CN102639703A - 土壤杆菌属(agrobacterium)介导甘蔗转化的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了产生一种转化甘蔗组织或其细胞的方法，所述方法包含：a)采用一种土壤杆菌属(Agrobacterium)接种混悬液接种一种甘蔗组织或其细胞，所述土壤杆菌属(Agrobacterium)含有一个目的核酸，以获得一种土壤杆菌属(Agrobacterium)接种的甘蔗组织或其细胞；b)在缺乏共同培养基的表面，共同培养所述土壤杆菌属(Agrobacterium)接种的甘蔗组织或其细胞，培养时间足以减少所述土壤杆菌属(Agrobacterium)接种的甘蔗组织或其细胞的原始重量；c)选择一种转化的甘蔗组织或其细胞。本发明的转化方法可达到增加转基因甘蔗植物转化频率和恢复。

Description

土壤杆菌属(AGROBACTERIUM)介导甘蔗转化的方法

优先权声明

根据35U.S.C.§119(e)，本申请声明美国临时申请第61/220,405号(于2009年6月25日归档)的利益和美国临时申请第61/290,803(于2009年12月29日归档)的利益，它们每个的全部内容均通过提及而结合于本文件中。

发明领域

本发明一般涉及植物分子生物学，特别是土壤杆菌属(Agrobacterium)介导的甘蔗转化的方法。

背景

甘蔗(甘蔗属(Saccharum))是下述行业的一种重要原料来源：蔗糖工业；酒精、醋酸、丁醇、纸、胶合板、工业用酶和动物饲料的生产涉及的相关行业。这些行业寻求改进甘蔗的方法，即通过引入赋予需要的特征或特点的异源多聚核苷酸。

根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)是一种土壤中带有的病原体，它广泛用于把异源多聚核苷酸引入植物细胞中，包括来自甘蔗的植物细胞。根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)能将肿瘤诱导性(Ti)质粒的一个特定多聚核苷酸片段引入感染宿主细胞的细胞核中，所述片段随后稳定结合于宿主基因组中。有利的是，异源多聚核苷酸可置于Ti质粒的边界之间，然后转移到植物细胞中。

虽然土壤杆菌属(Agrobacterium)介导的转化已用于甘蔗的遗传操纵，现有方法的效率和再现性仍是一个挑战。实际上，根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)在培养的转化甘蔗组织中能诱导坏死，导致较低的转化频率(Arencibia等(1998)：Transgenic Res.[转基因研究]，7：123-222；Enriquez-Obregón等(1997)：Biotecnología Aplicada，14：169-174；和de la Riva等(1998)：Electron.J.Biotechno.[生物技术电子杂志]，1：118-133)。

由于操纵甘蔗改进特征(如增加对生物应激或非生物应激的抵抗性、或改进生产)具有重要意义，人们需要另外的、能增加该重要农作物土壤杆菌属(Agrobacterium)介导转化效率的方法。。

因此，通过提供土壤杆菌属(Agrobacterium)介导的甘蔗和其它重要植物的转化，获得较高的转化效率，本发明克服了本领域技术中的缺点。

本发明的概述

列出了土壤杆菌属(Agrobacterium)介导甘蔗(甘蔗属(Saccharum))转化的方法。这些方法包含一种方案，其中在选择转化组织之前，把土壤杆菌属(Agrobacterium)接种的甘蔗组织在干燥环境或极端干燥环境中进行共同培养。处理可以设计为诱导各种严重程度的长时间干燥。本发明的转化方法可达到增加转基因甘蔗植物转化频率和恢复。

因此，本发明提供了产生一种转化甘蔗组织或其细胞的方法，所述方法包含：a)采用一种土壤杆菌属(Agrobacterium)接种混悬液接种一种甘蔗组织或其细胞，所述土壤杆菌属(Agrobacterium)含有一个目的核酸，以获得一种土壤杆菌属(Agrobacterium)接种的甘蔗组织或其细胞；和b)在缺乏共同培养基的表面，共同培养所述土壤杆菌属(Agrobacterium)接种的甘蔗组织或其细胞，培养时间足以减少所述土壤杆菌属(Agrobacterium)接种的甘蔗组织或其细胞的原始重量；从而产生一种转化的甘蔗组织或其细胞。

本发明的详细说明

本发明导向土壤杆菌属(Agrobacterium)介导的转化方法，这种方法包含一种共同培养方案，这种方案能增加来自土壤杆菌属(Agrobacterium)的一种目的核酸转移到接种甘蔗细胞和组织的效率。本发明的土壤杆菌属(Agrobacterium)介导转化方法包含，在干燥环境中、在表面上共同培养一种土壤杆菌属接种甘蔗组织或其细胞，培养时间足以减少接种组织的原始重量，之后再选择转化的细胞或转化的组织。在一些实施例中，所述干燥环境可能是极端干燥环境，其中要除去过量细菌(如土壤杆菌属(Agrobacterium))接种混悬液，再把组织与细胞在缺乏共同培养基的条件下共同培养。在暴露于这个干燥步骤后，接种植物材料或组织可以进行一个选择步骤，以鉴别成功的转化事件。

在与土壤杆菌属(Agrobacterium)共同培养之前或在共同培养期间，植物部分的干燥在本领域技术中是已知的技术。例如，Vogel和Hill表明，在开始共同培养时进行7分钟的短暂干燥处理，在二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)的转化改善(Vogel和Hill(2008)：Plant Cell Rep.(植物细胞报告)27：471-478)。Arencibia等表明，在接种之前，采用在层流下晾干细胞15-60分钟，从甘蔗所得植物部分的土壤杆菌属(Agrobacterium)介导转化稍微改善(Arencibia等(1998)：Transgenic Res.[转基因研究]，7：123-222；也请参见下述文献：Zhang等(2006)：J.Integr.Plant Biol.[植物学报]，48：453-459)。但是，干燥处理持续60分钟以上，则对植物部分产生不可逆的损害(Arencibia等(1998)：supra))。Cheng和Fry报告，从玉米、水稻、大豆或小麦所得的植物部分与土壤杆菌属(Agrobacterium)在滤纸上共同培养(滤纸用各种量的无菌水预饱和2-3天)，可以减少植物部分的重量和增加β-葡萄糖苷酸酶表达(美国专利号7,045,357；和Cheng等(2003)：In Vitro Cell.Dev.Biol.[体外细胞和发育生物学]，39：595-604)。但是，使植物部分的重量减少35％以上，可能导致植物部分无法从重度水应激恢复(Cheng等：supra)。与这些早期报告形成对比，本发明能提供对甘蔗的更大范围有效处理，在共同培养期间对接种植物组织进行更极端水平的干燥。

不用受任何特定理论或作用机制所限制，在初始接种步骤后，在共同培养期间，把土壤杆菌属(Agrobacterium)接种的甘蔗组织置于干燥环境中，能使接种植物组织在暴露于土壤杆菌属(Agrobacterium)后正常观察到的细胞坏死/凋亡有利地减少，可以增加土壤杆菌属(Agrobacterium)介导目的核酸传递到目标甘蔗组织和/或其细胞中。此外，在共同培养步骤期间的干燥，能有利地改善选择/恢复/再生步骤中的后续细胞生存率，这些步骤通常在共同培养步骤之后。因此，本发明的土壤杆菌属(Agrobacterium)介导的转化方法，可达到增加转基因甘蔗植物的恢复。

值得注意的是，本发明的方法可应用于甘蔗的任何基因型，代表了甘蔗转化技术的重大改进。在转化技术中，长期以来人们渴望获得不依赖于基因型的甘蔗转化方法，本发明提供了对这个问题的一种解决方案(例如，请参见下述文献：Joyce等：Plant Cell Rep(植物细胞报告)，29：173-183(2009))。关于土壤杆菌属(Agrobacterium)介导的甘蔗转化(如土壤杆菌属(Agrobacterium)介导的转化)，在共同培养期间结合干燥，能使这种作物植物对土壤杆菌属(Agrobacterium)介导的转化(例如土壤杆菌属(Agrobacterium)介导的转化)更少抵抗性。

因此，在一些实施例，本发明提供了产生一种转化甘蔗组织或其细胞的方法，所述方法包含：a)采用一种土壤杆菌属(Agrobacterium)接种混悬液接种一种甘蔗组织或其细胞，所述土壤杆菌属(Agrobacterium)含有一个目的核酸，以获得一种土壤杆菌属(Agrobacterium)接种的甘蔗组织或其细胞；和b)在缺乏共同培养基的表面，共同培养所述土壤杆菌属(Agrobacterium)接种的甘蔗组织或其细胞，培养时间足以减少所述土壤杆菌属(Agrobacterium)接种的甘蔗组织或其细胞的原始重量；从而产生一种转化的甘蔗组织或其细胞。

“共同培养”和“进行共同培养”意思是指在植物组织或其细胞接种(如，使植物组织或其细胞与一种土壤杆菌属(Agrobacterium)菌株或能够进行核酸转移的其它细菌接触)后培养的时间期基至除去、失活或抑制细胞的时间期间。于是，例如，“进行共同培养”可能指在植物组织或其细胞接种后的培养时间期间至在接种组织中细菌的生长和代谢活动被抑制的时间期间；细菌的生长和代谢活动可通过加入化合物(如杀菌药或抑菌药)或通过抑制细菌生长的过程进行抑制，或通过此二者的组合进行抑制。如本文件所用，“进行抑制”、“抑制的”、“抑制”(及其语法变化)意思是，由于加入一种药物(如抑制药、抗生素以及诸如此类)和/或培养(生长)条件(如培养基、温度、湿度)变化，与没有这种药物或变化时比较，活性(如土壤杆菌属(Agrobacterium)的生长和繁殖)减慢或停止。通常情况下，共同培养过程在休眠、选择或再生步骤开始时结束。

如本文件所用，“干燥环境”意思是，共同培养步骤是在缺乏半固体或液体共同培养基的情况下进行的，从而使植物组织与土壤杆菌属(Agrobacterium)共同培养至干燥，由此减少它的原始重量，如下所述。在其它实施例中，“干燥环境”意思是在没有(即缺乏)共同培养基或其它添加液体的表面上共同培养土壤杆菌属(Agrobacterium)接种的植物组织，培养时间足以减少土壤杆菌属(Agrobacterium)接种植物组织的原始重量。如本文件所用，“共同培养基”或“进行共同培养的培养基”以及诸如此类，意思是在本领域技术中已知的、在采用土壤杆菌属(Agrobacterium)接种后培养一种植物组织或其细胞的任何培养基。在本领域技术中，共同培养基的成分一般是已知的，包括甘蔗共同培养基，在本文件中简称为SCCoCult。

在本发明的其它实施例中，土壤杆菌属(Agrobacterium)接种的组织或其细胞进行共同培养步骤，所述步骤包括：在一种极端干燥环境中培养接种的植物组织或其细胞，培养时间足以减少接种的植物组织或其细胞的原始重量。如本文件所用，术语“极端干燥环境”意思是，在共同培养步骤之前大体上除去过量的接种混悬液，其中所述组织与土壤杆菌属(Agrobacterium)在缺乏共同培养基的条件下进行共同培养。在其它实施例中，在大体除去预培养基后，再进行共同培养，其中组织或其细胞与土壤杆菌属(Agrobacterium)在缺乏共同培养基时进行共同培养。因此，公认的情况是，当从接种混悬液(如一种细菌混悬液培养基)除去时植物组织或其细胞可能保留附在其上的残留接种混悬液，或当从预培养基(如用于开始愈伤组织的培养)除去时植物组织或其细胞可能保留附在其上的残留预培养基。因此，在共同培养步骤期间，为尽可能扩大支持接种植物或其细胞的表面的干燥环境(即建立一种极端干燥环境)，可以从植物组织或其细胞大体上除去残留或过量接种混悬液和/或预培养基。“大体上除去”意思是指，当把接种的植物组织或其细胞放在干燥环境的表面上时，在接种植物组织或其细胞上存在的接种混悬液和/或其细胞的量极少(de minimus)或减少，只要遗留的量不会损害这种干燥环境或极端干燥环境的目标(如减少接种的植物组织或其细胞的原始重量，如下所述)。因此，在本发明的一些实施例中，在缺乏共同培养基的条件下进行共同培养之前，从所述土壤杆菌属(Agrobacterium)接种的甘蔗组织或其细胞大体上除去接种混悬液。

因此，在一些实施例中，在缺乏共同培养基的条件下进行共同培养之前，把土壤杆菌属(Agrobacterium)接种的其组织进行预干燥，预干燥包含从所述土壤杆菌属(Agrobacterium)接种的甘蔗组织或其细胞大体上除去接种混悬液的步骤。在共同培养步骤之前，能大体上除去含土壤杆菌属(Agrobacterium)接种混悬液的任何方法，均可用于预干燥植物组织或其细胞。在共同培养步骤之前，关于预干燥的方法的非限制性实例包括：排水，在干燥无菌吸水纸(如滤纸)上吸干，晾干接种的植物组织，或其任何组合。在共同培养步骤之前，当采用晾干时，例如在层流罩下或其它蒸发方法下，接种的植物组织可以晾干约1分钟至约60分钟，例如约1分钟、约5分钟、约10分钟、约15分钟、约30分钟、约60分钟，或约1分钟和约60分钟之间的任何时间。当用纸吸干时，接种的植物组织可以用多张无菌纸顺序吸干，直至吸水纸没有表现任何潮湿迹象，或直至大体上干燥(即，在吸干接种的植物组织后立即对滤纸进行肉眼检查，在纸上没有鉴别出任何水分或潮湿班点)。然后，土壤杆菌属(Agrobacterium)接种的植物组织或其细胞可在干燥环境中进行共同培养。

在其它实施例中，术语“极端干燥环境”意思是，把土壤杆菌属(Agrobacterium)接种的植物组织或其细胞放在一个表面上共同培养，所述表面包含至少一张干吸水纸(如滤纸)，其中所述干纸在共同培养期间定期更换。如本文件所用，“定期”的意思是，例如每小时一次、每天一次(即一天一次)、每两天一次、每三天一次以及诸如此类。因此，在一些实施例中，共同培养包含把所述土壤杆菌属(Agrobacterium)接种的甘蔗组织或其细胞放在至少一层干纸上进行培养。因此，在其它实施例中，共同培养包含把所述土壤杆菌属(Agrobacterium)接种的甘蔗组织或其细胞放在两层或以上干纸上进行培养。在另外的一些实施例中，共同培养包含把所述土壤杆菌属(Agrobacterium)接种的甘蔗组织或其细胞放在至少一层干纸上进行培养，其中所述干纸在共同培养期间定期更换。又在另外的一些实施例中，共同培养包含把所述土壤杆菌属(Agrobacterium)接种的甘蔗组织或其细胞放在两层或以上干纸上进行培养，其中所述干纸在共同培养期间定期更换。在其它一些实施例中，共同培养包含把所述土壤杆菌属(Agrobacterium)接种的甘蔗组织或其细胞放在至少一层干纸上进行培养，其中所述干纸在共同培养期间每天更换一次。又在另外的一些实施例中，共同培养包含把所述土壤杆菌属(Agrobacterium)接种的甘蔗组织或其细胞放在两层或以上干纸上进行培养，其中所述干纸在共同培养期间每天更换一次。又在其它实施例中，共同培养包含把所述土壤杆菌属(Agrobacterium)接种的甘蔗组织或其细胞放在缺乏干纸的所述表面上进行培养。

