CN108164590A

CN108164590A - OsGBP3基因在调控水稻株高、粒型及千粒重中的应用

Info

Publication number: CN108164590A
Application number: CN201711481146.2A
Authority: CN
Inventors: 余四斌; 龚蓉
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2017-12-29
Filing date: 2017-12-29
Publication date: 2018-06-15
Anticipated expiration: 2037-12-29
Also published as: CN108164590B

Abstract

本发明提供OsGBP3基因在调控水稻株高、粒型及千粒重中的应用，该基因正调控株高和种子大小，超量表达该基因，促进植株的生长，不仅增加株高，而且使种子的粒长和粒宽增加，从而增加千粒重。抑制该基因的表达，降低株高，减小粒长。本发明为作物育种提供了宝贵的基因资源，可将水稻OsGBP3基因广泛应用于农作物杂交育种和杂交制种中。

Description

OsGBP3基因在调控水稻株高、粒型及千粒重中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体地说，涉及OsGBP3基因在调控水稻株高、粒型及千粒重中的应用。

背景技术

水稻是世界一半以上人口的主要粮食作物，矮化育种和杂交育种使水稻产量经历了两次飞跃，然而随着自然生态坏境的恶化以及耕地面积的不断减少，通过传统的育种方式提高水稻产量，越来越难以满足不断增涨的人口数量，因此提高水稻单产逐渐成为育种家的目标，而理想株型材料的培育则是实现高单产水稻的途径之一。

株高是影响水稻株型的主要决定因子，也是重要的农艺性状，它关系到水稻的收获指数以及增产潜力，是理想株型的研究重点。研究还表明株高与穗重、千粒重、一次枝梗、二次枝梗等重要农艺性状显著正相关(Wang et al.,2012)。在一定的临界值内，株高的增加将促进产量的增加，然而当其超出临界值后，反而会导致产量的下降。株高过高的植株易倒伏，不仅收割困难，而且还降低产量，因此株高适中是理性株型的目标，也是水稻实现高产的基础。到目前为止，研究者已克隆了很多调控水稻株高的重要基因，这些基因大多与赤霉素、油菜素内酯、独脚金内酯等激素的生物合成代谢或信号转导途径相关，它们在降低株高的同时，在其它一些性状上也会带来不利的影响，如叶片变短变宽、结实率降低，无效分蘖增加，降低产量等(Miura et al.,2009；Lin et al.,2009；Tong et al.,2009；Utsunomiya et al.,2011)。因此，挖掘控制株高的新基因，是构建理想株型实现水稻单高产育种目标的基础。

为了满足市场的需求，水稻育种除了追求高产目标之外，还需保证甚至进一步提升稻米品质。稻米品质包括外观品质、加工品质、蒸煮食味品质以及营养品质，而外观品质中种子粒型则为最主要的因素。粒型主要由粒长、粒宽、粒厚组成，它不仅决定着稻米的外观品质，而且也是影响产量的重要因素，因此，研究者们对水稻粒型有较深入的研究，克隆一些控制粒型的主效基因，例如调控粒长的基因GS3、qGL3、GL7/GW7(Fan et al.,2006；Zhang et al.,2012；Wang et al.,2015a；Wang et al.,2015b)，调控粒宽的基因GW2、GS5、GW8(Song et al.,2007；Li et al.,2011；Wang et al.,2012)。这些基因通过影响颖壳细胞的伸长或细胞的分化来正调控或者负调控粒型。然而调控粒宽的基因，往往在增加产量的同时会降低稻米品质，如GW2、GW8等，因此发掘与应用新的粒型基因，对增加水稻产量和改善稻米品质具有重要的生产应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供水稻基因OsGBP3的用途，特别是OsGBP3基因在调控水稻株高、粒型及千粒重中的应用。

为了实现本发明目的，本发明提供OsGBP3基因在调控水稻株高、粒型及千粒重中的应用，所述OsGBP3基因是编码如下蛋白质(a)或(b)的基因：

(a)由SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)SEQ ID NO:3所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a)衍生的蛋白质。

所述调控是指在水稻中过表达所述OsGBP3基因，增加水稻株高，以及种子的粒长、粒宽和千粒重；在水稻中抑制所述OsGBP3基因表达，降低株高和种子粒长。

本发明还提供水稻基因OsGBP3在水稻粒型及千粒重改良中的应用。

本发明还提供水稻基因OsGBP3在水稻株高改良中的应用。

本发明还提供一种增加水稻株高的方法，将OsGBP3基因的CDS序列构建到植物表达载体上，转化水稻(如中花11)，获得过表达OsGBP3基因的阳性转基因植株，转基因植株的株高增加。

本发明还提供一种增加种子粒长、粒宽和千粒重的方法，将OsGBP3基因的CDS序列构建到植物表达载体上，转化水稻(如中花11)，获得过表达OsGBP3基因的阳性转基因植株，结实留种，种子粒长、粒宽和千粒重均增加。

优选地，所述OsGBP3基因的CDS序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明中，过表达OsGBP3基因使用的植物表达载体优选为pCAMBIA1301S。

