BRPI1015564B1

BRPI1015564B1 - método de produção de tecido da cana-de-açúcar transformado ou célula derivada do mesmo

Info

Publication number: BRPI1015564B1
Application number: BRPI1015564-3A
Authority: BR
Inventors: Paulo Cezar De Lucca; Shujie Dong; Robert Jason Christopher Geijskes; Erik Martin Dunder; Manuel Benito Sainz
Original assignee: Syngenta Participations Ag; Queensland University Of Technology
Priority date: 2009-06-25
Filing date: 2010-06-24
Publication date: 2021-02-09
Also published as: BRPI1015564A2; CA2766075A1; US20120156673A1; WO2010151634A1; CN102639703A; EP2446040A1; AU2010264445A1; MX2011013951A; US8952219B2; EP2446040A4

Abstract

MÉTODO PARA TRANSFORMAÇÃO DA CANA-DE-AÇÚCAR MEDIADA POR AGROBACTERIUM. A presente invenção refere-se aos métodos de produção de um tecido da cana-de-açúcar transformada ou da célula derivada do mesmo, sendo que o referido método compreende: a) a inoculação de um tecido da cana-de-açúcar ou da célula derivada do mesmo, através da suspensão da inoculação de Agrobacterium, sendo que a referida Agrobacterium-compreende um ácido nucleico de interesse, a fim de obter um tecido da cana-de-açúcar inoculado por Agrobacteriumou a célula derivada do memso; b) o respectivo cocultivo do tecido da cana-de-açúcar inoculado por Agrobacterium ou da célula derivada do mesmo, em uma superfície, na ausência de meios de cocultura por um período de tempo suficiente para reduzir o peso original do referido tecido da cana-de-açúcar inoculado por Agrobacterium ou da célula derivada do mesmo; e c) a seleção de um tecido da cana-de-açúcar transformado ou da célula derivada do mesmo que compreende o respectivo ácido nucleico de interesse. Os métodos de transformação da invenção ajudam a aumentar a frequência da transformação e a recuperação de plantas transgênicas da cana- de-açúcar.

Description

Declaração de Prioridade

[001] Este pedido reivindica o benefício, sob a lei 35 U.S.C. § 119 (e), do Pedido Provisório N° 61/220.405; protocolado em 25 de junho de 2009 e do Pedido Provisório N° 61/290.803; protocolado em 29 de dezembro de 2009, de todo o conteúdo incorporado por referência neste documento.

Campo da Invenção

[002] A invenção refere-se geralmente à biologia molecular de plantas, principalmente aos métodos para transformação da cana-de- açúcar mediada por Agrobacterium.

Antecedentes

[003] A cana-de-açúcar (Saccharum spp.) é uma importante fonte de matéria prima para a indústria de açúcar e indústrias envolvidas na produção de produtos como o álcool, ácido acético, butanol, papel, madeira compensada, enzimas industriais e ração para animais. Estas indústrias buscam aprimorar a cana-de-açúcar com a introdução de polinucleótidos heterólogos que conferem características ou traços desejáveis.

[004] Agrobacterium tumefaciens é um patógeno existente no solo, amplamente utilizado para a introdução de heterólogos polinucleótidos nas células vegetais, incluindo células vegetais da cana-de-açúcar. A. tumefaciens transfere um segmento polinucleotídico específico de um plasmídeo indutor de tumor (Ti) ao núcleo das células do hospedeiro infectado, que se integra posteriormente de maneira estável ao genoma do hospedeiro. Os polinucleótidos heterólogos podem ser colocados de maneira benéfica entre as bordas do plasmídeo Ti e transferidos às células vegetais.

[005] Embora a transformação mediada por Agrobacterium seja usada para a manipulação genética da cana-de-açúcar, a eficácia e a reprodutibilidade das metodologias disponíveis ainda são um desafio. De maneira efetiva, A. tumefaciens induz a necrose no tecido da cana- de-açúcar cultivado transformado, com uma baixa frequência de transformação resultante (Arencibia et al. (1998) Transgenic Res. 7:123222; Enriquez-Obregón et al. (1997) Biotecnología Aplicada 14:169-174; e de la Riva et al. (1998) Electron. J. Biotechno. 1:118-133).

[006] Devido à importância da manipulação da cana-de-açúcar para melhoria das características (por exemplo: maior resistência a pressões bióticas ou abióticas ou aumento da produção), há a necessidade de métodos adicionais que aumentem vantajosamente a eficácia da transformação mediada por Agrobacterium desta importante cultura agrícola.

[007] Portanto, a presente invenção supera as deficiências da técnica ao fornecer métodos de transformação da cana-de-açúcar e de outras plantas importantes mediada por Agrobacterium, que resultam em uma maior eficácia de transformação.

Sumário da Invenção

[008] São apresentados métodos de transformação da cana-de- açúcar (Saccharum spp.) mediada por Agrobacterium. Os métodos compreendem um protocolo, em que tecidos da cana-de-açúcar inoculados com Agrobacterium são cocultivados em ambiente dessecante ou extremamente dessecante antes da seleção dos tecidos transformados. Os tratamentos podem ser programados para induzir a dessecação prolongada de gravidade variável. Os métodos de transformação da invenção ajudam a aumentar a frequência da transformação e a recuperação de plantas transgênicas da cana-de- açúcar.

[009] Portanto, a presente invenção permite produzir um tecido ou célula de cana-de-açúcar transformada, e o método acima consiste em: a) inocular um tecido ou célula de cana-de-açúcar com uma suspensão de inoculação de Agrobacterium, sendo o Agrobacterium constituído por um ácido nucleico de interesse, para a obtenção de tecido ou célula de cana-de-açúcar inoculada com Agrobacterium; e b) cocultivo do referido tecido ou célula de cana-de-açúcar inoculada com Agrobacterium em uma superfície na ausência do meio de cocultura durante um período suficiente para reduzir o peso original do tecido ou célula de cana-de- açúcar inoculada com Agrobacterium, produzindo, portanto, um tecido ou célula de cana-de-açúcar transformada.

Descrição Detalhada da Invenção

[010] A presente invenção destina-se aos métodos de transformação mediada por Agrobacterium compostos por um protocolo de cocultivo que permitem aumentar a eficácia da transferência de um ácido nucleico de interesse a partir da Agrobacterium em tecidos e células de cana-de-açúcar inoculadas. Os métodos de transformação mediada por Agrobacterium da presente invenção compreendem o cocultivo do tecido ou célula de cana-de-açúcar inoculada com Agrobacterium em uma superfície em um ambiente de dessecação por um período suficiente para reduzir o peso original do tecido inoculado antes da seleção das células ou tecido transformado. Em algumas modalidades, o ambiente de dessecação pode ser extremo, em que o excesso de suspensão de inoculação bacteriana (por exemplo: Agrobacterium) é removido antes do cocultivo do tecido com as bactérias na ausência de meio de cocultura. Após a exposição a esta etapa de dessecação, o material ou tecido vegetal inoculado pode ser submetido à etapa de seleção para identificar os eventos de transformação bem-sucedidos.

[011] A dessecação de partes de plantas antes ou durante o cocultivo com Agrobacterium é um método conhecido. Vogel e Hill, por exemplo, demonstraram uma melhoria na transformação de Brachypodium distachyon após o breve tratamento de dessecação de sete minutos no início do cocultivo (Vogel e Hill (2008) Plant Cell Rep. 27:471-478). Arencibia et al. demonstrou alguma melhoria na transformação mediada por Agrobacterium em partes de plantas de cana-de-açúcar por meio da secagem de células a ar sob fluxo laminar durante 15 a 60 minutos antes da inoculação (Arencibia et al. (1998) Transgenic Res. 7:123-222; consultar também, Zhang et al. (2006) J. Integr. Plant Biol. 48:453-459). Os tratamentos com secagem duraram mais de 60 minutos, no entanto, produziram danos irreversíveis às partes da planta (Arencibia et al. (1998) supra). Cheng e Fry relataram que o cocultivo de partes de plantas como milho, arroz, soja e trigo com Agrobacterium em um papel filtro saturado com quantidades variáveis de água esterilizada durante dois ou três dias reduziram o peso de parte da planta e aumentou a expressão β-glucuronidase (Patente dos EUA N.° 7.045.357; e Cheng et al. (2003) In Vitro Cell. Dev. Biol. 39:595-604). A redução do peso de parte da planta em mais de 35%, no entanto, resultou em partes de plantas que não puderam ser recuperadas com o estresse severo da água (Cheng et al., supra). Em contraste com os relatórios anteriores, a presente invenção na cana-de-açúcar oferece uma gama mais ampla de tratamentos eficazes, que resultam em um nível mais extremo de dessecação de tecidos vegetais inoculados durante o cocultivo.

[012] Sem estar vinculada a qualquer teoria ou mecanismo de ação específico, a submissão de tecidos de cana-de-açúcar inoculados com Agrobacterium à dessecação durante o período de cocultivo após a etapa de inoculação inicial reduz vantajosamente a apoptose/necrose celular do tecido vegetal inoculado, normalmente observada após a exposição dos tecidos de cana-de-açúcar ao Agrobacterium, e pode aumentar a produção de ácido nucleico de interesse mediada por Agrobacterium nos tecidos e/ou células-avo de cana-de-açúcar. Além disso, a dessecação durante a etapa de cocultivo aumenta, de forma vantajosa, a sobrevivência das células subsequentes durante as etapas de seleção/recuperação/regeneração que normalmente se seguem à etapa de cocultivo. Como consequência, os métodos de transformação mediada por Agrobacterium da presente invenção preveem o aumento da recuperação de plantas de cana-de-açúcar transgênicas.

[013] Note-se que o método da invenção pode ser aplicado a qualquer genótipo da cana-de-açúcar e representa uma melhoria significativa dos métodos de transformação para cana-de-açúcar. A necessidade de um método transformação da cana-de-açúcar que não seja dependente do genótipo tem sido sentido e o presente método fornece uma solução para o problema (consulte, por exemplo, Joyce et al. Plant Cell Rep 29:173-183 (2009)). A incorporação da dessecação durante o cocultivo para a transformação da cana-de-açúcar mediada por Agrobacterium (por exemplo: transformação mediada por Agrobacterium) resulta em menos recalcitrantes dessa planta de cultivo para a transformação mediada por Agrobacterium (por exemplo: transformação mediada por Agrobacterium).

[014] Portanto, em algumas modalidades, a presente invenção permite produzir um tecido ou célula de cana-de-açúcar transformada, e o método acima consiste em: a) inocular um tecido ou célula de cana- de-açúcar com uma suspensão de inoculação de Agrobacterium, sendo o Agrobacterium constituído por um ácido nucleico de interesse, para a obtenção de tecido ou célula de cana-de-açúcar inoculada com Agrobacterium; e b) cocultivo do referido tecido ou célula de cana-de- açúcar inoculada com Agrobacterium em uma superfície na ausência do meio de cocultura durante um período suficiente para reduzir o peso original do tecido ou célula de cana-de-açúcar inoculada com Agrobacterium, produzindo, portanto, um tecido ou célula de cana-de- açúcar transformada.

[015] Por "cocultivo" e "em cocultivo" entende-se o período de tempo da cultura após a inoculação de tecidos ou células vegetais (por exemplo: contato dos tecidos ou células vegetais com uma cepa de Agrobacterium ou outras bactérias capazes de transferir ácido nucleico) até o período em que as bactérias são removidas, inativadas ou suprimidas. Assim, por exemplo, "em cocultivo" pode referir-se ao período da cultura após a inoculação de tecidos vegetais ou célula até o período em que o crescimento e a atividade metabólica das bactérias dentro do tecido inoculado são suprimidos pela adição de compostos (por exemplo: agentes bactericidas ou bacteriostáticos) ou por meio de processos que inibem o crescimento de bactérias ou uma combinação de ambos. Conforme usado neste documento, "suprimir", "suprimido" e "supressão" (ou suas variações gramaticais) significam que a atividade (por exemplo: crescimento e reprodução de Agrobacterium) é retardada ou interrompida devido à adição de um agente (por exemplo: inibidores, antibióticos ou similares) e/ou à alteração das condições de cultura (crescimento) (por exemplo: meio, temperatura, umidade, luz e similares), em comparação à atividade na ausência do agente ou alteração. Geralmente, o processo de cocultivo termina no início de uma etapa de repouso, seleção ou regeneração.

[016] Conforme usado neste documento, "ambiente de dessecação" significa que a etapa de cocultivo é feita na ausência de meio de cocultura semissólido ou líquido, permitindo assim que os tecidos vegetais cocultivados com Agrobacterium sequem e seu peso original seja reduzido conforme descrito a seguir. Em outras modalidades, "ambiente de dessecação" significa o cocultivo de tecidos vegetais Agrobacterium inoculados em uma superfície sem (ou seja, na ausência de) meio outro líquido adicionado por um período suficiente para reduzir o peso original do tecido da planta inoculada com Agrobacterium. Conforme usado neste documento, "meio de cocultura" ou "em meio de cocultura" ou similar significa qualquer meio conhecido no método de cultura de tecidos ou células vegetais após a inoculação com Agrobacterium. Os componentes do meio de cocultivo são geralmente conhecidos no método e incluem o meio de cocultura da cana-de-açúcar referido neste documento como SCCoCult.

[017] Em outras modalidades da invenção, o tecido ou célula inoculada com Agrobacterium é submetido ao cocultivo que inclui a cultura de tecidos ou células vegetais inoculadas sobre uma superfície em um ambiente extremamente dessecante por um período suficiente para reduzir o peso original do tecido ou célula vegetal inoculada. Neste documento, o termo "ambiente dessecante extremo" significa que a suspensão da inoculação em excesso é substancialmente removida antes da etapa de cocultivo em que o tecido é cocultivado com Agrobacterium na ausência de meio de cocultivo. Em outras modalidades, o meio de pré-cultivo é substancialmente removido antes da etapa de cocultivo em que o tecido ou célula é cocultivada com Agrobacterium na ausência de meio de cocultivo.

[018] Assim, é reconhecido que o tecido ou célula vegetal, quando removido da suspensão de inoculação (por exemplo: cultura de suspensão bacteriana), pode manter a suspensão de inoculação residual aderindo a eles ou o tecido ou célula vegetal, quando removido do meio de pré-cultura (por exemplo: meio para o início do calo), pode reter o meio de pré-cultura residual aderindo a eles. Portanto, para maximizar o ambiente de dessecação da superfície (ou seja, criar um ambiente de dessecação extremo) que apoia o tecido ou célula vegetal inoculada durante a etapa de cocultivo, a suspensão de inoculação residual ou excesso e/ou meio de pré-cultura podem ser substancialmente removidos do tecido ou célula vegetal. Por "substancialmente removido" entende-se a quantidade de minimus ou reduzida de meio de suspensão de inoculação e/ou meio de pré-cultura que pode estar presente (ou seja, aderido) no tecido ou célula vegetal inoculada quando colocados sobre uma superfície em um ambiente de dessecação, contanto que a quantidade remanescente não contrarie o objetivo do ambiente de dessecação ou ambiente de dessecação extremo (por exemplo: para reduzir o peso original do tecido ou célula vegetal inoculada, conforme descrito abaixo). Assim, em algumas modalidades da presente invenção, a suspensão de inoculação é substancialmente removida do referido tecido ou célula inoculada com Agrobacterium antes do cocultivo na ausência de meio de cocultivo.

[019] Assim, em algumas modalidades, o tecido inoculado com Agrobacterium é submetido à pré-secagem, que consiste substancialmente na remoção da suspensão de inoculação do referido tecido ou célula inoculada com Agrobacterium antes do cocultivo na ausência de meio de cocultivo. Qualquer método usado substancialmente para a remoção da suspensão de inoculação contendo Agrobacterium pode ser usado para pré-secar o tecido ou célula vegetal antes da etapa de cocultivo. Os exemplos de métodos não limitados para pré-secagem incluem a drenagem, blotting sobre papel absorvente estéril seco (por exemplo: filtro de papel), secagem do tecido inoculado com ar ou qualquer combinação deles antes da etapa de cocultivo. Caso a secagem a ar seja usada, o tecido vegetal inoculado pode ser secado a ar, por exemplo, sob uma capa laminar ou outros meios para evaporação, durante cerca de 1 minuto a cerca de 60 minutos, por exemplo, cerca de 1 minuto, cerca de 5 minutos, cerca de 10 minutos, cerca de 15 minutos, cerca de 30 minutos, cerca de 60 minutos ou em qualquer período entre cerca de 1 minuto e cerca de 60 minutos antes da etapa de cocultivo. No caso de blotagem em papel, o tecido vegetal inoculado pode ser manchado em sequência com diversos papéis estéreis até que o papel não mostre sinais de umidade ou esteja substancialmente seco (ou seja, inspeção visual do papel filtro imediatamente depois que o blotting do tecido vegetal inoculado não identificar quaisquer pontos de umidade ou umectação no papel). O tecido ou a célula vegetal inoculada com Agrobacterium pode, em seguida, ser cocultivada sobre uma superfície em ambiente de dessecação.

[020] Em modalidades adicionais, o termo "ambiente de dessecação extremo" significa o cocultivo de tecidos ou células vegetais inoculados com Agrobacterium sobre uma superfície que consiste de pelo menos um papel absorvente seco (por exemplo: papel filtro), onde o papel seco é alterado periodicamente durante o cocultivo. "Periodicamente" neste documento significa, por exemplo, de hora em hora, diariamente (ou seja, a cada dia), a cada dois dias, a cada três dias e assim por diante. Assim, em algumas modalidades, o cocultivo consiste na cultura do referido tecido ou célula de cana-de-açúcar inoculada com Agrobacterium em, pelo menos, uma camada de papel seco. Em outras modalidades, o cocultivo consiste na cultura do tecido ou célula de cana-de-açúcar inoculada com Agrobacterium em duas ou mais camadas de papel seco. Em outras modalidades, o cocultivo consiste na cultura do tecido ou célula de cana-de-açúcar inoculada com Agrobacterium em, pelo menos, uma camada de papel seco, na qual o papel seco é substituído periodicamente durante o cocultivo. Além disso, em outras modalidades, o cocultivo consiste na cultura do tecido ou célula de cana-de-açúcar inoculada com Agrobacterium em duas ou mais camadas de papel seco, na qual o papel seco é substituído periodicamente durante o cocultivo. Em outras modalidades, o cocultivo consiste na cultura do tecido ou célula de cana-de-açúcar inoculada com Agrobacterium em, pelo menos, uma camada de papel seco, na qual o papel seco é substituído diariamente durante o cocultivo. Além disso, em outras modalidades, o cocultivo consiste na cultura do tecido ou célula de cana-de-açúcar inoculada com Agrobacterium em duas ou mais camadas de papel seco, na qual o papel seco é substituído diariamente durante o cocultivo. Em outras modalidades, o cocultivo consiste na cultura do referido tecido ou célula de cana-de-açúcar inoculada com Agrobacterium na referida superfície na ausência de papel seco.