于是，在本发明的一些实施例中，把接种的组织或其细胞在干燥环境和/或一种极端干燥环境中的表面进行共同培养，培养时间足以减少这种接种的植物组织的原始重量，使其减少＜1％、约1％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％以及诸如此类。在其它实施例中，使原始重量减少＞35％至约60％，例如，约36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、以及介于约35％和约60％之间的此类其它值。在一些实施例中，使原始重量减少＜1％至约10％、＞约1％至约10％、约1％至约15％、约1％至约19％、约1％至约20％、约1％至约25％、约1％至约30％、约1％至约40％、约1％至约50％、约1％至约55％、约1％至约60％、约1％至约70％、约1％至约80％、约10％至约20％、约10％至约25％、约10％至约30％、约10％至约40％、约10％至约50％、约10％至约60％、约10％至约70％、约10％至约80％、约15％至约25％、约15％至约30％、约15％至约40％、约15％至约50％、约15％至约60％、约15％至约70％、约15％至约80％、约20％至约30％、约20％至约40％、约20％至约50％、约20％至约60％、约20％至约70％、约20％至约75％、约20％至约80％、约30％至约40％、约30％至约50％、约30％至约60％、约30％至约65％、约30％至约70％、约30％至约80％、约40％至约50％、约40％至约60％、约40％至约70％、约40％至约80％、约50％至约60％、约50％至约65％、约50％至约70％、约50％至约75％、约50％至约80％、约60％至约65％、约60％至约70％、约60％至约75％、约60％至约80％、约65％至约70％、约65％至约80％、约75％至约80％以及诸如此类、以及介于约1％和约80％的此类其它值。在一些实施例中，使原始重量减少＞约1％至约13％、＞约1％至约19％、＞约36％至约50％。

在另外的实施例中，把接种的组织或其细胞在干燥环境中和/或极端干燥环境中、在一个表面上进行共同培养，培养时间足以使接种的植物组织原始重量减少至少约1％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％以有诸如此类。因此，在一些实施例中，使原始重量减少至少约35％。在其它实施例中，使原始重量减少至少约55％。

于是，在一些实施例中，使所述土壤杆菌属(Agrobacterium)接种甘蔗组织或其细胞的原始重量减少＞1％至约55％。又在另外的实施例中，使所述土壤杆菌属(Agrobacterium)接种甘蔗组织或其细胞的原始重量减少＞1％至约10％。在另外的实施例中，使所述土壤杆菌属(Agrobacterium)接种甘蔗组织或其细胞的原始重量减少到35％。在另外的实施例中，使所述土壤杆菌属(Agrobacterium)接种甘蔗组织或其细胞的原始重量减少到55％。因此，例如，如果接种的植物组织原始重量是20g，那么在干燥环境中共同培同步骤的时间应足以使接种组织的重量减少＞约35％(即至＜约13g的重量)。如本文件所述，在共同培养期间，植物组织或其细胞的干燥使这种植物组织或其细胞的原始重量减少，可以显著改善甘蔗的转化效率。

“原始重量”意思是指，在转化过程开始之前，土壤杆菌属(Agrobacterium)接种甘蔗组织或其细胞的重量。在一些实施例中，转化过程是这样开始的，即使甘蔗组织或其细胞暴露于温度冲击，如下所述。在本发明的其它实施例中，所述组织不暴露于温度冲击，转化过程是这样开始的，即把土壤杆菌属(Agrobacterium)或其它适当细菌加到甘蔗组织或其细胞中。于是，“原始重量”是指在接种之前测定的这种组织的重量。因此，如本文件所用，原始重量的减少是指，在采用含有土壤杆菌属(Agrobacteria)的一种接种混悬液接种之前，所取的这种植物组织的重量，并与细菌共同培养后测定的组织重量进行比较。根据在这两个时间点(即在接种之前和在共同培养之后)测定的重量，可以计算原始重量减少的百分率。

培养时间是否足以减少土壤杆菌属(Agrobacterium)接种的植物组织的原始重量，将取决于这种接种植物组织的大小、组织的类型(例如愈伤组织对比分生组织)、与干燥环境或极端干燥环境有关的物理参数。于是，例如，这种环境可以操纵为加速接种植物组织的干燥。在一些实施例中，共同培养步骤可能是在存在空气流(如在层流罩或接近风扇的地方以便加速干燥)、在抽真空条件下、在存在适当干燥剂(如氧化钙、硫酸、硅胶等)情况下进行的。

在一些实施例中，共同培养的时间可能是约1天至约14天、约2天至约14天、约2天至约12天、约2天至约10天、约2天至约8天、约2天至约6天、约2天至约4天、约3天至约14天、约3天至约12天、约3天至约10天、约3天至约8天、约3天至约6天、约3天至约4天、约4天至约14天、约4天至约12天、约4天至约10天、约4天至约8天、约4天至约6天、约5天至约14天、约5天至约12天、约5天至约10天、约5天至约8天、约5天至约6天、约6天至约14天、约6天至约12天、约6天至约10天、约6天至约8天、约7天至约14天、约7天至约12天、约7天至约10天、约7天至约8天、约8天至约14天、约8天至约12天、约8天至约10天、约9天至约14天、约9天至约12天、约9天至约10天、约10天至约14天、约10天至约12天以及诸如此类。在其它实施例中，共同培养时间可能是1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天。在一些实施例中，上述共同培养时间，可与如上所述的、具有植物组织或其细胞原始重量不同变化的各种实施例结合。因此，任何一种共同培养时间可与如上所述的、植物组织或其细胞任何一种原始重量变化结合，和/或如上述所在共同培养中加入液体。

在共同培养步骤期间，温度可以是在本领域技术中已知的、共同培养的任何适当温度。于是，在代表性的实施例中，温度可以在从约15℃至约30℃的范围、从约16℃至约29℃的范围、从约17℃至约28℃的范围、从约18℃至约27℃的范围、从约19℃至约26℃、从约20℃至约28℃、从约20℃至约25℃、从约21℃至约24℃的范围或从约22℃至约23℃的范围。于是，在一些实施例中，在共同培养期间的温度可以是约15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃以及诸如此类、以及其任何组合。在一些实施例中，在共同培养步骤期间的温度是约20℃至约28℃，共同培养的时间是约3天至约5天；在其它实施例中，在共同培养步骤期间的温度是约23℃、约24℃或约25℃，共同培养的时间是约3天至约5天。在其它实施例中，共同培养步骤的温度是约23℃、约24℃或约25℃，共同培养的时间是约3天。又在其它实施例中，共同培养步骤的温度是约23℃、约24℃或约25℃，共同培养的时间是约4天。又在其它实施例中，共同培养步骤的温度是约23℃、约24℃或约25℃，共同培养的时间是约5天。在一些实施例中，共同培养步骤是在黑暗环境(如在缺乏外部光源的条件)中进行的。

如本文件所用，“约”的意思是在一个值的统计学意义范围内，如一个声明的浓度范围、时间范围、重量(如百分率变化，即重量的减少或增加)、体积、温度或pH。如此一个范围可能是一个给定值或范围的数量级内，典型的情况是在20％内，更典型的情况是在10％内，又更典型的情况是在5％范围内。“约”涵盖的允许变化，将取决于在研究中的特殊系统，这是本领域技术人员容易理解的。

如本文件所用，“一个(种)”或“这个(种)”的意思可能是一个或一个以上。例如，“一个(种)”细胞可能是指单独一个(种)细胞或是多个(种)细胞。

如本文件所用，“和/或”是指和涵盖一个或多个有关列出项目的任何和所有可能组合，以及当替代解释时则缺乏组合(“或”)。

如本文件所用，术语“多肽”涵盖肽类和蛋白类。

如本文件所用，一个“分离的”多肽或多肽片段意思是从天然生物至少一些其它组分(例如通常发现与这种多肽有关的细胞组分或其它多肽或核酸)中分离或大体没有此类组分的一个多肽或多肽片段。在本发明的代表性实施例中，一个“分离的”多肽、多肽片段和/或蛋白至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％纯度(w/w)或以上。

如本文件所用，“核酸”是一种大分子，它由单体核苷酸链构成，单体核苷酸包括但不限于脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。一个核酸可以包含一个基因。在特定实施例中，在本发明中的核酸是“分离的”核酸。如本文件所用，一个“分离的”核酸意思是从天然生物(例如通常发现与这种核酸有关的细胞结构组分或其它多肽或核酸)的至少一些其它组分分离的或大体上不含这些组分。在特定实施例中，“分离的”核酸至少约1％、5％、10％、25％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或以上纯度(w/w)。在其它实施例中，一个“分离的”核酸表明，与起始材料/组织或其细胞比较，达到至少约5倍、10倍、25倍、100倍、1000倍、10,000倍、100,000倍或以上的核酸富集(w/w)。

如本文件所用，关于一种核酸的术语“表达”(和语法等效词)是指这种核酸的转录和在可选情况下翻译。

如本文件所用，翻译短语“基本包括”，意思是一项权利要求的范围可以解释为涵盖在所要求保护发明的权利要求“和实质上不影响基本特征和新特征的那些材料或步骤”中引用的指定材料或步骤。因此，术语“基本包括”当在本发明的一项权利要求中使用时，意思不是要解释为等效于“包含”。

本发明的各种实施例在本文件中说明。本文所述的发明的各种实施例的任何特点能结合起来，产生属于本发明范围内的其它实施例。

共同培养是在干燥环境或极端干燥环境中、在适当的表面上进行的。典型的表面包括(但不限于)一个容器、烧瓶、培养皿(如一个皮氏培养皿或培养皿)、一个容器以及诸如此类的表面。此类容器可以由任何适当的材料组成，包括(但不限于)玻璃、瓷器、塑料(如聚苯乙烯)以及诸如此类。其它适当的表面包括：干吸水纸(如滤纸[即适合用作滤纸的一种多孔性纸，如Whatman

版滤纸]、种子发芽纸、纸巾、吸墨纸、咖啡过滤器、餐巾以及诸如此类)。

在用纸作为表面时，公认可以使用一层或多层纸，以促进接种植物组织或其细胞的干燥，例如起着一种吸收灯芯的作用。因此，例如，在一些实施例中，在共同培养步骤期间所用的表面包含、基本包括和/或包括至少一层干纸(如干滤纸)。在其它实施例中，在共同培养步骤期间所用的表面包含、基本包括和/或包括两层干纸或三层干纸。在其它实施例中，在共同培养步骤期间所用的表面包含、基本包括和/或包括4、5、6、7、8、9、10层或以上干纸。如果使用纸作为表面，它可能包含在任何适当容器、烧瓶、培养皿(如皮氏培养皿、组织培养皿)、容器中以及诸如此类。公认的是，在共同培养步骤中要用的表面可能在使用之前采用任何适当的灭菌方法进行灭菌，这些灭菌方法对本领域技术人员来说是已知的。

因此，在本发明的一些实施例中，共同培养包含把所述土壤杆菌属(Agrobacterium)接种的甘蔗组织或其细胞放在至少一层干滤纸上进行培养。在其它实施例中，共同培养包含把所述土壤杆菌属(Agrobacterium)接种的甘蔗组织或其细胞放在两层或以上干滤纸上进行培养。又在本发明的其它实施例中，共同培养包含把所述土壤杆菌属(Agrobacterium)接种的甘蔗组织或其细胞放在缺乏纸(如缺乏滤纸)的表面上进行培养。

此外，如上所述，共同培养包含把所述土壤杆菌属(Agrobacterium)接种的甘蔗组织或其细胞放在至少一层干纸上进行培养，其中所述干纸在共同培养期间定期更换。如本文件所用，“定期”的意思是，例如每小时一次、每天一次、每两天一次、每三天一次以及诸如此类。因此，在一些实施例中，共同培养包含把所述土壤杆菌属(Agrobacterium)接种的甘蔗组织或其细胞放在至少一层干纸上进行培养，其中所述干纸在共同培养期间定期更换。

在一些实施例中，其中所述环境是一种干燥环境，少量的无菌水或液体培养基，一般在共同培养步骤时可以加入＜约20uL、50uL、75uL、100uL、200uL、300uL、400uL、500uL、600uL、700uL、800uL、900uL或约1000uL。在此处所述的任何液体量可与上述任何百分率的接种植物组织或其细胞一起使用。

如本文件所述，加入少量无菌水或液体培养基，可以减慢、减少或减小干燥速度。在一些实施例中，在干燥环境中的共同培养包含把所述土壤杆菌属(Agrobacterium)接种的甘蔗组织或其细胞放在至少一层干纸上进行培养，干纸含液体达1000μL。在其它实施例中，在干燥环境中的共同培养包含把所述土壤杆菌属(Agrobacterium)接种的甘蔗组织或其细胞放在至少一层干纸上进行培养，干纸含液体＜50μL。

本发明的土壤杆菌属(Agrobacterium)介导的转化方法，适用于甘蔗属(Saccharum)(即甘蔗、能源甘蔗)及其杂种，包括甘蔗属(Saccharum)植物之间的杂种，以及相关属植物(如细叶芒(Miscanthus)、蔗茅属(Erianthus)、高梁(Sorghum)及其它)的杂种。如本文件所用，“甘蔗”和“甘蔗属(Saccharum)”意思是甘蔗属(Saccharum)多年生高草类的6-37种类的任何一种(取决于分类学解释)。特别是，这种植物可能是Saccharum aegypuacum、Saccharumesculentum、Saccharum arenicol、Saccharum arundinaceum、Saccharumbarberi、Saccharum bengalense、Saccharum biflorum、Saccharum chinense、Saccharum ciliare、Saccharum cylindricum、Saccharum edule、Saccharumelephantinum、Saccharum exaltatum、Saccharum fallax、Saccharum fallax、Saccharum floridulum、Saccharum giganteum、Saccharum hybridum、Saccharumjaponicum、Saccharum koenigii、Saccharum laguroides、Saccharum munja、Saccharum narenga、Saccharum officinale、Saccharum officinarum、Saccharumpaniceum、Saccharum pophyrocoma、Saccharum purpuratum、Saccharumravennae、Saccharum robustum、Saccharum roseum、Saccharum sanguineum、Saccharum sara、Saccharum sinense、Saccharum spontaneum、Saccharumtinctorium、Saccharum versicolor、Saccharum violaceum、Saccharum violaceum以及种类间杂种及其商业品种的任何一种。

