CN103614358A

CN103614358A - 郁金香查尔酮异构酶TfCHI蛋白及其编码基因

Info

Publication number: CN103614358A
Application number: CN201310529333.9A
Authority: CN
Inventors: 袁媛; 史益敏; 唐东芹; 马晓红
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2012-10-31
Filing date: 2013-10-30
Publication date: 2014-03-05
Anticipated expiration: 2033-10-30
Also published as: CN102978194A; CN103614358B

Abstract

本发明涉及一种郁金香查尔酮异构酶TfCHI蛋白及其编码基因，所述蛋白质为由如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质或如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有郁金香查尔酮异构酶活性的蛋白质。本发明还提供了一种编码上述蛋白质的如SEQ ID NO.3所示的核酸序列；利用本发明的郁金香查尔酮异构酶基因，通过各种常规筛选方法，能筛选出与查尔酮异构酶TfCHI相关发生相互作用的物质、受体、抑制剂或拮抗剂等。利用本发明的郁金香查尔酮异构酶基因，为通过基因工程改变花色，创造新花色提供了一种新途径。

Description

郁金香查尔酮异构酶TfCHI蛋白及其编码基因

技术领域

本发明涉及郁金香花色苷合成途径中的关键酶及其编码基因，具体涉及一种郁金香查尔酮异构酶TfCHI蛋白及其编码基因，属于生物学技术领域。

背景技术

查尔酮异构酶（Chalcone isomerase，CHI）是类黄酮合成途径中紧接查尔酮合成酶（CHS）的第二个酶，在CHI的催化作用下，一个查尔酮分子经过分子内反应将C-环关闭而转变为黄烷酮。该反应的一个重要特点是将黄色的查尔酮转变成了无色黄烷酮，这一点可作为研究CHI功能的一个重要生物标志。植物体内几乎所有的类黄酮类化合物都是从黄烷酮衍生而来。查尔酮异构酶是增加黄酮化合物的关键酶，黄酮化合物是一类结构相似的多酚化合物，大多具有颜色，对植物生长发育及防御敌害具有重要作用。对人类而言则具有清除自由基、抗氧化、抗癌等多种生物活性，对肿瘤和心血管等疾病的治疗与预防也有重要的药用价值。

应用基因工程技术将CHI基因导人到植物中，其表达产物可以促进有益于人体健康的黄酮类化合物的生物合成，改变花色、果色，改善口感等。具有开发应用的前景。如将矮牵牛CHI基因转入番茄并获得了转基因番茄，在其果皮中黄酮类含量比对照增加了78倍、果肉中黄烷醇增加了2l倍。将水母雪莲CHI基因转入新疆雪莲，诱导出新疆雪莲发根，在转CHI基因新疆雪莲发根中芹菜素含量比对照组提高了12倍，总黄酮量可提高4倍；通过插入转座子的方法突变康乃馨花瓣中的CHI基因，会使白色的花朵变成黄色；将CHS正义基因和CHI反义基因导人到甜橙中，转基因甜橙中苦味物质的合成量减少，水果的口味发生了改变，口感更好了。

CHI的编码基因是一个多基因家族，该基因已从多种植物中分离出来，如矮牵牛、菜豆、玉米等，但对于球根花卉郁金香（Tulipa fosteriana），CHI基因的克隆、表达模式及CHI蛋白序列目前尚不清楚。目前，未有任何与郁金香CHI蛋白及其编码基因序列相关的文献报道。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种郁金香CHI蛋白TfCHI序列以及编码上述蛋白质的核酸序列；本发明公开了郁金香TfCHI蛋白及其核酸序列在郁金香不同器官、不同发育阶段的表达模式，填补郁金香CHI基因家族成员的克隆、表达模式分析以及郁金香CHI蛋白的空白。此外，利用本发明的郁金香查尔酮异构酶基因，通过各种常规筛选方法，能筛选出与查尔酮异构酶相关发生相互作用的物质、受体、抑制剂或拮抗剂等。本发明为今后利用本发明的TfCHI基因，通过基因工程技术改变花色、创造新花色提供了一种新的途径。