[021] Portanto, em algumas modalidades da presente invenção, o tecido ou célula inoculada é cocultivada sobre uma superfície em um ambiente de dessecação e/ou ambiente de dessecação extremo durante um período suficiente para reduzir o peso original do tecido vegetal inoculado em menos de 1%, em cerca de 1%, cerca de 5%, cerca de 10%, cerca de 15%, cerca de 20%, cerca de 25% cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 45%, cerca de 50%, cerca de 55%, cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, etc. Em outras modalidades, o peso original é reduzido em cerca de 35% ou mais a cerca de 60%, por exemplo, cerca de 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48% 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60% e outros valores entre cerca de 35% e cerca de 60%. Em algumas modalidades, o peso original é reduzido em menos de 1% a cerca de 10%, em mais de cerca de 1% a cerca de 10%, cerca de 1% a cerca de 15%, cerca de 1% a cerca de 19%, cerca de 1% a cerca de 20%, cerca de 1% a cerca de 25%, cerca de 1% a cerca de 30%, cerca de 1% a cerca de 40%, cerca de 1% a cerca de 50%, cerca de 1% a cerca de 55%, cerca de 1% a cerca de 60%, cerca de 1% a cerca de 70%, cerca de 1% a cerca de 80%, cerca de 10% a cerca de 20%, cerca de 10% a cerca de 25%, cerca de 10% a cerca de 30%, cerca de 10% a cerca de 40%, cerca de 10% a cerca de 50%, cerca de 10% a cerca de 60%, cerca de 10% a cerca de 70%, cerca de 10% a cerca de 80%, cerca de 15% a cerca de 25%, cerca de 15% a cerca de 30%, cerca de 15 % a cerca de 40%, cerca de 15% a cerca de 50%, cerca de 15% a cerca de 60%, cerca de 15% a cerca de 70%, cerca de 15% a cerca de 80%, cerca de 20% a cerca de 30%, cerca de 20% a cerca de 40%, cerca de 20% a cerca de 50%, cerca de 20% a cerca de 60%, cerca de 20% a cerca de 70%, cerca de 20% a cerca de 75%, cerca de 20% a cerca de 80%, cerca de 30% a cerca de 40%, cerca de 30% a cerca de 50%, cerca de 30% a cerca de 60%, cerca de 30% a cerca de 65%, cerca de 30% a cerca de 70%, cerca de 30% a cerca de 80%, cerca de 40% a cerca de 50%, cerca de 40% a cerca de 60%, cerca de 40% a cerca de 70%, cerca de 40% a cerca de 80%, cerca de 50% a cerca de 60%, cerca de 50% a cerca de 65%, cerca de 50% a cerca de 70%, cerca de 50% a cerca de 75%, cerca de 50% a cerca de 80%, cerca de 60% a cerca de 65%, cerca de 60% a cerca de 70%, cerca de 60% a cerca de 75%, cerca de 60% a cerca de 80%, cerca de 65% a cerca de 70%, cerca de 65% a cerca de 80%, cerca de 75% a cerca de 80%, etc. e outros os valores semelhantes entre cerca de 1% e cerca de 80%. Em algumas modalidades, o peso original é reduzido em cerca de mais de 1% a cerca de 13%, em cerca de mais de 1% a cerca de 19%, em de cerca de mais de 36% a cerca de 50%.

[022] Em outras modalidades, o tecido ou célula inoculada é cocultivado sobre uma superfície em um ambiente de dessecação e/ou ambiente de dessecação extremo por um período suficiente para reduzir o peso original do tecido da planta inoculada em, pelo menos, cerca de 1%, pelo menos, cerca de 5%, pelo menos, cerca de 10%, pelo menos, cerca de 15%, pelo menos, cerca de 20%, pelo menos, cerca de 25%, pelo menos, cerca de 30%, pelo menos, cerca de 35%, pelo menos, cerca de 40%, pelo menos, cerca de 45 %, pelo menos, cerca de 50%, pelo menos, cerca de 55%, pelo menos, cerca de 60%, pelo menos, cerca de 65%, pelo menos, cerca de 70%, pelo menos, cerca de 75%, pelo menos, cerca de 80% e assim por diante. Portanto, em algumas modalidades, o peso original é reduzido em, pelo menos, cerca de 35%. Em outras modalidades, o peso original é reduzido em, pelo menos, cerca de 55%.

[023] Portanto, em algumas modalidades, o peso original do referido tecido ou célula de cana-de-açúcar inoculada com Agrobacterium é reduzido em cerca de mais de 1% a cerca de 55%. Em outras modalidades, o peso original do referido tecido ou célula de cana- de-açúcar inoculada com Agrobacterium é reduzido em cerca de mais de 1% a cerca de 10%. Em outras modalidades, o peso original do referido tecido ou célula de cana-de-açúcar inoculada com Agrobacterium é reduzido em, pelo menos, 35%. Em outras modalidades, o peso original do referido tecido ou célula de cana-de- açúcar inoculada com Agrobacterium é reduzido em, pelo menos, 55%. Assim, por exemplo, caso o peso original do tecido da planta inoculada seja 20 gramas, o período da etapa de cocultivo no ambiente de dessecação é suficiente para reduzir o peso do tecido inoculado em cerca de mais de 35% (por exemplo, para um peso de menos de cerca de 13 gramas). A dessecação do tecido ou célula vegetal durante o cocultivo para reduzir o peso original do tecido ou célula vegetal conforme descrito neste documento aumenta significativamente a eficácia de transformação da cana-de-açúcar.

[024] Por "peso original" entende-se o peso do tecido ou célula inoculada com Agrobacterium antes do início do processo de transformação. Em algumas modalidades, o processo de transformação inicia-se com a exposição do tecido ou célula de cana-de-açúcar ao choque térmico, conforme descrito a seguir. Em outras modalidades da invenção, o tecido não é exposto a choques térmicos e o processo de transformação inicia-se com a adição de Agrobacterium ou outra bactéria apropriada para o tecido ou célula de cana-de-açúcar. Portanto, o "peso original" refere-se ao peso do tecido determinado antes da inoculação. Desse modo, a redução do peso original como o utilizado neste documento refere-se ao peso do tecido vegetal medido antes da inoculação com uma suspensão de inoculação composta de Agrobacteria, em comparação ao peso do tecido determinado após o cocultivo com as bactérias. Com base no peso determinado nesses dois pontos temporais (ou seja, antes da inoculação e após o cocultivo), a percentagem de redução do peso original pode ser determinada.

[025] O período suficiente para reduzir o peso original do tecido vegetal inoculado com Agrobacterium dependerá do tamanho do tecido vegetal inoculado, do tipo de tecido (por exemplo: tecido do calo em comparação ao tecido meristemático) e dos parâmetros físicos associados ao ambiente de dessecação ou ambiente de dessecação extremo. Assim, por exemplo, o ambiente pode ser manipulado para acelerar a dessecação do tecido vegetal inoculado. Em algumas modalidades, a etapa de cocultivo pode ser realizada na presença de fluxo de ar (por exemplo: em uma capa laminar ou próximo de um ventilador) para acelerar a evaporação, na presença de vácuo, ou na presença de um dessecante adequado (por exemplo: óxido de cálcio, ácido sulfúrico, gel de sílica, etc.)

[026] Em algumas modalidades, o período de cocultivo pode ser de cerca de 1 dia a cerca de 14 dias, cerca de 2 dias a cerca de 14 dias, cerca de 2 dias a cerca de 12 dias, cerca de 2 dias a cerca de 10 dias, cerca de 2 dias a cerca de 8 dias, cerca de 2 dias a cerca de 6 dias, cerca de 2 dias a cerca de 4 dias, cerca de 3 dias a cerca de 14 dias, cerca de 3 dias a cerca de 12 dias, cerca de 3 dias a cerca de 10 dias, cerca de 3 dias a cerca de 8 dias, cerca de 3 dias a cerca de 6 dias, cerca de 3 dias a cerca de 4 dias, cerca de 4 dias a cerca de 14 dias, cerca de 4 dias a cerca de 12 dias, cerca de 4 dias a cerca de 10 dias, cerca de 4 dias a cerca de 8 dias, cerca de 4 dias a cerca de 6 dias, cerca de 5 dias a cerca de 14 dias, cerca de 5 dias a cerca de 12 dias, cerca de 5 dias a cerca de 10 dias, cerca de 5 dias a cerca de 8 dias cerca de 5 dias a cerca de 6 dias, cerca de 6 dias a cerca de 14 dias, cerca de 6 dias a cerca de 12 dias, cerca de 6 dias a cerca de 10 dias, cerca de 6 dias a cerca de 8 dias, cerca de 7 dias a cerca de 14 dias, cerca de 7 dias a cerca de 12 dias, cerca de 7 dias a cerca de 10 dias, cerca de 7 dias a cerca de 8 dias, cerca de 8 dias a cerca de 14 dias, cerca de 8 dias a cerca de 12 dias, cerca de 8 dias a cerca de 10 dias, cerca de 9 dias a cerca de 14 dias, cerca de 9 dias a cerca de 12 dias, cerca de 9 dias a cerca de 10 dias, cerca de 10 dias a cerca de 14 dias, cerca de 10 dias a cerca de 12 dias e assim por diante. Em outras modalidades, o período de cocultura pode ser por 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 8 dias, 9 dias, 10 dias, 11 dias, 12 dias, 13 dias ou 14 dias. Em algumas modalidades, o período de cocultivo descrito acima pode ser combinado em várias modalidades com as alterações no peso original do tecido ou célula vegetal, conforme descrito acima. Assim, qualquer período de cocultivo pode ser combinado a quaisquer alterações do peso original do tecido ou célula vegetal, conforme descrito acima e/ou com a adição de líquido ao cocultivo, conforme descrito acima.

[027] Durante a etapa de cocultivo, a temperatura pode ser qualquer temperatura adequada para o cocultivo, conforme conhecido na técnica. Portanto, em modalidades representativas, a temperatura pode ser uma faixa de cerca de 15°C a cerca de 30°C, de cerca de 16°C a cerca de 29°C, de cerca de 17°C a cerca de 28°C, de cerca de 18°C a cerca de 27°C, de cerca de 19°C a cerca de 26°C, de cerca de 20°C a cerca de 28°C, de cerca de 20°C a cerca de 25°C, de cerca de 21°C a cerca de 24°C ou de cerca de 22°C a cerca de 23°C. Em algumas modalidades, a temperatura durante o cocultivo pode ser de cerca de 15°C, 16°C, 17°C, 18°C, 19°C, 20°C, 21°C, 22°C, 23°C, 24°C, 25°C, 26°C, 27°C, 28°C, 29°C, 30°C, etc., ou qualquer combinação destas. Em algumas modalidades, a temperatura durante a etapa de cocultivo é de cerca 20°C a cerca de 28°C, e o período de cocultivo é de cerca de 3 dias a cerca de 5 dias e, em outras modalidades, a temperatura durante a etapa de cocultivo é de cerca de 23°C, cerca de 24°C ou cerca de 25°C e o período de cocultivo é de cerca de 3 dias a cerca de 5 dias. Em outras modalidades, a etapa cocultivo é de cerca de 23°C a de 24°C ou cerca de 25°C e o período de cocultivo é de cerca de 3 dias. Em outras modalidades, a etapa de cocultivo é de cerca de 23°C, cerca de 24°C ou cerca de 25°C e o período de cocultivo é de cerca de 4 dias. Em outras modalidades, a etapa cocultivo é de cerca de 23°C, cerca de 24°C ou cerca de 25°C e o período de cocultivo é de cerca de 5 dias. Em algumas modalidades, a etapa de cocultivo ocorre no escuro (ou seja, na ausência de fonte de luz externa).

[028] Conforme usado neste documento, "cerca de" significa uma faixa estatisticamente significativa de valor, como uma faixa de concentração indicada, intervalo de tempo, peso (por exemplo: uma variação percentual - redução ou aumento de peso), volume, temperatura ou pH. Esta faixa pode estar dentro de uma ordem de magnitude, geralmente com 20%, tipicamente dentro de 10%, ou mais tipicamente dentro de 5% de um determinado valor ou intervalo. A variação permitida abrangida por "cerca de" dependerá do sistema específico em estudo e pode ser facilmente apreciada por alguém versado na técnica.

[029] Conforme usado neste documento, "um", "uma" ou "o(a)" pode significar um ou mais de um. Por exemplo: "uma" célula pode significar uma única célula ou uma multiplicidade de células.

[030] Conforme usado neste documento, "e/ou" refere-se e abrange toda e qualquer combinação possível de um ou mais itens listados associados, bem como a falta de combinações quando interpretado no modo alternativo ("ou").

[031] Conforme usado neste documento, o termo "polipeptídeo" abrange tanto os peptídeos como as proteínas, salvo indicação ao contrário.

[032] Conforme usado neste documento, um polipeptídeo ou fragmento de polipeptídeo "isolado" significa um polipeptídeo ou fragmento de polipeptídeo separado ou substancialmente livre de pelo menos alguns dos outros componentes que ocorrem naturalmente no organismo, por exemplo: os componentes celulares ou outros polipeptídeos ou ácidos nucleicos comumente encontrados associados aos polipeptídeos. Em modalidades representativas da invenção, um polipeptídeo "isolado", fragmento de polipeptídeo e/ou proteína é, pelo menos, cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% puro (p/p) ou mais.

[033] Conforme usado neste documento, "ácido nucleico" é uma macromolécula composta de cadeias de nucleotídeos monoméricos incluindo, sem limitação, o ácido desoxirribonucleico (DNA) e o ácido ribonucleico (RNA). O ácido nucleico pode incluir um gene. Em modalidades específicas, os ácidos nucleicos usados na presente invenção são ácidos nucleicos "isolados". Conforme usado neste documento, um ácido nucleico "isolado" significa um ácido nucleico separado ou substancialmente livre de pelo menos alguns dos outros componentes que ocorrem naturalmente no organismo, por exemplo: os componentes celulares estruturais ou outros polipeptídeos ou ácidos nucleicos comumente encontrados associados ao ácido nucleico. Em modalidades específicas da invenção, o ácido nucleico "isolado" é, pelo menos, cerca de 1%, 5%, 10%, 25%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% puro (p/p) ou mais. Em outras modalidades, um ácido nucleico "isolado" indica que, pelo menos, cerca de 5 vezes, 10 vezes, 25 vezes, 100 vezes, 1.000 vezes, 10.000 vezes, 100.000 vezes ou mais enriquecimentos do ácido nucleico (p/p) são obtidos em comparação ao tecido/material ou célula vegetal original.

[034] Conforme usado neste documento, o termo "expressão" (e equivalentes gramaticais) com referência a um ácido nucleico refere-se a transcrição do ácido nucleico e, opcionalmente, tradução.

[035] Conforme usado neste documento, a frase de transição "que consiste essencialmente em" significa que o escopo de uma reivindicação deve ser interpretado para abranger os materiais ou etapas especificados na "reivindicação e aqueles que não afetam substancialmente a(s) característica(s) básicas(s) e constituição" da invenção reivindicada. Portanto, o termo "que consiste essencialmente em", quando usado na reivindicação desta invenção, não deve ser interpretado como equivalente a "compreende".

[036] Diversas modalidades da invenção são descritas neste documento. Qualquer uma das características das diversas modalidades da invenção descritas neste documento podem ser combinadas, criando-se modalidades adicionais que devem pertencer ao mesmo escopo da invenção.

[037] O cocultivo ocorre em uma superfície adequada em um ambiente de ressecação ou ambiente de dessecação extremo. Os exemplos de superfícies incluem, sem limitação, a superfície de um recipiente, frasco, placa, por exemplo, placa de Petri ou placa de cultura, vasilhames etc. Tais recipientes pode ser compostos de qualquer material adequado, incluindo, sem limitação, vidro, porcelana, plástico (por exemplo: poliestireno), e similares. Outras superfícies adequadas podem ser papel seco absorvente (por exemplo: papel filtro, ou seja, papel poroso próprio para uso como papel filtro (por exemplo: papel filtro marca Whatman® )), papel para germinação de sementes, papel toalha, papel de blotagem, filtro de papel, guardanapos, e similares).

[038] Nos casos onde o papel é a superfície, recomenda-se o uso de uma ou mais camadas de papel para facilitar a dessecação do tecido ou célula inoculada, agindo por exemplo, como um pavio de absorção. Assim, por exemplo, em algumas modalidades, a superfície usada durante a etapa que o cocultivo compreende, consiste essencialmente em e/ou consiste em pelo menos uma camada de papel seco (por exemplo: papel filtro seco). Em algumas modalidades, a superfície usada durante a etapa que o cocultivo compreende, consiste essencialmente em e/ou consiste em pelo menos duas ou três camadas de papel seco. Em algumas modalidades, a superfície usada durante a etapa que o cocultivo compreende, consiste essencialmente em e/ou consiste em pelo menos quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou mais camadas de papel seco. Nos casos em que o papel serve como a superfície, ele pode estar contido em qualquer recipiente adequado, frasco, placa (por exemplo: Petri, cultura de tecidos), recipiente, etc. Também é recomendável que a superfície a ser usada na etapa de cocultivo seja esterilizada antes do uso por meio de qualquer método de esterilização apropriado conhecido para aqueles com habilidade na técnica.

[039] Assim, em algumas modalidades da presente invenção, o cocultivo consiste na cultura do referido tecido ou célula de cana-de- açúcar inoculada com Agrobacterium em, pelo menos, uma camada de papel filtro seco. Em outras modalidades, o cocultivo consiste na cultura do tecido ou célula de cana-de-açúcar inoculada com Agrobacterium em duas ou mais camadas de papel filtro seco. Em outras modalidades da presente invenção, o cocultivo consiste na cultura do referido tecido ou célula de cana-de-açúcar inoculada com Agrobacterium em uma superfície na ausência de papel (por exemplo: na ausência de papel filtro).

