CN102307998A - 甘蔗的转化 - Google Patents

Abstract

在此提供了转化甘蔗的方法。这些方法包括利用甘蔗幼苗作为用于转化的植物材料来源。切下部分甘蔗幼苗并且通过任何合适的转化方法转化。在一些实施方案中，在转化前在胚性培养物诱导培养基中培养这些部分。可以经由土壤杆菌介导的基因递送、基因枪转化、以及类似方法进行转化。从在利于转化细胞生长并且同时抑制未转化细胞生长的条件下生长的小植株中再生转基因植物。

Description

甘蔗的转化

发明领域

本发明涉及植物分子生物学，特别是用于转化甘蔗的方法和组合物。

发明背景

甘蔗(Saccharum spp.)是生长在从热带到亚热带的世界不同地区的一种高度多倍体的植物，并且占世界糖产量的约60％。在很多发展中/发达国家，它还是重要的经济作物，具有高的贸易价值。近年来甘蔗的重要性已经增加，因为甘蔗是一种用于制糖工业和联合工业生产乙醇、乙酸、丁醇、纸、合板、工业用酶以及动物饲料的重要原料。考虑到它在农业产业中重要性，正做出一致努力使用生物技术方法用于对它的改进。

作为将有用的和改进的性状导入许多对于作物综合管理和生物燃料应用而言具有经济相关性的栽培变种的一种方式，甘蔗转化的重要性正在增加。将通过基因工程改进的一些主要性状是：对于病毒、昆虫、以及真菌攻击的耐受性、除草剂抗性、纤维质量的改进以及甘蔗植物作为生物反应器的用途。

多年以来，用于甘蔗的稳定转化的可繁殖的方法的缺乏对其基因操作一直是一个重要障碍。1992年，Bower和Birch成功从通过粒子轰击转化的细胞悬液和胚性愈伤组织恢复了转基因甘蔗植物(Bower R和Birch RG ThePlant J.2(3)：409-416(1992))。同时，Arencibia et al Biotecnologia Aplicada 9，156-65(1992)开发了一种通过电穿孔分生组织用于甘蔗的稳定转化的过程。后来，由同一小组(Arencibia et al.Plant Cell Reports 14，305-9.1995)建立了通过完整细胞电穿孔来产生转基因甘蔗植物的一种方法。已经报道了包含bar基因并且通过基因枪转化的衍生自商业品种NCo 310的抗除草剂植物的开发(Gallo-Meagher和Irvine Crop Sci 36：1367-1374(1996))。

发明概述

提供了转化甘蔗的方法。这些方法包括利用甘蔗幼苗作为用于转化的植物材料来源。切下甘蔗幼苗节段/部分(segments)并且通过任何合适的转化方法进行转化。在一些实施方案中，在转化前，在胚性培养物诱导培养基中培养这些节段。可以用土壤杆菌介导的基因递送、基因枪转化、以及类似方法进行转化。从在利于转化细胞生长并且同时基本上抑制非转化细胞生长的条件下生长的小植株中再生转基因植物。

使用甘蔗幼苗用于转化提供了胜过现有方法的显著优势，其中可以被导入的植物经过一个重要的时间段产生了大量幼苗，在实验室和转化方案中，这些幼苗是一种用于转化靶材料的理想来源，为了获得用于转化的幼苗，不需要牺牲植物也不需要牺牲其实质部分。此外，这些幼苗可以从在年龄上非常小的甘蔗植物进行收集。

在序列表中序列的简要说明

概述

已经报道了使用粒子和土壤杆菌介导的基因递送方法二者进行的成功的甘蔗再生和转化。用作转化目标的外植体是衍生自来自6-9个月大的老田或温室生长的植物的顶部的幼叶基或甘蔗植物的幼花的初级胚性培养物。来自这些顶部的侧芽或枝条分生组织还被用作转化目标。据报道，使用通过胚性培养物的土壤杆菌介导的转化，甘蔗的转化效率高达35％(Manickavasagam，M等，Plant Cell Rep.23：134-143；2004.)。

本发明提供了一种用于在非常短的时间内恢复具有潜在的高转化频率的转基因甘蔗植物的可替代的转化目标。在此描述的外植体是甘蔗幼苗。出于本发明的目的，“甘蔗”将指任何甘蔗属植物或杂种。杂种植物包括由传统甜根子草(Saccharum spontaneum)与甘蔗(Saccharum officianarum)杂种材料杂交产生的那些，该甘蔗(Saccharum officianarum)杂种材料构成了目前所有的商品甘蔗和能源甘蔗种质、以及通过甘蔗与亲缘关系较近或较远的品种杂交而产生的任何其他杂种。可以与甘蔗杂交产生杂种植物或新甘蔗种类的其他种类的实例包括芒属(Miscanthus)和高粱属(Sorghum)。

“幼苗”(immature shoot)是源自甘蔗接近土壤表面的基部或根株(stool)的小于约6个月龄、小于约5个月龄、小于约4个月龄、小于约3个月龄、小于约2个月龄或小于约1个月龄的任何苗。幼苗还可以被称为一个初生苗、次生苗、或侧苗。甘蔗“节段”(setts)包括含有一个或几个芽的茎段。节段可以被种植并将萌芽初生苗(除了次生苗或幼苗以外)。