一方面，本发明提供了具有郁金香查尔酮异构酶活性的蛋白质，所述蛋白质是由如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或由SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有郁金香查尔酮异构酶活性的蛋白质。该蛋白质在花朵的不同发育阶段、不同器官内的有无及活性大小存在较大差异。

优选的，所述蛋白质为SEQ ID NO.4所示氨基酸序列经过1～50个氨基酸的缺失、插入和/或取代，或者在C末端和/或N末端添加1～20个以内氨基酸而得到的序列。

进一步优选的，所述蛋白质为SEQ ID NO.4所示氨基酸序列中1～10个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成的序列。

另一方面，本发明提供了一种编码上述蛋白质的核酸序列。

优选的，所述核酸序列具体为：（a）碱基序列如SEQ ID NO.3第1～693位所示；或（b）与SEQ ID NO.3第1～693位所示的核酸有至少70%的同源性的序列；或（c）能与SEQ ID NO.3第1～693位所示的核酸进行杂交的序列。

优选的，所述核酸序列具体为SEQ ID NO.3第1～693位所示的核酸序列中1～90个核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加60个以内核苷酸形成的序列。

在本发明中，“分离的DNA”、“纯化的DNA”是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中相伴随的蛋白质分开。

在本发明中，术语“郁金香查尔酮异构酶TfCHI蛋白编码序列”指编码具有郁金香TfCHI蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3所示的第1～693位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.3所示的第1～693位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.3所示的第1～693位核苷酸序列同源性低至约70%的简并序列也能编码出SEQ ID NO.4所示的序列。该术语还包括与SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的同源性至少70%的核苷酸序列。

该术语还包括能编码天然郁金香TfCHI蛋白的相同功能、SEQ ID NO.3所示序列的变异形式。这些变异形式包括（但并不限于）：通常为1～90个核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加为60个以内核苷酸。

在本发明中，术语“郁金香查尔酮异构酶TfCHI蛋白”指具有郁金香TfCHI蛋白活性的SEQ ID NO.4所示序列的多肽。该术语还包括具有与天然郁金香TfCHI蛋白相同功能的、SEQ ID NO.4序列的变异形式。这些变异形式包括（但并不限于）：通常为1～50个氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或为20个以内氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括郁金香TfCHI蛋白的活性片段和活性衍生物。

本发明的郁金香TfCHI蛋白的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨条件下能与郁金香TfCHI相关DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用郁金香TfCHI蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。

在本发明中，“郁金香TfCHI保守性变异多肽”指与SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列相比，有至多10个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。

表1

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val;Leu;Ile	Val
Arg(R)	Lys;Gln;Asn	Lys
			Asn(N)	Gln;His;Lys;Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro;Ala	Ala
			His(H)	Asn;Gln;Lys;Arg	Arg
Ile(I)	Leu;Val;Met;Ala;Phe	Leu
			Leu(L)	Ile;Val;Met;Ala;Phe	Ile
Lys(K)	Arg;Gln;Asn	Arg
			Met(M)	Leu;Phe;Ile	Leu
Phe(F)	Leu;Val;Ile;Ala;Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr

Thr(T)	Ser	Ser
			Trp(W)	Tyr;Phe	Tyr
Tyr(Y)	Trp;Phe;Thr;Ser	Phe
			Val(V)	Ile;Leu;Met;Phe;Ala	Leu

发明还包括郁金香TfCHI蛋白或多肽的类似物。这些类似物与郁金香TfCHI相关多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其它已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基（如D-氨基酸）的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸（如β、γ-氨基酸）的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述列举的代表性的多肽。

修饰（通常不改变一级结构）形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶（如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶）而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基（如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸）的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，可用实时荧光定量PCR的方法分析郁金香TfCHI基因产物的表达模式，即分析郁金香TfCHI基因的mRNA转录物在细胞中的存在与否和数量。

