CN104023521A - 用于甘蔗中增加的表达的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

在此提供一种包含一种重组核酸分子的甘蔗植物细胞，该重组核酸分子包含一个感兴趣的核苷酸序列、一个启动子以及SEQ ID NO:1的核苷酸序列，其中该启动子在SEQ ID NO:1的核苷酸序列的下游并与其操作性相关联并且在该感兴趣的核苷酸序列的上游并与其操作性相关联，并且该感兴趣的核苷酸序列以一个水平表达，该水平比一种对照中所述感兴趣的核苷酸序列的表达水平高至少约6倍。此外，提供了一种使用本发明的重组核酸分子增加一种甘蔗植物细胞中一种感兴趣的核苷酸序列的表达的方法。

Description

用于甘蔗中增加的表达的组合物和方法

优先权声明

本申请在35U.S.C.§119(e)下要求在2011年12月15日提交的美国临时申请号61/576,112的权益，该临时申请的全部内容通过引用结合在此。

关于序列表的电子提交的声明

作为纸质副本的替代提供了一个ASCII文本格式的序列表，该序列表在37C.F.R.§1.821下提交，名称为9207-10_ST25.txt，大小为49,289字节，生成于2012年12月5日并且经由EFS-Web提交。这个序列表由此通过引用以其披露内容在此结合到本说明书中。

发明领域

本发明涉及用于增强甘蔗植物中的表达的组合物和方法。

背景

甘蔗是全世界最重要的作物之一。它是食品和饮料用糖以及生物燃料的生产用糖的主要来源。与甘蔗育种相关联的困难和限制以及遗传工程的广泛潜力使得生物技术成为一种用于改善甘蔗的优先性状的有吸引力的方法，这些性状如增加的含糖量以及非生物和生物胁迫耐受性(阿克什曼安(Lakshmanan)等人，体外细胞和发育生物学：植物(In vitro Cell.Dev.Biol.Plant)，41,345-363(2005))。此外，生物技术可以通过能够产生除蔗糖之外的有价值的替代性产物的植物的工程化，而用于使甘蔗工业多样化。例如，工程化的甘蔗可以适用于作为用于生产高价值产物(如药物、抗体、工业产品、以及替代性糖)的生物工厂(阿克什曼安等人，体外细胞和发育生物学：植物，41,345-363(2005)；王(Wang)等人，转基因研究(Transgenic Research)，14,167-178(2005)；哈梅利(Hamerli)等人，植物生物技术杂志(Plant Biotech.J.)，9,32-37(2011))。

通过生物技术改善甘蔗和使其多样化的关键要求之一是高水平的转基因表达。然而，可用于成功的遗传工程并且具体地说用于驱动高水平的基因表达的分子工具在甘蔗中比在许多其他植物中相对有限。

因此，本发明通过提供增强甘蔗植物中的转基因表达的组合物和方法来克服技术中的缺陷。

发明内容

在本发明的一个方面，提供了一种包含一种重组核酸分子的甘蔗植物细胞，该重组核酸分子包含一个感兴趣的核苷酸序列、一个启动子以及SEQID NO:1的核苷酸序列，其中该启动子在SEQ ID NO:1的核苷酸序列的下游并与其操作性相关联并且在该感兴趣的核苷酸序列的上游并与其操作性相关联，进一步地其中该启动子是一个玉米聚泛素-1启动子和/或一个玉米磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PepC)启动子并且该感兴趣的核苷酸序列以一个水平表达，该水平比一种对照中所述感兴趣的核苷酸序列的表达水平高至少约6倍。

在本发明的一个第二方面，提供了一种增加一种甘蔗植物细胞中一个感兴趣的核苷酸序列的表达的方法，该方法包括：向该甘蔗植物细胞中引入一种重组核酸分子，该重组核酸分子包含一个感兴趣的核苷酸序列、一个启动子以及SEQ ID NO:1的核苷酸序列，其中在该感兴趣的核苷酸序列被表达的条件下，该启动子在SEQ ID NO:1的核苷酸序列的下游并与其操作性相关联并且在该感兴趣的核苷酸序列的上游并与其操作性相关联，进一步地其中该启动子是一个玉米聚泛素-1启动子和/或一个玉米PepC启动子，从而将该感兴趣的核苷酸序列的表达增加至比一种对照中所述感兴趣的核苷酸序列的表达高至少约6倍。

在其它实施例中，本发明提供包含本发明的一种核酸分子的甘蔗植物细胞、植物、以及植物部分和/或一种包括本发明的多个甘蔗植物的作物。在仍然其它实施例中，本发明还提供由本发明的甘蔗植物细胞、甘蔗植物、和/或甘蔗植物部分产生的收获产物和加工产物。

附图简要说明

图1示出六月龄甘蔗植物的第一展开叶中不同启动子-scoGUS构建体的β-葡萄糖醛酸酶(GUS)表达。SC11(Zm-Ubi1-scoGUS)、SC27(eFMVe35S-ZmUbi-scoGUS)、SC24(ZmPEPC-scoGUS)、SC25(eFMVe35S-ZmPEPC-scoGUS)、SC28(CMP-iUbi-scoGUS)、SC29(eFMVe35S-pCMP-iUbi-scoGUS)。示出的是平均值(±SEM)。具有不同上标的数据差异显著(p<0.05)。

图2示出与大约11月龄的母株相关联的甘蔗分蘖的第一展开叶中不同启动子-scoGUS构建体的GUS表达。SC11(Zm-Ubi-scoGUS)、SC27(eFMVe35S-ZmUbi-scoGUS)、SC24(ZmPEPC-scoGUS)、SC25(eFMVe35S-ZmPEPC-scoGUS)、SC28(CMP-iUbi-scoGUS)、SC29(eFMVe35S-pCMP-iUbi-scoGUS)。示出的是平均值(±SEM；n＝5)。具有不同上标的数据差异显著(p<0.05)。

图3示出与大约11月龄的母株相关联的甘蔗分蘖的茎(节间3和4)中不同启动子-scoGUS构建体的GUS表达。SC11(Zm-Ubi1-scoGUS)、SC27(eFMVe35S-ZmUbi-scoGUS)、SC24(ZmPEPC-scoGUS)、SC25(eFMVe35S-ZmPEPC-scoGUS)、SC28(CMP-iUbi-scoGUS)、SC29(eFMVe35S-pCMP-iUbi-scoGUS)。示出的是平均值(±SEM；n＝5)。具有不同上标的数据差异显著(p<0.05)。

图4A-4B示出取自处于12月龄(未成熟(节间3和4))、正在成熟(节间8)、以及成熟(节间20)的植物的甘蔗茎中(图4A)以及六月龄甘蔗植物的第一展开叶中(图4B)Zm-Ubi1-scoGUS和eFMVe35S-ZmUbi-scoGUS构建体的GUS表达。TSP＝总可溶性蛋白质。示出的是平均值(±SEM；在图4A中，n＝5；并且在图4B中，n＝11(对照)以及n＝12(增强子))。

图5示出含有不同启动子-scoGUS构建体的转基因甘蔗的茎中的GUS表达。样品取自转移至土壤后12个月时的植物的未成熟(节间3和4)、正在成熟(节间8)以及成熟(节间20)茎区。GUS丰度使用qELISA测量。示出的是平均值(±SEM；n＝7)。具有不同字母的数据差异显著(p<0.05)。

图6示出T0和再生(T0R1)植物的叶中不同启动子-scoGUS构建体的GUS表达的比较。在转移至土壤(T0)后六个月或再生后五个月(T0R1；此时该T0R1植物处于与六月龄T0植物相当的高度)时对来自每个独立的转基因事件的第一完全展开叶进行分析。GUS丰度使用qELISA测量。示出的是平均值(±SEM或SD(Zm-PepC)；n＝2-5)。*指示相对于T0的统计上显著的差异(p<0.001)。

在下文本发明描述中更详细地阐述本发明的这些方面和其他方面。

发明详细说明

本说明不旨在是一个本发明以其而实施的所有不同方式，或可以加入本发明中的所有特征的详细目录。例如，关于一个实施例所说明的特征可以结合入其他实施例中，并且关于一个具体实施例所说明的特征可以从那个实施例删除。因此，本发明预期，在本发明的一些实施例中，在此阐述的任何特征或特征的组合可以被排除或遗漏。另外，鉴于本披露内容，对在此建议的不同实施例的众多变体以及附加对于本领域技术人员是明显的，这不脱离本发明。因此，以下说明旨在阐述本发明的一些具体实施例，并且并没有穷尽地叙述其所有排列、组合和变化。

除非另外定义，在此所使用的全部技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的意思。在此的本发明的说明中使用的术语仅仅是出于描述具体实施例的目的并且不旨在限制本发明。

在本说明书中提到的所有公开和专利申请对于本发明所涉及领域的技术人员的技术水平是指示性的。另外，在此提到的公开、专利申请、专利、以及其他参考文献通过引用以其全部内容结合。

如先前所述，可用于甘蔗的成功遗传操纵的分子工具与许多其他植物相比是相对有限的。具体地说，实现异源核酸的高水平表达已经证明是困难并且不一致的。证据提示与甘蔗的转基因表达相关联的一些困难可能由翻译后基因沉默造成(转录后基因沉默(PTGS)；马奇(Mudge)等人，植物(Planta)，229,549-558(2009)；伯奇(Birch)等人，热带植物生物学(Tropical Plant Biol.)，3,88-97(2010))。在这些情况下，许多启动子的活性已经显示出在正在成熟的甘蔗中被显著降低。许多启动子已经被证明能够在稳定的转基因甘蔗中表达异源核酸。在这些之中，玉米聚泛素-1(Zm-Ubi1)启动子一般被视为基准，因为它已经是用于甘蔗的遗传工程的最一致的、被彻底评价的、并且最常用的启动子(J.R.威尔逊(J.R.Wilson)等人编，甘蔗：对有效且持续生产的研究(Sugarcane:Researchtowards efficient and sustainable production)中的格罗夫(Grof)等人，(1996)甘蔗中蔗糖磷酸酯合成酶的分子操纵(Molecular manipulation ofsucrose phosphate synthase in sugarcane)，联邦科学与工业研究组织热带作物和牧草研究所(CSIRO Division of Tropical Crops and Pastures)，澳大利亚布里斯班(Brisbane,Australia)，第124-126页；辛格V(Singh V)编，(国际甘蔗技术专家协会第二十三届会议论文集(Proc.Int.Soc.SugarcaneTechnol.XXIII congress)中的汉瑟姆(Hansom)等人，(1999)甘蔗中转基因表达的调控(Regulation of transgene expression in sugarcane)，印度食糖技术专家协会(STAI)，新德里(New Delhi)，278-290；麦奎特(McQualter)等人，植物生物技术杂志(Plant Biotech.J.)，3,29-41(2005)；维克斯(Vickers)等人，作物科学(Crop Sci.)，45,354-362(2005)；王等人，转基因研究，14,167-178(2005)；杰恩(Jain)等人，植物细胞报告(Plant Cell Rep.)，26,581-590(2007)；彼得劳绍维奇(Petrasovits)等人，植物生物技术杂志，5,162-172(2007)；吴(Wu)和伯奇，植物生物技术杂志，5,109-117(2007)；克里斯蒂(Christy)等人，植物细胞报告，28,175-184(2009)；翁(Weng)等人，转基因研究，20,759-772(2011))。尽管如此，在从Zm-Ubi1和至今测试的其他启动子当前实现的转基因表达水平上的甘蔗中转基因表达水平的改善对这种作物的遗传工程将是非常有益的。