本发明还提供一种降低水稻株高的方法，利用基因工程技术抑制OsGBP3基因在水稻中的表达，从而使水稻的株高变矮。

本发明还提供一种减小水稻种子粒长的方法，利用基因工程技术抑制OsGBP3基因在水稻中的表达，从而使水稻种子粒长减小。

所述基因工程技术是指构建靶向OsGBP3基因的抑制子，并导入水稻植株中。所述抑制子选自shRNA、siRNA、dsRNA、miRNA、cDNA、反义RNA/DNA、低分子化合物、肽、抗体等中的至少一种。

优选地，所述抑制OsGBP3基因在水稻中表达的方法是将如SEQ ID NO:4所示的cDNA双链片段构建到植物表达载体上，转化水稻(如日本晴)，获得阳性转基因植株，转基因植株的株高变矮；结实留种，种子粒长减小。

本发明中，抑制OsGBP3基因表达使用的植物表达载体优选为pDS1301。

本发明还提供OsGBP3基因在水稻育种中的应用。

本发明的目的是采用以下的技术方案来实现的：

步骤：A、从水稻品种分离基因OsGBP3；B、将基因OsGBP3的CDS序列与载体pCAMBIA1301S连接构建超量表达载体；C、将基因OsGBP3的cDNA双链片段(SEQ ID NO:4)与载体pDS1301连接构建抑制表达载体；D、利用根癌农杆菌将重组载体导入水稻，获得转基因植株；E、利用聚合酶链式反应对T0代转化植株进行阳性检测，收获种子；F、将选留的T0代阳性单株的种子种成T1代家系，进行阳性检测后继续种植T2代家系。通过超量表达OsGBP3增加水稻株高，使谷粒变长、变宽，从而增加千粒重，而抑制其表达则降低株高，减小谷粒长度。

本发明的目的还可以采用以下的技术措施来进一步实现。

1、利用聚合酶链式反应(PCR)从水稻品种日本晴中扩增得到基因OsGBP3，基因全长3484个碱基，包括1946个碱基的启动子，1026个碱基的基因以及512个碱基的基因下游序列，核苷酸序列见SEQ ID NO:1。基因的编码序列(CDS)由1026个碱基组成，核苷酸序列见SEQ ID NO:2，编码341个氨基酸(SEQ ID NO:3)。

2、将步骤1中得到的基因OsGBP3的CDS序列与超表达载体pCAMBIA1301S连接，构建OsGBP3超表达载体。

3、将基因OsGBP3的一段269个碱基的cDNA(SEQ ID NO:4)与抑制载体pDS1301连接构建OsGBP3的抑制表达载体。

4、利用根癌农杆菌EHA105(购于Takara公司，公开产品)介导的转基因方法分别将构建的OsGBP3的超表达载体导入水稻品种中花11中，将构建的抑制表达载体导入水稻品种日本晴中，获得转基因植株。

5、利用聚合酶链式反应(PCR)对步骤4产生的T0代超量表达转基因植株进行阳性检测，通过实时定量PCR(qRT-PCR)检测阳性转基因植株中OsGBP3的表达，选择OsGBP3表达量显著升高的转基因植株，收获单株自交种子。

6、将步骤5选留的两个单独转基因植株的种子种植成T1代家系，继续利用PCR对T1代单株进行阳性检测，考察阳性转基因单株和对照(CK)转基因阴性材料的株高，以及收获后的种子大小，结合田间表现选择表现优良的转基因单株，自交留种。

7、利用PCR对步骤4产生的T0代抑制表达转基因植株进行阳性检测，并通过qRT-PCR检测阳性转基因植株中OsGBP3的表达，选择OsGBP3表达量显著下降的转基因植株，收获单株自交种子。

8、将步骤7选留的转基因植株的种子种植成T1代家系，继续利用PCR对T1代单株进行阳性检测，考察阳性转基因单株和对照(CK)转基因阴性材料的株高，以及收获后的种子大小，结合田间表现选择表现优良的转基因单株，自交留种。

本发明提供的水稻基因OsGBP3在株高及粒型改良中的应用，其步骤为：

(1)将OsGBP3的CDS在水稻品种中花11中超量表达，转基因植株的株高增加。

(2)将OsGBP3的CDS在水稻品种中花11中超量表达，转基因植株种子粒长、粒宽以及千粒重均增加，水稻品种中花11粒型及粒重得到改良。

(3)将OsGBP3的一段cDNA双链片段(SEQ ID NO:4)在日本晴中表达后，抑制日本晴中内源OsGBP3的表达，转基因植株株高变矮，种子粒长变短。

本发明首次揭示了水稻OsGBP3基因的生物学功能，该基因正调控株高和种子大小，超量表达该基因，促进植株的生长，不仅增加株高，而且使种子的粒长和粒宽增加，从而增加千粒重。抑制该基因的表达，降低株高，减小粒长。本发明为作物育种提供了宝贵的基因资源，可将水稻OsGBP3基因广泛应用于农作物品质育种和杂交制种中。

附图说明

图1为本发明实施例2中水稻OsGBP3基因抑制表达载体的构建示意图。将基因OsGBP3的一段269个碱基的cDNA片段连接到表达载体pDS1301上形成中间载体，再将同一段cDNA片段与中间载体反向连接形成抑制重组载体。