此外，本发明列出了关于土壤杆菌属(Agrobacterium)介导任何植物转化的方法，特别是可用于增加土壤杆菌属介导转化的效率，或可用于制备对土壤杆菌属(Agrobacterium)介导转化更少抵抗性的一种特定植物。此类植物的实例包括(但不限于)：大麦，广义豆类，芸苔属(Brassica)，三叶草，可可，咖啡，棉花，亚麻，玉米，黍，花生，油菜/芸苔，水稻，黑麦，红花，高梁，大豆，糖用甜菜，向日葵，甘薯，荼，小麦；蔬菜类包括(但不限于)：瓜类，花茎甘蓝，芽甘蓝菜，卷心菜，胡萝卜，木薯，花椰菜，小扁豆，莴苣，豌豆，胡椒，菠萝，马铃薯，萝卜，番茄；草类包括(但不限于)：苜蓿，狗牙根，大象草，无芒虎尾草，高羊茅草，高麦草，细叶芒(Miscanthus)，柳枝稷；树木水果类包括(但不限于)：苹果，杏，鳄梨，香蕉，柑橘，椰子，梨，桃子，胡桃；花类包括(但不限于)：康乃馨，兰花，玫瑰。

在一些实施例中，用于本发明的土壤杆菌属(Agrobacterium)介导转化方法的一种植物、植物部分、植物组织，意思是同一植物的植物器官(如叶、茎柄、植物细胞和后代。因此，植物、植物部分、植物组织也包括(但不限于)源于植物或其后代的原生质体、结节、愈伤组织(如胚性愈伤组织)、混悬液培养物、胚胎以及花、胚珠、茎柄、果实、叶、侧芽(也叫做分蘖)、根、根尖以及诸如此类。植物细胞包括(但不限于)从下述部分获得的一种细胞：种子，胚胎，分生区域，愈伤组织，混悬液培养物，叶，根，幼苗，配子体，孢子体，花粉，和/或小胞子。本发明的植物、植物部分、植物组织可从温室生长植物或从田间生长植物获得。

在一些实施例中，用于本发明的土壤杆菌属(Agrobacterium)介导转化方法的适合植物组织可能是任何植物源的组织或其细胞，它们在引入目的核酸后适合于再生全株植物。在其它实施例中，用于本发明的土壤杆菌属(Agrobacterium)介导转化方法的植物组织或其细胞可能是任何植物源的愈伤组织或其细胞。因此，在一些实施例中，所述植物组织包括(但不限于)细胞培养物(如细胞混悬液或混悬液培养物、愈伤组织)。

典型的甘蔗组织包括(但不限于)从下述植物部分获得的甘蔗组织：幼叶基，未成熟花或花序，腋芽，分离的幼苗或根分生组织，未成熟卷叶/轮生体，未成熟侧芽(也叫做未成熟分蘖或根出条)，种子，分离的胚胎，以及诸如此类。在一些实施例中，所述甘蔗组织或其细胞是从甘蔗茎梗或分蘖获得的。在其它实施例中，所述甘蔗组织可能是未成熟叶轮生体，是从甘蔗植物的一个茎干或一个分蘖切下的。在一些实施例中，所述甘蔗组织是从前述组织获得的胚性愈伤组织。在其它实施例中，所述甘蔗组织是从幼株甘蔗分蘖组织(如未成熟侧芽)获得的胚性愈伤组织。又在其它实施例中，所述甘蔗组织是从一个茎梗或分蘖切下的一个卷叶片段或一个叶鞘片段。在另外的实施例中，所述甘蔗组织是胚性愈伤组织或其细胞，是从一个茎梗或分蘖切下的一个卷叶片段或一个叶鞘片段获得的。在另外的实施例中，所述甘蔗组织是胚性愈伤组织或其细胞。又在另外的实施例中，所述甘蔗组织是从未成熟叶轮生体组织获得的胚性愈伤组织或其细胞。胚性愈伤组织是从前述植物组织获得，是通过本领域技术中已知的和下述的预培养方法获得的。

如本文件所用，“侧芽”的意思是除初生芽(即初生茎)外的一个芽，来源于与土壤表面接近的、甘蔗植物的根茎。一个侧芽也可能叫做一个“次生芽(次生茎)”。

如上所述，在一些实施例中，植物组织或其细胞可能是从在下节间开始延伸成长发育阶段的未成熟侧芽获得的。在这个阶段的侧芽月龄通常介于约1-6个月、约1-约3个月、约1-约4个月、约1-约5个月、约2-约3个月、或约2-约4个月之间范围。在其它实施例中，在这个阶段的侧芽月龄介于6-12个月之间范围。更幼小或未成熟的侧芽从正在成熟的甘蔗植物基部生长，可通过下述方法诱导此类侧芽的产生：把正在成熟的甘蔗切至基部，以及除去更大的侧芽以促进更多侧芽生长。因此，在一些实施例中，在温室中可以产生较大数量的幼小侧芽，对转化过程可形成非常稳定的植物材料来源。应用侧芽进行转基因植物的转化和再生，可以显著减少对甘蔗生长和发育的影响，因为没有必要取下整个初生芽或其部分用于转化目的，且甘蔗植物可以在相当的一段时间继续产生侧芽。这种植物材料可以许多不同的方式加工和预处理，以尽量扩大它用作土壤杆菌属(Agrobacterium)介导转化目标的潜力。另外，侧芽可以从温室种植的植物获得。在其它实施例中，用于本发明的这种植物组织是从田间生长植物获得的。

可以采用本文件所述的和对本领域技术人员来说众所周知的标准方法，从植物切下初生芽和侧芽并进行灭菌，以便在人工培养基中建立无菌培养物。例如，侧芽可以70％酒精溶液或20％漂白剂溶液接触。在切下的侧芽灭菌后，获得植物组织的一个片段、切片或切面。在一些实施例中，所述切面的厚度可能是约0.1mm、约0.2mm、约0.3mm、约0.4mm、约0.5mm、约0.6mm、约0.7mm、约0.8mm、约0.9mm、约1mm、约1.5mm、约2mm、约3mm、约4mm、约5mm、约6mm，7mm、约8mm、约9mm、约10mm或以上。以这种方式获得的植物组织常常叫做“外植体”。术语“外植体”是指从一种生物切下并放在一种培养基中进行组织培养的活组织。

在一些实施例中，外植体可能是从初生茎或侧芽组织获得的，包括叶纺缍体或轮生体、茎柄、叶鞘、卷叶(分生区域)、结节或节间片段。在一些实施例中，所述外植体可能是叶鞘或卷叶切面。这个片段可以从紧邻顶生分生组织正上方至顶生分生组织之上达约10mm至约50mm的部分切下。因此，所述片段可以从紧邻顶生分生组织正上方至顶生分生组织之上大约10mm、大约20mm、大约30mm、大约40mm或大约50mm的部分切下。在各种实施例中，所述外植体不是一个结节片段人，也不是一个切间片段。如本文件所用，“结节片段”的意思是在可能从其生长出一个或多个叶的一个茎柄中任何关节，包括在茎柄一侧(如在叶腋)上的任何侧芽(腋芽)。介于两个结节之间的茎柄部分叫做“节间”。在切成片段这衫，可以从侧芽切下外部的一个或两个叶。

如上所述，在一些实施例中，本发明列出了把植物组织进行一个预培养步骤的方法，其中所述植物组织是在足以产生胚性愈伤组织的条件下、在一种适当的预培养基中进行培养的。因此，在本发明的一些实施例中，所述甘蔗组织或其细胞是通过把所述分蘖的一个片段预培养一段时间获得的，以产生胚性愈伤组织，再把所述甘蔗组织或其细胞与含有土壤杆菌属(Agrobacterium)的所述接种混悬液进行接触。

术语“愈伤组织”是指一个未分化的繁殖性细菌或组织块。在各种实施例中，所述培养基适合于胚性愈伤组织的诱导。如本文件所用，“胚性愈伤组织”意思是这样的组织或细胞，它们是未分化的、没有重要结构的，但它们有潜力形成一种进一步分化的组织(如胚性组织)，这种组织可以产生胚胎和发芽形成植物。

足以进行胚性愈伤组织转化的培养条件对本领域技术人员来说是已知的，可能根据甘蔗栽培品种而变化。对建立和维持胚性愈伤组织培养物的适合培养基在下述文献中说明，例如：Methods in Molecular Biology(分子生物学方法)，第344卷(Wang，编辑；Springer(2006))，第227-235页；出版国际申请号WO 01/33943；美国专利号5,908,771；美国专利号6,242,257；Croy，编辑(1993)：Plant Molecular Biology(植物分子生物学)，Labfax(BiosScientific Publishers，Ltd.)；Jones，编辑(1995)：Plant Transfer and ExpressionProtocols(植物基因转移与表达)(Humana Press)；以及在本文件中引用的参考文献。这些参考文献每个经提及而以其整体合并入本文中。与培养植物细胞有关的其它细节内容，包括预处理过程，均列在下面的“实验”一节中。

用于转化的植物组织可培养约1天至约100天，包括1天和100天，然后再用土壤杆菌属(Agrobacterium)或其它适当的细菌进行接种(即预培养的)。在各种实施例中，在转化之前，植物组织可以培养约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约12天、约14天、约16天、约18天、约20天、约25天、约30天、约35天、约40天、约45天、约50天、约55天、约60天、约65天、约70天、约75天、约80天、约85，天、约90天、约95天或约100天、以及诸如此类。培养基可能包括Murashige和Skoog(MS)营养配方(Murashige和Skoog(1962)：Physiologia Plantarum 15：473-497)或Gamborg氏培养基(Gamborg等(1968)：Exp.Cell Res(实验细胞研究)，50：151-158)。优先情况是，这种培养基包含有MS营养配方。可以理解的是，上述培养基是商品销售的，其它可能有用的培养基也是商品销售的。

这种培养基可能进一步包含蔗糖，可能另外包括琼脂。因此，可以理解的是，植物组织可以在固体或液体培养基中预培养。

预培养基的其它成分可能包括植物激素，如细胞分裂素和/或茁长素。在各种实施例中，细胞分裂素可以从激动素和N6-苄基腺嘌呤(BA)构成的小组中选择，或从其组合选择。根据本发明，有若干其它细胞分裂素和/或细胞分裂素样化合物可能是有用的，如玉米素、α-异戊基腺苷和/或二苯脲。

在各种实施例中，茁长素是1-萘乙酸(NAA)和/或2，4二氯苯氧基乙酸(2，4D)。根据本发明，有各种其它茁长素或茁长素样化合物可能是有用的，例如：吲哚-3-丁酸(IBA)，对氯苯氧基乙酸(CPA)，吲哚-3-乙酸(IAA)，2，4，5-三氯苯氧基乙酸，苯乙酸，毒莠定，β-萘氧基乙酸，麦草畏，和/或反式肉桂酸。

对熟练技术人员来说显而易见，茁长素和/或细胞分裂素的最有效浓度，可以交叉试验茁长素和/或细胞分裂素的各种浓度经验测定。它们任何一种或它们二者的最佳浓度，可以根据特定植物从其取得培养植物组织的特定植物栽培品种进行调整。

在初始胚胎愈伤组织形成后，高质量的反应可选次代培养约1天至约10天(包括1天和10天)，以获得用于经土壤杆菌属(Agrobacterium)接种的转化的愈伤组织。

然后，如本文件所述，把植物组织如胚性愈伤组织进行接种步骤，其中所述愈伤组织细胞与一种接种培养物接触，所述接种培养物含有一种细菌例如土壤杆菌属(Agrobacterium)，这种细菌含有要引入甘蔗植物组织中的一个目的核酸。

关于接种甘蔗组织或其细胞以获得一种土壤杆菌属(Agrobacterium)接种植物组织或其细胞的、以及关于选择一种转化甘蔗组织或其细胞的任何适当方法，都可用于本发明的方法中，包括对本领域技术人员来说已知的程序和下面所述的那些方法。本发明的转化方法具有一个明显特点，即土壤杆菌属(Agrobacterium)接种的组织或其细胞进行共同培养步骤的操作包括：如上所述，在干燥环境或极端干燥环境中的表面上培养接种的植物组织或其细胞，培养时间足以减少接种的植物组织或其细胞的原始重量。因此，关于含有采用土壤杆菌属(Agrobacterium)(这种细菌含有一种目的核酸)接种步骤的甘蔗的任何转化方案，均可通过修改这种方法纳入本文件披露的共同培养方案进行改进。

关于植物的土壤杆菌属(Agrobacterium)介导转化的许多方法，在本领域技术中是已知的。请参见下述文献，例如：美国专利号5,563,055和5,981,840；也请参见下述文献：Arencibia等(1998)：Transgenic Res.(转基因研究)，7：123-222；Arencibia&Carmona：“甘蔗(甘蔗属(Saccharum))”，在：Methodsin Molecular Biology，Agrobacterium Protocols(分子生物学方南，土壤杆菌属(Agrobacterium))，第2卷；编辑：Wang(第2版，Humana Press公司)，第227-235页(2007)；de la Riva等(1998)：Electron.J.Biotechnol.(生物电子技术杂志)，1：118-133；Manickavasagam等(2004)：Plant Cell Rep.(植物细胞报告)，23：134-143；Opabode(2006)：Biotechnol.Mol.Biol.Rev.(植物细胞报告)，1：12-20；和Zhang等.(2006)：J.Integr.Plant Biol.(生物技术与分子生物学评论)48：453-459)。

如本文件所用，“土壤杆菌属(Agrobacterium)”意思是土壤杆菌属(Agrobacterium)的一个种、亚种或菌株，它能够动员和选择性转移T-DNA到一种植物或其细胞中。在特殊实施例中，土壤杆菌属(Agrobacterium)可能是毛根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)(即毛根根瘤菌(Rhizobiumrhizogenes))或根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)。能够动员和选择地转移T-DNA到一种植物或植物细胞中任何土壤杆菌属(Agrobacterium)，均可用于本发明中。在一些实施例中，使用野生型菌株。在其它实施例中，使用土壤杆菌属(Agrobacterium)物种类的“去毒”衍生物，其中已除去Ti质粒的肿瘤诱导性序列。适合的根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)菌株包括(但不限于)：例如，EHA101，如下述文献所述：Hood等(1986)：J.Bacteriol.(细菌学杂志)，168：1291-1301)；LBA4404，如下述文献所述：Hoekema等(1983)：Nature(自然)，303：179-180；和C58(pMP90)，如下述文献所述：Koncz和Schell(1986)：Mol.Gen.Genet.(分子遗传学与普通遗传学)，204：383-396，EHA 105，AGLI和AGL0，SBI；以及诸如此类和其任何组合。适合的毛根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)菌株包括(但不限于)：15834(如下述文献所述：Birot等：Biochem[生物化学]，25：323-35)和R1000。在另外的实施例中，除土壤杆菌属(Agrobacterium)种类及其菌株外，对核酸转移可用的其它细菌种类及其菌株均可用于本发明的转化方法(请参见CAMBIA(www.cambia.org)所述的实例；也请参见Broothaerts等(Nature[自然]，433：629-633(2005))的实例。能进行核酸转移的非土壤杆菌(non-Agrobacterium)细胞的非限制性实例包括：中华根瘤菌(Sinorhizobium)、Mesorhizobium(华癸根瘤菌)和根瘤菌(Rhizobium)(Id.)。