因此，本发明涉及意料之外的发现：用包含与一种启动子操作性地相关联(并且该启动子进一步与SEQ ID NO:1的核苷酸序列操作性地相关联)的一种感兴趣的核苷酸序列的一种重组核酸分子转化的一种甘蔗植物细胞、植物和/或植物部分产生一种转化的甘蔗植物细胞、植物和/或植物部分，其具有该感兴趣的核苷酸序列的一个表达水平，该表达水平比一种对照甘蔗植物细胞、植物和/或植物中该感兴趣的核苷酸序列的表达水平高至少约6倍(例如，高约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15倍，等等)，该对照甘蔗植物细胞、植物和/或植物包含与在测试植物中使用的构建体不同的构建体，区别在于它不包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列(即，该对照植物包含该启动子和操作性相关联的该感兴趣的核苷酸序列，但是不包含该增强子(SEQ ID NO:1))。

SEQ ID NO:1的核苷酸序列是包含来自如下玄参花叶病毒(eFMV)和花椰菜花叶病毒(e35S)的增强子序列的双转录增强子：

agctgcttgtggggaccagacaaaaaaggaatggtgcagaattgttaggcgcacctaccaaaagcatctttgcctttattgcaaagataaagcagattcctctagtacaagtggggaacaaaataacgtggaaaagagctgtcctgacagcccactcactaatgcgtatgacgaacgcagtgacgaccacaaaactcgagacttttcaacaaagggtaatatccggaaacctcctcggattccattgcccagctatctgtcactttattgtgaagatagtggaaaaggaaggtggctcctacaaatgccatcattgcgataaaggaaaggctatcgttgaagatgcctctgccgacagtggtcccaaagatggacccccacccacgaggagcatcgtggaaaaagaagacgttccaaccacgtcttcaaagcaagtggattgatgtgatatctccactgacgtaagggatgacgaacaatcccactatccttc(SEQ ID NO:1)。

在一些实施例中，SEQ ID NO:1的核苷酸序列包括与SEQ ID NO:1具有约80％至约100％序列同一性的核苷酸序列。因此，在一些实施例中，SEQID NO:1的核苷酸序列包括与SEQ ID NO:1的核苷酸序列具有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的核苷酸序列。

除增加操作性地连接到其上的感兴趣的核苷酸序列的表达(与对照相比)之外，还意外地发现当与其增强其他植物种类(如玉米)的转录的能力相比，SEQ ID NO:1的核苷酸序列(eFMVe35S构建体)将甘蔗植物中的转录增强至显著较高水平。因此，当将包含操作性地连接到进一步操作性地连接到感兴趣的核苷酸序列上的启动子上的核苷酸序列SEQ ID NO:1的核酸构建体转化到甘蔗中时，甘蔗植物中感兴趣的核苷酸序列的所得表达水平(与对照相比)比在用相同核酸构建体转化的玉米中观察到的增强的转录水平(与对照相比)大2-3倍。这个令人惊讶的发现显示这种eFMVe35S双增强子(SEQ ID NO:1)尤其良好适合用于增强甘蔗中的表达并且是在用于增加甘蔗中核苷酸序列的表达的其他方法上的一个显著改善。

因此，在本发明的一个方面，提供了一种包含一种重组核酸分子的甘蔗植物细胞，该重组核酸分子包含、基本上由、或由一个感兴趣的核苷酸序列、一个启动子以及SEQ ID NO:1的核苷酸序列组成，其中该启动子在SEQ ID NO:1的核苷酸序列的下游并与其操作性相关联并且在该感兴趣的核苷酸序列的上游并与其操作性相关联，并且该感兴趣的核苷酸序列以一个水平表达，该水平比一种对照中所述感兴趣的核苷酸序列的表达水平高至少约6倍(例如，高约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15倍，等等)。在一些实施例中，该启动子可以是如下所述的任何启动子。在其它实施例中，该启动子是一个玉米聚泛素-1启动子和/或一个玉米磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PepC)启动子。

因此，在本发明的另一个方面，提供了一种包含一种重组核酸分子的甘蔗植物细胞分子，该重组核酸分子包含、基本上由、或由一个感兴趣的核苷酸序列、一个启动子以及SEQ ID NO:1的核苷酸序列组成，其中该启动子在SEQ ID NO:1的核苷酸序列的下游并与其操作性相关联并且在该感兴趣的核苷酸序列的上游并与其操作性相关联，进一步地其中该启动子是一个玉米聚泛素-1启动子和/或一个玉米PepC启动子并且该感兴趣的核苷酸序列以一个水平表达，该水平比一种对照中所述感兴趣的核苷酸序列的表达水平高至少约6倍(例如，高约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15倍，等等)。

在本发明的另一个方面，提供了一种增加一种甘蔗植物细胞中一种感兴趣的核苷酸序列的表达的方法，该方法包括：向该甘蔗植物细胞中引入一种重组核酸分子，该重组核酸分子包含、基本上由、或由一个感兴趣的核苷酸序列、一个启动子以及SEQ ID NO:1的核苷酸序列组成，其中在该感兴趣的核苷酸序列被表达的条件下，该启动子在SEQ ID NO:1的核苷酸序列的下游并与其操作性相关联并且在该感兴趣的核苷酸序列的上游并与其操作性相关联，从而将该感兴趣的核苷酸序列的表达增加至比一种对照中所述感兴趣的核苷酸序列的表达高至少约6倍(例如，高约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15倍，等等)。在一些实施例中，该启动子可以是如下所述的任何启动子。在其它实施例中，该启动子是一个玉米聚泛素-1启动子和/或一个玉米PepC启动子。

因此，在另一个方面，提供了一种增加一种甘蔗植物细胞中一种感兴趣的核苷酸序列的表达的方法，该方法包括：向该甘蔗植物细胞中引入一种重组核酸分子，该重组核酸分子包含、基本上由、或由一个感兴趣的核苷酸序列、一个启动子以及SEQ ID NO:1的核苷酸序列组成，其中在该感兴趣的核苷酸序列被表达的条件下，该启动子在SEQ ID NO:1的核苷酸序列的下游并与其操作性相关联并且在该感兴趣的核苷酸序列的上游并与其操作性相关联，进一步地其中该启动子是一个玉米聚泛素-1启动子和/或一个玉米PepC启动子，从而将该感兴趣的核苷酸序列的表达增加至比一种对照中所述感兴趣的核苷酸序列的表达高至少约6倍(例如，高约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15倍，等等)。

在具体实施例中，该对照是包含缺乏该增强子序列的相同重组核酸分子的一种甘蔗植物(即，该重组核酸分子包含与该感兴趣的核苷酸序列操作性相关联的启动子，但是不包含与该启动子操作性相关联的SEQ ID NO:1的核苷酸序列)。

在一些方面，本发明的一种重组核酸分子进一步包含一个Kozak序列。因此，在本发明的一个实施例中，该重组核酸分子包含、基本上由、或由一个感兴趣的核苷酸序列、一个启动子、一个Kozak序列以及SEQ IDNO:1的核苷酸序列组成，其中该启动子在SEQ ID NO:1的核苷酸序列的下游并与其操作性相关联并且在该感兴趣的核苷酸序列的上游并与其操作性相关联，并且该Kozak序列在该感兴趣的核苷酸序列的上游(例如，紧接上游)并在该启动子的下游并且与该启动子和该感兴趣的核苷酸序列二者均操作性相关联。可以使用任何kozak序列。在一些具体实施例中，该Kozak序列是gcggccgcc。

本发明的另外方面提供用本发明的一种重组核酸分子转化的甘蔗植物细胞、植物和植物部分以及从转化的甘蔗植物和植物部分收获的产物以及由本发明的收获产物生产的加工产物。因此，本发明的一个特定方面提供一种包含一种植物细胞的植物，该植物细胞进一步包含本发明的一种重组核酸分子。

从甘蔗收获的产物包括但不限于：甘蔗渣、甘蔗杆、秸秆、以及类似物、和/或其任何组合。由该收获的甘蔗产物生产的加工产物的非限制性实例包括：纸浆、纸、蔗渣板、用于树脂的糠醛、生物燃料(包括但不限于乙醇)、动物饲料、食品(包括但不限于糖、甘蔗汁、糖浆、朗姆酒、糖蜜)、以及类似物、和/或其任何组合。加工产物还可以由用作生物工厂的甘蔗生产。生物工厂产品的非限制性实例包括：酶、药物、替代性糖、抗体、工业产品、以及类似物、和/或其任何组合。

在又另一个实施例中，本发明提供一种包括在农场中栽植在一起的多个本发明的转基因甘蔗植物的甘蔗作物。

除非上下文另外清楚指示，否则如在本发明的实施例的描述和附加权利要求中使用的单数形式“一个/种”和“该”旨在也包括复数形式。

如在此所使用，“和/或”是指并且包括相关联的列出项中的一个或多个的任何和所有可能的组合。

术语“约”如在此所使用，当指一个可测量的值(如化合物的量、剂量、时间、温度、以及类似物)时，意在包括指定量的20％、10％、5％、1％、0.5％、或甚至0.1％的变型。

术语“包含(comprise、comprises和/或comprising)”当在本说明书中使用时，指明所列举特征、整体、步骤、操作、元件、和/或部件的存在，但是不排除一种或多种其他特征、整体、步骤、操作、元件、部件、和/或其组的存在或添加。

如在此所使用，过渡短语“基本上由…组成”意思是意在将权利要求的范围解读为包括在权利要求书中所述的所指定材料或步骤和并不实质影响要求保护的发明的一个或多个基本特征和新颖特征的那些。因此，当在本发明的权利要求书中使用时，术语“基本上由…组成”不旨在被解读为等同于“包含”。因此，术语“基本上由...组成(以及语法上的变体)”，当应用于本发明的多核苷酸序列时，意思是由所列举的序列(例如，SEQ ID NO)以及该所列举序列的5'和/或3'端上的总共十个或更少的(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个)额外核苷酸二者组成的一个多核苷酸，这样使得该多核苷酸的功能未在实质上改变。该总共十个或更少的额外的核苷酸包括全部数量的两个端上加在一起的额外的核苷酸。