幼苗从幼小或成熟的甘蔗植物的基部生长，并且可以通过接近地面或从地面开始修剪成熟的甘蔗来诱导它们的产生，连同移除较大的幼苗以促进更多的幼苗的生长。可以在温室中大量产生定期来源的高质量幼苗，有助于用于转化过程的植物材料的非常可靠的来源。用于转化和再生转基因植物的幼苗的使用已经显著减少了对甘蔗植物生长和发育的影响。通过在它们达到成熟以前不断地移除幼苗，甘蔗植物被诱导以连续产生更多的幼苗，持续一个重要的时间长度。

从小于约24个月龄、小于约23个月龄、小于约22个月龄、小于约21个月龄、小于约20个月龄、小于约19个月龄、小于约18个月龄、小于约17个月龄、小于约16个月龄、小于约15个月龄、小于约14个月龄、小于约13个月龄、小于约12个月龄、小于约11个月龄、小于约10个月龄、小于约9个月龄、小于约8个月龄、小于约7个月龄、小于约6个月龄、小于约5个月龄、小于约4个月龄、小于约3个月龄、小于约2个月龄、或不足月1个月龄的甘蔗植物中收集幼苗。可替代地，从大于约24个月龄、大于约30个月龄、大于约36个月龄或大于42个月龄的甘蔗植物中收集幼苗。这些甘蔗植物是在温室或田野生长的植物。

在此使用的冠词“一种”和“一个”是指一个或多于一个(即，至少一个)的该冠词的合乎语法的对象。作为举例，“一种要素”(元件)是指一种或多种要素(元件)。贯穿本说明书，单词“包括”或其变体例如“包括了”或“包括”应被理解为是指包括一种所述要素、整体或步骤，或一组要素、整体或步骤，但是不排除任何其他要素、整体或步骤，或一组要素、整体或步骤。

外植体

本发明的这些方法包括用一种或多种感兴趣的核苷酸序列转化甘蔗幼苗。除非另外说明，对于在此披露的转化方法有用的幼苗是在发育期的幼苗，即其中下部节间正开始伸长。在这一时期，幼苗的年龄典型地是在约一周和六个月大之间，包括约一个月至约三个月、约一个月至约四个月、约一个月至约五个月、约两个月至约三个月、或约两个月至约四个月大。

这些幼苗被从植物上切下，并且用如在此描述的并且对于本领域的普通技术人员来说熟知的标准方法灭菌，以在人工培养基中建立无菌培养物。例如，这些幼苗可以与一种70％的乙醇溶液、或20％的漂白溶液进行接触。在给切下的幼苗灭菌以后，获得植物组织的节段、薄片或区段。术语“外植体”是指从生物体上移下的并且将其置于用于组织培养的培养基中的活组织。在一些实施方案中，该区段的厚度可以是约0.1mm、约0.2mm、约0.3mm、约0.4mm、约0.5mm、约0.6mm、约0.7mm、约0.8mm、约0.9mm、约1.0mm、约1.5mm、约2mm、约3mm、约4mm、约5mm、或约6mm。这些切下的区段可以被进一步水平切割。

位于从幼苗切下的顶端分生组织以上的这个节段可以被用作转化目标或直接培养。可替代地，该节段可以以很多方式被切碎，例如纵向切割、水平切割、或切为多个节段，以产生许多外植体，作为转化目标或用于培养的源材料。可以从幼苗组织获得该外植体，这些幼苗组织包括叶纺锤形骨针(leaf spindle)或轮生体(whorl)、茎、叶鞘、叶卷(分生区域)、节、或节间节段。在一些实施方案中，该外植体是叶鞘或叶卷区段。可以从正好位于该顶端分生组织上方高达约3cm或高达约6cm的顶端分生组织上方切下该节段。在不同的实施方案中，该外植体不是节点节段或不是节间节段。如在本发明的上下文中使用的，术语“节点节段”包括从那里一个或多个叶片可以长出的在茎中的任何连接，并且还包括在茎侧面的任何侧(侧面的)芽(如在叶腋中)。在两个节间的茎的部分被称为“节间”。在分段之前，可以从该幼苗上移除外侧的一片或两片叶子。

愈伤组织的诱导

在一些实施方案中，在足以诱导胚性培养物反应并产生胚性培养物或愈伤系的条件下培养这些切割的节段。术语“愈伤组织”是指未分化的细胞或组织的增殖团块。在不同的实施方案中，这些培养基适合用于胚性培养物诱导。术语“胚性培养物”是指未分化的并且没有显著结构的，但是具有形成进一步分化的组织(例如胚性组织)的潜力的组织或细胞，该进一步分化的组织可以产生体细胞胚或苗并且萌发成植物。

对于本领域的那些技术人员来说足以形成胚性培养物的培养条件是已知的，并且可以根据甘蔗栽培变种而变化。在以下文献中描述了用于建立和维持胚性培养物的适合培养基，例如Wang ed.Methods in Molecular BiologyVol.344，第27-235页；已公布的国际申请号WO 01/33943、美国专利号5,908,771、美国专利号6,242,257，Croy(Ed.)Plant Molecular Biology Labfax，Bios Scientific Publishers Ltd.(1993)，Jones(Ed.)Plant Transfer and ExpressionProtocols，Humana Press(1995)，以及在其中所引证的参考文献中。这些参考文献的每一篇都以其全文通过引用结合在此。将在以下的实例中提供关于培养植物细胞的额外的详细描述，包括预处理过程。