接种可以根据本领域技术中已知的任何方法进行，通常涉及把甘蔗组织或其细胞与含有一种细菌菌株(如土壤杆菌属(Agrobacterium)的接种培养物混合，这种细菌菌株包含质粒或载体，这种质粒或载体含有一个目的核酸。一种典型的接种培养物是从培养的土壤杆菌属(Agrobacterium)制备的一种接种混悬液。采用这种方式，含有待转化于甘蔗组织或其细胞的目的核酸的土壤杆菌属(Agrobacterium)菌株，在适当的培养基上进行培养，这种培养基添加有对这种菌株或载体选择性的抗生素(例如，请参见下面“实验”一节所述的研究方案)。本领域技术人员熟悉关于土壤杆菌属(Agrobacterium)和适当培养条件的程序。一般来说，土壤杆菌属(Agrobacterium)培养物是从一种甘油储备溶液或从划线平板接种的，再培养过夜。然后洗涤细菌细胞，并把细菌细胞再悬浮于适合甘蔗组织或其细胞接种的培养基中。如本文件所用，“接种混悬液”意思是准备用于接种植物或其细胞的一种细菌细胞(如土壤杆菌属(Agrobacterium))混悬液。“接种培养物”是指细菌细胞和植物组织或其细胞的合并物质。

接种(即感染)本身是在室温下(即在约20℃至约25℃下)、可能持续至少约1分钟至约12小时(即过夜)。在接种过程中，可以考虑应用其它处理方法协助土壤杆菌属(Agrobacterium)感染，如接种培养物的超声处理或真空浸润。例如，可以超声处理接种培养物，如下述文献所述：Trick和Finer(1998)：Plant Cell Rep.(植物细胞报告)，17：482-488；和美国专利号5,693,512。另外或此外，接种培养物可如下述文献所述在抽真空条件下进行浸润：Amoah等(2001)：J.Exp.Bot.(实验植物学杂志)，52：1135-1142；和Park等(2005)：PlantCell Rep(植物细胞报告)，24：494-500。

在一些实施例中，在接种之前，可以考虑把甘蔗组织进行温度差别预处理。“温度差别预处理”意思是，把甘蔗组织或其细胞暴露于比进行接种时温度较高的温度下。因此，例如，如果接种是在约室温下(如约20℃至约25℃)，那么温度差别预处理可包含使甘蔗组织或其细胞暴露于比进行接种温度(例如，室温)高约5℃、约10℃、约15℃、约20℃、约25℃或约30℃的温度。温度差别预处理的时间长度，将根据甘蔗组织的类型和来源而变化。因此，在一些实施例中，温度差别预处理的时间长度是约1分钟至约60分钟、约1分钟至约50分钟、约1分钟至约40分钟、约1分钟至约30分钟、约1分钟至约20分钟、约1分钟至约15分钟、约1分钟至约10分钟或约1分钟至约5分钟。在其它实施例中，温度差别预处理的时间长度是1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、11分钟、12分钟、13分钟、14分钟、15分钟、16分钟、17分钟、18分钟、19分钟、20分钟、21分钟、22分钟、23分钟、24分钟、25分钟、26分钟、27分钟、28分钟、29分钟、30分钟、31分钟、32分钟、33分钟、34分钟、35分钟、36分钟、37分钟、38分钟、39分钟、40分钟、41分钟、42分钟、43分钟、44分钟、45分钟、46分钟、47分钟、48分钟、49分钟、50分钟、51分钟、52分钟、53分钟、54分钟、55分钟、56分钟、57分钟、58分钟、59分钟、60分钟以及诸如此类。

因此，在一些实施例中，在采用本领域技术人员已知的方法进行接种之前，可以考虑把甘蔗组织或其细胞用热休克预处理。因此，作一个非限制性实例，热休克包含使植物组织或其细胞与预热至约温度35℃至约55℃的培养基接触约1分钟至约15分钟，如碱性培养基(Murashige和Skoog培养基；Murashige和Skoog(1962)：Physiol.Plant[植物生理学]，15：473-497)。在另一个非限制性实例中，热休克包含使植物组织或其细胞与预热至约45℃温度的培养基接触约5分钟。

在共同培养步骤后、在选择和再生转基因植物部分或转基因植物之前，可选通过把接种的植物组织在休眠培养基中培养，使土壤杆菌属(Agrobacterium)接种的植物组织休眠。如本文件所用，“休眠培养基”意思是在共同培养后培养接种植物组织或其细胞的一种培养基，共同培养典型含有能够抑制或阻止细菌生长和代谢活性或杀死细菌的药物(如抑菌药或杀菌药)。如本文件所用，“抑菌的”意思是能够抑制或阻止细菌的生长或繁殖。相比而言，“杀菌的”的意思是能够直接杀死细菌。例如，休眠培养基可能是一种基础培养基(如Murashige和Skoog(MS)培养基)，添加有特美汀(替卡西林/克拉维酸钾)和/或其它抗生素(包括但不限于：头孢噻肟和/或羧苄西林)。也请参见下述文献：Zhao等(2001)：Molecular Breeding(分子育种)，8：323-333。

于是，在休眠步骤中，土壤杆菌属(Agrobacterium)接种的植物组织或其细胞可在休眠培养基中培养约1天至约15天、约2天至约14天、约2天至约12天、约2天至约11天、约2天至约10天、约3天至约10天、约4天至约10天、约5天至约10天、约6天至约9天或约6天至约8天。这样，在共同培养步骤后，接种的植物组织或其细胞可在休眠培养基中培养约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天或约15天。在一些实施例中，没有纳入休眠步骤，代之在共同培养后，植物组织或其细胞进行如下述的选择。在一些实施例中，选择培养基可能包括能抑制细菌生长和或杀死细菌的至少一种化合物。

在代表性实施例中，在接种和共同培养后，后续的选择和再生步骤可以采用本领域已知的任何方法进行。请参见下述文献，例如：McCormick等(1986)：Plant Cell Rep.(植物细胞报告)，5：81-84。例如，可能把植物材料转移到含有一种选择性药物的培养基中，所述选择性药物能阻止没有接受目标多聚核苷酸(例如，能编码目的核苷酸的一个多聚核苷酸和/或编码赋予对选择性药物耐药性的一种核苷酸序列的一个多聚核苷酸)的细胞生长，所述多聚核苷酸的至少一种表达产物能够阻止一种选择性药物的作用，从而选择转化的植物细胞。如本文件所用，“选择”的意思是这样的一个过程，其中一种或多种植物、植物组织或植物细胞被鉴别为具有一个或多个目的特性，例如一个可选择标记基因或一个可评分标记基因、增强抗虫性、增加或减少类胡萝卜素水平、改变颜色等。例如，选择过程可能包括把生物置于这样的条件下，这些条件支持具有一种特定基因型的那些生物的生长。

选择步骤可能包含：把含有目的核苷酸序列的植物愈伤组织和/或其细胞置于选择性条件下，其中这种选择性条件包括足以区分转化细胞与非转化细胞的条件。此类条件可能随下述情况而变化，例如：所用可选择标记基因的类型，栽培品种，靶向经的植物材料；但此类条件一般包含支持转化细胞生长但抑制非转化细胞生长的条件。

例如，在代表性实施例中，在选择过程中，在一种分步式选择过程中可以把土壤杆菌属(Agrobacterium)接种的植物材料暴露于一种选择性药物的亚致死水平约2周至约12周，然后暴露于这种选择性植物材料的致死水平约4周至约30周。

编码可选择标记基因的核酸可能在目的核苷酸序列的同一个表达盒中，或在不同的表达盒中共同转化。可选择标记物和选择性药物在本领域技术中是已知的。编码在转化方法常规使用的可选择标记基因的核酸非限制性实例包括：编码nptII的核酸，后者赋予对卡那霉素和相关抗生素的耐药性(Messing和Vierra(1982)：Gene(基因)，19：259-268；Bevan等(1983)：Nature(自然)，304：184-187)；编码bar的核酸，后者赋予对除草剂草丁膦的耐药性(White等(1990)：Nucleic Acids Res.[核酸研究]，18：1062；Spencer等(1990)：Theor.Appl.Genet.[理论和应用遗传学]，79：625-631)；编码hph的核酸，后者赋予对抗生素潮霉素的耐药性(Blochinger和Diggelmann(1984)：Mol.Cell.Biol.[分子与细胞生物学]，4：2929-2931)；编码dhfr的核酸，后者赋予对甲氨喋呤的耐药性(Bourouis等(1983)：EMBO J.(EMBO杂志)，2(7)：1099-1104)；编码EPSPS的核酸，后者赋予对草甘膦的耐药性(美国专利号4,940,935和5,188,642)；和编码磷酸甘露糖异构酶(PMI)的核酸，后者赋予对代谢甘露糖的能力(美国专利号5,767,378和5,994,629)。

这样，在一些实施例，本发明提供了产生一种转化甘蔗组织或其细胞的方法，所述方法包含：用一种土壤杆菌属(Agrobacterium)接种一种甘蔗组织或其细胞，所述土壤杆菌属(Agrobacterium)含有一种目的核酸，从而获得一种土壤杆菌属(Agrobacterium)接种的甘蔗组织或其细胞，其中所述目的核酸含有一个表达盒，所述表达盒含有赋予对一种选择性药物耐药性的一种核酸；把所述土壤杆菌属(Agrobacterium)接种的甘蔗组织或其细胞在缺乏共同培养基的表面上进行培养，培养时间足以减少所述土壤杆菌属(Agrobacterium)接种甘蔗组织或其细胞的原始重量；选择含有所述目的核酸的一种转化甘蔗组织或其细胞，其中这种选择包含把所述土壤杆菌属(Agrobacterium)接种的甘蔗组织放在含有所述选择性药物的一种培养基上进行培养、并选择含有所述目的核酸的一种转化甘蔗组织或其细胞。

在存在选择性药物的条件下生长的植物组织或其细胞，可进一步操纵进行植物再生。如本文件所用，“进行再生”、“再生”(和其语法等效变化)的意思是从包括根苗的各种植物部分(如植物外植体、愈伤组织、植物细胞)形成一种外植体。从各种植物部分再生植物，在本领域技术中是众所周知的。请参见下述文献，例如：Methods for Plant Molecular Biology(植物分子生物学方法)(Weissbach等，编辑：Academic Press公司(1988)；关于甘蔗的再生，请参见见下述文献，例如：Arencibia等(Trans.Res.[转基因研究]，7：213-222(1998))；Elliot等(Plant Cell Rep.[植物细胞报告]，18：707-714(1999))；和Enriquez-Obregon等(Planta 206：20-27(1998))。例如，含有经土壤杆菌属(Agrobacterium)引入一个目的核酸的、从叶外植体获得的植物，可以进行再生，如下述文献所述：Horsch等(1985)：Science(科学)，227：1229-1231。简言之，转化体是在存在一种选择性药物和在能诱导幼苗(如甘蔗的幼苗)再生的培养基等条件下生长的。请参见下述文献，例如：Fraley等(1983)：Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院院刊)，80：4803-4807。这种方法通常在约2周至4周内产生幼苗，然后把转化的幼苗转移到适当的根诱导培养基中，所述培养基含有这种选择性药物和防止细胞进一步生长的一种抗生素。通常情况下，转化幼苗的根是在存在选择药物的条件下培养以形成小苗，再把这种转化的幼苗移栽到土壤或其它培养基中，以便产生另外的根。(欲知关于甘蔗再生的参考文献，请参见：Lakshmann等：In Vitro Cell DevelBiol[体外细胞和发育生物学]，41：345-363(2005)。)

然后把转基因小苗移到土壤或土壤替代物中繁殖，以促进生长为成熟的转基因植物。从这些小苗繁殖转基因植物，在比如珍珠岩、泥炭和沙石(1∶1∶1)或商用植物栽培介质混合物中、在温室条件下进行。

如上所述，本发明的转化方法可用于把目的核酸引入甘蔗植物、植物部分和/或植物组织中。

在目的核苷酸序列环境中的“引入”，意思是使所述目的核苷酸序列出现在植物、植物部分或植物组织中，其方式是可以使这种核苷酸序列进入细胞的内容。当引入一个以上的核苷酸序列时，这些核苷酸序列可以组装成单独一个多聚核苷酸或核酸构建体的一部分，或组装不同的多聚核苷酸或核酸构建体，它们可位于相同的或不同的转化载体上。因此，可在单独一个转化事件和不同的转化事件中、或例如作为育种方案一部分，把这些多聚核苷酸引入甘蔗植物细胞中。

在多聚核苷酸环境中的“短暂转化”，意思是把一个多聚核苷酸引入这种细胞中、但没有结合在这种细胞的基因组中。

在多聚核苷酸环境中“稳定引入”或“已稳定引入”，意思是表明这种引入的多聚核苷酸是稳定结合于这种细胞的基因组中，因此这种细胞是采用这种多聚核苷酸稳定转化的。

本文件所用的“稳定转化”或“已稳定转化的”，意思是把一种核酸引入一种细胞中并结合于这种细胞的基因组中。照此，这种结合的核酸能够被其后代继承，尤其能够被多个连续世代的后代继承。如本文件所用，基因组也包括质粒基因组，因此包括核酸结合于(例如)叶绿体基因组中的情况。如本文件所用，稳定转化也指染色体外(例如微型染色体)维持存在的转基因。

和本发明的方法一致，通过传统转化方法把目的核酸引入能够进行核酸转移的一种细菌菌株(如一种土壤杆菌属(Agrobacterium)菌株)，然后所述细菌菌株用于本发明的转化方法中，以便把所述目的核酸引入一种甘蔗植物、植物部分、组织或细胞中。许多载体可供用于土壤杆菌属(Agrobacterium)的转化。这些载体通常携带至少一个T-DNA边界序列，包括诸如pBIN19(Bevan，Nucleic Acids Res.[核酸研究]，12：8711-8721(1984))等的载体。欲知在土壤杆菌属(Agrobacterium)转化中有用的载体的构建，例如请参见美国专利号2006/0260011；它通过提及而以其整体合并入本文件中。