术语“核苷酸序列”、“核酸”、“核酸分子”“寡核苷酸”以及“多核苷酸”在此可互换地使用来指核苷酸的杂聚物并且包括RNA和DNA二者，包括cDNA、基因组DNA、mRNA、合成(例如，化学合成的)DNA或RNA以及RNA和DNA的嵌合体。术语核酸是指一个核苷酸链，而不考虑该链的长度。一个核酸可以是双链或单链的。在是单链时，该核酸可以是一个有义链或一个反义链。可以使用寡核苷酸类似物或衍生物(例如，肌苷或硫代磷酸核苷酸)合成核酸。这类寡核苷酸可以被使用(例如)来制备具有改变的碱基配对能力或增加的对核酸酶的抗性的核酸。在此提供的核酸序列在此以5'至3'方向从左至右表示，并且使用代表核苷酸字符的标准代码描述，如美国序列规则，37CFR§§1.821-1.825和世界知识产权组织(WIPO)标准ST.25中所述。

如在此所使用，术语“基因”是指能够用于产生mRNA、反义RNA、miRNA等的核酸分子。基因可以或不可以能够用来产生功能蛋白质。基因可以包括编码区和非编码区(例如、内含子、调节元件、启动子、增强子、终止序列和5'和3'非翻译区)二者。

一种“分离的”核酸分子或核苷酸序列或一种“分离的”多肽是借助于人的手脱离其天然环境存在的一种核酸分子、核苷酸序列或多肽，并且因此不是自然的产物。分离的核酸分子或分离的多肽可能以纯化形式存在或可能存在于非天然环境(例如像重组宿主细胞)中。因此，例如，相对于多核苷酸而言，术语“分离的”意思是将该多核苷酸从它天然存在于其中的染色体和/或细胞中分离出。如果将一种多核苷酸从它天然存在于其中的染色体和/或细胞中分离出并且然后将其插入它并不天然存在于其中的遗传背景、染色体、和/或细胞中，则该多核苷酸也是被分离的。本发明的重组核酸分子和核苷酸序列可以被认为是如上文所定义的“分离的”。

因此，“分离的核酸分子”或“分离的核苷酸序列”是不与在其所衍生自的有机体的天然存在的基因组中与其紧接相邻(一个在5'端并且一个在3'端)的全部核苷酸序列紧接相邻的核酸分子或核苷酸序列。在一个实施例中，分离的核酸分子或分离的核苷酸序列包括与编码序列紧接相邻的5'非编码(例如，启动子)序列的一些或全部。该术语因此包括(例如)结合到载体中、结合到自主复制的质粒或病毒中、或结合到原核生物或真核生物的基因组DNA中的重组核酸分子、或作为独立于其他序列的单独分子存在的重组核酸分子(例如，通过PCR或限制性核酸内切酶处理产生的cDNA或基因组DNA片段)。它也包括作为编码额外多肽或肽序列的杂合核酸分子的部分的重组核酸。

术语“分离的”可以进一步指核酸分子、核苷酸序列、多肽、肽或片段，该片段基本上不含细胞材料(包括但不限于蛋白质，如组蛋白)、病毒材料、和/或培养基(例如，当通过重组DNA技术产生时)、或化学前体或其他化学品(例如，当化学合成时)。另外，“分离的片段”是不作为片段天然存在并且不会在天然状态下如此存在的核酸分子、核苷酸序列或多肽的片段。“分离的”不必须意味着该制备是工业纯的(同质的)，但是它是足够纯的以提供处于一种可以用于预期目的形式的多肽或核酸。

在本发明的代表性实施例中，“分离的”核酸分子、核苷酸序列和/或多肽具有至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％纯度(w/w)或更大纯度。在其他实施例中，“分离的”核酸、核苷酸序列和/或多肽表示与起始材料相比，实现该核酸的至少约5倍、10倍，25倍、100倍、1000倍、10,000倍、100,000倍或更大富集(w/w)。

如在此所使用，“异源的”是指一个核酸分子或核苷酸序列，该序列来源于另一种物种或来自相同物种或有机体，但是对其原初形式或在细胞中表达的初始形式进行了改性。因此，衍生自与将其引入的细胞所属的有机体或物种不同的有机体或物种的核苷酸序列相对于那个细胞或细胞的子代而言是异源的。另外，异源核苷酸序列包括这样的一种核苷酸序列，它衍生自并插入相同的天然原初细胞类型，但是却以非天然状态存在，例如，以不同拷贝数目存在，和/或处于与在该核酸分子的天然状态中发现的那些不同的调节序列的控制下。

“野生型”核苷酸序列或氨基酸序列是指天然存在(“天然”)或内源核苷酸序列或氨基酸序列。因此，例如，“野生型mRNA”是天然存在于或内源于有机体的mRNA。“同源”核苷酸序列是与它被引入其中的宿主细胞天然相关联的核苷酸序列。

关于多核苷酸编码序列的术语“表达(express或expression)”，意思是该序列被转录，并且任选被翻译。因此，在本发明的一些具体实施例中，本发明的编码序列的表达将导致多肽的产生。

“感兴趣的核苷酸序列”是指任何核苷酸序列，当被引入一种植物中时，该核苷酸序列赋予该植物一种所希望的特征，如抗生素抗性、病毒抗性、抗虫性、抗病性、或对其他害虫的抗性、除草剂耐受性、改善的营养价值、工业过程中改善的性能或改变的繁殖能力。“感兴趣的核苷酸序列”还可以是被转移到植物中用于在该植物中产生商业上有价值的产物(如酶或代谢物)的核苷酸序列。

如在此所使用，短语“可操作地连接”、“操作性地连接”、“操作性地相关联的”或“操作性相关联”以及类似物是指核酸构建体的元件(如表达盒或核酸分子)被配置以便执行它们通常的功能。因此，可操作地连接到一个感兴趣的核苷酸序列上的调节或控制序列(例如，启动子)能够影响该感兴趣的核苷酸序列的表达。另外，控制序列可以由调节序列(如本发明的核苷酸序列，例如，SEQ ID NO:1)调节，与一种对照植物中该感兴趣的核苷酸序列的表达相比，这些调节序列当可操作地连接到进而可操作地连接到该感兴趣的核苷酸序列上的启动子上时可以导致该感兴趣的核苷酸序列的表达增加(其中该对照植物是包含相同重组核酸分子的一种甘蔗植物，不同之处在于，就该对照而言，该重组核酸分子包含该启动子和操作性相关联的该感兴趣的核苷酸序列，但是不包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列，并且因此不包含与该启动子操作性相关联的SEQ ID NO:1的核苷酸序列)。

调节或控制序列不必与该感兴趣的核苷酸序列相邻，只要它们起到指导其表达的作用。因此，例如，介入未翻译的、已转录的序列可以在一种启动子与一种编码序列之间存在，并且该启动子序列仍可以被认为“可操作地连接到”该编码序列上。因此，在本发明的一些实施例中，一个感兴趣的核苷酸序列可以操作性地连接到操作性地连接到SEQ ID NO:1的核苷酸序列上的启动子上，从而允许该感兴趣的核苷酸序列在植物、植物部分和/或植物细胞中的表达增加。

如在此所使用，术语“转化”和“转基因”是指含有至少一种重组(例如，异源)多核苷酸的全部或部分的任何植物、植物细胞、愈伤、植物组织、或植物部分。在一些实施例中，将该重组多核苷酸的全部或部分稳定地整合到一个染色体或稳定的染色体外元件中，以使得其传递到连续世代。出于本发明的目的，术语“重组多核苷酸”是指已经通过基因工程予以改变、重排或修饰的多核苷酸。实例包括任何克隆的多核苷酸，或与异源序列连接或接合的多核苷酸。术语“重组”不指因天然存在的事件(如自发突变)或因非自发诱变随后选择性育种而产生的多核苷酸改变。

在一种植物细胞、植物和/或植物部分的背景下的“引入”意思是使一种核酸分子与该植物、植物部分、和/或植物细胞以这样一种方式相接触：该核酸分子获得进入该植物细胞和/或该植物和/或植物部分的一个细胞内部的途径。其中有待引入一个以上核酸分子的情况下，这些核酸分子可以作为单个多核苷酸或核酸构建体的部分，或者作为分开的多核苷酸或核酸构建体而进行组装，并且可以位于相同的或不同的核酸构建体上。因此，可以在单一的转化事件中、在分开的转化事件中，或(例如)作为育种方案的一部分，将这些多核苷酸引入植物细胞中。因此，如在此所使用的术语“转化”是指将异源核酸引入细胞中。细胞的转化可以是稳定或瞬时的。

如在此所使用的术语“植物部分”包括但不限于：胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果、谷粒、穗、穗轴、谷壳、茎杆、根、根尖、花药，植物细胞(包括在植物和/或植物的部分中完整的植物细胞)、植物原生质体、植物组织、植物细胞组织培养物、植物愈伤、植物团(plant clump)以及类似物。此外，如在此所使用，“植物细胞”是指该植物的一种结构和生理单元，该单元包括一种细胞壁并且还可以指一种原生质体。在一些实施例中，一种植物细胞可以处于一种分离的单细胞的形式或可以是一种培养细胞或可以是一种更高组织单位(例如像一种植物组织或一种植物器官)的一部分。

在多核苷酸背景下的“瞬时转化”意思是：一种多核苷酸被引入细胞中并且不整合到该细胞的基因组中。

如在此所使用，在被引入细胞中的多核苷酸背景下的“稳定引入(stably introducing、stably introduced)”、“稳定转化(stabletransformation或stably transformed)”意思是：引入的多核苷酸被稳定地整合到该细胞的基因组中，并且因此该细胞用该多核苷酸稳定地转化。因此，整合的多核苷酸能够由其后代继承，更具体地说，由多个连续世代的后代继承。如在此所使用的“基因组”包括核和/或质体基因组，并且因此包括多核苷酸到例如叶绿体基因组中的整合。如在此所使用的稳定转化还可以指被保持在染色体外，例如，作为一种微染色体的多核苷酸。

瞬时转化可以通过例如酶联免疫测定(ELISA)或蛋白质印迹来进行检测，这两种方法可以检测由引入有机体的一个或多个核酸分子编码的肽或多肽的存在。细胞的稳定转化可以通过例如细胞基因组DNA与多种核酸序列(这些序列与引入有机体(例如，植物)中的核酸分子的核苷酸序列特异性地杂交)的DNA印记杂交测定来进行检测。细胞的稳定转化可以通过例如细胞的RNA与多种核酸序列(这些序列与引入植物或其他有机体的核酸分子的核苷酸序列特异性地杂交)的RNA印记杂交测定来进行检测。细胞的稳定转化还可以由例如本领域中熟知的聚合酶链式反应(PCR)或其他扩增反应来进行检测，这些反应采用与核酸分子的一个或多个靶序列杂交的特异性引物序列，从而导致该一个或多个靶序列的扩增，这可以根据标准方法进行检测。转化还可以由本领域中熟知的直接测序和/或杂交方案来进行检测。