该外植体在转化之前可以培养从约0天至约90天，包括90天。在不同的实施方案中，该外植体在转化前培养约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约12天、约14天、约16天、约20天、约25天、约30天或长达90天。该培养基可以包括Murashige和Skoog(MS)营养素配方(Murashige and Skoog，1962，Physiologia Plantarum 15 473)或Gamborg培养基(Gamborg et al，1968，Exp.Cell Res 50 15 1)。优选地，该培养基包括MS配方。应当理解的是，以上提到的培养基是可商购的，如同其他的潜在有用的培养基。

该培养基进一步包括蔗糖，以及可以另外包括琼脂。因此，应当理解的是，该外植体可以在固体或液体培养基中进行培养。

该培养基的附加成分可以包括植物激素，例如细胞分裂素和/或茁长素。在不同的实施方案中，该细胞分裂素选自下组，该组由以下各项组成：激动素、TDZ、和N₆-苄基腺嘌呤(BA)。存在多种其他细胞分裂素或根据本发明可能是有用的细胞分裂素样化合物，例如玉米素、异戊烯基腺苷、以及二苯基脲。

在不同的实施方案中，该茁长素是1-萘乙酸(NAA)、或2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)。存在多种其他茁长素或根据本发明可能是有用的茁长素类化合物存在着多种其他的茁长素或根据本发明可能是有用的茁长素样化合物，例如二氯甲氧苯酸(dicamba)、吲哚-3-丁酸(IBA)、对氯苯氧乙酸(CPA)、吲哚-3-乙酸(IAA)、2，4，5-三氯苯氧乙酸、苯乙酸、落叶素(picloram)、β-萘氧乙酸、以及反式肉桂酸。

对于熟练的技术人员而言将易于明白的是，可以通过交叉测试不同浓度的茁长素和细胞分裂素来经验地确定茁长素和/或细胞分裂素的最有效的浓度。根据自其取得培养的外植体的具体的植物栽培变种，可以定制出以上二者之一或二者的最佳浓度。

按照最初的胚性培养物配方，任选地次代培养的高质量反应约1至约90天，包括90天，以使该用于转化的愈伤组织增大(bulk up)。胚性培养物是由分化到不同程度的体细胞胚和/或细胞组成的培养物。当进行诱导以进一步分化和再生时，或通过胚胎发生、或器官发生(ganogenesis)、亦或这两个过程的一些组合，可以从这些培养物中产生苗。

在本发明的一些实施方案中，随后用感兴趣的一个或多个核苷酸序列转化该胚性培养物或愈伤组织。可以以多种本领域公认的方式将在此描述的表达盒引入该胚性培养物的细胞中。术语“引入”在多核苷酸(例如，感兴趣的核苷酸构建体)的背景下是意指以这样一种方式将多核苷酸呈现在植物中，即该多核苷酸得到了到植物细胞的内部的途径。在有待引入多于一个多核苷酸时，这些多核苷酸可以作为单个核苷酸构建体的一部分、或作为分离的核苷酸构建体进行组装，并且可以位于相同的或不同的转化载体上。因此，这些多核苷酸可以在单一的转化事件中、在多个分离的转化事件中、或者例如在植物中作为育种试验计划的一部分被引入感兴趣的宿主细胞中。本发明的方法并不依赖于用于将一个或多个多核苷酸引入植物中的一种具体的方法，只要这个或这些多核苷酸得到了进入该植物的至少一个细胞的内部的途径。用于将多核苷酸引入植物中的方法在本领域中是已知的，包括但不限于：瞬时转化法、稳定转化法、以及病毒介导法。

可以从该幼苗上切下的多种不同的外植体可以或者用作直接转化的目标，或者用作以产生转化目标材料的培养源。通过粒子递送、土壤杆菌或基因递送的其他方法，可以将外植体直接靶向用于基因递送。可替代地，在靶向它们用于基因递送之前，这些外植体可以被置于体外培养若干小时、天、周或月。这个培养期可以产生也可以用作转化目标的胚性培养系或/和愈伤组织。

转化

“瞬时转化”在多核苷酸的背景下意指多核苷酸被引入植物中而并不整合到该植物的基因组中。

在被引入植物中的多核苷酸的背景下，对于“稳定引入”或“被稳定地引入”一词是指被引入的多核苷酸被稳定地结合到该植物的基因组中，并且因此用该多核苷酸稳定地转化该植物。

“稳定的转化”或“被稳定地转化”是意指被引入植物中的多核苷酸(例如，在此描述的核苷酸构建体)整合到该植物的基因组中并且能够被其子代(更具体地说是被多个连续世代的子代)遗传。

可用于植物转化的众多转化载体对于植物转化领域的普通技术人员来说是已知的，并且对本发明有用的基因可以与任何这样的载体结合使用。已经将Ti质粒载体用于外源DNA的递送以及直接DNA摄入、脂质体、电穿孔、显微注射、以及微弹。此外，可以将来自土壤杆菌属的细菌用来转化植物细胞。

对于使用根癌土壤杆菌进行的转化而言，许多载体是可供使用的。这些典型地携带至少一个T-DNA边界序列，并且包括如pBIN19的载体(Bevan，Nucl.Acids Res.(1984))。对于在土壤杆菌转化中有用的载体的构建，参见例如美国专利申请公开号2006/0260011，该申请通过引用结合在此。