图2为本发明实施例4中超量表达OsGBP3的T0代转基因植株阳性检测及基因OsGBP3表达量检测示意图。图2A为通过qRT-PCR检测转基因单株中OsGBP3基因的相对表达量，其中阴性转基因单株为白色柱子显示，阳性单株为黑色柱子显示；图2B为载体上筛选标记潮霉素基因(Hn)引物进行PCR检测结果，转基因阳性单株扩增片段大小约700bp，而转基因阴性单株无扩增片段。

图3为本发明实施例6中抑制OsGBP3表达T0代转基因植株的阳性检测及表达量检测示意图。图3A为通过qRT-PCR检测转基因植株中OsGBP3的相对表达量，其中阴性转基因单株为白色柱子显示，阳性单株为黑色柱子显示；图3B为检测抑制表达载体上正向和反向插入的OsGBP3的一段cDNA片段引物PMCGF1/R1和PMCGF2/R2进行PCR扩增的结果，第一对引物扩增的大小约为700bp的条带，第二对引物扩增约为500bp的条带，两对引物均出现目的大小的扩增片段，为转基因阳性，否则为阴性。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

本发明中使用的遗传转化的培养基及其配制的方法如下：

(1)试剂和溶液缩写

本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下：

6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-苄基腺嘌呤)；

CN(Carbenicillin，羧苄青霉素)；

KT(Kinetin，激动素)；

NAA(Napthalene acetic acid，萘乙酸)；

IAA(Indole-3-acetic acid，吲哚乙酸)；

2,4-D(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid，2,4-二氯苯氧乙酸)；

AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；

CH(Casein Enzymatic Hydrolysate，水解酪蛋白)；

HN(Hygromycin B，潮霉素)；

DMSO(Dimethyl SulTOXide，二甲基亚砜)；

N6max(N6大量元素成分溶液)；

N6mix(N6微量元素成分溶液)；

MSmax(MS大量元素成分溶液)；

MSmix(MS微量元素成分溶液)

(2)主要溶液配方

1)N6培养基大量元素母液(按照10倍浓缩液(10×)配制)：

将上述试剂逐一溶解，然后室温下用蒸馏水定容至1000毫升。

2)N6培养基微量元素母液(按照100倍浓缩液(100×)配制

将上述试剂在室温下溶解并用蒸馏水定容至1000毫升。

3)铁盐(Fe₂EDTA)贮存液(按照100×浓缩液配制)

将3.73克乙二铵四乙酸二钠(Na₂EDTA·2H₂O)和2.78克FeSO₄·7H₂O分别溶解，混合并用蒸馏水定容至1000毫升，至70℃温浴2小时，4℃保存备用。

4)维生素贮存液(按照100×浓缩液配制)

加蒸馏水定容至1000毫升，4℃保存备用。

5)MS培养基大量元素母液(MSmax母液)(按照10×浓缩液配制)

将上述试剂在室温下溶解，并用蒸馏水定容至1000毫升。

6)MS培养基微量元素母液(MSmin母液)(按照100×浓缩液配制)

将上述试剂在室温下溶解，并用蒸馏水定容至1000毫升。

7)2,4-D贮存液(1毫克/毫升)的配制

称取2,4-D 100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，于室温下保存。

8)6-BA贮存液(1毫克/毫升)的配制

称取6-BA 100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，室温保存。

9)萘乙酸(NAA)贮存液(1毫克/毫升)的配制

秤取NAA 100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，4℃保存备用。

10)吲哚乙酸(IAA)贮存液(1毫克/毫升)的配制

秤取IAA 100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，4℃保存备用。

11)葡萄糖贮存液(0.5克/毫升)的配制

称取葡萄糖125克，然后用蒸馏水溶解定容至250毫升，灭菌后4℃保存备用。

12)AS贮存液的配制

称取AS 0.392克，加入DMSO 10毫升溶解，分装至1.5毫升离心管内，4℃保存备用。

13)1N氢氧化钾贮存液的配制

称取氢氧化钾5.6克，用蒸馏水溶解定容至100毫升，室温保存备用。

(3)用于水稻遗传转化的培养基配方

1)诱导培养基

N6max母液(取已经制备好的10×浓缩液，下同)100毫升

N6mix母液(取已经制备好的100×浓缩液，下同)10毫升

Fe²⁺EDTA贮存液(取已经制备好的100×浓缩液，下同)10毫升

维生素贮存液(取已经制备好的100×浓缩液，下同)10毫升

加蒸馏水至900毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000毫升，分装到50毫升三角瓶(25毫升/瓶)，封口后按常规方法灭菌(例如121℃下灭菌25分钟，下述的培养基灭菌方法与本培养基的灭菌方法相同)。

2)继代培养基

加蒸馏水至900毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000毫升，分装到50毫升三角瓶(25毫升/瓶)，封口，按上述方法灭菌。