本发明检测样品中是否存在郁金香TfCHI相关核苷酸序列的检测方法，包括用上述的核酸序列与样品进行杂交，然后检测核酸序列是否发生了结合。该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于郁金香TfCHI相关核苷酸编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为15～50个核苷酸。

此外，根据本发明的郁金香TfCHI核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选郁金香TfCHI相关同源基因或同源蛋白。

为了得到与郁金香TfCHI相关基因的点阵，可以用DNA探针筛选郁金香cDNA文库，这些探针是在低严谨条件下，用³²P对郁金香TfCHI相关的全部或部分做放射活性标记而得的。适合于筛选的cDNA文库是来自郁金香的文库。构建来自感兴趣的细胞或者组织的cDNA文库的方法是分子生物学领域众所周知的。另外，许多这样的cDNA文库也可以购买到，例如购自Clontech,Stratagene,Palo Alto,Cal.。这种筛选方法可以识别与郁金香CHI相关的基因家族的核苷酸序列。

本发明的郁金香TfCHI相关核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

当获得了有关序列后，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

除了用重组法产生之外，本发明蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽而加以生产（Stewart等人，（1969）固相多肽合成，WH Freeman Co.,San Francisco;Merrifield J.（1963）J.Am Chem.Soc85:2149-2154）。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成仪（Foster City，CA）来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。

利用本发明的郁金香TfCHI蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与郁金香TfCHI蛋白相关发生相互作用的物质，或者受体、抑制剂或拮抗剂等。

此外，本发明郁金香查尔酮异构酶基因或其同源序列可通过植物表达载体导入植物组织、细胞或器官；用于构建所述植物表达载体的出发载体可为任意一种可用于根癌农杆菌转化植物的双元载体或可用于植物微弹轰击的载体等。如pBin系列载体、pBI系列载体、Gateway^TM系列载体、pCAMBIA系列载体或其它衍生植物表达载体，所述的出发载体还可以为在原核生物中复制的载体，如pENTER-TOPO、pUC系列载体等。

使用本发明中郁金香查尔酮异构酶基因或其同源序列构建表达载体时，在其转录超始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子。组成型启动子可为花椰菜花叶病毒（CAMV）35S启动子等；组织特异性启动子可以为根、叶片、花、种子等特异性表达启动子；诱导型启动子可为受乙烯、书醇等诱导的启动子。上述启动子可以单独使用或与其它植物启动子结合使用。此外，利用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物基因、具抗性的抗生素标记物基因、或是抗化学试剂标记基因等。所述含新霉素磷酸转移酶（NPTII）基因的宿主植物细胞、组织或器官可由卡那霉素或其替代衍生物等进行筛选，含潮霉素转移酶基因的宿主植物细胞、组织或器官可由潮霉素进行筛选。经上述方法进行筛选后还可采用Southern、PCR或点杂交等分子检测手段对转基因植株进行检测，以确定其是否转化有目的基因。

本发明首次克隆郁金香类黄酮生物合成途径中增加黄酮化合物的关键酶查尔酮异构酶TfCHI蛋白的编码序列，并采用荧光实时定量PCR的方法分析TfCHI基因的表达模式。此外，本发明中通过原核表达分离TfCHI蛋白，近一步将TfCHI与查耳酮进行孵育，生成了黄烷酮，表明TfCHI的确具备查尔酮异构酶的活性，能利用本发明的郁金香查尔酮异构酶基因，通过各种常规筛选方法，能筛选出与查尔酮异构酶相关发生相互作用的物质、受体、抑制剂或拮抗剂等。此外，可利用本发明的TfCHI，为通过基因工程改变花色、创造新花色提供了一种新的途径。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为本发明的郁金香TfCHI基因与美洲油棕查尔酮异构酶基因mRNA的核苷酸序列的同源比较(GAP)结果；

