CN104379747A - 具有增强的产量相关性状的植物和用于制备该植物的方法 - Google Patents

Abstract

本文提供了用于增强植物中多种经济重要的产量相关性状的方法。更具体地，通过调节植物中编码POI(目的蛋白)多肽的核酸的表达提供了增强植物中一个或多个产量相关性状的方法。本文还提供了具有编码POI多肽的核酸的受调节表达的植物，所述植物与对照植物相比具有一个或多个增强的产量相关性状。本文还提供了在实施本发明方法中有用的构建体。

Description

具有增强的产量相关性状的植物和用于制备该植物的方法

本申请要求以下申请的优先权：2012年6月22日提交的EP 12 173160.8和2012年6月22日提交的US 61/662944，全部所述申请完整引入本文作为参考。

背景技术

本发明总体上涉及植物分子生物学领域并且涉及用于通过调节植物中编码POI(目的蛋白)多肽的核酸表达而增强植物中一个或多个产量相关性状的方法。本发明还涉及具有编码POI多肽的核酸的调节的表达的植物，所述植物相对于对应野生型植物或其他对照植物具有一个或多个增强的产量相关性状。本发明也提供可用于本发明方法、用途、植物、可收获部分和产品中的构建体。

持续增长的世界人口和农业用可耕地供应萎缩刺激了有关增加农业效率的研究。常规的作物及园艺学改良手段利用选择育种技术以鉴定具有受欢迎特性的植物。然而，此类选择育种技术具有几个缺陷，即这些技术一般耗费很多劳动并且产生这样的植物，其经常含有异源性遗传组分，其可能不总是导致从亲代植物中传递的所希望性状。分子生物学进展已经允许人类改良动物及植物的种质。植物的遗传工程使得可以分离和操作遗传物质(一般处于DNA或RNA形式)并且随后导入该遗传物质至植物中。此类技术具有产生具备多种经济学、农学或园艺学改良性状的作物或植物的能力。

具有经济意义的性状是增加的产量。产量通常定义为来自作物的经济价值的可测量结果。该结果可以就数量和/或品质方面进行定义。产量直接取决于几个因素，例如器官的数目和大小、植物构造(例如枝的数目)、种子产生、叶衰老等。根发育、养分摄入量、胁迫耐受性和早期萌发势(earlyvigor)也可以是决定产量的重要因素。优化前述因素因而可以对增加作物产量有贡献。

种子产量是重要的性状，因为众多植物的种子对人与动物营养是重要的。作物如玉米、稻、小麦、油菜和大豆占超过一半的人类总热量摄入，无论通过直接消费种子本身或通过消费基于加工的种子而产生的肉产品。作物也是糖、油及工业加工中所用众多类型代谢物的来源。种子含有胚(新苗和新根的起源)和胚乳(萌发期间及幼苗早期生长期间用于胚生长的营养来源)。种子发育涉及多种基因并且需要代谢物从根、叶和茎转移至正在生长的种子中。胚乳尤其同化糖类、油和蛋白质的代谢前体并且将它们合成为贮藏大分子以灌满籽粒。

对于众多作物的另一个重要性状是早期萌发势。改进早期萌发势是现代稻育种计划在温带和热带稻品种上的重要目标。长根在水栽稻中对于正确土壤固定是重要的。在将稻直接播种至被淹没田地的情况下，以及在植物必须从水中迅速出苗的情况下，较长的苗与萌发势相关。在实施条播的情况下，较长的中胚轴和胚芽鞘对于良好出苗是重要的。将早期萌发势人工改造到植物内的能力将在农业中是极其重要的。例如，不良的早期萌发势已经限制了基于玉米带种质(Corn Belt germplasm)的玉米(Zea mayes L.)杂种在欧洲大西洋地区的引种。

另一重要性状是改进的非生物胁迫耐受性。非生物胁迫是世界范围作物损失的主要原因，对于大多数主要作物植物而言降低平均产量超过50％(Wang等,Planta 218,1-14,2003)。非生物胁迫可以由干旱、盐度、养分缺乏、极端温度、化学毒性和氧化胁迫引起。提高植物对非生物胁迫耐受性的能力将在世界范围对农民是极大经济优势并且会允许在不利条件期间及在作物栽培否则是不可能的陆地上栽培作物。

作物产量因而可以通过优化前述因素之一而增加。

ATP依赖性分子伴侣样蛋白质ClpA(At3g52490)是参与调节性蛋白质降解及蛋白质聚集体的溶解和降解的ClpAP蛋白酶的部分。例如，ClpA识别特异性蛋白质中的序列，然后以依赖ATP的方式解折叠该蛋白质，并转运入相关ClpP蛋白质的降解室。小接头样蛋白质ClpS调节ClpA的活性，是此蛋白质的重要调节因子。它保护ClpA免受自降解，且似乎改变(redirect)其活性远离可溶性蛋白质，偏向聚集的蛋白质。

取决于最终用途，对某些产量性状的改良可能优先于其它产量性状。例如对于应用如饲料或木材生产或生物燃料资源而言，增加植物营养体部分可能是希望的，而对于应用如面粉、淀粉或油生产而言，增加种子参数可能是尤其希望的。即便在种子参数当中，某些参数可以更优先于其它参数，这取决于应用。多种机制可以对增加种子产量有贡献，无论形式为增加的种子大小或是增加的种子数目。

现在已经发现，可以通过调节植物中编码POI(目的蛋白)多肽的核酸的表达改善非胁迫条件下及环境胁迫条件下植物中的多种产量相关性状。

发明简述

本发明涉及用于通过增加植物中编码POI多肽的核酸表达增强植物中一个或多个产量相关性状的方法。本发明还涉及具有编码POI多肽的核酸的增加表达的植物，所述植物与对照植物相比具有一个或多个增强的产量相关性状。本发明也提供了在实施本发明方法中有用的迄今未知的POI多肽、POI核酸和包含编码POI的核酸的构建体。

优选的实施方案是一种在植物中相对于对照植物增强一个或多个产量相关性状的方法，所述方法包括步骤：增加，优选地通过重组方法增加植物中编码POI多肽的核酸表达，优选地所述核酸是外源的，其中表达优选地处在与编码POI多肽的核酸有效连接的启动子序列控制下，并且培育该植物。本发明的这些方法包括增加植物中编码POI多肽的核酸的表达并且因而与对照相比植物增强所述植物的一个或多个产量相关性状。术语“因而增强”理解为包括增加POI多肽表达的直接作用以及间接作用，只要增加的编码POI多肽的核酸的表达导致增强至少一种产量相关性状。例如转录因子A的过量表达可以增加另一种转录因子B的转录，转录因子B转而控制给定途径的许多基因的表达，导致增强的生物量或种子产量。虽然转录因子A不直接增强导致增强的产量相关性状的途径的基因表达，但是增加的A表达是增强的产量相关性状的作用的原因。

因此，本发明的一个目的是提供与有益启动子序列有效连接的包含编码POI多肽的核酸的表达盒和载体构建体。提供这类基因构建体用于制备转基因植物的用途，所述转基因植物相对于对照植物具有一个或多个增强的产量相关性状，优选地增加的生物量。

另外，优选实施方案是用本发明的一个或多个表达盒转化并且因此以特定方式表达编码POI蛋白的核酸的转基因植物，其中植物具有一个或多个增强的产量相关性状。本发明转基因植物的可收获部分和源自转基因植物及其可收获部分的产物也是本发明的部分。

发明详述

本发明显示增加植物编码POI多肽的核酸的表达产生了相对于对照植物具有一个或多个增强的产量相关性状的植物。

根据第一实施方案，本发明提供用于相对于对照植物增强植物中一个或多个产量相关性状的方法，包括增加植物中编码POI多肽的核酸表达并且任选地选择具有一个或多个增强的产量相关性状的植物。根据另一个实施方案，本发明提供一种用于产生相对于对照植物具有一个或多个增强的产量相关性状的植物的方法，其中所述方法包括以下步骤：增加所述植物中编码如本文所述的POI多糖的核酸表达并且任选地选择具有一个或多个增强的产量相关性状的植物。

一种用于增加编码POI多肽的核酸表达的优选方法是在植物中引入并且表达编码POI多肽的核酸。

下文对“本发明方法中有用的蛋白质”的任意谈及意指如本文定义的POI多肽。下文对“本发明方法中有用的核酸”的任意谈及意指能够编码这种POI多肽的核酸。在一个实施方案中，对“本发明方法中有用的蛋白质或核酸”的任意谈及理解为意指“在本发明的方法、构建体、植物、可收获部分和产物中有用的“蛋白质或核酸”。待引入植物(并且因此在实施本发明的方法中有用)的核酸是编码现在将进行描述的蛋白质类型的任意核酸，下文也称作“POI核酸”或“POI基因”。POI基因编码蛋白伴侣样多肽。

本文定义的“POI多肽”指任意分子伴侣样多肽(CLP)，优选含双Clp-N基序的P环核苷三磷酸水解酶超家族蛋白质，更优选包含Interpro基序IPR004176(Clp，N端)和/或IPR023150(双Clp-N基序)，优选二者。在优选实施方案中，POI多肽指包含附加的ATP依赖性蛋白酶活性的CLP多肽。在另一优选实施方案，该CLP多肽在用Interproscan软件(此软件的详情见实施例4)分析时包含PFAM结构域PF02861，甚至更优选包含PFAM结构域PF02861作为CLP中的断裂(split)结构域，其中PFAM结构域PF02861的N端部分在N端或N端附近找到匹配，优选按优先顺序起始于CLP多肽的N端的100、90、80、70、60、55、50、45、40、35、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸内，PFAM结构域PF02861的C端部分在C端找到匹配，其中两个匹配的氨基酸序列定位在CLP多肽的N端一半，优选定位在N端四分之一。在一个实施方案中，在忽略CLP多肽的任意前序列、N端标记、信号肽或转运肽时，断裂PFAM结构域的N端部分匹配CLP多肽的起始于CLP多肽的残基20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，优选起始于残基23或24，最优选起始于氨基酸残基24的氨基酸残基。

在另一优选实施方案，优选在用InterProScan软件(InterProScan v4.8&the InterPro database版本41.0,2013年2月13日)分析时，CLP多肽包含Interpro基序IPR004176(Clp，N-端)和/或IPR023150(双Clp-N基序)(优选二者)及PFAM结构域PF02861，但不包含PFAM结构域PF00004(缩写为AAA)和/或不包含PFAM结构域PF07724(缩写为AAA_2)。

在一个实施方案中，在植物宿主细胞中表达时，CLP多肽适于形成EC 3.4.21.92的蛋白酶活性与内源多肽的蛋白质复合物，但CLP多肽本身不具有EC 3.4.21的酶活性。

在另一优选实施方案中，优选在用InterProScan软件(InterProScanv4.8&the InterPro database版本41.0,2013年2月13日)分析时，CLP多肽优选在本文所述的CLP多肽的N端部分中包含Interpro基序IPR004176(Clp，N-端)和/或IPR023150(双Clp-N基序)(优选二者)及PFAM结构域PF02861，且在PFAM结构域PF02861后向C端的部分中，多肽链直至(即包括)C端包含按数目计比具有碱性侧链的氨基酸多的具有酸性侧链的氨基酸，和/或包含按数目计至少30％(即CLP多肽的每100个氨基酸)，优选按数目计至少35％、40％、44％、45％、46％、47％、48％或49％的脂肪族氨基酸和脂肪族羟基氨基酸，其中脂肪族氨基酸是具有单字母密码G、A、V、L和I的那些，脂肪族羟基氨基酸是丝氨酸和苏氨酸。优选地，可以用Sequence Manipulation Suite(Stothard P(2000)The Sequence Manipulation Suite:JavaScript programs for analyzing andformatting protein and DNA sequences.Biotechniques 28:1102-1104)来测定这些。

更优选地，从PF02861结构域向后直至C端，丝氨酸和苏氨酸按数目计占CLP多肽的氨基酸的至少10％、12％、13％、14％或15％。优选地，可以用Sequence Manipulation Suite(Stothard P(2000)The SequenceManipulation Suite:JavaScript programs for analyzing and formattingprotein and DNA sequences.Biotechniques 28:1102-1104)来测定这些。还在另一优选实施方案中，从PF02861结构域向后直至C端的该CLP多肽链部分是酸性氨基酸链，即在从包含PF02861结构域的N端部分分开分析时，它具有低于7.0，优选等于或小于6.0、更优选等于或小于5.5的等电点值(pI)。本领域中可用多种技术和工具来测定给定多肽链的pI值。在一个实施方案中，用Sequence Manipulation Suite(Stothard P(2000)TheSequence Manipulation Suite:JavaScript programs for analyzing andformatting protein and DNA sequences.Biotechniques 28:1102-1104)测定pI值。

在一个实施方案中，用于本发明的方法、构建体、植物、可收获部分和产物中的核酸序列是编码CLP多肽的序列，但排除编码2009年4月16日作为US2009/100536公开的第一发明人为Thomas Adams的专利申请US 11/879,787中公开的多肽序列(如SEQ ID NO:425、426或427)和/或UniProt数据库(可从EMBL European Bioinformatics Institute,EMBL-EBI,Wellcome Trust Genome Campus,Hinxton,Cambridge,CB101SD,UK和http://www.ebi.ac.uk/uniprot/获得)中作为Q9SVD0公开的多肽的那些核酸。

根据一个实施方案，提供了用于相对于对照植物改善植物中如本文提供的产量相关性状的方法，所述方法包括增加植物中编码如本文定义的CLP多肽的核酸表达。优选地，所述一个或多个增强的产量相关性状包括相对于对照植物增加的产量，并且优选地包括相对于对照植物增加的生物量和/或增加的种子产量，并且优选地包括相对于对照植物增加的地上部分生物量，增加的地下部分生物量、增加的种子产量和/或增加的糖产量(如每株植物、每份鲜重、每份干重或每个面积的可收获糖)。

在一个实施方案中，在本发明的方法、构建体、植物、可收获部分和产物中所用的核酸序列是

选自以下的核酸分子：

(i)由SEQ ID NO:1、86、88、90、92、94、96、98、100、102或104代表的核酸，优选由SEQ ID NO:1代表的核酸；

(ii)由SEQ ID NO:1、86、88、90、92、94、96、98、100、102或104代表的核酸的互补核酸，优选由SEQ ID NO:1代表的核酸的互补核酸；

(iii)编码CLP多肽的核酸，所述CLP多肽以增加的优选顺序与SEQID NO:2、87、89、91、93、95、97、99、101、103或105，优选与SEQID NO:2所代表的氨基酸序列具有至少35％、40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性并且额外地或备选地包含一个或多个基序，所述基序以增加的优选顺序与SEQ ID NO:76至SEQ ID NO:81中所给出的基序的任意一个或多个基序和如上定义的共有基序1至3(SEQID NO:83至SEQ ID NO:85)的一个或多个基序具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性，并且还优选地相对于对照植物赋予一个或多个增强的产量相关性状；和

(iv)与(i)至(iii)的核酸分子在高严格杂交条件下杂交并且优选地相对于对照植物赋予一个或多个增强的产量相关性状的核酸分子；

或编码选自以下的多肽：

(i)由SEQ ID NO:2、87、89、91、93、95、97、99、101、103或105代表的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO:2代表的氨基酸序列；

(ii)氨基酸序列，所述氨基酸序列以增加的优选顺序与SEQ ID NO:2、87、89、91、93、95、97、99、101、103或105，优选与SEQ ID NO:2所代表的氨基酸序列具有至少35％、40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性并且额外地或备选地包含一个或多个基序，所述基序以增加的优选顺序与SEQ ID NO:76至SEQ ID NO:81中所给出的基序的任意一个或多个基序和如上定义的共有基序1至3(SEQ ID NO:83至SEQ ID NO:85)的一个或多个基序具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性，并且还优选地相对于对照植物赋予一个或多个增强的产量相关性状；和

(iii)以上(i)或(ii)中给出的任一氨基酸序列的衍生物。

优选地，多肽包含如本文中其他地方定义的一个或多个基序和/或结构域。

使用如图2和实施例2中所显示的比对结果并推导共有序列，得出共有序列。

在一个实施方案中，CLP多肽包含如SEQ ID NO:75中给出的共有序列。

如下文显示的基序1至6如实施例2和4中所述那样产生。

在另一实施方案中，如本文所用的CLP多肽包含如下文定义的基序1、2、3、4、5或6的至少一个，其中在任意基序的字母-数目组合–x(a,b)-中，字母x代表Xaa，即任意氨基酸，并且整数数字a和b给出可以在位居x之前的氨基酸后存在的Xaa的最小数字和最大数字。例如，S-x(0,3)-P表示在氨基酸丝氨酸后可以在脯氨酸残基之前包含任意选择的一个、两个或三个氨基酸，或无氨基酸存在于这个基序的丝氨酸和脯氨酸残基之间。

因此，字母

–x(2)

表示在基序的这个位置处确切地存在任意类型的两个氨基酸。括号内无数字的单个–x表示在基序的这个位置处存在的任意类型的一个氨基酸残基。

另外，替换–x的任意氨基酸残基可以与居其之前或尾随其后的氨基酸残基相同或不同，或在相同或任意其他位置处插入任意其他氨基酸替代–x。

方括号内的残基代表备选残基。

在一个优选实施方案中，POI多肽包含

1)以下全部基序：

基序1(SEQ ID NO:76)：

A-[AGLV]-K-x(0,2)-I-x(1,3)-Q-L-[IMV]-[IV]-S-I-L-[DH]-D-P-S-V-S-R-V-M-R-[DE]-A-[DG]-F-[NS]-S-[PST]-x-[LV]-[KR]-[ANST]-x-[IV]-E-x-[AE]；

基序2(SEQ ID NO:77)：

F-x-E-x-[NST]-[ADEST]-E-N-L-x(2)-L-[CS]-x-A-L-x(2)-[EKR]-x-[PST]

基序3(SEQ ID NO:78)：

T-W-[FLM]-[FL]-F-x-G-x-[DGN]-x(2)-[ADG]-[KR]-x(2)-[IMV]-[ACS]-x-E-L-A-x-[LV]-V-F-G-S-x(3)-[FV]-x-[ACST]-x(3)-[ADGS]-[ADEGNST]；

基序4(SEQ ID NO:79)：

G-x(1,2)-V-x(0,1)-L-x-[LV]-[EG]-D-L-x-[WY]-x(2)-[DE]-x(2)-[AST]；

基序5(SEQ ID NO:80)：

E-x(0,4)-L-x-[PT]-[FILV]-[ATV]-[IV]-P-[ADV]-[GST],和

基序6(SEQ ID NO:81)：

L-x-D-[AST]-I-[IV]-[IV]-x-[CGNS]-x-[AEQ]；

或

2)根据1)的基序和另外如SEQ ID NO:75下所列序列所代表的共有序列；或

3)根据上面1)或2)的基序，且另外包含所有下面的共有基序

共有基序1(SEQ ID NO:83):HPLQC[KR]ALELCF[NS]VA

共有基序2(SEQ ID NO:84):NAL[GV]AA[LF]KRAQAHQR

和

共有基序3(SEQ ID NO:85)：LDDPSVSRVMREA[GS]F；

或

4)在1)中所列出的任意5个基序和3)中所列出的所有3个共有基序；或

5)在1)中所列出的任意4个基序和3)中所列出的所有3个共有基序；或

6)在1)中所列出的任意4个基序和3)中所列出的任一个共有基序；或

7)在1)中所列出的任意3个基序；或

8)本文表B1或表B2中列出的结构域中的任一个或多个；或

9)上文1)中所列出的所有基序、上文3)中所列出的所有基序，另外如上文所述的作为断裂结构域的Interpro基序IPR004176(Clp,N-端)和IPR023150(双Clp-N端)，以及PFAM结构域PF02861，任选来自本文表B2中列出的那些中的任意其他结构域；或

10)如本文以上所述的基序之一。

在另一实施方案中，CLP多肽以增加的优选顺序包含至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或全部6个除如上文定义的共有序列之外的基序。

额外地或备选地，CLP蛋白以增加的优选顺序与由SEQ ID NO:2、87、89、91、93、95、97、99、101、103或105代表的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO:2代表的的氨基酸序列具有至少25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％总体序列同一性，条件是该同源蛋白包含任意一个或多个如上文所概述的保守基序。使用总体比对算法，如程序GAP(GCG Wisconsin Package,Accelrys)中的Needleman Wunsch算法，优选地采用默认参数并且优选地采用成熟蛋白质的序列(即不考虑分泌信号或转运肽)，确定总体序列同一性。在一个实施方案中，通过在SEQ IDNO:2、87、89、91、93、95、97、99、101、103或105的氨基酸序列，优选SEQ ID NO:2的序列的整个长度范围内比较多肽序列确定序列同一性水平。可选地，通过核酸序列与SEQ ID NO:1、86、88、90、92、94、96、98、100、102或104，优选SEQ ID NO:1中编码成熟蛋白的序列比较确定序列同一性。在另一个实施方案中，通过在1、86、88、90、92、94、96、98、100、102或104，优选SEQ ID NO:1的序列的编码序列的整个长度范围内比较核酸序列确定核酸序列的序列同一性水平。

在另一个实施方案中，通过将SEQ ID NO:2、87、89、91、93、95、97、99、101、103或105，优选SEQ ID NO:2中的一个或多个保守结构域或基序与其他CLP多肽中的相应保守结构域或基序比较，确定序列同一性水平。与总体序列同一性相比，仅考虑保守的结构域或基序时，所述序列同一性通常将更高。优选地，CLP多肽中的基序以增加的优选顺序与SEQ ID NO:76至SEQ ID NO:81(基序1至6)中所给出的基序的任意一个或多个基序和如上定义的共有基序1至3(SEQ ID NO:83至SEQ IDNO:85)的一个或多个基序和/或如SEQ ID NO:31所代表的共有序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。换句话说，在另一个实施方案中提供一种用于增强植物中一个或多个产量相关性状的方法，其中所述CLP多肽包含与SEQ ID NO:2中始于氨基酸11直至氨基酸166的保守结构域具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的保守结构域。

术语“结构域”、“标签”和“基序”在本文“定义”部分中定义。

优选地，该多肽序列在构建进化系统树(如图5中所绘制的一个进化系统树)中使用时，与包含由SEQ ID NO:2、87、89、91、93、95、97、99、101、103或105所代表的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO:2所代表的氨基酸序列所代表的氨基酸序列的CLP多肽组聚类，而不与任意其他组聚类。

在另一个实施方案中，本发明的多肽在构建进化系统树(如图3中所绘制的一个进化系统树)中使用时，使离开SEQ ID NO:2、87、89、91、93、95、97、99、101、103或105，优选SEQ ID NO:2所代表的氨基酸序列的氨基酸序列的不多于4、3或2个等级分支点(hierarchical branch point)聚类。

在一个实施方案中，CLP多肽(至少以其天然形式)一般具有ATP结合活性，和/或具有或有助于ATP-依赖性蛋白酶活性。用于测量ATP结合活性或ATP-依赖性蛋白酶活性的工具和技术是本领域熟知的。另外，当根据本发明方法如实施例7和9中所概述那样在稻中表达时，编码CLP多肽的核酸产生在正常或干旱条件下，具有增加的产量相关性状、尤其具有增加的地上部分生物量、增加的植物重心高度，和特别具有增加的种子产量的植物。在活的植物细胞中转录并翻译编码CLP多肽的核酸序列时，本发明的这种核酸序列的另一个功能是赋予合成CLP蛋白的信息，所述CLP蛋白增加如本文所述的产量或产量相关性状。

通过用SEQ ID NO:1所代表的核酸序列转化植物说明本发明，其中所述核酸序列编码SEQ ID NO:2的多肽序列。然而，本发明的实施不限于这些序列；本发明的方法可以有利地使用如本文中定义的任意编码CLP的核酸或CLP多肽实施。如本文所用的术语“CLP”或“CLP多肽”还意在包括如下文定义的SEQ ID NO:2代表的氨基酸序列的同源物。

在本文实施例部分的表A中给出编码CLP多肽的核酸的例子。此类核酸用于实施本发明的方法。在实施例部分的表A中给出的氨基酸序列是由SEQ ID NO:2所代表的CLP的直向同源物和旁系同源物的例子序列，术语“直向同源物”和“旁系同源物”如本文中定义。可以通过执行如定义部分中所述的所谓交互性blast检索轻易地鉴定其他直向同源物和旁系同源物；在查询序列是SEQ ID NO:1、86、88、90、92、94、96、98、100、102或104，优选SEQ ID NO:1，或SEQ ID NO:2、87、89、91、93、95、97、99、101、103或105，优选SEQ ID NO:2的情况下，第二BLAST(反向BLAST)将针对番茄序列。

对于本发明的或用于本发明的方法、构建体、植物、可收获部分和产物中的序列，在一个实施方案中，将并非源自高等植物的核酸或多肽序列用于本发明的方法或用于本发明的方法的表达构建体。在另一实施方案中，将植物来源的核酸或多肽序列用于本发明的方法、构建体、植物、可收获部分和产物，因为该核酸和多肽分别具有针对植物中的表达优化的密码子选择及植物中常见的氨基酸和调节位点的使用的特征。植物来源可以是任意植物，但优选本文所述的那些植物。还在另一实施方案中，将并非源自高等植物但人为改变为具有高等植物的密码子选择的核酸序列用于本发明的方法中所用的表达构建体。

本发明还提供了迄今未知的编码CLP的核酸和CLP多肽，其用于相对于对照植物在植物中赋予一个或多个增强的产量相关性状。

根据本发明的另一实施方案，因而提供选自以下的分离核酸分子：

(i)由表A中任意SEQ ID NO所代表的核酸；

(ii)由表A中任意SEQ ID NO所代表的核酸的互补核酸；

编码CLP多肽的核酸，所述CLP多肽以增加的优选顺序与表A中的任意氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性并且额外地或备选地包含一个或多个基序，所述基序以增加的优选顺序与SEQ ID NO:76至SEQ ID NO:81中所给出的基序的任意一个或多个基序和如上定义的共有基序1至3(SEQ ID NO:83至SEQ ID NO:85)的一个或多个基序具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性，并且还优选地相对于对照植物赋予一个或多个增强的产量相关性状；和

(iii)与(i)至(iii)的核酸分子在高严格杂交条件下杂交并且优选地相对于对照植物赋予一个或多个增强的产量相关性状的核酸分子。

根据本发明的另一实施方案，还提供分离的多肽，其选自：

(i)由表A中任意SEQ ID NO所代表的氨基酸序列代表的氨基酸序列；

(ii)氨基酸序列，所述氨基酸序列以增加的优选顺序与表A中任意SEQ ID NO所代表的氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性并且额外地或备选地包含一个或多个基序，所述基序以增加的优选顺序与SEQ ID NO:76至SEQ ID NO:81中所给出的基序的任意一个或多个基序和如上定义的共有基序1至3(SEQ ID NO:83至SEQID NO:85)的一个或多个基序具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性，并且还优选地相对于对照植物赋予一个或多个增强的产量相关性状；和

(iii)以上(i)或(ii)中给出的任一氨基酸序列的衍生物。

在一个实施方案中，本发明方法中有用的核酸是表I中作为前导序列或同源物列出的那些，或编码表II中作为前导序列或同源物列出的蛋白质序列的那些，或包含表IV中所示的共有序列和样式的那些。

核酸变体也可以用于实施本发明的方法。此类变体的例子包括编码在实施例部分的表A中所给出的任一个氨基酸序列的同源物和衍生物的核酸，术语“同源物”和“衍生物”如本文中定义。下述核酸也在本发明的方法、构建体、植物、可收获部分和产物中有用，所述核酸在实施例部分表A中所给出的任一个氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的同源物和衍生物。在本发明方法中有用的同源物和衍生物与衍生它们的非修饰蛋白质具有基本上相同的生物活性和功能活性。在实施本发明方法中有用的其他变体是其中优化了密码子选择或其中去除miRNA靶位点的变体。

在实施本发明方法中有用的其他核酸变体包括编码CLP多肽的核酸的部分、与编码CLP多肽的核酸杂交的核酸、编码CLP多肽的核酸的剪接变体、编码CLP多肽的核酸的等位变体和通过基因改组获得的编码CLP多肽的核酸的变体。术语“杂交序列”、“剪接变体”、“等位变体”和“基因改组”如本文所述。

编码CLP多肽的核酸不需要是全长核酸，因为本发明方法的实施不依赖于使用全长核酸序列。根据本发明，提供了用于增强植物中一个或多个产量相关性状的方法，所述方法包括在植物中引入，优选地通过重组方法引入并且表达在实施例部分的表A中给出的任一个核酸序列的一部分或编码在实施例部分表A中给出的任一氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸的一部分。

核酸的一部分可以例如通过对所述核酸产生一个或多个缺失而制备。所述部分可以以分离的形式使用或它们可以与其他编码(或非编码)序列融合，例如旨在产生组合有几种活性的蛋白质。与其他编码序列融合时，翻译时产生的所得多肽可以比对该蛋白质部分所预测的多肽更大。

在本发明的方法、构建体、植物、可收获部分和产物中有用的部分编码了如本文中定义的CLP多肽或至少其部分，并且具有与实施例部分表的A中给出的氨基酸序列基本上相同的生物活性。优选地，该部分是在实施例部分的表A中给出的任一核酸的一部分，或是编码在实施例部分的表A中给出的任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸的一部分。优选地，该部分具有至少500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、1950、2000、2050、2100、2150、2200、2250、2300、2350、2400或2048个连续核苷酸长度，所述连续核苷酸属于在实施例部分表A中给出的任一核酸序列或属于编码在实施例部分表A中给出的任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸。最优选地，该部分是由SEQ ID NO:1、86、88、90、92、94、96、98、100、102或104，优选SEQ ID NO:1的核酸的部分。优选地，该部分编码氨基酸序列的片段，所述氨基酸序列包含如上文定义的基序1至6，更优选另外的共有基序1至3和共有序列和/或具有ATP-依赖性蛋白酶生物活性，和/或与SEQ ID NO:2、87、89、91、93、95、97、99、101、103或105代表的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO:2代表的具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、93％、95％、97％或99％序列同一性。

在本发明的方法、构建体、植物、可收获部分和产物中有用的另一种核酸变体是能够在降低的严格条件下，优选在严格条件下与如本文中定义的编码CLP多肽的核酸或与如本文中定义的部分杂交的核酸。根据本发明，提供了一种用于增强植物中一个或多个产量相关性状的方法，包括在植物中引入，优选地通过重组方法引入并且表达下述核酸，所述核酸能够与编码实施例部分的表A中给出的任一种蛋白质的核酸的互补核酸杂交，或与下述核酸的互补核酸杂交，所述核酸编码表A中给出的任一种蛋白质的直向同源物、旁系同源物或同源物。