3)预培养基

加蒸馏水至250毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口，按上述方法灭菌。

使用前加热溶解培养基并加入5毫升葡萄糖贮存液和250微升AS贮存液，分装倒入培养皿中(25毫升/皿)。

4)共培养基

使用前加热溶解培养基并加入5毫升葡萄糖贮存液和250微升AS贮存液，分装倒入培养皿中(25毫升/每皿)。

5)悬浮培养基

加蒸馏水至100毫升，调节pH值到5.4，分装到两个100毫升的三角瓶中，封口，按上述方法灭菌。

使用前加入1毫升无菌葡萄糖贮存液和100微升AS贮存液。

6)选择培养基

加蒸馏水至250毫升，调节pH值到6.0，封口，按上述方法灭菌。

使用前溶解培养基，加入250微升HN(50毫克/毫升)和400微升CN(250毫克/毫升)分装倒入培养皿中(25毫升/皿)。(注：第一次选择培养基羧苄青霉素浓度为400毫克/升，第二次及以后选择培养基羧苄青霉素浓度为250毫克/升)。

7)预分化培养基

加蒸馏水至250毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，封口，按上述方法灭菌。

使用前溶解培养基，250微升HN(50毫克/毫升)250微升CN(250毫克/毫升)，分装倒入培养皿中(25毫升/皿)。

8)分化培养基

加蒸馏水至900毫升，1N氢氧化钾调节pH值到6.0。

煮沸并用蒸馏水定容至1000毫升，分装到50毫升三角瓶(50毫升/瓶)，封口，按上述方法灭菌。

9)生根培养基

加蒸馏水至900毫升，用1N氢氧化钾调节pH值到5.8。

煮沸并用蒸馏水定容至1000毫升，分装到生根管中(25毫升/管)，封口，按上述方法灭菌。

实施例1基因OsGBP3的克隆

提取水稻品种日本晴的DNA(引物序列为：上游引物5′-GATCAATCACAGAAGACACG-3′和下游引物5′-CCAGATTAGGTACAGAACCT-3′)进行聚合酶链式反应(PCR)，将得到的PCR产物进行测序得到基因OsGBP3的基因序列，由3484个碱基组成，核苷酸序列见SEQ ID NO:1。PCR程序：94℃预变性5分钟；35个循环(94℃变性30秒；55℃退火30秒；72℃延伸4分钟)，72℃延伸10分钟。抽取水稻品种日本晴叶片的RNA，反转录成cDNA，用引物(引物序列为：上游引物5′-GGATCCCAGCGCCGCTCTTGTTCGA-3′和下游引物5′-TCTAGAGCAGAGCAACCTACAAAGC-3′)进行聚合酶链式反应(PCR)，扩增产物大小为1137bp(包含65bp 5’非翻译区以及46bp 3’非翻译区序列)，将得到的PCR产物进行测序分析得到基因OsGBP3的编码序列(CDS)，由1026个碱基组成，核苷酸序列见SEQ ID NO:2。PCR程序：94℃预变性5分钟；30个循环(94℃变性30秒；56℃退火30秒；72℃延伸1分钟)，72℃延伸7分钟。利用Primer3软件(http://frodo.wi.mit.edu/)翻译编码序列(CDS)获得氨基酸序列，编码341个氨基酸，序列见SEQID NO:3。

上述引物由上海生工合成，序列测定由华大基因测定。DNA、RNA抽提，PCR及试剂配方参照J.萨姆布鲁克等，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等(译)，科学出版社，2002。

实施例2重组载体的构建和转化农杆菌的建立

(1)将实施例1中扩增获得的包含OsGBP3基因CDS(SEQ ID NO:2)的序列用BamH I和Xba I双酶切，分离回收目标产物，与用BamHI和Xba I双酶切过的pCAMBIA1301S载体，用T4连接酶连接形成超表达载体。上述引物由上海生工合成，限制性内切酶BamH I、Xba I及T4连接酶均购于Takara公司。

(2)根据图1的载体构建技术路线，将实施例1得到的CDS序列用引物(引物序列为：上游引物5′-AAAGAGCTCGGATCCTGGACCTCTCAAGGATACCAAC-3′和下游引物5′-AAAACTAGTGGTACCATGCTTCGCCCAGAAGGTCTTC-3′)进行聚合酶链式反应(PCR)，分离得到基因OsGBP3的一段269个碱基的cDNA片段，其序列为SEQ ID NO:4所示。PCR程序：94℃预变性5分钟；30个循环(94℃变性30秒；55℃退火30秒；72℃延伸30秒)，72℃延伸7分钟。将目标片段先用BamH I和Kpn I酶切，分离回收目标产物，与用BamH I和Kpn I酶切过的pDS1301载体用T4连接酶连接形成中间载体1，再将目标片段用Sac I和Spe I酶切，分离回收后,与用Sac I和SpeI酶切过的中间载体1用T4连接酶连接形成抑制表达载体。上述引物由上海生工合成，限制性内切酶(BamH I、Kpn I、Sac I和Spe I)和T4连接酶均购于Takara公司。

(3)将超表达载体和抑制载体转化农杆菌EHA105(Takara公司产品)中，OsGBP3超表达载体转化后的菌株命名为TOX；RNA抑制载体转化后的菌株命名为TR。

上述RNA抽提，RNA反转录成cDNA，PCR，酶切连接等分子克隆方法及试剂配方参照J.萨姆布鲁克等，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等(译)，科学出版社，2002。