图2为本发明的郁金香TfCHI蛋白与美洲油棕查尔酮异构酶的氨基酸序列的同源比较（FASTA）结果，其中，相同的氨基酸在两个序列之间用氨基酸单字符标出。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册（New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、郁金香TfCHI基因的克隆

1.植物材料的获得

将健康、大小一致的郁金香球茎（Tulipa fosteriana‘Shangnongzaoxia’，已通过上海市农作物品种审定委员会审定。编号：沪农品认花卉2011第004号）按常规种植并进行田间管理，待花朵完全开放，花瓣完全着色时采集花瓣组织，用于提取RNA；

2.RNA的抽提

用“RNA prep pure植物总RNA提取试剂盒”抽提总RNA（RNA prep pure Plant Kit：天根生化科技（北京）有限公司），用甲醛变性胶电泳鉴定RNA的完整性，然后在分光光度计（Thermo Scientific NANODROP1000Spectrophotometer）上测定RNA的纯度及浓度；

3.基因的全长克隆

根据其它物种中CHI基因的氨基酸保守序列，利用同源性基因克隆原理，采用RACE方法（3’-Full RACE Core Set Ver.2.0：宝生物工程（大连）有限公司，SMARTer^TM RACEcDNA Amplification Kit:Clontech Laboratories,Inc.）进行cDNA全长克隆，分三个阶段进行：

（1）RT-PCR获得基因中间片段

将提取的RNA进行反转录（Prime ScriptⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit:宝生物工程（大连）有限公司），以第一链cDNA为模板，利用引物F1（SEQ ID NO.1）和R1（SEQ ID NO.2）进行PCR，扩增得到338bp片段，回收并连接到pMD18-T Simplevector载体上，用RV-M和M13-47作为通用引物，采用终止物荧光标记（Big-Dye，Perkin-Elmer，USA）的方法，在ABI377测序仪（Perkin-Elmer，USA）上进行测序，测序结果通过在NCBI网站进行BLAST（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）比对已有的数据库（GenBank），知其核酸序列及编码蛋白与已知的美洲油棕属查尔酮异构酶基因的同源性很高，初步认为它是一个查尔酮异构酶基因；

（2）3’RACE

二轮巢式PCR完成3’末端序列的扩增。

第一轮：Outerprimer+CHI3-1（5’-TTCACCCAGTCCCCTTCAGGTTCAC-3’）

第二轮：Innerprimer+CHI3-2（5’-TCTCTCAGAGGCAGTATTGGAGTCG-3’）

Outerprimer和Innerprimer为试剂盒提供。3’RACE得到TfCHI的3’末端序列（372bp），回收，连接到pMD18-T Simple vector载体上，用RV-M和M13-47作为通用引物，采用终止物荧光标记（Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI377测序仪（Perkin-Elmer，USA）上进行测序，测序结果通过在NCBI网站进行BLAST（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）比对已有的数据库（GenBank），知其核酸序列及编码蛋白与已知的美洲油棕属查尔酮异构酶基因的同源性很高；

（3）5’RACE

以5’RACE ready cDNA为模板，通过二轮巢式PCR完成5’末端序列的扩增，

第一轮：UPM+CHI5-1（5’-TCGTGAGTGAACCTGAAGGGGACTGGG-3’）

第二轮：NUP+CHI5-1（5’-CTGCTCGGCTGCAACACCTTCAGCTTC-3’）

UPM和NUP为试剂盒提供。5’RACE得到郁金香TfCHI基因的5’末端序列（450bp），回收连接后用同上面一样的方法进行测序，将通过上述3种方法获得的序列的测序结果进行拼接，将拼接序列提交BLAST分析，结果证明从郁金香中新得到的TfCHI基因的确为一个与查尔酮异构酶相关的基因，将测序结果结合NCBI的ORF Finding（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf）预测，发现了郁金香TfCHI基因的起始密码子与终止密码子，根据获得的序列，分别从起始密码子和终止密码子处设计特异性引物ORF-F（5’-ATGGCAGCAGTCGCGCCCAAGCTTG-3’），ORF-R（5’-TCACACAGAGACAGTGGCGGGTAGC-3’），以郁金香cDNA为模板进行PCR，扩增得到693bp郁金香TfCHI蛋白的全长编码序列（SEQ ID NO.3）。