在本发明的方法、构建体、植物、可收获部分和产物中有用的杂交序列编码了如本文中定义的CLP多肽，所述多肽具有与实施例部分表的A中给出的氨基酸序列基本上相同的生物活性。优选地，该杂交序列能够与编码实施例部分的表A中给出的任一种蛋白质的核酸的互补核酸或与这些序列中任一序列的一部分杂交，所述的一部分如本文定义，或该杂交序列能够与下述核酸的互补核酸杂交，所述核酸编码在实施例部分的表A中给出的任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物。最优选地，杂交序列能够与核酸的互补核酸或与其部分杂交，其中所述核酸编码如SEQ ID NO:2、87、89、91、93、95、97、99、101、103或105，优选SEQ ID NO:2代表的多肽。在一个实施方案中，杂交条件是中等严格的，优选地是高严格的，如本文定义。

优选地，该杂交序列编码具有下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列包含如上文定义的基序1至6，更优选另外的共有基序1至3和共有序列和/或具有ATP-依赖性蛋白酶生物活性和/或与SEQ ID NO:2、87、89、91、93、95、97、99、101、103或105代表的氨基酸序列，优选由SEQ IDNO:2代表的具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、93％、95％、97％或99％序列同一性。

在另一个实施方案中，提供一种用于增强植物中一个或多个产量相关性状的方法，所述方法包括在植物中引入，优选地通过重组方法引入并且表达编码实施例部分的表A中给出的任一种蛋白质的核酸的剪接变体或编码在实施例部分的表A中给出的任一氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸的剪接变体。

优选的剪接变体是由SEQ ID NO:1、86、88、90、92、94、96、98、100、102或104，优选地SEQ ID NO:1代表的核酸的剪接变体，或编码SEQ ID NO:2、87、89、91、93、95、97、99、101、103或105，优选SEQID NO:2所代表的氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸的剪接变体。优选地，由该剪接变体编码的氨基酸序列包含如上文定义的基序1至6，更优选另外的共有基序1至3和共有序列和/或具有ATP-依赖性蛋白酶生物活性和/或与SEQ ID NO:2、87、89、91、93、95、97、99、101、103或105，优选SEQ ID NO:2所代表的氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、93％、95％、97％或99％序列同一性。

在另一实施方案中，提供一种用于增强植物中一个或多个产量相关性状的方法，所述方法包括在植物中引入，优选地通过重组方法引入并且表达编码在实施例部分的表A中给出的任一种蛋白质的核酸的等位变体，或包括在植物中引入，优选地通过重组方法引入并且表达下述核酸的等位变体，其中所述核酸编码在实施例部分的表A中给出的任一氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物。

由本发明方法中有用的等位变体编码的多肽具有与SEQ ID NO:2、87、89、91、93、95、97、99、101、103或105，优选SEQ ID NO:2的CLP多肽和实施例部分的表A中所述的任一氨基酸序列基本上相同的生物活性。等位变体存在于自然界中，并且在本发明的方法中包括使用这些天然的等位基因。优选地，该等位变体是1、86、88、90、92、94、96、98、100、102或104，优选SEQ ID NO:1的等位变体或编码SEQ ID NO:2、87、89、91、93、95、97、99、101、103或105，优选SEQ ID NO:2所代表的氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸的等位变体。优选地，由该等位变体编码的氨基酸序列包含如上文定义的基序1至6，更优选另外的共有基序1至3和共有序列和/或具有ATP-依赖性蛋白酶生物活性和/或与SEQ ID NO:2、87、89、91、93、95、97、99、101、103或105，优选SEQ ID NO:2所代表的氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、93％、95％、97％或99％序列同一性。

在另一个实施方案中，可用于本发明方法、构建体、植物、可收获部分和产物中的多肽序列与SEQ ID NO:2、87、89、91、93、95、97、99、101、103或105代表的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO:2代表的的序列相比具有取代、缺失和/或插入，其中所述氨基酸取代、插入和/或缺失可以各自是1至10个氨基酸。

在另一实施方案中，提供一种用于增强植物中一个或多个产量相关性状的方法，所述方法包括在植物中引入，优选地通过重组方法引入并且表达编码在实施例部分的表A中给出的任一种蛋白质的核酸的变体，或包括在植物中引入，优选地通过重组方法引入并且表达下述核酸的变体，其中所述核酸编码在实施例部分的表A中给出的任一氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物，所述变体核酸通过基因改组获得。

优选地，由借助基因改组所获得的变体核酸编码的氨基酸序列包含如上文定义的基序1至6，更优选另外的共有基序1至3和共有序列和/或具有ATP-依赖性蛋白酶生物活性和/或与SEQ ID NO:2、87、89、91、93、95、97、99、101、103或105代表的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO:2代表的具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、93％、95％、97％或99％序列同一性。

另外，也可以通过位点定向诱变获得核酸变体。几种方法可用于实现位点定向诱变，最常见方法是基于PCR的方法(Current Protocols inMolecular Biology.Wiley编著)。与SEQ ID NO:2、87、89、91、93、95、97、99、101、103或105，优选SEQ ID NO:2的序列差异一个或几个氨基酸(如本文定义的取代、插入和/或缺失)的CLP多肽可以同等地在本发明的方法和构建体和植物中用来增加植物的产量。

编码CLP肽的核酸可以源自任意天然或人工来源。该核酸可以通过人类有意操作，在组成和/或基因组环境方面从其天然形式修改而来。优选地，编码CLP多肽的核酸来自植物，还优选地来自双子叶植物，更优选地来自十字花科(Brassicaceae)，最更优选地来自鼠耳芥属(Arabidopsis)，最优选地核酸来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)。

用于增强植物中如本文所述的一个或多个产量相关性状的本发明方法包括在植物中引入，优选地通过重组方法引入和表达如本文定义的核酸，并且优选地包括培育植物的另一步骤和任选地收获植物或其部分的步骤。

在另一个实施方案中，本发明扩展至包含在本发明方法中有用的核酸序列的重组染色体DNA，其中所述核酸因为重组方法而存在于该染色体DNA中，但是不位于其天然遗传环境中。在另一实施方案中，本发明的重组染色体DNA包含于植物细胞中。包含于细胞、特别地具有细胞壁的细胞如植物细胞内部的DNA受到更好地保护免遭裸核酸序列那样的降解、破坏和/或断裂。这适用于包含在宿主细胞(例如植物细胞)中的DNA构建体。

在一个优选实施方案中，本发明涉及包含本发明的重组染色体DNA和/或本发明的构建体和宿主细胞，优选地植物细胞的组合物，其中重组染色体DNA和/或构建体包含于宿主细胞内部，优选地包含于具有植物细胞或细胞壁的宿主细胞内部。在另一实施方案中，所述组合物包含死宿主细胞、活宿主细胞或死宿主细胞和活宿主细胞的混合物，其中本发明的重组染色体DNA和/或构建体可以位于死宿主细胞和/或活宿主细胞中。任选地，组合物还可以包含不包含本发明的重组染色体DNA或本发明的构建体的宿主细胞。本发明的组合物可以用于扩增或分配本发明的重组染色体DNA和/或构建体的过程中，和或可选地用来如上文所解释那样保护本发明的重组染色体DNA和/或构建体免遭分解和/或降解。本发明的重组染色体DNA和/或本发明的构建体可以用作本发明组合物的品质标记，作为来源的指示物和/或作为生产商的指示物。

特别地，本发明的方法可以在非胁迫条件下实施。在一个实例中，本发明的方法可以在非胁迫条件如轻度干旱下实施以产生相对于对照植物具有增加的产量的植物。

在另一个实施方案中，本发明的方法可以在胁迫条件下，优选地在非生物胁迫条件下实施。

在一个例子中，本发明的方法可以在胁迫条件如干旱下实施以产生相对于对照植物具有增加的产量的植物。

在另一个例子中，本发明的方法可以在胁迫条件如养分缺乏下实施以产生相对于对照植物具有增加的产量的植物。

养分缺乏可以因缺少养分如氮、磷酸盐和其他含磷化合物、钾、钙、镁、锰、铁和硼及其他元素所致。

在另一实例中，本发明的方法可以在胁迫条件如盐胁迫下实施以产生相对于对照植物具有增加的产量的植物。术语“盐胁迫”不限于食盐(NaCl)，不过可以是NaCl、KCl、LiCl、MgCl₂、CaCl₂等中的任意一种或多种。

在另一例子中，本发明的方法可以在胁迫条件如寒冷胁迫或冰冻胁迫下实施以产生相对于对照植物具有增加的产量的植物。

在一个优选实施方案中，实施本发明的方法，使用需要增加非生物胁迫耐受性例如耐旱性、盐度和/或冷温度或热温度和/或因一种或多种养分缺乏如缺氮所致的养分利用的耐受性的植物。

本发明方法的实施产生了具有一个或多个增强的产量相关性状的植物。特别地，本发明方法的实施产生了相对于对照植物具有早期生长和/或增加的产量、尤其增加的生物量和/或增加的种子产量。术语“早期生长势”、“产量”和“种子产量”在本文的“定义”部分中更详细地描述。

本发明因此提供一种用于相对于对照植物增加植物的产量相关性状、尤其生物量产量和/或种子产量的方法，所述方法包括增加植物中编码如本文定义的CLP多肽的核酸的表达。

根据本发明的优选特征，本发明方法的实施产生了相对于对照植物具有增加的生长速率的植物。因此，根据本发明，提供一种用于增加植物生长速率的方法，所述方法包括在植物中增加编码如本文中定义的CLP多肽的核酸表达。

相对于可比较条件下培育的对照植物，本发明方法的实施给予在非胁迫条件下或在干旱条件下所培育的植物增加的产量相关性状，优选增加的生物量和/或种子产量。因此，根据本发明，提供一种用于增加非胁迫条件下或在干旱条件下所培育的植物中产量相关性状，优选增加生物量和/或种子产量的方法，所述方法包括增加植物中编码CLP多肽的核酸表达。

相对于可比较条件下生长的对照植物，本发明方法的实施给予在养分缺乏条件下、尤其缺氮条件下所培育的植物增加的产量相关性状。因此，根据本发明，提供一种用于增加养分缺乏下所培育的植物中产量相关性状的方法，所述方法包括增加植物中编码POI多肽的核酸表达。

相对于可比较条件下培育的对照植物，本发明方法的实施给予盐胁迫条件下所培育的植物增加的产量相关性状。因此，根据本发明，提供一种用于增加盐胁迫下所培育的植物中产量相关性状的方法，所述方法包括增加植物中编码POI多肽的核酸表达。

在本发明的一个实施方案中，增加根生物量，优选地增加甜菜和/或直根生物量，更优选地在糖料甜菜植物中增加，并且任选地不增加种子产量和/或地上部分生物量。

在本发明的另一个实施方案中，增加地上部分生物量，优选地增加茎、茎秆和/或茎段(sett)生物量，更优选地在禾本科(Poaceae)中、甚至更优选地在甘蔗属(Saccharum)物种中，最优选地在甘蔗中增加，并且任选地不增加种子产量和/或根生长。

在另一实施方案中，增加可收获总糖，优选地葡萄糖、果糖和/或蔗糖，优选地还增加如本文定义的其他产量相关性状，例如生物量，和更优选地还增加含糖量，优选地葡萄糖、果糖和/或蔗糖含量。

本发明也提供基因构建体和载体以促进在植物中引入和/或表达编码CLP多肽的核酸。可以将基因构建体插入适于转化至植物或宿主细胞中并且适于在转化细胞中表达目的基因的载体，所述载体可以是市售的。本发明也提供如本文中定义的基因构建体在本发明方法中的用途。

更具体地，本发明提供构建体，其包含：

(a)编码如上文定义的CLP多肽的分离的核酸；

(b)能够驱动(a)的核酸序列表达的一个或多个控制序列；和任选地

(c)转录终止序列。

优选地，编码CLP多肽的核酸如上文定义。术语“控制序列”和“终止序列”如本文定义。

具体而言，本发明的基因构建体是植物表达构建体，即，在已经将该构建体引入，优选地通过重组手段引入这种植物、植物细胞或植物组织后允许编码CLP的核酸在植物、植物细胞或植物组织中表达的基因构建体。植物表达构建体可以例如包含编码CLP的所述核酸，所述核酸与启动子和任选地控制所述核酸在一个或多个植物细胞中表达的其他控制序列处于功能性连接，其中启动子和任选的其他控制序列不天然地与所述核酸功能性连接。在一个优选实施方案中，当已经将本发明的构建体引入植物、植物细胞或植物组织时，包含启动子的控制序列导致所述核酸的过量表达。

本发明的基因构建体可以包含于宿主细胞，例如植物细胞、种子、农产品或植物中。用包含上述任意核酸的基因构建体如载体或表达盒转化植物或宿主细胞。因此，本发明进一步提供用如上文所述的构建体转化的植物或宿主细胞。具体而言，本发明提供用如上文所述的构建体转化的植物。所述植物具有如本文所述的增加的产量相关性状。

在一个实施方案中，本发明的基因构建体向此时已经引入该构建体的植物赋予增加的产量或产量相关性状，所述植物表达包含于该基因构建体中并且优选地导致增加CLP多肽丰度的编码CLP的核酸。在另一个实施方案中，本发明的基因构建体向包含其中已经引入该构建体的植物细胞的植物赋予增加的产量或产量相关性状，所述植物细胞表达包含于基因构建体中的编码CLP的核酸。

这种基因构建体中的启动子可以相对于上述核酸是非天然启动子，即与其天然环境下启动子调节所述核酸的表达。

在一个优选实施方案中，可用于本发明方法、构建体、植物、可收获部分和产物中的编码CLP多肽的核酸与启动子处于功能性连接，导致编码CLP多肽的所述核酸在

－单子叶植物植物，优选地禾本科植物、更优选地甘蔗属物种植物的地上部分生物量，优选地叶子和苗、更优选地茎中，和/或

-双子叶植物、更优选地茄科和/或甜菜属物种植物的叶、地下生物量和/或根生物量，优选地块茎、直根和/或甜菜器官、更优选地直根和甜菜器官中表达。

本发明的表达盒或基因构建体可以包含于宿主细胞、植物细胞、种子、农产品或植物中。

技术人员非常清楚必须在所述基因构建体上存在以便成功转化、选择和增殖含有目的序列的宿主细胞的遗传元件。目的序列与一个或多个控制序列(至少与启动子)有效地连接。

有利地，任意类型的启动子，无论是天然的或合成的，均可以用来驱动该核酸序列表达，不过优选地，该启动子是植物源的。组成型启动子特别用于所述方法中。对于多种启动子类型的定义，见本文的“定义”部分。

组成型启动子优选地是中等强度的遍在组成型启动子。更优选地，它是植物衍生的启动子，例如植物染色体来源的启动子，如GOS2启动子或具有基本上相同强度并且具有基本上相同表达模式的启动子(功能等同的启动子)，更优选地，该启动子是来自稻的GOS2启动子。更优选地，该组成型启动子由基本上与SEQ ID NO:82相似的核酸序列代表，最优选地，该组成型启动子是如SEQ ID NO:82所代表的组成型启动子。对于组成型启动子的其他例子，见本文的“定义”部分。

应当明白本发明的适用性不限于SEQ ID NO:1所代表的编码CLP多肽的核酸，当编码CLP多肽的核酸受组成型启动子驱动时，本发明的适用性也不限于GOS2稻启动子。

另一实施方案涉及可用于本发明方法、载体构建体、植物、可收获部分和产物中的基因构建体，其中基因构建体包含本发明的CLP核酸，所述本发明的CLP核酸功能性连接至如本文以上公开的启动子并且还功能性连接至以下一个或多个增强核酸表达的核酸(NEENA)：

a)如作为WO2011/023537公开的国际专利申请中第27页至第28页上表1中公开和/或SEQ ID NO:1至19和/或如所述国际申请的权利要求1的项i)至vi)中所定义，其中NEENA在此通过引用的方式并入；和/或

b)如作为WO2011/023539公开的国际专利申请中第27页上表1中公开和/或SEQ ID NO:1至19和/或如所述国际申请的权利要求1的项i)至vi)中所定义，其中NEENA在此通过引用的方式并入；和/或

c)如含于或公开于以下中：

i)2011年7月5日作为EP 11172672.5提交的欧洲优先权申请第27页上表1中和/或SEQ ID NO:1至14937，优选地SEQ ID NO:1至5、14936或14937，和/或如所述欧洲优先权申请的权利要求1的项i)至vi)中所定义，其中NEENA在此通过引用的方式并入；和/或

ii)2011年7月6日作为EP 11172825.9提交的欧洲优先权申请第27页上表1中和/或SEQ ID NO:1至65560，优选地SEQ ID NO:1至3，和/或如所述欧洲优先权申请的权利要求1的项i)至vi)中所定义，其中NEENA在此通过引用的方式并入；和/或

d)具有基本上相同的增强作用的等同物；和/或

2)功能性连接至一个或多个可靠性增强核酸(RENA)分子

a)如含于或公开于2011年9月15日作为EP 11181420.8提交的欧洲优先权申请第26页上表1中和/或SEQ ID NO:1至16或94至116666，优选地SEQ ID NO:1至16，和/或如所述欧洲优先权申请的权利要求1的项a)的点i)至v)中所定义，其中RENA分子在此通过引用的方式并入；或

b)具有基本上相同的增强作用的等同物。

本发明的优选实施方案涉及可用于本发明方法、构建体、植物、可收获部分和产物中并在如本文以上所述的启动子控制下编码处本发明CLP多肽的核酸分子，其中NEENA、RENA和/或启动子相对于编码本发明CLP多肽的所述核酸分子是异源的。

任选地，可以在引入植物的构建体中使用一个或多个终止子序列。本领域技术人员将知道可能适用于实施本发明的终止子序列。优选地，该构建体包含这样的表达盒，其包含基本上与SEQ ID NO:82相似的与编码CLP多肽的核酸有效连接的GOS2启动子。另外，编码选择标记的一个或多个序列可以存在于引入植物的构建体上。

根据本发明的优选特征，受调节的表达是增加的表达。本领域中充分记录了用于增加核酸或者基因或基因产物表达的方法并且在定义部分中提供了例子。

如上文提到，用于增加编码CLP多肽的核酸表达的优选方法是通过在植物中引入，优选地通过重组方法引入并且表达编码CLP多肽的核酸；然而，使用其他熟知的技术，包括但不限于T-DNA激活标签法、TILLING、同源重组，也可以实现实施本方法的效果，即增强一个或多个产量相关性状。在定义部分中提供对这些技术的描述。

本发明也提供一种用于产生转基因植物的方法，所述转基因植物相对于对照植物具有一个或多个增强的产量相关性状，其中所述方法包括在植物中引入并且表达编码如本文所定义的CLP多肽的任意核酸。

更具体地，本发明提供一种用于产生转基因植物的方法，所述转基因植物具有一个或多个增强的产量相关性状，特别地增加的生物量，优选地地上部分和/或根生物量，和/或种子产量，所述方法包括：

(i)在植物或植物细胞中引入，优选地通过重组方法引入并且表达编码的CLP多肽的核酸或包含编码CLP多肽的核酸的基因构建体；和

(ii)在促进植物生长和发育，优选地促进相对于对照植物具有一个或多个增强的产量相关性状的植物的植物生长和发育的条件下培育植物细胞。

优选地，通过重组方法引入POI多肽-编码核酸。

(i)的核酸可以是能够编码如本文中定义的CLP多肽的任意核酸。

在促进植物生长和发育的条件下培育植物细胞，可以或可以不包括再生和/或生长至成熟。因此，在本发明的一个特定实施方案中，通过本发明方法转化的植物细胞可再生成为转化的植物。在另一个特定实施方案中，通过本发明方法转化的植物细胞不可再生成为转化的植物，即，使用本领域已知的细胞培养技术不能够再生成植物的细胞。尽管植物细胞通常具有全能性特征，但是一些植物细胞不能用来从所述细胞再生或繁殖出完整植物。在本发明的一个实施方案中，本发明的植物细胞是此类细胞。在另一个实施方案中，本发明的植物细胞是不以自养方式自我维持的植物细胞。一个例子是不能借助光合作用通过从此类无机物质如水、二氧化碳和无机盐合成糖类和蛋白质而自我维持的植物细胞。

可以将核酸直接引入植物细胞或引入植物自身中(包括引入组织、器官或植物的任意其他部分)。根据本发明的优选特征，核酸优选地通过转化引入植物或植物细胞中。术语“转化”在本文的“定义”部分中更详细地描述。

在一个实施方案中，本发明的方法是用于产生相对于对照植物具有一个或多个增强的产量相关性状的转基因甘蔗禾本科植物，优选地甘蔗属物种植物、其转基因植物部份或转基因植物细胞的方法，所述方法包括从转基因植物收获茎段并栽种茎段并且将茎段培育成植物步骤，其中茎段包含编码CLP多肽的外源核酸和与之有效连接的启动子序列。

在一个实施方案中，本发明扩展至通过本文所述任意方法产生的任意植物细胞或植物，并扩展至全部植物部分及其繁殖体。

本发明包括通过本发明方法可获得的植物或其部分(包括种子)。植物或植物部分或植物细胞包含如上文定义的，优选地在基因构建体(如表达盒)中包含编码CLP多肽的核酸转基因。本发明进一步扩展以包括已经通过前述任意方法产生的原代转化或转染细胞、组织、器官或完整植物的子代，唯一要求是子代展示出与本发明方法中由亲本产生的那些相同的基因型和/或表型特征。

在另一实施方案中，本发明扩展至重组地包含如上文所述的本发明表达盒、本发明基因构建体或编码CLP的核酸和/或CLP多肽的种子。一般，从本发明种子培育的植物也将显示增强的产量相关性状。

本发明也包括宿主细胞，其含有编码如上文定义的CLP多肽的分离核酸。在一个实施方案中，本发明的宿主细胞是植物细胞、酵母、细菌或真菌。对本发明方法中所用的核酸、构建体、表达盒或载体，宿主植物原则上有利地是能够合成本发明方法中所用多肽的全部植物。在一个特定实施方案中，本发明的植物细胞过量表达本发明的核酸分子。

在另一实施方案中,本发明涉及包含本发明构建体的转基因花粉粒和/或本发明植物细胞的单倍体衍生物。虽然在一个具体实施方案中，本发明的花粉粒不能用来在不添加其他遗传物质的情况下再生完整植株和/或不能够光合作用，但是本发明的花粉粒可以具有以下用途：通过使用本发明的活花粉粒使另一个植株的卵细胞受精，从受精的卵细胞产生种子并从所产生的种子培育出植物，将增强的产量相关性状引入另一个植株中。另外，使用花粉粒作为地理和/或时间来源的标志物。

本发明的方法有利地适用于任意植物，尤其适用于如本文中定义的任意植物。在本发明方法中特别有用的植物包括属于植物界超家族、尤其单子叶和双子叶植物的全部植物，包括饲用或饲料豆科植物、观赏植物、粮食作物、树或灌木。根据本发明的一个实施方案，植物是作物植物。作物植物的例子包括但不限于菊苣、胡萝卜、木薯、百脉根、大豆、甜菜、糖料甜菜、向日葵、卡诺拉油菜、苜蓿、菜籽、亚麻、棉花、番茄、马铃薯、甜叶菊属(Stevia)物种如但不限于甜叶菊(Stevia rebaudiana)和烟草。根据本发明的另一个实施方案，植物是单子叶植物。单子叶植物的实例包括甘蔗。根据本发明的另一个实施方案，植物是谷类植物。谷类的实例包括稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱、二粒小麦、斯佩耳特小麦、单粒小麦、画眉草(teff)、蜀黍(milo)和燕麦。在一个特定实施方案中，本发明的或在本发明方法中所用的植物选自玉米、小麦、稻、大豆、棉花、油籽油菜(包括卡诺拉油菜)、甘蔗、糖料甜菜和苜蓿。有利地，本发明方法比已知的方法更高效，原因是与可比较方法中使用的对照植物相比，本发明的植物具有增加的产量和/或增加的针对环境胁迫的胁迫耐受性。

本发明也扩展至植物的可收获部分如，但不限于种子、叶、果实、花、茎、茎段、根、根状茎、块茎和球茎，所述可收获部分包含编码如本文定义的CLP多肽的重组核酸。具体而言，这类可收获部分是根如直根、根状茎、果实、茎、甜菜根、块茎、球茎、叶、花和/或种子。在一个实施方案中可收获部分是茎插枝(如甘蔗茎段)。

本发明还涉及从这种植物的一个或多个可收获部分衍生或产生，优选地从中直接衍生或产生的产物，如干燥颗粒，压茎、茎段、粕或粉末、纤维、含有由本发明植物产生的纤维的布、纸或纸板、油、脂肪和脂肪酸、含糖淀粉、含有由本发明植物产生的糖的纸或纸板、树汁、果汁、碎干草或蛋白质。优选的糖类是淀粉、纤维素和/或糖，优选地是蔗糖。优选的产物还是残余干纤维，例如，茎(如去除甘蔗汁后来自甘蔗的甘蔗渣)、糖蜜或滤渣的残余干纤维，优选地来自甘蔗的残余干纤维。所述产物可以是农产品。

在一个实施方案中，该产品包含编码CLP多肽的重组核酸和/或重组CLP多肽，例如作为该产品特定品质的指示物。在另一个实施方案中，本发明涉及防伪的磨碎种子、磨碎的茎和/或磨碎的根，其具有本发明的植物细胞和/或本发明的构建体以作为来源的指示和/或作为生产商的指示，其中磨碎的根优选地是磨碎的甜菜根，更优选地磨碎的糖料甜菜根。

本发明也包括用于制造产品的方法，包括a)培育本发明的植物并且b)从或借助本发明的植物或其部分(包括茎、茎段根、甜菜根和/或种子)产生所述产品。在另一实施方案中，所述方法包括步骤a)培育本发明的植物，b)从这些植物中取出如本文所述的可收获部分和c)从或采用本发明的可收获部分产生所述产品。

在一个实施方案中，本发明的方法是一种通过以下方式制造布匹的方法：a)培育能够产生可用于布匹制造的纤维的本发明植物，例如棉花，b)从所述植物取出如本文所述的可收获部分，和c)从所述可收获部分产生纤维和d)从c)的纤维产生布匹。本发明的另一个实施方案涉及一种产生用于生物反应器、发酵过程或生物燃气厂的进料的方法，所述方法包括a)培育本发明的植物，b)从这些植物中取出如本文所述的可收获部分和c)产生用于生物反应器、发酵过程或生物燃气厂的进料。在一个优选实施方案中，本发明的方法是一种从来自植物材料产生醇的方法，所述方法包括a)培育本发明的植物，b)从这些植物中取出如本文所述的可收获部分和c)任选地产生用于发酵过程的进料，和d)-在步骤b)或c)后-从所述进料或可收获部分产生一种或多种醇，优选地通过使用微生物如真菌、藻类、细菌或酵母或细胞培养物产生。一个常见例子将是使用含糖可收获部分例如玉米种子、甘蔗茎部分或糖料甜菜的甜菜根部分生产乙醇。\

在一个实施方案中，从转基因植物的茎产生产物。在另一个实施方案中，从根，优选地植物直根和/或甜菜根产生产物。

在另一个实施方案中，本发明的方法是一种用于产生一种或多种聚合物的方法，所述方法包括a)培育本发明的植物，b)从这些植物中取下如本文所述的可收获部分和c)从可收获部分产生一种或多种单体，任选地涉及中间产物，d)通过所述单体至少之一与其他单体反应或所述单体彼此反应产生一种或多种聚合物。在另一个实施方案中，本发明的方法是一种用于产生药物化合物的方法，所述方法包括a)培育本发明的植物，b)从这些植物中取下如本文所述的可收获部分和c)从可收获部分产生一种或多种单体，任选地涉及中间产物，d)从可收获部分和/或中间产物产生药物化合物。在另一个实施方案中，本发明的方法是一种用于产生一种或多种化学品的方法，所述方法包括a)培育本发明的植物，b)从这些植物中取下如本文所述的可收获部分和c)从可收获部分产生一种或多种化学结构单元，如但不限于乙酸酯、丙酮酸酯、乳酸酯、脂肪酸、糖、氨基酸、核苷酸、类胡萝卜素、类萜或类固醇，任选地涉及中间产物，d)通过所述结构单元至少之一与其他所述结构单元反应或所述所述结构单元彼此反应产生一种或多种化学品。

本发明也涉及通过如本文所述的用于制造产品的方法获得的产品。在另一实施方案中，通过本发明的制造方法产生的产物是植物产物，如但不限于食品原料、饲料原料、食品补充物、饲料补充物、纤维、化妆品或药物。在另一个实施方案中，这些生产方法用来制备农产品，如但不限于纤维、植物提取物、一个或多个提取过程后的饼粕或压滤饼和其他边角料、粉、蛋白质、氨基酸、糖类、脂肪、油、聚合物、维生素等。优选的糖类是糖，优选地是蔗糖。在一个实施方案中，农产品选自由1)纤维、2)木材、3)植物提取物、4)一个或多个提取过程后的饼粕或压滤饼或其他边角料、5)面粉、6)蛋白质、7)糖类、8)脂肪、9)油、10)聚合物例如纤维素、淀粉、木质素、木质纤维素、和11)1)至10)中任一者的组合和/或混合物。在优选的实施方案中，产物或农产品通常不包含活植物细胞，包含如本文所述的表达盒、基因构建体、蛋白质和/或多核苷酸。

在另一实施方案中，本发明的多核苷酸或多肽或构建体包含于农产品中。在一个特定实施方案中，本发明的核酸序列和蛋白质可以用作产品标志物，例如在通过本发明方法产生农产品的情况下。这种标志物可以用来鉴定已经由有利方法产生的产品，其中所述的有利方法不仅导致该方法的更高效率，还导致改进的产品质量，原因在于该方法中所用的植物材料和可收获部分的品质提高。可以通过本领域已知的多种方法检测此类标志物，例如，但不限于基于PCR的核酸检测方法或基于抗体的蛋白质检测方法。

本发明也包括编码如本文中所述的CLP多肽的核酸的用途，和这些CLP多肽的用途，用于增强植物中任意的前述产量相关性状。例如，编码本文中所述的CLP多肽的核酸或CLP多肽自身可以用于育种计划中，在所述育种计划中鉴定到可以与编码CLP多肽的基因遗传连锁的DNA标记。这些核酸/基因或CLP多肽本身可以用来定义分子标记。这种DNA或蛋白质标志物随后可以用于育种计划中以在本发明方法中选择具有如本文所定义的一个或多个增强的产量相关性状的植物。另外，编码CLP多肽的核酸/基因的等位变体也可以用于标记辅助的育种程序中。编码CLP多肽的核酸也可以用作探针以遗传地和物理地定位这些核酸作为其部分的基因并且用作与这些基因连锁的性状的标志物。此类信息可能用于植物育种中以开发具有所需表型的品系。