实施例3农杆菌介导的遗传转化

(1)诱导：将成熟的水稻品种(中花11和日本晴)种子去壳，然后依次用75％体积比的乙醇处理1分钟，0.15％浓度的氯化汞(HgCl₂)种子表面消毒18分钟；用灭菌水洗种子4-5次；将种子放在粳稻诱导培养基上；将接种后的培养基置于黑暗处培养4周，温度25±1℃。

(2)继代：挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于粳稻继代培养基上黑暗下培养2-3周，温度25±1℃。

(3)农杆菌培养：

在带有卡那霉素抗性(上海生工公司产品)选择的LA培养基(LA培养基的配制参照J.萨姆布鲁克等，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等(译)，科学出版社，2002)上预培养农杆菌株TOX和FR两天，温度28℃；刮取农杆菌至悬浮培养基中悬浮培养30min，温度28℃。

(4)侵染：将预培养的愈伤转移至灭好菌的瓶子内；调节农杆菌TOX和FR的悬浮液至OD₆₀₀为0.8-1.0；将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在粳稻共培养基上培养3天，温度19-20℃。

(5)筛选：用灭菌水洗涤愈伤8遍；浸泡在含400毫克/L羧苄青霉素(CN)(上海生工公司产品)的灭菌水中30分钟；转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；转移愈伤至含有250mg/L羧苄青霉素(CN)、50mg/L潮霉素(Hn)(Roche公司产品)粳稻选择培养基上选择培养2-3次，每次2周。

(6)分化：将抗性愈伤转移至粳稻分化培养基上，光照下培养，温度26℃。

(7)生根：剪掉再生苗分化时产生的根；然后将其转移至生根培养基中光照下培养2-3周，温度26℃。

(8)移栽：洗掉再生植株根上的残留培养基，移入钵中盆栽，同时在最初的几天保持水分湿润，待植株存活健壮后移入大田。

实施例4OsGBP3过表达转基因水稻植株的鉴定

从实施例2和3中获得OsGBP3超量表达T0代转基因植株共16株，命名TOX1至TOX16，取T0代转化单株叶片提取DNA，用载体pCAMBIA1301S筛选标记潮霉素(Hn)的引物(引物序列为：上游引物5′-AGAAGAAGATGTTGGCGACCT-3′和下游引物5′-GTCCTGCGGGTAAATAGCTG-3′)进行PCR；PCR程序：94℃预变性5分钟；35个循环(94℃变性30秒；55℃退火30秒；72℃延伸40秒)，72℃延伸7分钟；检测阳性转化植株，能扩增出约700bp大小条带的单株即为阳性转化单株(图2B)。抽提叶片RNA,进行荧光定量PCR，以内参基因UBQ(引物序列为：上游引物5′-AACCAGCTGAGGCCCAAGA-3′和下游引物5′-ACGATTGATTTAACCAGTCCATGA-3′)为对照，检测OsGBP3基因(引物序列为：上游引物5′-ACAAGGCTCTTCACAATCTC-3′和下游引物5′-TGGTGGCTCATCAATAACAG-3′)的表达量变化，其中TOX3、TOX7、TOX15这3个转化植株中OsGBP3的表达量显著上升(图2A)。

DNA抽提、RNA抽提、RNA反转录成cDNA和PCR反应体系等相关技术参照J.萨姆布鲁克等，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等(译)，科学出版社，2002。

实施例5水稻基因OsGBP3在水稻品种中花11株高及粒型改良中的应用

在实施例4中获得了将基因OsGBP3在水稻品种中花11中超量表达的转基因株系后，根据转基因植株生长状态和结实情况，从实施例4水稻基因OsGBP3表达量显著上升的阳性植株中，选取TOX3和TOX7这两个转基因单株种植成T1代转基因家系，进一步利用PCR(方法同实施例4)检测各家系中的阳性单株，以阴性转基因家系单株为对照(CK)，考察株高、粒型及粒重相关性状，TOX3和TOX7家系中阳性单株的株高相比对照显著增加，而且粒长、粒宽以及千粒重与对照相比也显著增加(表1)。水稻基因OsGBP3在水稻品种中花11中超量表达后，转基因阳性单株的谷粒变长、变宽，植株变高，水稻品种中花11的粒型、千粒重以及株高均得到改良。

表1OsGBP3超量表达转基因家系粒型、千粒重及株高考察

注：**，T测验P<0.01；*，T测验P<0.05。

实施例6OsGBP3抑制表达转基因水稻植株的鉴定

从实施例2和3中获得OsGBP3抑制表达T0代转基因植株共15株，命名TR1至TR15，取T0代转化单株叶片提取DNA，用抑制载体pDS1301上检测外源正向插入片段的引物PMCGF1/R1(引物序列为：上游引物5′-CTGCTCCACACATGTCCATT-3′和下游引物5′-CCCACCATCTTGTGGAGCTA-3′)，检测外源反向插入片段引物PMCGF2/R2(引物序列为：上游引物5′-GGCTCACCAAACCTTAAACAA-3′和下游引物5′-CTGAGCTACACATGCTCAGGTT-3′)进行PCR扩增；PCR程序：94℃预变性5分钟；35个循环(94℃变性30秒；55℃退火30秒；72℃延伸40秒)，72℃延伸7分钟；检测阳性转化植株，两组引物分别能扩增出约700bp和500bp大小条带的单株即为阳性转化单株(图3B)。抽提叶片RNA,进行荧光定量PCR，以内参基因UBQ(引物序列为：上游引物5′-AACCAGCTGAGGCCCAAGA-3′和下游引物5′-ACGATTGATTTAACCAGTCCATGA-3′)为对照，检测OsGBP3基因(引物序列为：上游引物5′-ACAAGGCTCTTCACAATCTC-3′和下游引物5′-TGGTGGCTCATCAATAACAG-3′)的表达量变化，结果发现大部分转基因阳性单株中基因OsGBP3的表达量显著下降(图3A)。