实施例2、郁金香TfCHI基因的序列信息与同源性分析

本发明新的郁金香TfCHI基因全长开放读码框序列为693bp，详细序列见SEQ ID NO.3所示序列。根据开放读码框序列推导出郁金香TfCHI的氨基酸序列，共230个氨基酸残基，分子量为24374.9道尔顿，等电点（pI）为5.15，详细序列见SEQ ID NO.4所示序列；

将郁金香TfCHI的开放读码框序列及其编码蛋白的氨基酸序列用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDS translations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现它与美洲油棕CHI基因（GenBank登录号为FJ940770.1）在核苷酸水平上具有75%的相同性，如图1所示（Query：郁金香查尔酮异构酶TfCHI的编码基因序列；Sbjct：美洲油棕查尔酮异构酶的mRNA序列）；在氨基酸水平上，它与美洲油棕CHI基因（GenBank登录号ACQ41836.1）也有76%的一致性和86%的相似性，如图2所示（Query：郁金香查尔酮异构酶TfCHI的氨基酸序列；Sbjct：美洲油棕查尔酮异构酶的氨基酸序列）。由此可见，郁金香TfCHI基因与美洲油棕CHI基因无论从核酸还是蛋白水平上都存在较高的同源性。

实施例3、郁金香TfCHI基因在花朵不同发育阶段以及在郁金香不同组织中的表达差异性

1.材料的获得：在郁金香花朵的4个不同发育阶段（花蕾，花瓣未着色；花蕾，花瓣开始着色；花朵部分开放，花瓣未完全着色；花朵完全开放，花瓣完全着色），于田间采取其花瓣，同时采取其叶片、地上茎、花部器官雄蕊、雌蕊、花瓣（各着色阶段花瓣的混合样），将样品分别用铝铂纸包好后立刻投入液氮中，接着转入-80℃超低温冰箱中贮存待用；

2.RNA的提取：利用RNA prep pure植物总RNA提取试剂盒（RNA prep pure PlantKit：天根生化科技（北京）有限公司）提取郁金香不同发育阶段花朵的花瓣以及不同组织中的RNA；

3.RNA的完整性、纯度、浓度的确定：用普通琼脂糖凝胶电泳（胶浓度1.2%；0.5×TBE电泳缓冲液；150v，15min）检测完整性，电泳条带中最大rRNA亮度应为第二条rRNA亮度的1.5～2.0倍，否则表示rRNA样品的降解；纯度较好的RNA，A₂₆₀/A₂₈₀以及A₂₆₀/A₂₃₀约为2.0左右，用分光光度计测定OD值并计算RNA含量；

4.cDNA的获得：以500ng的总RNA为模板，按照宝生物公司TaKaRa PrimeScript^TMRT reagent Kit Perfect Real Time试剂盒操作说明进行反转录获得cDNA备用；

5.设计特异性引物以进行实时荧光定量PCR分析基因在各器官与组织中的表达量，根据已经获得的郁金香TfCHI基因序列，利用引物设计软件设计用于Real-time PCR中TfCHI基因定量分析的特异性引物，引物CI-F（5’-CCGCTGACTGGACAACAA-3’），引物CI-R（5’-CCCGGATTCAGGAATAGAAC-3’），内参基因为Actin（GenBank登录号AB456684），引物为Actin-F（5’-AGTCAGTCATACAGTGCCAATC-3’），Actin-R（5’-TCATAAGAGAGTCGGTCAAATCC-3’）；