在一个实施方案中，与对照植物和对照植物的相应植物部分相比，本发明植物或其部分并且尤其所述植物的可收获部分的总贮藏糖类含量增加。贮藏糖类优选地是糖如，但不限于蔗糖、果糖和葡萄糖，和多糖，如但不限于淀粉、葡聚糖和果聚糖。可以按本领域已知的许多方式测量总贮藏糖类含量和各个类别或种类的糖的含量。例如，作为WO2006066969公开的国际申请在第[79]至[117]段中公开了确定甘蔗的总贮藏糖类含量(包括果聚糖含量)的方法。

另一种用于甘蔗的方法如下：

将转基因甘蔗植物在温室或田间培育10至15个月。使用用于培育植物的标准条件。

收获具有10至15月龄并具有超过10节间的甘蔗植物的茎秆。在已经移除全部叶后，将茎秆的节间从顶部(＝1)至底部(例如＝36)编号。从每个节间的中部切下重量大约1-2g的茎秆圆片。随后将3个节间的茎秆圆片合并以产生一份样品并冷冻在液氮中。

对于糖提取，首先将茎秆圆片在Waring搅拌器(来自Waring，NewHartford，Connecticut，美国)中粉碎。通过在95℃在10mM磷酸钠缓冲液pH7.0中振摇1小时，提取糖。此后，通过经30μm筛过滤移除固形物。随后将所产生的溶液糖用于测定(见下文)。

将转基因甘蔗植物生长10至15个月。在每种情况下，使转基因系和野生型甘蔗植物的甘蔗茎秆脱叶，将茎秆分成具有3个节间的段，并且将这些节间段在密封的50ml塑料容器中冷冻于液氮中。测定样品的鲜重。出于糖测定目的的提取如下文所述那样进行。

通过NAD+(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)转化成NADH(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)，在酶测定法中以光度测定方式确定根据上文描述的糖提取方法所获得的提取物中的葡萄糖含量、果糖含量和蔗糖含量。在还原期间，烟酰胺环处的芳族特征丧失，并且吸收光谱因此改变。可以按光度测定方式检测到吸收光谱的这种改变。借助酶己糖激酶和腺苷三磷酸(ATP)，提取物中存在的葡萄糖和果糖转化成葡萄糖-6-磷酸和果糖-6-磷酸。葡萄糖-6-磷酸随后由酶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶氧化以产生6-磷酸葡萄糖酸。在这个反应中，NAD+还原以产生NADH，并且以光度测定方式测定形成的NADH的量。形成的NADH和提取物中存在的葡萄糖之间的比率是1:1，因而可以使用NADH的摩尔吸收系数(每摩尔和每cm光路6.31)，从NADH含量算出葡萄糖含量。在葡萄糖-6-磷酸完全氧化后，已经在溶液中同样形成的果糖-6-磷酸由磷酸葡萄糖异构酶转化以产生葡萄糖-6-磷酸，后者转而氧化以产生6-磷酸葡萄糖酸。再次，果糖和形成的NADH的量之间的比率是1:1。此后，提取物中存在的蔗糖由蔗糖酶(Megazyme)切割以产生葡萄糖和果糖。释放的葡萄糖分子和果糖分子随后用上述酶在NAD+依赖性反应中转化以产生6-磷酸葡萄糖酸。一个蔗糖分子转化成6-磷酸葡萄糖酸产生两个NADH分子。同样以光度测定方式测定形成的NADH的量并且使用NADH的摩尔吸收系数，将它用于计算蔗糖含量。

如上所述，在每种情况下将甘蔗茎秆分成3个节间的段。将节间从顶部至底部编号(顶部＝节间1，底部＝节间21)。

另外，可以使用本领域已知的任意方法分析转基因甘蔗植物，所述方法例如是但不限于：

●通过全宽度Hatch采样器对甘蔗采样；ICUMSA(国际糖分析统一方法委员会，http://www.icumsa.org/index.php？id＝4)方法GS 5-5(1994)，从Verlag Dr.Albert Bartens KG,Lückhoffstr.16,14129Berlin(http://www.bartens.com/)可获得

●通过取样管法对甘蔗采样；ICUMSA方法GS 5-7(1994)，从VerlagDr.Albert Bartens KG,Lückhoffstr.16,14129Berlin(http://www.bartens.com/)可获得

●通过气相色谱测定糖蜜和工厂产品-官方；和甘蔗汁中的蔗糖；ICUMSA方法GS 4/7/8/5-2(2002)，从Verlag Dr.Albert Bartens KG,Lückhoffstr.16,14129Berlin(http://www.bartens.com/)可获得

●通过气相色谱测定甘蔗糖蜜中蔗糖、葡萄糖和果糖以及甜菜糖蜜中的蔗糖；ICUMSA方法GS 7/4/8-23(2011)，从Verlag Dr.Albert BartensKG,Lückhoffstr.16,14129Berlin(http://www.bartens.com/)可获得

●通过高效离子色谱测定甘蔗汁、糖浆和糖蜜中的葡萄糖、果糖和蔗糖以及甜菜糖蜜中的蔗糖；ICUMSA方法GS 7/8/4-24(2011)，从Verlag Dr.Albert Bartens KG,Lückhoffstr.16,14129Berlin(http://www.bartens.com/)可获得。

对于甘蔗之外的作物，相似方法是本领域已知的或可以从用于另一种作物的已知方法容易地改造。例如，可以在针对糖料甜菜修改的情况下，通过上文描述用于甘蔗的任意方法，测定糖料甜菜的贮藏糖类含量。

另外，可以使用本领域已知的任意方法对转基因糖料甜菜植物分析生物量或它们的含糖量或其他表型参数，所述方法例如是但不限于：

●通过酶促方法甜菜汁和加工产物中的葡萄糖和果糖-ICUMSA(国际糖分析统一方法委员会，http://www.icumsa.org/index.php？id＝4)方法GS8/4/6-4(2007)，从Verlag Dr.Albert Bartens KG,Lückhoffstr.16,14129Berlin(http://www.bartens.com/)可获得

●通过HPAEC-PAD测定甜菜糊和甜菜汁中的甘露醇、葡萄糖、果糖、蔗糖和蜜三糖；ICUMSA方法GS8-26(2011)，从Verlag Dr.Albert BartensKG,Lückhoffstr.16,14129Berlin(http://www.bartens.com/)可获得

●通过气相色谱测定甘蔗糖蜜中蔗糖、葡萄糖和果糖以及甜菜糖蜜中的蔗糖；ICUMSA方法GS 7/4/8-23(2011)，从Verlag Dr.Albert BartensKG,Lückhoffstr.16,14129Berlin(http://www.bartens.com/)可获得

●通过高效离子色谱测定甘蔗汁、糖浆和糖蜜中的葡萄糖、果糖和蔗糖以及甜菜糖蜜中的蔗糖；ICUMSA方法GS 7/8/4-24(2011)，从Verlag Dr.Albert Bartens KG,Lückhoffstr.16,14129Berlin(http://www.bartens.com/)可获得

●通过酶促方法甜菜汁和加工产物中的葡萄糖和果糖；ICUMSA方法GS 8/4/6-4(2007)，从Verlag Dr.Albert Bartens KG,Lückhoffstr.16,14129Berlin(http://www.bartens.com/)可获得

●通过Luff Schoorl法测定甜菜渣的表观总含糖量；ICUMSA方法GS 8-5(1994)，从Verlag Dr.Albert Bartens KG,Lückhoffstr.16,14129Berlin(http://www.bartens.com/)可获得。

另外，本发明涉及下列具体的实施方案，其中表述“如权利要求/项X中定义”意指指导技术人员如项/权利要求X中所公开那样适用该定义。例如，“如项1中所定义的核酸应如此理解，从而如项1中的核酸的定义应适用于该核酸。因此，术语“如项中所定义的”或“如权利要求中定义”可以分别用该项或权利要求的相应定义替换。

另外，本发明涉及以下具体实施方案：

1.一种用于相对于对照植物增强植物中一个或多个产量相关性状的方法，所述方法包括调节，优选增加植物中编码CLP多肽的核酸的表达，其中所述的CLP多肽包含Interpro基序IPR004176(Clp,N-端)和/或IPR023150(双Clp-N基序)，优选包含此基序两者，任选包含优选作为断裂结构域的PFAM结构域PF02861，其中PFAM结构域PF02861的N-端在CLP多肽的N-端处或其附近发现匹配，且PFAM结构域PF02861的C-端在CLP多肽的C-端发现匹配，其中匹配的氨基酸序列定位在CLP多肽的N-端的一半处，优选定位在CLP多肽的N-端四分之一处，且其中所述CLP多肽选自：

(i)表A中列出的任意SEQ ID NO的氨基酸序列，优选SEQ ID NO:2、87、89、91、93、95、97、99、101、103或105的氨基酸序列，更优选SEQ ID NO:2的氨基酸序列；和

(ii)氨基酸序列，其以增加的优选顺序与表A中列出的任意SEQ IDNO的氨基酸序列，优选SEQ ID NO:2、87、89、91、93、95、97、99、101、103或105的氨基酸序列，更优选SEQ ID NO:2的氨基酸序列在与表A中列出的任意SEQ ID NO的氨基酸序列，优选SEQ ID NO:2、87、89、91、93、95、97、99、101、103或105的氨基酸序列，更优选SEQ IDNO:2的氨基酸序列的整个长度范围内具有至少35％、40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，并且还优选地相对于对照植物赋予一个或多个增强的产量相关性状。

2.根据实施方案1的方法，其中CLP多肽以增加的优选顺序与SEQID NO:2、87、89、91、93、95、97、99、101、103或105，优选SEQ IDNO:2所代表的氨基酸序列的多肽序列在SEQ ID NO:2、87、89、91、93、95、97、99、101、103或105，优选SEQ ID NO:2所代表的氨基酸序列的整个氨基酸序列长度范围内具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。

3.根据实施方案1或2的方法，其中所述增加的表达通过在植物中引入并且表达编码所述CLP多肽的所述核酸实现。

4.根据实施方案1、2或3的方法，其中所述核酸选自：

(i)由SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69或71代表的核酸，优选由SEQ ID NO:1代表的核酸；

(ii)由SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69或71代表的核酸，优选由SEQ ID NO:1代表的核酸的互补核酸；

(iii)编码POI多肽的核酸，所述POI多肽以增加的优选顺序与由表A列出的任意SEQ ID NO的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO:2代表的所代表的完整氨基酸序列具有至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，并且还优选地相对于对照植物赋予一个或多个增强的产量相关性状；和

(iv)与(i)至(iii)的核酸分子在高严格杂交条件下杂交并且优选地相对于对照植物赋予一个或多个增强的产量相关性状的核酸分子。

5.根据实施方案1至4中任一个实施方案的方法，其中所述一个或多个增强的产量相关性状包含相对于对照植物增加的产量，并且优选地包括相对于对照植物增加的生物量和/或增加的种子产量。

6.根据实施方案1至5中任一个实施方案的方法，其中所述一个或多个增强的产量相关性状在非胁迫条件下获得。

7.根据实施方案1至5中任一个实施方案的方法，其中所述一个或多个增强的产量相关性状在环境胁迫条件下获得。

8.根据实施方案1至7中任一个实施方案的方法，其中所述CLP多肽包含：

i)以下全部基序：

基序1(SEQ ID NO:76)：

A-[AGLV]-K-x(0,2)-I-x(1,3)-Q-L-[IMV]-[IV]-S-I-L-[DH]-D-P-S-V-S-R-V-M-R-[DE]-A-[DG]-F-[NS]-S-[PST]-x-[LV]-[KR]-[ANST]-x-[IV]-E-x-[AE]；

基序2(SEQ ID NO:77)：

F-x-E-x-[NST]-[ADEST]-E-N-L-x(2)-L-[CS]-x-A-L-x(2)-[EKR]-x-[PST]

基序3(SEQ ID NO:78)：

T-W-[FLM]-[FL]-F-x-G-x-[DGN]-x(2)-[ADG]-[KR]-x(2)-[IMV]-[ACS]-x-E-L-A-x-[LV]-V-F-G-S-x(3)-[FV]-x-[ACST]-x(3)-[ADGS]-[ADEGNST]；

基序4(SEQ ID NO:79)：

G-x(1,2)-V-x(0,1)-L-x-[LV]-[EG]-D-L-x-[WY]-x(2)-[DE]-x(2)-[AST]；

基序5(SEQ ID NO:80)：

E-x(0,4)-L-x-[PT]-[FILV]-[ATV]-[IV]-P-[ADV]-[GST],和

基序6(SEQ ID NO:81)：

L-x-D-[AST]-I-[IV]-[IV]-x-[CGNS]-x-[AEQ]；

或

ii)根据i)的基序和另外如SEQ ID NO:75下所列序列所代表的共有序列；或

iii)根据上面i)或ii)的基序，且另外包含所有下面的共有基序

共有基序1(SEQ ID NO:83):HPLQC[KR]ALELCF[NS]VA

共有基序2(SEQ ID NO:84):NAL[GV]AA[LF]KRAQAHQR

和

共有基序3(SEQ ID NO:85)：LDDPSVSRVMREA[GS]F；

或

iv)在i)中所列出的任意5个基序和iii)中所列出的所有3个共有基序；或

v)在i)中所列出的任意4个基序和iii)中所列出的所有3个共有基序；或

vi)在i)中所列出的任意4个基序和iii)中所列出的任一个共有基序；或

vii)在i)中所列出的任意3个基序；或

viii)如本文以上所述的基序之一；

其中–x代表在任意基序位置存在经常如–x之后括号内最低整数数字或最高整数数字或者最低数字和最高数字之间任意整数数字指示的任意类型的氨基酸残基，其中最低整数数字和最高整数数字可能是相同的并且因此仅一个整数数字存在于–x之后的括号内部，并且其中–x(1)缩写为–x，并且在-x位置插入的任意氨基酸残基不需要与前一个氨基酸残基或另一个插入的氨基酸残基是相同类型。

9.根据实施方案1至8中任一个实施方案的方法，其中编码CLP多肽的所述核酸是植物来源的，优选地来自双子叶植物，进一步优选地来自十字花科，最优选地来自鼠耳芥属。

10.根据实施方案1至9中任一个实施方案的方法，其中所述编码CLP的核酸编码在表A中所列的任一种多肽或是这种核酸的一部分或是能够与这种核酸的互补序列杂交的核酸。

11.根据实施方案1至10中任一个实施方案的方法，其中所述核酸序列编码在表A中给出的任一多肽的直向同源物或旁系同源物。

12.根据实施方案1至11中任一个实施方案的方法，其中所述核酸编码由SEQ ID NO:2所代表的氨基酸序列代表的多肽。

13.根据实施方案1至12中任一个实施方案的方法，其中所述的核酸与植物来源的组成型启动子，优选地与植物来源的中等强度组成型启动子、更优选地与GOS2启动子、最优选地与来自稻的GOS2启动子有效连接。

14.通过根据实施方案1至14中任一个实施方案的方法可获得的植物、或其部分或植物细胞，其中所述植物、植物部分或植物细胞包含编码如实施方案1、2、4和8至12中任一个实施方案中所限定的CLP多肽的重组核酸。

15.构建体，其包含：

(i)编码如实施方案1、2、4和8至12中任一个实施方案中所限定的CLP的核酸；

(ii)能够驱动(i)的核酸序列表达的一个或多个控制序列；和任选地

(iii)转录终止序列。

16.根据实施方案15的构建体，其中所述控制序列之一是植物来源的组成型启动子，优选地是植物来源的中等强度组成型启动子，更优选地是GOS2启动子，最优选地是来自稻的GOS2启动子。

17.宿主细胞，优选地细菌宿主细胞、更优选地农杆菌物种宿主细胞，其包含根据实施方案15或16中任一个实施方案的构建体或如实施方案4中所限定的核酸。

18.根据实施方案15或16的构建体在用于制备植物的方法中的用途，所述植物相对于对照植物具有一个或多个增强的产量相关性状，优选地相对于对照植物具有增加的产量，并且更优选地相对于对照植物具有增加的种子产量和/或增加的生物量。

19.用根据实施方案15或16的构建体转化的植物、植物部分或植物细胞。

20.用于产生转基因植物的方法，所述转基因植物相对于对照植物具有一个或多个增强的产量相关性状，优选地相对于对照植物具有增加的产量，并且更优选地相对于对照植物具有增加的种子产量和/或增加的生物量，所述方法包括：

(i)在植物细胞或植物中引入并且表达编码如实施方案1、2、4和8至12中任一个实施方案中所限定的CLP多肽的核酸；并且

(ii)在促进植物生长和发育的条件下培育所述植物细胞或植物。

21.转基因植物或源自所述转基因植物的转基因植物细胞，所述转基因植物相对于对照植物具有一个或多个增强的产量相关性状，优选地相对于对照植物具有增加的产量，并且更优选地具有增加的种子产量和/或增加的生物量，原因在于编码如实施方案1、2、4和7至12中任一个实施方案中所限定的CLP多肽的核酸表达增加。

22.根据实施方案14、19或21的转基因植物或源自其的转基因植物细胞，其中所述植物是作物植物，如甜菜、糖料甜菜或苜蓿，或单子叶植物如甘蔗；或谷类，如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱、二粒小麦、斯佩耳特小麦、单粒小麦、画眉草、蜀黍或燕麦。

23.根据实施方案22的植物的可收获部分，其中所述可收获部分优选地是苗生物量和/或根生物量和/或种子。

24.产物，从根据实施方案22的植物和/或从根据实施方案23的植物的可收获部分衍生。

25.编码如实施方案1、2、4和8至12中任一个实施方案中所限定的CLP多肽的核酸的用途，用于相对于对照植物增强植物中的一个或多个产量相关性状，优选地用于增加产量，并且更优选地用于相对于对照植物，增加植物中的种子产量和/或增加生物量。

26.一种用于制造产品的方法，包括以下步骤：培育根据实施方案14、19、21或22的植物并且从或借助所述植物或其包括种子在内的部分产生所述产品。

27.重组染色体DNA，包含根据实施方案15或16构建体。

28.根据实施方案15或16的构建体或根据实施方案27的重组染色体DNA，其包含于植物细胞，优选地作物植物细胞中。

额外或备选的实施方案：

A.根据实施方案1至13中任一个实施方案的方法，其中所述多肽由核酸分子编码，所述核酸分子包含选自以下的核酸分子：

(i)由SEQ ID NO:1(中任一个)代表的核酸；

(ii)由SEQ ID NO:1(中任一个)代表的核酸的互补核酸；

(iii)编码多肽的核酸，所述多肽如SEQ ID NO:2、87、89、91、93、95、97、99、101、103或105(中任一个)代表的氨基酸序列，优选由SEQID NO:2代表的中任一者所代表，并且还优选地相对于对照植物赋予一个或多个增强的产量相关性状；

(iv)核酸，其以增加的优选顺序与SEQ ID NO:1(中任意)核酸序列具有至少30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，并且还优选地相对于对照植物赋予一个或多个增强的产量相关性状；

(v)与(i)和(iv)的核酸分子的互补核酸分子在严格杂交条件下杂交并且优选地相对于对照植物赋予一个或多个增强的产量相关性状的核酸分子；

(vi)编码所述多肽的核酸，所述多肽以增加的优选顺序与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57或59(中任意)，优选地SEQ ID NO:2、10、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57或59、更优选地SEQ ID NO:2、10或39、甚至更优选地SEQ ID NO:2所代表的氨基酸序列具有至少30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性并且优选地相对于对照植物赋予一个或多个增强的产量相关性状；或

(vii)包含以上(i)至(vi)的特征的任意组合的核酸。

B.产物，从根据实施方案14、19、20或22的植物和/或从根据实施方案23的植物的可收获部分产生。

C.根据实施方案15或16的构建体，包含于植物细胞中。

D.重组染色体DNA，包含根据实施方案15或16的构建体。

其他实施方案：

I.一种用于相对于对照植物增强植物中一个或多个产量相关性状的方法，所述方法包括调节，优选地增加植物中编码CLP多肽的核酸的表达，其中所述的CLP多肽包含Interpro基序IPR004176(Clp,N-端)和/或IPR023150(双Clp-N基序)，优选包含此基序两者，且包含作为断裂结构域的PFAM结构域PF02861，其中PFAM结构域PF02861的N-端在CLP多肽的N-端处或其附近发现匹配(match)，且PFAM结构域PF02861的C-端在CLP多肽的C-端发现匹配，其中匹配的氨基酸序列定位在CLP多肽的N-端的一半处，优选定位在CLP多肽的N-端四分之一处，并且其中所述CLP多肽选自：

(iii)表A中列出的任意SEQ ID NO的氨基酸序列，优选SEQ ID NO:2的氨基酸序列；和

(iv)氨基酸序列，其以增加的优选顺序与表A中列出的任意SEQ IDNO的氨基酸序列，优选SEQ ID NO:2的氨基酸序列在表A中列出的任意SEQ ID NO的氨基酸序列，优选SEQ ID NO:2的序列的整个长度范围内具有至少35％、40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，并且还优选地相对于对照植物赋予一个或多个增强的产量相关性状。

II.根据实施方案I的方法，其中所述核酸选自：

(v)由SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69或71代表的核酸，优选由SEQ ID NO:1代表的核酸；

(vi)由SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69或71代表的核酸，优选由SEQ ID NO:1代表的核酸的互补核酸；

(vii)编码POI多肽的核酸，所述POI多肽以增加的优选顺序与由表A中列出的任意SEQ ID NO的完整氨基酸序列，优选由SEQ ID NO:2的完整氨基酸序列具有至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，并且还优选地相对于对照植物赋予一个或多个增强的产量相关性状；和

(viii)与(i)至(iii)的核酸分子在高严格杂交条件下杂交并且优选地相对于对照植物赋予一个或多个增强的产量相关性状的核酸分子。

III.根据实施方案I或II的方法，其中所述增加的表达通过在植物中引入并且表达编码所述CLP多肽的所述核酸实现。

IV.根据实施方案1I至III中任一个实施方案的方法，其中所述CLP多肽包含

i)以下全部基序：

基序1(SEQ ID NO:76)：

A-[AGLV]-K-x(0,2)-I-x(1,3)-Q-L-[IMV]-[IV]-S-I-L-[DH]-D-P-S-V-S-R-V-M-R-[DE]-A-[DG]-F-[NS]-S-[PST]-x-[LV]-[KR]-[ANST]-x-[IV]-E-x-[AE]；

基序2(SEQ ID NO:77)：

F-x-E-x-[NST]-[ADEST]-E-N-L-x(2)-L-[CS]-x-A-L-x(2)-[EKR]-x-[PST]

基序3(SEQ ID NO:78)：

T-W-[FLM]-[FL]-F-x-G-x-[DGN]-x(2)-[ADG]-[KR]-x(2)-[IMV]-[ACS]-x-E-L-A-x-[LV]-V-F-G-S-x(3)-[FV]-x-[ACST]-x(3)-[ADGS]-[ADEGNST]；

基序4(SEQ ID NO:79)：

G-x(1,2)-V-x(0,1)-L-x-[LV]-[EG]-D-L-x-[WY]-x(2)-[DE]-x(2)-[AST]；

基序5(SEQ ID NO:80)：

E-x(0,4)-L-x-[PT]-[FILV]-[ATV]-[IV]-P-[ADV]-[GST],和

基序6(SEQ ID NO:81)：

L-x-D-[AST]-I-[IV]-[IV]-x-[CGNS]-x-[AEQ]；

或

ii)根据i)的基序和另外如SEQ ID NO:75下所列序列所代表的共有序列；或

iii)根据上面i)或ii)的基序，且另外包含所有下面的共有基序

共有基序1(SEQ ID NO:83):HPLQC[KR]ALELCF[NS]VA

共有基序2(SEQ ID NO:84):NAL[GV]AA[LF]KRAQAHQR

和

共有基序3(SEQ ID NO:85)：LDDPSVSRVMREA[GS]F；

或

iv)在i)中所列出的任意5个基序和iii)中所列出的所有3个共有基序；或

v)在i)中所列出的任意4个基序和iii)中所列出的所有3个共有基序；或

vi)在i)中所列出的任意4个基序和iii)中所列出的任一个共有基序；或

vii)在i)中所列出的任意3个基序；或

viii)如本文以上所述的基序之一；

其中–x在任意基序位置代表存在经常如–x之后括号内最低整数数字或最高整数数字或者最低数字和最高数字之间任意整数数字指示的任意类型的氨基酸残基，其中最低整数数字和最高整数数字可能是相同的并且因此仅一个整数数字存在于–x之后的括号内部，并且其中–x(1)缩写为–x，并且在-x位置插入的任意氨基酸残基不需要与前一个氨基酸残基或另一个插入的氨基酸残基是相同类型。

V.根据实施方案I至IV中任一个实施方案的方法，其中所述一个或多个增强的产量相关性状包含相对于对照植物增加的产量，并且优选地包括相对于对照植物增加的生物量和/或增加的种子产量。

VI.根据实施方案I至IV中任一个实施方案的方法，其中编码CLP多肽的所述核酸是植物来源的，优选地来自双子叶植物，进一步优选地来自十字花科，最优选地来自鼠耳芥属。

VII.根据实施方案I至VI中任一个实施方案的方法，其中所述的核酸与植物来源的组成型启动子，优选地与植物来源的中等强度组成型启动子、更优选地与GOS2启动子、最优选地与来自稻的GOS2启动子有效连接。

VIII.构建体，其包含：

(i)编码如实施方案I、II、IV、VI和VII中任一个实施方案中所限定的CLP的核酸；

(ii)能够驱动(i)的核酸序列表达的一个或多个控制序列；和任选地

(iii)转录终止序列。

IX.宿主细胞，优选地细菌宿主细胞、更优选地农杆菌物种宿主细胞，其包含根据实施方案VIII的构建体或如实施方案2中所限定的核酸。

X.根根据实施方案VIII的构建体在用于制备植物的方法中的用途，所述植物相对于对照植物具有一个或多个增强的产量相关性状，优选地相对于对照植物具有增加的产量，并且更优选地相对于对照植物具有增加的种子产量和/或增加的生物量。

XI.用于产生转基因植物的方法，所述转基因植物相对于对照植物具有一个或多个增强的产量相关性状，优选地相对于对照植物具有增加的产量，并且更优选地相对于对照植物具有增加的种子产量和/或增加的生物量，所述方法包括：

(i)在植物细胞或植物中引入并且表达编码如实施方案I、II、IV、VI和VII中任一个实施方案中所限定的CLP多肽的核酸；并且

(ii)在促进植物生长和发育的条件下培育所述植物细胞或植物。

XII.通过根据实施方案I至VII或XI中任一个实施方案的方法可获得的植物、或其部分或植物细胞，其中所述植物、植物部分或植物细胞包含编码如实施方案I、II、IV、VI和VII中任一个实施方案中所限定的CLP多肽的重组核酸。

XIII.转基因植物，其相对于对照植物具有一个或多个增强的产量相关性状，优选地相对于对照植物具有增加的产量，并且更优选地具有增加的种子产量和/或增加的生物量，原因在于编码如实施方案I、II、IV、VI和VII中任一个实施方案中所限定的CLP多肽的核酸表达增加，或源自所述转基因植物的转基因植物细胞。

XIV.根据实施方案XII或XIII的植物的可收获部分，其包含实施方案VIII的构建体，其中所述可收获部分包含实施方案VIII的构建体。

XIV.根据实施方案XII或XIII的转基因植物或源自其中的转基因植物细胞，其中所述植物是作物植物，如甜菜、糖料甜菜或苜蓿，或单子叶植物如甘蔗；或谷类，如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱、二粒小麦、斯佩耳特小麦、单粒小麦、画眉草、蜀黍或燕麦。

定义

以下定义将在本申请中自始至终使用。本申请中的章节标题和节标题目的仅在于方便和参考目的并且不应当以任意方式影响本申请的含义或解释。通常向本申请范围内所用的技术术语和表述给予在植物生物学、分子生物学、生物信息学和植物育种的相关领域中常适用于它们的含义。以下全部术语定义均适用于本申请的完整内容。应当理解如本说明书中和权利要求中所用，“一个”或“该”可以意指一个或多个，这取决于使用它的上下文。因此，例如，对“一个细胞”的提及可以利用至少一个细胞。与某属性或值相联系的情况下，术语“基本上”、“约”、“大约”等还分别具体地确切限定该属性或确切限定该值。在给定数值或范围的情况下，术语“约”特别设计处于给予的所述值或范围的20％以内、10％以内或5％以内的值或范围。如本文所用，术语“包含”也包括术语“由……组成”。

肽/蛋白质

除非本文中另外提到，否则术语“肽”、“寡肽”、“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用并且指由肽键连接在一起的处于任意长度的聚合形式下的氨基酸。

多核苷酸/核酸/核酸序列/核苷酸序列

术语“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”、“核酸”、“核酸分子”在本文中可互换地使用并且指任意长度的聚合非分支形式的核苷酸：核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或这二者的组合。

术语“核苷酸”指由核碱基、戊糖和至少一个磷酸酯基团组成的核酸结构单元。因此，术语“核苷酸”包括单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸。

同源物

蛋白质的“同源物”包括这样的肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶，它们相对于所讨论的未修饰蛋白具有氨基酸取代、缺失和/或插入并且与衍生所述肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶的未修饰蛋白具有基本上相同的生物活性和功能活性。

基因的“同源物”包括这样的核酸序列，它们相对于所讨论的未修饰基因具有核苷酸取代、缺失和/或插入并且与衍生这些核酸序列的未修饰基因具有基本上相同的活性和/或功能特性，或编码多肽，所述多肽与未修饰的核酸序列所编码的多肽具有基本上相同的生物活性和/或功能活性。

直向同源物和旁系同源物是两种不同形式的同源物并且包括用来描述基因或蛋白质的祖先关系的进化概念。旁系同源物是相同物种内起源于先祖基因复制的基因或蛋白质；而直向同源物是来自不同生物的起源于物种形成的基因或蛋白质，并且也源自共同的祖先基因。

“缺失”指从蛋白质中移除一个或多个氨基酸或从核酸移除一个或多个核苷酸。

”插入”指将一个或多个氨基酸残基引入蛋白质中的预定位点内或指将一个或多个核苷酸引入核酸序列中的预定位点内。关于蛋白质，插入可以包含单个或多个氨基酸的氨基端融合和/或羧基端融合以及序列内插入。通常，在氨基酸序列内部的插入会比氨基端融合或羧基端融合更小，约1-10个残基级别。氨基端或羧基端融合蛋白或融合肽的实例包括如酵母双杂交系统中所用转录激活物的结合结构域或激活结构域、噬菌体外壳蛋白、(组氨酸)-6-标签、谷胱甘肽S-转移酶-标签、蛋白A、麦芽糖结合蛋白、二氢叶酸还原酶、Tag·100表位、c-myc表位、-表位、lacZ、CMP(钙调蛋白结合肽)、HA表位、蛋白C表位和VSV表位。