实施例7水稻基因OsGBP3在水稻品种日本晴中粒型和株高的改良应用

在实施例6中得到水稻基因OsGBP3在水稻品种日本晴中的抑制表达转基因植株后，结合转基因植株生长状态和结实情况，将水稻基因OsGBP3表达量显著下降的转基因单株TR3和TR10的种子，种成T1代家系，继续利用PCR(方法同实施例6)检测各家系中的阳性单株，考察两个家系中转基因阳性单株种子的粒长、粒宽及株高性状，以转基因阴性家系单株为对照(CK)。两个转基因家系中阳性单株的粒长和株高与阴性对照相比均显著降低，粒宽没有显著差异(表2)。水稻基因OsGBP3在水稻品种日本晴中抑制表达之后，水稻品种日本晴的谷粒长度减小。

表2 OsGBP3抑制转基因家系的株高及粒型考察

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

参考文献

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序列表

<110> 华中农业大学

<120> OsGBP3基因在调控水稻株高、粒型及千粒重中的应用

<130> KHP171119255.2

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3484

<212> DNA

<213> 水稻( Oryza sativa)

<400> 1

gatcaatcac agaagacacg agatttgacg tgaaaaaccc tcccaaagta ggagaggaaa 60

aaccacggat gccagccagc gaatatcttc accatatcgg gtgaggttac aacaccgaac 120

gacggtttac aggaatatat atgaaggtga aaccctaaaa aaataacgat ccataccgtt 180

tcgctccgtt tgaagtgggc ctgtttagtt cactaggtaa tgccacatct agtactaggt 240

agctacattt tgaaacggag gaagtactga gtataacacc tccccaactt tcgaaaccag 300

agcaaatcga gtctctttgg atagaggttt catccttcat gacgctcatg agactgtcgg 360

tgagaaaaat taaaataata acagccccca cctctcccta ggccctagag caaatcgagt 420

ctctttggat agagatttca tccttcatga cgctcatgag acctacatgt taatgagaaa 480

aattaaaata ataacagccc ccgcctctcc caggccaggc ccacttacat ttggcaactt 540

tcatatgttg tagactgtcc tcacagacca acacaagtct tttctgcaca ctaggccaag 600

cacgcttaac ctcagagttc tttagatatc ggtttctgga aaataagttg caacttgttg 660

atgtaagtat tctattaatt ctattaagcc ttgggccaag atgtcacaat ccatgagccc 720

tgcgctgcat ccgctggcct tcgacccggt tgccgaggtc gctagggtgg tagacggcgg 780

ccgacatcgg cgagctcgca gggagtgcgg gtaggaatag cgaggagcta ctatcctgaa 840

attgttgtcg ccgtccgaca aggcatcgtt gccttgctcc tctcctgaca ttcgatggga 900

gtttcccgga ctaggatgcc acatcagtca aatcagctat ccatattgtc ttactacttc 960

agggcctgtt tagttcacta acgaaaattt ttagcgtgtc acatcggcga tacggacaca 1020

catttaaagt attaaatata gactaataac aaaacaaatt acagattccg cctaaaaatt 1080

gcgagacgaa tttattaagc ctaattaatc catcattagt aaatgtttac tgtagcacca 1140

cgttgtcaaa tcatggcgta attaggctta aaagattcgt ctcgcaattt acacgtaacc 1200

tgtgtaatta ttatttttat ttatatttaa tactccatgc atatgccgaa acattcaatg 1260

tgacagggtg aaaaattttt gtttgggaac tacacagggc cttatttaac ccggttttga 1320

aagatggatg tttaataatt tctgaagata aaggacctac agtgaactta ttccatccca 1380

aaacagtgtg gtggtgtggc ttggatgggc cgggctgggc ctcctacagt ccggctcggt 1440

ccaactatat atctctccca cctttatcta ttctattaac aaaaaagtga aaaataaaga 1500

aaaattcatt cttcttctcc ttctccttct tctcttcttg gaggatattt cttccccctc 1560

cgtctccggc gccgatctgc atccacccgc cgagcagaga ccagcgccgc cgccgtcgcc 1620

gtccgttcct cctgtatcgc gtcctggtga gcatccgccc ctcgttacgc acattttttt 1680

attcgaattt ttttttcaag aatgaatttc tgtgcgttaa ccctagatag tacgtagctt 1740

ccgttgtaga tctggatctg gaaagctttt ctcttgattt gttcgtaatg tgatactaat 1800

agcagtttct ttgcttgttt gtttgtttcc ctaaagaaat ttcttttttc tgggatgtcc 1860

gacgttggag acgcccctgt gcagcgccgc tcttgttcga atccggccgg tggtctgtag 1920

gattgggcgg ctgcggcggc ggcgagatgg acgacgacgc cagcatgagc ataagatggg 1980

ggggattctt cgagtcgccg gcgaggaacc tcggcctgca gctcatgtcg tcggtgcctg 2040