土壤杆菌属(Agrobacterium)转化，通常涉及携带这个目的核酸的一个二元载体转移到一种适当的土壤杆菌属(Agrobacterium)菌株中，它可能依赖于这个宿主土壤杆菌属(Agrobacterium)菌株携带的vir基因的补体，所述补体或在共居Ti质粒上或在染色体上(Uknes等(1993)：Plant Cell[植物细胞]，5：159-169)。这种重组二元载体转移到土壤杆菌属(Agrobacterium)中，是采用携带这种重组二元载体的大肠杆菌(E.coli)三亲株交配程序完成的；这种大肠杆菌(E.coli)是一种大肠杆菌(E.coli)协助菌株，它携带诸如pRK2013的一种质粒，它也能动员这种重组二元载体到目标土壤杆菌属(Agrobacterium)菌株中。或者，可以采用DNA转化，把这个重组二元载体转移到土壤杆菌属(Agrobacterium)中(Hofgen和Willmitzer(1988)：Nucleic Acids Res.[核酸研究]，16：9877)。

任何目的核酸均可转化到土壤杆菌属(Agrobacterium)菌株或能进行核酸转化的其它菌株中，以便采用本发明的方法进行后续的甘蔗转化。在一些实施例中，所述核酸将会是含有一个表达盒的一个多聚核苷酸构建体；所述表达盒含有功能性元件，在经本发明的土壤杆菌属(Agrobacterium)介导转化方法把一个目的多聚核苷酸引入甘蔗中后，这些功能性元件允许这个目的多聚核苷酸在甘蔗中表达。

表达盒可能含有编码一个多聚核苷酸的一个核酸，所述多聚核苷酸赋予可以用于检测、鉴别或选择转化植物细胞和组织的一种特性(如用于选择转化细胞的标记基因)。编码这个标记基因的核酸可能在目的核苷酸序列的同一个表达盒中，或可能在不同的表达盒中共同转化。在一些实施例中，编码这种标记基因的核酸可能是目的核苷酸序列。因此，在本发明的一些实施例中，所述目的核酸含有一个表达盒，所述表达盒进一步含有赋予对一种选择性药物耐药性的一个核苷酸序列，因此所述选择包含把土壤杆菌属(Agrobacterium)接种的甘蔗组织或其细胞在含有这种选择性药物的培养基中培养，并选择含有所述目的核酸的一种转化甘蔗组织或其细胞。

在其它实施例中，所述核酸可能是含有一个表达盒的一个多聚核苷酸构建体，所述表达盒含有一个功能性核苷酸。如本文件所用，“功能性多聚核苷酸”意思是可被转录(但不是翻译)的多聚核苷酸，如抑制性核酸。

抑制性核酸可能抑制一种目的多肽的表达，如下述的那些多肽。通过防止编码一种多肽(例如：有义抑制/协同抑制，反义抑制，通过较小干扰性RNA的双链RNA(dsRNA)干扰，微小RNA或短发夹RNA，扩增子介导干扰，核酶)的信使RNA翻译，抑制性核酸可以直接抑制这种多肽的表达。在其它实施例中，所述核酸可能编码抑制一种核酸序列转录或翻译的一种多肽，所述核酸序列编码所述目的多肽。在本领域技术中，抑制或消除一种基因产物在哺乳动物细胞中的表达是众所周知的，任何此类方法均可用于本发明，以抑制目的多肽的表达。

对有义抑制/协同抑制，表达盒可以设计为表达一个协同抑制性核酸，所述核酸相当于在“有义”方向编码一种目的多肽的天然核酸。协同抑制性核酸可能相当于编码所述目的多肽的核酸的全部或部分、编码所述目的多肽的核酸5′端和/或3′端非翻译区域的全部或部分、或编码所述目的多肽的编码序列和非翻译区域的全部或部分。一般情况下，协同抑制性核酸可能含有至少约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000个核苷酸，或可能是达到和包括编码所述目的多肽的全长核酸序列的任何大小。如果协同抑制性核酸含有所述目的多肽编码区域的全部或部分，则所述表达盒可以设计为消除起始密码子，以便从所述抑制性核酸不会转录任何功能性目的多肽。协同抑制性核酸的过度表达，可能导致编码所述目的多肽的核酸的表达减少。

对反义抑制，表达盒可以设计为表达一种反义核酸，所述反义核酸与编码所述目的多肽的一种天然核酸全部或部分是互补的。反义核酸可能相当于编码所述目的多肽的核酸补体的全部或部分、编码所述目的多肽的核酸5′端和/或3′端非翻译区域补体的全部或部分、或编码所述目的多肽的编码序列和非翻译区域补体的全部或部分。反义核酸也可能与编码所述目的多肽的核酸是完全互补的(即与靶标核酸序列的补体100％相同)或部分互补的(即与靶标核酸序列的补体＜100％相同)。反义核酸的表达，可能导致编码所述目的多肽的核酸的表达减少。

无论所用的反义核酸是什么类型，可以使用至少15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550个核苷酸或以上的序列。

在表达盒中，通过在反义序列的3′端位置和聚腺苷酸化信号的5′端位置纳入一个聚DT区域，可以增加反义抑制的效率。请参见美国专利申请公布号2002/0048814。

对dsRNA干扰，在同一细胞中表达与上述协同抑制核酸类似的一个有义核酸和与这个有义核酸序列完全或部分互补的一个反义核酸，导致编码所述目的多肽的一种天然核酸表达的抑制。通过设计表达盒含有编码所述目的多肽的核酸的有义序列和反义序列，可以完成这些有义和反义核酸的表达。或者，对有义和反义核酸，可以使用不同的表达盒。

无论用于dsRNA干扰的核酸是什么类型，可以使用至少15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550个核苷酸或以上的序列。

对扩增子介导的干扰，扩增子表达构建体可以设计为含有一个核酸序列，所述核酸序列含有一个病毒源序列，所述病毒源序列含有编码所述目的多肽的天然核酸的全部或部分。在扩增子表达盒中转录产物存在的病毒序列，允许所述转录产物指导它本身的复制。相对于编码所述目的多肽的核酸序列，由扩增子产生的转录物可能是有义的或反义的。

无论用于扩增子介导干扰的核酸是什么类型，可以使用至少15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550个核苷酸或以上的序列。

对核酶，表达构建体可以设计为表达一个核酸，所述核酸对由编码所述目的多肽的天然核酸序列表达的mRNA有催化活性。这种催化性核酸引起编码所述目的多肽的mRNA或核酸降解，导致所述目的多肽的表达减少。

无论用于核酶的核酸是什么类型，可以使用至少15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550个核苷酸或以上的序列。

对微小RNA(miRNA)干扰，表达构建体可以设计为表达一个核酸，所述核酸与编码所述目的多肽的天然核酸序列是互补的，以便可以使所述miRNA转录(但不是翻译)到所述目的多肽中(即一种非编码性RNA)。把每个初级转录物(pri-miRNA)加工成一个短茎环结构(叫做pre-miRNA)，最后加工成一个功能性miRNA。成熟的miRNA在抑制所述编码目的多肽的核酸表达方面是高度有效的。因为成熟的miRNA与编码所述目的多肽的一个或多个核酸是部分互补的，它们通过抑制编码所述目的多肽的核酸的翻译或有时促进编码所述目的多肽的核酸的断开而下调基因表达。

对短发夹RNA(shRNA)干扰，表达盒可以设计为表达一个核酸，所述核酸与编码所述目的多肽的天然核酸是互补的，它形成一个紧密的发夹环，可用于使经RNA干扰的基因表达沉默。shRNA干扰也可能是含有内含子的发夹RNA(ihpRNA)干扰，其中所述表达盒可以设计为表达一个核酸，所述核酸编码具有一种发夹结构的内含子剪接RNA。

无论所用的shRNA是什么类型，可以使用至少15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550个核苷酸或以上的序列。

关于shRNA干扰，表达盒也可以这样设计，以致有义序列和反义序列并不相当于编码所述目的多肽的核酸。代之，所述有义和反义序列位于一个环序列的侧面，所述环序列含有一个核苷酸序列，所述核苷酸序列相当于编码所述目的多肽的核酸序列的全部或部分。因此，所述环区域决定了RNA干扰的专属性。请参见下述文献，例如：国际专利申请公布号WO 02/00904。

此外，转录基因沉默(TGS)可通过使用shRNA分子完成，其中所述发夹结构的倒转重复，与编码所述待沉默目的多肽的核酸序列启动子区域具有序列一致性。把shRNA加成可与同源启动子区域相互作用的短RNA，可能触发导致沉默的变性或甲基化(请参见下述文献，例如：Aufsatz等：Proc.Natl.Acad.Sci.[美国国家科学院院刊]，99：16499-16506(2002)；和Mette等：EmboJ.[EMBO杂志]，19：5194-5201(2000))。

因此，本发明的方法包含采用所述一个或更多目的核酸分子进行植物组织或其细胞的转化。在一项实施例中，所述核酸包含一个表达盒，所述表达盒含有编码所述目的多肽和/或功能性目的多聚核苷酸的一个核苷酸序列。如在本文中所用，“表达盒”意思是能够在一种甘蔗细胞中指导特定核苷酸序列的表达的DNA序列，包含可操作连接至所述目的核苷酸序列(其可操作连接至终止信号)的启动子。它也通常包含对于核苷酸序列的正确翻译来说所需要的序列。编码区通常编码目的多肽，但也可编码目的功能性RNA，例如反义RNA或非翻译RNA(以有义或反义方向)。含有目的核苷酸序列的表达盒可能是嵌合基因，意味着它的至少一个成分对它的至少一个其它构件来说是异源性的。表达盒也可能是天然发生的(即来源于甘蔗)，在一些实施例中它是以重组形式获得的、对异源表达有用的表达盒。但是，通常情况下，表达盒对甘蔗植物来说是异源的，即表达盒的特定DNA序列不是在甘蔗植物中天然发生的，必须采用转化事件引入甘蔗植物中或引入甘蔗植物的原种中。在表达盒中目的核苷酸序列的表达可能是在组成型启动子或诱导型启动子的控制下进行的，所述启动子仅在甘蔗植物、组织或细胞暴露于一些特定外部刺激时才开始转录。此外，所述启动子也可能在特定细胞、特定组织或特定器官中专门表达或优先表达，或在某一特定发育阶段专门表达或优先表达。

表达盒可能包含在5′-3′端转录方向、一个转录和翻译开始区域(即启动子)、一个目的多聚核苷酸。表达盒可选包含在植物中的转录和翻译功能性终止区域(即终止区域)。在一些实施例中，表达盒进一步包含编码一个核酸的一个核苷酸序列，所述核酸赋予对一种选择性药物的耐药性(如可选择标记核酸)，这样可允许选择稳定的转化体。又在另外的实施例，本发明的表达盒也可能包含一个前导序列和/或允许目的多聚核苷酸诱导型表达的一个序列。请参见下述文献，了解关于允许进行诱导型表达的实例：Guo等(2003)：Plant J.(植物杂志)，34：383-92；和Chen等(2003)：Plant J.(植物杂志)，36：731-40。

表达构建体的调控序列是可操作地连接到目的核苷酸的。如本文件所用，当指与第二个核酸序列可操作地连接的第一个核酸时，“可操作连接”意思是把第一个核酸序列置于与第二个核酸序列存在功能性关系的情况。例如，如果一个启动子能够影响一个编码序列的转录或表达，那么这个启动子可操作连接到这个编码序列上。一般情况下，可操作连接的核酸序列是邻接的；在有必要把两个蛋白编码区域连接在一起时，则开放阅读框架对齐。

在本发明的工作中，可以使用能够在目的植物中驱动表达的任何启动子。对在其中要引入所述表达盒的甘蔗植物，所述启动子可能是天然的或同源的、或外源的或异源的。当在本文件中用于指一个核酸序列(如一个DNA或RNA序列)时，术语“异源”和“外源”是指从这个特定植物的外部来源发生的(即对这种甘蔗植物是外源的)，或如果是同相同来源发生的、但是从其原始形式改良的。因此，例如，在甘蔗植物中异源核酸包括对这种特定细胞是内源的、但已通过(例如)运用DNA重排改良的核酸。术语“异源”或“外源”核酸也包括一个天然发生DNA序列的非天然的多个拷贝。因此，这些术语是指与这种细胞外源或异源的DNA片段，或对这种甘蔗细胞同源、但处于这个元件非常规发现的细胞基因组位置的DNA片段。表达外源/异源DNA片段，则产生外源/异源多肽或功能性多聚核苷酸。

“同源”核酸序列是与待引入该核酸序列的甘蔗细胞天然有关的核酸(如DNA或RNA)序列。

选择要纳入表达盒的启动子，取决于几个因素，包括(但不限于)：效率，选择性，诱导性，需要的表达水平，细胞或组织优先表达情况。对本领域技术人员来说，调节一个可操作连接序列的表达是一种常规工作，即通过适当选择和定位启动子和相对于一个序列的其它调控区域。

一些适当的启动子只在或主要在特定细胞类型中开始转录。因此，如本文件中所用，一种细胞类型优先或组织优先启动子是在甘蔗组织中优先驱动表达的启动子，但也可能在其它细胞类型或组织中引起一定的表达。例如，在植物基因组DNA中鉴别和表征的启动子区域的方法，包括在下述参考文献中所述的那些方法：Jordano等：Plant Cell(植物细胞)，1：855-866(1989)；Bustos等：Plant Cell(植物细胞)，1：839-854(1989)；Green等：EMBO J.(EMBO杂志)，7，4035-4044(1988)；Meier等：Plant Cell(植物细胞)，3，309-316(1991)；和Zhang等：Plant Physiology(植物生理学)，110：1069-1079(1996)。

本发明中也要考虑的是在光合成组织中有活性的启动子，以便能在绿色组织(如叶和茎柄)中驱动转录。最适合的启动子是仅在或主要在此类组织中驱动表达的启动子。所述启动子可能在整个植物中而组成型赋予表达，或优先对绿色组织而组成型赋予表达，或优先对表达发生的绿色组织发育阶段而组成型赋予表达，或响应外部刺激而组成型赋予表达。

此类启动子的实例包括核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(RbcS)启动子，如：从美洲落叶松(美加落叶松(Larix laricina))获得的RbcS启动子，松树cab6启动子(Yamamoto等(1994)：Plant Cell Physiol.[植物和细胞生理学]，35：773-778)，从小麦获得的Cab-1基因启动子(Fejes等(1990)：Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]，15：921-932)，从菠菜获得的CAB-1启动子(Lubberstedt等(1994)：PlantPhysiol.[植物生理学]，104：997-1006)，从水稻获得的cab1R启动子(Luan等(1992)：Plant Cell[植物细胞]，4：971-981)，从玉米获得的丙酮酸正磷酸二激酶(PPDK)启动子(Matsuoka等(1993)：Proc Natl Acad Sci USA[美国国家科学院院刊]，90：9586-9590)，烟草Lhcb1*2启动子(Cerdan等(1997)：Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]，33：245-255)，拟南芥(Arabdopsis thaliana)SUC2蔗糖-H+共输送体启动子(Truernit等(1995)：Planta，196：564-570)，和从菠菜获得的类囊体膜蛋白启动子(psaD，psaF，psaE，PC，FNR，atpC，atpD，cab，rbcS)。在茎柄、叶和绿色组织中驱动转录的其它启动子，在美国专利公布号2007/0006346中说明；此专利文献通过提及而结合于本文件整体中。