“取代”指以具有相似特性(如相似疏水性、亲水性、抗原性、形成或破坏α-螺旋结构或β-折叠结构的倾向)的其它氨基酸替换蛋白质的氨基酸。氨基酸取代一般是单个残基的，不过可以是簇集性的，这取决于置于多肽的功能性约束。氨基酸取代优选地是保守性氨基酸取代。保守性取代表是本领域众所周知的(见例如Creighton(1984)Proteins.W.H.Freeman andCompany(编著)和下表1)。

表1：保守性氨基酸取代的实例

残基	保守性取代	残基	保守性取代
				Ala	Ser	Leu	Ile；Val
Arg	Lys	Lys	Arg；Gln
				Asn	Gln；His	Met	Leu；Ile
Asp	Glu	Phe	Met；Leu；Tyr
				Gln	Asn	Ser	Thr；Gly
Cys	Ser	Thr	Ser；Val
				Glu	Asp	Trp	Tyr
Gly	Pro	Tyr	Trp；Phe
				His	Asn；Gln	Val	Ile；Leu
Ile	Leu，Val

氨基酸取代、缺失和/或插入可以使用本领域众所周知的肽合成技术如固相肽合成法等或通过重组DNA操作而容易地进行。用于操作DNA序列以产生蛋白质的取代、插入或缺失变体的方法是本领域众所周知的。例如，用于在DNA中的预定位点处产生取代突变的技术是本领域技术人员众所周知的并且包括M13诱变法、T7-Gen体外诱变法(USB，Clevelaand，OH)、QuickChange位点定向诱变法(Stratagene，San Diego，CA)、PCR-介导的位点定向诱变或其它位点定向诱变法。

衍生物

“衍生物”包括这样的肽、寡肽、多肽，其中与天然存在形式的蛋白质(如目的蛋白)的氨基酸序列相比，它们包含以非天然存在的氨基酸残基对氨基酸的取代或非天然存在的氨基酸残基的添加。蛋白质的“衍生物”也包含这样的肽、寡肽、多肽，其中与多肽的天然存在形式的氨基酸序列相比，它们包含天然存在的改变(糖基化、酰化、异戊二烯化、磷酸化、肉豆蔻酰化、硫酸盐化等)氨基酸残基或非天然的改变氨基酸残基。与衍生物所来源的氨基酸序列相比，该衍生物可以也包含与所述氨基酸序列共价或非共价结合的一个或多个非氨基酸取代基或添加(例如报道分子或其它配体)，如为促进检测该衍生物而结合的报道分子，和与天然存在的蛋白质的氨基酸序列相对比的非天然存在的氨基酸残基。此外，“衍生物”也包括天然存在形式蛋白质与标签肽如FLAG、HIS6或硫氧还蛋白(对于标签肽的综述，见Terpe,Appl.Microbiol.Biotechnol.60,523-533,2003)的融合物。

核酸的“衍生物”包括这些核酸，与该核酸的天然存在形式的核苷酸序列相比，它们可以包含缺失，改变或非天然存在的核苷酸添加。与该核酸的天然存在形式的核苷酸序列相比，这些衍生物可以是天然改变或非天然改变的核苷酸。分别在植物中表达或阻遏时，蛋白质或核酸的衍生物仍提供基本上相同的功能，例如增强的产量相关性状。

功能性片段

术语“功能性片段”指任意核酸或蛋白质，所述核酸或蛋白质分别仅包含全长核酸或全长蛋白质的部分，但分别在植物中过量表达或阻遏时仍提供基本上相同的功能，例如增强的产量相关性状。

在需要过量表达核酸的情况下，术语“基本上相同的功能活性”或“基本上相同的功能”意指在植物中表达时，任意同源物和/或片段提供增加/增强的产量相关性状。优选地，基本上相同的功能活性或基本上相同的功能意指与通过外源表达全长的编码POI的核苷酸序列或POI氨基酸序列所提供的功能活性相比，至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％或更高的增加/增强的产量相关性状。

结构域、基序/共有序列/标签

直向同源物和旁系同源物包含用来描述基因祖先关系的进化概念。旁系同源物是相同物种内起源于先祖基因复制的基因，而直向同源物是来自不同生物的起源于物种形成的基因。

术语“基序”或“共有序列”或“标签”指在进化相关的氨基酸序列或核酸序列中短的保守区。对于氨基酸序列，基序往往是结构域的高度保守部分，不过也可以仅包括该结构域的部分，或可以位于保守结构域之外(若该基序的全部氨基酸位于定义的结构域之外)。

存在用于鉴定结构域的专业数据库，例如，SMART(Schultz等人，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95,5857-5864；Letunic等人，(2002)Nucleic Acids Res 30,242-244)、InterPro(Mulder等，(2003)Nucl.Acids.Res.31,315-318)、Prosite(Bucher和Bairoch(1994),A generalized profilesyntax for biomolecular sequences motifs and its function in automaticsequence interpretation.(在)ISMB-94；第二届分子生物学智能系统国际会议文集(Proceedings 2nd International Conference on Intelligent Systemsfor Molecular Biology).Altman R.,Brutlag D.,Karp P.,Lathrop R.,SearlsD.编著，第53-61页,AAAI Press,Menlo Park；Hulo等，Nucl.Acids.Res.32:D134-D137,(2004))或Pfam(Bateman等，Nucleic Acids Research 30(1):276-280(2002))及Pfam蛋白质家族数据库：R.D.Finn,J.Mistry,J.Tate,P.Coggill,A.Heger,J.E.Pollington,O.L.Gavin,P.Gunesekaran,G.Ceric,K.Forslund,L.Holm,E.L.Sonnhammer,S.R.Eddy,A.Bateman NucleicAcids Research(2010)Database Issue 38:211-222)。一组用于计算机芯片上分析蛋白质序列的工具是在ExPASY蛋白质组服务器上可获得的(瑞士生物信息研究所(Gasteiger等人,ExPASy:The proteomics server forin-depth protein knowledge and analysis,Nucleic Acids Res.31:3784-3788(2003))。也可以使用常规技术如通过序列比对鉴定结构域或基序。

用于比对序列以比较的方法是本领域熟知的，此类方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。GAP使用Needleman和Wunsch算法((1970)J Mol Biol 48:443-453)以找到使匹配数最大化并使空位数最小化的两个序列的总体(即，覆盖完整序列的)比对。BLAST算法(Altschul等人,(1990)J Mol Biol 215:403-10)计算序列同一性百分数并且开展两个序列之间相似性的统计学分析。用于开展BLAST分析的软件是通过国家生物技术信息中心(NCBI)可公开获得的。同源物可以使用例如ClustalW多重序列比对算法(版本1.83)，以默认配对比对参数和百分数评分方法容易地鉴定。也可以使用MatGAT软件包中的可用方法之一确定相似性和同一性的总体百分数(Campanella等，BMC Bioinformatics.2003年7月10日；4:29.MatGAT:an application that generates similarity/identitymatrices using protein or DNA sequences)。如对本领域技术人员显而易见，可以进行少许手工编辑以优化保守基序之间的比对。此外，作为使用全长序列鉴定同源物的替代，也可以使用特定的结构域。使用上文提及的程序，使用默认参数，可以确定在完整核酸或氨基酸序列范围或所选结构域或保守基序范围内的序列同一性值。对于局部比对，Smith-Waterman算法是特别有用的(Smith TF,Waterman MS(1981)J.Mol.Biol 147(1)；195-7)。

交互式BLAST

通常，这包括第一BLAST，其中所述的第一BLAST包括将查询序列(例如使用实施例部分的表A中列出的任意序列)针对任意序列数据库，如可公开获得的NCBI数据库进行BLAST(以目的序列作为查询序列运行BLAST软件)。从核苷酸序列开始时，一般使用BLASTN或TBLASTX(使用标准默认值)，并且从蛋白质序列开始时，使用BLASTP或TBLASTN(使用标准默认值)。可以任选地筛选BLAST结果。筛选结果或非筛选结果的全长序列随后针对来自衍生查询序列的生物中的序列进行反向BLAST搜索(第二BLAST)。随后比较第一BLAST和第二BLAST的结果。如果来自第一blast的高阶位命中是来自与衍生该查询序列的物种相同的物种，则鉴定到旁系同源物，随后的反向BLAST理想地产生最高命中当中的所述查询序列；若在第一BLAST中的高阶位命中不是来自与衍生该查询序列的物种相同的物种，则鉴定到直向同源物，并且当反向BLAST时，优选地产生属于最高命中的所述查询序列。

高阶位命中是具有低E-值的那些命中。E-值越低，评分越显著(或换句话说，偶然发现该命中的几率越低)。E-值的计算是本领域熟知的。除了E-值外，比较结果也由同一性百分数评定。同一性百分数指两个所比较的核酸(或多肽)序列之间特定长度范围内的相同核苷酸(或氨基酸)的数目。在大型家族的情况下，可以使用ClustalW，随后使用邻接树法，以帮助观察相关基因的聚类并鉴定直向同源物和旁系同源物。

转运肽

“转运肽”(或转运信号，信号肽，信号序列)是指导蛋白质转运，优选地转运至细胞内部的细胞器或转运至某些亚细胞位置或用于分泌蛋白质的短(长3-60个氨基酸)肽链。转运肽也可以称作转运信号、信号肽、信号序列、靶向信号或(亚细胞)定位信号。

杂交

如本文中所定义的术语”杂交"是其中基本上同源的互补核苷酸序列相互复性的过程。杂交过程可以完全在溶液中进行，即两种互补性核酸均处于溶液中。杂交过程也可以在互补性核酸之一固定到基质如磁珠、琼脂糖(Sepharose)珠或任意其他树脂的情况下发生。杂交过程也可以在互补性核酸之一固定至固相支持体如硝酸纤维素膜或尼龙膜上或通过例如照相平版印刷术固定至例如硅酸玻璃支持物(后者称作核酸阵列或微阵列或称作核酸芯片)上的情况下进行。为使杂交发生，通常将核酸分子热变性或化学变性以使双链解链成为两条单链和/或去除来自单链核酸的发夹或其它二级结构。

术语”严格性”指在其中发生杂交的条件。杂交的严格性受条件如温度、盐浓度、离子强度和杂交缓冲液组成影响。通常，将低严格性条件选择为在确定的离子强度及pH时低于特定序列热解链温度(Tm)约30℃。中等严格性条件是此时温度低于Tm约20℃并且高严格性条件是此时温度低于Tm约10℃。高严格性杂交条件一般用于分离与靶核酸序列具有高序列相似性的杂交序列。然而，核酸可以在序列上偏离并且因遗传密码子的简并性而依旧编码基本上相同的多肽。因而有时候可能需要中等严格性杂交条件以鉴定此类核酸分子。

Tm是在确定的离子强度及pH时的温度，在所述温度下50％的靶序列与完全匹配的探针杂交。Tm取决于溶液条件和探针的碱基组成及长度。例如，较长的序列在较高温度下特异性地杂交。从低于Tm约16℃直至32℃获得最大杂交速率。一价阳离子在溶液中的存在降低了两条核酸链间的静电排斥，因而促进杂交分子形成；这种作用对于高达0.4M的钠浓度是明显的(对于更高浓度，这种效应可以忽略)。甲酰胺降低DNA-DNA和DNA-RNA双链体的解链温度，每百分数甲酰胺降低0.6-0.7℃，并且添加50％甲酰胺允许在30-45℃进行杂交，虽然杂交速率会降低。碱基对错配降低了杂交速率及双链体的热稳定性。平均而言并且对于大的探针来说，每％碱基错配Tm下降约1℃。取决于杂交分子的类型，Tm可以使用下列等式计算：

1)DNA-DNA杂交分子(Meinkoth和Wahl，Anal.Biochem.，138：267-284，1984)：

Tm＝81.5℃+16.6xlog10[Na+]a+0.41x％[G/Cb]–500x[Lc]-1–0.61x％甲酰胺

2)DNA-RNA或RNA-RNA杂交分子

Tm＝79.8℃+18.5(log10[Na+]a)+0.58(％G/Cb)+11.8(％G/Cb)2-820/Lc

3)寡DNA或寡RNAd杂交分子：

对于<20个核苷酸：Tm＝2(ln)

对于20–35个核苷酸：Tm＝22+1.46(ln)

a或对于其它一价阳离子，但是仅在0.01–0.4M范围内是精确的。

b仅对于％GC在30％-75％范围内是精确的。

c L＝双链体的长度(以碱基对计)。

d Oligo，寡核苷酸；ln，＝引物的有效长度＝2×(G/C数)+(A/T数)。

可以众多已知技术的任意一种控制非特异性结合，例如用含蛋白质的溶液封闭薄膜、添加异源性RNA、异源性DNA及SDS至杂交缓冲液并且用RNA酶处理。对于非同源性探针，一系列杂交可以通过改变以下条件之一进行：(i)渐进地降低复性温度(例如从68℃至42℃)或(ii)渐进地降低甲酰胺浓度(例如从50％至0％)。技术人员了解杂交期间可以加以改变和将维持或改变严格性条件的多种参数。

除杂交条件之外，杂交特异性一般还取决于杂交后洗涤的功能。为除去因非特异性杂交所致的背景，样品用稀释的盐溶液洗涤。此类洗涤的关键因素包括最终洗涤溶液的离子强度及温度：盐浓度越低并且洗涤温度越高，则洗涤的严格性越高。洗涤条件一般在杂交严格性上或低于杂交严格性而进行。阳性杂交产生至少两倍于背景信号的信号。通常，用于核酸杂交分析法或基因扩增检测方法的合适严格性条件如上所述。也可以选择更严格或更不严格的条件。技术人员了解洗涤期间可以加以改变和将维持或改变严格性条件的多种参数。

例如，用于长度大于50个核苷酸的DNA杂交分子的常见高严格性杂交条件包括在65℃于1×SSC中或在42℃于1×SSC和50％甲酰胺中杂交，随后在65℃于0.3×SSC中洗涤。用于长度大于50个核苷酸的DNA杂交分子的中等严格性杂交条件的实例包括在55℃于4×SSC中或在40℃于6×SSC和50％甲酰胺中杂交，随后在50℃于2×SSC中洗涤。杂交分子的长度是杂交核酸的预期长度。当序列已知的核酸杂交时，可以通过比对序列并鉴定本文中所述的保守区而确定杂交分子长度。1×SSC是0.15MNaCl和15mM柠檬酸钠；杂交溶液和洗涤溶液可以额外地包含5×Denhardt试剂、0.5-1.0％SDS、100μg/ml变性的片段化鲑精DNA、0.5％焦磷酸钠。在一个优选实施方案中，高严格性条件意指在65℃于包含0.1SDS和任选地5x Denhardt试剂、100μg/ml变性片段化鲑精DNA、0.5％焦磷酸钠的0.1x SSC中杂交，随后在65℃于0.3x SSC中的洗涤。

为了定义严格性水平的目的，可以参考Sambrook等(2001)MolecularCloning：a laboratory manual，第三版Cold Spring Harbor LaboratoryPress，CSH，New York或参考Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y.(1989和每年更新版本)。

剪接变体

如本文中所用的术语”剪接变体”包含其中已经切除、替换、移位或添加所选内含子和/或外显子或其中内含子已经缩短或加长的核酸序列的变体。此类变体将是其中基本上保留了蛋白质的生物学活性的一种变体；这可以通过选择性保留蛋白质的功能性片段而实现。此类剪接变体可以在自然界中找到或可以人工制造。用于预测和分离此类剪接变体的方法是本领域众所周知的(见例如Foissac和Schiex(2005)BMC Bioinformatics.6:25)。

等位变体

等位基因或等位变体是给定基因的替代形式，位于相同染色体位置内。等位变体包含单核苷酸多态性(SNP)和小插入/缺失多态性(INDEL)。INDEL的尺寸通常小于100bp。SNP和INDEL形成在大部分生物的天然存在性多态性株系中序列变体的最大集合。

内源的

本文中对“内源”核酸和/或蛋白质的称谓指如植物中以其天然形式(即不存在任意人类干预如重组DNA技术的情况下)存在的所讨论核酸和/或蛋白质，还指处于分离形式的随后被(再)导入植物(转基因)的相同基因(或基本上同源的核酸/基因)。例如，含有这种转基因的转基因植物可以遇到转基因表达的明显降低和/或内源基因表达的明显降低。分离的基因可以从生物分离，或可以是人造的，例如通过化学合成法。

外源的

术语“外源”(与“内源的”相反)核酸或基因指已经借助重组DNA技术引入植物中的核酸。“外源”核酸可以不以其天然形式出现在这种植物中，与如植物中以其天然形式存在的所讨论核酸不同，或可以与如植物中以其天然形式存在的所讨论核酸相同，但是不整合在其天然遗传环境内部。“外源”的相应含义在蛋白质表达的背景下适用。例如，与内源基因表达相比时，含有转基因(即，外源核酸)的转基因植物可以遭遇相应的基因或蛋白质表达总体上大幅度增加。本发明的转基因植物包括整合在任意基因座处的外源POI核酸，并且任选地，所述植物还可以包括在天然遗传背景内部的内源基因。

基因改组/定向进化

基因改组或定向进化的组成为：反复DNA改组，随后适当筛选和/或选择以产生编码具有改良生物学活性的蛋白质的核酸或其部分的变体(Castle等，(2004)Science 304(5674):1151-4；美国专利5,811,238和6,395,547)。

表达盒

如本文所用的“表达盒”是能够在宿主细胞中或在体外表达系统中表达的DNA。优选地，DNA、DNA部分或形成表达盒的遗传元件的排列是人造的。技术人员非常清楚为了成功表达而必须在表达盒中存在的遗传元件。表达盒包含与如本文所述的一个或多个控制序列(至少与启动子)有效连接的待表达的目的序列。额外的调节元件可以包括转录增强子以及翻译增强子、一个或多个如本文所述的NEENA和/或一个或多个如本文所述的RENA。本领域技术人员将知道可能适用于实施本发明的终止子和增强子序列。如用于增加的表达/过量表达的定义部分中所描述，也可以将内含子序列添加至5'非翻译区(UTR)或编码序列中，以增加胞质溶胶中积累的成熟信息的量。其他控制序列(除启动子、增强子、沉默子、内含子序列、3'UTR和/或5'UTR区域之外)可以是蛋白质和/或RNA稳定化元件。此类序列将是已知的或可以由本领域技术人员容易地获得。

表达盒可以整合至宿主细胞的基因组中并且随所述宿主细胞的基因组一起复制。

构建体/基因构建体

这是在所含遗传元件的排列中部分或完全人造的DNA，能够一般通过在宿主细胞中复制来增加或减少目的DNA和/或蛋白质的表达并用于将目的DNA序列引入宿主细胞或宿主生物中。复制可以在整合入宿主细胞的基因组后或因构建体作为载体或人工染色体的部分存在于宿主细胞内部发生。

本发明的宿主细胞可以是选自细菌细胞(如大肠杆菌或农杆菌属物种细胞)、酵母细胞、真菌、藻类或蓝细菌(Cyanobacteria)细胞或植物细胞的任意细胞。技术人员非常清楚必须在所述基因构建体上存在以便成功转化、选择和增殖含有目的序列的宿主细胞的遗传元件。

一般，构建体/基因构建体是表达构建体并且包含一个或多个可以导致目的基因过量表达(过量表达构建体)或减少表达的表达盒。构建体可以由表达盒组成。目的序列与如本文所述的一个或多个控制序列(至少与启动子)有效地连接。额外的调节元件可以包括转录增强子以及翻译增强子、一个或多个如本文所述的NEENA和/或一个或多个如本文所述的RENA。本领域技术人员将知道可能适用于实施本发明的终止子和增强子序列。如用于增加的表达/过量表达的定义部分中所描述，也可以将内含子序列添加至5'非翻译区(UTR)或编码序列中，以增加胞质溶胶中积累的成熟信息的量。其他控制序列(除启动子、增强子、沉默子、内含子序列、3'UTR和/或5'UTR区域之外)可以是蛋白质和/或RNA稳定化元件。此类序列将是已知的或可以由本领域技术人员容易地获得。

本发明的遗传构建体可以还包括用于特定细胞类型中维持和/或复制所需要的复制起点序列。一个实例是遗传构建体需要作为游离型遗传元件(例如质粒或粘粒分子)在细菌细胞中维持的情况。优选的复制起点包括但不限于f1-ori和colE1。

为检测如本发明方法中所用核酸序列的成功转移和/或选择包含这些核酸的转基因植物，使用标记基因(或报道基因)是有利的。因此，所述遗传构建体可以任选地包含一种选择标记基因。在本文的“定义”部分中更详细地描述选择标记。一旦不再需要所述标记基因时，可以从转基因细胞中移除或切除它们。用于标记移除的技术是本领域已知的，有用的技术在上文定义部分中描述。

载体构建体/载体

这是在所含遗传元件的排列中部分或完全人造的DNA(如但不限于质粒或病毒DNA)，能够在宿主细胞中复制并用于将目的DNA序列引入宿主细胞或宿主生物中。载体可以是构建体或可以包含至少一个构建体。载体可以在不整合至宿主细胞基因组中的情况下复制，例如细菌宿主细胞中的质粒载体，或它可以将其部分或全部DNA整合至宿主细胞的基因组中并且因此导致其DNA的复制和表达。本发明的宿主细胞可以是选自细菌细胞(如大肠杆菌或农杆菌属物种细胞)、酵母细胞、真菌、藻类或蓝细菌(Cyanobacteria)细胞或植物细胞的任意细胞。技术人员非常清楚必须在所述基因构建体上存在以便成功转化、选择和增殖含有目的序列的宿主细胞的遗传元件。一般，载体包含至少一个表达盒。一个或多个目的序列与如本文所述的一个或多个控制序列(至少与启动子)有效地连接。额外的调节元件可以包括转录增强子以及翻译增强子、一个或多个如本文所述的NEENA和/或一个或多个如本文所述的RENA。本领域技术人员将知道可能适用于实施本发明的终止子和增强子序列。如定义部分中描述，内含子序列也可以添加至5'非翻译区(UTR)或编码序列中，以增加胞质溶胶中积累的成熟信息的量。其他控制序列(除启动子、增强子、沉默子、内含子序列、3'UTR和/或5'UTR区域之外)可以是蛋白质和/或RNA稳定化元件。此类序列将是已知的或可以由本领域技术人员容易地获得。

调节元件/控制序列/启动子

术语“调节元件”、“控制序列”和“启动子”均在本文中可互换使用并且在广义上意指能够实现与之结合的序列表达的调节性核酸序列。术语”启动子”或“启动子序列”一般指位于基因转录起点上游并参与识别及结合RNA聚合酶和其它蛋白质，因而指导有效连接的核酸转录的核酸控制序列。前述术语包括从典型的真核基因组基因(包括对于精确转录启动所需的TATA盒，具有或没有CCAAT盒序列)中衍生的转录调节序列和应答发育刺激和/或外部刺激或以组织特异性方式改变基因表达的额外调节元件(如，上游激活序列、增强子和沉默子)。本术语还包括典型的原核基因的转录调节序列，在此情况下它可以包括–35盒序列和/或–10盒转录调节序列。术语“调节元件”也包含赋予、激活或增强核酸分子在细胞、组织或器官中表达的合成的融合分子或衍生物。

“植物启动子”包含介导编码序列区段在植物细胞中表达的调节元件。因此，植物启动子不需要是植物来源的，而是可以源自病毒或微生物，例如来自侵袭植物细胞的病毒。“植物启动子”也可以源自植物细胞，例如来自用待于本发明方法中表达及在本文中描述的核酸序列所转化的植物。这也适用于其它“植物”调节性信号，如“植物”终止子。用于本发明方法中的核苷酸序列的启动子上游可以由一个或多个核苷酸取代、插入和/或缺失而受到修饰，但不干扰启动子、可读框(ORF)或3'调节区如终止子或远离ORF的其它3'调节区的功能性或活性。启动子的活性还有可能因修饰该启动子的序列或由更活跃的启动子、甚至来自异源生物的启动子彻底替换该启动子而增加。为在植物中表达，如上所述，核酸分子必须有效连接至或包含合适的启动子，其中所述的启动子在正确时间点上并以所需要的空间表达模式表达基因。

为鉴定功能性等效启动子，候选启动子的启动子强度和/或表达模式可以通过将该启动子与报道基因有效连接并分析该报道基因在植物多种组织的表达水平和模式而进行分析。合适的公知报道基因包括例如β-葡糖醛酸糖苷酶或β-半乳糖苷酶。启动子活性通过测量β-葡糖醛酸糖苷酶或β-半乳糖苷酶的酶活性进行分析。启动子强度和/或表达模式随后可以与参考启动子(如本发明方法中所用的一种启动子)的启动子强度和/或表达模式比较。备选地，启动子强度可以使用本领域已知方法如Northern印迹法及放射自显影图的密度计分析法、定量实时PCR或RT-PCR(Heid等，1996Genome Methods 6：986-994)，通过定量mRNA水平或通过将本发明方法中所用核酸的mRNA水平与持家基因(如18S rRNA)的mRNA水平比较而分析。通常“弱启动子”意指驱动编码序列在低水平上表达的启动子。“低水平”意指在每个细胞约1/10,000转录物至约1/100,000转录物、至约1/500,0000转录物的水平上。相反，“强启动子”驱动编码序列在高水平、或在每个细胞约1/10转录物至约1/100转录物、至约1/1,000转录物上表达。通常，“中等强度启动子”意指以下的启动子，其驱动编码序列以低于强启动子的水平、尤其在全部情况以低于受35S CaMV启动子控制时所获得水平的水平表达。

有效地连接

术语“有效地连接”或“功能性连接”互换地使用，并且如本文所用，指启动子序列与目的基因之间功能性连接，以至于启动子序列能够指导目的基因转录。

就调节元件而言，术语“功能性连接”或“功能性连接的”理解为意指例如调节元件(例如启动子)与待表达的核酸序列并且根据需要与其他调节元件(例如，终止子、如本文所述的NEENA或如本文所述的RENA)以如此方式依次排列，从而每种调节元件可以履行其目的功能以允许、修饰、促进或影响所述核酸序列的表达。作为同义词，可以使用“有效连接”或“有效连接的”。表达可以根据所述核酸序列的排列导致有义或反义RNA。为此目的，不是必需要求化学意义上的直接连接。遗传控制序列例如增强子序列也能够从远离的位置或甚至从其它DNA分子对靶序列产生其作用。优选的排列是这样的排列，其中待表达的核酸序列重组地位于充当启动子的序列之后，从而这两个序列相互共价地连接。该启动子序列与待重组表达的核酸序列之间的距离优选地小于200碱基对、特别地优选小于100碱基对、非常特别优选地小于50碱基对。在优选的实施方案中，待转录的核酸序列以如此方式位于启动子之后，其中转录起点与本发明RNA的所希望的开端相同。功能性连接和表达构建体可以借助如(例如，在Maniatis T，Fritsch EF和Sambrook J(1989)Molecular Cloning：A LaboratoryManual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor(NY)；Silhavy等人(1984)Experiments with Gene Fusions，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor(NY)；Ausubel等人(1987)Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Assoc.andWiley Interscience；Gelvin等人(编著)(1990)Plant Molecular BiologyManual；Kluwer Academic Publisher,Dordrecht,The Netherlands)所述的惯用重组和克隆技术产生。然而，其他序列，例如充当带限制性酶特定切割位点的接头或充当信号肽的序列，也可以位于这两个序列之间。序列的插入也可以导致融合蛋白的表达。优选地，由调节性区域例如启动子和待表达核酸序列的连接组成的表达构建体可以以载体整合的形式存在并且被插入植物基因组，例如通过转化法。

组成型启动子

“组成型启动子”指在生长和发育的大部分、但不必全部阶段期间和在大部分环境条件下在至少一个细胞、组织或器官内有转录活性的启动子。下表2a给出组成型启动子的实例。

表2a：组成型启动子的实例

遍在启动子

遍在启动子在生物基本上所有组织或细胞内有活性。

发育调节性启动子

发育调节性启动子在某个发育期期间或在经历发育变化的植物部分内有活性。

诱导型启动子

诱导型启动子在应答化学品(综述见Gatz 1997，Annu.Rev.PlantPhysiol.Plant Mol.Biol.，48：89-108)、环境刺激或物理刺激时具有受诱导或增加的转录启动，或可以是“胁迫诱导性的”，即当植物暴露于多种胁迫条件时受到激活，或是“病原体诱导性的”，即当植物暴露于多种病原体时受到激活。

器官特异性/组织特异性启动子

器官特异性或组织特异性启动子是能够优先在某些器官官或组织如叶、根、种子组织等内启动转录的启动子。例如，“根特异性启动子”是在植物根中优势地具有转录活性的启动子，在植物的任意其它部分内基本上无活性，尽管在植物的这些其它部分内允许任意泄露表达。能够仅在某些细胞中启动转录的启动子在本文中称作“细胞特异的”。

下表2b中列出根特异性启动子的实例。

表2b：根特异性启动子的实例

种子特异性启动子主要在种子组织中有转录活性，但不必排他性地在种子组织中有转录活性(在泄露表达的情况下)。种子特异性启动子可以在种子发育期间和/或萌发期间有活性。种子特异性启动子可以是胚乳/糊粉/胚特异性的。下表2c至2f中显示种子特异性启动子(胚乳/糊粉/胚特异性)的实例。种子特异性启动子的其他实例在Qing Qu和Takaiwa(PlantBiotechnol.J.2,113-125,2004)中给出，所述文献的公开内容通过引用方式如完整给出那样并入本文。

表2c：种子特异性启动子的实例

表2d：胚乳特异性启动子的实例

表2e：表2e：胚特异性启动子的实例

表2f：糊粉特异性启动子的实例

如本文中所定义的绿色组织特异性启动子是主要在绿色组织中具有转录活性的启动子，在植物的任意其它部分内基本上无活性，尽管在植物的这些其它部分内允许任意泄露表达。

可以用来实施本发明方法的绿色组织特异性启动子的实例在下表2g中显示。

下表2g中显示可以用来实施本发明方法的绿色组织特异性启动子的实例。

表2g：绿色组织特异性启动子的实例

组织特异性启动子的另一个实例是分生组织特异性启动子，其主要在分生性组织中具有转录活性，在植物的任意其它部分内基本上无活性，尽管在植物的这些其它部分内允许任意泄露表达。下表2h中显示可以用来实施本发明方法的绿色分生组织特异性启动子的实例。