ctgagcgtga caccaagcag ctgctctctg gtagcccctt cctgcatcat cagcatcagc 2100

agcatgtccc gcaccaccac catcagcccc atcacccgcg tgactgcggc gccaatggca 2160

atgccaatgg tggtgctatg cctcctcctc ctgccacgga ggctccccct tcaatgccga 2220

tgaacttcgc gcgcagtgac atgtggatgc acccgcaaca gcagcagcaa catcatcatc 2280

cccgcgagca caaggctctt cacaatctca ctgttggcca tggttcttcg cacattgcgc 2340

atcatgaccc agtgggctat gggatgatcc ccggtacgca taccctgcag atgatgcagc 2400

agcaaacaga gcctcaactg caacccccac caccgcctca gcagccaaaa gaggaatgca 2460

tttcctcgcc attgatcgag gaaaatgtac ctgttattga tgagccacca cctcccaaga 2520

agcggcagca gggccgccaa cccaaggtac caagggctaa gaagcccaag aagtctgctg 2580

ctcctcgtga ggatggcgca ccacccaatg caccagcacc acggagaagg ggtcccagga 2640

agaatatagg gatggtaatt aatggtattg atttggacct ctcaaggata ccaacgccca 2700

tttgttcttg cacgggcgca ccacagcagt gctatcggtg gggtgcaggt ggttggcaat 2760

ctgcgtgctg cacaaccacc atctcaacgt acccactgcc aatgagtacg aagcgccgtg 2820

gtgcacgaat cgcaggcagg aagatgagcc atggtgcgtt caagaaagta cttgagaagc 2880

ttgctggtga aggttataat cttaataatc cgattgacct gaagaccttc tgggcgaagc 2940

atggaacaaa caagtttgtt accataaggt aaaagacaat gaaattctaa aatttgttgg 3000

ctttgtaggt tgctctgcag ctgtttggtc tgagtaattg tctgtatgta ctctagatta 3060

caaactgcag aatcctttta ggtgtaggtt ttaggcatgt cctgtccctt tgcagtagtt 3120

tacatgcctc atctgtgacc tgggtgctga cctgtatggt ggctatctgc atgtatcttt 3180

gtcattatct ttacaagtag cagtgtaatg cgacaatctc taatttaggt ggcatgaaag 3240

ttaatctgtt caacgtttct cattatgctt aagtcttctg ttatacaatg ctccattgca 3300

atgcctggat gttttacaga atacaatata gttgctatct catgaagtag aaacgttatc 3360

tttttcatgc tgtgttctgt atgcatgcaa agtttatata gcctatatat acatgtcttt 3420

tcttttattg aactgatgtt tgcatgcatg atgaatgtgg gcaaaggttc tgtacctaat 3480

ctgg 3484

<210> 2

<211> 1026

<212> DNA

<213> 水稻( Oryza sativa)

<400> 2

atggacgacg acgccagcat gagcataaga tgggggggat tcttcgagtc gccggcgagg 60

aacctcggcc tgcagctcat gtcgtcggtg cctgctgagc gtgacaccaa gcagctgctc 120

tctggtagcc ccttcctgca tcatcagcat cagcagcatg tcccgcacca ccaccatcag 180

ccccatcacc cgcgtgactg cggcgccaat ggcaatgcca atggtggtgc tatgcctcct 240

cctcctgcca cggaggctcc cccttcaatg ccgatgaact tcgcgcgcag tgacatgtgg 300

atgcacccgc aacagcagca gcaacatcat catccccgcg agcacaaggc tcttcacaat 360

ctcactgttg gccatggttc ttcgcacatt gcgcatcatg acccagtggg ctatgggatg 420

atccccggta cgcataccct gcagatgatg cagcagcaaa cagagcctca actgcaaccc 480

ccaccaccgc ctcagcagcc aaaagaggaa tgcatttcct cgccattgat cgaggaaaat 540

gtacctgtta ttgatgagcc accacctccc aagaagcggc agcagggccg ccaacccaag 600

gtaccaaggg ctaagaagcc caagaagtct gctgctcctc gtgaggatgg cgcaccaccc 660

aatgcaccag caccacggag aaggggtccc aggaagaata tagggatggt aattaatggt 720

attgatttgg acctctcaag gataccaacg cccatttgtt cttgcacggg cgcaccacag 780

cagtgctatc ggtggggtgc aggtggttgg caatctgcgt gctgcacaac caccatctca 840

acgtacccac tgccaatgag tacgaagcgc cgtggtgcac gaatcgcagg caggaagatg 900

agccatggtg cgttcaagaa agtacttgag aagcttgctg gtgaaggtta taatcttaat 960

aatccgattg acctgaagac cttctgggcg aagcatggaa caaacaagtt tgttaccata 1020

aggtaa 1026

<210> 3

<211> 341

<212> PRT

<213> 水稻( Oryza sativa)