不依赖于土壤杆菌的转化技术包括通过粒子轰击、原生质体摄入(例如，PEG和电穿孔)以及显微注射的转化。

在一些实施方案中，采用了土壤杆菌介导的转化方法。参见WO94/00977以及美国专利号5,591,616，这两者均通过引用结合在此。还参见Negrotto et al.，Plant Cell Reports 19：798-803(2000)，通过引用结合在此。术语“土壤杆菌”(Agrobacterium)是指能够使其移动并有选择地将T-DNA转移进入植物细胞的细菌土壤杆菌的种、亚种、或株系。例如，该土壤杆菌任选地是发根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)，但是更典型地是根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)。适合的土壤杆菌菌株包括根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)和发根土壤杆菌(Rhizobium rhizogenes(Agrobacterium rhizogenes))。同时可以使用野生型菌株，优选的是两个种的“卸甲”(“disarmed”)衍生物，其中Ti质粒的肿瘤诱导序列已经被除去。适合的根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株包括，例如EHA 101，如由Hood et al.((1986)J.Bacteriol.，168：1291-1301)所说明，LBA4404，如由Hoekema et al.((1983)Nature，303：179-80)所说明，以及58(pMP90)，如由Koncz and Schell((1986)MoI.Gen.Genet.，204：383-96)所说明。优选的发根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)菌株是15834，，如Birot et al.(Biochem，25：323-35)所说明，以及R1000。

土壤杆菌转化典型地涉及将携带感兴趣的外源DNA的二元载体转移进入适当的土壤杆菌菌株。土壤杆菌菌株的选择可以取决于由宿主土壤杆菌菌株携带的或者在共驻存的Ti质粒上或者在染色体上的vir基因互补物(Ukneset al.Plant Cell 5：159-169(1993))。将重组二元载体转移到土壤杆菌是通过一种三亲本杂交方法实现的，即使用携带该重组二元载体的大肠杆菌、一种辅助大肠杆菌的菌株，该辅助菌株携带一种质粒并且能够将该重组二元载体移动到目标土壤杆菌菌株中。可替代地，该重组二元载体可以通过DNA转化转移到土壤杆菌中(Hofgen & Willmitzer，Nucl.Acids Res.16：9877(1988))。

通过重组土壤杆菌转化甘蔗幼苗通常涉及该土壤杆菌与来自该植物的外植体的共培养，并且遵循本领域中熟知的方案。将转化的组织在存在于二元质粒T-DNA边界之间的携带有抗生素标记或选择性标记的选择性培养基上再生。

另一种对转化有用的方法涉及在植物组织和细胞中注入惰性的或生物学活性的粒子。美国专利号4,945,050、5,036,006、以及5,100,792(都是对于Sanford等人)中披露了这种技术。通常，这种方法涉及在细胞上在有效穿透该细胞的外表面并提供掺入在其内部中的条件下注入惰性的或生物学活性的粒子。当使用惰性粒子时，可以通过用含有所希望的基因的载体包被这些粒子以将该载体引入细胞中。可替代地，可以用载体围绕目标细胞使得该载体通过该粒子的激发而被带入该细胞中。也可以将生物学活性的粒子(例如，干酵母细胞、干细菌或噬菌体，各自包含被试图引入的DNA)推进到植物细胞组织中。

其他的转化技术包括使用PEG或电穿孔技术的直接基因转移进入原生质体、以及由触须介导将基因递送进入愈伤组织。可以用单一DNA种类或多种DNA种类(即，共转化)进行转化，并且这两种技术都适合用于本发明中。共转化可能具有避免完全型载体构建以及生成对于感兴趣的基因与选择性标记具有非伴性基因座的转基因植物的优点，使得能够在随后的世代中去除该选择性标记(如果这被认为是令人希望的)。然而，使用共转化的一个缺点是小于100％的频率，使用该频率分将离的DNA种类整合到基因组中(Schocher et al.Biotechnology 4：1093-1096(1986))。

用于转化的另一技术涉及直接切下的外植体或已经培养一段时间的外植体或已建立的胚性培养物的粒子轰击。这包括在基因递送之前的或者使用高蔗糖亦或使用高麦芽糖的渗透处理步骤。在轰击之前，将任何数量的目标置于具有用于诱导体细胞胚的蔗糖(Murashiga and Skoog，PhysiologiaPlantarum 15：473-497(1962))和植物激素的MS培养基上，这允许在黑暗中进行。在选好的轰击这天，从诱导培养基中移除目标，并且置于渗压剂上。添加渗压剂(即增加渗透性的补充剂)到培养物/轰击培养基可以大大增加转化率，虽然用于每一栽培变种的最佳浓度可以变化。提高的渗压剂浓度被认为保护细胞不会渗漏或破裂，并且还可以改进粒子穿透。适合的渗压剂，例如甘露醇、山梨醇和这些的混合物对于本领域的那些技术人员来说是已知的。在MS培养基中的渗压剂浓度为零至0.3M甘露醇，以及零至0.3M的山梨醇，这适合于培养物/轰击。

允许这些目标进行质壁分离2-3小时或更久，然后进行轰击。每个目标板二十个目标是典型的，尽管不是关键性的。使用标准方法使一种适当的携带基因的质粒(如pCIB3064或pSOG35)沉淀在微米大小的金颗粒上。使用约600psi至约1500psi的爆破压力，使用标准的80目网筛，例如用DuPont

氦装置射击每个目标板。在轰击之后，将这些目标放回到黑暗中恢复约24小时(仍在渗压剂上)。24小时后，从渗压剂上移开这些目标并将其放回到诱导培养基上，在再生之前它们在这里保持约1个月，培养基中具有或不具有添加的适当的选择剂。约1个月之后，将具有发育中的胚性培养物的目标外植体转移到再生培养基(MS+1mg/升NAA、5mg/升GA)上，进一步包含适当的选择剂。约1个月之后，将发育的苗转移到更大的被称为“GA7”的灭菌容器中，这些容器包含半浓度的MS、2％的蔗糖、以及相同浓度的选择剂。