转化

用于转化植物的程序是熟知的并且在本领域内是常规的并且在文献中普遍描述。用于转化植物的方法的非限制性实例包括：经由细菌介导的核酸递送(例如，经由农杆菌)、病毒介导的核酸递送、碳化硅或核酸晶须介导的核酸递送、脂质体介导的核酸递送的转化；微注射、微粒轰击、磷酸钙介导的转化、环糊精介导的转化、电穿孔、纳米粒子介导的转化、超声处理、浸润、聚合物介导的转化(包括但不限于聚乙二醇(PEG)介导的核酸摄取)、以及导致将核酸引入植物细胞中的任何其他电学、化学、物理(机械)和/或生物学机制、包括其任何组合。本领域中已知的各种植物转化方法的一般指南包括：植物分子生物学与生物技术的方法(Methods in PlantMolecular Biology and Biotechnology)中的美纪(Miki)等人(“用于将外源DNA引入植物的程序(Procedures for Introducing Foreign DNA intoPlants)”，格里克B.R.(Glick,B.R.)和汤普森J.E.(Thompson,J.E.)编(CRC出版有限公司(CRC Press,Inc.)，波卡拉顿(Boca Raton)，1993)，第67-88页)以及拉科沃奇-特罗扬诺夫斯卡(Rakowoczy-Trojanowska)(细胞与分子生物学学报(Cell.Mol.Biol.Lett.)7:849-858(2002))。

农杆菌介导的转化是用于转化植物(具体地说，双子叶植物)的一种常用方法，这是由于其高转化效率并且由于其在许多不同物种中的广泛应用。农杆菌介导的转化典型地涉及将携带感兴趣的外源DNA的二元载体转移到一种适当的农杆菌菌株，该农杆菌菌株可以取决于由该宿主农杆菌菌株在共存Ti质粒上或染色体地携带的vir基因的补体(乌肯斯(Uknes)等人(1993)植物细胞(Plant Cell)5:159-169)。将该重组二元载体转移到农杆菌可以使用携带该重组二元载体的大肠杆菌、一种辅助大肠杆菌的菌株(携带能够将该重组二元载体移动到该靶农杆菌菌株中)通过一种三亲本交配程序实现。可替代地，可以通过核酸转化将该重组二元载体转移到农杆菌中(霍夫根和威尔米策(Willmitzer)(1988)核酸研究(Nucleic Acids Res.)16:9877)。

通过重组农杆菌转化植物通常涉及该农杆菌与来自该植物的外植体的共培养，并且遵循本领域中熟知的方法。将转化的组织在携带位于这些二元质粒T-DNA边界之间的抗生素标志或除草剂抗性标志的选择性培养基上进行再生。

另一种用于转化植物、植物部分以及植物细胞的方法涉及在植物组织和细胞上推进惰性或生物学活性的粒子。参见，例如美国专利号4,945,050、5,036,006和5,100,792。一般来说，这种方法涉及在有效穿透该细胞的外表面并且提供在其内部中的结合的条件下在植物细胞上推进惰性或生物学活性的粒子。当使用惰性粒子时，可以通过用含有感兴趣的核酸的载体包被这些粒子而将该载体引入该细胞中。可替代地，一个或多个细胞可以被该载体围绕使得该载体通过该粒子的激发而被带入该细胞中。也可以将生物学活性的粒子(例如，干酵母细胞、干细菌或噬菌体，各自含有一种或多种被试图引入的核酸)推进到植物组织中。

因此，在本发明的具体实施例中，植物细胞可以通过本领域中已知的任何方法进行转化并且可以使用多种已知技术中的任何一种来从这些转化的细胞再生出完整的植物。因此，在一些实施例中，用本发明的核酸分子转化的植物细胞可以通过本领域中熟知的方法再生，以产生本发明的转化的植物或植物部分。从植物细胞、植物组织培养物和/或培养的原生质体的植物再生描述于例如埃文斯(Evans)等人(植物细胞培养手册(Handbook of PlantCell Cultures)，第1卷，麦克米兰出版公司(MacMilan Publishing Co.)纽约(New York)(1983))；以及瓦希尔I.R.(Vasil I.R.)(编)(植物的细胞培养与体细胞遗传学(Cell Culture and Somatic Cell Genetics ofPlants)，学术出版社(Acad.Press)，奥兰多(Orlando)，第I卷(1984)和第II卷(1986))。对转化的转基因植物、植物细胞和/或植物组织培养物进行选择的方法在本领域内是常规的并且可以在在此提供的本发明的方法中采用。

同样地，在一些实施例中，工程化进入上述本发明的转基因种子以及植物、植物部分、和/或植物细胞中的遗传特性可以通过有性生殖或营养生长被传递，并且因此可以在子代植物中被维持和繁殖。总体而言，维持和繁殖利用了已知的农业方法，这些方法被开发以适合特定目的(如收获、播种或耕作)。

因此能够以本领域中熟知的任何数目的方法将一种核苷酸序列引入该植物、植物部分和/或植物细胞中。本发明的这些方法并不取决于将一种或多种核苷酸序列引入植物中的具体方法，仅取决于它们获得进入该植物的至少一个细胞内部的途径。在有待引入一种以上核苷酸序列的情况中，这些对应的核苷酸序列可以作为一种单一核酸构建体/分子的部分、或者作为分开的核酸构建体/分子而进行组装，并且可以位于相同的或不同的核酸构建体/分子上。因此，可以在单一的转化事件中、在分开的转化事件中，或例如在植物中，作为育种方案的部分，将这些核苷酸序列引入细胞中。

在本发明的一些实施例中，如果引入的核酸分子被结合到非染色体自主复制子中或被整合到该植物的一条或多条染色体中，其可以稳定地维持在该植物细胞中。可替代地，引入的核酸分子可以存在于染色体外非复制型载体上并且可以短暂地表达或短暂地具有活性。不论是存在于染色体外非复制型载体中或整合到一个染色体中的载体中，该核酸分子可以存在于一个植物表达盒中。

核酸构建体

一个植物表达盒或核酸分子可以含有驱动植物细胞中基因表达的调节序列(除SEQ ID NO:1的核苷酸序列之外)，这些序列可操作地连接以使得每个序列可以实现其功能，例如，通过多腺苷酸化信号的转录终止。示例性多腺苷酸化信号可以是起源于根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)T-DNA的那些，例如已知为Ti-质粒pTiACH5的章鱼碱合成酶(吉耶朗(Gielen)等人，欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J.)3:835(1984))或其功能等效物的基因，但是植物中的所有其他具有功能活性的终止子也是合适的。

因此，本发明的一些实施例针对被设计来表达本发明的核苷酸序列和核酸分子的表达盒。如在此所使用，“表达盒”是指一种核酸分子，该核酸分子具有操作性地连接到感兴趣的核苷酸序列上的至少一个控制序列。以这种方式，例如，可操作地与待表达的核苷酸序列相互作用或相关联的植物启动子可以在表达盒中提供，用于一种植物、植物部分和/或植物细胞中的表达。

如在此所使用，术语“启动子”是指核苷酸序列的一个区域，该区域结合对于操作性地与该启动子相关联的编码序列的有效表达所必需的信号。这可以包括RNA聚合酶结合于其上的序列，但是并不限于此类序列，并且可以包括与在蛋白质翻译控制中涉及的区域一起的其他调节蛋白结合的区域并且还可以包括编码序列。此外，本发明的“启动子”是一种能够在植物细胞中起始核酸分子转录的启动子(例如，一个核苷酸序列)。

与本发明一起可用的启动子的选择可以在许多不同类型的启动子中做出。因此，启动子的选择取决于若干因素，包括但不限于：细胞或组织特异性表达、所希望的表达水平、效率、可诱导性和/或可选择性。例如，除可诱导性之外，在希望在特异性组织或器官中表达的情况下，可以使用一种组织特异性启动子(例如，根特异性启动子)。相比之下，在希望响应于一个刺激表达的情况下，可以使用由其他刺激或化学物可诱导的启动子。在希望在植物的所有细胞中连续表达的情况下，可以选择组成型启动子。

组成型启动子的非限制性实例包括：夜香树属(cestrum)病毒启动子(cmp)(美国专利号7,166,770)、水稻肌动蛋白1启动子(王等人(1992)，分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)12:3399-3406；以及美国专利号5,641,876)、CaMV35S启动子(奥德尔(Odell)等人(1985)，自然(Nature)313:810-812)、CaMV19S启动子(劳顿(Lawton)等人(1987)，植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)9:315-324)、nos启动子(艾柏特(Ebert)等人(1987)，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.SciUSA)84:5745-5749)、Adh启动子(沃克(Walker)等人(1987)，美国科学院院刊84:6624-6629)、蔗糖合成酶启动子(杨(Yang)和拉塞尔(Russell)(1990)，美国科学院院刊87:4144-4148)、以及泛素启动子。

与本发明一起可用的组织特异性启动子的一些非限制性实例包括：编码种子贮藏蛋白(如β-伴大豆球蛋白、十字花科蛋白、油菜籽蛋白和菜豆素)，玉米素或油体蛋白(如油质蛋白)，或脂肪酸生物合成中涉及的蛋白质(包括酰基载体蛋白、硬脂酰-ACP去饱和酶和脂肪酸去饱和酶(fad2-1))，以及在胚发育中表达的其他核酸(如Bce4，参见例如克里德(Kridl)等人(1991)种子科学研究(Seed Sci.Res.)1:209-219；连同欧洲专利号255378)的那些。因此，在一些实施例中，与这些组织特异性核酸相关联的启动子可以使用于本发明中。

