q-TOF检测时流动相洗脱梯度
3.2实验结果
pMAL-c2X-LbUGT71BX2的重组蛋白成功转入大肠杆菌(图4)，并表达出重组蛋白(图5)，进一步酶活分析来鉴定了它们的功能。酶活反应的供体分别为UDP-葡萄糖或UDP-半乳糖，受体分别为山奈酚(C15H10O6，购自上海源叶生物科技有限公司，产品目录号：B21126)或杨梅素(C15H10O8，购自上海源叶生物科技有限公司，产品目录号：B21458)或棉花素(C15H10O8，购自上海源叶生物科技有限公司，产品目录号：B29179)或槲皮万寿菊素(C15H10O8，购自上海源叶生物科技有限公司，产品目录号：B29299)。利用质谱鉴定酶活产物，发现LbUGT71BX2对于受体为山奈酚、杨梅素、棉花素和槲皮万寿菊素的酶活反应均有产物峰(P1-P8)。
与含有pMAL-c2X空载的粗酶催化体系检测结果相比，当以山奈酚为底物，UDP-半乳糖为糖供体时，产物P1具有和山奈酚-3-O-半乳糖苷(K3Gal)相同的保留时间和质谱裂解规律([M-H]-:m/z＝447.0935、[M-H-Gal]-:m/z＝284.0325)；当以山奈酚为底物，UDP-葡萄糖为糖供体时，产物P2具有和山奈酚-3-O-葡萄糖苷(K3Glu)相同的保留时间和质谱裂解规律([M-H]-:m/z＝447.0920、[M-H-Glu]-:m/z＝284.0315)(图6)。
与含有pMAL-c2X空载的粗酶催化体系检测结果相比，当以杨梅素为底物，UDP-半乳糖为糖供体时，产物P3具有和杨梅素-3-O-半乳糖苷(M3Gal)相同的保留时间和质谱裂解规律([M-H]-:m/z＝479.0830、[M-H-Gal]-:m/z＝316.0224)；当以杨梅素为底物，UDP-葡萄糖为糖供体时，产物P4依据裂解规律判定为杨梅素-3-O-葡萄糖苷(M3Glu)([M-H]-:m/z＝479.0828、[M-H-Glu]-:m/z＝316.0226)，P5具有和杨梅素-7-O-葡萄糖苷(M7Glu)相同的保留时间和质谱裂解规律([M-H]-:m/z＝479.0832、[M-H-Glu]-:m/z＝317.0303)(图7)。
与含有pMAL-c2X空载的粗酶催化体系检测结果相比，当以棉花素为底物，UDP-葡萄糖为糖供体时，产物P6依据裂解规律判定为棉花素-3-O-葡萄糖苷(G3Glu)([M-H]-:m/z＝479.0868、[M-H-Glu]-:m/z＝316.0243)(图8)。
与含有pMAL-c2X空载的粗酶催化体系检测结果相比，当以槲皮万寿菊素为底物，UDP-葡萄糖为糖供体时，产物P7依据裂解规律判定为槲皮万寿菊素-3-O-葡萄糖苷(Q3Glu)([M-H]-:m/z＝479.0823、[M-H-Glu]-:m/z＝316.0226)，P8具有和槲皮万寿菊素-7-O-葡萄糖苷(Q7Glu)相同的保留时间和质谱裂解规律([M-H]-:m/z＝479.0797、[M-H-Glu]-:m/z＝317.0305)(图9)。
综上，基于质谱检测数据，确定糖基转移酶LbUGT71BX2具有催化山奈酚生成山奈酚-3-O-葡萄糖苷/半乳糖苷、催化杨梅素生成杨梅素-3-O-葡萄糖苷/半乳糖苷和杨梅素-7-O-葡萄糖苷、催化棉花素生成棉花素-3-O-葡萄糖苷、催化槲皮万寿菊素生成槲皮万寿菊素-3/7-O-葡萄糖苷的功能。