选择

在用感兴趣的一个或多个核苷酸序列转化之后，该植物材料被典型地转移到包括选择剂的培养基上，该选择剂能够阻止没有接受基因(例如选择性标记)的细胞的生长，该基因的表达产物能够阻止该选择剂的作用，由此选出转化的植物细胞。术语“选择”是指一个或多个植物或植物细胞被鉴定为具有一种或多种感兴趣的特性的过程，这些特性例如是选择性标记、增强的抗虫性、增加的或减少的类胡萝卜素水平、改变的着色等。例如，选择过程可以包括将生物体置于将利于那些具有特殊基因型的生物体的生长的条件下。

选择步骤包括在选择性条件下培养暴露于感兴趣的核苷酸序列的细胞。“选择性条件”包括足以从非转化细胞中区别出转化细胞的那些条件。例如，这些条件将随着所使用的选择性标记的类型、栽培变种、以及转化方法而变化，但是通常会包括利于转化细胞的生长但是抑制非转化细胞生长的条件。在不同的实施方案中，选择性条件包括在那些条件下生长的至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更多的细胞是转基因的那些。

在某些实施方案中，在一个逐步选择过程中，例如，组织暴露于亚致死水平的选择剂持续约2-12个周，并且然后暴露于致死水平的选择剂持续约4-30个周。在本领域中许多种选择性标记是已知的，并且在这里的其他地方描述了示例性的标记。在某些实施方案中，细胞被转移到恢复培养基中，该培养基包括反选择剂(例如抗生素等)，例如在约1-15天的时期(例如在被转移到包括选择剂的培养基之前或在被转移的同时)抑制土壤杆菌细胞的生长或将其杀死，在培养一段时期后，将继续正常生长的植物细胞从已经被减缓生长或终止的细胞中分离出来。

再生

可以进一步操作在选择剂的存在下的植物组织生长用于植物再生。术语“再生”或“产生”是指包括有根的苗的植物的形成。来自不同的外植体的植物的再生在本领域是熟知的。参见例如Weissbach et al.(Eds.)，Methods for PlantMolecular Biology，Academic Press，Inc.(1988)。在本发明的某些实施方案中，再生和生长过程包括选择转化细胞和苗、使转化苗生根、并且在土壤里使小植株生长等步骤。例如，可以实现包含从叶外植体经过土壤杆菌导入的基因的植物的再生，如由Horsch et al.(1985)Science，227：1229-1231中所说明。在这一过程中，转化体是在选择剂存在的条件下生长，并且在培养基中生长，该培养基诱导转化的植物种中的苗的再生，如由Fraley et al.(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.LJ.S.A.，80：4803中所说明。在二至四个周内这一过程典型地产生了苗，并且这些转化的苗接下来被转移到适当的根诱导培养基中，该培养基包含该选择剂和一种阻止细菌生长的抗生素。典型地，转化的苗在选择剂存在的条件下生根，以形成小植株，然后这些小植株被移栽到土壤或者其他允许产生另外的根的培养基中。

然后这些转基因的小植株在土壤或土壤替代物中繁殖，以促进生长为成熟的转基因植物。从这些小植株进行转基因植物的繁殖，例如在温室条件下的珍珠岩、泥煤苔和沙子(1∶1∶1)中。

转基因表达的检测

以上条件导致具有光合作用能力的绿色小植株和植物的再生。如上所述，用于确认该基因被稳定整合进入宿主植物的基因组的测试必然取决于有待赋予给该植物的特性。例如，当该特性是除草剂抗性时，可以通过用以对对照植物(未经受转化过程的植物)来说致死的浓度的除草剂喷洒或涂抹叶片来处理正在生长的植物而实现确认。

在一个实施方案中，使用免疫方法检测类转基因表达。可以使用的免疫方法包括，但并不限于使用基于免疫的技术(例如蛋白质印迹)的竞争与非竞争测定系统、放射免疫测定、ELISA(酶联免疫测定)、多重ELISA、“夹心”免疫测定、免疫沉淀测定、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定、凝集测定、补体结合测定、免疫放射测定、荧光免疫测定、蛋白A免疫测定、以及类似方法。这些分析在本领域是常规的和已知的(参见例如Ausubel et al，eds，1994，Current Protocols in Molecular Biology，Vol.1，JohnWiley and Sons，Inc.，New York，通过引用以其全文结合在此。)。

除了免疫测定以外，可以通过评估该转基因或报告基因或二者的表达谱来测量表达。例如，可以通过Northern分析、PCR、RT-PCR、Taq Man分析、核糖核酸酶保护测定、FRET检测、监测一个或多个分子信标、与寡核苷酸芯片的杂交、与cDNA芯片的杂交、与多核苷酸芯片的杂交、与液体微阵列的杂交、与微电子芯片的杂交、cDNA测序、克隆杂交、cDNA片段指纹图谱、以及类似方法评估表达谱。所选择的具体方法将取决于例如所回收的RNA的量、技术人员的偏好、可供使用的反应物和设备、检测器等因素。