组织特异性启动子的额外实例包括但不限于：根特异性启动子RCc3(郑(Jeong)等人植物生理学(Plant Physiol)153:185-197(2010))和RB7(美国专利号5459252)；凝集素启动子(林斯特龙(Lindstrom)等人(1990)Der.Genet.11:160-167；以及沃德金(Vodkin)(1983)临床生物学研究进展(Prog.Clin.Biol.Res.)138:87-98)；玉米醇脱氢酶1启动子(丹尼斯(Dennis)等人(1984)核酸研究(Nucleic Acids Res.)12:3983-4000)；S-腺苷-L-甲硫氨酸合成酶(SAMS)(范德米金斯布鲁格(VanderMi jnsbrugge)等人(1996)植物与细胞生理学(Plant and CellPhysiology)，37(8):1108-1115)；玉米集光复合体启动子(班赛尔(Bansal)等人(1992)美国科学院院刊89:3654-3658)；玉米热激蛋白启动子(奥德尔(O’De11)等人(1985)欧洲分子生物学学会杂志5:451-458；以及罗切斯特(Rochester)等人(1986)欧洲分子生物学学会杂志5:451-458)；豌豆小亚基RuBP羧化酶启动子(植物遗传工程(GeneticEngineering of Plants)(霍兰德尔(Hollaender)编，Plenum出版社(Plenum Press)1983)中的卡什莫尔(Cashmore)，“编码核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶的小亚基的核基因(Nuclear genes encoding the small subunit ofribulose-1,5-bisphosphate carboxylase”)29-39；以及波尔森(Poulsen)等人(1986)分子与普通遗传学(Mol.Gen.Genet)205:193-200)；Ti质粒甘露氨酸合成酶启动子(兰格里奇(Langridge)等人(1989)美国科学院院刊86:3219-3223)；Ti质粒胭脂氨酸合成酶启动子(兰格里奇等人(1989)同上)；矮牵牛查尔酮异构酶启动子(范杜能(van Tunen)等人(1988)欧洲分子生物学学会杂志7:1257-1263)；豆富甘氨酸蛋白1启动子(凯勒(Keller)等人(1989)基因与发育(Genes Dev.)3:1639-1646)；截短的CaMV35S启动子(奥德尔等人(1985)自然313:810-812)；马铃薯贮藏蛋白启动子(温茨勒(Wenzler)等人(1989)植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)13:347-354)；根细胞启动子(山本(Yamamoto)等人(1990)核酸研究18:7449)；玉米素启动子(克里茨(Kriz)等人(1987)分子与普通遗传学(Mol.Gen.Genet.)207:90-98；兰格里奇(Langridge)等人(1983)细胞(Cell)34:1015-1022；雷纳(Reina)等人(1990)核酸研究18:6425；雷纳等人(1990)核酸研究18:7449；以及万德尔特(Wandelt)等人(1989)核酸研究17:2354)；球蛋白-1启动子(贝朗葛(Belanger)等人(1991)遗传学(Genetics)129:863-872)；α-微管蛋白cab启动子(沙利文(Sullivan)等人(1989)分子与普通遗传学(Mol.Gen.Genet.)215:431-440)；PEPCase启动子(哈得斯佩斯(Hudspeth)和久拉(Grula)(1989)植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)12:579-589)；R基因复合体-相关联启动子(钱德勒(Chandler)等人(1989)植物细胞(Plant Cell)1:1175-1183)；以及查尔酮合成酶启动子(弗兰肯(Franken)等人(1991)欧洲分子生物学学会杂志10:2605-2612)。对于种子特异性表达特别有用的是豌豆球蛋白启动子(扎科(Czako)等人(1992)分子与普通遗传学(Mol.Gen.Genet.)235:33-40；以及美国专利号5,625,136)。对于在成熟叶中表达的其他有用启动子是在衰老开始时开启的那些，如来自拟南芥属(Arabidopsis)的SAG启动子(甘(Gan)等人，(1995)科学(Science)270:1986-1988)。

此外，可以使用在质体中发挥功能的启动子。此类启动子的非限制性实例包括噬菌体T3基因95'UTR以及其他的披露于美国专利号7,579,516中的启动子。在其他实施例中，适用于本发明的启动子包括但不限于S-E9小亚基RuBP羧化酶启动子以及Kunitz胰蛋白酶抑制剂基因启动子(Kti3)。

在一些实例中，诱导型启动子是与本发明一起可用的。与本发明一起可用的诱导型启动子的实例包括但不限于：四环素阻抑物系统启动子、Lac阻抑物系统启动子、铜诱导型系统启动子、水杨酸盐诱导型系统启动子(例如PR1a系统)、糖皮质激素诱导型启动子(青山(Aoyama)等人(1997)，植物杂志(Plant J.)11:605-612)和蜕皮激素诱导型系统启动子。诱导型启动子的其他非限制性实例包括：ABA诱导型启动子和膨胀诱导型启动子、生长素结合蛋白基因启动子(施沃布(Schwob)等人(1993)，植物杂志4:423-432)、UDP葡萄糖类黄酮糖基转移酶启动子(罗尔斯顿(Ralston)等人(1988)，遗传学(Genetics)119:185-197)、MPI蛋白酶抑制剂启动子(科尔德罗(Cordero)等人(1994)，植物杂志6:141-150)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子(科勒(Kohler)等人(1995)植物分子生物学29:1293-1298；马丁内斯(Martinez)等人(1989)，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)208:551-565；以及奎格利(Quigley)等人(1989)分子进化学杂志(J.Mol.Evol.)29:412-421)、苯磺酰胺诱导型启动子(美国专利号5,364,780)以及谷胱甘肽S-转移酶启动子。同样地，人们可以使用描述于以下文献中的任何适当的诱导型启动子：盖兹(Gatz)(1996)生物工艺学现行观点(Current Opinion Biotechnol.)7:168-172以及盖兹(1997)植物生理学与植物分子生物学年度综述(Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.)48:89-108。

如上所述，该增强子(例如，SEQ ID NO:1)可以与本领域技术人员已知的任何启动子一起使用，用于在甘蔗植物中表达感兴趣的核苷酸序列。在具体实施例中，本发明的增强子(例如，SEQ ID NO:1)操作性地连接到一个玉米聚泛素-1启动子和/或一个玉米PepC启动子上，该玉米聚泛素-1启动子和/或该玉米PepC启动子进而操作性地连接到一个感兴趣的核苷酸序列上。

除上述增强子(例如，SEQ ID NO:1)和启动子之外，该表达盒还可以包括其他调节序列。如在此所使用，“调节序列”是指位于一种编码序列的上游(5'非编码序列)、内部、或下游(3'非编码序列)的核苷酸序列，并且这些核苷酸序列影响相关联的编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或翻译。除启动子之外，调节序列包括但不限于：额外增强子、内含子、kozak序列、翻译前导序列以及多腺苷酸化信号序列。

已知源自病毒的多个非翻译前导序列用来增强基因表达。确切地说，已经显示来自烟草花叶病毒(TMV，“ω-序列”)、玉米褪绿斑驳病毒(MCMV)以及苜蓿花叶病毒(AMV)的前导序列在增强表达方面有效(加利(Gallie)等人(1987)核酸研究15:8693-8711；以及斯库策斯基(Skuzeski)等人(1990)植物分子生物学15:65-79)。本领域中已知的其他前导序列包括但不限于：小核糖核酸病毒前导序列，如脑心肌炎(EMCV)5'非编码区前导序列(埃尔罗伊-斯坦因(Elroy-Stein)等人(1989)，美国科学院院刊86:6126-6130)；马铃薯Y病毒组前导序列，如烟草蚀纹病毒(TEV)前导序列(艾利森(Allison)等人(1986)，病毒学(Virology)154:9-20)；玉米矮花叶病毒(MDMV)前导序列(艾利森等人(1986)，同上)；人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)前导序列(马策耶克和萨摩(Macejak&Samow)(1991)自然353:90-94)；来自苜蓿花叶病毒(AMV)的外壳蛋白mRNA的非翻译前导序列(AMV RNA4；乔布林和格尔克(Jobling&Gehrke)(1987)，自然325:622-625)；烟草花叶病毒TMV前导序列，(加利(Gallie)等人(1989)RNA分子生物学(Molecular Biology of RNA)237-256)；以及MCMV前导序列(罗米尔(Lommel)等人(1991)病毒学81:382-385)。还参见黛拉-塞奥帕(Della-Cioppa)等人(1987)植物生理学(Plant Physiol.)84:965-968。

表达盒还可以任选地包括在植物中起作用的一种转录和/或翻译终止区(即，终止区)。对于在表达盒中使用而言，多种转录终止子是可用的并且负责在超出该感兴趣的异源核苷酸序列时的转录终止以及正确的mRNA聚腺苷酸化。该终止区对于该转录起始区可以是原生的，对于该操作性地连接的感兴趣的核苷酸序列可以原生的，对于该植物宿主可以是原生的，或者可以源自另一种来源(即，对于该启动子、该感兴趣的核苷酸序列、该植物宿主、或其任何组合而言是外源的或异源的)。适当的转录终止子包括但不限于CAMV35S终止子、tml终止子、胭脂碱合成酶终止子和豌豆rbcs E9终止子。这些终止子可以在单子叶植物和双子叶植物二者中使用。此外，可以使用编码序列的天然转录终止子。

在一些具体实施例中，一种信号序列可以可操作地连接到本发明的核酸分子上，以指导该核苷酸分子进入细胞区室。以此方式，该表达盒可以包含可操作地连接到用于该信号序列的核苷酸序列上的本发明的核酸分子。该信号序列可以可操作地连接在该核酸分子的N-或C-端。

如上所述，在一些实施例中，本发明的表达盒或核酸分子可以包括一个Kozak序列，其中该Kozak序列在该感兴趣的核苷酸序列的紧接上游(例如，紧接上游)并且在该启动子的下游并且与该启动子和该感兴趣的核苷酸序列二者操作性相关联。在一些具体实施例中，该Kozak序列是gcggccgcc。

该表达盒还可以包括一种用于可选择性标志的核苷酸序列，该核苷酸序列可以用以对一种转化的植物、植物部分和/或植物细胞进行选择。如在此所使用，“可选择性标志(selectable marker)”是指一种核苷酸序列，当该核苷酸序列表达时赋予一种不同的表型给表达该标志的植物、植物部分和/或植物细胞，并且因此允许此类转化的植物、植物部分和/或植物细胞与不具有该标志的那些区别开来。这样的核苷酸序列可以编码一种可选择的抑或可筛选的标志，这取决于该标志是否给予一种可以通过化学方法而被选择的性状，如通过使用一种选择性试剂(例如，一种抗生素、除草剂、或类似物)，或者取决于该标志是否仅是一种人们可以通过观察或测试而鉴别的性状，如通过筛选(例如，R基因座性状)。当然，合适的可选择性标志的许多实例在本领域中是已知的并且可以用于在此描述的这些表达盒中。

可选择性标志的实例包括但不限于：一种编码neo或nptll的核苷酸序列，它赋予对卡那霉素、G418、以及类似物的抗性(拍特里库斯(Potrykus)等人(1985)，分子与普通遗传学(Mol.Gen.Genet.)199:183-188)；一种编码bar的核苷酸序列，它赋予对草丁膦的抗性；一种编码改变的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸(EPSP)合成酶的核苷酸序列，它赋予对草甘膦的抗性(欣奇(Hinchee)等人(1988)，生物技术(Biotech.)6:915-922)；一种编码腈水解酶(如来自臭鼻克雷白氏杆菌(Klebsiellaozaenae)的bxn)的核苷酸序列，它赋予对溴草腈的抗性(斯托克尔(Stalker)等人(1988)，科学242:419-423)；一种编码改变的乙酰乳酸合成酶(ALS)的核苷酸序列，它赋予对咪唑啉酮、磺酰脲或其他ALS-抑制化学品的抗性(欧洲专利申请号154204)；一种编码甲氨蝶呤-抗性的二氢叶酸还原酶(DHFR)的核苷酸序列(泰莱特(Thillet)等人(1988)，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)263:12500-12508)；一种编码茅草枯脱卤素酶的核苷酸序列，它赋予对茅草枯的抗性；一种编码甘露糖-6-磷酸异构酶(也称为磷酸甘露糖异构酶(PMI))的核苷酸序列，它赋予代谢甘露糖的能力(美国专利号5,767,378和5,994,629)；一种编码改变的邻氨基苯甲酸盐合酶的核苷酸序列，它赋予对5-甲基色氨酸的抗性；和/或一种编码hph的核苷酸序列，它赋予对潮霉素的抗性。本领域技术人员能够选择用于本发明表达盒中的合适可选择性标志。