[040] Além disso, conforme descrito acima, o cocultivo consiste na cultura do referido tecido ou célula de cana-de-açúcar inoculada com Agrobacterium em, pelo menos, uma camada de papel seco, em que o papel seco é substituído periodicamente durante o cocultivo. "Periodicamente" neste documento significa, por exemplo, de hora em hora, diariamente, a cada dois dias, a cada três dias e assim por diante. Portanto, em algumas modalidades, o cocultivo consiste na cultura do tecido ou célula de cana-de-açúcar inoculada com Agrobacterium em, pelo menos, uma camada de papel seco, em que o papel seco é substituído diariamente durante o cocultivo.

[041] Em algumas modalidades, onde o ambiente é um ambiente de dessecação, pequenas quantidades de água estéril ou meio líquido, geralmente não superior a cerca de 20 ml, cerca de 50 ml, cerca de 75 ml, cerca de 100 ml, cerca de 200 ml, cerca de 300 ml, cerca de 400 ml, cerca de 500 ml, cerca de 600 ml, cerca de 700 ml, cerca de 800 ml, cerca de 900 ml ou cerca de 1000 ml podem ser adicionados à etapa de cocultivo. Qualquer quantidade de líquido descrita neste documento pode ser usada com qualquer alteração percentual do peso do tecido ou célula inoculada, conforme descrito acima.

[042] Pequenas quantidades de água estéril ou meio líquido, conforme descrito neste documento, podem ser adiocionadas para retardar, reduzir ou atenuar a taxa de dessecação. Em algumas modalidades, o cocultivo em um ambiente de dessecação consiste na cultura do referido tecido ou célula de cana-de-açúcar inoculada com Agrobacterium em, pelo menos, uma camada de papel seco, que compreende até 1000 μl de líquido. Em algumas modalidades, o cocultivo em um ambiente de dessecação consiste na cultura do referido tecido ou célula de cana-de-açúcar inoculada com Agrobacterium em, pelo menos, uma camada de papel seco, que compreende menos de 50 μl de líquido.

[043] Os métodos de transformação mediada por Agrobacterium- da presente invenção aplicam-se às plantas do gênero Saccharum (por exemplo; cana-de-açúcar, cana para geração de energia) e seus híbridos, incluindo os híbridos entre plantas do gênero Saccharum e gêneros correspondentes, como Miscanthus, Erianthus, Sorghum e outros. Conforme usado neste documento, "cana-de-açúcar" e "Saccharum spp." significam qualquer uma das seis a trinta e sete espécies (dependendo da interpretação taxonômica) de gramíneas perenes altas do gênero Saccharum. De maneira específica, a planta pode ser Saccharum aegyptiacum, Saccharum esculentum, Saccharum arenicol, Saccharum arundinaceum, Saccharum barberi, Saccharum bengalense, Saccharum biflorum, Saccharum chinense, Saccharum ciliare, Saccharum cylindricum, Saccharum edule, Saccharum elephantinum, Saccharum exaltatum, Saccharum fallax, Saccharum fallax, Saccharum floridulum, Saccharum giganteum, Saccharum hybridum, Saccharum japonicum, Saccharum koenigii, Saccharum laguroides, Saccharum munja, Saccharum narenga, Saccharum officinale, Saccharum officinarum, Saccharum paniceum, Saccharum pophyrocoma, Saccharum purpuratum, Saccharum ravennae, Saccharum robustum, Saccharum roseum, Saccharum sanguineum, Saccharum sara, Saccharum sinense, Saccharum spontaneum, Saccharum tinctorium, Saccharum versicolor, Saccharum violaceum, Saccharum violaceum e qualquer um dos híbridos interespecíficos e variedades comerciais dos mesmos.

[044] Além disso, a presente invenção fornece métodos para a transformação mediada por Agrobacterium de qualquer planta e, de maneira específica, podem ser usados para aumentar a eficácia da transformação mediada por Agrobacterium ou podem ser usados para tornar uma determinada planta menos recalcitrante para a transformação mediada por Agrobacterium. Exemplos de tais plantas incluem, entre outras, cevada, feijões em geral, Brassica spp., trevo, cacau, café, algodão, linho, milho, milheto, amendoim, colza/canola, arroz, centeio, cártamo, sorgo, soja, beterraba, girassol, batata-doce, chá e trigo; vegetais, incluindo, entre outros, cucurbitáceas, brócolis, couve-de-bruxelas, repolho, cenoura, mandioca, couve-flor, lentilha, alface, ervilha, pimentão, abacaxi, rabanete, batata e tomate; gramíneas, incluindo, entre outras, alfafa, grama-bermuda, capim- elefante, capim Rhodes, grama festuca alta, grama de trigo alta, Miscanthus spp. e switchgrass; frutos de árvores, incluindo, entre outros, maçã, damasco, abacate, banana, cítricos, cocos, pêras, pêssegos e nozes; e flores, incluindo, entre outras, cravos, orquídeas e rosas.

[045] Em algumas modalidades, uma planta, parte da planta ou tecido da planta para uso nos métodos de transformação mediada por Agrobacterium da invenção significa os órgãos da planta (por exemplo: folhas, caules, raízes, etc.), sementes, células vegetais e descendentes deles. Portanto, a planta, parte da planta, o tecido da planta também inclui, sem limitação, protoplastos, nódulos, calos (por exemplo: tecido do calo embriogênico), cultura de suspensão, embriões, bem como flores, óvulos, caules, frutos, folhas, brotos laterais (também conhecidos como perfilhos), raízes, pontas de raízes e similares originários da plantas ou de seus descendentes. A célula vegetal inclui, sem limitação, uma célula obtida de uma semente, embrião, região meristemática, tecido do calo, cultura de suspensão, folha, caule primário, raiz, broto, gametófito, esporófito, pólen e/ou microesporo. A planta, parte da planta e tecido vegetal da presente invenção podem ser derivados de plantas cultivadas em estufa a partir de plantas cultivadas em campo.

[046] Em algumas modalidades, o tecido vegetal adequado para uso em métodos de transformação mediada por Agrobacterium da invenção pode ser de qualquer tecido ou célula de origem vegetal, que é passível de regeneração de uma planta inteira após a introdução do ácido nucleico de interesse. Em outras modalidades, o tecido ou célula vegetal do mesmo para uso em métodos transformação mediada por Agrobacterium da invenção pode ser qualquer tecido ou célula de calo de origem vegetal. Nesse caso, em algumas modalidades, o tecido vegetal inclui, sem limitação, a cultura de células (por exemplo: suspensão de células ou cultura de suspensão, tecido do calo).

[047] Exemplos de tecidos de cana-de-açúcar incluem, entre outros, aqueles derivados de bases de folhas jovens, flores imaturas ou florescências, gemas axilares, meristemas de brotos ou raízes isolados, rolos/espirais de folhas imaturas, brotos laterais imaturos (também conhecidos como perfilhos imaturos ou rebentos), sementes, embriões isolados, etc. Em algumas modalidades, o tecido ou célula da cana-de- açúcar é obtido de uma haste ou perfilho de cana-de-açúcar. Em outras modalidades, o tecido da cana-de-açúcar pode ser espirais de folha imatura excisados a partir de qualquer haste primária ou de um rebento de uma planta de cana-de-açúcar. Em algumas modalidades, o tecido da cana-de-açúcar é um tecido de calo embriogênico derivado dos tecidos descritos anteriormente. Em outras modalidades, o tecido da cana-de-açúcar é um calo embriogênico derivado do tecido de perfilhos de cana-de-açúcar (por exemplo: brotos laterais imaturos). Em outras modalidades, o tecido da cana-de-açúcar é obtido de um segmento de rolo de folhas ou segmento de bainha da folha excisado de uma haste ou perfilho. Em outras modalidades, o tecido da cana-de-açúcar é um tecido ou célula de calo embriogênico derivado de um segmento de rolo de folhas ou segmento de bainha da folha excisado de uma haste ou perfilho. Em outras modalidades, o tecido da cana-de-açúcar é um tecido ou célula de calo embriogênico. Em outras modalidades, o tecido da cana-de-açúcar é um calo embriogênico ou célula derivada de tecido de espiral de folhas imaturas. O calo embriogênico é derivado de tecidos vegetais mencionados acima por meio de métodos de pré-cultivo conforme conhecidos e descritos a seguir

[048] Conforme usado neste documento, "broto lateral" significa outro broto além do broto primário (ou seja, talo), originário da coroa da planta de cana-de-açúcar próxima da superfície do solo. O broto lateral também é conhecido como "broto secundário".

[049] Como descrito acima, em algumas modalidades, o tecido ou célula vegetal podem ser derivados de brotos laterais imaturos no estágio de desenvolvimento, em que o entrenó inferior começa a se alongar. A idade do broto lateral nesta fase é geralmente entre cerca de um e seis meses, inclusive cerca de um a cerca de três meses, cerca de um a cerca de quatro meses, cerca de um a cerca de cinco meses, cerca de dois a cerca de três meses ou cerca de dois a cerca de quatro meses. Em outras modalidades, a idade do broto lateral nesta fase é entre seis e 12 meses. Brotos laterais jovens ou imaturos crescem a partir da base das plantas de cana-de-açúcar no estágio de amadurecimento e a produção desses brotos laterais pode ser induzida derrubando-se as canas no estágio de amadurecimento, bem como removendo os brotos laterais maiores para promover o crescimento de outros brotos laterais. Desse modo, em algumas modalidades, brotos laterais jovens podem ser produzidos em grande número na estufa, contribuindo para uma fonte muito consistente de material vegetal para um processo de transformação. O uso de brotos laterais para a transformação e regeneração de plantas transgênicas reduz significativamente o impacto sobre o crescimento e desenvolvimento da cana-de-açúcar, contanto que o talo primário inteiro ou parte dele não precise ser removido para fins de transformação e a planta de cana-de- açúcar continue a produzir brotos laterais por um extenso período de tempo. Estes materiais vegetais podem ser processados e pré-tratados de maneiras diferentes para maximizar o seu potencial como um alvo para a transformação mediada por Agrobacterium. Além disso, os brotos laterais podem ser obtidos de plantas cultivadas em estufa. Em outras modalidades, os tecidos vegetais usados na presente invenção são derivados de plantas cultivadas em campo.

[050] Os brotos primários e secundários podem ser excisados da planta e esterilizados por métodos padrão conhecidos, conforme descrito neste documento, para o estabelecimento de culturas estéreis em meio artificial. Por exemplo: os brotos laterais pode ser contactados com uma solução de etanol a 70% ou solução de água sanitária a 20%. Após a esterilização do broto lateral excisado, um segmento, fatia ou secção de tecido vegetal é obtido. Em algumas modalidades, a seção pode ser cerca de 0,1 mm, cerca de 0,2 mm, cerca de 0,3 mm, cerca de 0,4 mm, cerca de 0,5 mm, cerca de 0,6 mm, cerca de 0,7 mm, cerca de 0,8 mm, cerca de 0,9 mm, cerca de 1 mm, cerca de 1,5 mm, cerca de 2 mm, cerca de 3 mm, cerca de 4 mm, cerca de 5 mm, cerca de 6 mm, 7 mm, cerca de 8 mm, cerca de 9 mm, cerca de 10 mm ou mais de espessura. O tecido vegetal obtido desta forma é normalmente conhecido como ok"explante". O termo "explante" refere-se a tecidos vivos removidos de um organismo e colocados em um meio de cultura de tecidos.

[051] Em algumas modalidades, o explante pode ser obtido a partir do talo primário ou tecidos do broto lateral, incluindo cones ou espirais da folha, caules, bainha da folha, rolo de folha (região meristemática), nó, entrenó ou segmentos. Em algumas modalidades, o explante pode ser a bainha da folha ou seções do rolo de folhas. O segmento pode ser cortado logo acima do meristema apical até cerca de 10 mm a 50 mm acima do meristema apical. Portanto, o segmento pode ser cortado logo acima do meristema apical até cerca de 10 mm, até cerca de 20 mm, até cerca de 30 mm, até cerca de 40 mm ou até cerca de 50 mm acima do meristema apical. Em modalidades diversas, o explante não é um segmento de nó ou não é um segmento de entrenó. Conforme usado neste documento, "segmento do nó" significa qualquer articulação em um talo do qual uma ou mais folhas podem crescer e inclui quaisquer gomos laterais (axilares) ao lado do caule, como em uma axila foliar. A parte do caule entre dois nós é denominada "entrenó". Uma ou duas folhas externas podem ser removidas do broto lateral antes da segmentação.

[052] Conforme mencionado acima, em algumas modalidades, a presente invenção apresenta métodos com os quais o tecido da planta pode ser submetido a uma etapa de pré-cultura em que o tecido vegetal é cultivado em um meio de pré-cultura apropriado, sob condições suficientes para produzir calos embriogênicos. Portanto, em algumas modalidades da invenção, o tecido ou célula de cana-de-açúcar é obtido por meio de pré-cultura de um segmento do referido perfilho durante um intervalo de tempo para produzir tecidos de calos embriogênicos antes de entrar em contato com o referido tecido ou célula de cana-de-açúcar, em que a referida cultura de inoculação consiste em Agrobacterium.

[053] O termo "calo" refere-se a uma massa indiferenciada de proliferação de células ou tecidos. Em modalidades distintas, os meios são adequados para a indução de calos embriogênicos. Conforme usado neste documento, "calo embriogênico" significa os tecidos ou células indiferenciados e sem estrutura significativa, mas com potencial para formar um tecido diferenciado (por exemplo: tecido embriogênico), que pode produzir embriões e germinam em plantas.

[054] As condições de cultura suficientes para a formação de calos embriogênicos são métodos conhecidos e podem variar de acordo com o cultivo da cana-de-açúcar. Os meios de cultura adequados para o estabelecimento e manutenção de culturas de calos embriogênicos são descritos, por exemplo, em Methods in Molecular Biology, Vol. 344 (Wang, ed. Springer (2006)), páginas 227-235; Published International Application N° WO 01/33943; Patente dos EUA N.° 5.908.771; Patente dos EUA N.° 6.242.257; Croy, ed. (1993) Plant Molecular Biology Labfax (Bios Scientific Publishers, Ltd.); Jones, ed. (1995) Plant Transfer and Expression Protocols (Humana Press); e em referências citadas neste documento. Cada uma dessas referências é incorporada ao documento em sua totalidade. Os detalhes adicionais relacionados com a cultura de células vegetais, incluindo os processos de pré-tratamento, são fornecidos na seção Experimental abaixo.

[055] O tecido vegetal para transformação pode ser cultivado a partir de cerca de 1 a cerca de 100 dias, inclusive, antes da inoculação com Agrobacterium ou outra bactéria apropriada (por exemplo: pré- cultivada). Em modalidades distintas, o tecido vegetal pode ser cultivado por cerca de 5 dias, cerca de 6 dias, cerca de 7 dias, cerca de 8 dias, cerca de 9 dias, cerca de 10 dias, cerca de 12 dias, cerca de 14 dias, cerca de 16 dias, cerca de 18 dias , cerca de 20 dias, cerca de 25 dias, cerca de 30 dias, cerca de 35 dias, cerca de 40 dias, cerca de 45 dias, cerca de 50 dias, cerca de 55 dias, cerca de 60 dias, cerca de 65 dias, cerca de 70 dias, cerca de 75 dias, cerca de 80 dias, cerca de 85, dias, cerca de 90 dias, cerca de 95 dias ou cerca de 100 dias e assim por diante, antes da transformação. O meio de cultura pode incluir a formulação do nutriente Murashige e Skoog (MS) (Murashige e Skoog (1962) Physiologia Plantarum 15:473-497) ou meio de Gamborg (Gamborg et al. (1968) Exp. Cell Res 50:151-158). Preferivelmente, o meio compreende a formulação de nutrientes MS. Será apreciável que o meio acima mencionado esteja disponível comercialmente, como outros meios potencialmente úteis.

[056] O meio pode ainda pode conter sacarose e pode incluir ágar. Assim, será apreciável que o tecido vegetal seja pré-cultivado em meio sólido ou líquido.

[057] Os componentes adicionais do meio de pré-cultura podem incluir fitormônios como citocininas e/ou auxina. Em modalidades distintas, a citocinina pode ser selecionada do grupo que consiste em cinetina e N6-benziladenina (BA) e suas combinações. Há diversos outros compostos de citocinina e/ou semelhantes à citocinina que podem ser utilizados de acordo com a presente invenção, por exemplo: zeatina, α-isopentiladenosina e/ou difenilureia.

[058] Em modalidades distintas, a auxina é 1-ácido naftaleneacético(NAA) e/ou 2,4 ácido diclorofenoxiacético (2,4 D). Há uma variedade de auxinas ou compostos semelhantes à auxina que podem ser utilizados de acordo com a presente invenção, por exemplo: ácido indol-3-butírico (IBA), ácido p-clorofenoxiacético (CPA), indol-3- ácido acético (IAA ), 2,4,5-ácido triclorofenoxiacético, ácido fenilacético, picloram, e-ácido naftoxiacético, dicamba e/ou ácido transcinâmico.

[059] Será facilmente perceptível para o técnico habilidoso que as concentrações mais eficazes de auxina e/ou citocinina podem ser determinadas de maneira empírica por meio de testes cruzados com diferentes concentrações de auxina e/ou citocinina. A concentração ideal de uma ou ambas pode ser adaptada de acordo com o cultivar de plantas específico do qual o tecido vegetal cultivado foi retirado.

[060] Após a formação do calo embriogênico inicial, as respostas de alta qualidade são opcionalmente subcultivadas por cerca de 1 a cerca de 10 dias, inclusive, para a produção de calos para a transformação por meio da inoculação com Agrobacterium.

[061] O tecido vegetal (por exemplo: calo embriogênico) pode ser submetido a uma etapa de inoculação, conforme descrito neste documento, no qual as células de cultura de calos são contactadas com uma cultura de inoculação que compreenda uma bactéria (por exemplo: Agrobacterium), que compreende um ácido nucleico de interesse que deve ser introduzido no tecido da planta de cana-de-açúcar.