植物表达盒

本发明的这些方法包括用一种或多种感兴趣的核苷酸序列转化甘蔗。在一个实施方案中，该核苷酸序列编码一种感兴趣的多肽。这些核酸序列可能存在于DNA构建体或表达盒中。如在此所使用的“表达盒”是指能够在适当的宿主细胞中指示表达一段具体的核苷酸序列的核酸分子，包括与感兴趣的核苷酸序列可操作地连接的启动子，该感兴趣的核苷酸序列与终止信号可操作地连接。它还典型地包括用于核苷酸序列的正确翻译所需要的序列。该编码区通常对一种感兴趣的蛋白进行编码，但是还可以对一种感兴趣的功能性RNA进行编码，例如在正义或反义方向上的反义RNA或一种非翻译RNA。包含这种感兴趣的核苷酸序列的表达盒可能是嵌合的，意味着它的至少一种组分相对于它的至少一种其他组分是异源的。该表达盒也可以是天然发生的但已经是以对于异源表达有用的一种重组体形式获得的表达盒。然而，典型地，该表达盒对于宿主是异源的，即，该表达盒的特殊DNA序列并不天然发生于该宿主细胞内，并且必须已通过转化事件而被引入该宿主细胞或该宿主细胞的祖先中。在该表达盒中的核苷酸序列的表达可能处于组成型启动子或诱导型启动子的控制之下，该启动子只有在该宿主细胞暴露于一些特定的外部刺激时才引发转录。另外，该启动子对于一种特定的组织或器官或发育阶段也可以是特异性的。

该表达盒可以在5′-3′的转录方向上包括转录和翻译的起始区(即，启动子)和感兴趣的多核苷酸。该表达盒可以任选地包括在植物中起作用的转录和翻译终止区(即终止区)。在一些实施方案中，该表达盒包括一种选择性标记基因从而允许选择稳定的转化体。本发明的表达构建体还可以包括前导序列和/或允许感兴趣的多核苷酸的诱导表达的序列。对于允许诱导表达的序列的实例参见Guo et al.(2003)Plant J.34：383-92和Chen et al.(2003)Plant J.36：731-40。

该表达构建体的调节序列与感兴趣的多核苷酸可操作地连接。对于“可操作地连接”意指在启动子与第二序列之间的功能性连接，其中该启动子序列引发和介导了对应于该第二序列的DNA序列的转录。通常，可操作地连接表示被连接的核苷酸序列是邻近的。

在本发明的实践中可以使用任何能够在感兴趣的植物中驱动表达的启动子。该启动子可以是天然的或模拟的或外来的或与该宿主植物是异源的。当在此用来提及核酸序列(例如，DNA或RNA序列)或基因时，术语“异源的”和“外源的”是指源自对于特定的宿主细胞是外来的来源的、或者如果源自相同的来源是自其原始形式进行修饰的一种序列。因此，宿主细胞中的异源基因包括对于该特定宿主细胞是内源性的但是已经通过例如使用DNA改组进行修饰的一种基因。这些术语还包括一种天然发生的DNA序列的非天然发生的多份拷贝。因此，这些术语是指一种DNA节段，它对于该细胞是外来的或异源的或与该细胞是同源的但是处于该宿主细胞核酸的位置(其中通常找不到该元件)。表达了外源DNA节段以产生外源性多肽。

“同源的”核酸(如DNA)序列是与它被引入其中的宿主细胞自然地相关联的一种核酸(例如DNA或RNA)序列。

有待包括的启动子的选择取决于几个因素，包括但不限于：效率、可选择性、诱导性、所希望的表达水平、以及细胞优先表达或组织优先表达。对于本领域的技术人员而言，通过相对于该序列来适当地选择并且定位启动子以及其他的调节区而调整该序列的表达是一种惯例。

一些适当的启动子仅仅或者主要在某些细胞类型中启动转录。因此，如在此所使用的，一种细胞类型的启动子或组织优先的启动子是优选在靶组织中驱动表达、但也可以在其他细胞类型或组织中导致某种表达的启动子。用于在植物基因组DNA中鉴定并表征启动子区的方法包括例如在以下文献中所说明的那些：Jordano，et al.，Plant Cell，1：855-866(1989)；Bustos，et al..Plant Cell，1：839-854(1989)；Green，et al.，EMBO J.7，4035-4044(1988)；Meier，et al.，Plant Cell，3，309-316(1991)；and Zhang，et al.，Plant Physiology110：1069-1079(1996)。

为了驱动在绿色组织(如叶和茎)中的转录，在光合组织中活跃的启动子也是本发明所考虑的。最适合的是仅仅或主要在此类组织中驱动表达的启动子。该启动子可以组成性地赋予遍及该植物的表达(或相对于绿色组织差异性地、或相对于其中发生表达的绿色组织的发育阶段差异性地、或响应外部刺激)。

这些启动子的实例包括核酮糖-1，5二磷酸羧化酶(RbcS)启动子，例如来自美洲落叶松(Larix laricina)的RbcS启动子、松cab6启动子(Yamamotoet al.(1994)Plant Cell Physiol.35：773-778)、来自小麦的Cab-1基因启动子(Fejes et al.(1990)Plant MoI.Biol.15：921-932)、来自菠菜的CAB-I启动子(Lubberstedt et al.(1994)Plant Physiol.104：997-1006)、来自水稻的cab 1 R启动子(Luan et al.(1992)Plant Cell 4：971-981)、来自玉米的丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)启动子(Matsuoka et al.(1993)Proc Natl Acad Sci USA90：9586-9590)、烟草Lhcbl 2启动子(Cerdan et al.(1997)Plant MoI.Biol.33：245-255)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)SUC2蔗糖-H+转运体启动子(Truemit et al.(1995)Planta 196：564-570)、以及来自菠菜的类囊体膜蛋白启动子(psaD、psaF、psaE、PC、FNR、atpC、atpD、cab、rbcS)。在美国专利公开号2007/0006346中描述了在茎、叶和绿色组织中驱动转录的其他启动子，该文献通过引用以其全部内容结合在此。

