CN108251408A

CN108251408A - 查尔酮异构酶及其编码基因、表达载体与宿主菌和应用

Info

Publication number: CN108251408A
Application number: CN201810165970.5A
Authority: CN
Inventors: 孙威
Original assignee: Guizhou Education University
Current assignee: Guizhou Education University
Priority date: 2018-02-27
Filing date: 2018-02-27
Publication date: 2018-07-06
Anticipated expiration: 2038-02-27
Also published as: CN108251408B

Abstract

本发明提供了查尔酮异构酶及其编码基因、表达载体与宿主菌和应用，属于生物工程技术领域。本发明通过提供查尔酮异构酶通过首次从日本蛇根草克隆得到的查尔酮异构酶编码基因表达获得，将编码基因连接到表达载体并转入宿主菌；将查尔酮异构酶编码基因应用到调控植物花色苷或者种子颜色，具有较好的调控效果，具有实际的应用价值。

Description

查尔酮异构酶及其编码基因、表达载体与宿主菌和应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体而言，涉及查尔酮异构酶及其编码基因、表达载体与宿主菌和应用。

背景技术

花色苷化合物是一种非常重要的植物次生代谢产物，它除了可以赋予花、果实、叶片等组织颜色外，还有很多重要的功能。它可以保护植物细胞免受紫外线的伤害，抵抗病原体与食草动物，作为信号分子促进植物与微生物之间的相互作用，影响花粉的生长与发育、根瘤的产生，植物体内激素的转运等。同时大量实验已经证明花色苷与人体健康之间也有密切的关系，它具有抗氧化、抗病毒、抗细胞增殖等生物活性，已经被用于治疗动脉硬化及心脑血管等疾病。

查尔酮异构酶是花色苷化合物合成途径中的第二个关键酶，可以催化查尔酮生成具有诸多生理活性的黄烷酮。目前关于茜草目植物中CHI基因的克隆与功能研究未见任何报道，这极大地限制了人们对CHI的进化研究，同时也限制了人们对茜草目植物CHI的利用及对其花色苷生物合成的调控与改良，从分子和基因角度研究茜草目植物尤其是日本蛇根草查尔酮异构酶基因的报道还没有。

发明内容

本发明的第一目的在于提供查尔酮异构酶，该查尔酮异构酶作为花色苷合成途径的关键酶，能控制植物色素的合成。

本发明的第二目的在于提供编码上述查尔酮异构酶的编码基因。

本发明的第三目的在于提供含有上述查尔酮异构酶的编码基因的重组表达载体。

本发明的第四目的在于提供含有上述查尔酮异构酶的编码基因的重组宿主菌。

本发明的第五目的在于提供上述的查尔酮异构酶的编码基因在调控植物花色苷合成中的应用。

本发明的第六目的在于提供上述查尔酮异构酶的编码基因在调控植物种子颜色中的应用。

为了实现本发明的上述目的，采用以下技术方案：

查尔酮异构酶，查尔酮异构酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

编码上述的查尔酮异构酶的编码基因。

含有上述的查尔酮异构酶的编码基因的重组表达载体。

含有上述的查尔酮异构酶的编码基因的重组宿主菌。

上述的查尔酮异构酶的编码基因在调控植物花色苷合成中的应用。

上述的查尔酮异构酶的编码基因在调控植物种子颜色中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明通过提供查尔酮异构酶通过首次从日本蛇根草克隆得到的查尔酮异构酶编码基因表达获得，将编码基因连接到表达载体并转入宿主菌；将查尔酮异构酶编码基因应用到调控植物花色苷或者种子颜色，具有较好的实际应用价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例1提供的查尔酮异构酶序列比对结果图；

图2为本发明实施例1提供的系统进化树结果图；

图3为本发明实施例2提供的查尔酮异构酶原核表达结果图；

图4为本发明实施例3提供的查尔酮异构酶酶活检测结果图；

图5为本发明实验例1提供的转基因植物表型图；

图6为本发明实验例1提供的OjCHI转基因植物RT-PCR检测结果图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

花色苷是影响植物颜色呈现的最主要色素物质之一，它可以赋予植物从红色到紫色等一系列不同颜色。研究显示花色苷除可以赋予花、果实等组织颜色外，其还有很多重要的功能。它可以保护植物细胞免受紫外线的伤害，抵抗病原体与食草动物，作为信号分子促进植物与微生物之间的相互作用，影响花粉的生长与发育、植物体内激素的转运等。另外大量实验已经证明花色苷与人体健康之间也有密切的关系，它具有抗氧化、抗病毒、抗细胞增殖等生物活性，已经被用于治疗动脉硬化及心脑血管等疾病，是现阶段研究者们重点关注的次生代谢产物之一。花色苷是由编码其合成的结构基因控制合成的，在矮牵牛中，降低CHI-A的活性，会导致柚皮素查尔酮(黄色)的大量积累，从而导致花粉的颜色从白色变为黄色、或者由蓝色变为绿色；RNA干扰抑制甘蓝型油菜CHI基因家族后，转基因油菜的种皮颜色、花瓣颜色都明显变浅。由此表明，CHI是影响植物花色苷合成的重要关键酶，同时其也是改良植物颜色表型及有益保健成分(花色苷)的靶点酶。