6.制作目的基因及内参基因的标准曲线：用EASY Dilution（试剂盒提供）将标准品cDNA溶液进行梯度稀释，然后分别以稀释后的cDNA溶液为模板，以目的基因及内参基因的特异性引物进行Real-time PCR扩增，反应结束后绘制溶解曲线和标准曲线；分析溶解曲线，判断目的基因及内参基因的溶解曲线是否得到单一峰，以判断使用该引物能否得到单一的PCR扩增产物；通过标准曲线确定模板cDNA的合适稀释倍数；

7.待测样品中目的基因的实时荧光定量分析：以合成的cDNA第一条链为模板，分别用目的基因与内参照基因的特异性引物扩增进行荧光定量分析，Real-time PCR反应在BIO-RAD Chromo4实时定量仪上进行，反应体系为20μL，反应采用三步法，94℃变性20s，接着41个循环：94℃15s；56℃15s；72℃25s；每次扩增完成后，均做溶解曲线，以检验扩增产物是否为特异产生；

8.采用2^-△△Ct法作相对定量分析，结果表明郁金香TfCHI基因的表达水平在花朵的发育过程中先急剧下降再缓缓上升，在花蕾未着色阶段的表达量最高，当花蕾开始着色时的表达量最低，花朵完全开放、花瓣完全着色时表达水平又有所回升。其中最高表达量为最低表达量的8.73倍，说明该基因的表达与花朵的发育过程有明显的相关性，具有时间表达特异性；郁金香TfCHI基因在茎、叶、雌蕊、花瓣中有表达，但在雄蕊中检测不到转录本。TfCHI基因在茎、叶、雌蕊、花瓣中表达水平从高到低依次为茎、雌蕊、叶、花瓣，说明郁金香TfCHI基因的表达具有明显的空间差异性。

实施例4、郁金香TfCHI基因在基因组中的拷贝数分析

为了确定TfCHI基因的拷贝数，提取郁金香基因组DNA，进行Southern杂交试验。采用CTAB法大提基因组DNA,具体方法如下:

（1）取3叶片，在液氮中充分研磨，加入20ml65℃预热的2×CTAB抽提液(使用前加入2%的β-巯基乙醇)，用涡旋器充分震荡混匀，65℃保温45min，中间颠倒混匀数次；

（2）加入等体积氯仿：异戊醇（24：1），轻柔颠倒混匀，置于室温乳化10min；12000rpm离心15min（18-20℃），吸取上清于另一干净的50ml离心管；再用等体积氯仿：异戊醇（24：1）重复抽提一次，离心后吸取上清于另一干净的50ml离心管；

（3）加入等体积的在-20℃预冷过的异丙醇，充分颠倒混匀，出现DNA丝状沉淀，置于-20℃30min沉淀；

（4）用枪头将DNA勾出来溶于75%乙醇中，4℃浸泡过夜；

（5）8000rpm离心10min，沉淀于室温或60℃以下的恒温箱中干燥至出现半透明状；

（6）用2ml去离子水溶解沉淀

使用

的HindⅢ、EcoRⅠ限制性内切酶对基因组DNA进行酶切。酶切体系参照内切酶说明书，在37℃水浴条件下，酶切6h。酶切完全后于0.8%琼脂糖/溴化乙锭/1×TAE凝胶电泳至溴酚兰迁移至凝胶的五分之三距离。电泳结束后取出凝胶，用水冲洗2-3次后进行脱嘌呤、变性、和中和。脱嘌呤：胶用0.25M HCl于室温下轻微振荡10min；变性：胶用变性液变性25min，置于摇床上轻微振荡；中和：用中和液于室温下振荡30min。

凝胶的转膜和固定采用虹吸式印迹法，具体过程如下：

（1）取一搪瓷盘上架上一块长和宽大于凝胶的玻璃板，板上铺上清洁的Whatman3MM滤纸，盘中加入足量的转移缓冲液（10×SSC），滤纸两端浸在10×SSC溶液中，当滤纸湿透后，用玻璃棒赶出气泡；。10×SSC溶液配方为：氯化钠87.65g，柠檬酸钠44.1g用离子水定容到一升，pH7.0。