编码磷酸烯醇羧化酶(PEPC)的一个玉米核酸，已在下述文献中说明：Hudspeth和Grula(1989)：Plant Molec.Biol(植物分子生物学)，12：579-589。采用标准分子生物学技术，这种核酸的启动子可用于在转基因植物中以绿色组织特异性方式驱动任何核酸的表达。

在本发明的一些其它实施例中，诱导型启动子可能是需要的。诱导型启动子能响应外部刺激(如化学药品或环境刺激)而驱动转录。例如，诱导型启动子可以响应激素(如赤霉酸或乙烯)、或响应光或干旱而赋予转录。

有若干转录终止子供表达盒可选使用。这些终止子负责在表达盒范围内、在超过目的多聚核苷酸的编码区域时转录终止，并纠正mRNA聚腺苷酸化。这种终止区域可能对转录开始区域是天然的，可能对可操作连接的目的DNA序列是天然的，可能对甘蔗植物是天然的，或可能是从另一种来源获得的(即对所述启动子、目的DNA序列、甘蔗植物、或其任何组合是外源的或异源的)。适当的转录终止子是已知在植物中能发挥功能的那些转录终止子，包括CAMV 35S终止子、tml终止子、胭脂碱合成酶终止子和豌豆rbcs E9终止子。此外，可以使用任何基因的天然转录终止子。

已发现众多序列可以从转录单位内部增强基因表达，所述序列可与本发明的表达盒一起用于增强目的多聚核苷酸在转基因甘蔗植物或其植物中的表达。

已表明各种内含子序列能增强表达，特别是在单子叶植物细胞中。人们发现，编码玉米乙醇脱氢酶的核酸的内含子1是特别有效的，在与编码氯霉素乙酰转移酶的核酸的融合构建体是可以增强表达(Callis等(1987)：GenesDevelop.[基因开发]，1：1183-1200)。内含子序列常规结合于植物转化载体中，通常在非翻译前导序列内。

同样，已知从病毒获得的若干非翻译前导序列能增强表达，本文件涵盖这些前导序列。具体地说，已表明从烟草花叶病毒(TMV，“Ω-序列”)、玉米萎黄斑驳病毒(MCMV)和苜蓿花叶病毒(AMV)获得的前导序列在增强表达时是有效的(请参见下述文献，例如：Gallie等(1987)：Nucleic Acids Res.[核酸研究]，15：8693-8711；Skuzeski等(1990)：Plant Molec.Biol.[植物分子生物学]，15：65-79)。在本领域技术中已知的其它前导序列包括(但不限于)：小核糖核酸病毒前导序列，例如EMCV前导序列(脑心肌炎5′端非编码区域)(Elroy-Stein等(1989)：Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]，86：6126-6130)；马铃薯Y病毒组前导序列，例如TEV前导序列(烟草蚀刻病毒)(Allison等(1986)：Virology[病毒学]，154：9-20；和Gallie等(1995)：Gene[基因]，165：233-238)；MDMV前导序列(玉米矮花叶病毒；Allison等(1986)：Virology[病毒学]，154：9-20)；人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)前导序列(Macejak和Samow(1991)：Nature[自然]，353：90-94)；来自苜蓿花法病毒外壳蛋白mRNA的非翻译前导序列(AMV RNA4)(Jobling等(1987)：Nature[自然]，325：622-625)；烟草花叶病毒前导序列(TMV；Gallie等(1987)：NucleicAcids Res.[核酸研究]，15：3257-3273；Gallie等(1988)：Nucleic Acids Res.[核酸研究]，16：883-893；Gallie等(1992)：Nucleic Acids Res.[核酸研究]，20：4631-4638)；和玉米褪绿斑驳病毒前导序列(MCMV；Lommel等(1991)：Virology[病毒学]，81：382-385)。也请参见下述文献：Della-Cioppa等(1987)：Plant Physiology(植物生理学)，84：965-968。

已知靶向基因产物的各种机制存在于植物中，已相当详细地表征了控制这些机制功能作用的序列。例如，对叶绿体基因产物的靶向为各种蛋白氨基酸末端发现的一种信号序列所控制，所述序列是在叶绿体输入过程中切断的，以便产生成熟蛋白(请参见下述文献，例如：Comai等：J.Biol.Chem.[生物化学杂志]，263：15104-15109(1988))。这些信号序列可以融合到异源基因产物中，以便使异源产物输入到叶绿体中(van den Broeck等(1985)：Nature[自然]，313：358-363)。对适当信号序列的DNA编码，可以从编码下述蛋白的cDNAs的5′-端分离出来：RUBISCO蛋白，CAB蛋白，EPSP合成酶，GS2蛋白，及已知为定位叶绿体的其它许多蛋白。也请参见美国专利号5,639,949中实例37中标题为“叶绿体靶向的表达”一节。

上述靶向序列不仅可与它们的内源启动子一而使用，而且也可与异源启动子一起使用。使用对靶向序列异源的启动子，不仅可以获得靶向所述序列的能力，而且也能获得与靶向信号原始来源的启动子表达模式不同的一种表达模式。

为确保在质粒中的定位，使用一种运送肽是可以理解的；运送肽包括(但不限于)：来自质粒铁氧化还原蛋白的运送肽：NADP+菠菜的氧化还原酶(FNR)；后者在下述文献中披露：Jansen等：Current Genetics(最新遗传学)，13(1988)，517-522)。特别是，可以使用在本文件中披露的、介于cDNA核苷酸(-171)至165范围的序列，所述序列包含5′-端非翻译区域以及编码运送肽的序列。另一个实例是玉米蜡质蛋白的运送肽，它含有成熟蜡质蛋白的头34个氨基酸残基(Klosgen等(1989)：Mol.Gen.Genet.[分子遗传学与普通遗传学]，217：155-161)。也可能使用不含成熟蛋白头34个氨基酸的这种运送肽。另外，也可以使用下述酶类的信号肽：二磷酸核酮糖羧化酶小亚单位(Wolter等：Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]，85(1988)，846-850；Nawrath等：Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]，91(1994)，12760-12764)；NADP苹果酸脱氢酶(Galiardo等：Planta[植物]，197(1995)，324-332)；谷胱甘肽还原酶(Creissen等：Plant J.[植物杂志]，8(1995)，167-175)；或R1蛋白(Lorberth等：Nature Biotechnology[自然生物技术]，16，(1998)，473-477)。

采用本发明的土壤杆菌属(Agrobacterium)介导转化方法，待引入一种甘蔗植物组织或其细胞的目的核酸可以含有编码任何目的多肽的表达盒。适合在甘蔗中表达的目的多肽的非限制性实例，包括引起农艺学重要特点的那些多肽，如除草剂耐药性、病毒耐药性、抗病毒性、抗细菌病原体性、抗虫性、抗线虫性和抗真菌性。请参见下述文献，例如：美国专利号5,569,823、5,304,730、5,495,071、6,329,504和6,337,431。目的多肽的其它非限制性实例也可能包括引起植物活力或产率增加的多肽(包括允许植物在不同温度、土壤条件、阳光和降雨量水平下生长的多肽)或允许鉴别表现目的特点的植物(如可选择标记基因、种皮颜色等)。

在一些实施例中，转化的甘蔗表现对一种除草剂的耐药性。有若干核酸可用，包括转基因和非转基因的核酸，它们赋予除草剂耐药性。除草剂耐药性有时也叫做除草剂耐受性。赋予对一种可抑制生长点或分生组织的除草剂耐药性的核酸，可能是适合的。在这个类型代码中关于突变体ALS和AHAS酶的典型核酸，如美国专利号5,767,366和5,928,937所述。美国专利号4,761,373和5,013,659导向能耐受各种咪唑啉酮类或磺胺类除草剂的植物。美国专利号4,975,374涉及一种核酸的植物细胞和植物，所述核酸编码能耐受除草剂抑制作用的一种突变体谷氨酸合成酶(GS)，所述除草剂已知能抑制GS，如草丁膦和蛋氨酸磺酸盐。美国专利号5,162,602披露能耐受环己二酮类和芳氧基苯氧丙酸类除草剂抑制作用的植物。这种耐药性是由改变的乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)赋予的。

赋予对草甘膦耐药性的核酸也是适合的。请参见下述文献，例如：美国专利号4,940,835和美国专利号4,769,061。美国专利号5,554,798披露草甘膦耐药生转基因玉米植物，所述草甘膦耐药性是一种改变的5-烯醇丙酮基-3-磷酸莽草酸(EPSP)合成酶核酸赋予的。

编码对膦酰基化合物(如草铵膦或草丁膦)、吡啶氧基或酚氧基丙酸类和环己酮类耐药性的核酸也是适合的。请参见下述文献，欧洲专利申请号0242246。也请参见下述文献：美国专利号5,879,903、5,276,268和5,561,236。

其它适合的除草剂包括抑制光合作用的那些除草剂，如三嗪和苄腈(腈水解酶)。请参见下述文献，美国专利号4,810,648。其它适合的除草剂包括：2，2-二氯丙酸、稀禾定、吡氟氯禾灵、咪唑啉酮类除草剂、磺酰脲类除草剂、三唑嘧啶类除草剂、s-三嗪类除草剂和溴苯腈。同样，适合的核酸能够：赋予对一种原卟啉原氧化酶耐药性，或能获得抗植物疾病性增强；增强对不良环境条件的耐受性，所述不良环境条件包括(但不限于)：干旱，过冷，过热，过大土壤盐渍度或极端酸性或碱性；和植物株型或发育改变，包括发育定时改变。请参见下述文献，例如：美国专利申请公布号2001/0016956和美国专利号6,084,155。

对本发明有用的杀虫蛋白，可以控制害虫的足够量(即控制害虫量)表达。公认在植物中控制昆虫必需的杀虫蛋白量可能有变化，取决于甘蔗栽培品种、昆虫类型、环境因素以及诸如此类。赋予抗虫性或抗害虫性的核酸包括：例如，在杆菌属(Bacillus)生物中鉴别的编码毒素的核酸。已克隆了编码来自几个亚种的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)(Bt)毒素的核酸，已发现重组克隆对鳞翅目、双翅目和鞘翅目昆虫幼虫是有毒的(例如，编码各种δ-内毒素的核酸，所述内毒素如Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1B、Cry1C、Cry1D、Cry1Ea、Cry1Fa、Cry3A、Cry9A、Cry9C和Cry9B；以及编码植物性杀虫蛋白的核酸，所述植物性杀虫蛋白如Vip1、Vip2和Vip3)。关于Bt毒素的完全列表，列在苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)毒素术语数据库的世界网站上，此数据库由萨塞克斯大学大学维护(也请参见下述文献：Crickmore等(1998)：Microbiol.Mol.Biol.Rev.[微生物学与分子生物学评论]，62：807-813)。

目的多肽对控制大范围害虫可能也是有用的，所述害虫包括(但不限于)：甘蔗鞭黑粉菌(Ustilago scttaminea)、甘蔗花法病毒、非洲茎螟(Eldanasaccharina)、蔗螟(Diatraea saccharalis)、高粱花叶病毒等。

适合于在甘蔗中表达的目的多肽还包括改善或此外促进收割甘蔗转化成商用产品的多肽，例如增加或改变碳水化合物含量和/或分布、改善发酵特性、增加油含量、增加蛋白含量、改善可消化性和增加功能食物含量(如增加植物甾醇含量、增加生育酚含量、增加甾烷醇含量或增加维生素含量)。目的多肽也包括，例如导致或促进在收割作物中不需要成分的含量减少，所述不需要成分如植酸或糖降解酶。“导致”或“促发”的意思是，目的多肽可直接或间接促发目的特点的存在(如通过纤维素的异源表达而增加纤维素降解)。

在一项实施例中，目的多肽促进食物或饲料的可消化性改善。木聚糖酶是能改善植物细胞壁分解的半纤维素分解酶，导致植物营养被动物更好地利用。这导致改善生长率和饲料转化。同样，可以减少含木聚糖饲料的粘度。在工业加工中，在植物细胞中木聚糖酶的表达也起着潜在促进至可发酵糖的木质纤维转化。

已鉴别和表征来自真菌和细菌微生物的众多木聚糖酶；请参见下述文献，例如：美国专利号5,437,992；Coughlin等(1993)：“关于里氏木霉(Trichoderma reesei)纤维素酶和其它水解酶的第二届TRICEL讨论会会议记录”，埃斯波；Souminen和Reinikainen，编辑(1993)：Foundation for Biotechnicaland Industrial Fermentation Research(生物技术和工业发酵的基础)，8：125-135；美国专利申请公布号2005/0208178；和WO 03/16654)。特别是，在里氏木霉(T.reesei)中已鉴别出三种特殊的木聚糖酶(XYL-I、XYL-II和XYL-III)(Tenkanen等(1992)：Enzyme Microb.Technol.[酶与微生物技术]，14：566；Torronen等(1992)：Bio/Technology[生物技术]，10：1461；和Xu等(1998)：Appl.Microbiol.Biotechnol.[应用微生物学与生物技术]，49：718)。

在另一项实施例中，目的多肽是一种多糖降解酶。此类植物对再生(例如)用于生物加工的发酵原料可能是有用的。在一些实施例中，对发酵工艺有用的酶类包括：α-淀粉酶，蛋白酶，普鲁兰酶，异淀粉酶，纤维素酶，半纤维素酶，木聚糖酶，环糊精葡萄糖基转移酶，脂肪酶，植酸酶，虫漆酶，氧化酶，酯酶，角质蛋白酶，粒状淀粉水解酶，和其它葡萄糖淀粉酶。

多糖降解酶包括(但不限于)：淀粉降解酶，如α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、葡萄糖苷酸酶(E.C.3.2.1.131)；外-1，4-α-D葡聚糖酶，如淀粉葡萄糖苷酶和葡萄糖淀粉酶(EC 3.2.1.3)、β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)、α-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.20)和其它外-淀粉酶；和淀粉脱支酶，如：a)异淀粉酶(EC 3.2.1.68)、普鲁兰酶(EC 3.2.1.41)以及诸如此类；b)纤维素酶，如外-1，4-3-纤维二糖水解酶(EC3.2.1.91)、外-1，3-β-D-葡聚糖酶(EC 3.2.1.39)、β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)；c)L-阿拉伯糖酶，如内-1，5-α-L-阿拉伯糖酶(EC 3.2.1.99)、α-阿拉伯糖苷酶(EC3.2.1.55)以及诸如此类；d)半乳聚糖酶，如内-1，4-β-D-半乳聚糖酶(EC3.2.1.89)、内-1，3-β-D-半乳聚糖酶(EC 3.2.1.90)、α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)、β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)以及诸如此类；e)甘露聚糖酶，如内-1，4-β-D-甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)、β-甘露糖苷酶(EC 3.2.1.25)、α-甘露糖苷酶(EC 3.2.1.24)以及诸如此类；f)木聚糖酶，如内-1，4-β-木聚糖酶(EC 3.2.1.8)、β-D-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)、1，3-β-D-木聚糖酶以及诸如此类；g)其它酶类，如α-L-岩藻糖苷酶(EC 3.2.1.51)、α-L-鼠李糖苷酶(EC 3.2.1.40)、果聚糖酶(EC 3.2.1.65)、菊糖酶(EC 3.2.1.7)以及诸如此类。