本发明主要是通过三代全长转录组分析，获得珠芽艾麻中黄酮糖基转移酶序列，并通过原核表达重组蛋白，确认重组蛋白LbUGT71BX2以UDP-葡萄糖为供体时，可以催化山奈酚生成山奈酚-3-O-葡萄糖苷、催化杨梅素生成杨梅素-3/7-O-葡萄糖苷、催化棉花素生成棉花素-3-O-葡萄糖苷、催化槲皮万寿菊素生成槲皮万寿菊素-3/7-O-葡萄糖苷的产生；以UDP-半乳糖为供体时，可以催化山奈酚生成山奈酚-3-O-半乳糖苷、催化杨梅素生成杨梅素-3-O-半乳糖苷的产生。
上述具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限制。本领域技术人员应该明白的是，取决于设计要求和其他因素，可以发生各种各样的修改、组合、子组合和替代。任何在本发明的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明保护范围之内。

Claims (8)

1.一种蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.权利要求1所述蛋白的编码基因，其特征在于：所述编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示。
3.含有权利要求2所述编码基因的表达盒、重组表达载体或重组菌。
4.扩增权利要求2所述编码基因全长的引物对，所述引物对中，一条引物序列如SEQ IDNO:3所示，另一条引物序列如SEQ ID NO:4所示。
5.权利要求1所述的蛋白在作为糖基转移酶中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述糖基转移酶为具有如下任一功能的酶：
(1)当以UDP-半乳糖为糖供体时，催化底物山奈酚生成山奈酚-3-O-半乳糖苷；
(2)当以UDP-葡萄糖为糖供体时，催化底物山奈酚生成山奈酚-3-O-葡萄糖苷；
(3)当以UDP-半乳糖为糖供体时，催化底物杨梅素生成杨梅素-3-O-半乳糖苷；
(4)当以UDP-葡萄糖为糖供体时，催化底物杨梅素生成杨梅素-3-O-葡萄糖苷；
(5)当以UDP-葡萄糖为糖供体时，催化底物棉花素生成棉花素-3-O-葡萄糖苷；
(6)当以UDP-葡萄糖为糖供体时，催化底物槲皮万寿菊素生成槲皮万寿菊素-3-O-葡萄糖苷或槲皮万寿菊素-7-O-葡萄糖苷。
7.权利要求1所述的蛋白在如下任一中的应用：
(1)当以UDP-半乳糖为糖供体时，催化底物山奈酚生成山奈酚-3-O-半乳糖苷；
(2)当以UDP-葡萄糖为糖供体时，催化底物山奈酚生成山奈酚-3-O-葡萄糖苷；
(3)当以UDP-半乳糖为糖供体时，催化底物杨梅素生成杨梅素-3-O-半乳糖苷；
(4)当以UDP-葡萄糖为糖供体时，催化底物杨梅素生成杨梅素-3-O-葡萄糖苷；
(5)当以UDP-葡萄糖为糖供体时，催化底物棉花素生成棉花素-3-O-葡萄糖苷；
(6)当以UDP-葡萄糖为糖供体时，催化底物槲皮万寿菊素生成槲皮万寿菊素-3-O-葡萄糖苷或槲皮万寿菊素-7-O-葡萄糖苷。
8.权利要求2所述的编码基因在如下任一中的应用：
(1)当以UDP-半乳糖为糖供体时，催化底物山奈酚生成山奈酚-3-O-半乳糖苷；
(2)当以UDP-葡萄糖为糖供体时，催化底物山奈酚生成山奈酚-3-O-葡萄糖苷；
(3)当以UDP-半乳糖为糖供体时，催化底物杨梅素生成杨梅素-3-O-半乳糖苷；
(4)当以UDP-葡萄糖为糖供体时，催化底物杨梅素生成杨梅素-3-O-葡萄糖苷；
(5)当以UDP-葡萄糖为糖供体时，催化底物棉花素生成棉花素-3-O-葡萄糖苷；
(6)当以UDP-葡萄糖为糖供体时，催化底物槲皮万寿菊素生成槲皮万寿菊素-3-O-葡萄糖苷或槲皮万寿菊素-7-O-葡萄糖苷。
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