[062] Qualquer método adequado para a inoculação do tecido ou célula de cana-de-açúcar dele para obter um tecido ou célula vegetal inoculado com Agrobacterium e para a seleção de um tecido ou célula de cana-de-açúcar transformada pode ser usado nos métodos da presente invenção, incluindo os procedimentos conhecidos por alguém com habilidade no método e aqueles descritos a seguir. A característica distintiva dos métodos de transformação da presente invenção é a sujeição do tecido ou célula inoculada com Agrobacterium à etapa de cocultivo que inclui a cultura de tecidos ou células vegetais inoculadas sobre uma superfície em um ambiente de dessecação ou ambiente de dessecação extremo por um período suficiente para reduzir o peso original do tecido ou célula vegetal inoculada, conforme descrito acima. Portanto, qualquer protocolo de transformação da cana-de-açúcar, que compreende uma etapa de inoculação com Agrobacterium consistindo em um ácido nucleico de interesse, uma etapa de cocultivo e uma etapa de seleção pode ser aprimorada por meio da modificação do método para incluir o protocolo de cocultivo divulgado neste documento.

[063] Diversos métodos de transformação de plantas mediada por Agrobacterium são conhecidos. Consulte, por exemplo, as Patentes dos EUA N° 5.563.055 e 5.981.840; consulte também, Arencibia et al. (1998) Transgenic Res. 7:123-222; Arencibia e Carmona "Sugar cane (Saccharum spp.)," in Methods in Molecular Biology, Agrobacterium Protocols, Vol. 2, ed. Wang (2nd ed., Humana Press, Inc.), páginas 227235 (2007); de la Riva et al. (1998) Electron. J. Biotechnol. 1:118-133; Manickavasagam et al. (2004) Plant Cell Rep. 23:134-143; Opabode (2006) Biotechnol. Mol. Biol. Rev. 1:12-20; e Zhang et al. (2006) J. Integr. Plant Biol. 48:453-459).

[064] Conforme usado neste documento, "Agrobacterium" significa uma espécie, subespécie ou cepa de Agrobacterium capaz de mobilizar e transferir T-DNA de forma seletiva a uma planta ou célula vegetal. Em modalidades específicas, Agrobacterium pode ser Agrobacterium rhizogenes (por exemplo: Rhizobium rhizogenes) ou A. tumefaciens. Qualquer cepa de Agrobacterium capaz de mobilizar e transferir T-DNA de maneira seletiva a uma planta ou célula pode ser usada na presente invenção. Em algumas modalidades, cepas selvagens são usadas. Em outras modalidades, os derivados de espécies de Agrobacterium "desarmados", em que as sequências indutoras de tumor do plasmídeo Ti foram removidas, são usados. Exemplos de cepas de A. tumefaciens apropriados incluem, entre outros, EHA101, conforme descrito por Hood et al. (1986) J. Bacteriol. 168:1291-1301); LBA4404, conforme descrito por Hoekema et al. (1983) Nature 303:179-180; e C58 (pMP90), conforme descrito por Koncz e Schell (1986) Mol. Gen. Genet. 204:383396, EHA 105, AGLI e AGL0, SBI, e qualquer combinação deles. Exemplos de cepas de Agrobacterium rhizogenes apropriadas incluem, entre outros, 15834, conforme descrito por Birot et al. (Biochem, 25: 323-35) e R1000. Em outras modalidades, além de espécies e cepas de Agrobacterium , outras espécies e cepas de bactérias, que são competentes para a transferência de ácido nucleico, podem ser usadas nos métodos de transformação da presente invenção (consulte, por exemplo, as descrições de CAMBIA (www.cambia.org), consulte também Broothaerts et al. Nature 433:629-633 (2005)). Exemplos não limitados de bactérias não-Agrobacterium competentes para transferência de ácido nucleico incluem Sinorhizobium, Mesorhizobium e Rhizobium (Id.).

[065] A inoculação pode ser feita de acordo com qualquer método conhecido e, normalmente, envolve a mistura do tecido ou célula de cana-de-açúcar com uma cultura de inoculação que consiste em uma cepa da bactéria (por exemplo: Agrobacterium) abrigando um plasmídeo ou vetor com um ácido nucleico de interesse. Uma cultura de inoculação típica é a suspensão de inoculação preparada a partir de cultura de Agrobacterium. Desse modo, a cepa de Agrobacterium, que abriga o ácido nucleico de interesse a ser transformado em tecido ou célula vegetal da cana-de-açucar, é cultivada em um meio de cultura apropriada suplementado com antibióticos selecionados para a cepa e vetor (consulte, por exemplo, o protocolo descrito na seção Experimental a seguir). Os técnicos habilitados no método conhecem os procedimentos de crescimento de Agrobacterium e condições de cultura adequadas. Geralmente, uma cultura de Agrobacterium é inoculada a partir de um estoque de glicerol ou placa de colônias e cultivada durante a noite. As células bacterianas são lavadas e suspensas novamente em meio de cultura adequado para a inoculação do tecido ou célula de cana-de-açúcar. Conforme usado neste documento, "suspensão de inoculação" significa a suspensão de células bacterianas (por exemplo: Agrobacterium spp.) a serem usadas para inoculação do tecido ou célula vegetal. "Cultura de inoculação" refere-se à combinação de células de bactérias e ao tecido ou célula vegetal.

[066] A inoculação (ou seja, infecção) em si pode ocorrer em, pelo menos, cerca de um minuto a cerca de doze horas (ou seja, durante a noite) à temperatura ambiente (ou seja, cerca de 20°C a cerca de 25°C). Durante a inoculação, é possível aplicar os vários tratamentos adicionais para ajudar a infecção do Agrobacterium como sonicação ou infiltração a vácuo da cultura de inoculação. Por exemplo: a cultura de inoculação pode passar por sonicação conforme descrito em Trick e Finer (1998) Plant Cell Rep. 17:482-488, e Patente dos EUA N° 5.693.512. Alternativamente, ou como opção, a cultura de inoculação pode ser infiltrada conforme descrito em Amoah et al. (2001) J. Exp. Bot. 52:1135-1142 e Park et al. (2005) Plant Cell Rep. 24:494-500).

[067] Em algumas modalidades, é recomendável que o tecido da cana-de-açúcar seja submetido a um pré-tratamento diferencial de temperatura antes da inoculação. Por "pré-tratamento diferencial de temperatura" entende-se que o tecido ou célula da cana-de-açúcar é exposto a uma temperatura superior à temperatura em que a inoculação será realizada. Assim, por exemplo, se a inoculação for realizada a cerca de temperatura ambiente (por exemplo: cerca de 20°C a cerca de 25°C), o pré-tratamento diferencial de temperatura poderá comprometer a exposição do tecido ou célula de cana-de-açúcar a uma temperatura equivalente a cerca de 5°C, cerca de 10°C, cerca de 15°C, cerca de 20°C, cerca de 25°C ou cerca de 30°C mais elevada (nesse caso, o tecido ou célula de cana-de-açúcar é exposta a um pré-tratamento térmico, ou seja, choque térmico) do que a temperatura com a qual a inoculação será realizada (por exemplo: temperatura ambiente). A duração pré-tratamento diferencial de temperatura vai variar dependendo do tipo e origem do tecido de cana-de-açúcar. Portanto, em algumas modalidades, a duração do pré-tratamento diferencial de temperatura é de cerca de 1 minuto a cerca de 60 minutos, 1 minuto a cerca de 50 minutos, 1 minuto a cerca de 40 minutos, 1 minuto a cerca de 30 minutos, cerca de 1 minuto a cerca de 20 minutos, cerca de 1 minuto a cerca de 15 minutos, cerca de 1 minuto a cerca de 10 minutos ou cerca de 1 minuto a cerca de 5 minutos. Em outras modalidades, a duração do pré-tratamento diferencial de temperatura é de 1 minuto, 2 minutos, 3 minutos, 4 minutos, 5 minutos, 6 minutos, 7 minutos, 8 minutos, 9 minutos, 10 minutos, 11 minutos, 12 minutos, 13 minutos, 14 minutos, 15 minutos, 16 minutos, 17 minutos, 18 minutos, 19 minutos, 20 minutos, 21 minutos, 22 minutos, 23 minutos, 24 minutos, 25 minutos, 26 minutos, 27 minutos, 28 minutos, 29 minutos, 30 minutos, 31 minutos, 32 minutos, 33 minutos, 34 minutos, 35 minutos, 36 minutos, 37 minutos, 38 minutos, 39 minutos, 40 minutos, 41 minutos, 42 minutos, 43 minutos, 44 minutos, 45 minutos, 46 minutos, 47 minutos, 48 minutos, 49 minutos, 50 minutos, 51 minutos, 52 minutos, 53 minutos, 54 minutos, 55 minutos, 56 minutos, 57 minutos, 58 minutos, 59 minutos, 60 minutos e assim por diante.

[068] Assim, em algumas modalidades, recomenda-se que o tecido ou célula de cana-de-açúcar seja pré-tratado com choque térmico antes da inoculação usando métodos conhecidos para aqueles com habilidade no método. Assim, como exemplo não limitado, o choque térmico consiste em contactar o tecido da planta ou célula com o meio como meio básico (por exemplo: meio Murashige e Skoog, Murashige e Skoog (1962) Physiol. Plant 15:473-497) pré-aquecido a temperatura de cerca de 35°C a cerca de 55°C, por cerca de 1 minuto a cerca de 15 minutos. Em outro exemplo não limitado, o choque térmico consiste em contactar o tecido da planta ou célula com o meio pré-aquecido a uma temperatura de cerca de 45°C por cerca de 5 minutos.

[069] Após a etapa de cocultivo e antes da seleção e regeneração de plantas ou partes de plantas transgênicas, o tecido da planta inoculada com Agrobacterium pode ser, opcionalmente, mantido em "descanso" por meio da cultura do tecido da planta inoculada em um meio de descanso. Conforme usado neste documento, "meio de descanso" significa um meio de cultura de tecidos de plantas inoculadas ou células das mesmas após o cocultivo e, normalmente, consiste em agentes que podem inibir ou suprimir o crescimento e a atividade metabólica das bactérias ou eliminação delas (por exemplo: agentes bacteriostáticos ou bactericidas). Conforme usado neste documento, "bacteriostático" significa a capacidade de inibir ou suprimir o crescimento ou a reprodução de bactérias. Em contraste, "bactericida" significa a capacidade de eliminar as bactérias totalmente. Os componentes de tal meio são geralmente métodos conhecidos. Por exemplo: o meio de descanso pode ser um meio basal (por exemplo: meio Murashige e Skoog (MS)), suplementado com timentina e/ou outro antibiótico incluindo, entre outros, cefotaxima e/ou carbenicilina. Consulte também, Zhao et al. (2001) Molecular Breeding 8:323-333.

[070] Portanto, na etapa de descanso, o tecido ou célula inoculada com Agrobacterium pode ser cultivada no meio de descanso durante cerca de 1 dia a cerca de 15 dias, cerca de 2 dias a cerca de 14 dias, cerca de 2 dias a cerca de 12 dias, cerca de 2 dias a cerca de 11 dias, cerca de 2 dias a cerca de 10 dias, cerca de 3 dias a cerca de 10 dias, cerca de 4 dias a cerca de 10 dias, cerca de 5 dias a cerca de 10 dias, cerca de 6 dias a cerca de 9 dias ou cerca de 6 dias a cerca de 8 dias. Desse modo, após a etapa de cocultivo, o tecido ou célula vegetal inoculada pode ser cultivada no meio de descanso durante cerca de 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 8 dias, 9 dias, 10 dias, 11 dias, 12 dias, 13 dias, cerca de 14 dias ou cerca de 15 dias. Em algumas modalidades, nenhuma etapa de repouso é incluída e, em vez disso, após o cocultivo, o tecido ou célula vegetal é submetido à seleção, como descrito a seguir. Em algumas modalidades, o meio de seleção pode incluir pelo menos um composto para inibir o crescimento e/ou eliminar as bactérias.

[071] Em modalidades representativas, após a inoculação e cocultivo e, opcionalmente, o cultivo em um meio de descanso, a seleção subsequente e as etapas de regeneração podem ser quaisquer métodos conhecidos. Consulte, por exemplo, McCormick et al. (1986) Plant Cell Rep. 5:81-84. Por exemplo: o material vegetal pode ser transferido a um meio que inclui um agente seletivo capaz de impedir o crescimento de células que não receberam um polinucleotídeo-alvo (por exemplo: codificação de um polipeptídeo de interesse por um polinucleotídeo e/ou sequência de nucleotídeos que conferem resistência a um agente de seleção), dos quais pelo menos um produto de expressão é capaz de impedir a ação de um agente seletivo para a seleção de células vegetais transformadas. Conforme usado neste documento, "seleção" significa um processo em que uma ou mais plantas, tecidos ou células vegetais são identificadas como com uma ou mais propriedades de interesse, por exemplo: um marcador selecionável ou um marcador escalável, maior resistência a insetos, aumento ou diminuição dos níveis de carotenoides, coloração alterada, etc. Por exemplo: um processo de seleção pode incluir a colocação de organismos em condições nas quais o crescimento daqueles com um genótipo específico será favorecido.

[072] A etapa de seleção pode compreender o cultivo sob condições seletivas do tecido do calo ou célula exposto à sequência de nucleotídeos de interesse, em que as condições seletivas incluem aquelas que são suficientes para distinguir uma célula transformada a partir de uma célula não transformada. Essas condições variam de acordo com, por exemplo, o tipo de marcador selecionável usado, o cultivar do material vegetal alvo de transformação, mas geralmente compreendem condições que favorecem o crescimento de células transformadas e inibem o crescimento de células não transformadas.

[073] Por exemplo: em modalidades representativas durante o processo de seleção, o material vegetal inoculado com Agrobacterium pode ser exposto a níveis subletais de um agente seletivo durante cerca de duas semanas a cerca de 12 semanas e para níveis letais do agente seletivo durante cerca de 4 semanas a cerca de 30 semanas, em um processo de seleção passo a passo.

[074] O ácido nucleico que codifica o marcador selecionável pode estar no mesmo cassete de expressão que a sequência de nucleotídeos de interesse ou pode ser cotransformado em um cassete de expressão distinto. Os marcadores selecionáveis e agentes de seleção são métodos conhecidos. Os exemplos de ácidos nucleicos não limitados de codificação dos marcadores selecionáveis usados rotineiramente na transformação incluem o ácido nucleico de codificação de nptII, que confere resistência à canamicina e antibióticos relacionados (Messing e Vierra (1982) Gene 19:259-268; Bevan et al. (1983) Nature 304:184187); ácido nucleico de codificação de bar, que confere resistência ao herbicida fosfinotricina (White et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18:1062; Spencer et al.(1990) Theor. Appl. Genet. 79:625-631); ácido nucleico de codificação de hph, que confere resistência ao antibiótico higromicina (Blochinger e Diggelmann (1984) Mol. Cell. Biol. 4:2929-2931); ácido nucleico de codificação de dhfr, que confere resistência ao metatrexato (Bourouis et al. (1983) EMBO J. 2(7):1099-1104); ácido nucleico de codificação de EPSPS, que confere resistência ao glifosato (Patente dos EUA N° 4.940.935 e 5.188.642) e o ácido nucleico de codificação de isomerase fosfomanose (PMI), que confere a capacidade de metabolizar manose (Patente dos EUA N° 5.767.378 e 5.994.629).

[075] Portanto, em algumas modalidades, a presente invenção fornece métodos de produção de tecido ou célula de cana-de-açúcar transformada que consiste em: inocular um tecido ou célula de cana-de- açúcar com Agrobacterium, em que o referido Agrobacterium consiste em um ácido nucleico de interesse para a obtenção de um tecido ou célula de cana-de-açúcar inoculada com Agrobacterium, em que o ácido nucleico de interesse consiste em um cassete de expressão que consiste em um ácido nucleico que confere resistência ao um agente de seleção; cocultivo do referido tecido ou célula de cana-de-açúcar inoculada com Agrobacterium em uma superfície na ausência de meio de cocultura por período de tempo suficiente para reduzir o peso original do referido tecido ou célula de cana-de-açúcar inoculada com Agrobacterium; seleção de um tecido ou célula de cana-de-açúcar transformada que consiste em um ácido nucleico de interesse, em que a seleção consiste no cultivo do referido tecido ou célula de cana-de- açúcar inoculada com Agrobacterium em um meio que consiste no referido agente de seleção e seleção de um tecido ou célula de cana de açúcar ou célula transformada que consiste em um ácido nucleico de interesse.

[076] O tecido ou célula vegetal que cresce na presença de um agente seletivo pode ser manipulado posteriormente para a regeneração de plantas. Conforme usado neste documento, "regenerar", "regeneração" e "regenerando" (e suas variações gramaticais) significam a formação de uma planta de várias partes da planta (por exemplo: explantes de plantas, tecidos de calos, células vegetais) que incluem um broto com raiz. A regeneração de plantas a partir de diversas partes da planta é um método bem conhecido. Consulte, por exemplo, Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach et al., ed. Academic Press, Inc. (1988); para regeneração de plantas de cana-de-açúcar, consulte, por exemplo, Arencibia et al. (Trans. Res. 7:213-222 (1998)); Elliot et al. (Plant Cell Rep. 18:707-714 (1999)); e Enriquez-Obregon et al. (Planta 206:20-27 (1998)). A regeneração de plantas que contém um ácido nucleico de interesse introduzido por Agrobacterium de explantes de folhas, por exemplo, pode ser obtida conforme descrito por Horsch et al. (1985) Science 227:1229-1231. De maneira resumida, os transformantes são cultivados na presença de um agente de seleção e em um meio que induz a regeneração de brotos (por exemplo: na cana-de-açúcar). Consulte, por exemplo, Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-4807. Este método normalmente produz brotos no intervalo de duas a quatro semanas e os brotos transformados são, em seguida, transferidos a um meio de indução de raiz apropriado contendo o agente seletivo e um antibiótico para evitar maior crescimento bacteriano. Normalmente, os brotos transformados que crescem na presença do agente seletivo para formar mudas são, em seguida, transplantados no solo ou outros meios para permitir a produção de raízes adicionais (para obter referências de regeneração de cana-de-açúcar, consulte Lakshmann et al. In Vitro Cell Devel Biol 41:345-363 (2005))

[077] As mudas transgênicas são, em seguida, propagadas no solo ou um substituto do solo para promover o crescimento em uma planta transgênica madura. A propagação de plantas transgênicas dessas mudas é feita, por exemplo, em perlite, turfa e areia (1:1:1) ou mistura para cultivo de plantas comercial em condições de estufa.

[078] Conforme descrito acima, os métodos de transformação da invenção preveem a introdução de um ácido nucleico de interesse em uma planta de cana-de-açúcar, parte da planta e/ou tecidos vegetais.