Hudspeth和Grula(Plant Molec Biol 12：579-589(1989))已经描述了一种编码磷酸烯醇羧化酶(PEPC)的玉米基因。使用标准分子生物技术，用于这种基因的启动子可以用来在转基因植物中以一种绿色组织特异的方式驱动任何基因的表达。

在本发明的其他一些实施方案中，诱导型启动子可能是所希望的。诱导型启动子驱动响应于外部刺激(如化学试剂或环境刺激)的转录。例如，诱导型启动子可以响应于激素类(如赤霉酸或乙烯)、化学药品(例如乙醇)或响应于光或干旱而赋予转录。

许多种用于表达盒中的转录终止子是可获得的。这些转录终止子负责超过该转基因的转录终止以及正确的mRNA多聚腺苷酸化。该终止区可以是与该转录引发区天然在一起的、可以是与感兴趣的可操作地连接的DNA序列天然在一起的、可以是与该宿主植物天然在一起的、或者可以是源自另一种来源(即，对于该启动子、该感兴趣的DNA序列、该宿主植物、或它们的任何组合是外来的或异源的)。适当的转录终止子是已知在植物中发挥作用的那些，并且包括CAMV 35S终止子、tml终止子、胭脂碱合成酶终止子以及豌豆rbcS E9终止子。此外，可以使用一种基因的天然转录终止子。

该表达盒将包括一种选择性标记基因用于选择转化的细胞。该选择性标记基因可以在相同表达盒上作为感兴趣的模子核苷酸序列(die nucleotidesequence)，或者可以在分离的表达盒上共转化(contransformed)。在转化中常规使用的选择性标记包括赋予对卡那霉素以及相关抗生素的抗性的nptll基因(Messing and Vierra.Gene 19：259-268(1982)；Bevan et al.Nature304：184-187(1983))、赋予对除草剂草酊磷的抗性的bar基因(White et al.Nucl.Acids Res 18：1062(1990)，Spencer et al.Theor.Appl.Genet 79：625-631(1990))、赋予对抗生素潮霉素的抗性的hph基因(Blochinger and Diggelmann，MoI Cell Biol 4：2929-2931)、以及赋予对甲氨喋呤的抗性的dhfr基因(Bourouis et al.EMBO J.2(7)：1099-1104(1983))、赋予对草甘磷的抗性的EPSPS基因(美国专利号4,940,935和5,188,642)、以及赋予代谢甘露糖的能力的磷酸甘露糖异构酶基因(PMl)(美国专利号5,767,378和5,994,629)。

已经发现众多序列增强了来自转录单位之内的基因表达并且这些序列可以与本发明的基因结合使用以增加它们在转基因植物中的表达。

已经显示不同的内含子序列增强了特别是在单子叶植物的细胞中的表达。已经发现内含子1是特别有效的并且在与氯霉素乙酰转移酶基因的融合构建体中增强了表达(Callis等，Genes Develop.1：1183-1200(1987))。常规地已经将内含子序列结合到植物转化载体中，典型地在非翻译前导序列中。

还已知多种从病毒衍生的非翻译前导序列增强了表达，并且在此包括了这些序列。确切地说，已经显示来自烟草花叶病毒(TMV，“W-序列”)、玉米枯黄斑点病毒(MCMV)、以及苜蓿花叶病毒(AMV)的前导序列在增强表达方面是有效的(例如，Gallie et al.Nucl.Acids Res.15：8693-8711(1987)；Skuzeski et al.Plant Molec.Biol.15：65-79(1990))。本领域中已知的其他前导序列包括但不限于：细小核糖核酸病毒(picomavirus)前导序列，例如，EMCV前导序列(脑心肌炎5′非编码区)(Elroy-Stein，O.，Fuerst，T.R.and Moss，B.PNAS USA 86：6126-6130(1989))；马铃薯Y病毒属前导序列，例如TEV前导序列(烟草蚀纹病毒)(Allison et al.1986)；MDMV前导序列(玉米矮花叶病毒)；Virology 154：9-20；人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)前导序列(Macejak，D.G.and Samow，P.，Nature 353：90-94(1991))；来自苜蓿花叶病毒的外壳蛋白mRNA的未翻译的前导序列(AMV RNA 4)(Jobling，S.A.andGehrke，L.，Nature 325：622-625(1987))；烟草花叶病毒前导序列(TMV)(Gallie，D.R.et al.Molecular Biology of RNA，pages 237-256(1989))；以及玉米枯黄斑点病毒前导序列(MCMV)(Lommel，S.A.et al.Virology81：382-385(1991))。还参见Della-Cioppa et al.，Plant Physiology 84：965-968(1987)。

已知在植物中存在着用于靶向基因产物的不同机制，并且控制这些机制的功能的序列已经在一些细节上被表征。例如，基因产物靶向到叶绿体是通过在不同蛋白的氨基末端发现的信号序列进行控制的，该氨基末端在叶绿体输入期间被切割以产生成熟的蛋白(例如Comai et al.J.Biol.Chem.263：15104-15109(1988))。这些信号序列可以与异源基因产物融合以影响异源产物被输入到叶绿体中(van den Broeck et al.Nature 313：358-363(1985))。用于编码适当的信号序列的DNA可以从编码RUBISCO蛋白、CAB蛋白、EPSP合成酶、GS2蛋白以及许多其他的已知位于叶绿体上的蛋白的cDNA的5′端分离。还参见在美国专利号5,639,949的实例37中的标题为“Expression WithChloroplast Targeting”的部分。