（2）裁一张长和宽比凝胶大1mm的HYBOND-N+尼龙膜，先用去离子水湿润，再转入10×SSC溶液至少5min；

（3）取出凝胶，点样孔向下倒置凝胶于湿润的3MM滤纸中央，排除气泡；用Parafilm膜围绕凝胶周边以防短路；

（4）将湿润的尼龙膜准确地盖在凝胶上面，膜与胶间不应有气泡；

（5）用10×SSC溶液润湿两张与尼龙膜相同大小的3MM滤纸，将湿润滤纸置于膜的上方，排除气泡；切一叠略小于3MM滤纸的纸巾置于滤纸上方，纸巾上放一块玻璃板，其上压0.5-1kg重物，水平放置转移8-24h，纸巾浸湿后应及时更换；

（6）转移结束后，翻转凝胶和尼龙膜（胶的一面向上）置于一干的3MM滤纸上，从尼龙膜上剥离凝胶弃之，用2×SSC溶液于室温浸泡滤膜5min；取出膜，使膜上的溶液滴尽后平放在纸巾上，室温晾干30min以上；

（7）晾干的膜放在2张3MM滤纸上，60℃烤干2h，备用。

DNA探针为回收纯化的TfCHI cDNA的ORF全长扩增片段，片段回收方法为将扩增TfCHI cDNA ORF全长序列电泳，紫外灯下割取DNA条带，用Sanprep柱式DNA胶回收试剂盒（上海生工生物工程有限公司）回收，回收方法参照试剂盒说明书。探针的标记、与尼龙膜的杂交、洗膜以及信号的检测均参照Amersham Gene Images AlkPhos DirectLabelling and Detection System(GE Healthcare)试剂盒中的说明书进行。

使用TfCHI基因cDNA的ORF为探针，与分别经HindⅢ、EcoRⅠ酶切后的基因组进行杂交，结果均出现2条深带和多条浅带，表明TfCHI基因在基因组中有多个拷贝。

实施例5、郁金香TfCHI酶功能验证

1.原核表达载体的构建

在扩增TfCHI基因ORF片断(SEQ ID NO.3第1～693位所示)的上下游引物两端分别加上BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点。

上游引物序列为5’-CGCGGATCCATGGCAGCAGTCGCGCCCAAG-3’，下游引物为5’-ATTCTCGAGTCACACAGAGACAGTGGCGG-3’。通过PCR扩增TfCHI cDNA的ORF片断，电泳后在紫外灯下割取目的条带，用Sanprep柱式DNA胶回收试剂盒回收片断。

使用的限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ同时对TfCHI片断和表达载体pMAL-c2x(New England BioLabs)在37℃进行双酶切，时间15min。酶切体系参照酶切说明书。对酶切产物进行凝胶电泳，回收。

使用DNA Ligation Kit试剂盒（TaKaRa,China）对酶切后的TfCHI片断和pMAL-c2x进行连接，连接方法参见试剂盒说明书。将连接产物转化大肠杆菌BL21感受态。在含50mg·l^-1氨卞的LB固体平板培养基上37℃培养过夜。挑取单菌落，PCR鉴定阳性后送测序确认TfCHI片断与pMAL-c2x成功连接。LB培养基的配方为：胰蛋白胨10g·l^-1，酵母提取物5g·l^-1，氯化钠10g·l^-1。调节pH至7.0，灭菌。LB固体培养基配方为在LB液体培养基中，加入15g·l^-1琼脂粉，灭菌。

2.TfCHI的融合蛋白诱导

挑选生长状态良好的BL21菌株单克隆，转接至10ml含50mg·l^-1氨卞的LB液体培养基中，37℃，200rpm过夜培养。按1：50的比例转接至300ml含50m g·l^-1氨卞的LB液体培养中37℃，200rpm培养至OD₆₀₀为0.8左右。将培养物转入20℃的摇床中200rpm,振荡培养1小时。加入1ml1M IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)(终浓度为1mM)，继续培养6h诱导融合蛋白表达。