[079] "Introdução", no contexto de uma sequência de nucleotídeos de interesse, significa incorporar a sequência de nucleotídeos de interesse à planta, parte da planta ou tecido da planta de forma que a sequência de nucleotídeos tenha acesso ao interior de uma célula. Nos casos em que mais de uma sequência de nucleotídeos for introduzida, essas sequências de nucleotídeos podem ser montadas em parte como um polinucleotídeo simples ou construção de ácido nucleico ou como construções polinucleotídeas ou de ácido nucleico distintas, que podem estar localizadas nos mesmos vetores de transformação ou vetores distintos. Dessa maneira, os polinucleotídeos podem ser introduzidos em células de plantas de cana-de-açúcar em um evento de transformação único, em eventos de transformação distintos ou, por exemplo, como parte de um protocolo de criação.

[080] "Transformação transitória", no contexto de um polinucleotídeo, significa que um polinucleotídeo é introduzido na célula, mas não integra o genoma da célula.

[081] Os termos "introduzindo de forma estável" ou "introduzido (s) de forma estável" no contexto de um polinucleótido introduzido em uma célula referem-se ao polinucleótido introduzido, que é incorporado de forma estável no genoma da célula e, assim, a célula é transformada de maneira estável com o polinucleótido.

[082] "Transformação estável" ou "transformado de forma estável", conforme utilizados aqui, significam que um ácido nucleico é introduzido em uma célula e integra-se ao genoma da célula. Como tal, o ácido nucleico integrado é capaz de ser herdado através da descendência daí decorrente, mais especificamente, através da descendência de múltiplas gerações sucessivas. O genoma como utilizado neste documento também inclui o genoma plastídeo, incluindo, portanto, a integração do ácido nucleico, por exemplo, ao genoma do cloroplasto. A transformação estável, conforme aqui utilizada, também pode se referir a um transgene que é mantido extracromossomicamente, como, por exemplo, um minicromossomo.

[083] De acordo com os métodos da presente invenção, um ácido nucleico de interesse é introduzido em uma linhagem bacteriana competente para a transferência de ácido nucleico (por exemplo: uma cepa Agrobacterium) através de métodos convencionais de transformação e a linhagem bacteriana é, então, utilizada em métodos de transformação da invenção para introduzir o ácido nucleico de interesse em uma planta da cana-de-açúcar, parte da planta, tecido ou célula. Muitos vetores estão disponíveis para a transformação de Agrobacterium. Estes geralmente carregam, pelo menos, uma sequência de margens de T-DNA e incluem vetores, tais como o pBIN19 (Bevan, Nucleico Acids Res. 12:8711-8721 (1984)). Para a construção de vetores úteis na transformação de Agrobacterium, consulte, por exemplo, a Publicação de Patentes dos EUA N° 2006/0260011, aqui incorporada como referência em sua totalidade.

[084] A transformação de Agrobacterium típica envolve a transferência de um vetor binário que carrega o ácido nucleico externo de interesse até a cepa de Agrobacterium adequada que depende de genes vir carregados pela cepa Agrobacterium do hospedeiro, no plasmídeo do Ti corresidente ou cromossomicamente (Uknes et al. (1993) Plant Cell 5:159-169). A transferência do vetor de recombinação binária para Agrobacterium é realizada através de um procedimento de cruzamento entre três progenitores utilizando E. coli, que carrega o vetor binário de recombinação, uma cepa de E. coli auxiliar que carrega um plasmídeo e que é capaz de mobilizar o vetor binário de recombinação até a linha Agrobacteriana de destino. Alternativamente, o vetor binário de recombinação pode ser transferido para a Agrobacterium pela transformação do DNA (Hofgen e Willmitzer (1988) Nucleic Acids Res. 16:9877).

[085] Qualquer ácido nucleico de interesse pode ser transformado na linhagem Agrobacterium ou em outra linhagem bacteriana competente para a transferência de ácido nucleico para posterior transformação da cana-de-açúcar, utilizando os métodos da presente invenção. Em algumas modalidades, o ácido nucleico será um elemento do polinucleótido que compreende um cassete de expressão que apresenta elementos funcionais que permitem a expressão de um polinucleótido de interesse na cana-de-açúcar, após sua introdução através dos métodos de transformação mediados por Agrobacterium abordados na presente invenção.

[086] Um cassete de expressão pode compreender um ácido nucleico que codifica um polinucleótido que confere uma propriedade que pode ser utilizada para detectar, identificar ou selecionar células e tecidos vegetais transformados (por exemplo, um marcador para a seleção de células transformadas). O ácido nucleico que codifica o marcador pode estar no mesmo cassete de expressão que a sequência de nucleotídeos de interesse, ou pode ser cotransformada em um cassete de expressão separado. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica o marcador pode ser a sequência do nucleotídeo de interesse. Assim, em algumas modalidades da presente invenção, o ácido nucleico de interesse compreende um cassete de expressão que também compreende uma sequência de nucleotídeos que conferem resistência ao um agente de seleção e, dessa forma, a seleção compreende o cultivo do tecido ou da cana-de-açúcar inoculado por Agrobacterium ou da célula daí resultante, que compreende o ácido nucleico de interesse.

[087] Em outras modalidades, o ácido nucleico pode ser um elemento do polinucleótido que compreende um cassete de expressão que integra um polinucleótido funcional. Conforme utilizado neste documento, o termo "polinucleótido funcional" significa um polinucleótido que pode ser transcrito, mas não transmitido, a exemplo de um ácido nucleico inibitório.

[088] Os ácidos nucleicos inibitórios podem inibir a expressão de um polipeptídeo de interesse, tais como os descritos abaixo. Os ácidos nucleicos inibitórios podem inibir diretamente a expressão de um polipeptídio, evitando a transmissão de um RNA mensageiro que codifica o polipeptídio (por exemplo, supressão/cossupressão de sentido; supressão antissentido; interferência de RNA bicatenário (dsRNA) através de pequeno RNA de interferência, micro RNA ou RNA curto geminado; interferência mediada por amplicon e ribozimas). Em outras modalidades, os ácidos nucleicos podem codificar um polipeptídio que inibe a transcrição ou transmissão de uma sequência de ácido nucleico que codifica o polipeptídio de interesse. São conhecidos na técnica os métodos para inibição e eliminação da expressão de um produto do gene em células de mamíferos e quaisquer desses métodos podem ser utilizados na presente invenção para inibir a expressão do polipeptídio de interesse.

[089] Para supressão/cossupressão de sentido, um cassete de expressão pode ser projetado para representar um ácido nucleico de cossupressão correspondente a um ácido nucleico natural que codifica um polipeptídio de interesse na orientação do "sentido". O ácido nucleico de cossupressão corresponde a todo ou parte do ácido nucleico que codifica o polipeptídio de interesse, toda ou parte da região não traduzida de 5’ e/ou 3’ do ácido nucleico que codifica o polipeptídio de interesse, ou toda ou parte da sequência de codificação e regiões não traduzidas do ácido nucleico que codifica o polipeptídio de interesse. Em geral, o ácido nucleico de cossupressão pode compreender, pelo menos, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 ou 1.000 nucleotídeos, ou pode ser de qualquer tamanho, até, e inclusive, a sequência completa de ácidos nucleicos que codificam o polipeptídio de interesse. Onde o ácido nucleico de cossupressão compreende toda ou parte da região de codificação do polipeptídio de interesse, o cassete de expressão pode ser projetado para eliminar o códon de iniciação, de forma que nenhum polipeptídio de interesse seja transmitido a partir do ácido nucleico de cossupressão. A expressão excessiva do ácido nucleico pode resultar na expressão reduzida do ácido nucleico que codifica o polipeptídio de interesse.

[090] Para supressão antissentido, um cassete de expressão pode ser projetado para representar um ácido nucleico complementar de todo ou parte de um ácido nucleico natural que codifica o polipeptídio de interesse. O ácido nucleico antissentido pode corresponder a todo ou parte de um complemento do ácido nucleico que codifica o polipeptídio de interesse, todo ou parte de um complemento da região não traduzida de 5’ e/ou 3’ do ácido nucleico que codifica o polipeptídio de interesse, ou todo ou parte do complemento tanto da sequência de codificação quanto das regiões não traduzidas do ácido nucleico que codifica o polipeptídio de interesse. O ácido nucleico antissentido pode também ser totalmente complementar (ou seja, 100% idêntico ao complemento da sequência de ácidos nucleicos de destino) ou parcialmente complementar (ou seja, menos de 100% idêntico ao complemento da sequência de ácidos nucleicos de destino) para o ácido nucleico que codifica o polipeptídio de interesse. A expressão do ácido nucleico antissentido pode resultar na expressão reduzida do ácido nucleico que codifica o polipeptídio de interesse.

[091] Independentemente do tipo de ácido nucleico antissentido utilizado, podem ser utilizadas sequências de, no mínimo, 15 nucleotídeos, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 nucleotídeos ou mais.

[092] A eficiência da supressão antissentido pode ser aumentada incluindo uma região poli-dT no cassete de expressão, em uma posição de 3’ em relação à sequência antissentido e de 5’ do sinal de poliadenilação. Consulte a Publicação de Aplicações de Patentes dos EUA N° 2002/0048814.

[093] Para interferência de dsRNA, um ácido nucleico de sentido como o supracitado para cossupressão e um ácido nucleico antissentido, total ou parcialmente complementar à sequência de ácidos de sentido, são expressos na mesma célula, resultando na inibição da expressão de um ácido nucleico natural que codifica o polipeptídio de interesse. A expressão dos ácidos nucleicos de sentido e antissentido pode ser obtida projetando um cassete de expressão que compreenda tanto as sequências de sentido quanto as de antissentido para o ácido nucleico que codifica o polipeptídio de interesse. Opcionalmente, podem ser utilizados cassetes de expressão separados para ácidos nucleicos de sentido e de antissentido.

[094] Independentemente do tipo de ácido nucleico utilizado para interferência de dsRNA, podem ser utilizadas sequências de, no mínimo, 15 nucleotídeos, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 nucleotídeos ou mais.

[095] Para interferência okmediada por amplicon, um elemento de expressão do amplicon pode ser projetado com uma sequência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência derivada de vírus, que contenha todo ou parte de um ácido nucleico natural que codifica o polipeptídio de interesse. As sequências virais presentes no produto de transcrição do cassete de expressão do amplicon permitem que o produto de transcrição oriente sua própria replicação. As transcrições produzidas pelo amplicon podem ser de sentido ou antissentido, relativas à sequência de ácidos nucleicos naturais que codificam o polipeptídio de interesse.

[096] Independentemente do tipo de ácido nucleico utilizado para interferência mediada por amplicon, podem ser utilizadas sequências de, no mínimo, 15 nucleotídeos, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 nucleotídeos ou mais.

[097] Para ribozimas, um elemento de expressão pode ser projetado para representar um ácido nucleico com atividade catalítica em relação a um mRNA expresso por uma sequência de ácidos nucleicos naturais que codificam o polipeptídio de interesse. O ácido nucleico catalítico causa a degradação do mRNA ou do ácido nucleico que codifica o polipeptídio de interesse.

[098] Independentemente do tipo de ácido nucleico utilizado para ribozimas, podem ser utilizadas sequências de, no mínimo, 15 nucleotídeos, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 nucleotídeos ou mais.

[099] Para interferência de micro RNA (miRNA), um elemento de expressão pode ser projetado para representar um ácido nucleico complementar a uma sequência de ácidos nucleicos naturais que codificam o polipeptídio de interesse, de tal forma que o miRNA é transcrito, mas não traduzido para dentro do polipeptídio de interesse. Cada transcrição primária (uma pri-miRNA) é processada em uma estrutura de laços curtos em forma de haste, denominada pré-miRNA e, finalmente, em um miRNA funcional. As miRNAs consistem em cerca de 22 a 23 ribonucleotídeos. As miRNAs maduras são altamente eficientes na inibição da expressão do ácido nucleico que codifica o polipeptídio de interesse. Como as mRNAs são parcialmente complementares a um ou mais ácidos nucleicos que codificam o polipeptídio de interesse, elas sub-regulam a expressão do gene, inibindo a transmissão ou, às vezes, facilitando a clivagem dos ácidos nucleicos que codificam o polipeptídio de interesse.

[0100] Para interferência de RNA curto geminado (miRNA), um cassete de expressão pode ser projetado para representar um ácido nucleico complementar a um ácido nucleico natural que faz um giro apertado geminado que pode ser utilizado para neutralizar a expressão do gene através da interferência do RNA. A interferência de shRNA também pode ser do tipo RNA geminado de sequência intrínseca (ihpRNA), na qual o cassete de expressão pode ser projetado para representar um ácido nucleico que codifica o RNA de junção intrínseca com a estrutura geminada.

[0101] Independentemente do tipo de shRNA utilizado, podem ser utilizadas sequências de, no mínimo, 15 nucleotídeos, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 nucleotídeos ou mais.

[0102] O cassete de expressão da interferência de shRNA também pode ser projetado de tal forma que as sequências de sentido e antissentido não correspondam à sequência de ácidos nucleicos que codificam o polipeptídio de interesse. Em vez disso, as sequências de sentido e antissentido flanqueiam uma sequência de laços que compreende um sequência de nucleotídeos correspondente a toda ou parte da sequência de ácidos nucleicos que codificam o polipeptídeo de interesse. Assim, a região de laços determina a especificidade da interferência de RNA. Consulte, por exemplo, a Publicação de Aplicações de Patentes Internacionais N° WO 02/00904.

[0103] Além disso, o silenciamento transcricional do gene (TGS) pode ser obtido através do uso de moléculas de shRNA, nas quais seja silenciada uma repetição inversa da identidade sequencial de compartilhamentos geminados com a região promotora de um ácido nucleico que codifica o polipeptídeo de interesse. O processamento do shRNA para RNAs curtos que podem interagir com a região promotora homóloga pode desencadear a degradação ou metilação que resulta no silenciamento (consulte, por exemplo, Aufsatz et al Proc. Natl. Acad. Sci. 99: 16499-16506 (2002) e Mette et al Embo J. 19: 5194-5201 (2000)).

[0104] Os métodos da invenção compreendem, portanto, a transformação de tecido vegetativo ou de uma célula a partir daí, com um ou mais moléculas de ácido nucleico de interesse. Em algumas modalidades, o ácido nucleico envolve um cassete de expressão que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo de interesse e/ou polinucleótido funcional de interesse. Conforme utilizado neste documento, o termo "cassete de expressão" significa um ácido nucleico capaz de direcionar a expressão de uma sequência específica de nucleotídeos em uma célula da cana-de- açúcar, compreendendo um promotor vinculado operacionalmente à sequência de nucleotídeos de interesse, que é vinculada operacionalmente a sinais de terminações. Tipicamente, isso também compreende sequências necessárias à transmissão adequada de uma sequência de nucleotídeos de interesse. A região de codificação normalmente codifica um polipeptídeo de interesse, mas também pode codificar um RNA funcional de interesse, por exemplo, o RNA de antissentido ou um RNA de não-transmissão, na direção de sentido ou antissentido. O cassete de expressão que compreende a sequência de nucleotídeos de interesse pode ser quimérica, significando que, pelo menos, um de seus componentes é heterólogo com relação a, pelo menos, um de seus outros componentes. O cassete de expressão também pode ser aquele que ocorre naturalmente (por exemplo, derivado da cana-de-açúcar), que, em algumas modalidades, foi obtido em uma forma de recombinação útil à expressão heteróloga. Tipicamente, contudo, o cassete de expressão é heterólogo com relação à planta de cana-de-açúcar, por exemplo, a sequência específica de DNA do cassete de expressão não ocorre naturalmente em uma planta de cana-de-açúcar e deve ser introduzido nessa planta ou em um ancestral da planta de cana-de-açúcar, através de um evento de transformação. A expressão da sequência de nucleotídeos de interesse no cassete de expressão pode estar sob o controle de um promotor constitutivo ou de um promotor induzível que inicia a transcrição apenas quando a planta da cana-de-açúcar, tecido ou célula é exposta a algum estímulo externo específico. Além disso, o promotor pode também ser exclusivo ou preferencialmente expresso em células específicas, tecidos específicos ou órgãos específicos, ou exclusivo ou preferencialmente expresso em um estágio específico do desenvolvimento.

[0105] O cassete de expressão pode se inserir na direção da transcrição de 5'-3', na região de iniciação transcricional ou transmissional (isto é, um promotor) e de um polinucleótido de interesse. O cassete de expressão pode, alternativamente, compreender uma região de terminações transcricionais ou transmissionais (isto é, a região de terminações), que é funcional nas plantas. Em algumas modalidades, o cassete de expressão compreende, também, uma sequência de nucleotídeos que codifica um ácido nucleico que confere resistência ao agente de seleção (por exemplo, o ácido nucleico do marcador selecionável), que permite a seleção de transformantes estáveis. Em modalidades ainda mais detalhadas, os elementos de expressão da invenção também podem compreender uma sequência piloto e/ou uma sequência que permite a expressão induzível do polinucleótido de interesse. Consulte, Guo et al. ((2003) Plant J. 34:38392) e Chen et al. ((2003) Plant J. 36:731-40) para ver exemplos de sequências que permitem a expressão induzível.

[0106] As sequências reguladoras do elemento de expressão são vinculadas operacionalmente ao polinucleótido de interesse. Conforme utilizado neste documento, o termo "vinculada operacionalmente", ao referir-se a uma primeira sequência de ácidos nucleicos que esteja vinculada operacionalmente a uma segunda sequência de ácidos nucleicos, significa uma situação em que a primeira sequência de ácidos nucleicos é colocada em uma relação funcional com a uma segunda sequência de ácidos nucleicos. Por exemplo, um promotor é vinculado operacionalmente a uma sequência de codificação se o promotor afeta a transcrição ou expressão da sequência de codificação. Geralmente, as sequências de ácidos nucleicos vinculadas operacionalmente são contíguas e, onde necessário para juntar duas regiões de codificação de proteínas, os quadros abertos de leitura ficam alinhados.