另外可选择性标志包括但不限于：一种编码β-葡萄糖醛酸酶的核苷酸序列或编码对于多种显色底物已知的一种酶的uidA(GUS)；一种编码在植物组织中对花色苷色素(红色)进行调节的产物的R基因座核苷酸序列(Dellaporta(德拉普塔)等人，染色体结构与功能：新概念的影响(Chromosome Structure and Function:Impact of New Concepts)中的263-282“通过Ac转座子标签技术对玉米R-nj等位基因的分子克隆”(“Molecularcloning of the maize R-nj allele by transposon-tagging with Ac”)，第18届斯特德莱遗传学专题讨论会(18th Stadler Genetics Symposium)(古斯塔夫森(Gustafson)和阿佩尔斯(Appels)编，Plenum出版社(Plenum Press)(1988))；一种编码β-内酰胺酶的核苷酸序列，对于β-内酰胺酶而言多种显色底物是已知的(例如，PADAC，一种显色头孢菌素)(苏利夫(Sutcliffe)(1978)美国科学院院刊75:3737-3741)；一种编码xylE的核苷酸序列，xylE编码一种儿茶酚双加氧酶(茹科夫斯基(Zukowsky)等人(1983)美国科学院院刊80:1101-1105)；一种编码酪氨酸酶的核苷酸序列，酪氨酸酶能够氧化酪氨酸成为DOPA以及多巴醌，其进而缩合形成黑色素(卡茨(Katz)等人(1983)普通微生物学杂志(J.Gen.Microbiol.)129:2703-2714)；一种编码β-半乳糖苷酶的核苷酸序列，对于β-半乳糖苷酶而言存在显色底物；一种编码荧光素酶(lux)的核苷酸序列，荧光素酶允许生物发光检测(奥(Ow)等人(1986)科学234:856-859)；一种编码水母发光蛋白的核苷酸序列，水母发光蛋白可以在钙敏感的生物发光检测中采用(普鲁切(Prasher)等人(1985)生物化学与生物物理学研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Comm.)126:1259-1268)；或一种编码绿色荧光蛋白的核苷酸序列(涅茨(Niedz)等人(1995)植物细胞报道(Plant CellReports)14:403-406)。本领域技术人员能够选择用于本发明表达盒中的合适可选择性标志。

感兴趣的核苷酸序列

核酸分子或表达盒还可以包括用于一个或多个多肽的一个编码序列，这一个或多个多肽用于主要受益者是种子公司、栽培者或谷物加工者的农艺性状。感兴趣的多肽可以是由感兴趣的核苷酸序列编码的任何多肽。适合用于植物中生产的感兴趣多肽的非限制性实例包括导致农艺学上重要性状的那些，这些性状如除草剂抗性(有时也称为“除草剂耐受性”)、病毒抗性、细菌病原体抗性、昆虫抗性、线虫抗性、和/或真菌抗性。参见，例如美国专利号5,569,823、5,304,730、5,495,071、6,329,504、以及6,337,431。该多肽还可以是提高植物活力或产量(包括允许植物在不同的温度、土壤条件以及日光和沉淀水平下生长的性状)的多肽、或是允许对展现感兴趣性状的植物进行鉴定的多肽(例如，可选择性标志、种皮颜色、等等)。不同的感兴趣的多肽，以及用于将这些多肽引入植物的方法描述于例如，美国专利号4,761,373、4,769,061、4,810,648、4,940,835、4,975,374、5,013,659、5,162,602、5,276,268、5,304,730、5,495,071、5,554,798、5,561,236、5,569,823、5,767,366、5,879,903、5,928,937、6,084,155、6,329,504以及6,337,431；以及美国专利公开号2001/0016956。还参见，万维网(WorldWide Web)上的lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/。

赋予对抑制生长点或分生组织的除草剂(如咪唑啉酮或磺酰脲)的抗性/耐受性的核苷酸序列也可以适用于本发明的一些实施例中。对于突变ALS和AHAS酶在这一分类号中的示例性核苷酸序列如(例如)美国专利号5,767,366和5,928,937中描述。美国专利号4,761,373和5,013,659针对抵抗不同的咪唑啉酮或磺酰脲除草剂的植物。美国专利号4,975,374涉及含有一种核酸的植物细胞和植物，该核酸编码抵抗已知抑制GS的除草剂(例如草胺膦和蛋氨酸亚砜亚胺)的抑制作用的突变谷氨酰胺合成酶(GS)。美国专利号5,162,602披露了抵抗环己二酮和芳氧苯氧丙酸除草剂的抑制作用的植物。该抗性由改变的乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)赋予。

由赋予对草甘膦的抗性的核苷酸序列编码的多肽也适合与本发明一起使用。参见，例如美国专利号4,940,835和美国专利号4,769,061。美国专利号5,554,798披露了抗草甘膦的转基因玉米植物，所述抗性由改变的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸(EPSP)合成酶基因赋予。

编码对磷酰基化合物(如草铵膦或草胺膦、以及吡啶氧丙酸或苯氧丙酸以及环己酮)的抗性的核苷酸序列也是适合的。参见欧洲专利申请号0 242246。参见，例如美国专利号5,879,903、5,276,268和5,561,236。

其他合适的核苷酸序列包括编码对抑制光合作用的除草剂(如三嗪和苯基氰(腈水解酶))的抗性的那些。参见美国专利号4,810,648。编码用于除草剂抗性的另外的合适核苷酸序列包括编码对2,2-二氯丙酸、烯禾啶、吡氟氯禾灵、咪唑啉酮除草剂、硫酰脲除草剂、三唑并嘧啶除草剂、均三嗪除草剂以及溴草腈的抗性的那些。同样适合的是赋予对原卟啉原氧化酶的抗性或者提供增强的对植物疾病的抗性、增强的对不利环境条件(非生物胁迫)的耐受性(这些条件包括但不限于干旱、极冷、极热、或极端的土壤盐度或极端的酸度或碱度)、以及在植物构型或发育中的改变(包括发育时间方面的变化)的核苷酸序列。参见，例如，美国专利公开号2001/0016956和美国专利号6,084,155。

在本发明中有用的杀昆虫蛋白可以按一个足以控制昆虫害虫的量(即昆虫控制量)进行生产。应当理解的是，在植物中对控制昆虫必要的杀虫蛋白的生产量可以变化，这取决于栽培品种、昆虫的类型、环境因素等。对于昆虫或害虫抗性有用的核苷酸序列包括，例如编码在杆菌(Bacillus)有机体中已鉴别的毒素的那些。已经克隆了编码来自几种亚种的苏云金芽孢杆菌(Baccillus thuringiensis)(Bt)毒素的核苷酸序列，并且已经发现重组克隆毒杀鳞翅类、双翅类和鞘翅类昆虫幼虫(例如，不同的Δ-内毒素基因，如Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1B、Cry1C、Cry1D、Cry1Ea、Cry1Fa、Cry3A、Cry9A、Cry9C和Cry9B；以及编码植物性杀昆虫蛋白的基因，如Vip1、Vip2和Vip3)。Bt毒素的完整清单可以在万维网在苏塞克斯大学(University of Sussex)维护的苏云金芽胞杆菌毒素命名法数据库中找到(还参见，例如克里克摩尔(Crickmore)等人(1998)微生物分子生物学综述(Microbiol.Mol.Biol.Rev.)62:807-813)。

适合在植物中生产的多肽进一步包括改进或通过其他方式有助于收获的植物和/或植物部分转化成为一种商业上有用的产品(包括(例如)增加的或改变的碳水化合物含量和/或分布、改善的发酵特性、增加的油含量、增加的蛋白含量、改善的消化率、以及增加的营养成分含量(例如，增加的植物甾醇含量、增加的生育酚含量、增加的甾烷醇含量和/或增加的维生素含量))的那些。感兴趣的多肽还包括，例如在一种收获的作物中导致或促成不需要的成分，例如植酸、或降解糖的酶类的含量降低的那些。“导致”或“促成”是指这种感兴趣的多肽可以直接或间接地促成一种感兴趣的性状的存在(例如，通过一种异源纤维素酶的使用来增加纤维素降解)。

在一个实施例中，感兴趣的多肽促成了食品或饲料的改善的可消化度。木聚糖酶是半纤维素分解酶，这些酶改善了植物细胞壁的分解，这导致动物更好地利用这些植物营养素。这导致了改善的生长率和饲料转化。而且，可以通过木聚糖酶降低含有木聚糖的饲料的粘度。在植物细胞内异源产生木聚糖酶也可以促进木质纤维素转化成工业加工中的可发酵糖。

来自真菌和细菌微生物的多种木聚糖酶已经得到鉴别和特征化(参见，例如美国专利号5,437,992；库格林(Coughlin)等人(1993)“里氏木霉纤维素酶和其他水解酶的第二三醋酸纤维研讨会论文集(Proceedings of theSecond TRICEL Symposium on Trichoderma reesei Cellulases and OtherHydrolases)”，埃斯波(Espoo)；索米宁(Souminen)和雷尼凯恩(Reinikainen)编(1993)生物技术和工业发酵研究基金会(Foundation forBiotechnical and Industrial Fermentation Research)8:125-135；美国专利公开号2005/0208178；以及PCT公开号WO03/16654)。具体地说，在里氏木霉(T.reesei)中已经鉴别出三种特异性木聚糖酶(XYL-I、XYL-II、和XYL-III)(滕卡宁(Tenkanen)等人，(1992)微生物酶技术(EnzymeMicrob.Technol.)14:566；特洛宁(Torronen)等人，(1992)生物/技术(Bio/Technology)10:1461；以及徐(Xu)等人，(1998)应用微生物生物技术(Appl.Microbiol.Biotechnol.)49:718)。

在另一个实施例中，对于本发明有用的多肽可以是多糖降解酶。生产这种酶的本发明的植物对于产生例如用于生物加工的发酵原料会是有用的。在一些实施例中、可用于发酵过程的酶包括α淀粉酶、蛋白酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、环糊精糖基转移酶、脂肪酶、植酸酶、漆酶、氧化酶、酯酶、角质酶、颗粒淀粉水解酶以及其他葡糖淀粉酶。