表2h：分生组织特异性启动子的实例

终止子

术语”终止子”包括这样的控制序列，其是在转录单位末端的DNA序列，发出对初级转录物进行3’加工并多聚腺苷化以及终止转录的信号。终止子可以衍生自天然基因、来自多种其它植物基因或来自T-DNA。待添加的终止子可以来自例如胭脂碱合酶或章鱼碱合酶基因或备选地来自其它植物基因或较不优选地来自任意其它真核基因。

选择标记(基因)/报道基因

"选择标记"、"选择标记基因"或“报道基因”包括向细胞赋予表型的任意基因，其中在所述的细胞内表达所述基因以促进鉴定和/或选择用本发明的核酸构建体所转染或转化的细胞。这些标记基因能够通过一系列不同原理鉴定核酸分子的成功转移。合适的标记可以选自赋予抗生素耐药性或除草剂抗性、导入新代谢性状或允许目视选择的标记。选择标记基因的实例包括赋予抗生素耐药性的基因(如使新霉素和卡那霉素磷酸化的nptII或使潮霉素磷酸化的hpt或赋予对例如博来霉素、链霉素、四环素、氯霉素、氨苄青霉素、庆大霉素、遗传霉素(Geneticin)(G418)、壮观霉素或杀稻瘟素的抗性的基因)、赋予除草剂抗性的基因(例如提供抗性的bar；提供草甘膦抗性的aroA或gox或赋予对例如咪唑啉酮、膦丝菌素或磺脲类的抗性的基因)或提供代谢性状的基因(如允许植物使用甘露糖作为唯一碳源的manA或利用木糖的木糖异构酶或抗营养标记如2-脱氧葡萄糖抗性)。目视标记基因的表达导致形成颜色(例如β-葡糖醛酸糖苷酶、GUS或β-半乳糖苷酶与其有色底物例如X-Gal)、发光(如萤光素/萤光素酶系统)或萦光(绿色萦光蛋白GFP及其衍生物)。这个名单仅代表少数的可能标记。技术人员熟悉此类标记。取决于生物和选择方法，优选不同的标记。

已知当核酸稳定或瞬时整合至植物细胞时，仅小部分的细胞摄取外来DNA并且根据需要将其整合至细胞基因组，这取决于所用表达载体和使用的转染技术。为鉴定并选择这些整合子，通常将编码选择标记(如上文所述之一)的基因连同目的基因一起导入宿主细胞。这些标记可以在其中这些基因因例如常规方法所致的缺失而无功能的突变体中使用。此外，编码选择标记的核酸分子可以导入宿主细胞中，与在包含编码本发明多肽或本发明方法中所用多肽的序列在同一载体上，或在单独的载体上。已经用导入的核酸稳定转染的细胞可以通过选择进行鉴定(例如具有整合的选择标记的细胞存活而其它细胞死亡)。

因为一旦已经成功导入了核酸，则转基因宿主细胞中不再需要或不希望有标记基因，尤其抗生素耐药性基因和除草剂抗性基因，因此用于导入核酸的本发明方法有利地使用能够去掉或切除这些标记基因的技术。一种如此方法称作共转化法。共转化法使用同时用于转化的两种载体，一种载体携带本发明的核酸而另一种载体携带标记基因。高比例的转化体接受，或在植物的情况下，包含(高达40％或更多的转化体)这两种载体。在用农杆菌(Agrobacterium)转化的情况下，转化体通常仅接受载体的一部分，即侧翼有T-DNA的序列，它通常代表表达盒。标记基因随后可以通过进行杂交而从转化的植物中去掉。在另一种方法中，整合至转座子的标记基因用来与想要的核酸一起进行转化(称作Ac/Ds技术)。转化体可以与转座酶来源植物杂交或转化体用导致转座酶表达的核酸构建体瞬时或稳定地转化。在一些情况下(大约10％)，转座子在已经成功发生转化时跳出宿主细胞的基因组并丢失。在其它更多情况下，转座子跳至不同位置。在这些情况下，标记基因必须通过进行杂交而去除。在微生物学中，开发了实现或促进检测这类事件的技术。另一有利的方法依赖于重组系统；此方法的优势在于不必通过杂交去除。该类型的最知名系统称作Cre/lox系统。Cre1是去掉位于loxP序列之间序列的重组酶。若标记基因整合于loxP序列之间，则通过重组酶表达已经成功发生转化时，标记基因被去除。其它重组系统是HIN/HIX、FLP/FRT和REP/STB系统(Tribble等，J.Biol.Chem.，275，2000：22255-22267；Velmurugan等，J.Cell Biol.，149，2000：553-566)。有可能将本发明核酸序列以位点特异性方式整合至植物基因组。这些方法自然也可以应用至微生物如酵母、真菌或细菌。

转基因的/转基因/重组

为本发明目的，"转基因的"、”转基因”或"重组"就核酸序列而言意指包含此核酸序列的表达盒、基因构建体或载体或用本发明的核酸序列、表达盒或载体转化的生物，这些构建均通过重组方法产生，其中

(a)编码用于本发明方法中的蛋白质的核酸序列，或

(b)与本发明核酸序列有效连接的遗传控制序列，例如启动子，或

c)a)和b)

不处于其天然遗传环境中或已经通过遗传操作方法修饰，修饰有可能采用例如取代、添加、缺失、倒位或插入一个或多个核苷酸残基的形式。天然遗传环境理解为意指来源植物中的天然基因组基因座或染色体基因座或在基因组文库中存在。在基因组文库的情况下，核酸序列的天然遗传环境优选地得到保留，至少部分地得以保留。该环境分布在核酸序列的至少一侧并且具有至少50bp，优选至少500bp，特别优选至少1000bp，最优选至少5000bp的序列长度。天然存在的表达盒–例如核酸序列的天然启动子与编码本发明方法中所用多肽的对应核酸序列的天然存在的组合，如上文所定义–在这种表达盒通过非天然的合成(“人工”)方法(如诱变处理)而受到修饰时，变成转基因表达盒。合适方法例如在US 5,565,350、US200405323或WO 00/15815中描述。另外，天然存在的表达盒–例如核酸序列的天然启动子与编码本发明方法中所用的蛋白质的对应核酸序列的天然存在的组合，如上文所定义–在这种表达盒未整合在天然遗传环境中，而因将所述表达盒从其天然遗传环境分离并在不同遗传环境再插入而导致整合于不同遗传环境中时，变成重组表达盒。

应当进一步指出，在本发明的上下文中，术语“分离的核酸”或“分离的多肽”在一些情况下可以分别视为同义于“重组核酸”或“重组多肽”，并且分别指不位于其天然遗传环境或细胞环境和/或已经通过重组方法修饰过的核酸或多肽。分离的核酸序列或分离的核酸分子是这样一种核酸序列或分子，它不处于其天然环境或其天然核酸邻居中，然而它与其他核酸序列或核酸分子物理地和功能地连接并且作为核酸构建体、载体序列或染色体的部分存在。

为本发明目的，如上所述，将转基因植物因而理解为意指在本发明方法中所使用的核酸不存在于所述植物的基因组中或不源于其中，或存在所述植物的基因组中，但是不处在所述植物基因组中它们的天然基因座内，所述核酸有可能同源或异源地表达。然而如所提及，转基因还意指尽管本发明核酸或在本发明方法中所用核酸处于植物基因组中该核酸的天然位置内，然而其序列相对于天然序列而言已经受到修饰，和/或所述天然序列的调节序列已经受到修饰。转基因优选地理解为意指本发明核酸在基因组中的非天然基因座内表达，即发生核酸的同源表达或优选异源表达。在本文中提到了优选的转基因植物。

如本文所用，术语“转基因”指生物例如转基因植物，指生物，例如，植物、植物细胞、愈伤组织、植物组织或植物部分，其外源地含有本文所述的核酸、构建体、载体或表达盒或其部分，所述核酸、构建体、载体或表达盒或其部分优选地是通过基本上不是生物转化法的方法，优选地通过农杆菌介导转化法或粒子轰击法引入。为本发明目的，如上所述，将转基因植物因而理解为意指本文中所述的核酸不存在于或不源于所述植物的基因组中，或存在所述植物的基因组中，但是不处在所述植物基因组中它们的天然基因环境内，所述核酸有可能同源或异源地表达。

调节

相对于表达或基因表达，术语“调节”意指这样的过程，在所述过程中与对照植物相比，表达水平因所述的基因表达而改变，该表达水平可以增加或减少。原初的、未调节的表达可以是任意类型的结构性RNA(rRNA、tRNA)或mRNA表达，伴随后续翻译。为了本发明的目的，原始未调节的表达也可以是不存在任意表达。就本发明方法、构建体、表达盒、载体、植物、种子、宿主细胞和用途中所用的蛋白质或核酸而言，术语“调节活性”或术语“调节表达”意指本发明核酸序列或所编码蛋白质的表达的任意变化，所述变化导致植物中增加或减少的产量相关性状。表达可以从零(不存在表达或不可测量的表达)增加至某个量，或可以从某个量下降至不可测量的微小量或零。

表达

术语“表达”或“基因表达”意指一个特定基因或多个特定基因或特定遗传构建体的转录。术语“表达”或“基因表达”尤其意指某个基因或多个基因或遗传构建体转录成结构性RNA(rRNA、tRNA)或mRNA，所述mRNA随后翻译成或不翻译成蛋白质。该过程包括DNA的转录和所得mRNA产物的加工。术语“表达”或“基因表达”还可以包括翻译mRNA和随后合成所编码的蛋白质，即，蛋白质表达。

增加的表达/过量表达

如本文中所用的术语“增加的表达”、“增强的表达”或“过量表达”意指相对于原有野生型表达水平是额外的任意形式表达。出于本发明的目的，原始野生型表达水平也可以是零，即不存在表达或不可测量的表达。本文中对“增加的表达”，“增强的表达”或“过量表达”的谈及意指相对于对照植物而言基因表达的增加，和/或只要谈及多肽，增加的多肽水平和/或增加的多肽活性。与对照植物相比，表达、多肽水平或多肽活性的增加以增加的优选顺序是至少10％、20％、30％、40％或50％、60％、70％、80％、85％、90％、或100％或甚至更多。与对照植物相比，表达的增加可以以增加的优选顺序是至少100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％、2000％、3000％、4000％或5000％或甚至更多。当对照植物仅具有非常少量表达、所讨论序列和/或重组基因的多肽水平或多肽活性处在强力调节元件控制下时的情况下，与对照植物相比，表达、多肽水平或多肽活性的增加可以是至少100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍、3000倍、5000倍、10000倍、20000倍、50000倍、100000倍或甚至更多倍。在本领域内详细记载了用于增加基因或基因产物表达的方法并且它们包括例如，由适宜启动子驱动的过量表达、使用转录增强子或翻译增强子。可以在非异源形式的多核苷酸的适宜位置(一般是上游)内导入作为启动子或增强子元件的分离核酸，以便上调编码目的多肽的核酸的表达。例如，内源性启动子可以通过突变、缺失和/或取代而在体内改变(见Kmiec，US 5,565,350；Zarling等，WO9322443)，或可以将分离的启动子以相对于本发明基因的正确方向及距离导入植物细胞，以便控制基因表达。

若需要多肽表达，通常希望在多核苷酸编码区的3’末端包括多聚腺苷化区。多聚腺苷化区可以来自天然基因、来自多种其它植物基因或来自T-DNA。待添加的3’末端序列可以来自例如胭脂碱合酶或章鱼碱合酶基因或备选地来自另一植物基因或更不优选来自任意其它真核基因。

内含子序列也可以添加至5'非翻译区(UTR)或部分编码性序列的编码序列上，以增加在胞浆内积累的成熟信息的量。已经证实可剪接内含子在植物表达构建体和动物表达构建体中转录单位内的包含在mRNA水平及蛋白质水平上增加基因表达至多达1000倍(Buchman和Berg(1988)Mol.Cell biol.8：4395-4405；Callis等(1987)Gens Dev 1：1183-1200)。基因表达的此类内含子增强作用一般在位于转录单位5'末端附近时最强烈。使用玉米内含子Adh1-S内含子1、2和6、Bronze-1内含子是本领域已知的。对于一般信息，见：《玉米手册》，第116章，编者Freeling和Walbot，Springer，N.Y.(1994)。

为了获得多肽的增加表达或过量表达，最常见地，使编码这种多肽的核酸按有义方向伴随多聚腺苷化信号的情况下过量表达。除了适于以预期表达模式驱动表达的启动子之外，可以使用内含子或其他增强性元件。与此相反，相同核酸序列作为反义构建体的过量表达将不导致蛋白质的增加表达，而导致蛋白质的减少表达。

减少的表达

本文中对“减少的表达”或“降低或基本消除”表达的称谓意指内源基因表达和/或多肽水平和/或多肽活性相对于对照植物的降低。与对照植物相比，降低或基本去除以递增优选顺序是至少10％、20％、30％、40％或50％、60％、70％、80％、85％、90％,或95％、96％、97％、98％、99％或更多的降低。

为了降低或基本去除内源基因在植物中的表达，需要核酸序列的足够长度的基本上连续的核苷酸。为了开展基因沉默，这个长度可以是少至20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10个或更少的核苷酸，或者该长度可以多至整个基因(包括5’和/或3’UTR，部分或全体)。基本上连续的核苷酸片段可以来自编码目的蛋白的核酸(靶基因)或来自能够编码目的蛋白的直向同源物、旁系同源物或同源物的任意核酸。优选地，基本上连续的核苷酸片段能够与靶基因(有义链或反义链)形成氢键，更优选地，基本上连续的核苷酸片段以递增优选顺序与靶基因(有义链或反义链)具有50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列同一性。编码(功能性)多肽的核酸序列不是本文中所讨论用于降低或基本去除内源基因表达的多种方法所需的。

表达的这种降低或基本去除可以使用常规工具和技术完成。用于降低或基本去除内源基因表达的优选方法是在植物中导入(优选通过重组方法)并表达这样的遗传构建体，其中核酸(在此情况下是来自目的基因或任意核酸的一段基本上连续的核苷酸序列，其中所述的任意核酸能够编码任意一种目的蛋白的直向同源物、旁系同源物或同源物)克隆至所述的遗传构建体内作为由间隔区(非编码性DNA)隔开的(部分或完全的)反向重复序列。

在这种优选的方法中，使用核酸或其部分(在此情况下是从目的基因或从任意核酸中衍生的一段基本上连续的核苷酸序列，其中所述的任意核酸能够编码目的蛋白的直向同源物、旁系同源物或同源物)的反向重复序列(优选能够形成发夹结构)，通过RNA介导的沉默作用而降低或基本上去除内源基因的表达。反向重复序列在包含控制序列的表达载体中克隆。非编码性DNA核酸序列(间隔序列，例如基质附着区片段(MAR)、内含子、多接头等)位于形成反向重复序列的两个反向核酸之间。在反向重复序列转录后，形成具有(部分或完全)自身互补结构的嵌合RNA。这种双链RNA结构称作发夹RNA(hpRNA)。hpRNA由植物加工成为siRNA，其被掺入RNA诱导性沉默复合物(RISC)中。RISC进一步切开mRNA转录物，因而大幅度降低待翻译成多肽的mRNA转录物的数目。对于其它一般细节，见例如Grierson等(1998)WO 98/53083；Waterhouse等(1999)WO 99/53050)。

本发明方法的实施不依赖在植物中导入并表达其中克隆入核酸作为反向重复序列的遗传构建体，而是几种公知“基因沉默”方法的任意一种或多种可以用来实现相同的效果。

一种用于降低内源基因表达的如此方法是RNA介导的基因表达沉默(下调)。沉默作用在这种情况下由基本上与内源性靶基因相似的双链RNA序列(dsRNA)在植物中触发。这种dsRNA被植物进一步加工成约20到约26个核苷酸，称作短干扰性RNA(siRNA)。siRNA被掺入RNA诱导性沉默复合物(RISC)内，其中所述的RISC进一步切割内源性靶基因的mRNA转录物，因而大幅度降低待翻译成多肽的mRNA转录物的数目。优选地，双链RNA序列对应于靶基因。

RNA沉默方法的另一个实例包括以有义方向导入核酸序列或其部分(在此情况下是从目的基因或从任意核酸中衍生的一段基本上连续的核苷酸，其中所述的任意核酸能够编码目的蛋白的直向同源物、旁系同源物或同源物)至植物内。“有义方向”指与其mRNA转录物同源的DNA序列。因而将向植物中导入该核酸序列的至少一个拷贝。这种额外的核酸序列会降低内源基因表达，产生已知为共抑制作用的现象。当核酸序列的几个额外拷贝导入植物时，基因表达的降低将更明显，因为高转录物水平与共抑制作用的触发之间存在正相关。

RNA沉默方法的另一个实例包括使用反义核酸序列。"反义"核酸序列包含与编码蛋白质的"有义"核酸序列互补，即与双链cDNA分子的编码链互补，或与mRNA转录物序列互补的核苷酸序列。反义核酸序列优选地与待沉默的内源基因互补。互补性可以位于基因的“编码区”和/或”非编码区”内。术语”编码区"指包含被翻译成氨基酸残基的密码子的核苷酸序列区。术语”非编码区"指分布在编码区两侧的被转录但不翻译成氨基酸的5’和3’序列(也称作5'和3'非翻译区)。

反义核酸序列可以根据Watson和Crick碱基配对规则设计。反义核酸序列可以与整个核酸序列互补(在此情况下是从目的基因或从任意核酸中衍生的一段基本上连续的核苷酸，其中所述的任意核酸能够编码目的蛋白的直向同源物、旁系同源物或同源物)，不过也可以是仅与核酸序列的一部分(包括mRNA 5’和3’UTR)反义的寡核苷酸。例如，反义寡核苷酸序列可以与围绕编码多肽的mRNA转录物的翻译起点周围的区域互补。合适的反义寡核苷酸序列的长度是本领域已知的并且可以从长度约50、45、40、35、30、25、20、15或10个核苷酸或更少的核苷酸开始。本发明的反义核酸序列可以利用本领域已知方法，使用化学合成和酶连接反应而构建。例如，反义核酸序列(例如反义寡核苷酸序列)可以使用天然存在的核苷酸或多种修饰的核苷酸化学地合成，其中所述修饰的核苷酸被设计旨在增加分子的生物学稳定性或增加反义核酸序列与有义核酸序列之间所形成双链体的物理稳定性，例如，可以使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。可以用来产生反义核酸序列的修饰核苷酸的实例是本领域众所周知的。已知的核苷酸修饰包括甲基化、环化和'加帽'及用类似物(如肌苷)取代一个或多个天然存在的核苷酸。其它的核苷酸修饰是本领域众所周知的。

这种反义核酸序列可以使用其中核酸序列已经以反义方向加以亚克隆(即从插入的核酸中转录的RNA将与目的靶核酸呈反义方向)的表达载体以生物学方式产生。优选地，反义核酸序列在植物中的产生借助稳定整合的核酸构建体进行，其中所述的核酸构建体包含启动子、有效连接的反义寡核苷酸和终止子。

用于本发明方法中沉默作用的核酸分子(无论向植物中导入或在原位(in situ)产生)与编码多肽的mRNA转录物和/或基因组DNA杂交或结合，以便例如通过抑制转录和/或翻译而抑制蛋白质表达。杂交可以通过形成稳定双链体的常规核苷酸互补性所致，或在结合于DNA双链体的反义核酸序列的情况下，因双螺旋大沟内特异性相互作用所致。反义核酸序列可以通过转化或在特定组织部位直接注射而导入植物。备选地，反义核酸序列可以为了靶向所选择的细胞而受到修饰并且随后系统性施用。例如，对于系统性施用，反义核酸序列可以被修饰以便它们特异结合表达在所选择的细胞表面上的受体或抗原，例如通过连接反义核酸序列至与细胞表面受体或抗原结合的肽或抗体。反义核酸序列也可以使用本文中所述的载体送递至细胞内。

根据另一方面，反义核酸序列是α-异头核酸序列。α异头核酸序列与互补性RNA形成特定双链杂交分子，其中与惯常b-单元相反，所述链相互平行(Gaultier等(1987)Nucl Ac Res 15：6625-6641)。反义核酸序列也可以包含2'-o-甲基核糖核苷酸(Inoue等(1987)Nucl Ac Res 15，6131-6148)或嵌合RNA-DNA类似物(Inoue等(1987)FEBS Lett.215，327-330)。

内源基因表达的降低或基本去除也可以使用核酶而进行。核酶是具有核糖核酸酶活性的催化性RNA分子，能够切割与其具有互补区域的单链核酸序列，如mRNA。因此，核酶(例如锤头核酶(在Haselhoff和Gerlach(1988)Nature 334，585-591中描述)可以用来催化性地切割编码多肽的mRNA转录物，因而大幅度降低待翻译成多肽的mRNA转录物的数目。可以设计对核酸序列具特异性的核酶(见例如：Cech等美国专利号4,987,071；和Cech等美国专利号5,116,742)。备选地，对应于核酸序列的mRNA转录物可以用来从RNA分子库中选出具有特异性核糖核酸酶活性的催化性RNA(Bartel和Szostak(1993)Science 261，1411-1418)。核酶用于植物中基因沉默的用途是本领域已知的(例如Atkins等(1994)WO94/00012；Lenne等(1995)WO 95/03404；Lutziger等(2000)WO 00/00619；Prinsen等(1997)WO 97/13865和Scott等(1997)WO 97/38116)。

基因沉默也可以通过插入诱变(例如T-DNA插入或转座子插入)或通过如Angell和Baulcombe((1999)Plant J.20(3)：357-62)、(Amplicon VIGSWO 98/36083)或Baulcombe(WO 99/15682)及其它人描述的策略而实现。

当在内源基因上存在突变和/或在随后导入植物的分离的基因/核酸上存在突变时，基因沉默也可以发生。降低或基本去除可以由无功能的多肽引起。例如，多肽可以与多种相互作用性蛋白质结合；一个或多个突变和/或截短因而可以提供仍能够结合相互作用性蛋白质(如受体蛋白质)但不能表现其正常功能的多肽(如起信号作用的配体)。

另一种基因沉默的方法是靶定与基因调节区(例如启动子和/或增强子)互补的核酸序列以形成阻止基因在靶细胞中转录的三螺旋结构。见Helene，C.，Anticancer Drug Res.6，569-84，1991；Helene等，Ann.N.Y.Acad.Sci.660，27-361992和Maher，L.J.Bioassays 14，807-15，1992。

其它方法，如使用针对内源性多肽的抗体以抑制此多肽在植物中的功能，或干扰所述多肽参与的信号途径，对于技术人员将是众所周知的。尤其，可以构思的是人造分子可以用于抑制靶多肽的生物学功能，或用于干扰靶多肽参与其中的信号途径。

备选地，可以建立筛选程序以鉴定在植物群体中基因的天然变体，其中所述的变体编码具有降低活性的多肽。此类天然变体也可以用于例如进行同源重组。

人工和/或天然的微RNA(miRNA)可以用来敲除基因表达和/或mRNA翻译。内源性miRNA是通常19-24个核苷酸长度的单链小RNA。它们的主要功能是调节基因表达和/或mRNA翻译。大多数的植物微RNA(miRNA)与其靶序列具有完全的或接近完全的互补性。然而，存在具有多达5个错配的天然靶标。它们由切酶家族的双链特异性RNA酶从具有特征性折回结构的较长的非编码性RNA中加工而来。在加工时，它们通过与RNA诱导性沉默复合物(RISC)的主要成分Argonaute蛋白质结合而掺入该复合体。MiRNA充当RISC的特异性成分，因此它们与细胞质中的靶核酸(大多是mRNA)碱基配对。后续的调节事件包括靶mRNA切割和破坏和/或翻译抑制。miRNA过量表达的作用因此在靶基因降低的mRNA水平上得到反映。

通常21个核苷酸长度的人工微RNA(amiRNAs)可以遗传改造以特异性地负调节单个或多个目的基因的基因表达。植物微RNA靶的选择的决定因素是本领域众所周知的。用于靶识别的经验参数已经确定并且可以用来辅助设计特定的amiRNA(Schwab et al.,Dev.Cell 8,517–527,2005)。用于设计并产生amiRNA及其前体的便利工具也是公众可获得的(Schwab etal.,Plant Cell 18,1121-1133,2006)。

为最佳性能，用于降低内源基因在植物中表达的基因沉默技术需要使用来自单子叶植物的核酸序列以转化单子叶植物，和使用来自双子叶植物的核酸序列以转化双子叶植物。优选地，将来自任意给定植物物种的核酸序列导入同一个物种内。例如，将来自稻的核酸序列转化至稻植物。然而，并非绝对要求待导入的核酸序列起源于与该核酸序列将要导入的植物相同的植物物种。只要内源性靶基因与待导入的核酸之间存在相当大的同源性就足够了。

上文描述的是用于降低或基本去除内源基因在植物中表达的多种方法的实例。本领域技术人员会容易地能够调整前述用于沉默的方法以至于例如通过利用合适启动子而实现降低内源基因在整株植物或在其部分中的表达。

转化

如本文中所提及的术语“导入”或“转化”包括外源性多核苷酸转移至宿主细胞内，无论用于转化的方法是什么。能够后续克隆性增殖(无论通过器官发生或胚胎发生)的植物组织可以用本发明的遗传构建体转化并且可以从中再生整株植物。选择的具体组织将取决于可用于并且最适于正进行转化的具体物种的克隆性增殖系统。示例性组织靶包括叶盘、花粉、胚、子叶、下胚轴、大配子体、愈伤组织、现存分生组织(例如顶端分生组织、腋芽和根分生组织)和诱导的分生组织(例如子叶分生组织和下胚轴分生组织)。多核苷酸可以瞬时或稳定地导入宿主细胞并且可以非整合地维持，例如作为质粒。备选地，多核苷酸可以整合至宿主基因组内。产生的转化植物细胞随后可以用来以本领域技术人员已知的方式再生出转化植物。备选地，可以选择不能再生成植株的植物细胞作为宿主细胞，即所产生的转化的植物细胞不具有再生成(完整)植株的能力。

外来基因转化至植物基因组内称作转化。植物物种的转化现在是相当常规的技术。有利地，几种转化方法中的任一方法可以用来将目的基因导入合适的祖先细胞。用于从植物组织或植物细胞中转化并再生出植物所述的方法可以用于瞬时转化或用于稳定转化。转化方法包括使用脂质体、电穿孔法、增加游离DNA摄入的化学品、DNA直接注射至植物、粒子枪轰击法、使用病毒或花粉的转化法和显微投射法(microprojection)。转化方法可以选自用于原生质体的钙/聚乙二醇法(Krens，F.A.等，(1982)Nature296，72-74；Negrutiu I等(1987)Plant Mol Biol 8：363-373)；原生质体的电穿孔法(Shillito R.D.等(1985)Bio/Technol 3，1099-1102)；对植物材料的微量注射法(Crossway A等，(1986)Mol.Gen Genet 202：179-185)；DNA或RNA涂布的粒子轰击法(Klein TM等，(1987)Nature 327：70)、(非整合性)病毒感染法等。转基因植物，包括转基因作物植物，优选地通过农杆菌介导的转化法产生。有利的转化方法是在植物中(in planta)的转化法。为此目的，例如有可能使农杆菌作用于植物种子或有可能用农杆菌接种植物的分生组织。根据本发明已经证明使转化的农杆菌混悬液作用于完整植物或至少作用于花原基是特别有利的。植物随后继续培育直至获得所处理植物的种子(Clough和Bent，Plant J.(1998)16，735–743)。用于农杆菌介导的稻转化的方法包括用于稻转化的公知方法，如在任一以下文献中描述的那些方法：欧洲专利申请EP 1198985A1，Aldemita和Hodges(Planta199：612-617，1996)；Chan等(Plant Mol Biol 22(3)：491-506，1993)，Hiei等(Plant J 6(2)：271-282，1994)，其公开内容在本文中引入作为参考，如同完全给出那样。在玉米转化的情况下，优选的方法如Ishida等(Nat.Biotechnol 14(6)：745-50，1996)或Frame等(Plant Physiol 129(1)：13-22，2002)描述，其公开内容在本文中如充分所述那样引入作为参考。所述方法通过举例方式进一步由B.Jenes等，Techniques for Gene Transfer,在：Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，编者S.D.Kung和R.Wu，Academic Press(1993)128-143及在Potrykus Annu.Rev.PlantPhysiol.Plant Molec.Biol.42(1991)205-225)中描述。待表达的核酸或构建体优选地克隆至适于转化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的载体，例如pBin19(Bevan等，Nucl.Acids Res.12(1984)8711)。由这种载体转化的农杆菌随后可以按照已知方式用于转化植物，例如作为模型使用的植物，如拟南芥(鼠耳芥属于本发明的范围，不视为作物植物)或作物植物，例如烟草植物，通过在农杆菌溶液中浸泡擦伤的叶或切碎的叶并随后将它们在合适的培养基内培育。植物通过根癌农杆菌的转化例如由和Willmitzer在Nucl.Acid Res.(1988)16，9877中描述或尤其从F.F.White，Vectors for Gene Transfer in Higher Plants；在Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，编者S.D.Kung和R.Wu，AcademicPress，1993，第15-38页中获知。

除了转化体细胞(其随后必须再生成完整植物)之外，还有可能转化植物分生组织的细胞及特别转化发育成配子的那些细胞。在这种情况下，转化的配子遵循天然的植物发育过程，产生转基因植物。因此，例如拟南芥种子用农杆菌处理并且从发育植物中获得种子，其中一定比例的所述植物受到转化并且因此是转基因的[Feldman，KA和Marks MD(1987)Mol GenGenet 208：1-9；Feldmann K(1992)。在：编者C Koncz，N-H Chua和J Shell，Methods in Arabidopsis Research.Word Scientific，Singapore，第274-289页]。替代性方法基于反复去掉花序并使莲座叶丛中心中的切除部位与转化的农杆菌温育，因而转化的种子同样可以在较晚的时间点获得(Chang(1994)Plant J.5：551-558；Katavic(1994)Mol Gen Genet，245：363-370)。然而，尤其有效的方法是改良的真空渗入法，如“花浸染”法。在拟南芥真空渗入法的情况下，完整植物在减压下用农杆菌混悬液处理[Bechthold，N(1993)。C R Acad Sci Paris Life Sci，316：1194-1199]，而在“花浸染法”的情况下，正在发育的花组织与表面活性剂处理的农杆菌混悬液短暂温育[Clough，SJ和Bent，AF(1998)The Plant J.16，735-743]。在两种情况下收获了一定比例的转基因种子，并且这些种子可以通过在如上所述的选择条件下培育而与非转基因种子区分。此外，质体的稳定转化是有利的，因为质体在大部分作物中以母体方式遗传，降低或消除了转基因经花粉流动风险。叶绿体基因组的转化一般通过已在Klaus等，2004[Nature Biotechnology 22(2)，225-229]中示例性加以展示的方法实现。简而言之，待转化的序列连同选择标记基因一起克隆至与叶绿体基因组同源的侧翼序列之间。这些同源的侧翼序列指导位点特异性整合至原质体系内。已经对众多不同植物物种描述了质体转化并且综述可以出自Bock(2001)在基础研究和植物生物技术中的转基因质体(Transgenic plastids in basic research and plantbiotechnology).J Mol Biol.2001年9月21日；312(3)：425-38或Maliga，P(2003)质体转化技术商业化进展(Progress towards commercialization ofplastid transformation technology).Trends Biotechnol.21，20-28。进一步生物技术进展最近已经以无标记质体转化体的形式作了报道，所述无标记质体转化体可以通过瞬时共整合的标记基因产生(Klaus等，2004，NatureBiotechnology 22(2)，225-229)。