另外，可能使用的其它酶类包括蛋白酶，如真菌蛋白酶和细菌蛋白酶。真菌蛋白酶包括，例如：从曲霉属(Aspergillus)、木霉属(Trichoderma)、毛霉属(Mucor)和根霉菌属(Rhizopus)获得的真菌蛋白酶，所述此类霉属如黑曲霉(A.niger)、泡盛曲霉(A.awamori)、米曲霉(A.oryzae)和米黑毛霉(M.miehei))。在本发明中，特别重要的是纤维二糖水解酶(CBH)(EC 3.2.1.91)。在一项实施例中，所述纤维二糖水解酶是CBH1或CBH2。

其它酶类包括(但不限于)：半纤维素酶，如甘露聚糖酶和阿拉伯呋喃糖酶(EC 3.2.1.55)；木质酶；脂肪酶(如E.C.3.1.1.3)，葡糖氧化酶，果胶酶，木聚糖酶，转葡萄糖苷酶，α-1，6-葡萄糖苷酶(如E.C.3.2.1.20)；酯酶，如阿魏酸酯酶(EC 3.1.1.73)和乙酰木聚糖酯酶(EC 3.1.1.72)；和角质蛋白酶(e.g.E.C.3.1.1.74)。

同样也公认，编码目的多肽的核苷酸序列可针对在转化甘蔗细胞中增加表达进行优化。这就是说，核苷酸序列可以采用改善表达的甘蔗优先密码子来合成，或可以采用甘蔗优选密码子应用频率的密码子来合成。一般来说，应增加核苷酸序列的GC含量。请参见下述文献，了解关于宿主优先密码子应用的讨论，例如：Campbell和Gowri(1990)：Plant Physiol.(植物生理学)，92：1-11。在本领域技术中提供了合成植物优先基因的方法。请参见下述文献，例如：美国专利号5,380,831和5,436,391；和Murray等(1989)：Nucleic Acids Res.(核酸研究)，17：477-498；它们通过提及而结合于本文件中。

例如，在构建目的核酸(例如包含本文件所述表达盒的核酸)后，把所述构建体结合于本文件所述的土壤杆菌属(Agrobacterium)或其它能进行其它转移的细菌中，然后根据本文件所述的转化方法通过接种和共同培养引入一种植物、植物部分或植物细胞中。

如上所述，本发明的一些实施例可以再生和具有光合作用能力的绿叶小苗和植物。为确证目的核苷酸序列稳定结合于甘蔗植物的基因组中，所采用的试验取决于待转移到所述植物的特性。例如，当这种特性是除草剂耐药性时，可以采用这种除草剂喷洒或涂覆叶子对生长植物进行处理，从而达到确证目的，除草剂的浓度应足以使没有进行转化过程的对照植物致死。

如果所转移的核酸编码一种目的多肽，则可以采用免疫学方法检测在转化甘蔗植物中所述多肽的表达。可以使用的免疫学方法包括(但不限于)：采用基于免疫技术的竞争性和非竞争性系统，如Western印迹法、放射免疫分析法、ELISA(酶联免疫吸附测定法)、多重酶联免疫吸附测定法、“三明治”免疫分析法、免疫沉淀分析法、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散分析法、凝集反应分析法、补体结合分析法、免疫放射测定分析法、荧光免疫分析法、蛋白A免疫分析法以及诸如此类。此类分析法是常规方法，在本领域技术中是已知的；请参见下述文献，例如：Current Protocols inMolecular Biology[分子生物学实验方法汇编]，第1卷(Ausubel等，编辑：JohnWiley和Sons公司，纽约(1994)；此文献通过提及而以其整体结合于本文件中。

在本发明的其它实施例中，可以通过评价编码目的多肽的多聚核苷酸表达模式、或报告基因的表达模式、或它们二者，来测定表达情况。例如，表达模式可以采用下述方法进行评价：Northern印迹分析，聚合酶链反应(PCR)，逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)，Taq Man基因表达分析法(Applied Biosystems公司；Foster City，加利福尼亚州)，核糖核酸酶保护分析法，荧光共振能量转移(FRET)检测法，一个或多个分子信标监测，对cDNA阵列的杂交，对多聚核苷酸阵列的杂交，对液体微阵列的杂交，对微电阵列的杂交，cDNA定序，克隆杂交，cDNA片段指纹分析，以及诸如此类。所选择的特殊方法应取决于此类因素，如回收的RNA量、技术人员喜好、可用的试验和设备、检测器以及诸如此类。在本领域技术中，此类分析法是常规的和已知的(请参见下述文献，例如：Ausubel等：supra)。

如果优先的核苷酸是一种功能性多聚核苷酸，则可以采用在本领域技术中已知的任何适当方法检测在转化甘蔗植物中所述多聚核苷酸的存在和/或效率，包括上述分子分析法。例如，可以使用的分子分析法包括(但不限于)：Northern印迹分析，聚合酶链反应(PCR)，逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)，TaqMan基因表达分析法(Applied Biosystems公司；Foster City，加利福尼亚州)，核糖核酸酶保护分析法，荧光共振能量转移(FRET)检测法，一个或多个分子信标监测，对寡聚核苷酸阵列的杂交，对cDNA阵列的杂交，对多聚核苷酸阵列的杂交，对液体微阵列的杂交，对微电阵列的杂交，cDNA定序，克隆杂交，cDNA片段指纹分析，以及诸如此类。

本发明的土壤杆菌属(Agrobacterium)介导转化方法，可以有利地减少细胞坏死；细胞坏死在甘蔗植物组织或其细胞与(例如)土壤杆菌属(Agrobacterium)共同培养期间是正常发生的。与采用相同的接种和选择方案但采用标准共同培养方案(即其中土壤杆菌属(Agrobacterium)接种的植物组织或其细胞在共同培养基上进行共同培养)进行比较，本发明的方法在甘蔗植物中可以有利地增加土壤杆菌属(Agrobacterium)介导的转化效率，这种情况可能是在共同培养期间细胞坏死减少介导的。在一些实施例中，转化效率可增加约至少5％、10％、15％、20％或25％。在其它实施例中，转化效率可增加约至少30％、35％、40％、45％或50％或以上。转化效率是以每g起始甘蔗植物组织获得的事件数(即转基因植物数)计算的。

现在，本发明将引用下述实例进行说明。应理解的是，所述实例用于阐明本发明各个方面的目的，并不是限制本发明的范围，如权利要求所规定。

实施例

实施例1：在干燥过程中土壤杆菌属介导的甘蔗转化。

这个实施例显示，当在干燥环境中进行时，土壤杆菌属(Agrobacterium)介导的甘蔗组织转化是更有效的。

方法

植物来源和材料：从田间生长甘蔗植物收集叶轮生体材料，并在EM3培养基上开始培养(请参见下述内容)。从上述分生组织切取厚度介于1-3mm的成熟叶轮生体横切面(约20)，并以顶端向上方向放置。培养物在黑暗环境中、在25℃下培养28-42天。用于转化的愈伤组织在最后一个次代培养的4-10天内。根据形态学特点选择愈伤组织，如致密结构和黄色颜色。尽可能选择黄色胚性愈伤组织，因为它们可获得良好的再生、一致的转化并以小簇群分段(2-4mm)。这种情况在四种甘蔗栽培品种中是类似的(如Q208、KQ228、Q117和Q232)。

土壤杆菌属(Agrobacterium)的制备：土壤杆菌属(Agrobacterium)培养物含有一个载体，所述载体含有绿色荧光蛋白(GFP：GFP是一种典型的标记基因，它可以允许采用荧光显微镜测定基因转移效率)或nptII(可选择标记基因)；所述培养物在含有适当抗生素的LB培养基(请参见下述内容)上划线种菌，并在28℃下生长3天，然后在4℃贮藏达1个月。在转化这前，选择单独的菌落，并在新鲜制备LB平板上划线种菌，并在28℃下生长1-2天。

在30mLAB培养基(请参见下述内容)或LB培养基中，一种土壤杆菌属(Agrobacterium)培养物从一个分离集落开始，并在28℃下、在200RPM速度的振荡器中生长4-5小时。把这种培养物转移到含有100-150mL新鲜制备AB或LB培养基的500mL锥形瓶中。该培养物在28℃、在150RPM速度下生长12-14小时，至在600nm处的光密度(OD)为0.2-1.0。

然后把土壤杆菌属(Agrobacterium)培养物在2000RPM转速、在25℃下离心20分钟。所获得的小丸再悬浮于1/2含量Murashige和Skoog(MS)培养基150mL(不含蔗糖)，此培养基中添加有400uM乙酰丁香酮。然后把该培养物在28℃下、在150RPM转速下培养4小时，再感染。调节OD至需要的水平，再感染待转化的植物材料。

感染和共同培养：称取愈伤组织的重量，以确保可以比较所有实验。每次处理使用约10g愈伤组织，并把愈伤组织放入一个200mL培养瓶中。加入预热的1/2含量MS培养基50mL(不含蔗糖)，使愈伤组织置于45℃下进行热休克5分钟(对Q208无需此处理)，然后使愈伤组织在45℃水浴中培养。然后把MS培养基从愈伤组织沥干，把25mL土壤杆菌属(Agrobacterium)接种混悬液加到每个培养瓶中，并轻轻混匀。把愈伤组织/土壤杆菌属(Agrobacterium)混合物放在真空度-27.5mmHg的真空室中，使之进行真空浸润10分钟。然后把愈伤组织/土壤杆菌属(Agrobacterium)混合物放在黑暗环境中静置5-10分钟。

然后从愈伤组织沥干土壤杆菌属(Agrobacterium)接种混悬液，吸干剩余的愈伤组织培养物，以除去过量的土壤杆菌属(Agrobacterium)接种混悬液。把植物组织放在滤纸(如Whatman 1级纸)上吸干，直至大体上除去土壤杆菌属(Agrobacterium)接种混悬液。然后把愈伤组织转移至90x25-mm皮氏培养皿进行共同培养(所述皮氏培养皿不含共同培养基，或含有干滤纸或无菌水湿润的滤纸)，并用NESCOFILM

MICROPORE^TM胶带(3M；Minneapolis，明尼苏达州)或类似材料密封。对照物在培养基上进行共同培养，作为对照处理。也包括一些另外的处理，如之前或之后的共同培养干燥，如下表所述。把这些培养皿在22℃下、在黑暗环境中培养2-3天。

转化后：在共同培养后，把愈伤组织转移到含有200mg/L特美汀的MS1培养基(请参见下述内容)(“休眠”培养基)，并在25℃下、在黑暗环境中保存4天。选择步骤是在含50mg/L遗传霉素和200mg/L特美汀的MS2培养基(请参见下述内容)中、在25℃下、在黑暗环境中培养14-15天进行的。

再生和植根：再生是在添加有50mg/L遗传霉素和200mg/L特美汀的MS3培养基(请参见下述内容)中、在25℃下在16小时照明条件下进行的。要求逐渐增加照明强度。对头一周，把培养物留在正常室内照明的实验室工作台上；对下3周，把培养物在中等照明强度条件下生长。

在2-4周之间观察到幼苗形成。当第一片叶出现时，把幼苗移到MS4培养基(请参见下述内容)中，直至植物长到4-5cm高度。然后对它们进行抽样分析，并转移到土壤中。

培养基：上述所指的培养基中的成分如下：

EM3：MS盐和维生素；0.5g/L酪蛋白水解物；100ml/L椰子汁；20g/L蔗糖；和3mg/l 2，4-D。

LB底料：10g/L NaCl；5g/L酵母提取物；和10g/L胰蛋白胨。

LB固体：LB底料加15g/L琼脂。

AB：下述盐经高温高压消毒并加入：2g/L(NH₄)₂SO₄(硫酸铵)；6g/LNa₂HPO₄(磷酸氢二钠)；3g/L KH₂PO₄(磷酸二氢钾)；和3g/L NaCl(氯化钠)。下述化合物经过滤灭菌：0.1mM CaCl₂(氯化钙)；1.0mM MgCl₂(氯化镁)；0.003mM FeCl₃(氯化铁)；和5g/L葡萄糖。

MS底料：MS培养基盐和维生素，加25g/L蔗糖。

MS 1：MS底料添加3.0mg/L 2，4-D和200mg/L特美汀。

MS 2：MS底料添加3.0mg/L 2，4-D、50mg/L遗传霉素和200mg/L特美汀。

MS 3：MS底料添加过滤灭菌的40mL椰子汁、1.0-2.0mg/L BAP(取决于栽培品种，因此并不是对所有栽培品种都要求的)、50mg/L遗传霉素和200mg/L特美汀。

MS 4：MS底料添加1.0g/L木炭和1.0mg IBA(吲哚-3-丁酸)(并不是对所有栽培品种都要求的)和50mg/L遗传霉素。

CoCult培养基：关于香蕉的共同培养的培养基如下述文献所述：Khanna等：Molecular Breeding(分子育种)：14(3)：239-252(2004)。

如下表所示，对Q117甘蔗栽培品种研究了六种不同的共同培养条件。这种共同培养条件不同于没有共同培养基的条件(即没有培养基)，在后者中植物组织仅在平板底部进行培养(加干滤纸或湿滤纸)。转化载体为pUGfpN(s)或pUbiNptII(s)。

转化载体pUGFPN(s)含有两个表达盒，所述表达盒介于转化载体的左右边界之间。其中一个表达盒含有下述可以一起操作连接的元件：玉米泛素启动子，连接到编码绿色荧光蛋白的一个核酸序列，再连接到S65终止序列。第二个表达盒含有连接到编码蛋白NptII(此蛋白予赋遗传霉素耐药性)的一个核酸序列的玉米泛素启动子，再连接到Nos终止序列。转化载体pUbiNptII(s)含有一个表达盒，所述表达盒介于转化载体的左右边界之间。这个表达盒含有下述可以一起连接的元件：连接到编码蛋白NptII(此蛋白赋予遗传霉素耐药性)的一个核酸序列的玉米泛素启动子，再连接到Nos终止序列。