下面对本发明实施例的查尔酮异构酶及其编码基因、表达载体与宿主菌和应用进行具体说明。

编码上述的查尔酮异构酶的编码基因。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，编码基因的碱基序列如SEQ ID NO.2所示。

含有上述的查尔酮异构酶的编码基因的重组表达载体。

含有上述的查尔酮异构酶的编码基因的重组宿主菌。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，重组宿主菌为农杆菌。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，植物为拟南芥或日本蛇根草。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，植物种子为拟南芥的种子。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供一种查尔酮异构酶，该查尔酮异构酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，推测蛋白质分子量是25.018kD，等电点为4.95。

本实施例还提供一种查尔酮异构酶的编码基因，查尔酮异构酶的编码基因的碱基序列如SEQ ID NO.2所示。

查尔酮异构酶的编码基因是根据日本蛇根草花瓣组织的转录组测序结果设计的引物，扩增控制日本蛇根草花色苷合成的CHI基因的cDNA，然后通过PCR扩增得到。

与苜蓿的已知晶体结构的查尔酮异构酶CHI进行比对分析，结果表明日本蛇根草的CHI具有查尔酮异构酶普遍存在的活性位点，结果如图1所示，CHI-MEDICAGO.PRO表示苜蓿查尔酮异构酶氨基酸序列，CHI-OPHIORRHIZA.PRO表示日本蛇根草查尔酮异构酶的氨基酸序列；从图中可以看出，日本蛇根草查尔酮异构酶的氨基酸序列和苜蓿查尔酮异构酶氨基酸序列相似度较高。随后，将不同植物来源的查尔酮异构酶CHI的氨基酸序列与日本蛇根草查尔酮异构酶OjCHI进行多序列比对，并完成系统进化树的构建，结果如图2所示，OjCHI与I型查尔酮异构酶归为一类，这一结果与氨基酸比对中OjCHI具有5个酶活性位点比较结果是一致的。

实施例2

本实施例提供一种查尔酮异构酶基因的功能的研究，包括通过基因体外表达进一步验证和测定。

重组质粒的构建：利用克隆得到的全长日本蛇根草查尔酮异构酶OjCHI基因的cDNA作为模板，以分别带有BamH I和Hind III酶切位点的引物进行OjCHI开放阅读框的PCR扩增。分别利用BamHI和HindIII两种限制性内切酶双酶切上述扩增得到的DNA片段，并将其连接克隆到pET-32a载体上。这样构建的重组质粒命名为pET32-OjCHI，并导入宿主细胞大肠杆菌BL21(DE3)细胞中，准备可溶性重组蛋白的大量制备。

可溶性重组查尔酮异构酶蛋白的原核表达；

将上述大肠杆菌划线接种于含Amp的LB固体培养基中，37℃恒温培养箱倒置培养12-16h。挑取克隆，过夜培养。次日按1％的接菌量将菌液接种于5mL含有LB液体培养基的试管中，200rpm，37℃，震荡培养，每半小时拿出一支，4℃暂时保存。其中一只试管不接菌，作空白对照。将各个时间段的菌液取出2mL，测定OD600值，每个时间点重复测三次，绘制生长曲线，结果显示在2h后大肠杆菌进入生长对数期，在2.5h时生长速度最快，菌的状态最佳，所以选择2.5h后对该菌进行IPTG诱导。经不同IPTG浓度及不同诱导时间的摸索，最终确定该蛋白的最佳诱导条件为25℃，IPTG浓度为0.05mM下诱导12h。

按照上述条件大量制备蛋白，并通过镍柱与咪唑洗脱对目的蛋白进行分离与纯化，将洗脱后得到的蛋白进行大量收集并完成透析，利用变色硅胶在低温条件下完成目的蛋白的浓缩，将得到的目的蛋白保存于-80℃冰箱中，待酶活检测。

对诱导表达的蛋白进行PAGE检验，具体实验结果如图3所示，图中，1表示蛋白Marker，2表示空载体菌，3表示未经IPTG诱导的重组载体，4表示重组蛋白纯化前，5表示重组蛋白纯化后的结果；从图中可以看出，经IPTG诱导，重组菌可以大量表达得到目的蛋白查尔酮异构酶。