可以借助技术人员熟悉的全部方法再生出基因修饰的植物细胞。合适的方法可以在S.D.Kung和R.Wu,Potrykus或和Willmitzer的上述出版物中找到。备选地，基因修饰的植物细胞不可再生成完整植株。

通常，在转化后，对植物细胞或细胞群体选择一个或多个标记的存在，其中所述的标记由连同目的基因一起被共转移的植物可表达基因编码，随后将转化的材料再生成完整植物。为了选出转化的植物，转化中所获得的植物材料原则上经历选择性条件，从而转化的植物可以与未转化的植物区分。例如，按上述方式获得的种子可以种植，并且在初始培育期后，经受喷洒所致的合适选择作用。另一种可能性在于将种子(如果适宜，在消毒后)在使用合适选择剂的琼脂板上培育，从而仅转化的种子可以长成植物。备选地，对转化的植物筛选选择标记(如本文所述的选择标记)的存在。

在DNA转移和再生后，也可以对推定转化的植物，例如使用DNA印迹分析，评价目的基因的存在、拷贝数和/或基因组构造。备选或额外地，可以使用RNA印迹分析和/或蛋白质印迹分析，监测新导入的DNA的表达水平，这两项技术均是本领域普通技术人员熟知的。

可以通过多种手段增殖产生的转化植物，如通过克隆性增殖或经典育种技术。例如，第一世代(或T1)转化植物可以自交并且可以选择纯合的第二世代(或T2)转化体，并且随后可以通过经典育种技术进一步增殖T2植物。产生的转化生物可以采取多种形式。例如，它们可以是转化细胞与非转化细胞的嵌合体；克隆性转化体(例如，经转化以含有表达盒的全部细胞)；转化组织和未转化组织的移植体(例如，在植物中，嫁接至未转化接穗的转化砧木)。

在本申请通篇范围内，用构建体转化或互换地由构建体转化或者用或由核酸转化的植物、植物部分、种子或植物细胞将理解为因通过生物技术手段引入这种构建体或这种核酸而携带所述构建体或所述核酸作为转基因的植物、植物部分、种子或植物细胞。这种植物、植物部分、种子或植物细胞因此包含这种重组构建体或这种重组核酸。

T-DNA激活标签化

“T-DNA激活”标签化(Hayashi等Science(1992)1350-1353)涉及在目的基因的基因组区域内或基因编码区上游或下游10kb处以如此结构插入T-DNA(通常含有启动子(也可以是翻译增强子或内含子))，使得启动子指导被靶定基因的表达。通常，由靶定基因的天然启动子对所述靶定基因表达的调节作用遭到破坏并且该基因处在新导入的启动子控制下。启动子一般嵌入在T-DNA中。这种T-DNA随机地插入植物基因组，例如通过农杆菌感染，并导致在所插入T-DNA附近的基因的改良表达。因靠近所导入启动子的基因的改良表达，产生的转基因植物表现显性表型。

TILLING

用于产生和/或鉴定核酸诱变技术，其中所述的核酸编码具有修饰表达和/或活性的蛋白质。TILLING还允许选择携带此类突变变体的植物。这些突变变体可以显示在强度方面或在位置方面或在时间方面改良的表达(例如若突变影响启动子)。这些突变变体可以显示比由处于其天然形式的基因所显出活性更高的活性。TILLING将高密度诱变与高通量筛选方法组合。一般在TILLING中遵循的步骤是：(a)EMS诱变(Redei GP和KonczC(1992)在Methods in Arabidopsis Research，Koncz C，Chua NH，SchellJ，Singapore编辑，World Scientific Publishing Co，第16–82页；Feldmann等，(1994)在Meyerowitz EM，Somerville CR编辑，Arabidopsis.ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，第137-172页；Lightner J和Caspar T(1998)在J Martinez-Zapater，J Salinas编者，Methods on Molecular Biology第82卷.Humana Press，Totowa，NJ，第91-104页)；(b)个体的DNA制备和汇集；(c)PCR扩增目的区；(d)变性和复性以允许形成异源双链体；(e)DHPLC，其中将异源双链体是否在汇集物中的存在检测为色谱图中的一个额外峰；(f)鉴定突变个体；和(g)对突变PCR产物测序。用于TILLING的方法是本领域众所周知的(McCallum等，(2000)Nat Biotechnol 18：455-457；综述见Stemple(2004)Nat Rev Genet5(2)：145-50)。

同源重组

同源重组允许选择的核酸在基因组中于确定的所选择位置内导入。同源重组是在生物科学中常规地用于低等生物如酵母或苔藓剑叶藓(Physcomitrella)的标准技术。用于在植物中开展同源重组的方法已经不仅对模式植物(Offringa等(1990)EMBO J 9(10)：3077-84)而且对作物植物例如稻(Terada等(2002)Nat Biotech 20(10)：1030-4；Iida和Terada(2004)Curr Opin Biotech 15(2)：132-8)进行了描述，并且存在与靶生物无关而通常适用的方法(Miller等人,Nature Biotechnol.25,778-785,2007)。

产量相关性状

“产量相关性状”是与植物产量相关的性状或特征。产量相关性状可以包括以下非限制特征清单中的一个或多个：早期开花时间、产量、生物量、种子产量、早期生长势、绿度指数、生长速率、农艺性状如例如淹没耐受性(这导致稻中增加的产量)、水使用效率(WUE)、氮使用效率(NUE)等。

术语“一个或多个产量相关性状”理解为指与对照植物相比，一种植物的一个产量相关性状，或两个、或三个、或四个、或五个、或六或七个或八个或九个或十个或超过十个产量相关性状。

本文中对“增强的产量相关性状”的谈及意指相对于对照植物而言，完整植物或某植物的一个或多个部分的产量相关性状(例如早期生长势和/或生物量)的增加，所述的部分可以包括(i)地上部分，优选地上可收获部分和/或(ii)地下部分，优选地可收获地下部分。

具体而言，这类可收获部分是根如直根、茎、甜菜根、块茎、叶、花或种子。

在本申请通篇范围，植物针对一种或多种农业化学品的耐受性和/或抗性，例如除草剂耐受性，不视为本申请该术语含义范围内的产量相关性状。植物针对一种或多种农业化学品的改变的耐受性和/或抗性，例如改善的除草剂耐受性，不是如本申请通篇范围所用的“增强的产量相关性状”。

在本发明的一个特定实施方案中，任意对一个或多个增强的产量相关性状的谈及意在排除与原始野生型植物或原始变种相比时，恢复POI多肽在其中已经减少或废止POI多肽表达和/或活性的植物中的表达和/或活性。例如，不将POI多肽在其中已经敲除所述POI多肽或直向同源物或旁系同源物的植物的敲除突变变种中的过量表达视为增强本发明含义范围内的一个或多个产量相关性状。

产量

术语“产量”通常意指经济价值的可测量结果，一般与指定作物、与面积并且与时间段有关。基于其数目、大小和/或重量，个体植物部分直接对产量作出贡献，或实际产量是某种作物和一年的每平方米产量，这通过总产量(包括收获的产量和评估的产量)除以种植的平方米数而确定。

术语植物的“产量”并且“植物产量”在本文中可互换地使用，并意指营养体生物量如根和/或苗生物量，意指繁殖器官，和/或意指繁殖体，如该植物的种子。

玉米中的花是单性的；雄性花序(雄穗)源自顶端茎并且雌性花序(雌穗)来自腋芽顶端。雌性花序在中轴(玉米芯)表面上产生成对小穗。雌性小穗的每一个包封两朵能育性小花，一旦受精，它们中至少一朵将通常成熟为玉米谷粒。因此，玉米中的产量增加可以表现为以下一项或多项：每平方米已建立的植物数目增加、每株植物的谷穗数增加、行数、每行核粒数、核粒重、千粒重、谷穗长度/直径的增加、种子充实率(其为充实小花(即含有种子的小花)数除以小花总数并乘以100的数值)增加，及其他。

稻植物中的花序命名为圆锥花序。圆锥花序携带小穗，小穗是圆锥花序的基本单位并由花梗和小花组成。小花生于花梗上并且包括花，花由两片保护性颖片覆盖：较大颖片(外稃)和较短颖片(内稃)。因此，以稻为例，产量增加可以自身表现为以下一项或多项的增加：每平方米植物数、每株植物的圆锥花序数、圆锥花序长度、每个圆锥花序的小穗数、每个圆锥花序的花(或小花)数、种子充实率(其为充实小花(即含有种子的小花)数除以小花总数并乘以100的数值)增加、千粒重增加，及其他。

早期开花时间

如本文所用的具有“早期开花时间”的植物是比对照植物更早开始开花的植物。因而，该术语指显示较早开始开花的植物。植物的开花时间可以通过计数播种与第一圆锥花序出现之间的日数(“至开花的时间”)进行评估。可以例如使用如WO 2007/093444中所述的方法确定植物的“开花时间”。

早期萌发势

“早期萌发势”指活跃、健康、充分平衡的生长，尤其是植物生长早期阶段期间，并且可以因植物适应性增加而产生，其原因在于例如植物更好地适应其环境(即优化能源的使用和苗与根之间的分配)。具有早期萌发势的植物也显示增加的幼苗存活和更好的作物建立，这往往导致高度均匀的田块(作物整齐地生长，即大多数植物在基本上相同的时间上达到发育的各阶段)和往往更好及更高的产量。因而，早期萌发势可以通过多种因子如千粒重、萌发百分数、出苗百分数、幼苗生长、幼苗高度、根长度、根及苗生物量和众多其它因素而确定。

增加的生长速率

增加的生长速率可以专指植物的一个或多个部分(包括种子)，或可以基本上遍及整株植物。具有增加的生长速率的植物可以具备较短的生活周期。植物的生活周期可以意指从成熟种子生长直至植物已经产生与起始材料相似的成熟种子的阶段所需要的时间。这个生活周期可以受诸多因素如萌发速度、早期萌发势、生长速率、绿度指数、开花时间和种子成熟速度影响。生长速率的增加可以在植物生活周期的一个或多个阶段或基本上在植物整个生活周期期间发生。在植物生活周期中的早期阶段间，增加的生长速率可以反映增强的生长势。生长速率的增加可以改变植物的收获周期，从而允许植物更晚播种和/或更早收获，而这本来是不可能的(在开花时间更早情况下，可以获得相似的效果)。如果生长速率充分地增加，则可以允许进一步播种相同植物物种的种子(例如播种并收获稻植物，随后播种并收获其他稻植物，全部稻植物均处于一个常规的生长时期内)。类似地，如果生长速率充分地增加，则可以允许进一步播种不同植物物种的种子(例如播种并收获玉米植物，随后例如播种并任选收获大豆、马铃薯或任意其他合适的植物)。在一些作物植物的情况下，从相同砧木收获额外的次数也可以是可能的。改变植物的收获周期可以导致每平方米一年生物量生产的增加(原因在于可以培育并收获任意具体植物的次数(即在一年中)增加)。生长速率的增加也可以允许转基因植物在比野生型对应物更广泛的地理区域内栽培，因为栽培某作物的地域限制往往由栽种时间(早季)或收获时间(晚季)的不利环境条件决定。如果缩短收获周期，则可以避开这类不利条件。生长速率可以通过从生长曲线推算多项参数来确定，此类参数可以是：T-Mid(植物达到其50％最大尺寸所耗费的时间)和T-90(植物达到其90％最大尺寸所耗费的时间)，以及其他参数。

胁迫抗性

与对照植物相比，无论植物处于非胁迫条件下或无论植物暴露于多种胁迫，发生产量和/或生长速率的增加。植物一般通过生长得更慢而应答暴露于胁迫。在严重胁迫的情况下，植物甚至可能完全停止生长。另一方面，轻度胁迫在本文中定义为植物所暴露的任意胁迫，其不导致植物完全停止生长，但同时不能恢复生长。与非胁迫条件下的对照植物相比，轻度胁迫在本发明的意义下导致受胁迫植物的生长减少小于40％、35％、30％或25％、更优选地小于20％或15％。由于农业实践(灌溉、施肥、杀虫剂处理)的进步，栽培的作物植物中并不经常遭遇严重胁迫。因此，由轻度胁迫引起的受损生长往往是对农业而言不受欢迎的特征。

将“生物性胁迫”理解为由其他活生物如细菌、病毒、真菌、线虫、昆虫、其他动物或其他植物对植物产生的不利影响。“生物性胁迫”一般是由病原体如细菌、病毒、真菌、植物、线虫和昆虫或其他动物引起的那些胁迫，这些胁迫可以对植物生长和/或产率产生不利作用。

将“非生物胁迫”理解为特定环境中非活力因素对活植物的不利影响。非生物胁迫或环境胁迫可以因干旱或过量的水、缺氧胁迫、盐胁迫、化学毒性、氧化胁迫和热、寒冷或冰冻温度所致。“非生物胁迫”可以是因水胁迫(尤其归因于干旱)、盐胁迫或冷冻胁迫引起的渗透胁迫。非生物性胁迫也可以是氧化胁迫或寒冷胁迫。“冷冻胁迫”意指归因于冰冻温度(即，可用水冷冻并变成冰的温度)的胁迫。“寒冷胁迫”，也称作“低温胁迫”意指寒冷温度，例如，10°以下或优选地5℃以下的温度，但是在所述温度上水分子不冻结。如Wang等人(Planta(2003)218:1-14)中所报道，非生物性胁迫导致一系列不利影响植物生长及生产力的形态学、生理学、生物化学和分子变化。干旱、盐度、极端温度和氧化胁迫已知是相互联系的，并且可以通过相似的机制引起生长损害及细胞损害。Rabbani等人(Plant Physiol(2003)133:1755-1767)描述了干旱胁迫与高盐度胁迫之间特别高程度的“串话”。例如，干旱和/或盐化作用主要表现为渗透胁迫，从而导致细胞内稳态和离子分布的破坏。氧化胁迫，其经常伴随高温或低温、盐度或干旱胁迫，可以造成功能蛋白和结构蛋白变性。因此，这些多样的环境胁迫常常激活相似的细胞信号传导途径和细胞应答，如产生胁迫蛋白、上调抗氧化物质、积累兼容性溶质和生长抑制。如本文中所用的术语“非胁迫”条件是允许植物最佳生长的那些环境条件。本领域技术人员清楚给定地点的正常土壤条件和气候条件。伴有最佳生长条件(在非胁迫条件下培育)的植物一般以递增的优选顺序产生该植物在给定环境中至少97％、95％、92％、90％、87％、85％、83％、80％、77％或75％的平均产量。平均产量可以基于收获量和/或季节计算。本领域技术人员清楚作物的平均生产产量。

增加/改善/增强

在产量相关的性状背景中的术语“增加”、“改善”或“增强”是可互换的并且在本申请的含义下应当指与如本文中定义的对照植物相比产量相关性状(如但不限于更多产量和/或生长)至少3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％，优选地至少15％或20％、更优选地25％、30％、35％或40％增加。

种子产量

增加的种子产量可以本身表现为以下一项或多项：

a)种子生物量(种子总重量)的增加，这可以基于单粒种子和/或每株植物和/或每平方米而言计算；

b)每株植物增加的花数；

c)增加的种子数；

d)增加的种子充实率(其表述为充实小花数除以小花总数之间的比率)；

e)增加的收获指数，其表述为可收获部分(如种子)的产量除以植物地上部分的生物量的比率；和

f)增加的千粒重(TKW)，其从计数的充实种子数及其总重量外推而来。增加的TKW可以因增加的种子尺寸和/或种子重量引起，并且也可以因胚尺寸和/或胚乳尺寸增加引起。

术语“充实的小花”和“充实的种子”可以视为同义词。

种子产量的增加也可以表现为种子尺寸和/或种子体积的增加。此外，种子产量的增加也可以自身表现为种子面积和/或种子长度和/或种子宽度和/或种子周长的增加。

绿度指数

如本文中所用的“绿度指数”从植物的数字图像计算。对于属于该图像上植物目标的每个像素，计算绿色值对红色值的比率(以编码颜色的RGB模式)。绿度指数表述为绿色/红色比超过给定阈值的像素的百分数。在正常生长条件下，在盐胁迫生长条件下和在养分可利用性降低的生长条件下，在开花前的最后成像中测量植物的绿度指数。相反，在干旱胁迫生长条件下，在干旱后的首次成像中测量植物的绿度指数。

生物量

如本文所用的术语“生物量”意指植物或植物部分的总重量。总重量可以计量为干重、鲜重或湿重。在生物量的定义范围内，可以在植物的一个或多个部分的生物量之间做出区分，所述的部分可以包括以下的任意一项或多项：

-地上部分，如但不限于苗生物量、种子生物量、叶生物量等；

-地上可收获部分，如但不限于苗生物量、种子生物量、叶生物量、茎生物量、茎段(sett)等；

-地下部分，如但不限于根生物量、块茎、球茎等；

-地下可收获部分，如但不限于根生物量、块茎、球茎等；

-部分地下的可收获部分，如但不限于甜菜和植物的其他下胚轴区域、根状茎、匍匐茎或攀爬根茎；

-营养体生物量如根生物量、苗生物量等；

-繁殖器官；和

-繁殖体如种子。

在本申请通篇范围的一个优选实施方案中，对“根”作为生物量或作为可收获部分或例如作为含糖量增加的器官的任意谈及理解为谈及部分地插在土地中或与土地实际接触的可收获部分，如但不限于甜菜根和植物的其他下胚轴区域、根状茎、匍匐茎或攀爬根茎，但是不包括叶，以及地下可收获部分，如但不限于根、直根、块茎或球茎。

在另一个实施方案中，将地上部分或地上可收获部分或地上部分生物量理解为不包括种子和/或果实的地上部分营养体生物量。

标记辅助育种

此类育种计划有时需要通过使用例如EMS诱变法对植物进行诱变处理来导入等位变异；或者，所述计划可以始于一组并非故意造成的所谓“自然”来源性等位变体。随后进行等位变体的鉴定，例如通过PCR法。而后是步骤：选择所讨论序列的并且导致产量增加的优异等位变体。一般通过监测含有所讨论序列的不同等位变体的植物的生长性能实施选择。可以在温室中或在田间监测生长性能。其他任选的步骤包括将其中鉴定到优异等位变体的植物与另一株植物杂交。这可能用来例如产生感兴趣的表型特征的组合。

用作(基因作图)中的探针

编码目的蛋白的核酸用于对基因进行遗传和物理作图的用途仅需至少15个核苷酸长度的核酸序列。这些核酸可以用作限制性片段长度多态性(RFLP)标记。限制性消化的植物基因组DNA的DNA印迹物(Sambrook J，Fritsch EF和Maniatis T(1989)Molecular Cloning，A Laboratory Manual)可以用编码目的蛋白的核酸探测。所得的带型随后可以使用计算机程序如MapMaker(Lander等人(1987)Genomics 1：174-181)，进行遗传分析以构建遗传图。此外，所述核酸可以用来探测含有一组个体的限制性内切核酸酶处理的基因组DNA的DNA印迹物，其中所述的一组个体代表确定的遗传杂交的亲本和子代。DNA多态性的分离被注意到并且用来计算编码目的蛋白的核酸在先前使用这个群体所获得的遗传图中的位置(Botstein等人(1980)Am.J.Hum.Genet.32:314-331)。

在Bernatzky和Tanksley(1986)Plant Mol.Biol.Reporter 4:37-41中描述了植物基因来源的探针的产生及其在遗传作图中的用途。许多出版物描述了使用上文概述的方法学或其变型对特定cDNA克隆的遗传作图。例如，F2互交群、回交群、随机交配群、邻近纯合系和其他个体群体可以用于作图。此类方法学是本领域技术人员熟知的。

所述核酸探针也可以用于物理作图(即序列在物理图上的排列；见Hoheisel等人，在：Non-mammalian Genomic Analyasis：A PracticalGuide，Academic press 1996，第319-346页及其中引用的参考文献)。

在另一个实施方案中，所述核酸探针可以用于直接萦光原位杂交(FISH)作图中(Trask(1991)Trends Genet.7:149-154)。尽管现有的FISH作图法支持大克隆(几个kb至几百个kb；见Laan等人(1995)Genome Res.5:13-20)的使用，然而灵敏度的改善可以允许使用更短探针进行FISH作图。

多种基于核酸扩增的用于遗传作图及物理作图的方法可以使用所述核酸实施。实例包括等位基因特异性扩增法(Kazazian(1989)J.Lab.Clin.Med 11:95-96)、PCR扩增片段的多态性(CAPS；Sheffield等人(1993)Genomics 16:325-332)、等位基因特异性连接(Landegren等人(1988)Science 241:1077-1080)、核苷酸延伸反应(Sokolov(1990)Nucleic Acid Res.18:3671)、放射杂交作图(Walter等人(1997)Nat.Genet.7:22-28)和Happy作图法(Dear和Cook(1989)Nucleic Acid Res.17:6795-6807)。对于这些方法，将核酸的序列用来设计并且产生在扩增反应或在引物延伸反应中所使用的引物对。此类引物的设计是本领域技术人员熟知的。在使用基于PCR的遗传作图方法中，可能需要鉴定在对应于本发明核酸序列的区域内作图交叉的亲本之间的DNA序列差异。然而，对作图法而言，这通常不是必需的。

植物

如本文中所用的术语”植物”包含整株植物、植物的祖先及后代和植物部分，包括种子、枝条、茎、叶、根(包括块茎)、花和组织及器官，其中每种所提及对象包含目的基因/核酸。术语”植物”也包含植物细胞、悬浮培养物、愈伤组织、胚、分生组织区、配子体、孢子体、花粉和小孢子，同样每种提及的对象包含目的基因/核酸。

特别用于本发明方法中的植物包括属于植物界(Viridiplantae)超家族的全部植物，尤其单子叶植物和双子叶植物，包括选自以下的饲用或饲料豆类、观赏植物、粮食作物、树或灌木：槭树属物种(Acer spp.)、猕猴桃属物种(Actinidia spp.)、秋葵属物种(Abelmoschus spp.)、剑麻(Agavesisalana)、冰草属物种(Agropyron spp.)、匍匐剪股颖(Agrostisstolonifera)、葱属物种(Allium spp.)、苋属物种(Amaranthus spp.)、欧洲海滨草(Ammophila arenaria)、凤梨(Ananas comosus)、番荔枝属物种(Annona spp.)、芹菜(Apium graveolens)、落花生属物种(Arachis spp.)、木波罗属物种(Artocarpus spp.)、石刁柏(Asparagus officinalis)、燕麦属物种(Avena spp.)(例如燕麦(Avena sativa)、野燕麦(Avena fatua)、比赞燕麦(Avena byzantina)、Avena fatua var.sativa、杂种燕麦(Avena hybrida)、阳桃(Averrhoa carambola)、箣竹属(Bambusa sp.)、冬瓜(Benincasahispida)、巴西栗(Bertholletia excelsea)、甜菜(Beta vulgaris)、芸苔属物种(Brassica spp.)(例如欧洲油菜(Brassica napus)、芜青物种(Brassica rapassp.)[卡诺拉油菜、油菜(oilseed rape)、蔓青(turnip rape)])、Cadabafarinosa、茶(Camellia sinensis)、美人蕉(Canna indica)、大麻(Cannabissativa)、辣椒属物种(Capsicum spp.)、Carex elata、番木瓜(Carica papaya)、大果假虎刺(Carissa macrocarpa)、山核桃属物种(Carya spp.)、红花(Carthamus tinctorius)、栗属物种(Castanea spp.)、美洲木棉(Ceibapentandra)、苦苣(Cichorium endivia)、樟属物种(Cinnamomum spp.)、西瓜(Citrullus lanatus)、柑桔属物种(Citrus spp.)、椰子属物种(Cocos spp.)、咖啡属物种(Coffea spp.)、芋头(Colocasia esculenta)、非洲梧桐属物种(Colaspp.)、黄麻属(Corchorus sp.)、芫荽(Coriandrum sativum)、榛属物种(Corylus spp.)、山楂属物种(Crataegus spp.)、番红花(Crocus sativus)、南瓜属物种(Cucurbita spp.)、香瓜属物种(Cucumis spp.)、菜蓟属(Cynara spp.物种)、胡萝卜(Daucus carota)、山马蝗属物种(Desmodium spp.)、龙眼(Dimocarpus longan)、薯蓣属物种(Dioscorea spp.)、柿树属物种(Diospyrosspp.)、稗属物种(Echinochloa spp.)、油棕属(Elaeis)(例如油棕(Elaeisguineensis)、美洲油棕Elaeis(oleifera))、穇子(Eleusine coracana)、画眉草(Eragrostis tef)、蔗茅属(Erianthus sp.)、枇杷(Eriobotrya japonica)、桉属(Eucalyptus sp.)、红仔果(Eugenia uniflora)、荞麦属物种(Fagopyrum spp.)、水青冈属物种(Fagus spp.)、苇状羊茅(Festuca arundinacea)、无花果(Ficuscarica)、金桔属物种(Fortunella spp.)、草莓属物种(Fragaria spp.)、银杏(Ginkgo biloba)、大豆属(Glycine spp.)(例如大豆、大豆(Soja hispida)或大豆(Soja max))、陆地棉(Gossypium hirstum)、向日葵属(Helianthus spp.)(例如向日葵(Helianthus annuus))、长管萱草(Hemerocallis fulva)、木槿属物种(Hibiscus spp.)、大麦属(Hordeum spp.)(例如大麦(Hordeum vulgare))、甘薯(Ipomoea batatas)、核桃属物种(Juglans spp.)、莴苣(Lactuca sativa)、山黧豆属物种(Lathyrus spp.)、兵豆(Lens culinaris)、亚麻(Linumusitatissimum)、荔枝(Litchi chinensis)、百脉根属物种(Lotus spp.)、棱角丝瓜(Luffa acutangula)、羽扇豆属物种(Lupinus spp.)、Luzula sylvatica、番茄属(Lycopersicon spp.)(例如番茄(Lycopersicon esculentum、Lycopersicon lycopersicum、Lycopersicon pyriforme))、硬皮豆属物种(Macrotyloma spp.)、苹果属物种(Malus spp.)、凹缘金虎尾(Malpighiaemarginata)、牛油果(Mammea americana)、芒果(Mangifera indica)、木薯属物种(Manihot spp.)、人心果(Manilkara zapota)、苜蓿(Medicagosativa)、草木樨属物种(Melilotus spp.)、薄荷属物种(Mentha spp.)、芒(Miscanthus sinensis)、苦瓜属物种(Momordica spp.)、黑桑(Morus nigra)、芭蕉属物种(Musa spp.)、烟草属物种(Nicotiana spp.)、木犀榄属物种(Oleaspp.)、仙人掌属物种(Opuntia spp.)、鸟足豆属物种(Ornithopus spp.)、稻属(Oryza spp.)(例如稻、阔叶稻(Oryza latifolia))、稷(Panicum miliaceum)、柳枝稷(Panicum virgatum)、鸡蛋果(Passiflora edulis)、欧防风(Pastinacasativa)、狼尾草属物种(Pennisetum sp.)、鳄梨属物种(Persea spp.)、芹菜(Petroselinum crispum)、虉草(Phalaris arundinacea)、菜豆属物种(Phaseolus spp.)、猫尾草(Phleum pratense)、刺葵属物种(Phoenix spp.)、南方芦苇(Phragmites australis)、酸浆属物种(Physalis spp.)、松属物种(Pinus spp.)、阿月浑子(Pistacia vera)、豌豆属物种(Pisum spp.)、早熟禾属物种(Poa spp.)、杨属物种(Populus spp.)、牧豆草属物种(Prosopis spp.)、李属物种(Prunus spp.)、番石榴属物种(Psidium spp.)、石榴(Punicagranatum)、西洋梨(Pyrus communis)、栎属物种(Quercus spp.)、萝卜(Raphanus sativus)、波叶大黄(Rheum rhabarbarum)、茶藨子属物种(Ribesspp.)、蓖麻(蓖麻)、悬钩子属物种(Rubus spp.)、甘蔗属物种(Saccharumspp.)、柳属物种(Salix sp.)、接骨木属物种(Sambucus spp.)、黑麦(Secalecereale)、胡麻属物种(Sesamum spp.)、白芥属物种(Sinapis sp.)、茄属(Solanum spp.)(例如马铃薯(Solanum tuberosum)、红茄(Solanumintegrifolium)或番茄(Solanum lycopersicum))、两色蜀黍(两色蜀黍)、菠菜属物种(Spinacia spp.)、蒲桃属物种(Syzygium spp.)、万寿菊属物种(Tagetesspp.)、酸豆(Tamarindus indica)、可可树(Theobroma cacao)、车轴草属物种(Trifolium spp.)、鸭茅状摩擦禾(Tripsacum dactyloides)、Triticosecalerimpaui、小麦属(Triticum spp.)(例如普通小麦(Triticum aestivum)、硬粒小麦(Triticum durum)、圆柱小麦(Triticum turgidum)、Triticumhybernum、马卡小麦(Triticum macha)、普通小麦(Triticum sativum)、一粒小麦(Triticum monococcum)或普通小麦(Triticum vulgare))、小金莲花(Tropaeolum minus)、金莲花(Tropaeolum majus)、越桔属物种(Vaccinium spp.)、野碗豆属物种(Vicia spp.)、豇豆属物种(Vigna spp.)、香堇(Viola odorata)、葡萄属物种(Vitis spp.)、玉蜀黍、Zizania palustris、枣属物种(Ziziphus spp.)等等。

对照植物

合适的对照植物的选择是实验设计的例行部分，并且可以包括相应的野生型植物或无目的基因的相应植物。对照植物一般是相同的植物物种或甚至是与待评估植物相同的品种。对照植物也可以是待评估植物的失效合子。失效合子(或失效对照植物)是因分离而丢失转基因的个体。另外，将对照植物在与本发明植物的培育条件相同的培育条件下培育，即在本发明植物附近并与之同时培育。如本文中所用的“对照植物”不仅指完整植物，也指植物部分，包括种子和种子部分。