[0107] Qualquer promotor capaz de orientar a expressão na planta de interesse pode ser utilizado na prática da invenção. O promotor pode ser natural ou análogo, externo ou heterólogo, para a planta de cana- de-açúcar na qual será introduzido o cassete de expressão. Os termos "heterólogo" e "exógeno", conforme utilizados aqui para denominarem uma sequência de ácidos nucleicos (por exemplo, uma sequência de DNA ou RNA), referem-se a uma sequência que é derivada de uma fonte extrínseca à planta específica (por exemplo, extrínseca à planta da cana-de-açúcar) ou, caso seja da mesma fonte, que seja modificada a partir de sua forma original. Assim ocorre, por exemplo, com um ácido nucleico heterólogo de uma célula da cana-de-açúcar que seja endógeno para uma célula específica, mas que foi modificado, por exemplo, através do uso da inversão do DNA. Os termos ácido nucleico "heterólogo" ou "exógeno" incluem, também, cópias múltiplas que ocorrem de forma não natural a partir de uma sequência de DNA que ocorre naturalmente. Dessa forma, estes termos referem-se ao segmento de DNA que é extrínseco ou heterólogo à célula, ou homólogo à célula da cana-de-açúcar, mas em uma posição dentro do genoma da célula no qual o elemento não é normalmente encontrado. Os segmentos exógenos/heterólogos de DNA são expressos para produzirem polipeptídeos exógenos/heterólogos ou polinucleótidos funcionais.

[0108] Uma sequência "homóloga" de ácido nucleico é uma sequência de ácidos nucleicos (por exemplo, DNA ou RNA) naturalmente associada à célula da cana-de-açúcar na qual é introduzida.

[0109] A escolha de promotores a serem incluídos em um cassete de expressão depende de vários fatores, inclusive, mas não limitados à eficiência, seletividade, indutibilidade, nível de expressão desejado e expressão preferencial por célula ou tecido. É uma questão de rotina de habilidade na arte de moldar a expressão de uma sequência vinculada operacionalmente, ao selecionar e posicionar adequadamente promotores e outras regiões reguladoras relacionadas a essa sequência.

[0110] Alguns promotores adequados iniciam a transcrição, apenas ou predominantemente, em certos tipos de célula. Assim, conforme aqui descrito, um promotor preferencial de tecido ou tipo de célula é aquele que orienta a expressão preferencialmente para o tecido alvo da cana- de-açúcar, mas também pode direcionar a alguma expressão de outros tipos de células ou tecidos. Os métodos de identificação e caracterização de regiões de promotores no DNA do genoma das plantas incluem, por exemplo, aqueles descritos nas seguintes referências: Jordano et al. (1989) Plant Cell 1:855-866; Bustos et al. (1989) Plant Cell 1:839-854; Green et al. (1988) EMBO J. 7:4035-4044; Meier et al. (1991) Plant Cell 3:309-316; e Zhang et al. (1996) Plant Physiology 110:1069-1079.

[0111] São também contemplados na presente invenção os promotores que atuam no tecido fotossintético para orientarem a transcrição em tecidos verdes, tais como folhas e caules. Os promotores mais adequados são aqueles que orientam a expressão, apenas ou predominantemente, em tais tecidos. O promotor pode conferir a expressão constitutivamente através da planta ou diferencialmente com relação aos tecidos verdes, ou diferencialmente com relação ao estágio de desenvolvimento do tecido verde no qual ocorre a expressão ou, ainda, em resposta a estímulos externos.

[0112] Exemplos de tais promotores incluem os promotores de carboxilase de bifosfato-1,5 de ribulose (RbcS) tais como o promotor RbcS do lariço-oriental (Larix laricina), o promotor cab6 do pinheiro (Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35:773-778), o promotor Cab-1 do trigo (Fejes et al. (1990) Plant Mol. Biol. 15:921-932), o promotor CAB-1 do espinafre (Lubberstedt et al. (1994) Plant Physiol. 104:997-1006), o promotor cab1R do arroz (Luan et al. (1992) Plant Cell 4:971-981), o promotor piruvato-ortofosfato diquinase (PPDK) do milho (Matsuoka et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:9586-9590), o promotor Lhcb1*2 do tabaco (Cerdan et al. (1997) Plant Mol. Biol. 33:245-255), o promotor simporte de sacarose-H+SUC2 (Truernit et al. (1995) Planta 196:564-570) e os promotores de proteínas da membrana tilacoide do espinafre (psaD, psaF, psaE, PC, FNR, atpC, atpD, cab, rbcS). Outros promotores que direcionam a transcrição em caules, folhas e no tecido verde são descritos na Publicação de Patentes dos EUA N° 2007/0006346, aqui incorporadas como referência em sua versão integral.

[0113] Um ácido nucleico do milho que codifica a carboxilase de fosfofenol (PEPC) foi descrito por Hudspeth e Grula (1989), em Plant Molec. Biol 12:579-589. Utilizando técnicas de biologia molecular, o promotor deste ácido nucleico pode ser utilizado para direcionar a expressão de qualquer ácido nucleico de forma específica para tecidos verdes de plantas transgênicas.

[0114] Em algumas outras modalidades da presente invenção, podem ser necessários promotores induzíveis. Os promotores induzíveis direcionam a transcrição em resposta a estímulos externos, tais como agentes químicos ou estímulos ambientais. Por exemplo, os promotores induzíveis podem conferir a transcrição em resposta a hormônios, tais como o ácido giberélico ou etileno, ou em resposta à luz ou à aridez.

[0115] Uma variedade de terminadores transcricionais estão disponíveis para uso opcional em cassetes de expressão. Estes são responsáveis pela terminação da transcrição além da região de codificação de um polinucleótido de interesse dentro do cassete de expressão e pela correta poliadenilação do mRNA. A região de terminação pode ser natural com a região de iniciação transcricional, pode ser natural com a sequência de interesse do DNA vinculado operacionalmente, pode ser natural com a planta de cana-de-açúcar ou pode ser derivado de outra fonte (ou seja, extrínseca ou heteróloga ao promotor, à sequência de interesse do DNA, à planta de cana-de-açúcar ou a qualquer combinação delas decorrente). Os terminadores transcricionais adequados são aqueles conhecidos por funcionarem em plantas e incluem o terminador CAMV 35S, o terminador tml, o terminador da nopalina sintetase e o terminador rbcs E9 da ervilha. Além disso, pode ser utilizado o terminador da transcrição natural de qualquer gene.

[0116] Foram descobertas inúmeras sequências para aumentar a expressão do gene a partir do interior da unidade transcricional e estas sequências podem ser utilizadas em conjunto com os cassetes de expressão desta invenção, a fim de aumentar a expressão de um polinucleótido de interesse em plantas de cana-de-açúcar e partes da planta a partir daí.

[0117] Várias sequências íntron foram mostradas para aumentar a expressão, especificamente em células monocotiledônicas. Descobriu- se que o íntron 1 do ácido nucleico que codifica a desidrogenase do álcool do milho era especialmente eficaz e aumentava a expressão em elementos de fusão com o ácido que codifica a acetiltransferase de cloranfenicol (Callis et al. (1987) Genes Develop. 1:1183-1200). As sequências de íntron foram naturalmente incorporadas aos vetores de transformação da planta, tipicamente dentro da guia não traduzida.

[0118] Também se sabe que algumas sequências de guias não traduzidas derivadas de vírus aumentam a expressão e estas já estão incluídas neste documento. Especificamente, mostrou-se que as sequências guias do Vírus do Mosaico do Tabaco (TMV, a "sequência- Q"), Vírus do Mosqueado Clorótico do Milho (MCMV) e Vírus do Mosaico da Alfafa (AMV) foram eficazes no aumento da expressão (consulte, por exemplo, Gallie et al. (1987) Nucleic Acids Res.15:8693-8711; Skuzeski et al. (1990) Plant Molec. Biol. 15:65-79). Outras sequências guias conhecidas na técnica incluem, entre outros, guias de picomavírus, por exemplo, guia de EMCV (região de não codificação de encefalomiocardite 5') (Elroy-Stein et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6126-6130); guias de potivírus, por exemplo, guia TEV (Vírus Erch do Tabaco) (Allison et al. (1986) Virology 154:9-20; e Gallie et al. (1995) Gene 165:233-238); guia MDMV (Vírus do Mosaico Comum do Milho, Allison et al. (1986) Virology 154:9-20); guia da proteína de ligação da cadeia pesada de imunoglobulina humana (BiP) (Macejak e Samow (1991) Nature 353:90-94); guia não transmitida da proteína de revestimento mRNA do vírus do mosaico da alfafa (AMV RNA 4) (Jobling et al. (1987) Nature 325:622-625); guia do vírus do mosaico do tabaco (TMV; Gallie et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:3257-3273; Gallie et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:883-893; Gallie et al. (1992) Nucleic Acids Res. 20:4631-4638); e guia do Vírus de Mosqueado Clorótico do Milho (MCMV; Lommel et al. (1991) Virology 81:382-385). Consulte, também: Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiology 84:965-968.

[0119] Sabe-se que existem vários mecanismos de abordagem seletiva de produtos relacionados aos genes de plantas e as sequências que controlam o funcionamento destes mecanismos foram caracterizadas em detalhes. Por exemplo, a abordagem seletiva de produtos relacionados aos genes do cloroplasto é controlada por uma sequência de sinais descoberta na extremidade terminal de aminos de várias proteínas, que é clivada durante a importação de cloroplasto para dar origem à proteína madura (consulte, por exemplo, Comai et al. (1988) J. Biol. Chem. 263:15104-15109). Estas sequências de sinais podem ser fundidas em produtos de genes heterólogos para influenciarem a importação de produtos heterólogos em relação ao cloroplasto (van den Broeck et al. (1985) Nature 313:358-363). A codificação de DNA de sequências adequadas de sinais pode ser isolada a partir da extremidade 5' de cDNAs que codificam a proteína RUBISCO, a proteína CAB, a enzima de sintetase EPSP, a proteína GS2 e muitas outras proteínas que se conhecem localizadas no cloroplasto. Consulte, também, a seção intitulada "Expression with Chloroplast Targeting" no Exemplo 37 da Patente dos EUA N° 5.639.949.

[0120] As sequências de abordagens seletivas acima descritas podem ser utilizadas não apenas em conjunto com seus promotores endógenos, mas também em conjunto com promotores heterólogos. O uso de promotores que são heterólogos na sequência de abordagens seletivas não apenas proporciona a habilidade de selecionar a sequência, mas também pode fornecer o padrão de expressão que é diferente daquele do promotor a partir do qual se origina o sinal da abordagem seletiva.

[0121] A fim de assegurar a localização dos plastídeos, é concebível utilizar um peptídeo de trânsito que inclui, mas não se limita ao peptídeo da Ferrodoxina plastídica: NADP+ oxidorredutase (FNR) do espinafre, que é divulgada em Jansen et al. (1988) Current Genetics 13:517-522. Especificamente, pode ser utilizada a sequência que vai dos nucleotídeos -171 até 165 da sequência do cDNA, divulgada neste documento, que compreende a região não traduzida de 5', bem como a sequência que codifica o peptídeo de trânsito. Outro exemplo de um peptídeo de trânsito é aquele da proteína parafinada do milho, inclusive os primeiros 34 resíduos de aminoácidos da proteína parafinada madura (Klosgen et al. (1989) Mol. Gen. Genet. 217:155-161). Também é possível utilizar este peptídeo de trânsito sem os primeiros 34 aminoácidos da proteína madura. Além disso, a pequena subunidade dos peptídeos sinalizadores da carboxilase de bifosfato de ribulose (Wolter et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:846-850; Nawrath et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:12760-12764), da malato desidrogenase de NADP (Galiardo et al. (1995) Planta 197:324-332), de redutase de glutationa (Creissen et al. (1995) Plant J. 8:167-175) e/ou da proteína R1 (Lorberth et al. (1998) Nature Biotechnology 16:473-477) pode ser utilizada.

[0122] O ácido nucleico de interesse a ser introduzido em um tecido vegetal ou célula equivalente da cana-de-açúcar utilizando os métodos de transformação mediados por Agrobacterium da presente invenção pode abranger um cassete de expressão que codifica qualquer polipeptídeo de interesse. Os exemplos ilimitados de polipeptídeos de interesse que são adequados para expressão da cana-de-açúcar incluem aqueles resultantes de características agronomicamente importantes, tais como a resistência a herbicidas, resistência a vírus, resistência a patogenias bacterianas, resistência a insetos, resistência a nematódeos e resistência a fungos. Consulte, por exemplo, Patente dos EUA N° 5.569.823; 5.304.730; 5.495.071; 6.329.504; e 6.337.431. Outros exemplos ilimitados de um polipeptídeo de interesse podem também ser os que resultam de aumentos na força ou produção da planta (inclusive polipeptídeos que permitem que a planta cresça em diferentes temperaturas, condições de solo e níveis de luz solar e precipitação) ou aqueles que permitem a identificação de uma planta que exibe uma característica de interesse (por exemplo, marcador selecionável, cor do revestimento da semente, etc.).

[0123] Em algumas modalidades, a cana-de-açúcar transformada mostra resistência a um herbicida. Alguns ácidos nucleicos estão disponíveis, tanto transgênicos quanto não-transgênicos, que conferem resistência a herbicidas. A resistência a herbicidas às vezes é também denominada tolerância a herbicidas. Pode ser adequando um ácido nucleico que confere resistência a um herbicida que inibe o ponto de crescimento ou meristema, tais como uma imidazalinona ou uma sulfonilureia. Exemplos de ácidos nucleicos deste código de categoria de enzimas mutantes ALS e AHAS conforme descritas, por exemplo, nas Patentes dos EUA N° 5.767.366 e 5.928.937. Patentes dos EUA N° 4.761.373 e 5.013.659 são direcionadas a plantas resistentes a vários herbicidas de imidazolinona ou sulfonamida. A Patente dos EUA N° 4.975.374 refere-se a células vegetais e plantas que contêm um ácido nucleico que codifica uma sintetase mutante de glutamina (GS) resistente à inibição por herbicidas que atuam na GS, por exemplo, fosfinotricina e sulfoximina de metionina. A Patente dos EUA N° 5.162.602 divulga plantas resistentes à inibição pelos herbicidas da ciclo-hexanediona e do ácido ariloxifenoxipropanoico. A resistência é conferida por uma carboxilase alterada pela acetil-coenzima A (ACCase).

[0124] Também são adequados os ácidos nucleicos que conferem resistência ao glifosato. Consulte, por exemplo, a Patente dos EUA N° 4.940.835 e a Patente dos EUA N° 4.769.061. A Patente dos EUA N° 5.554.798 divulga plantas de milho resistentes ao glifosato transgênico, cuja resistência é conferida por um ácido nucleico de sintase de 5- enolpiruvil-3-fosfoshikimato (EPSP).

[0125] Também são adequados os ácidos nucleicos que codificam para resistência a fosfono-compostos, tais como a amônia de glufosinato ou a fosfofinotricina e os ácidos piridinóxi ou fenóxi- propiônicos. Consulte, Pedido de Patente Europeia N° 0 242 246. Consulte também, Patente dos EUA N° 5.879.903, 5.276.268 e 5.561.236.

[0126] Outros herbicidas adequados incluem os que inibem a fotossíntese, tais como uma triazina e um benzonitrilo (nitrilase). Consulte, Patente dos EUA N° 4.810.648. Outros herbicidas adequados incluem o ácido dicloropropiônico-2,2, setoxidina, aloxifop, herbicidas imidazolinona e sulfonilureia, triazolopirimidina, herbicidas s-triazina e bromoxinil. Também adequados são os ácidos nucleicos que conferem resistência a uma enzima protox ou fornecem resistência reforçada à doenças de plantas, tolerância reforçada a condições ambientais adversas (pressões abióticas), inclusive, mas não limitadas à aridez, frio excessivo, calor excessivo ou salinidade excessiva do solo, além de acidez ou alcalinidade e alterações na arquitetura ou desenvolvimento da planta, inclusive alterações na cronologia do desenvolvimento. Consulte, por exemplo, a Publicação de Patente dos EUA N° 2001/0016956 e a Patente dos EUA N° 6.084.155.

[0127] As proteínas inseticidas úteis para a invenção podem ser expressas em um volume suficiente para controlar pragas de insetos, ou seja, volumes de controle de insetos. Reconhece-se que o volume de expressão da proteína inseticida em uma planta que é necessário para controlar os insetos pode variar, dependendo do cultivo da cana- de-açúcar, tipo de inseto, fatores ambientais, entre outros. Os ácidos nucleicos úteis para conferir resistência a pragas ou insetos incluem, por exemplo, ácidos nucleicos que codificam toxinas identificadas em organismos como os Bacilos. Ácidos nucleicos que codificam toxinas do Bacillus thuringiensis (Bt) a partir de várias subespécies foram clonados e descobriu-se que os clones recombinados eram tóxicos para as larvas de insetos lepidopteran, dipteran e coleopteran (por exemplo, ácidos nucleicos que codificam várias delta-endotoxinas, tais como Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1B, Cry1C, Cry1D, Cry1Ea, Cry1Fa, Cry3A, Cry9A, Cry9C e Cry9B; bem como ácidos nucleicos que codificam proteínas inseticidas de vegetais, tais como Vip1, Vip2 e Vip3). Uma lista completa de toxinas Bt pode ser encontrada no Banco de Dados da Nomenclatura de Toxinas Bacillus thuringiensis na Internet, mantido pela Universidade de Sussex (consulte também, Crickmore et al. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:807-813).

[0128] O polipeptídeo de interesse também pode ser útil para controlar uma ampla variedade de pragas, inclusive, mas não limitadas ao Ustilago scitaminea, o vírus do mosaico da cana-de-açúcar, o Eldana saccharina, o Diatraea saccharalis, o vírus do milho-miúdo, etc.

[0129] Os polipeptídeos de interesse que são adequados para expressão na cana-de-açúcar também incluem aqueles que melhoram, ou melhor, facilitam a conversão da cana-de-açúcar colhida em um produto comercialmente útil, por exemplo, distribuição e/ou conteúdo alterado ou aumentado, propriedades de fermentação melhoradas, maior conteúdo de óleo, conteúdo de proteína aumentado, digestibilidade melhorada e conteúdo nutracêutico aumentado, por exemplo, conteúdo de fitosterol aumentado, conteúdo de tocoferol aumentado, conteúdo de estanol aumentado ou conteúdo de vitaminas aumentado. Os polipeptídeos de interesse também incluem, por exemplo, aqueles resultantes ou que contribuem para um conteúdo reduzido de um componente não desejado de uma colheita, por exemplo, ácido fítico ou enzimas de degradação do açúcar. O termo "resultantes em" ou "que contribuem para" significam que o polipeptídeo de interesse pode contribuir direta ou indiretamente para a existência de uma característica de interesse (por exemplo, degradação progressiva de celulose através da expressão heteróloga de uma enzima de celulase).