实施例3

由于异源的原核表达容易导致酶失活，主要是因为日本蛇根草查尔酮异构酶属于植物真核基因的表达产物，而大肠杆菌是属于原核表达系统，不同的表达系统，可能在蛋白后期的折叠加工不一样，从而导致蛋白失活，因此蛋白表达成功也不一定会使蛋白具有相应的生物活性；因此需要进行生物活性的验证；另外由于密码子的偏好性，也有可能导致蛋白表达失败，因此可以基于本发明提供克隆的日本蛇根草查尔酮异构酶的基因序列进行序列密码子优化；使得原核表达的效率提高。

以柚皮素查尔酮为底物，反应体系为查尔酮异构酶CHI蛋白(2mg/mL)5μL，柚皮素查尔酮(1mg/mL)5μL，50mM磷酸钾(pH7.5)40μL，30℃条件下反应5min后,利用HPLC检测反应产物。洗脱条件如下：50％甲醇48％水2％乙酸，40℃，流速0.8mL/min，等度洗脱，同时在304nm条件下进行检测。

结果如图4所示，当仅添加柚皮素查尔酮(NC)作为底物的时候进行检测，图中表现出柚皮素查尔酮(NC)峰；当添加查尔酮异构酶CHI蛋白OjCHI后，通过HPLC检测，检测到柚皮素(NA)的信号，而未能检测到柚皮素查尔酮(NC)信号，说明添加查尔酮异构酶CHI蛋白OjCHI后，柚皮素查尔酮(NC)转变成了柚皮素(NA)，说明添加的查尔酮异构酶CHI蛋白OjCHI具有生物活性。说明通过原核表达获得的查尔酮异构酶CHI蛋白OjCHI能够催化柚皮素查尔酮(NC)反应生成柚皮素(NA)，证明日本蛇根草OjCHI具有查尔酮异构酶活性。

实验例1

本实验例验证日本蛇根草OjCHI基因对植物花色苷合成的影响，本实验例中选用模式植物拟南芥进行相关实验，同时日本蛇根草OjCHI基因对植物花色苷合成的影响，也可以选择其它的植物，尤其是日本蛇根草，但是由于模式植物使用广泛，因此本实验例优选拟南芥实验。

双元表达载体的构建

为验证OjCHI基因对拟南芥花色苷合成的影响，利用克隆得到的全长OjCHI基因作为模板，分别带有BamH I和Xba I酶切位点的引物进行OjCHI基因开放阅读框的PCR扩增。分别利用BamH I和Xba I两种限制性内切酶酶切上述扩增得到的DNA片段，并将其克隆到pBI121载体上。这样构建的重组质粒命名为pBI121-OjCHI，并将重组质粒pBI121-OjCHI通过热激法导入宿主菌农杆菌GV3101感受态细胞中，并筛选得到阳性的重组农杆菌，并将重组农杆菌采用花序浸染法进行拟南芥的遗传转化。

首先将OjCHI基因导入拟南芥突变体中进行初步功能验证。

利用上述构建好的重组质粒pBI121-OjCHI，通过农杆菌浸染液浸染拟南芥，受体材料为Columbia背景的CHI突变体植株，通过Kan抗性筛选获得过表达转基因植株。将转基因植株单株培养，并收集种子，将收取的种子种在含有抗性的花色苷诱导培养基上，观察T2代幼苗的表型变化并收获T2代的种子进行显微观察。

结果如图5所示，与突变体植株相比，转基因植株子叶与下胚轴中的花色苷得到成功恢复，而突变体没有花色苷的合成；从收获的种子可以看出，突变体种子中几乎没有原花青素，而OjCHI转基因植株获得的种子几乎能较大程度的恢复原花青素的合成。

另外，提取野生型、CHI突变体以及OjCHI转基因植株叶片中的总RNA，并通过RT-PCR验证，结果如图6所示，在转基因植株中成功检测到OjCHI，而野生型与突变体中没有检测到OjCHI。

通过酶活检测分析发现，OjCHI可以催化柚皮素查尔酮转化生成柚皮素，证明我们克隆得到的OjCHI确实是查尔酮异构酶。同时，当OjCHI基因转入拟南芥突变体后，可以使拟南芥突变体子叶和下胚轴中的花色苷及种子中的原花青素的合成得到恢复。

此外，通过分析该基因在日本蛇根草转录组测序中的表达量显示：在花色苷积累的组织中该基因表达量高，而在花色苷积累不明显的组织中表达量相对较低。同时伴随日本蛇根草花朵发育过程中，该基因的表达量与花色苷含量变化呈正相关。综上所述，说明克隆得到的日本蛇根草OjCHI基因可以控制日本蛇根草花色苷的合成，同时可应用于其它植物花色苷的改良。