多糖降解酶包括：淀粉降解酶类，例如，α-淀粉酶类(EC3.2.1.1)、葡萄糖醛酸酶类(E.C.3.2.1.131)；外-1,4-α-D葡聚糖酶类，如淀粉糖化酶类以及葡糖淀粉酶(EC3.2.1.3)、β-淀粉酶类(EC3.2.1.2)、α-糖苷酶类(EC3.2.1.20)、以及其他外-淀粉酶类；淀粉脱支酶类，如a)异淀粉酶(EC3.2.1.68)、支链淀粉酶(EC3.2.1.41)、以及类似物；b)纤维素酶类，如外-1,4-3-纤维素二糖水解酶(EC3.2.1.91)、外-1,3-β-D-葡聚糖酶(EC3.2.1.39)、β-糖苷酶(EC3.2.1.21)；c)L-阿拉伯糖酶类(arabinases)，如内-l,5-α-L-阿拉伯糖酶(EC3.2.1.99)、α-阿拉伯糖苷酶类(EC3.2.1.55)以及类似物；d)半乳聚糖酶类(galactanases)，如内-1,4-β-D-半乳聚糖酶(EC3.2.1.89)、内-1,3-β-D-半乳聚糖酶化(EC3.2.1.90)、α-半乳糖苷酶(EC3.2.1.22)、β-半乳糖苷酶(EC3.2.1.23)以及类似物；e)甘露聚糖酶类(mannanases)，如内-1,4-β-D-甘露聚糖酶(EC3.2.1.78)、β-甘露糖苷酶(EC3.2.1.25)、α-甘露糖苷酶(EC3.2.1.24)以及类似物；f)木聚糖酶类，如内-1,4-β-木聚糖酶(EC3.2.1.8)、β-D-木糖苷酶(EC3.2.1.37)、1,3-β-D-木聚糖酶、以及类似物；以及g)其他酶类，如α-L-岩藻糖苷酶(EC3.2.1.51)，α-L-鼠李糖苷酶(EC3.2.1.40)、果聚糖酶(EC3.2.1.65)、菊粉酶(EC3.2.1.7)、以及类似物。

可以与本发明一起使用的另外的酶包括蛋白酶，如真菌和细菌蛋白酶。真菌蛋白酶包括但不限于从曲霉属(Aspergillus)、木霉属(Trichoderma)、毛霉属(Mucor)和根霉属(Rhizopus)，如黑曲霉(A.niger)、泡盛曲霉(A.awamori)、米曲霉(A.oryzae)和米黑毛霉(M.miehei)获得的那些。在一些实施例中，本发明的多肽可以是纤维二糖水解酶(CBH)(EC3.2.1.91)。在一个实施例中，纤维二糖水解酶可以是CBH1或CBH2。

其他有用酶类包括但不限于：半纤维素酶类，如甘露聚糖酶类和阿拉伯呋喃糖酶类(EC3.2.1.55)；木素酶类；脂肪酶类(例如，E.C.3.1.1.3)、葡萄糖氧化酶类、果胶酶类、木聚糖酶类、转葡萄糖苷酶类、α1,6葡糖苷酶(例如，E.C.3.2.1.20)；酯酶，如阿魏酸酯酶(EC3.1.1.73)和乙酰基木聚糖酯酶(EC3.1.1.72)；以及角质酶(例如，E.C.3.1.1.74)。

感兴趣的核苷酸序列还可以包括编码包括但不限于核糖酶、siRNA、shRNA和/或miRNA的功能性核酸的核苷酸序列。

现在将参考以下实例描述本发明。应认识到，这些实例不旨在将权利要求的范围限于本发明，反而旨在成为某些实施例的示例。技术人员想到的所例举方法的任何变型旨在落入本发明的范围内。

实例

实例1.构建体的产生

所有聚合酶链式反应(PCR)均使用KAPAHiFi DNA聚合酶(Geneworks公司)执行，并且将所得PCR产物克隆到pGEM-T(普洛麦格公司(Promega))中并且在亚克隆之前对序列进行检验。

这些构建体中的每一个具有以下特征：

(1)针对在甘蔗中表达而优化的β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)编码序列(scoGUS；优化)

(2)一个Kozak序列(gcggccgcc)，它被放置在该scoGUS编码序列的紧接上游

(3)一个TMVΩ翻译增强子序列，它被放置在该Kozak(gtatttttacaacaattaccaacaacaacaaacaacaaacaacattacaattactatttacaattaca，SEQ IDNO:2)的紧接上游。

合成scoGUS、TMVΩ和kozak序列、连同胭脂碱合成酶(nos)终止子，并且在每个末端包括用于克隆的限制酶位点。使用PstI和SacII将TMVΩ、kozak、scoGUS基因、以及nos终止子亚克隆到pBluescript中，以产生scoGUS/pBS。合成来自玄参花叶病毒(eFMV)和花椰菜花叶病毒(e35S)的双翻译增强子序列，并且在每个末端包括用于克隆的限制酶位点。

如下产生构建体SC11由聚泛素翻译起始位点直接上游的1993bp的序列组成并且包括5’未翻译区(UTR)中的1010bp内含子的玉米泛素启动子(ZmUbi)使用PCR扩增(在5’末端添加一个HindIII位点并且在3’末端添加一个PstI位点)、克隆到pGEM-T中，并且对序列进行检验。随后使用HindIII和PstI将ZmUbi亚克隆到scoGUS/pBS中，以产生ZmUbi-scoGUS质粒。使用HindIII和AscI将ZmUbi-scoGUS和nos序列亚克隆到二元构建体UbinptIINos(S)中，以产生构建体SC11。

如下产生构建体SC24由PepC翻译起始位点直接上游的2423bp的序列、第一外显子、第一内含子、以及20bp的第二外显子组成的玉米磷酸烯醇丙酮酸羧化酶启动子(ZmPEPC)使用PCR扩增(在5’末端添加一个HindIII位点并且在3’末端添加一个PstI位点)、克隆到pGEM-T中，并且对序列进行检验。随后使用HindIII和PstI将ZmPEPC亚克隆到scoGUS/pBS中，以产生ZmPEPC-scoGUS质粒。使用HindIII和AscI将ZmPEPC-scoGUS和nos序列亚克隆到二元构建体UbinptIINos(S)中，以产生构建体SC24。

如下产生构建体SC25使用HindIII和SwaI将双翻译增强子(eFMVe35S)亚克隆到ZmPEPC-scoGUS质粒中，以产生eFMVe35S-ZmPEPC-scoGUS质粒。使用HindIII和AscI将eFMVe35S-ZmPEPC-scoGUS和nos序列亚克隆到二元构建体UbinptIINos(S)中，以产生构建体SC25。

如下产生构建体SC27使用HindIII和SwaI将双翻译增强子(eFMVe35S)亚克隆到ZmUbi-scoGUS质粒中，以产生eFMVe35S-ZmUbi-scoGUS质粒。使用HindIII和AscI将eFMVe35S-ZmUbi-scoGUS和nos序列亚克隆到二元构建体UbinptIINos(S)中，以产生构建体SC27。

如下产生构建体SC28将玉米泛素内含子(1010bp)连同40bp的5’侧翼外显子序列(iUbi)一起剪切作为BglII和BamHI片段并且克隆到质粒pCMP-PMI/pBS(含有397bp夜香树属病毒启动子序列pCMP)的BamHI位点中，以产生pCMP-iUbi-PMI/pBS。通过PCR从pCMP-iUbi-PMI/pBS克隆pCMP-iUbi序列(在5’末端添加HindIII和SwaI的限制酶位点并且在3’末端添加一个PstI位点)使用HindII和PstI将pCMP-iUbi序列亚克隆到scoGUS/pBS中。使用HindIII和AscI将pCMP-iUbi-scoGUS和nos序列亚克隆到二元构建体UbinptIINos(S)中，以产生构建体SC28。

如下产生构建体SC29使用HindIII和SwaI将双翻译增强子(eFMVe35S)亚克隆到pCMP-iUbi-scoGUS质粒中，以产生eFMVe35S-pCMP-iUbi-scoGUS质粒。使用HindIII和AscI将eFMVe35S-pCMP-iUbi-scoGUS和nos序列亚克隆到二元构建体UbinptIINos(S)中，以产生构建体SC29。

构建体的清单提供于表1。

表1.优化的启动子-GUS构建体的清单

构建体ID	构建体
		SC11	ZmUbi-scoGUS
SC24	ZmPEPC-scoGUS
		SC25	eFMVe35S-ZmPEPC-scoGUS
SC27	eFMVe35S-ZmUbi-scoGUS
		SC28	pCMP-ZmiUbi-scoGUS
SC29	eFMVe35S-pCMP-ZmiUbi-scoGUS

实例2.甘蔗的农杆菌介导的转化

使用标准热休克转化法将这些二元构建体转移到农杆菌菌株AGL1中。使用以下方法将含有这些二元构建体中的每一个的农杆菌用于转化甘蔗。

植物来源和材料：收集来自大田生长的甘蔗植物的叶轮材料并且在EM3培养基(参见下文)上开始。从分生组织正上方取厚度在1-3mm之间的未成熟叶轮的横切面(约20个)并且以顶端向上(top-up)的取向放置。在黑暗中，在25℃下维持培养28至42天。在最后一次传代培养的4-10天内将愈伤用于转化。根据形态特征(如致密结构(compact structure)和黄色)对愈伤进行选择。尽可能选择黄色的胚胎发生的愈伤，因为它们提供良好的再生、一致的转化以及小丛的片段化(2-4mm)。

转染和共培养：通过添加50ml预热的1/2强度MS培养基(无蔗糖)并且然后将该愈伤在45℃保持在水浴中来对愈伤组织进行热休克，在45℃持续5分钟。然后将MS培养基从该愈伤组织中排出，并且向每个容器中添加25ml的农杆菌接种悬浮液并且轻轻地混合。通过将该愈伤/农杆菌混合物放置在一个真空室中在-27.5mmHg下持续10分钟对其进行真空渗透。然后将该愈伤/农杆菌混合物在黑暗中静置5-10分钟。

然后将该农杆菌接种悬浮液从该愈伤中排出，并且将剩余的愈伤培养物吸干以去除过量的农杆菌接种悬浮液。将植物组织在滤纸(如瓦特曼(Whatman)1级纸)上吸干，直到基本上去除农杆菌接种悬浮液。然后为了共培养，将该愈伤转移至90x25-mm皮氏培养皿(不含共培养培养基或含有干滤纸或用无菌水润湿的滤纸)中，并且用MICROPORE^TM带(3M公司；明尼苏达州明尼阿波利斯市(Minneapolis,MN))或类似材料进行密封。将这些培养皿在黑暗中在22℃下孵育2-3天。

后-转化共培养后，将该愈伤组织转移到含有200mg/L的特美汀(“休眠”培养基)的MS1培养基(参见下文)中并且在黑暗中在25℃下持续4天。在含有50mg/L遗传霉素和200mg/L特美汀的MS2培养基(参见下文)中、在黑暗中，在25℃下持续14-15天，进行第一选择步骤。