<400> 3

Met Asp Asp Asp Ala Ser Met Ser Ile Arg Trp Gly Gly Phe Phe Glu

1 5 10 15

Ser Pro Ala Arg Asn Leu Gly Leu Gln Leu Met Ser Ser Val Pro Ala

20 25 30

Glu Arg Asp Thr Lys Gln Leu Leu Ser Gly Ser Pro Phe Leu His His

35 40 45

Gln His Gln Gln His Val Pro His His His His Gln Pro His His Pro

50 55 60

Arg Asp Cys Gly Ala Asn Gly Asn Ala Asn Gly Gly Ala Met Pro Pro

65 70 75 80

Pro Pro Ala Thr Glu Ala Pro Pro Ser Met Pro Met Asn Phe Ala Arg

85 90 95

Ser Asp Met Trp Met His Pro Gln Gln Gln Gln Gln His His His Pro

100 105 110

Arg Glu His Lys Ala Leu His Asn Leu Thr Val Gly His Gly Ser Ser

115 120 125

His Ile Ala His His Asp Pro Val Gly Tyr Gly Met Ile Pro Gly Thr

130 135 140

His Thr Leu Gln Met Met Gln Gln Gln Thr Glu Pro Gln Leu Gln Pro

145 150 155 160

Pro Pro Pro Pro Gln Gln Pro Lys Glu Glu Cys Ile Ser Ser Pro Leu

165 170 175

Ile Glu Glu Asn Val Pro Val Ile Asp Glu Pro Pro Pro Pro Lys Lys

180 185 190

Arg Gln Gln Gly Arg Gln Pro Lys Val Pro Arg Ala Lys Lys Pro Lys

195 200 205

Lys Ser Ala Ala Pro Arg Glu Asp Gly Ala Pro Pro Asn Ala Pro Ala

210 215 220

Pro Arg Arg Arg Gly Pro Arg Lys Asn Ile Gly Met Val Ile Asn Gly

225 230 235 240

Ile Asp Leu Asp Leu Ser Arg Ile Pro Thr Pro Ile Cys Ser Cys Thr

245 250 255

Gly Ala Pro Gln Gln Cys Tyr Arg Trp Gly Ala Gly Gly Trp Gln Ser

260 265 270

Ala Cys Cys Thr Thr Thr Ile Ser Thr Tyr Pro Leu Pro Met Ser Thr

275 280 285

Lys Arg Arg Gly Ala Arg Ile Ala Gly Arg Lys Met Ser His Gly Ala

290 295 300

Phe Lys Lys Val Leu Glu Lys Leu Ala Gly Glu Gly Tyr Asn Leu Asn

305 310 315 320

Asn Pro Ile Asp Leu Lys Thr Phe Trp Ala Lys His Gly Thr Asn Lys

325 330 335

Phe Val Thr Ile Arg

340

<210> 4

<211> 269

<212> DNA

<213> 水稻( Oryza sativa)

<400> 4

tggacctctc aaggatacca acgcccattt gttcttgcac gggcgcacca cagcagtgct 60

atcggtgggg tgcaggtggt tggcaatctg cgtgctgcac aaccaccatc tcaacgtacc 120

cactgccaat gagtacgaag cgccgtggtg cacgaatcgc aggcaggaag atgagccatg 180

gtgcgttcaa gaaagtactt gagaagcttg ctggtgaagg ttataatctt aataatccga 240

ttgacctgaa gaccttctgg gcgaagcat 269

Claims

1.OsGBP3基因在调控水稻株高、粒型及千粒重中的应用，其特征在于，所述OsGBP3基因是编码如下蛋白质(a)或(b)的基因：

(a)由SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述调控是指在水稻中过表达所述OsGBP3基因，增加水稻株高，种子粒长、粒宽和千粒重均增加；在水稻中抑制所述OsGBP3基因表达，降低水稻株高，减小种子粒长。

3.一种增加水稻株高的方法，其特征在于，将OsGBP3基因的CDS序列构建到植物表达载体上，转化水稻，获得过表达OsGBP3基因的阳性转基因植株，转基因植株的株高增加。

4.一种增加种子粒长、粒宽和千粒重的方法，其特征在于，将OsGBP3基因的CDS序列构建到植物表达载体上，转化水稻，获得过表达OsGBP3基因的阳性转基因植株，结实留种，种子粒长、粒宽和千粒重均增加。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述OsGBP3基因的CDS序列如SEQ IDNO:2所示，所述植物表达载体为pCAMBIA1301S，所述水稻为中花11。

6.一种降低水稻株高及减小水稻种子粒长的方法，其特征在于，利用基因工程技术抑制OsGBP3基因在水稻中的表达，从而使水稻的株高变矮，水稻种子粒长减小；

其中，所述基因工程技术是指构建靶向OsGBP3基因的抑制子，并导入水稻植株中；所述抑制子选自shRNA、siRNA、dsRNA、miRNA、cDNA、反义RNA/DNA、低分子化合物、肽、抗体中的至少一种。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，将如SEQ ID NO:4所示的cDNA双链片段构建到植物表达载体上，转化水稻，获得阳性转基因植株，转基因植株的株高变矮；结实留种，种子粒长减小。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述植物表达载体为pDS1301。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述水稻为日本晴。

10.OsGBP3基因在水稻育种中的应用。