[0130] Em uma modalidade, o polipeptídeo de interesse contribui para uma digestibilidade melhorada da alimentação ou durante o consumo. Xilanases são enzimas hemicelulolíticas que melhoram a desagregação das paredes de células vegetais, o que leva à melhor utilização dos nutrientes da planta pelo animal. Isto leva a uma taxa de crescimento melhorada e à conversão da alimentação. Além disso, a viscosidade de alimentos que contêm xilano pode ser reduzida. A expressão de xilanases em células vegetais também pode atuar potencialmente para facilitar a conversão lignocelulósica em açúcares fermentáveis no processamento industrial.

[0131] Inúmeras xilanases de micro-organismos fúngicos e bacterianos foram identificadas e caracterizadas (consulte, por exemplo, a Patente dos EUA N° 5.437.992; Coughlin et al. (1993) "Proceedings of the Second TRICEL Symposium on Trichoderma reesei Cellulases and Other Hydrolases," Espoo; Souminen e Reinikainen, eds. (1993) Foundation for Biotechnical and Industrial Fermentation Research 8:125-135; Publicação de Patente dos EUA N° 2005/0208178; e WO 03/16654). Em particular, três xilanases específicas (XYL-I, XYL- II e XYL-III) foram identificadas em T. reesei (Tenkanen et al. (1992) Enzyme Microb. Technol. 14:566; Torronen et al. (1992) Bio/Technology 10:1461; e Xu et al. (1998) Appl. Microbiol. Biotechnol. 49:718).

[0132] Em uma outra modalidade, o polipeptídeo de interesse é um polissacarídeo que degrada a enzima. Tais plantas podem ser úteis na geração, por exemplo, da fermentação de matérias-primas para bioprocessamento. Em algumas modalidades, as enzimas úteis no processo de fermentação incluem alfa-amilases, proteases, pululanases, isoamilases, celulases, hemicelulases, xilanases, ciclodextrino glicotransferases, lipases, fitases, lacoses, oxidases, esterases, cutinases, enzima da hidrólise do amido granular e outras glucoamilases.

[0133] As enzimas de degradação de polissacarídeos incluem, sem limitação: enzimas de degradação do amido tais como a-amilases (EC 3.2.1.1), glucuronidases (E.C. 3.2.1.131); exo-1,4-a-D glucanases, tais como amiloglucosidases e glucoamilase (EC 3.2.1.3), β-amilases (EC 3.2.1.2), a-glucosidases (EC 3.2.1.20) outras exoamilases; e enzimas de decomposição do amido, tais como a) isoamilase (EC 3.2.1.68), pululanase (EC 3.2.1.41) e similares; b) celulases, tais como exo-1,4-3- celobiohidrolase (EC 3.2.1.91), exo-1,3-β-D-glucanase (EC 3.2.1.39), β- glucosidase (EC 3.2.1.21); c) L-arabinases, tais como endo-1,5-a-L- arabinase (EC 3.2.1.99), a-arabinosidases (EC 3.2.1.55) e similares; d) galactanases, tais como endo-1,4-β-D-galactanase (EC 3.2.1.89), endo- 1,3-β-D-galactanase (EC 3.2.1.90), a-galactosidase (EC 3.2.1.22), β- galactosidase (EC 3.2.1.23) e similares; e) mananases, tais como endo- 1,4-β-D-mananase (EC 3.2.1.78), β-manosidase (EC 3.2.1.25), a- manosidase (EC 3.2.1.24) e similares; f) xilanases, tais como endo-1,4- β-xilanase (EC 3.2.1.8), β-D-xilosidase (EC 3.2.1.37), 1,3-β-D-xilanase , e similares; g) outras enzimas, tais como a-L-fucosidase (EC 3.2.1.51), a-L-ramnosidase (EC 3.2.1.40), levanase (EC 3.2.1.65), inulanase (EC 3.2.1.7) e similares.

[0134] Outras enzimas adicionais que podem ser utilizadas incluem as proteases, tais como as proteases fúngicas e bacterianas. As proteases fúngicas incluem, por exemplo, aquelas obtidas a partir da Aspergillus, Trichoderma, Mucor e Rhizopus, tais como A. niger, A. awamori, A. oryzae e M. miehei. De especial interesse na presente invenção são as enzimas celobio-hidrolase (CBH) (EC 3.2.1.91). Em uma modalidade, a enzima celobiohidrolase é CBH1 ou CBH2.

[0135] Outras enzimas incluem, mas não se limitam a hemicelulases, tais como manases e arabinofuranosidases (EC 3.2.1.55); ligninases; lipases (por exemplo, E.C. 3.1.1.3), glucose oxidases, pectinases, xilanases, transglucosidases, alfa 1,6 glucosidases (por exemplo, E.C. 3.2.1.20); esterases, tais como a esterase do ácido ferúlico (EC 3.1.1.73) e as esterases de acetilxilano (EC 3.1.1.72); e as cutinases (por exemplo, E.C. 3.1.1.74).

[0136] Também será reconhecido que a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo de interesse pode ser otimizada para expressão amplificada na célula da cana-de-açúcar. Ou seja, as sequências de nucleotídeos podem ser sintetizadas utilizando os códons preferidos da cana-de-açúcar para uma expressão melhorada ou podem ser sintetizadas utilizando os códons em uma frequência de uso de códons preferidos para a cana-de-açúcar. Geralmente, o conteúdo de GC da sequência de nucleotídeos será aumentado. Consulte, por exemplo, Campbell e Gowri (1990) Plant Physiol. 92:1-11 para uma discussão sobre o uso do códon preferido do hospedeiro. Estão disponíveis os métodos da técnica de sintetizar genes preferidos de plantas. Consulte, por exemplo, Patente dos EUA N° 5.380.831 e 5.436.391 e Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498, aqui incorporados como referência.

[0137] Após construir um ácido nucleico de interesse, por exemplo, um que compreende um cassete de expressão aqui descrito, o elemento é incorporado à Agrobacterium ou outra bactéria competente para a transferência do ácido nucleico, conforme descrito aqui e, depois, introduzido em uma planta, parte da planta ou célula vegetal por inoculação e cocultivo, de acordo com os métodos de transformação aqui revelados.

[0138] Conforme descrito abaixo, algumas modalidades da presente invenção levam à regeneração de plântulas e plantas verdes com capacidade fotossintética. O teste utilizado para confirmação de que a sequência de nucleotídeos de interesse está integrada de forma estável ao genoma da planta de cana-de-açúcar depende da propriedade a ser conferida a essa planta. Por exemplo, quando a propriedade é a resistência a herbicidas, a confirmação pode ser obtida através do tratamento de plantas em crescimento, borrifando ou pintando as folhas com o herbicida em uma concentração que seja letal para plantas de controle que não foram submetidas ao processo de transformação.

[0139] Onde o ácido nucleico transferido codifica um polipeptídeo de interesse, a expressão desse polipeptídeo na planta da cana-de- açúcar transformada pode ser detectada utilizando um método imunológico. Os métodos imunológicos que podem ser utilizados incluem, mas não se limitam a sistemas de determinação competitivos e não competitivos que utilizam técnicas baseadas na imunidade, tais como Western blots, determinações radioimunológicas, ELISA (ensaio de imunoabsorção ligado a enzima), multiplex ELISA, imunodeterminações "sanduíche", determinações de imunoprecipitação, reações de precipitina, reações de precipitina com difusão de gel, determinações de imunodifusão, determinações de aglutinação, determinações de fixação de complementos, determinações imunorradiométricas, imunodeterminações fluorescentes, imunodeterminações da proteína A e similares. Tais determinações são comuns e conhecidas na técnica (consulte, por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1 (Ausubel et al., eds. John Wiley e Sons, Inc., New York (1994)), que é incorporado aqui como referência em sua totalidade).

[0140] Em modalidades adicionais da presente invenção, a expressão pode ser medida avaliando padrões de expressão do polinucleótido que codifica o polipeptídeo de interesse ou dos genes relatados, ou de ambos. Por exemplo, os padrões de expressão podem ser avaliados pela análise Setentrional, reação em cadeia da polimerase (PCR), transcrição reversa PCR (RT-PCR), determinação da expressão de genes Taq Man (Applied Biosystems, Inc; Foster City, CA), determinações de proteção de ribonuclease, detecção da transferência de energia por ressonância fluorescente (FRET), monitoramento de um ou mais embalizamentos moleculares, hibridização para uma série de oligonucleotídeos, hibridização para uma série de cDNA, hibridização para uma série de polinucleótidos, hibridização para uma microssérie líquida, hibridização para uma série microelétrica, sequenciamento de cDNA, hibridização de clones, impressão digital de fragmentos de cDNA e similares. O método específico escolhido será dependente de tais fatores como a quantidade de RNA recuperada, preferência artesanal, reagentes e equipamentos disponíveis, detectores e similares. Tais determinações são comuns e conhecidas na técnica (consulte, por exemplo, Ausubel et al., supra).

[0141] Onde o ácido nucleico transferido é um polinucleótido funcional, a presença e/ou eficácia do polinucleótido de uma planta de cana-de-açúcar transformada pode detectada utilizando qualquer método adequado conhecido na técnica, inclusive as determinações moleculares descritas acima. Por exemplo, as determinações moleculares que podem ser utilizadas incluem, mas não se limitam à análise Setentrional, reação em cadeia da polimerase (PCR), transcrição reversa PCR (RT-PCR), determinação da expressão de genes Taq Man (Applied Biosystems, Inc; Foster City, CA), determinações de proteção de ribonuclease, detecção da transferência de energia por ressonância fluorescente (FRET), monitoramento de um ou mais embalizamentos moleculares, hibridização para uma série de oligonucleotídeos, hibridização para uma série de cDNA, hibridização para uma série de polinucleótidos, hibridização para uma microssérie líquida, hibridização para uma série microelétrica, sequenciamento de cDNA, hibridização de clones, impressão digital de fragmentos de cDNA e similares.

[0142] Os métodos de transformação mediados por Agrobacterium da presente invenção podem reduzir com vantagem o volume de necrose celular que normalmente ocorre durante o cocultivo do tecido da planta de cana-de-açúcar ou da célula daí derivada, por exemplo, a Agrobacterium. Os métodos da presente invenção aumentam com vantagem a eficiência da transformação mediada por Agrobacterium na cana-de-açúcar quando comparada àquela que é obtida utilizando os mesmos protocolos de seleção e inoculação, (por exemplo, nos quais o tecido da planta inoculada por Agrobacterium ou a célula daí derivada é coproduzida em um meio de cocultivo), que podem ser mediados por uma redução na necrose durante o cocultivo. Em algumas modalidades, a eficiência da transformação é aumentada em cerca de, no mínimo, 5%, 10%, 15%, 20% ou 25%. Em outras modalidades, a eficiência da transformação é aumentada em cerca de, no mínimo, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% ou mais. A eficiência da transformação é calculada como número de eventos (por exemplo, o número de plantas transgênicas) obtidos por grama de tecido inicial da planta de cana-de-açúcar.

[0143] A presente invenção agora será descrita com referência aos exemplos a seguir. Deve ser levado em conta que este exemplo tem o objetivo de ilustrar aspectos da presente invenção e não limita o escopo desta invenção, conforme definido nas reivindicações. EXEMPLOS Exemplo 1. Transformação mediada por Agrobacterium da cana-de-açúcar durante a dessecação.

[0144] Este exemplo mostra que a transformação dos tecidos da cana-de-açúcar mediada por Agrobacterium pode ser mais eficiente quando executada em ambiente de dessecação. Métodos

[0145] Fonte e material da planta: O material nodal da folha, a partir das plantas da cana-de-açúcar cultivadas no campo, foi coletado e iniciado em meio EM3 (veja abaixo). Seções transversais (aproximadamente 20) do nó da folha não madura entre 1-3 mm de espessura foram retiradas exatamente acima do meristema e posicionadas na direção ascendente. O material coletado foi mantido em ambiente escuro a 25°C durante 28 e 42 dias. O calo utilizado para a transformação estava entre 4-10 dias do último subcultivo. O calo foi selecionado por características morfológicas, tais como a estrutura compacta e a cor amarela. Os calos embriogênicos amarelos foram selecionados onde foi possível, pois eles ofereciam boa regeneração, transformação consistente e fragmentada em pequenos grupos (2-4 mm). Isto era semelhante entre quatro cultivadores da cana-de-açúcar (por exemplo, Q208, KQ228, Q117 e Q232).

[0146] Preparação da Agrobacterium: Agrobacterium com culturas que permeiam um vetor que compreende a proteína fluorescente verde (GFP; GFP é um marcador de pontuação exemplar que permite a determinação da eficiência no manuseio de genes utilizando um microscópio fluorescente) ou nptII (marcador selecionável) foram raiados no meio LB (veja abaixo) que contém antibióticos adequados e cultivados a 28°C durante 3 dias e, então, armazenados a 4°C por até 1 mês. Antes da transformação, uma colônia única foi selecionada e raiada na placa fresca de LB e cultivada durante 1-2 dias a 28°C.

[0147] Um cultivo de Agrobacterium foi iniciado em 30 ml do meio AB (veja abaixo) ou do meio LB, a partir de uma colônia isolada, e cultivada por 4-5 horas a 28°C em um mixer, a 200 revoluções por minuto (RPM). O cultivo foi transferido para um frasco de Erlenmeyer de 500 ml, com 100-150 ml de matéria-prima fresca AB ou LB. A coleta cultivada durante 12-14 horas a 28°C, com 150 RPM, a uma densidade óptica (OD) de 0,2-1,0 a 600 nm.

[0148] O cultivo de Agrobacterium foi, então, centrifugado por 20 minutos a 2000 RPM e a 25°C. A plaqueta obtida foi suspensa novamente à força de 150 ml % em um meio Murashige e Skoog (MS) (sem sacarose), complementado com 400 μM de acetossiringona. O material coletado foi, então, mantido a 28°C e a 150 RPM durante 4 dias, antes da infecção. OD foi ajustado em um nível desejado, antes da infecção do material da planta a ser transformada.

[0149] Infecção e cocultivo: O tecido do calo foi pesado, a fim de assegurar que todos os experimentos possam ser comparados. Aproximadamente 10 g do tecido do calo foi utilizado por tratamento e foi colocado em um recipiente de coleta de 200 ml. O tecido do calo foi submetido a choque térmico (não executado no Q208) a 45°C por 5 minutos, acrescentando 50 ml do volume de % força MS (sem sacarose), pré-aquecido e, depois, mantendo o calo em uma banheira com água a 45°C. O volume MS foi, então, drenado a partir do tecido do calo e 25 ml da suspensão da inoculação de Agrobacterium foram acrescentados a cada recipiente e misturados suavemente. A mistura do calo/Agrobacterium foi filtrada a vácuo, colocando-a em uma câmara de vácuo por 10 minutos a -27.5 mmHg de vácuo. A mistura do calo/Agrobacterium foi, então, deixada de molho por 5-10 minutos em ambiente escuro.

[0150] A suspensão da inoculação da Agrobacterium foi, então, drenada a partir do calo e a cultura do calo remanescente foi desidratada para remover o excesso da suspensão da inoculação da Agrobacterium. Tecidos vegetais foram desidratados em papel-filtro, como o papel Whatman Grade 1, até que a suspensão da inoculação de Agrobacterium fosse consideravelmente removida. O calo foi, então, transferido para cocultivo em placas de Petri de 90 x 25 mm que não continham nenhum volume de cocultivo ou que continham papéis-filtro secos ou papéis-filtro umedecidos com água esterilizada e vedados com fita NESCOFILM®, MICROPORETM(3M; Minneapolis, MN) ou material similar. Os controles foram cocultivados em meios como tratamentos de controle. Alguns tratamentos adicionais com pré ou pós dessecação de cocultivo foram também incluídos, conforme descritos na tabela abaixo. As placas foram incubadas em ambiente escuro a 22°C durante 2-3 dias.

[0151] Pós-transformação: Após o cocultivo, o tecido do calo foi transferido para o meio MS 1 (veja abaixo), contendo 200 mg/L de timentina (meio de "descanso") e mantido em ambiente escuro a 25°C durante 4 dias. A primeira etapa de seleção foi feita no meio MS 2 (veja abaixo), contendo 50 mg/L de geneticina e 200 mg/L de timentina, durante 14-15 dias em ambiente escuro a 25°C.

[0152] Regeneração e enraizamento: A regeneração foi conduzida no volume MS 3 (veja abaixo), complementado por 50 mg/L de geneticina e 200 mg/L de timentina a 25°C em 16 horas de luz solar. Foram necessários aumentos graduais na intensidade da luz. Ao longo da primeira semana, a cultura foi deixada na bancada do laboratório sob a luz ambiente comum e, nas próximas 3 semanas, a cultura foi mantida a uma intensidade moderada de luz.

[0153] A formação de rebentos foi observada entre 2-4 semanas. Quando apareceram as primeiras folhas, os rebentos foram transferidos para o meio MS 4 (veja abaixo) até as plantas crescerem a 4-5 cm de altura. Eles foram, então, coletados para análise e transferidos para o solo.

[0154] Meios: Os componentes do meio acima citados são conforme segue.

[0155] EM3: Sais e vitaminas MS; 0,5 g/L de hidrolisato de caseína; 100 ml/L de água de coco; 20 g/L de sacarose e 3 mg/l 2,4-D.

[0156] LB básico: 10 g/L de NaCl; 5 g/L de extrato de levedura; e 10 g/L de triptona.

[0157] LB sólido: LB básico com 15 g/L de agar.

[0158] AB: Os primeiros sais foram autoclavados e acrescentados: 2g/L de (NH4)2SO4; 6 g/L de Na2HPO4; 3 g/L de KH2PO4; e 3 g/L NaCl. Os seguintes compostos foram esterilizados com filtros: 0,1 mM de CaCl2; 1,0 mM MgCl2; 0,003 mM de FeCl3; e 5 g/L de glicose.

[0159] MS básico: Sais e vitaminas de meio MS, com 25 g/L de sacarose.

[0160] MS 1: MS básico complementado com 3,0 mg/L 2,4- D e 200mg/L de Timentina.

[0161] MS 2: MS básico complementado com 3,0 mg/L 2,4- D e 50mg/L de Geneticina e 200mg/L de Timentina.

[0162] MS 3: MS básico complementado com 40 ml de água de coco esterilizada com filtro e 1,0-2,0 mg/L de BAP (dependendo do cultivador, portanto, não necessária a todos os cultivadores) e 50mg/L de Geneticina e 200mg/L de Timentina.