繁殖材料/繁殖体

“繁殖材料”或“繁殖体”是能够发育成完整植物的植物器官、组织或细胞的任意一种。“繁殖材料”可以基于营养性繁殖(也称作营养繁殖、营养增殖或营养性克隆)或有性繁殖。繁殖材料可以是因此种子或非繁殖器官的部分，如茎或叶。具体地，就禾本科而言，合适的繁殖材料也可以是茎的切片，即，茎插枝(如茎段(sett))。

茎秆

“茎秆”是属于禾本科的植物的茎，并且又称作“有效茎”。在禾本科的情况下，“茎秆”、“茎”、“苗”或“分蘖”互换使用。

茎段

“茎段”是来自禾本科的植物的一段茎，其合适作为繁殖材料使用。“茎段”的同义表述是“种蔗(seed-cane)”、“茎插枝”、“茎秆切片”和“种段(seedpiece)”。

附图简述

在全部附图中，对于表A的每个序列，下表A中给出的缩写名用来代表序列。

本发明现在将参考以下图进行描述，其中：

图1.总结了SEQ ID NO:2的序列中的位置，A.鉴定的基序1至6(PATTERN_01至PATTERN_06)和它们相应的SEQ ID Nos.；和B.作为SEQ ID NO:2中的三个共有基序的起始和终止氨基酸残基；和C.SEQ IDNO:2中提供的氨基酸序列中的PFAM结构域PF02861。有趣的是，发现结构域PF02861的N-端部分在此CLP多肽的N-端附近匹配，且发现结构域PF02861的C-端部分在此CLP多肽的C-端(如SEQ ID NO:2中给出的位置所示的)匹配。

图2.表示各种POI多肽的多重比对结果。黑色阴影表示多个蛋白质序列之间相同的氨基酸，灰色阴影代表高度保守的氨基酸取代，即至少80％保守的残基，并且在其余位置，不存在序列保守性。当使用保守的氨基酸时，这些比对结果可以用于限定其他基序或标签序列。

图3.显示使用来自Invitrogen的VectorNTI软件套装的AlignX时，CLP多肽的进化系统树，详见实施例3。

图4.显示实施例3的序列相似性和同一性表。

图5.表示用于在稻GOS2启动子(pGOS2)控制下增加编码POI的核酸在稻中表达的双元载体。

图6.CLP总结不同SEQ ID NOs相对于前导序列的关系。

图7.显示InterproScan分析SEQ ID NO:2的结果；详见实施例4。

实施例

本发明现在参考如下实施例进行描述，所述实施例仅是说明性的。以下实施例不意在限制本发明的范围。具体而言，使用了在所描述的实验中使用的植物，因为拟南芥、烟草、稻和玉米植物是检验转基因的模式植物。因检验相对容易，它们广泛地用于本领域中，同时具有结果向农业中所用其他植物的良好可转移性，所述其他植物是如，但不限于玉米、小麦、稻、大豆、棉花、菜籽油菜(包括卡诺拉油菜)、甘蔗、糖料甜菜和苜蓿，或其他双子叶或单子叶植物作物。

除非另外说明，否则本发明采用植物生物学、分子生物学、生物信息学和植物育种的常规技术和方法。

DNA操作：除非另外说明，否则重组DNA技术根据(Sambrook(2001)Molecular Cloning:a laboratory manual,第3版Cold Spring HarborLaboratory Press,CSH,New York)或Ausubel等人(1994),CurrentProtocols in Molecular Biology,Current Protocols第1卷和第2卷中所述的标准方案进行。在BIOS科学出版有限责任公司(BIOS ScientificPublications Ltd(英国))和Blackwell科学出版社(Blackwell ScientificPublications)(英国)出版的R.D.D.Cray的Plant Molecular BiologyLabfax(1993)中描述了用于植物分子研究工作的标准材料和方法。

实施例1：鉴定与SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2相关的序列

使用数据库序列搜索工具，如基本局部比对工具(BLAST)(Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-410；和Altschul等人(1997)Nucleic AcidsRes.25:3389-3402)，在国家生物技术信息中心(NCBI)的Entrez核苷酸数据库中维护的那些序列中鉴定了与SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2相关的(全长cDNA、ESTs或基因组)序列。该程序用来通过将核酸序列或多肽序列与序列数据库比较并且计算匹配的统计显著性来找到序列之间的局部相似区域。例如，将SEQ ID NO:1的核酸所编码的多肽用于TBLASTN算法中，采用默认设置和过滤程序以忽略低复杂性序列抵消。该分析的输出结果通过逐对比较进行检验，并根据概率评分(E-值)评级，其中所述的评分反映特定比对结果偶然发生的概率(E-值越低，命中的显著性越高)。除E-值外，比较也可以由同一性百分数评定。同一性百分数指所比较的两个核酸(或多肽)序列之间在特定长度范围内的相同核苷酸(或氨基酸)的数目。在一些情况下，可以调整默认参数以调节搜索的严格性。例如，可以增加E-值以显示较不严格的匹配。以这种方式，可以鉴定到几乎精确的短匹配。

表A提供与SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2相关的一系列核酸序列。

表A:CLP编码核酸和多肽的例子：

使用SEQ ID NO:2作为起点，人工设计SEQ ID NO:87、89、91、93、95、97、99、101、103和105的多肽序列。它们分别与SEQ ID NO:2的序列共有大约70、75、80、85、90、92、95、96、97和98同一性百分数。SEQ ID NO:86、88、90、92、94、96、98、100、102和104是分别编码SEQ ID NO:87、89、91、93、95、97、99、101、103和105的多肽的核酸序列的例子。

序列已经由研究机构如基因组研究所(TIGR；始于TA)初步地组装并且公开披露。例如，真核生物基因直向同源物(EGO)数据库可以用来通过关键词检索或通过使用BLAST算法以目的核酸序列或多肽序列鉴定此类相关序列。已经为特定生物(例如针对某些原核生物)创建了专有核酸序列数据库，如由联合基因组研究所(Joint Genome Institute)创建。另外，登录专利数据库已经允许鉴定新的核酸序列和多肽序列。

实施例2：POI多肽序列的比对

比对用软件ClustalW(版本1.83)进行并且由Thompson等人,(Nucleic Acids Research 22,4673(1994))描述。独立程序的源代码是公众从德国海德堡欧洲分子生物学实验室可获得的。使用ClustalW v1.83的默认参数(空位开口罚分：10.0；空位延伸罚分：0.2；蛋白质矩阵：Gonnet；蛋白质/DNA末端空位：-1；蛋白质/DNA空位距离：4)，进行分析。

进行少许手工编辑以进一步优化该比对。在图2中比对POI多肽。

通过使用VectorNTI软件套件的AlignX(Invitrogen，Life TechnologiesGmbH分部，法兰克福Straβe129B，64293Darmstadt，德国)采用标准设置比对多个POI序列，构建CLP多肽的进化系统树(图3)。使用在ClustalW比对期间产生(参数如上文显示)的引导树：将ClustalW产生的多重序列比对(*.msf-file)文件和引导树(*.dnd)文件合并使用程序“GeneDoc”(Nicholas,Karl B,和Nichloas,Hugh B.Jr.,1997,"GeneDoc:atool for editing and annotating multiple sequence alignments(GeneDoc：一种用于编辑和注释多重序列比对结果的工具)”，在http://www.nrbsc.org/gfx/genedoc/可获得)输出成一个统一msf-file。为了进化系统树的可视化，将所产生的msf文件(含有多重序列比对结果和引导树信息)输出至AlignX(Vector NTI Advance 11.5.1,Invitrogen 2011)。

实施例3：计算多肽序列之间的总体同一性百分数

通过来自EMBOSS软件包，版本号6.3.1.2(欧洲分子生物学开放软件包；http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/；参见McWilliam H.,Valentin F.,Goujon M.,Li W.,Naraya-nasamy M.,Martin J.,Miyar T.和Lopez R.(2009),网页服务器位于European Bioinformatics Institute–2009,NucleicAcids Research 37:W6-W10；获自EMBL European BioinformaticsInstitute,EMBL-EBI,Wellcome Trust Genome Campus,Hinxton,Cambridge,CB101SD,UK,和http://emboss.sourceforge.net/)的程序“needle”确定用于实施本发明方法的全长多肽序列之间的总体相似性和同一性百分数；

图4中显示在这些多肽序列的全长范围内总体相似性百分数和同一性百分数的分析结果。序列相似性在分割线下半部分显示，并且序列同一性在对角分割线的上半部分显示。分析中使用的参数是：-空位开口0.0，-空位延伸0.5，矩阵：BLOSUM62。与SEQ ID NO:2相比，在实施本发明方法中有用的CLP多肽序列之间的序列同一性(以％计)可以低至35％(但是通常高于40％)。

基于CLP多肽的多重比对结果，例如实施例2的一个多重比对结果，技术人员可以选择保守序列并且作为输入提交用于相似性/同一性分析。这种方法用于CLP蛋白之间总体序列保守性相当低的情况下。

实施例4：鉴定在实施本发明方法中有用的多肽序列中所包含的基序 和结构域

蛋白质家族、结构域和位点的集成资源(InterPro)数据库是针对基于文本及基于序列的搜索法的常用特征标识数据库的集成界面。InterPro数据库合并了这些数据库，所述数据库使用不同的方法学及有关充分表征的蛋白质的程度各异的生物学信息以获得蛋白质特征标识(protein signatures)。合作数据库包括SWISS-PROT、PROSITE、TrEMBL、PRINTS、ProDom和Pfam、Smart和TIGRFAM。Pfam是覆盖许多常见蛋白质结构域和家族的多重序列比对结果和隐匿马尔科夫模型(HMM)的庞大集合。Pfam在英国Sanger研究所服务器上维护。Interpro在英国欧洲生物信息学研究所维护。

在表B1中呈现如SEQ ID NO:2所代表的多肽序列的InterProScan结果(见Zdobnov E.M.和Apweiler R.；“InterProScan-an integrationplatform for the signature-recognition methods in InterPro(InterProScan-用于InterPro中特征标识识别方法的集成平台).”；Bioinformatics,2001,17(9):847-8；InterPro数据库，版本37.0，2012年4月30日)。

使用InterProScan v4.8和InterPro database版本41.0,2013年2月13日的重复分析产生的结果示于表B2。

表B1:如SEQ ID NO:2所代表的多肽序列的InterProScan结果(主要登录号)。使用默认参数(DB遗传密码＝标准；转录物长度＝20)。

表B2：如SEQ ID NO:2所代表的多肽序列的InterProScan结果(主要登录号)。使用默认参数(DB遗传密码＝标准；转录物长度＝20)。

在一个实施方案中，POI多肽包含与SEQ ID NO:2中氨基酸11至166的保守结构域具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的保守结构域。

保守基序的鉴定

用软件工具MEME版本3.5鉴定保守样式。MEME由美国圣迭戈市加利福尼亚州立大学计算机科学与工程系Timothy L.Bailey和CharlesElkan开发并且由Timothy L.Bailey和Charles Elkan描述(Fitting amixture model by expectation maximization to discover motifs inbiopolymers(通过期望最大化拟合混合模型以发现生物聚合物中的基序)，第二届分子生物学智能系统国际会议文集(Proceedings of the SecondInternational Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology)，第28-36页,AAAI Press,Menlo Park,California,1994)。独立程序的源代码是公众从圣迭戈超级计算机中心(http://meme.sdsc.edu)可获得的。

为了用软件工具MEME鉴定全部序列中的共同基序，使用以下设置：-最大尺寸500000，-nmotifs 15，-evt 0.001，-maxw 60，-距离1e-3，-用于分析的序列的最少位点数。用于MEME的输入序列是FASTA格式的未比对序列。在这个版本软件中在默认设置下使用其他参数。

用软件工具2.1版Pratt或手工地生成保守结构域的PROSITE样式。Pratt由挪威卑尔根大学信息学系Jonassen开发并由Jonassen等人描述(I.Jonassen,J.F.Collins和D.G.Higgins,Finding flexible patterns inunaligned protein sequences(找到未比对的蛋白质序列中的柔性样式),Protein Science 4(1995),第1587-1595页；I.Jonassen,Effi-cient discoveryof conserved patterns using a pattern graph(使用样式图高效发现保守样式),1997年2月提交至CABIOS]。独立程序的源代码(ANSI C)是公众可获得的，例如在设立的生物信息中心如EBI(欧洲生物信息学研究所)处。

为了用软件工具Pratt生成样式，使用以下设置：PL(最大样式长度)：100，PN(最大样式符号数)：100，PX(最大连续x's数目)：30，FN(柔性间隔区最大数目)：5，FL(最大柔性)：30，FP(最大柔性乘积)：10，ON(最大样式数目)：50。Pratt的输入序列是蛋白质序列的如从软件工具MEME鉴定为显示高度相似性的不同区域。将必须匹配所生成样式的最小序列数目(CM，匹配Seq的最小数目)设定为所提供序列的至少80％。

通过PROSITE和/或MEME鉴定的样式用程序Fuzzpro进一步处理，如在“欧洲分子生物学开放软件包(The European Molecular Biology OpenSoftware Suite)”(EMBOSS)，版本6.3.1.2(Trends in Genetics,16(6)，276(2000))中那样执行，以得到如上文提供的基序1至6，更优选另外的共有基序1至3。

使用实施例3中所述的比对，鉴定到高度保守的共有基序1至3。

在一个实施方案中，CLP多肽包含与SEQ ID NO:2中所含的6个保守基序和/或三个共有基序中任意基序具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的基序，所述基序如图1A和B中通过其起始位置和结束位置所显示。

实施例5：CLP多肽序列的拓扑结构预测

TargetP 1.1预测真核蛋白的亚细胞定位。基于任意N端前序列：叶绿体转运肽(cTP)、线粒体靶向肽(mTP)或分泌途径信号肽(SP)的预测的存在进行定位指派。作为最终预测基础的评分并不真正是概率，并且它们不是必须相加在一起。然而，根据TargetP，具有最高评分的定位是最可能的，并且评分之间的关系(可靠性级别)可以指示该预测具有多大确定性。可靠性级别(RC)范围从1至5，其中1表示最可靠的预测。对于预测含有N端前序列的序列而言，也可以预测潜在的切割位点。在丹麦技术大学(Technical University of Denmark)的服务器上维护TargetP(见http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/和“Locating proteins in the cellusing TargetP,SignalP,and related tools(使用TargetP、SignalP和相关工具定位细胞中的蛋白质)”,Olof Emanuelsson,Brunak,Gunnar vonHeijne,Henrik Nielsen,Nature Protocols 2,953-971(2007))。

在分析序列前，必须选择许多参数，如生物组别(非植物或植物)、临界值集合(无、预定义的临界值集合或用户指定的临界值集合)和切割位点预测的计算(是或否)。TargetP设置是：“植物”；临界值cTP＝0；临界值mTP＝0；临界值SP＝0；其他临界值＝0。包括切割位点预测。

在表C中呈现如SEQ ID NO:2所代表的多肽序列的TargetP 1.1分析结果。已经选择“植物”生物组别，没有限定临界值，并且对预测的转运肽长度提出要求。如SEQ ID NO:2所代表的多肽序列的亚细胞定位最有可能在细胞质和/或细胞核中。

表C：如SEQ ID NO:2所代表的多肽序列的TargetP 1.1分析结果

长度(AA)	815
		叶绿体转运肽	0,24
线粒体转运肽	0,194
		分泌途径信号肽	0,006
其他亚细胞靶向	0,444
		预测的位置	-
可靠性级别	4
		预测的转运肽长度	0

许多的其他算法可以用来执行此类分析，它们包括：

·在丹麦技术大学服务器上维护的ChloroP1.1；

·在澳大利亚布里斯班昆士兰大学分子生物科学研究所的服务器上维护的Protein Prowler亚细胞定位预测者1.2版；

·在加拿大阿伯特省埃德蒙顿市阿尔伯塔大学的服务器上维护的PENCE蛋白组分析专家PA-GOSUB 2.5；

·在丹麦技术大学服务器上维护的TMHMM

·PSORT(URL:psort.org)

·PLOC(Park和Kanehisa,Bioinformatics,19,1656-1663,2003)。

实施例6：克隆编码CLP的核酸序列

使用定制的番茄cDNA文库作为模板，通过PCR扩增核酸序列。

使用定制的拟南芥幼苗cDNA文库作为模板，通过PCR扩增核酸序列。

用于克隆的cDNA文库从拟南芥Col-0幼苗的不同组织(例如叶、根)定制，所述番茄幼苗从比利时获得的种子中培育。

使用在50μl PCR混合物中的200ng模板，在标准条件下使用市售的具有校读功能的Taq DNA聚合酶进行PCR。所用的引物是prm17897(SEQ ID NO:73；有义，起始密码子为粗体字)：

5’ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatgagagctggaggctgc 3’

和prm17898(SEQ ID NO:74；反向、互补)：

5’ggggaccactttgtacaagaaagctgggtgcatacgtgcatgctgttagt 3’，

其中所述引物包括用于Gateway重组的AttB位点。还使用标准方法纯化扩增的PCR片段。随后进行Gateway方法的第一步骤，即BP反应，在此期间PCR片段与pDONR201质粒在体内重组以产生根据Gateway术语学的“进入克隆”，pPOI。作为技术的部分，质粒pDONR201从Invitrogen(Life Technologies GmbH,Frankfurter Straβe 129B,64293Darmstadt,德国)购买。

包含SEQ ID NO:1的进入克隆随后在LR反应中与用于稻转化的目的载体一起使用。这种载体在T-DNA边界内部含有以下作为功能性元件的：植物选择标记、筛选标记表达盒和意在与已经克隆于这个进入克隆中的目的核酸序列发生LR体内重组的Gateway盒。用于组成型表达的稻GOS2启动子(SEQ ID NO:82)位于这个Gateway盒上游。

在LR重组步骤后，将所得的表达载体pGOS2::POI(图5)根据本领域熟知的方法转化至农杆菌菌株LBA4044内。

实施例7：植物转化

稻转化

含有表达载体的农杆菌用来转化稻植物。将粳稻栽培品种Nipponbare的成熟干燥种子脱壳。通过在70％乙醇中孵育1分钟，随后在次氯酸钠溶液中孵育30分钟至60分钟，优选地30分钟(取决于污染等级)，随后用无菌蒸馏水洗涤3至6次，优选地4次。消毒的种子随后在含有2,4-D的培养基(愈伤组织诱导培养基)上萌发。在光照下孵育6日后，将盾片衍生的愈伤组织用如下文所述的农杆菌转化。

将含有所述表达载体的农杆菌菌株LBA4404用于共培育。将农杆菌接种在含有适宜抗生素的AB培养基上并在28℃培养3日。随后收集细菌并在液体共培育培养基中悬浮至密度(OD₆₀₀)约1。将愈伤组织浸入该悬液1至15分钟。将愈伤组织随后在滤纸上吸干并转移至固化的共培育培养基上并且在黑暗中于25℃孵育3日。在洗去农杆菌后，将愈伤组织在光照下在含有2,4-D的培养基上于28℃-32℃在选择剂存在下培育10至14日(indica的生长时间：3周)。在此时段期间，形成迅速生长的抗性愈伤组织。在转移这种材料至再生培养基后，胚发生潜能释放并且幼苗在随后的4至6周内发育。将苗从愈伤组织切下并且在含有植物生长素的培养基上孵育2至3周，其中将苗从所述培养基转移至土壤。硬化的苗在温室中在高湿度和短日照下培育。

稻栽培品种indica的转化也可以根据技术人员熟知的技术以上文给出的相似方式进行。

对于一个构建体，产生35至90个独立的T0稻转化体。将原代转化体从组织培养箱转移至温室。在定量PCR分析以验证T-DNA插入物的拷贝数后，仅保留对选择剂表现耐受性的单拷贝转基因植物用于收获T1种子。种子随后在移植后3至5个月收获。该方法以超过50％的比例产生单基因座转化体(Aldemita和Hodges 1996,Chan等人,1993,Hiei等人,1994)。

作为替代，可以根据以下方法产生稻植物：

将含有表达载体的农杆菌用来转化稻植物。将粳稻栽培品种Nipponbare的成熟干燥种子脱壳。通过在70％乙醇中孵育1分钟，随后在0.2％HgCl₂中孵育30分钟，随后用无菌蒸馏水洗涤6次15分钟而实施消毒。消毒的种子随后在含有2,4-D的培养基(愈伤组织诱导培养基)上萌发。在黑暗中孵育4周后，将盾片衍生的胚发生性愈伤组织切下并在同一种培养基上增殖。2周后，将愈伤组织通过在同一种培养基上传代培养另外2周进行繁殖或增殖。胚发生性愈伤组织片在新鲜培养基上传代培养3日，之后共培育(以增强细胞分裂活性)。

将含有所述表达载体的农杆菌菌株LBA4404用于共培育。将农杆菌接种在含有适宜抗生素的AB培养基上并在28℃培养3日。随后收集细菌并在液体共培育培养基中悬浮至密度(OD₆₀₀)约1。随后将混悬液转移至培养皿内，并且将愈伤组织浸入悬液中15分钟。将愈伤组织随后在滤纸上吸干并转移至固化的共培育培养基上并且在黑暗中于25℃孵育3日。共培育的愈伤组织在黑暗于28℃下在选择剂存在下于含2,4-D的培养基上培育4周。在此时段期间，形成迅速生长的抗性愈伤组织岛。在这种材料转移至再生培养基并在光照下孵育后，胚发生潜能释放并且幼苗在随后4至5周内发育。将苗从愈伤组织切下并且在含有植物生长素的培养基上孵育2至3周，其中将苗从所述培养基转移至土壤。硬化的苗在温室中在高湿度和短日照下培育。

对于一个构建体，产生大约35至90个独立的T0稻转化体。将原代转化体从组织培养箱转移至温室。在定量PCR分析以验证T-DNA插入物的拷贝数后，仅保留对选择剂表现耐受性的单拷贝转基因植物用于收获T1种子。种子随后在移植后3至5个月收获。该方法以超过50％的比例产生单基因座转化体(Aldemita和Hodges 1996,Chan等人,1993,Hiei等人,1994)。

实施例8：其他作物的转化

玉米转化

玉米的转化根据对Ishida等(1996.Nature Biotech 14(6)：745-50)描述方法的改良方法进行。在玉米中的转化是基因型依赖的并且仅特定的基因型可操作用于转化和再生。近交系A188(明尼苏达大学)或以A188作为亲本的杂种是用于转化的供体材料的良好来源，但是其它基因型也可以成功地使用。玉米穗从玉米植物中在授粉后大约11日(DAP)收获，此时不成熟胚的长度是大约1至1.2mm。不成熟胚与含有表达载体的根癌农杆菌共培育并且转基因植物通过器官发生而恢复。切下的胚在愈伤组织诱导培养基上、随后在玉米再生培养基上培育，其中所述的再生培养基含有选择剂(例如咪唑啉酮，但可以使用多种选择标记)。培养板在25℃于光照下培养2-3周，或直至苗发育。将绿色苗从每个胚转移至玉米生根培养基并在25℃培养2-3周，直至根发育。将生根的苗移植至温室的土壤中。从表现选择剂耐受的并含有单拷贝的T-DNA插入物的植物中产生T1种子。

小麦转化

小麦的转化用Ishida等Ishida等(1996)Nature Biotech 14(6):745-50描述的方法进行。通常在转化中使用(可从墨西哥CIMMYT获得的)栽培品种Bobwhite。不成熟胚与含有表达载体的根癌农杆菌共培育并且转基因植物通过器官发生而恢复。在与农杆菌温育后，胚在愈伤组织诱导培养基上、随后在再生培养基上体外培育，其中所述的再生培养基含有选择剂(例如咪唑啉酮，但可以使用多种选择标记)。培养平板在25℃于光照下培养2-3周，或直至苗发育。将绿色苗从每个胚转移至生根培养基并在25℃培养2-3周，直至根发育。将生根的苗移植至温室的土壤中。从表现选择剂耐受的并含有单拷贝的T-DNA插入物的植物中产生T1种子。

大豆转化

根据对Texas A&M美国专利5,164,310中所述方法的改良方法转化大豆。几个商业大豆品种对于通过这种方法的转化是可行的。栽培品种Jack(从Illinois种子基金会可获得)通常用于转化。对大豆种子消毒以便体外播种。从7日龄幼苗中切下下胚轴、胚根和一片子叶。进一步培育上胚轴和余下的子叶以发育腋生节。将这些腋生节切下并与含有表达载体的根癌农杆菌温育。在共培育处理之后，将外植体洗涤并转移至选择培养基。将再生的苗切下并置于苗伸长培养基上。将长度不超过1cm的苗置于生根培养基上直至根发育。将生根的苗移植至温室的土壤中。从表现选择剂耐受的并含有单拷贝T-DNA插入物的植物中产生T1种子。

油菜籽/卡诺拉油菜转化

使用5-6日龄幼苗的子叶柄和下胚轴作为用于组织培养的外植体并且根据Babic等(1998，Plant Cell Rep 17:183-188)转化。商业栽培品种Westar(Agriculture Canada)是用于转化的标准品种，但是也可以使用其它品种。对卡诺拉油菜种子作表面消毒以便体外播种。从体外幼苗中切下具有附着子叶的子叶柄外植体，并以(含有表达载体的)农杆菌通过叶柄外植体的切口端浸入细菌混悬液而接种。外植体随后在含有3mg/l BAP、3％蔗糖、0.7％植物琼脂(Phytagar)的MSBAP-3培养基上在23℃，16小时光照下培养2天。在与农杆菌共培育2日后，将叶柄外植体转移至含有的3mg/l BAP、头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀(300mg/l)的MSBAP-3培养基上持续7日，并且随后在含头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀和选择剂的MSBAP-3培养基上培养，直至苗再生。当苗具有5–10mm长度时，将苗切下并转移至苗伸长培养基(含0.5mg/l BAP的MSBAP-0.5)。将长度大约2cm的苗转移至用于根诱导的生根培养基(MS0)。将生根的苗移植至温室的土壤中。从表现选择剂耐受性并含有单拷贝T-DNA插入物的植物中产生T1种子。

苜蓿转化

苜蓿的再生性克隆使用(McKersie等，1999Plant Physiol 119:839–847)的方法加以转化。苜蓿的再生和转化是基因型依赖性的并且因而需要再生植物。已经描述了获得再生性植物的方法。例如，这些再生性植物可以选自栽培品种Rangelander(Agriculture Canada)或如Brown DCW与AAtanassov(1985.Plant Cell Tissue Culture 4:111-112)描述的任意其它商业苜蓿品种。备选地，RA3品种(威斯康星大学)已经被选择用于组织培养中(Walker等，1978Am J Bot 65:654-659)。将叶柄外植体与含有表达载体的根癌农杆菌C58C1pMP90(McKersie等，1999Plant Physiol 119:839–847)或LBA4404的过夜培养物共培育。外植体在黑暗中在含有288mg/L Pro、53mg/L硫代脯氨酸、4.35g/L K₂SO₄和100μm乙酰丁香酮的SH诱导培养基上共培育3天.外植体在半浓缩Murashige-Skoog培养基(Murashige和Skoog，1962)中洗涤并平板接种在不含乙酰丁香酮而含有合适选择剂和合适抗生素以抑止农杆菌生长的相同SH诱导培养基上。在数周后，将体细胞胚转移至不含生长调节剂、不含抗生素而含有50g/L蔗糖的BOi2Y发育培养基中。体细胞胚随后在半浓缩Murashige-Skoog培养基上萌发。将生根的幼苗移植至花钵内并且在温室中培育。从表现选择剂耐受性并含有单拷贝T-DNA插入物的植物中产生T1种子。

棉花转化

使用根癌农杆菌，根据US 5,159,135中所述的方法转化棉花。将棉花种子在3％次氯酸钠溶液中表面消毒20分钟并且在含500μg/ml头孢噻肟的蒸馏水中洗涤。将种子随后转移至含有50μg/ml苯菌灵的SH培养基用于萌发。将4至6日龄幼苗的下胚轴取下，切成0.5cm小片并且置于0.8％琼脂上。农杆菌悬液(每毫升大约10⁸个细胞，从含有用目的基因和合适选择标记转化的过夜培养物中稀释)用于接种下胚轴外植体。在室温和光照下3日后，将组织转移至固体培养基(1.6g/l脱乙酰吉兰糖胶)，所述固体培养基含有带维生素B5的Murashige和Skoog盐(Gamborg等人,Exp.Cell Res.50:151-158(1968))、0.1mg/l 2,4-D、0.1mg/l 6-呋喃甲基氨基嘌呤和750μg/ml MgCL₂以及杀死残余细菌的50至100μg/ml头孢噻肟和400-500μg/ml羧苄青霉素。各个细胞系在2至3个月(每隔4至6周继代培养)后分离并且在用于组织增殖的选择培养基上进一步培育(30℃，16小时光周期)。将转化的组织随后在非选择培养基上进一步培育持续2至3个月以产生体细胞胚。将至少4mm长度的外观健康胚转移至含有细蛭石中SH培养基的管内，所述SH培养基补充有0.1mg/l吲哚乙酸、6-糠基腺嘌呤和赤霉酸。在30℃以16小时光周期培育胚，并且将处于2至3叶期的小植物转移至具有蛭石和养分的盆钵。使植物硬化并随后移至温室以进一步培育。

糖料甜菜转化

将糖甜菜(甜菜(Beta vulgaris L.))的种子在70％乙醇中消毒1分钟，随后在20％次氯酸盐漂白粉(例如常规漂白粉(从Clorox,1221Broadway,Oakland,CA 94612,USA可商业获得))中摇动20分钟。将种子用无菌水冲洗并且晾干，随后铺种到萌发培养基(基于Murashige和Skoog(MS)的培养基(Murashige,T.和Skoog,1962.Physiol.Plant,第15卷,473-497)上，所述培养基包含B5维生素(Gamborg等人；Exp.Cell Res.,第50卷,151-8)，补充有10g/l蔗糖和0.8％琼脂)。根据Hussey和Hepher，将下胚轴组织基本上用于苗培养的启动(Hussey,G.和Hepher,A.,1978.Annals of Botany,42,477-9)并且在pH 5.8的基于MS的培养基上在23-25℃以16小时光周期维持，所述培养基补充有30g/l蔗糖外加0.25mg/L苄氨基嘌呤和0.75％琼脂。在转化实验中使用携带双元质粒的根癌农杆菌菌株，所述双元质粒载有选择标记基因，例如nptII。在转化之前1日，将包含抗生素的液体LB培养物在摇床上培育(28℃，150转/分钟)直至600nm处的光密度(O.D.)达到约1。将过夜培育的细菌培养物离心并且重悬于pH5.5的包含乙酰丁香酮的接种培养基(O.D.约1)中。将苗基组织切成小片(大约1.0cm x 1.0cm x 2.0mm)。将组织浸入细菌液体接种培养基中30秒。通过滤纸吸干除去多余的液体。在含有30g/l蔗糖的基于MS的培养基上的共培育进行24-72小时，随后是一个非选择时期，包括在含有30g/l蔗糖的基于MS的培养基上孵育，所述培养基含有诱导苗发育的1mg/L BAP和用于消除农杆菌的头孢噻肟。在3-10日后，将外植体转移至含有例如卡那霉素或G418(依赖基因型，50-100mg/L)的相似选择培养基。将组织每2-3周转移至新鲜培养基以维持选择压力。非常快的苗启动(在3-4日后)表示现存分生组织的再生，而非新发育的转基因分生组织的器官发生。在几轮传代培养后，将小苗转移至含有5mg/L NAA和卡那霉素或G418的根诱导培养基。采取额外的步骤以减少产生嵌合(部分转基因的)转化植物的可能性。来自再生苗的组织样品用于DNA分析。用于糖甜菜的其他转化方法是本领域已知的，例如Linsey和Gallois的那些方法(Linsey,K.和Gallois,P.,1990.Journal of Experimental Botany；第41卷,第226期；529-36)或在作为WO9623891A公开的国际申请中所公布的方法。