以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 贵州师范大学

<120> 查尔酮异构酶及其编码基因、表达载体与宿主菌和应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 233

<212> PRT

<213> Ophiorrhiza japonica

<400> 1

Met Ser Gly Ser Ser Ile Ser Ile Asn Glu Val Gln Val Asp Ser His

1 5 10 15

Val Phe Pro Ser Ala Val Asn Ala Pro Gly Ser Lys Gly Thr Phe Phe

20 25 30

Leu Gly Gly Ala Gly Val Arg Gly Leu Glu Ile Glu Gly Lys Phe Ile

35 40 45

Lys Phe Thr Ala Ile Gly Val Tyr Leu Glu Glu Ser Ala Ile Pro Trp

50 55 60

Leu Ala Cys Lys Trp Lys Gly Lys Ser Ala Tyr Glu Leu Met Asp Ser

65 70 75 80

Val Glu Phe Ser Arg Asp Ile Val Thr Gly Pro Phe Glu Lys Phe Ile

85 90 95

Gln Val Thr Phe Ile Leu Pro Leu Thr Gly Lys Gln Tyr Ser Glu Lys

100 105 110

Val Ala Glu Asn Cys Thr Ala Tyr Leu Lys Ser Val Gly Ile Tyr Ser

115 120 125

Asp Ala Glu Ala Lys Ala Ile Glu Lys Phe Leu Glu Val Phe Gln Asp

130 135 140

Glu Ser Phe Pro Pro Gly Ala Ser Val Leu Phe Thr Gln Ser Pro Val

145 150 155 160

Gly Ser Leu Thr Ile Ser Phe Ser Lys Asp Gly Thr Ile Pro Glu Val

165 170 175

Gly Asn Ala Val Ile Glu Asn Val Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Glu

180 185 190

Ser Ile Ile Gly Lys Gln Gly Val Ser Pro Ala Ala Arg Lys Ser Leu

195 200 205

Ala Glu Arg Leu Ser Glu Leu Leu Lys Gly Phe Asp Gly Ile Ala Lys

210 215 220

Glu Gly Phe Lys Glu Gly Gln Gln Leu

225 230

<210> 2

<211> 702

<212> DNA

<213> Ophiorrhiza japonica

<400> 2

atgtctggat catcaatctc catcaacgaa gttcaggtcg acagccatgt tttcccatct 60

gcagttaacg ctcctggttc taaaggaaca ttttttcttg gtggcgcagg ggtgagagga 120

ttggaaattg aaggcaagtt tatcaaattc actgctatag gagtgtactt ggaagagtct 180

gccattccat ggctggcctg taagtggaag ggcaagagtg catatgagtt gatggattcc 240

gttgagttct ccagagacat cgttacaggt cctttcgaaa agttcataca ggtgacattt 300

atcttgccat taacgggtaa gcaatattca gaaaaggttg cagaaaattg tactgcttac 360

ttgaaatcag tcggtattta cagtgatgca gaggcaaaag ctattgaaaa gttccttgag 420

gttttccagg atgaatcttt ccctcctggt gcctctgttc tgttcactca gtccccagtc 480

ggatcattaa cgattagctt ctccaaggat ggcacaatac ctgaagttgg taatgcagta 540

atagagaatg tgctactatc agaagcagtg ctcgaatcca tcatcggcaa gcaaggcgtt 600

tctccagctg cacggaagag tttggctgaa cgattatcag agttgttgaa aggttttgat 660

ggcattgcga aagaaggctt caaagaggga cagcaactgt aa 702

Claims

1.查尔酮异构酶，其特征在于，所述查尔酮异构酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.编码如权利要求1所述的查尔酮异构酶的编码基因。

3.根据权利要求2所述的查尔酮异构酶的编码基因，其特征在于，所述编码基因的碱基序列如SEQ ID NO.2所示。

4.含有权利要求2或3所述的查尔酮异构酶的编码基因的重组表达载体。

5.含有权利要求2或3所述的查尔酮异构酶的编码基因的重组宿主菌。

6.根据权利要求5所述的重组宿主菌，其特征在于，所述重组宿主菌为农杆菌。

7.如权利要求3所述的查尔酮异构酶的编码基因在调控植物花色苷合成中的应用。

8.根据权利要求6所述的查尔酮异构酶的编码基因在调控植物花色苷合成中的应用，其特征在于，所述植物为拟南芥或日本蛇根草。

9.如权利要求3所述的查尔酮异构酶的编码基因在调控植物种子颜色中的应用。

10.根据权利要求9所述的查尔酮异构酶的编码基因在调控植物种子颜色中的应用，其特征在于，所述植物种子为拟南芥的种子。