再生和生根：在补充有50mg/L遗传霉素和200mg/L特美汀的MS3培养基(参见下文)上、在25℃下、在16小时光照下进行再生。需要逐渐增加光强度。对于第一周，将该培养物留在实验室工作台上(在正常室内光照下)，并且对于接下来的3周，将该培养物在中等光强度下生长。在2-4周之间见到芽形成。在第一叶片出现时，将这些芽转移到MS4培养基(参见下文)，直到这些植物长至4-5cm高。

将转化的植物从组织培养物中初始移出并且放置在含有土壤的幼苗托盘中并且在生长室中孵育。在大约六至八周龄，将这些植物移到30cm的盆中直到成熟。

培养基：上文提及的培养基中的组分如下。

EM3：MS盐和维生素；0.5g/L酪蛋白水解物；100ml/L椰子水；20g/L蔗糖以及3mg/l2,4-D、用7g/L琼脂固化。

基本LB：10g/L NaCl；5g/L酵母提取物；以及10g/L胰蛋白胨。

LB固体：具有15g/L琼脂的基本LB。

基本MS：MS培养基盐以及维生素，连同25g/L蔗糖。

MS1：补充有0.25g/L酪蛋白水解物、40ml椰子水、3.0mg/L2,4-D以及200mg/L特美汀、用7g/L琼脂固化的基本MS。

MS2：补充有0.25g/L酪蛋白水解物、40ml的椰子水、3.0mg/L2,4-D，50mg/L遗传霉素以及200mg/L特美汀、用7g/L琼脂固化的基本MS。

MS3：补充有40ml椰子水以及0.5mg/L CuSO₄、1.0-2.0mg/L BAP(栽培品种依赖性，因此并非所有栽培品种都需要)以及50mg/L遗传霉素和200mg/L特美汀、用7g/L琼脂固化的基本MS。

MS4：补充有1.0g/L活性炭以及1.0mg IBA(吲哚-3-丁酸，并非所有栽培品种都需要)以及50mg/L遗传霉素、用7g/L琼脂固化的基本MS。

实例3.转基因甘蔗植物的特征化

使用分析，针对nptII和scoGUS基因的存在对植物进行筛选。仅选择被测定含有1个或2个拷贝的转基因构建体的植物用于进一步分析。

用于GUS表达的定量分析的甘蔗组织样品从叶(6月龄植物的第一展开叶或11月龄植物的甘蔗分蘖的第一展开叶)或茎(在12月时)获得。基因表达模式和代谢活性沿甘蔗茎的长度而变化，其中较嫩节间投入与生长和发育相关的过程，并且植物底部的成熟节间主要集中在蔗糖存储上(卡苏(Casu)等人，植物分子生物学52:371-386(2003)；卡苏等人，植物分子生物学，54:503-517(2004)；卡苏等人，功能和整合基因学(Funct.Int.Genomics)7:153-167(2007))。因此，为了充分理解转基因启动子对于甘蔗生物技术的价值，在存在于成熟植物的茎内的不同发育阶段上对启动子活性进行评价。为此，样品取自节间3和4(未成熟)、节间8(正在成熟)、以及节间20(成熟)处的甘蔗茎。

采取等于大约四个标准的穿孔的叶样品并且将其放置到保持在冰上的96孔样品块的一个孔中。从相同叶对每株植物进行取样，一式两份。随后将样品冰冻于-80℃并且在分析前冻干。采取茎样品、放置在冰上，并且随后冰冻于-80℃。使用一个标准咖啡磨或类似装置将冰冻的茎研磨成粉末并且冻干。大约40mg冻干的、粉末状茎组织被放置到96孔样品块的一个孔中。一式两份对每个样品进行分析。随后通过ELISA对叶和茎中的GUS表达进行定量。

对于GUS ELISA，将高度结合的96孔板(Nunc)在4℃下用25mM硼酸盐、75mM NaCl(pH8.5(100μl/孔))中的2μg/ml兔抗-GUS IgG(西格玛公司(Sigma)G5545)涂布过夜。用10mM Tris(pH8.0)将板洗涤三次，该Tris中含有0.05％的吐温-20和0.2％的NaN₃。向该板中添加样品或标准品(GUS型VII-A，西格玛公司G7646)(100μl/孔)，震荡下室温孵育1hr，并且洗涤五次。然后向该板中添加100μl/孔的2μg/ml辣根过氧化物酶(HRP)-标记的兔抗-GUS IgG(与HRP缀合的Invitrogen(英杰公司)A5790)，震荡下室温孵育1hr，并且如以前进行洗涤。通过添加100μl/孔四甲基联苯胺(TMB，西格玛公司T0440)并在室温显色30分钟，检测HRP缀合的抗体。通过添加100μl/孔的0.1N HCl，终止反应。使用微量平板读数仪(帝肯(Tecan)Sunrise,北卡罗来纳州三角研究园(Research Triangle Park,NC))以620作为参比，在450nm下测量吸光度。GUS标准曲线使用4参数曲线拟合。将曲线相对于对数而线性作图，范围从0至320ng/ml。

此外，为了评价在T0植物中实现的转基因表达水平在根蘖中是否被维持，对于每个构建体，选择六个植物用于进一步分析。在成熟时(转移至土壤后大约12个月)，在底部将主茎和这些植物的任何相关联的分蘖切断，并且在大约五个月之后对所得再生植物进行分析(此时它们在大小上大致相当于六月龄的T0植物)。在被选择用于再生的42株植物中，28株植物成功地再生，对于构建体中的每一个，由两株至五株之间的植物组成。

实例4.转化的甘蔗植物中的Gus表达

对于这些构建体中的每一个，六月龄甘蔗植物的第一展开叶中β-葡萄糖醛酸酶(GUS)的表达在图1中示出。与对于缺乏双增强子的相同构建体所观察到的GUS的表达水平相比，具有与启动子操作性相关联的双增强子eFMVe35S(SEQ ID NO:1)的构建体显示出显著增强的GUS表达。因此，具有双增强子和玉米磷酸烯醇丙酮酸羧化酶启动子(PEPC)的构建体SC27与仅具有PEPC启动子的构建体SC24相比，显示出超过6倍的蛋白质产生的增强。玉米泛素启动子(ZmUbi)的结果(SC11相对于SC27)显示出超过7倍的蛋白质产生的增强。

甘蔗分蘖的第一展开叶(图2)和分蘖的茎(图3)中的GUS表达显示出与上述六月龄甘蔗植物的第一展开叶的结果(图1)类似的结果。较老植物(无论茎(图2)还是叶(图3))中的总蛋白质产生水平总体上较高，而具有有增强子的构建体的植物相对于没有增强子的那些的蛋白质产生的相对水平显著较高。

双增强子(eFMVe35S，SEQ ID NO:1)增强GUS表达的另外证据在图4A-4B中提供。确切地说，图4A示出使用有和没有增强子eFMVe35S的玉米泛素启动子(ZmUbi)的甘蔗茎(未成熟(节间3和4)、正在成熟(节间8)、以及成熟(节间20))中的GUS表达。当该增强子操作性地连接到该ZmUbi启动子上时，观察到超过7倍的增强。叶中的表达在图4B中示出，其中具有连接到玉米泛素启动子上的增强子的构建体与仅具有该启动子的表达相比显示出8倍以上的表达的增加。

类似于图4，图5示出含有不同启动子-scoGUS构建体中的每一个的转基因甘蔗的茎中GUS表达的增强。样品取自转移至土壤后12个月时的植物的未成熟(节间3和4)、正在成熟(节间8)以及成熟(节间20)茎区。有趣的是，为叶优选启动子的Zm-PEPC启动子在与双增强子(eFMVe35S，SEQ ID NO:1)操作性地相关联时显示出表达。因此，该双增强子似乎改变了Zm-PEPC启动子的叶优选表达，从而导致类似于没有增强子的玉米泛素启动子的表达水平。

还检查了根蘖中的转基因表达并且结果在图6中示出。每个再生植物(T0R1)中的GUS表达高于在T0世代中观察到的表达，从而导致这些构建体中的每一个的平均表达的显著增加。含有Enh-CMP-Zm-iUbi1构建体的转基因T0R1植物显示出最高的GUS表达水平(图5；平均表达＝15.5ug/mg蛋白质)。此外，这些Enh-CMP-Zm-iUbi1事件中的一个还具有最高总表达水平(24.5ug/mg蛋白质)，其中GUS水平达到总可溶性叶蛋白的大约2.5％。

Claims (14)

1.一种包含一种重组核酸分子的甘蔗植物细胞，该重组核酸分子包含一个感兴趣的核苷酸序列、一个启动子以及SEQ ID NO:1的核苷酸序列，其中该启动子在SEQ ID NO:1的核苷酸序列的下游并与其操作性相关联并且在该感兴趣的核苷酸序列的上游并与其操作性相关联，并且该感兴趣的核苷酸序列以一个水平表达，该水平比一种对照中的所述感兴趣的核苷酸序列的表达水平高至少约6倍，进一步地其中该启动子是一个玉米聚泛素-1启动子和/或一个玉米PepC启动子。

2.如权利要求1所述的甘蔗植物细胞，其中该重组核酸分子进一步包含一个Kozak序列。

3.一种甘蔗植物或甘蔗植物部分，包含如权利要求1或权利要求2所述的植物细胞。

4.一种产物，该产物收获自如权利要求3所述的甘蔗植物或甘蔗植物部分。

5.一种加工产物，该加工产物是由如权利要求4所述的收获产物生产的。

6.一种作物，包括在农场中栽植在一起的多个如权利要求3所述的甘蔗植物。

7.一种增加甘蔗植物细胞中一种感兴趣的核苷酸序列的表达的方法，该方法包括：

向该甘蔗植物细胞中引入一种重组核酸分子，该重组核酸分子包含一个感兴趣的核苷酸序列、一个启动子以及SEQ ID NO:1的核苷酸序列，其中在该感兴趣的核苷酸序列被表达的条件下，该启动子在SEQ ID NO:1的核苷酸序列的下游并与其操作性相关联并且在该感兴趣的核苷酸序列的上游并与其操作性相关联，进一步地其中该启动子是一个玉米聚泛素-1启动子和/或一个玉米PepC启动子，从而将该感兴趣的核苷酸序列的表达水平增加至比一种对照中所述感兴趣的核苷酸序列的表达水平高至少约6倍。

8.如权利要求7所述的方法，其中该重组核酸分子进一步包含一个Kozak序列。

9.如权利要求6至8中任一项所述的方法，进一步包括从该植物细胞再生一个植物。

10.一种甘蔗植物细胞，该甘蔗植物细胞是通过如权利要求6或权利要求7所述的方法产生的。

11.一种甘蔗植物，该甘蔗植物是通过如权利要求9所述的方法产生的。

12.一种产物，该产物收获自如权利要求11所述的植物。

13.一种加工产物，该加工产物是由如权利要求12所述的收获产物生产的。

14.一种作物，包括在农场中栽植在一起的多个如权利要求11所述的甘蔗植物。