[0163] MS 4: MS básico complementado com 1,0 g/L de carvão vegetal e 1,0 mg de IBA (ácido indol-3-butírico, não necessário a todos os cultivadores, e 50mg/L de Geneticina.

[0164] CoCult: Meios de cocultivo de volumes, conforme descrito para a banana em Khanna et al. Molecular Breeding 14(3): 239-252 (2004).

[0165] Conforme mostrado nas tabelas abaixo, seis diferentes condições de cocultivo foram estudadas no cultivador Q117 da cana-de- açúcar. As condições de cocultivo variavam do meio de não-cultivo (ou seja, sem meios), no qual os tecidos vegetais forma cultivados apenas no fundo do recipiente, com papel-filtro seco ou com papel-filtro umedecido. Os vetores de transformação eram pUGfpN(s) ou pUbiNptII(s).

[0166] O vetor de transformação pUGFPN(s) contém dois cassetes de expressão entre a borda esquerda e direita do vetor de transformação. Um dos cassetes de expressão contém os seguintes elementos vinculados operacionalmente: promotor de ubiquitina do milho vinculado a uma sequência de ácidos nucleicos que codificam a proteína fluorescente verde, seguido pela sequência de terminação S65. O segundo cassete de expressão contém o promotor de ubiquitina do milho vinculado a uma sequência de ácidos nucleicos que codificam a proteína NptII, seguida pela sequência de terminação Nos. O vetor de transformação pUbiNptII(s) contém um cassete de expressão entre o limite esquerdo e direito do vetor de transformação. Este cassete de expressão contém os seguintes elementos vinculados operacionalmente: promotor de ubiquitina do milho vinculado a uma sequência de ácidos nucleicos que codificam a proteína NptII, que confere resistência à geneticina, seguida pela sequência de terminação Nos. Tabela 1: Resumo das seis condições de cocultivo com o calo Q117. Alteração de peso ao longo do período de cultivo, número de eventos transgênicos obtidos e o desenvolvimento do setor de GFP em 22 dias também é mostrado.

1 A alteração no peso em relação ao cocultivo, comparada ao peso inicial, é indicada nos parênteses.

[0168] Conforme mostrado na tabela 1, a expressão do ácido nucleico que codifica o marcador de pontuação de GFP e a recuperação de eventos transgênicos (portanto, a eficiência da transformação), foi a mais alta naqueles tecidos vegetais nos quais a coleta durante a fase de cocultivo ocorreu em ambientes com dessecação mais extrema, isto é, apenas uma superfície de placa ou apenas um papel-filtro, quando comparado àqueles tratamentos sem nenhuma dessecação (isto é, os tratamentos 2, 3, 8 e 9).

[0169] Um estudo duplicado foi desenvolvido com uma plantação de cana-de-açúcar diferente (Q208), conforme mostrado na tabela 2. O material nodal da folha, a partir das plantas de cana-de-açúcar cultivadas no campo, foi coletado e iniciado em meio EM3. Tabela 2: Resumo das seis condições de cocultivo com o calo Q208. Alteração de peso ao longo do período de cultivo, número de eventos transgênicos obtidos e o desenvolvimento do setor de GFP em 22 dias também é mostrado.

1 A alteração no peso em relação ao cocultivo, comparada ao peso inicial, é indicada nos parênteses. Exemplo 2. Protocolo adicional da transformação mediada por Agrobacterium da cana-de-açúcar durante a dessecação.

[0170] Este exemplo mostra os métodos adicionais de transformação dos tecidos e células da cana-de-açúcar em ambiente de dessecação. Este exemplo utiliza brotos como fonte inicial do tecido vegetal.

[0171] Fonte e material da planta: O calo embriogênico foi obtido a partir de mudas de cana-de-açúcar (Saccharum híbridas) cultivadas na estufa.

[0172] Indução de calos embriogênicos: Brotos não maduros foram coletados na fase de desenvolvimento em que o entrenó está começando a se alongar. Os brotos não maduros foram esterilizados por meio de borrifo com 70% de etanol ou mergulhando em 20% de CLOROX® Bleach (The Clorox Company; Oakland, CA) (com 3 gotas de TWEEN®-20/L; Sigma Aldrich; St. Louis, MO) durante 20 minutos e, então, enxaguados 3 vezes em água quente esterilizada.

[0173] Enrolamentos de folhas foram, então, isolados a partir de brotos esterilizados, cortando seções transversais de 1-2 mm, da área imediatamente acima do meristema apical em até 2-3 cm acima. Os enrolamentos de folhas isolados foram cultivados em SC+0,75 mg-3 mg/L 2.4-D médio (2-10/placa) em ambiente escuro, a 28°C durante 23 semanas. As respostas da coleta embriogênica de alta qualidade foram, então, subcultivadas seletivamente em meio SC + D fresco para servirem de material de destino para transformação.

[0174] Vetor de transformação e subespécies de Agrobacterium: Vetores binários em uma subespécie A. tumefaciens, a exemplo do LB4404 ou EHA101, foram utilizados na transformação da cana-de- açúcar. Dependendo do elemento, o vetor binário detecta a proteína fluorescente verde do Coral de Recifes (GFP; do elemento pNOV2145) ou a proteína Ciano-Fluorescente do Coral de Recifes (CFP; do elemento 13601) como ácido nucleico do marcador de pontuação. As culturas de Agrobacterium foram iniciadas semanalmente a partir de amostras de glicerol congeladas a -80°C em uma placa YP contendo antibióticos adequados e cultivadas a 28 oC em uma incubadora, conforme a seguir.

[0175] As subespécies de Agrobacterium foram removidas do freezer a -80°C e colocadas em gelo seco. Os meios de crescimento bacterianos foram retirados do armazenamento a 4°C, com antibióticos adequados para cada cepa de Agrobacterium (normalmente, YP/Spec, Kan).

[0176] Uma pequena quantidade de cepas de Agrobacterium do frasco foi removida com um gancho plástico de inoculação descartável esterilizado e colocado na placa. A Agrobacterium foi alongada com um gancho ou estirador de células para criar uma camada fina de células sobre a superfície do meio de crescimento.

[0177] As placas foram colocadas em uma incubadora a 28°C durante cerca de 2 dias, antes da utilização. Uma colônia foi cultivada de um dia para o outro em meios líquidos, com antibióticos adequados. As células de Agrobacterium foram, então, centrifugadas a 5000 rpm durante 10 minutos à temperatura ambiente. O líquido superflutuante foi removido e um grânulo celular for suspenso novamente em meio líquido de inoculação, como o SCInoc (veja abaixo). A absorção de luz da suspensão bacteriana foi medida em um espectrofotômetro e diluída em A660 de 0,1-0,85. Foi adicionada acetosiringona a uma concentração final de 40-80 mg/L (200-400 μM), para induzir a expressão do gene de virulência durante 10 minutos até 4 horas.

[0178] Preparação do tecido vegetal: Foram utilizados calos embriogênicos e enrolamentos de folhas na transformação. Foram selecionadas as peças-alvo da melhor qualidade, a partir de linhas de cultura embriogênicas para utilização na transformação. Foram utilizados na transformação enrolamentos de folhas, cultivados em meio SC2D (veja abaixo) durante 1, 3, 5 e até 30 dias.

[0179] Infecção e cocultivo do tecido vegetal da cana-de-açúcar: Os explantes preparados foram pré-processados com choque térmico a 45°C, conforme descrito no exemplo 1, durante 5 minutos. Foi removido o líquido resultante do choque térmico e o tecido vegetal foi misturado com a suspensão de Agrobacterium. A mistura foi incubada durante, pelo menos, 1 minuto ou até o outro dia, à temperatura ambiente.

[0180] A cultura de suspensão de Agrobacterium foi drenada a partir dos explantes e foi removido o excesso da cultura de suspensão, utilizando o processo de blotting com papel-filtro esterilizado ou secagem ao ar livre, durante 10-60 minutos, ou ambos.

[0181] Os explantes pré-secos foram colocados em uma placa vazia, com ou sem papel-filtro (complementada com meios de infecção de 50-1.000 μl, por exemplo, SCInoc (vide abaixo)). As placas de cocultivo foram, então, incubadas durante 3 a 5 dias a 20°C-28°C, em ambiente escuro. Foi realizado um tratamento de cocultivo de controle com meio SCCoCult (vide abaixo).

[0182] Fase de repouso: As partes infectadas da planta foram transferidas para um meio de repouso durante 2-10 dias para facilitar a recuperação do material transgênico. É utilizado um meio de recuperação sem agente de seleção, como o SCRecov (vide abaixo), com antibióticos adequados para inibirem o crescimento de Agrobactérias, durante a fase de repouso.

[0183] Seleção e regeneração de plantas transgênicas: Após a fase de repouso (ou seja, o período de recuperação), os explantes foram transferidos para o meio de seleção, como o SCSel ou SCMan (veja abaixo) e, então, cultivados a 28°C em ambiente escuro, durante 3-6 semanas.

[0184] Os setores de proliferação foram subcultivados seletivamente para meios de regeneração como o SCManRegen (com antibióticos adequados) (veja abaixo) para indução da regeneração e, depois, cultivados a 28°C em ambiente escuro, durante uma semana. Após uma semana, as placas de indução da regeneração foram cultivadas à presença da luz, a 28°C, durante 16 horas/dia. Após duas semanas, os brotos em desenvolvimento foram transferidos para meios de enraizamento da cana-de-açúcar (SCR, veja abaixo) para alongamento e enraizamento dos brotos.

[0185] Compostos dos meios: Os componentes dos meios acima citados são conforme segue.

[0186] Conforme mostrado na tabela 3 abaixo, três diferentes condições de cocultivo foram estudadas. As condições de cocultivo variavam a cultura conforme o meio de cocultivo (ou seja, sem meios), caso este em que os explantes foram cultivados no fundo do recipiente para umedecer o papel-filtro. A expressão transitória de GFP (elemento pNOV2145) ou CFP (elemento 13601) e, dessa forma, a eficiência da transformação, foi a mais alta nesses tecidos vegetais cultivados apenas na superfície da placa ou em papel de filtro umedecido. Tabela 3: Resumo das três condições de cocultivo.

1 O meio de cocultivo foi utilizado durante a fase de cocultivo; "Filtro" representa apenas o papel-filtro umedecido que foi utilizado durante o cocultivo; "Sem meios" representa explantes que foram cocultivados em uma placa vazia, sem qualquer meio ou papel-filtro. Mais * indicam expressão transitória mais alta 3 Foram usadas quantidades iguais de explantes para os diversos tratamentos 4N/A= dados não disponíveis ou não coletados Exemplo 3. Transformação da cana-de-açúcar mediada por Agrobacterium durante a dessecação.

[0187] Este exemplo mostra que os métodos acima descritos podem ser executados por um período mais longo de tempo. Métodos

[0188] Os métodos do exemplo 1 foram repetidos; contudo, o período de cocultivo é estendido de alguns dias até uma semana, a fim de alterar a taxa e extensão da dessecação. Em síntese, foram executadas cinco condições de cocultivo diferentes, ao longo de três ou cinco dias. Na primeira condição de cocultivo, o tecido do calo foi mantido durante uma hora em papel-filtro e, depois, cocultivado durante três dias, sem meios. Na segunda condição de cocultivo, o tecido do calo foi cocultivado durante três dias. Na terceira condição de cocultivo, o tecido do calo foi tratado como na segunda condição, porém, incluído a 500 μl H2O colocados em papel-filtro. Na quarto tecido em cocultivo, o tecido do calo foi tratado como na segunda condição, porém, incluído a 1.000 μl H2O colocados no papel-filtro. Na quinta condição de cocultivo, o tecido do calo foi tratado como na primeira condição, porém, cocultivado durante cinco dias.

[0189] Conforme mostrado nas tabelas 4 e 5, os níveis de expressão de GFP e o número de eventos gerados foram relativamente afetados por um aumento do tempo de cocultivo, mas indica que um período de cocultivo mais longo, de até 9 dias, ainda resulta em um número favorável de eventos de transformação. Tabela 4: Resumo da expressão de GFP sob diversas condições de cocultivo. 10 g de calos foram utilizados em cada condição de transformação.

Tabela 5: Resumo da geração de eventos transgênicos após diversas condições de cocultivo. 20 g de calos foram utilizados em cada condição de transformação.

Exemplo 4. Comparação da transformação da cana-de- açúcar mediada por Agrobacterium durante a dessecação em diversos intervalos de tempo.

[0190] Este exemplo mostra os efeitos da secagem pós-infecção e secagem pós cocultivo do tecido e das células da cana-de-açúcar.

[0191] Em síntese, os métodos do Exemplo 1 foram repetidos; contudo, foi aplicada uma secagem de pré ou pós cocultivo em algumas culturas, a fim de alterar a taxa e extensão da dessecação.

[0192] Quando combinados com o cocultivo tradicional (em meios) ou com o cocultivo por dessecação (conforme descrito aqui), nem a fase de secagem de pré nem a de pós cocultivo melhorou os métodos do Exemplo 1 ou do Exemplo 2. Conforme mostrado na tabela 6, o desenvolvimento do setor de GFP diminuiu em culturas que foram submetidas a uma secagem de pré ou de pósinfecção. Cada cultura tinha um peso inicial de 10 g de calos. Tabela 6: Resumo da expressão de GFP sob diversas condições de cocultivo.

1 A alteração no peso em relação ao cocultivo, comparada ao peso inicial, é indicada nos parênteses; cada cultura tinha um peso inicial de 10g de calos.

[0194] Da mesma forma, quando combinados com o cocultivo tradicional (em meios) ou com o cocultivo por dessecação (conforme descrito aqui), nem a fase de secagem de pré-infecção nem a de pós cocultivo melhorou os métodos do exemplo 1 ou do exemplo 2. Conforme mostrado na tabela 7, a produção de eventos transgênicos estáveis após a transformação com o vetor nptII diminuiu em culturas que foram submetidas a uma secagem de pré-infecção ou de póscocultivo. Cada cultura tinha um peso inicial de 10 g de calos. Tabela 7: Resumo da eficiência na geração de eventos transgênicos após diversas condições de cocultivo.

1 A alteração no peso em relação ao cocull tivo, comparada ao peso inicial, é indicada nos parênteses; cada cultura tinha um peso inicial de 10 g de calos.

[0195] Os próximos exemplos demonstram que a cana-de-açúcar pode ser eficientemente transformada, submetendo o tecido vegetal inoculado por Agrobacterium a dessecação extrema durante a fase de cocultivo, na qual os tecidos vegetais podem perder peso ao longo de um período maior de tempo. Ao cultivar o tecido vegetal inoculado por Agrobacterium no ambiente de dessecação durante a fase de cocultivo, a eficiência da transformação foi aumentada.

[0196] Todas as publicações e aplicações de patentes mencionadas nas especificações são referências do nível de habilidade dos que estão capacitados na técnica à qual pertence esta invenção. Todas as publicações e patentes citadas são aqui incorporadas como referência na mesma extensão, como se cada publicação individual fosse especificamente e individualmente indicada a ser incorporada como referência.

[0197] Embora a respectiva invenção tenha sido descrita com alguns detalhes por meio de ilustrações e exemplos, para fins de clareza e entendimento, será óbvio que certas alterações e modificações podem ser implementadas dentro do escopo de lista das respectivas modalidades e nas reivindicações complementares.

Claims

1. Método de produção de tecido da cana-de-açúcar transformado ou célula derivada do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende: a) a inoculação de um tecido da cana-de-açúcar ou da célula derivada do mesmo com uma suspensão de inoculação de Agrobacterium, sendo que esta Agrobacterium compreende um ácido nucleico de interesse, a fim de obter um tecido da cana-de-açúcar inoculado com Agrobacterium ou célula derivada do mesmo; e b) o cocultivo do referido tecido da cana-de-açúcar inoculado com Agrobacterium ou a célula derivada do mesmo em uma superfície na ausência de meios de cocultivo por um período de tempo suficiente para reduzir em 35% ou mais o peso original do respectivo tecido da cana-de-açúcar inoculado com Agrobacterium ou da célula derivada do mesmo por dessecação durante o cocultivo, que ocorre em um ambiente de dessecação; produzindo, a partir daí, um tecido de cana- de-açúcar ou célula transformada derivada do mesmo, c) selecionar um tecido da cana-de-açúcar transformado ou célula do mesmo compreendendo o ácido nucleico de interesse, em que o referido ácido nucleico de interesse compreende uma cassete de expressão que compreende um ácido nucleico que confere resistência a um agente de seleção, e em que a referida seleção compreende a cultura do referido tecido de cana-de-açúcar inoculado com Agrobacterium ou célula derivada do mesmo em um meio compreendendo o referido agente de seleção, e selecionar um tecido de cana de açúcar transformado ou célula derivada do mesmo compreendendo o referido ácido nucleico de interesse.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido cocultivo compreende a cultura do respectivo tecido da cana-de-açúcar inoculado com Agrobacterium ou da célula derivada do mesmo em, pelo menos, uma camada de papel seco.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o referido cocultivo compreende a cultura do respectivo tecido da cana-de-açúcar inoculado com Agrobacterium ou da célula derivada do mesmo, em duas ou mais camadas de papel seco.

4. Método, de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a troca periódica do papel durante o cocultivo.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a troca do papel a cada dia durante o cocultivo.

6. Método, de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a referida suspensão da inoculação é removida do respectivo tecido da cana-de-açúcar inoculado com Agrobacterium ou da célula derivada do mesmo, antes do cocultivo na ausência de meios de cocultivo.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido cocultivo compreende a cultura do respectivo tecido da cana-de-açúcar inoculado com Agrobacterium ou da célula derivada do mesmo na respectiva superfície, na ausência de papel seco.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o referido tecido da cana-de-açúcar ou a célula derivada do mesmo é obtido a partir de um caule ou broto de cana-de-açúcar.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o referido tecido da cana-de-açúcar ou a célula derivada do mesmo é tecido de calos embriogênicos.

10. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o referido tecido da cana-de-açúcar ou a célula derivada do mesmo é obtido a partir de um segmento de cartucho foliar ou segmento da bainha da folha, cortado do respectivo broto ou caule.

11. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o referido tecido da cana-de-açúcar ou a célula derivada do mesmo, é obtido com o pré-cultivo de um segmento do respectivo broto ou caule por um período de tempo, para produzir o tecido do calo embriogênico antes de entrar em contato com o referido tecido da cana-de-açúcar ou a célula derivada do mesmo, com a referida suspensão da inoculação compreendendo Agrobacterium.