表1：关于Q117愈伤组织的六种共同培养条件的总结。也显示在共同培养期间的重量变化、在22天时获得的转基因事件数和GFP扇面发育情况。

¹与起始重量比较在共同培养期间的重量变化以括号表示。

如表1所示，编码GFP可评分标记基因的核酸表达和转基因事件恢复(由此确定转化效率)，与没有干燥的那些处理(即处理2、3、8和9)比较，在更极端干燥环境(即仅为平板表面或在干滤纸上)进行共同培养步骤的植物组织中最高。

用一种不同的甘蔗栽培植物(Q208)进行一项重复研究，如表2所示。从田间生长甘蔗植物收集叶轮生体材料，并在EM3培养基上开始培养。

表2：关于Q208愈伤组织的六种共同培养条件的总结。也显示在共同培养期间的重量变化、在22天时获得的转基因事件数和GFP扇面发育情况。

¹与起始重量比较在共同培养期间的重量变化以括号表示。

实施例2：关于在干燥过程中土壤杆菌属介导甘蔗转化的进一步方案。

这个实施例显示在干燥环境中转化甘蔗细胞和组织的进一步的方法。这个实施例采用分蘖作为植物组织的起始来源。

植物来源和材料：胚性愈伤组织是从温室生长的甘蔗(甘蔗属(Saccharum)杂种)储备植物获得的。

胚性愈伤组织的诱导：在下节间开始延伸成长的发育阶段收集未成熟分蘖。未成熟分蘖采用70％乙醇或喷洒或浸泡在20％CLOROX

漂白液(TheClorox公司；Oakland，加利福尼亚州)(加入3滴TWEEN

-20/L；Sigma Aldrich；St.Louis，密苏里州)中20分钟进行灭菌，然后用无菌自来水洗涤3次。

然后从顶生分生组织正上向达2-3cm处切取1-2mm的横切面，从灭菌的分蘖分离叶轮生体。把分离的卷叶放在SC+0.75mg-3mg/L 2，4-D培养基上(2-10/平板)、在28C下、在黑暗环境中培养2-3周。然后，对新鲜制备的SC+D培养选择性次代培养高质量的胚性培养物反应，作为转化的目标材料。

转化载体和土壤杆菌属(Agrobacterium)菌株：采用在根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)菌株如LB4404或EHA101中的二元载体进行甘蔗转化。根据构建体，所述二元载体含有珊瑚礁绿色荧光蛋白(GFP，对构建体pNOV2145)或根据构建体，所述二元载体含有珊瑚礁绿色荧光蛋白深蓝色荧光蛋白(CFP，对构建体13601)作为可评分标记基因核酸。每周土壤杆菌属(Agrobacterium)培养物从-80℃冷冻器甘油储备液基质开始移到含有适当抗生素的YP平板，并在28℃下、在保温箱中生长，如下。

从-80℃冷冻器中取出土壤杆菌属(Agrobacterium)菌株，并放在冰上。对土壤杆菌属(Agrobacterium)每个菌株(通常为YP/Spec，Kan)，细菌生长培养基是从与适当抗生素在下4℃贮藏取得的。

用一个无菌一次性塑料接种环从小瓶中取出少量的土壤杆菌属(Agrobacterium)菌株，并放在平板上。用一个环或细胞涂布器涂布土壤杆菌属(Agrobacterium)，在生长培养基表面上形成一薄层细胞。

把平板放在28℃的保温箱中2天，备用。把一个集落放在加有适当抗生素的YP液体培养基中培养过夜。把土壤杆菌属(Agrobacterium)细胞在5000rpm速度下、在室温下离心10分钟。除去上清液，把细胞小丸再悬浮于接种培养基上，所述接种培养如SCInoc(请参见下述内容)。在分光光度计上测定细菌混悬液的光吸度，并稀释至A₆₆₀ 0.1-0.85。至最终浓度40-80mg/L(200-400μM)中加入乙酰丁香酮，诱导基因表达10分钟至达4小时。

植物组织的制备：采用胚性愈伤组织和卷叶进行转化。从用于转化的胚性培养物肉眼观察选择最佳质量的目标片段。把卷叶放在愈伤组织诱导培养基SC2D(请参见下述内容)上培养1、3、5和达30天时间，用于进行转化。

甘蔗植物组织的感染和共同培养：如实施例1所述，制备的外植体于45℃下热休克预处理5分钟。除去热休克液体，把外植体组织与土壤杆菌属(Agrobacterium)混悬液混合。把混合物在室温下培养至少1分钟或达过夜。

从外植体沥干土壤杆菌属(Agrobacterium)混悬液，有过量混悬液的培养物采用灭菌滤纸或吸干或凉干10-60分钟，或采用这两种方法进行。

把预干燥的外植体放在加或不加滤纸的一个空平板上(添加50-1000μL感染培养基，如SCInoc[请参见下述内容])。然后把共同培养平板在20℃-28℃下、在黑暗环境中保温培养3-5天。对照共同培养处理用SCCoCult培养基(请参见下述内容)进行。

休眠阶段：把感染的植物部分转移到休眠培养中培养2-10天，以促进转基因材料恢复。在休眠阶段中，采用不含选择性药物的恢复培养基，如含有适当抗生素的SCRecov(请参见下述内容)，以抑制土壤杆菌属(Agrobacterium)。

转基因植物的选择和再生：在休眠阶段(即恢复期间)后，把外植体转移到选择培养基如SCSel或SCMan(请参见下述内容)，然后在28℃下、在黑暗环境中培养3-6天。

把增殖性扇面放在再生培养基如SCManRegen(含有适当的抗生素，请参见下述内容)中进行选择性次代培养进行再生诱导，然后在28℃下、在黑暗环境中培养1周。在1周后，再生诱导平板在28℃下、在照明条件下培养16小时/天。在2周后，把发育的幼苗转移到甘蔗植根培养基(SCR，请参见下述内容)中，使幼苗延伸成长和植根。

培养基化合物：上述所指的培养基中的成分如下：

配方名称	SC2D
				最终pH	5.8
对1L的配方	化学品名称	数量	单位
					MS基础盐混合物	4.3	g
	B5维生素200X	5	mL
					蔗糖	30	g
	2，4-D 1mg/mL	2	mL
					Phytablend	7	g

配方名称	SCInoc
				最终pH	5.3
对1L的配方	化学品名称	数量	单位
					MS基础盐混合物	4.3	g
	B5维生素200X	5	mL
					蔗糖	88.5	g
	谷氨酸50mg/mL	17.5	mL
					葡萄糖	36	g
	2，4-D 1mg/mL	1	mL
					精氨酸	174	mg
	甘氨酸1mg/mL	7.5	mL
					天冬氨酸	266	mg
	酶促玉米蛋白水解物	500	mg
					乙酰丁香酮40mg/mL	1	mL

配方名称	SCCoCult
				最终pH	5.3
对1L的配方	化学品名称	数量	单位
					MS基础盐混合物	4.3	g
	B5维生素200X	5	mL
					蔗糖	30	g
	谷氨酸50mg/mL	17.5	mL
					葡萄糖	30	g
	2，4-D 1mg/mL	1	mL
					精氨酸	174	mg
	甘氨酸1mg/mL	7.5	mL
					Phytagel	3	g
	天冬氨酸	266	mg
					酶促玉米蛋白水解物	500	mg

配方名称	SCManRege
				最终pH	5.8
对1L的配方	化学品名称	数量	单位
					MS基础盐混合物	4.3	g
	B5维生素200X	5	mL
					蔗糖	24	g
	BA 1mg/mL	2	mL
					Phytablend	7	g
	甘露糖1g/mL	3	mL

配方名称	SCR
				最终pH	5.8
对1L的配方	化学品名称	数量	单位
					MS基础盐混合物	4.3	g
	B5维生素200X	5	mL
					蔗糖	20	g
	Phytablend	7.0	g
					NAA 1mg/mL	0.5	mL

如下表3所示，研究了三种不同的共同培养条件。共同培养条件随共同培养基和无培养基(即没有培养基)的培养而变化；在无培养基培养时，外植体是在平板底部、在湿润滤纸上培养的。在单用平板表面或在湿润滤纸上培养的那些植物组织中，有最高的短暂GFP(构建体pNOV2145)或CFP(构建体13601)表达，因此有最高的转化效率。

表3：三种共同培养条件的总结。

¹共同培养基在共同培养阶段使用；“滤纸”表示在共同培养期间仅使用湿润滤纸；“无培养基”表示外植体是在不含任何培养基或滤纸的空平板上共同培养的。

²*号越多，表示短暂表达越高

³对不同的处理均使用等量的外植体

⁴N/A＝数据没有提供或没有收集

实施例3：在延长时间干燥过程中土壤杆菌属(Agrobacterium)介导的甘蔗转化。

这个实施例显示上述方法可在延长时间的情况下进行。

方法

重复实施例1的方法；但是，共同培养期间延长几天至几近一周，以改变干燥的速度和程度。简言之，共五个不同的共同培养条件进行三天或四天。在第一条共同培养条件中，愈伤组织在滤纸上保持一小时，然后在没有培养基的情况下共同三天。在第二种共同培养条件下，愈伤组织在滤纸上共同培养三天。在第三种共同培养条件下，愈伤组织如第二种条件进行处理，但在包括在滤纸上加入500μL H₂O。在第四种共同培养条件下，愈伤组织如第二种条件进行处理，但在包括在滤纸上加入1000μL H₂O。在第五种共同培养条件下，愈伤组织如在第一种条件下处理，但共同培养5天。

如表4和表5所示，共同培养时间增加相对不影响GFP表达水平和所产生事件数，但表明达9天的更长的共同培养时间仍产生有用的转化事件数。

表4：在各种共同培养条件下GFP表达的总结。对每种转化条件，使用10g愈伤组织。

表5：在各种共同培养时间条件下转基因事件产生的总结。对每种转化条件，使用20g愈伤组织。

实施例4：在干燥过程中在不同时间点土壤杆菌属(Agrobacterium)介导甘蔗转化的比较。

这个实施例显示甘蔗细胞和组织感染后干燥和共同培养后干燥的影响。

简言之，重复实施例1的方法；但是，对一些培养物应用共同培养之前或之后干燥。

当与传统共同培养(在培养基上)或干燥共同培养(如本文件所述)合并应用时，在感染之前或共同培养之后的干燥步骤都没有改变实施例1或实施例2的方法。如表6所示，在进行感染之前或之后干燥的培养物中GFP扇面发育降低。每个培养物的起始重量是愈伤组织10g。

表6：在各种共同培养条件下GFP表达的总结。

¹在共同培养期间与起始重量比较的重量变化以括号表示；每种培养物的起始重量为愈伤组织10g。

同样，当与传统共同培养(在培养基上)或干燥共同培养(如本文件所述)合并应用时，在感染之前或共同培养之后的干燥步骤都没有改变实施例1或实施例2的方法。如表7所示，在进行感染之前或共同培养之后干燥的培养物中，在采用nptII载体转化后稳定转基因事件产生情况降低。每个培养物起始重量是的愈伤组织10g。

表7：在各种共同培养时间条件下转基因事件产生效率的总结。

¹在共同培养期间与起始重量比较的重量变化以括号表示；每种培养物的起始重量为愈伤组织10g。

前述实施例表明，在共同培养步骤期间，把土壤杆菌属(Agrobacterium)接种的植物组织置于极端干燥环境中(其中植物组织可能在延长时间情况下失去一定的重量)，可以有效转化甘蔗，在共同培养步骤期间，把土壤杆菌属(Agrobacterium)接种的植物组织在干燥环境中培养，转化效率升高。

在本规范中提及的所有发表文章和专利申请，都暗示本发明相关的、本领域的技术水平。所有这些出版物和专利申请都通过提及而结合于本文件中，其程度就如同专门和个别指出每个个别出版物或专利申请通过提及而结合于本文件中一样。

虽然为理解简明性的目的，前述的本发明已通过示范和实施例方式进行详细说明，但本领域技术人员应该清楚，在前述实施例和所附权利要求的范围内可以实施一定的改变和改良。

Claims (12)

1.产生一种转化甘蔗组织或其细胞的一种方法，所述方法包含：

a)用土壤杆菌属(Agrobacterium)接种混悬液接种甘蔗组织或其细胞，所述土壤杆菌属(Agrobacterium)含有一种目的核酸，以便获得土壤杆菌属(Agrobacterium)接种的甘蔗组织或其细胞；和

b)把所述土壤杆菌属(Agrobacterium)接种的甘蔗组织或其细胞在缺乏共同培养基的表面培养，培养时间足以减少所述土壤杆菌属(Agrobacterium)接种甘蔗组织或其细胞的原始重量，从而产生转化的甘蔗组织或其细胞。

2.权利要求1的方法，其中所述共同培养包含把所述土壤杆菌属(Agrobacterium)接种的甘蔗组织或其细胞放在至少一层干纸上进行培养。

3.权利要求2的方法，其中所述共同培养包含把所述土壤杆菌属(Agrobacterium)接种的甘蔗组织或其细胞放在至少两层或以上干纸上进行培养。

4.权利要求2或权利要求3的方法，进一步包含在共同培养过程中定期更换所述干纸。

5.权利要求4的方法，包含在共同培养过程中每天更换所述干纸。

6.前述权利要求任何一项的方法，其中在缺乏共同培养基的条件下进行共同培养之前，从所述土壤杆菌属(Agrobacterium)接种的甘蔗组织或其细胞大体上除去接种混悬液。

7.权利要求1的方法，其中所述共同培养包含把所述土壤杆菌属(Agrobacterium)接种的甘蔗组织或其细胞在缺乏干纸的表面上进行培养。

8.前述权利要求任何一项的方法，进一步包括选择含有目的核酸的转化甘蔗组织或其细胞，其中所述目的核酸含有一个表达盒，所述表达盒含有赋予对一种选择性药物耐药性的核酸，且其中所述选择过程包含把所述土壤杆菌属(Agrobacterium)接种的甘蔗组织或其细胞在含有所述选择性药物的培养基上进行培养、并选择含有所述目的核酸的转化甘蔗组织或其细胞。

9.前述权利要求任何一项的方法，其中所述甘蔗组织或其细胞是从甘蔗茎梗或分蘖获得的。

10.前述权利要求任何一项的方法，其中的所述甘蔗组织或其细胞是胚性愈伤组织。

11.权利要求9的方法，其中所述甘蔗组织或其细胞是从卷叶片段或叶鞘片段获得的，所述卷叶片段或叶片段是从所述茎梗或分蘖切下的。

12.权利要求9的方法，其中所述甘蔗组织或其细胞是把所述茎梗或分蘖的一个片段预培养一段时间获得的，以产生胚性愈伤组织，再把所述甘蔗组织或其细胞与含有土壤杆菌属(Agrobacterium)的所述接种混悬液进行接触。