将过夜培养物4℃，12000rpm离心10min，收集菌体，弃上清。用50ml裂解溶液重悬沉淀，然后冰上放置10min。在冰浴条件下，使用超声波（200-300w）破碎细胞，超声/间隔=10s/10s,6次。随后将破碎的细胞在4℃，12000rpm条件下离心30min，收集上清液用于纯化。在上清中加入1ml用裂解溶液清洗并平衡的直链淀粉树脂(Amylose resin)(New England Biolabs)，同时再向溶液加入另50ml裂解溶液，4℃孵育过夜。孵育后4℃，1000rpm离心1min后，弃上清。用50ml清洗溶液清洗树脂三次后，用1ml洗脱溶液洗脱蛋白。菌体裂解溶液的配方：20mMTris-HCl，pH8.0，200mM氯化钠，1mM PMSF，EDTA-free的蛋白酶抑制剂(Promega)，10％甘油；清洗溶液的配方：20mM Tris-HCl，pH8.0，200mM氯化钠，10％甘油；洗脱溶液的配方：20mM Tris-HCl，pH8.0，200mM氯化钠，50mM麦芽糖，10％甘油。

将收集到的TfCHI融合蛋白与底物在30℃下进行反应。反应体系体积为500μl,包含200mg TfCHI融合蛋白提取物,50Mm,pH为7.5的HEPES缓冲液（2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid，羟乙基哌嗪乙硫磺酸）和5%（V/V）的乙醇。1M HEPES缓冲液的配方：将23.8g HEPES溶于约90ml的水中，用NaOH调pH至7.5，然后用水定容至100ml。催化反应的底物分别为4，2’，4’，6’-四羟基查尔酮（10-200μM），4，2’，4’–三羟基查尔酮（2-50μM）和2’，4’-二羟基查尔酮（2-50μM）。底物均购自Indofine化工公司。分光光度计在381nm处吸光度的变化表明底物浓度的变化，从而换算为TfCHI对不同底物的催化活性。

结果显示，TfCHI在pH7.5左右的条件下对4，2’，4’，6’-四羟基查尔酮、4，2’，4’–三羟基查尔酮和2’，4’-二羟基查尔产生较高的催化活性，均能生成黄烷酮，对不同产物的催化活性间并无显著差异。表明TfCHI具有查尔酮异构酶的活性，能将底物查尔酮2’-羟基的去质子化。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims

1.一种如下（a）或（b）的蛋白质：

（a）由如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（b）SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有郁金香查尔酮异构酶活性的由（a）衍生的蛋白质。

2.如权利要求1所述的蛋白质，其特征是，所述蛋白质为SEQ ID NO.4所示氨基酸序列经过1～50个氨基酸的缺失、插入和/或取代，或者在C末端和/或N末端添加1～20个以内氨基酸而得到的序列。

3.如权利要求2所述的蛋白质，其特征是，所述蛋白质为SEQ ID NO.4所示氨基酸序列中1～10个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成的序列。

4.一种编码权利要求1所述蛋白质的核酸序列。

5.如权利要求4所述的核酸序列，其特征是，所述核酸序列具体为：

（a）碱基序列如SEQ ID NO.3第1～693位所示；

或（b）与SEQ ID NO.3第1～693位所示的核酸有至少70%的同源性的序列；

或（c）能与SEQ ID NO.3第1～693位所示的核酸进行杂交的序列。

6.如权利要求4所述的核酸序列，其特征是，所述核酸序列具体为SEQ ID NO.3第1～693位所示的核酸序列中1～90个核苷酸的缺失、插入和/或取代，或者在5’和/或3’端添加60个以内核苷酸形成的序列。