甘蔗转化

从田间培育的6月龄甘蔗植物分离纺锤体(Spindle)(见Arencibia等人,1998.Transgenic Research,第7卷,213-22；Enriquez-Obregon等人,1998.Planta,第206卷,20-27)。通过在20％次氯酸盐漂白粉(例如常规漂白粉(从Clorox,1221Broadway,Oakland,CA 94612,USA可商业获得))中浸泡，将材料消毒。将约0.5cm的横断切片以顶朝上的方向置于培养基上。将植物材料在基于MS(Murashige,T.和Skoog,1962.Physiol.Plant,第15卷,473-497)的培养基上在23℃于黑暗下培育4周，所述培养基包含B5维生素(Gamborg,O.等人,1968,Exp.Cell Res,第50卷,151-8)，补充有20g/l蔗糖、500mg/L酪蛋白水解物、0.8％琼脂和5mg/L2,4-D。在4周后，将培养物转移到相同的新鲜培养基上。在转化实验中使用携带双元质粒的根癌农杆菌菌株，所述双元质粒载有选择标记基因，例如hpt。在转化之前1日，将包含抗生素的液体LB培养物在摇床上培育(28℃，150转/分钟)直至600nm处的光密度(O.D.)达到约0.6。将过夜培育的细菌培养物离心并且重悬于pH 5.5的包含乙酰丁香酮的基于MS的接种培养基(O.D.约0.4)中。基于形态学特征如致密结构和黄颜色，将甘蔗胚发生性愈伤组织片(2-4mm)分离并且在层流罩(flow hood)干燥20分钟，随后浸入细菌接种液体培养基中10-20分钟。通过滤纸吸干除去多余的液体。在黑暗下于滤纸上共培育3-5日，其中所述滤纸置于包含B5维生素的含有1mg/L 2,4-D的基于MS的培养基顶部。在共培育后，愈伤组织用无菌水洗涤，接着是在相似培养基上的一个非选择培养时期，所述相似培养基含有500mg/l头孢噻肟以消灭剩余的农杆菌细胞。在3-10日后，将外植体转移至包含B5维生素的基于MS的选择培养基持续另外3周，所述选择培养基含有1mg/L 2,4-D，载有25mg/L潮霉素(依赖于基因型)。全部处理在23℃在黑暗条件下进行。抗性愈伤组织进一步在缺少2,4-D的包含1mg/LBA和25mg/L潮霉素的培养基上以16小时光周期培育，导致苗结构的发育。将苗分离并且在选择性生根培养基(基于MS，包含20g/l蔗糖、20mg/L潮霉素和500mg/L头孢噻肟)上培育。来自再生苗的组织样品用于DNA分析。用于甘蔗的其他转化方法是本领域已知的，例如来自作为WO2010/151634A公布的国际申请和授权的欧洲专利EP1831378。

对于通过粒子轰击法转化，可以通过Snyman等人的方法实施愈伤组织的诱导和甘蔗转化(Snyman等人,1996,S.Afr.J.Bot 62,151-154)。构建体可以随在pEmu启动子(Last等人,Theor.Appl.Genet.81,581-588)控制下表达npt[pi]基因的载体pEmuKN一起共转化(Beck等人,Gene 19,1982,327-336；GenBank登录号V00618)。通过Snyman等人2001年的方法(Acta Horticulturae 560,(2001),105-108))，105-108)再生植物。

实施例9：表型评价程序

9.1评价建立

产生35至90个独立的T0稻转化体。将原代转化体从组织培养室转移至温室以培育并且收获T1种子。留下6个事件，其中所述事件的T1子代以3:1比例对所述转基因的存在/不存在分离。对于这些事件中的每一个，通过监测目视标记表达选出大约10株含有该转基因的T1幼苗(杂合子和纯合子)和大约10株缺少该转基因的T1幼苗(失效合子)。以随机位置并排培育转基因植物和相应的失效合子。温室条件是短日照(12小时光照)，光照下28℃和黑暗下22℃，和70％相对湿度。在非胁迫条件下所培育的植物以规律的间隔期浇水，以确保水和养分不是限制性的并确保满足植物完整生长和发育的需要，除非这些植物用于胁迫筛选中。

使植物从播种期至成熟期数次通过数字成像室。在每个时间点上，从至少6个不同角度拍摄每株植物的数字图像(2048x 1536像素，1600万颜色)。

按照如对T1世代相同的评价方法，可以在T2世代中进一步评价T1事件，例如采用更少的事件和/或每个事件采用更多个体。

干旱筛选

将T1或T2植物在盆栽土壤中在正常条件下培育直至它们达到抽穗期。随后将它们转移至不予灌溉的“干燥”地段。将土壤湿度探针插入随机选择的盆钵内，以监测土壤含水量(SWC)。当SWC下降低于某个阈值时，自动对所述植物连续再浇水直至再次达到正常水平。随后将植物再转移至正常条件。栽培过程的剩余部分(植物成熟、种子收获)与不在非生物胁迫条件下所培育的植物相同。如正常条件下所详述那样记录生长和产量参数。

氮使用效率筛选

将T1或T2植物在盆栽土壤中在除营养液之外的正常条件下培育。从移植至成熟期间用含有降低的、通常少7至8倍之间的氮(N)含量的特定营养液浇灌盆钵。栽培过程的剩余部分(植物成熟、种子收获)与不在非生物胁迫下培育的植物相同。如正常条件下所详述那样记录生长和产量参数。

盐胁迫筛选

将T1或T2植物在由椰子纤维和焙烤粘土颗粒(Argex)(3:1比率)构成的基质上培育。在温室中移植小植物后，在头两周期间使用正常营养液。在头两周后，添加25mM盐(NaCl)至所述营养液，直至收获植物。如正常条件下生长所详述那样，记录生长和产量参数。

9.2统计分析：F-检验

使用两因素ANOVA(方差分析)作为总体评价植物表型特征的统计模型。对用本发明基因转化的全部事件的全部植物的全部所测量参数实施F检验。实施F检验以检查该基因对全部转化事件的影响并验证该基因的整体作用(又称作总体基因作用)。对于F检验而言，真实总体基因作用的显著性的阈值设在5％概率水平上。显著性F检验值指出基因作用，这意味不仅是仅基因的存在或位置才造成表型上的差异。

9.3测量的参数

使植物从播种期至成熟期数次通过数字成像室。在每个时间点上，从至少6个不同角度拍摄每株植物的数字图像(2048x1536像素，1600万颜色)，如WO2010/031780中所述。将这些量值用来测定不同的参数。

生物量相关的参数测量

通过测量植物地上面积(或叶生物质绿色生物量)确定植物地上部分的生物量，其中通过计数来自植物地上部分的数字图像上与背景区别的像素总数(AreaMax)确定所述植物地上面积。这个值对相同时间点上从不同角度拍摄的画面进行平均化并且通过校正过程换算成以平方mm表述的物理表面值(physical surface value)。实验显示以这种方式测量的地上部分植物面积与地上植物部分的生物量相关。地上部分面积是在植物已经实现其最大叶绿色生物量的时间点上所测量的面积。

根生物量的增加表述为根总生物量增加(度量为在植物生命期间观察到的最大根生物量，“RootMax”)；或表述为根/苗指数增加(“RootShInd”)，度量为在根和苗的活跃生长时期中根质量与苗质量之间的比例。换句话说，将根/苗指数定义为在根和苗活跃生长时期中根生长速度对苗生长速度的比率。这个参数是根生物量和发育的指标。

同时，可以测定根的直径、一定厚度水平以上的根的数量和一定薄度水平以下的根的数量。可以使用如WO 2006/029987中所述的方法确定根生物量。

可以测量植物的绝对高度(“HeightMax”)。植物高度的替代性稳健指标是测量重力中心的位置，即确定叶地上部分绿色生物量的重心的高度(以mm计)。基于曲线拟合的渐近线或如果该拟合不令人满意，则基于最大绝对值(“GravityYMax”)，这避免受单片直立叶影响。

也可以从数字图像测量开花前绿度(GNbfFlow)。它是植物在开花之前绿度的指标。在开花之前中最后成像时绿色像素和深绿色像素的比例(表述为％)。它是发育时间相关的参数和生物量相关的参数。

与发育时间相关的参数

早期生长势是萌发后3周的植物地上面积。通过计数来自植物地上部分中与背景区别的像素总数确定早期生长势。这个值对相同时间点上从不同角度拍摄的画面进行平均化并且通过校正过程换算成以平方mm表述的物理表面值(physical surface value)。

根生物量的增加表述为根总生物量增加(度量为在植物生命期间观察到的最大根生物量)。还可以测量根直径，高于某个厚度水平和低于某个薄度水平的根的量。可以使用如WO 2006/029987中所述的方法确定根生物量。也可以计量高于或低于阈值的粗根和/或细根的量。

AreaEmer是快速早期发育的指标，当与对照植物相比时这个值下降。它是植物需要产生30％最终生物量的时间和需要产生90％其最终生物量的时间之间的比率(以％表述)。

可以使用如WO 2007/093444中所述的方法确定植物的“至开花时间”或“开花时间”。

早期幼苗活力是萌发后…周(约4cm高的小植株)的幼苗地上面积。

“突出活力”是早期植物生长的指示。它是将已建立的幼苗从其萌发盘重新上盆入其最后的花盆一周后的植物地上生物量。它是成像中的叶生物量所覆盖的面积(mm²)。它通过计数来自区别于背景的地上植物部分的像素总数来测定。针对在同一时间点从不同角度拍摄的照片对此值进行平均，并通过计算转化为以平方毫米表示的物理表面值。

相对生长速率(RGR)是第二时间点测量的地上生物量(称为“总面积”)的自然对数减去第一时间点的地上生物量的自然对数除以这两个时间点之间的天数([log(总面积2)-log(总面积1)]/天数)。时间点对同一实验中的所有植物而言是相同的。选择第一时间点作为在栽植后25和41天之间进行的最早测量。如果该实验中该时间点的测量(植物)的数目小于该实验每个时间点进行的测量的最大数目的三分之一，则采用下一个时间点(同样对测量的数目具有相同的限制)。第二时间点简单地是下一时间点(同样对测量的数目具有相同的限制)。

测量植物的绿度

绿度指数计算为1减去浅绿色(光谱中的频点(bin)2-21)像素数除以像素总数乘以100(100*[1-(浅绿色像素数/总像素数)])。

早期绿度：

开花时间点之前的时间点的绿度指数，在该实验达到无效植物的最大平均绿度时。开花时间点定义为检测到超过3株具有圆锥花序的植物的时间点。

时间点对实验中的所有植物而言是相同的。如果该时间点的有效观察的数目为30或更少，则选择开花前无效植物具有第二高的平均绿度的时间点。从不选择第一时间点作为开花时间点。

晚期绿度：

开花时间点之后或开花时间点时的时间点的绿度指数，在该实验达到无效植物的最大平均绿度时。开花时间点定义为检测到超过3株具有圆锥花序的植物的时间点。

时间点对实验中的所有植物而言是相同的。如果该时间点的有效观察的数目为30或更少，则选择开花后或开花时无效植物具有第二低的平均绿度的时间点。

干旱后的绿度

干旱胁迫后的植物绿度可以测量为干旱处理后的第一次成像中绿色像素和深绿色像素的比例(表示为％)。

此外，可以测量植物在干旱条件下的生长。

种子相关的参数测量值

将成熟的原发圆锥花序收获、计数、装袋、加条形码标记并且随后在干燥箱内于37℃干燥3日。随后将圆锥花序脱粒，并且收集和计数全部种子。种子通常由干燥外部覆盖物-谷壳覆盖。使用鼓风装置，将充实粒(本文也称为充实小花)与空粒分开。弃去空粒并且再次计数剩余部分。在分析天平上将充实粒称重。通过计数分离步骤后仍留下的充实粒数目确定种子总数。通过称量从一株植物收获的全部充实粒测量种子总重量(“种子总产量”，“TWS”)。

通过计数从一株植物收获的籽粒(无论是否充实)数确定每株植物的种子(或小花；“nrtotalseed”)总数。

从计数的种子数及它们的总重量外推出千粒重(“TWS”)。

本发明中的收获指数(“harvestindex”,“HI”)定义为种子总重量与地上部分面积(mm²)之间的比率，乘以系数10⁶。

如本发明中定义的每圆锥花序花数(“每个圆锥花序花数(flowersperpanicle)”；“fpp”)是种子总数与成熟主穗数目之间的比率。

如本发明中定义的“种子填充率”或“种子充实率”(“nrfilledseed”)是充实种子(即含有种子的小花)对种子总数(即小花总数)的比例(表述为％)。换句话讲，种子充实率是填充有种子的小花的百分比。

同时，测量第一萌蘖枝(first flush,“firstpan”)中圆锥花序的数目。

实施例10：转基因植物的表型评价结果

下文在表D1中呈现非胁迫条件下转基因稻植物的评价结果，所述转基因稻植物处于T1世代并且表达了编码SEQ ID NO:2的CLP多肽的核酸。在非胁迫条件下培育时，观察到重心的高度(GravityYMax)在6个事件的3个事件中增加至少5％，且观察到种子产量参数，种子总数(nrtotalseed)、充实种子数(nrfilledseed)、充实率、种子总重(totalwgseeds)和收获指数(harvestindex)增加至少5％。而且，首次开花时的圆锥花序数目和每圆锥花序的花数目(估计植物上每个圆锥花序的平均小花数的计算参数(首次开花时的植物小花数/圆锥花序数))在至少一个事件中高于对照植物。另外，正如充实率和充实种子数，千粒重在至少两个事件中增加。有趣地，种子产率参数TKW和充实率或充实种子数有时显示在不同事件中增加，表明种子产率的增加是共同的，但事件可以在单个参数上不同。事件可以显示增加的TKW，但不显示最高充实率，而具有最高充实率的事件可以不显示TKW的增加。但第三事件可以显示增加的TKW和增加的充实率二者。

地上生物量(最大面积)和最大植物高度也在至少一个事件中增加。地上生物量在6个事件的至少2个中显著增加，且在两个事件中增加至多9％。

一个事件显示普遍减少的根生长，且具有减少的根生物量、较少的粗根和较少的细根。其他事件为中性或在2个事件中具有甚至增加的粗根。具有减少的根生长的事件还在早期阶段具有较低的绿度，这为另外两个事件所共有。绿度在后两个事件和第三事件的晚期阶段也降低。其他事件显示正常的绿度。

表D1：正常生长条件下转基因稻植物的数据总结；对于每个参数，显示T1世代植株的总体增加百分比，对于每个参数，p-值<0.05。

参数	总体
		totalwgseeds	16.0
nrtotalseed	6.7
		充实率	8.9
收获指数	11.7
		nrfilledseed	14.5
GravityYMax	5.2

以下表D2中显示在T1代评价转基因稻植物和在干旱条件下表达编码SEQ ID NO:2的CLP的核酸的结果。

在干旱条件下培养时，将所有事件的所有转基因植物放在一起，观察到种子产率参数，充实种子数(nrfilledseed)、充实率、种子总重(totalwgseeds)和收获指数(harvestindex)增加至少5％。所有这些总体提高超过20％。其他种子产率参数(如总种子数、TKW和第一萌蘖枝中的圆锥花序数)增加，但一个事件显示第一萌蘖枝中的圆锥花序数减少，2个事件显示增加或增加的趋势。一个事件显示总种子数减少，但其他种子参数增加。不同事件显示增加的种子数。

植物在干旱条件下的生长也总体增加。地上生物量在两个事件中增加，在另一事件的植物中减少至较低的程度。突出活力(EmerVigor)在一个事件中增加，另一事件显示较少的增减，另一事件显示延迟。绿度在已在早期阶段显示绿度降低的一个事件的植物中增加。在其他事件中，一个事件还显示早期绿度降低，另一个事件显示早期绿度提高。这两种事件的晚期绿度都正常，但具有降低的早期绿度的事件导致相对生长速率(RGR)增加。另一具有降低的早期绿度但强烈提高的晚期绿度的事件显示降低的总体相对生长速率和降低的早期高度。另一事件显示改善的早期高度、正常的早期和晚期绿度、减少的细根和根/冠指数(其他事件的这两个参数平淡无奇)、按数目计更多的种子和增加的地上生物量的趋势及对在干旱下萎蔫的强抗性(测量为在干旱胁迫前的图像和干旱胁迫后及恢复前的图像之间地上生物量所覆盖的面积(mm²)的减少)。

地上生物量在6个事件中的一个中显著增加，如上文所提到，另一事件具有增加地上生物量的趋势。另外至少两个事件显示根生物量(RootMax)的增加。有趣地，在非胁迫条件下通常具有减少的根生长的一个事件的植物在干旱下恢复，它们的根生物量、粗根和细根正常。

另外，突出活力在至少一个事件中增加，干旱后的绿度也如此。至少一个事件的重心与根厚(RootThickMax)的增加同时增加。

Claims (37)

1.一种用于相对于对照植物增强植物中一个或多个产量相关性状的方法，其包括增加植物中编码CLP多肽的核酸的表达和培养植物，其中所述CLP多肽包含Interpro基序IPR004176(Clp,N-端)和/或IPR023150(双Clp-N基序)，优选包含此基序两者，且其中所述CLP多肽选自：

(i)表A中列出的任意SEQ ID NO的氨基酸序列，优选SEQ ID NO:2、87、89、91、93、95、97、99、101、103或105的氨基酸序列，更优选SEQ ID NO:2的氨基酸序列；和

(ii)氨基酸序列，其以增加的优选顺序与表A中列出的任意SEQ ID NO的氨基酸序列，优选SEQ ID NO:2、87、89、91、93、95、97、99、101、103或105的氨基酸序列，更优选SEQ ID NO:2的氨基酸序列在与表A中列出的所述SEQ ID NO的氨基酸序列，优选SEQ ID NO:2、87、89、91、93、95、97、99、101、103或105的氨基酸序列，更优选SEQ ID NO:2的氨基酸序列的整个长度范围内具有至少35％、40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，并且还优选地相对于对照植物赋予一个或多个增强的产量相关性状。

2.根据权利要求1的方法，其中所述CLP多肽包含PFAM结构域作为断裂结构域，其中PFAM结构域PF02861的N-端在CLP多肽的N-端处或其附近发现匹配，且PFAM结构域PF02861的C-端在此CLP多肽的C-端发现匹配，其中匹配的氨基酸序列均定位在CLP多肽的N-端的一半处，优选定位在CLP多肽的N-端四分之一处。

3.根据权利要求1或2的方法，其中所述核酸选自：

(i)由SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69或71代表的核酸，优选由SEQ ID NO:1代表的核酸；

(ii)由SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69或71代表的核酸，优选由SEQ ID NO:1代表的核酸的互补核酸；

(iii)编码POI多肽的核酸，所述POI多肽以增加的优选顺序与表A列出的任意SEQ ID NO的完整氨基酸序列，优选由SEQ ID NO:2、87、89、91、93、95、97、99、101、103或105所代表的完整氨基酸序列，更优选由SEQ ID NO:2所代表的完整氨基酸序列具有至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，并且还优选地相对于对照植物赋予一个或多个增强的产量相关性状；和

(iv)与(i)至(iii)的核酸分子在高严格杂交条件下杂交并且优选地相对于对照植物赋予一个或多个增强的产量相关性状的核酸分子。

4.根据权利要求1、2或3的方法，其中通过一个或多个重组方法增加编码多肽的核酸的表达。

5.根据权利要求1、2、3或4的方法，其中所述增加的表达通过在植物中引入并且表达编码所述CLP多肽的所述核酸实现。

6.根据权利要求1至5中任一项权利要求的方法，其中所述CLP多肽包含：

i)以下全部基序：

基序1(SEQ ID NO:76)：

A-[AGLV]-K-x(0,2)-I-x(1,3)-Q-L-[IMV]-[IV]-S-I-L-[DH]-D-P-S-V-S-R-V-M-R-[DE]-A-[DG]-F-[NS]-S-[PST]-x-[LV]-[KR]-[ANST]-x-[IV]-E-x-[AE]；

基序2(SEQ ID NO:77)：

F-x-E-x-[NST]-[ADEST]-E-N-L-x(2)-L-[CS]-x-A-L-x(2)-[EKR]-x-[PST]

基序3(SEQ ID NO:78)：

T-W-[FLM]-[FL]-F-x-G-x-[DGN]-x(2)-[ADG]-[KR]-x(2)-[IMV]-[ACS]-x-E-L-A-x-[LV]-V-F-G-S-x(3)-[FV]-x-[ACST]-x(3)-[ADGS]-[ADEGNST]；

基序4(SEQ ID NO:79)：

G-x(1,2)-V-x(0,1)-L-x-[LV]-[EG]-D-L-x-[WY]-x(2)-[DE]-x(2)-[AST]；

基序5(SEQ ID NO:80)：

E-x(0,4)-L-x-[PT]-[FILV]-[ATV]-[IV]-P-[ADV]-[GST],和

基序6(SEQ ID NO:81)：

L-x-D-[AST]-I-[IV]-[IV]-x-[CGNS]-x-[AEQ]；

或

ii)根据i)的基序和另外如SEQ ID NO:75下所列序列所代表的共有序列；或

iii)根据上面i)或ii)的基序，且另外包含所有下面的共有基序

共有基序1(SEQ ID NO:83):HPLQC[KR]ALELCF[NS]VA

共有基序2(SEQ ID NO:84):NAL[GV]AA[LF]KRAQAHQR，和

共有基序3(SEQ ID NO:85)：LDDPSVSRVMREA[GS]F；

或

iv)在i)中所列出的任意5个基序和iii)中所列出的所有3个共有基序；或

v)在i)中所列出的任意4个基序和iii)中所列出的所有3个共有基序；或

vi)在i)中所列出的任意4个基序和iii)中所列出的任一个共有基序；或

vii)在i)中所列出的任意3个基序；或

viii)如本文以上所述的基序之一；

其中–x代表在任意基序位置存在经常如–x之后括号内最低整数数字或最高整数数字或者最低数字和最高数字之间任意整数数字指示的任意类型的氨基酸残基，其中最低整数数字和最高整数数字可能是相同的并且因此仅一个整数数字存在于–x之后的括号内部，并且其中–x(1)缩写为–x，并且在-x位置插入的任意氨基酸残基不需要与前一个氨基酸残基或另一个插入的氨基酸残基是相同类型。

7.根据权利要求1至6中任一项权利要求的方法，其中所述一个或多个增强的产量相关性状包含相对于对照植物增加的产量，并且优选地包括相对于对照植物增加的生物量和/或增加的种子产量，并且优选地包括相对于对照植物增加的地上部分生物量，增加的地下部分生物量、增加的种子产量和/或增加的糖产量。

8.根据权利要求1至7中任一项权利要求的方法，其中所述一个或多个增强的产量相关性状在非胁迫条件下获得。

9.根据权利要求1至7中任一项权利要求的方法，其中所述一个或多个增强的产量相关性状在环境胁迫条件下获得，优选在温度胁迫、盐胁迫、氮缺乏和/或干旱条件下获得。

10.根据权利要求1至9中任一项权利要求的方法，其中编码CLP多肽的所述核酸是植物来源的，优选来自双子叶植物，进一步优选来自十字花科，最优选来自鼠耳芥属。

11.根据权利要求1至10中任一项权利要求的方法，其中所述编码多肽的核酸编码在表A中所列的任一种多肽，或是这种核酸的一部分，或是能够与这种核酸的互补序列杂交的核酸。

12.根据权利要求1至11中任一项权利要求的方法，其中所述核酸序列编码在表A中给出的任意多肽的直向同源物或旁系同源物。

13.根据权利要求1至12中任一项权利要求的方法，其中所述核酸与植物来源的组成型启动子有效连接，优选与植物来源的中等强度组成型启动子有效连接、更优选与GOS2启动子有效连接、最优选与来自稻的GOS2启动子有效连接。

14.前述权利要求中任一项的方法，其中所述多肽具有从PFAM结构域PF02861向后且包含C端的多肽链，所述多肽链选自：

a.等电点值(pI)低于7.0的酸性氨基酸链；

b.按数目计丝氨酸和/或苏氨酸的含量等于或大于10％的多肽链；

c.按数目计至少30％的氨基酸具有脂肪族侧链或脂肪族羟基侧链的多肽链；和

d.上述a至c的任意组合。

15.前述权利要求中任一项的方法，其中优选在用InterProScan软件(InterProScan v4.8&the InterPro database版本41.0,2013年2月13日)分析时，CLP多肽不包含PFAM结构域PF00004(缩写为AAA)和/或不包含PFAM结构域PF07724(缩写为AAA_2)。

16.前述权利要求中任一项的方法，其中在植物宿主细胞中表达时，CLP多肽适于形成EC 3.4.21.92的蛋白酶活性与内源多肽的蛋白质复合物。

17.分离的核酸，其选自：

(a)SEQ ID NO:、86、88、90、92、94、96、98、100、102或104中公开的序列的核酸；或

(b)SEQ ID NO:87、89、91、93、95、97、99、101、103或105中公开的序列的多肽的编码核酸。

18.分离的多肽，其多肽序列如SEQ ID NO:87、89、91、93、95、97、99、101、103或105中所公开。

19.适合在植物细胞中表达的过量表达构建体，其包含：

(i)编码如权利要求1、2、3、6、10至12、14至16，和17中任一项权利要求中所限定的CLP多肽的核酸；

(ii)能够驱动(i)的核酸序列表达的一个或多个控制序列；和任选地

(iii)转录终止序列。

20.根据权利要求19的过量表达构建体，其中所述控制序列之一是组成型启动子，优选是中等强度组成型启动子，优选是植物启动子，更优选是GOS2启动子，最优选是来自稻的GOS2启动子。

21.用根据权利要求19或20的构建体转化的植物、植物部分或植物细胞。

22.宿主细胞，优选细菌宿主细胞、更优选农杆菌物种宿主细胞，其包含根据权利要求19或20的构建体或如权利要求17中所限定的核酸。

23.根据权利要求19或20的构建体在用于制备植物的方法中的用途，所述植物相对于对照植物具有一个或多个增强的产量相关性状，优选相对于对照植物具有增加的产量，并且更优选相对于对照植物具有增加的种子产量和/或增加的生物量。

24.用于产生转基因植物的方法，所述转基因植物相对于对照植物具有一个或多个增强的产量相关性状，优选相对于对照植物具有增加的产量，并且更优选相对于对照植物具有增加的种子产量和/或增加的生物量，所述方法包括：

(i)在植物细胞或植物中引入并且表达编码如权利要求1、2、3、6、10至12、14至16，和17中任一项权利要求中所限定的CLP多肽的核酸；并且

(ii)在促进植物生长和发育的条件下培育所述植物细胞或植物。

25.植物，或其部分，或植物细胞，其通过权利要求1至16中任一项的方法获得，其中所述植物，或其部分，或植物细胞包含编码如权利要求1、2、3、6、10至12、14至16，和17中任一项权利要求中所限定的CLP多肽的重组核酸。

26.转基因植物或源自所述转基因植物的转基因植物细胞，所述转基因植物相对于对照植物具有一个或多个增强的产量相关性状，优选相对于对照植物具有增加的产量，并且更优选具有增加的种子产量和/或增加的生物量，原因在于编码如权利要求1、2、3、6、10至12、14至16，和17中任一项权利要求中所限定的CLP多肽的核酸表达增加。

27.根据权利要求25或26的转基因植物或源自其的转基因植物细胞，其中所述植物是作物植物，如甜菜、糖料甜菜或苜蓿，或单子叶植物如甘蔗；或谷类，如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱、二粒小麦、斯佩耳特小麦、单粒小麦、画眉草、蜀黍或燕麦。

28.根据权利要求25、26或27的植物的可收获部分，其中所述可收获部分包含权利要求19或20的构建体，和/或权利要求17的核酸，和/或权利要求18的多肽。

29.根据权利要求28的可收获部分，其中所述可收获部分是：

a.苗生物量，和/或

b.根生物量，优选直根生物量和块茎生物量，和/或

c.种子。

30.产物，其衍生自根据权利要求25、26或27的植物和/或从根据权利要求28的植物的可收获部分，包含权利要求19或20的构建体，和/或权利要求17的核酸，和/或权利要求18的多肽。

31.编码如权利要求18中的多肽或权利要求1、2、3、6、10至12、14至16，和17中任一项权利要求中所限定的多肽的核酸，或权利要求19或20的构建体，或权利要求18中的多肽或权利要求1、2、3、6、10至12、14至16，和17中任一项权利要求中所限定的多肽的用途，用于相对于对照植物，在环境胁迫条件下和/或非胁迫条件下，增强植物中的一个或多个产量相关性状，优选用于增加产量，并且更优选用于相对于对照植物，增加植物中的种子产量和/或增加生物量。

32.一种用于制造产品的方法，其包括培育根据权利要求25、26或27的植物，和从或借助下述产生所述产品的步骤：

a.所述植物；或

b.所述植物包括种子在内的部分。

33.重组染色体DNA，其包含根据权利要求19或20的构建体。

34.根据权利要求19或20的过量表达构建体或根据权利要求33的重组染色体DNA，其包含于植物细胞中。

35.组合物，其包含根据权利要求33的重组染色体DNA和/或根据权利要求19或20的构建体，和宿主细胞，优选植物细胞，其中重组染色体DNA和/或构建体包含于宿主细胞内。

36.转基因花粉粒，其包含根据权利要求19或20的构建体。

37.前述权利要求中的任一项，其中CLP多肽不是2009年4月16日作为US2009/100536公开的第一发明人Thomas Adams的专利申请US11/879,787中公开的如SEQ ID NO:425、426或427任意多肽序列。