用于细胞靶向的上述机制不仅可以与它们的同源启动子联合使用，还可以与异源启动子联合使用，从而在启动子的转录调节下影响特定的细胞靶向目标，该启动子具有不同于自其衍生靶向信号的启动子的表达谱。

为了确保在质体中的定位，可以想到使用如下的转运肽：属于质体铁氧化还原蛋白的：菠菜的NADP+氧化还原酶(FNR)，包含在Jansen et al.(CurrentGenetics 13(1988)，517-522)中。特别是，可以使用在其中披露的cDNA序列的范围从-171至165的核苷酸的序列，它包括5′非翻译区连同编码转运肽的序列。另一个实例是玉米糯蛋白的转运肽，包括成熟玉米糯蛋白的前34个氨基酸残基(Klosgen等，MoI.Gen.Genet.217(1989)，155-161)。还可能使用没有成熟蛋白的前34个氨基酸的转运肽。此外，可以使用核酮糖二磷酸羧化酶小亚基的信号肽(Wolter et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85(1988)，846-850；Nawrath et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91(1994)，12760-12764)、NADP苹果酸脱氢酶的信号肽(Galiardo et al.，Planta 197(1995)，324-332)、谷胱甘肽还原酶的信号肽(Creissen et al.，Plant J.8(1995)，167-175)或R1蛋白的信号肽(Lorberth et al.，(Nature Biotechnology 16，(1998)，473-477)。

感兴趣的多肽

适合在甘蔗中表达的感兴趣的多肽包括导致农艺学上重要的性状的那些，这些性状例如是除草剂抗性、病毒抗性、细菌性病原体抗性、昆虫抗性、线虫抗性、以及真菌抗性。参见例如美国专利号5,569,823、5,304,730、5,495,071、6,329,504、以及6,337,431。感兴趣的多肽还可以是导致植物活力或产量增加的多肽(包括允许植物在不同的温度、土壤条件以及日光和沉淀水平下生长的多肽)，或是允许鉴定展现感兴趣的性状(例如，选择性标记基因、视觉表型变异等)的植物的多肽。

在一些实施方案中，转化的甘蔗展现出对除草剂的抗性。赋予除草剂抗性的许多基因是可获得的，包括转基因的和非转基因的二者。除草剂抗性还有时被称为除草剂耐受性。赋予对抑制生长点或分生组织的除草剂(例如咪唑啉酮或磺酰脲)的抗性的基因可以是合适的。对于突变ALS和AHAS酶在这一分类号中的示例性基因如描述在例如在美国专利号5,767,366和5,928,937中。美国专利号4,761,373和5,013,659是针对抗不同的咪唑啉酮或磺酰脲除草剂的植物。美国专利号4,975,374涉及包含编码抵抗除草剂的抑制作用的谷氨酰胺合成酶(GS)突变体的基因的植物细胞以及植物，已知这些除草剂(例如草胺膦和蛋氨酸亚砜亚胺)抑制GS。美国专利号5,162,602披露了抵抗环己二酮和芳氧苯氧丙酸除草剂的抑制作用的植物。该抗性是由改变的乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)赋予的。

抗草甘膦的基因也是适合的。参见例如美国专利号4,940,835和美国专利号4,769,061。美国专利号5,554,798披露了转基因抗草甘磷玉米植物，它的抗性是由改变的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸(EPSP)合成酶基因赋予的。

抵抗磷酰基化合物(例如草铵膦或草胺膦、以及吡啶氧丙酸或苯氧丙酸以及环己酮)的基因也是适合的。参见欧洲申请号0 242 246。还参见美国专利号5,879,903、5,276,268和5,561,236。

其他合适的除草剂包括抑制光合作用的那些，例如三嗪和苯基氰(腈水解酶)。参见美国专利号4,810,648。其他适合的除草剂包括2，2-二氯丙酸、稀禾定、吡氟氯禾灵、咪唑啉酮除草剂、磺酰脲除草剂、三唑嘧啶除草剂、均三嗪除草剂以及溴草腈。同样适合的是赋予对原卟啉原氧化酶的抗性或者提供增强的对植物疾病的抗性、增强的对不利环境条件(非生物胁迫)的耐受性(这些条件包括但不限于干旱、极冷、极热、或极端的土壤盐度或极端的酸度或碱度)、以及在植物构型或发育中的改变(包括发育时间方面的变化)的基因。参见例如美国专利申请号20010016956、以及美国专利号6,084,155。

对本发明有用的杀虫蛋白可以按足以控制昆虫害虫的量(即昆虫控制量)进行表达。应当理解的是，在植物中对控制昆虫必要的杀虫蛋白的表达量可以变化，这取决于甘蔗栽培变种、昆虫的类型、环境因素等。对于昆虫抗性或害虫抗性有用的基因包括，例如编码在杆菌生物体中已鉴定的毒素的基因。已经克隆了编码来自几个亚种的苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis，Bt)毒素的基因，并且已经发现这些重组克隆对鳞翅类、双翅类和鞘翅类昆虫幼虫是有毒的(例如不同的δ-内毒素基因例如Cry I Aa、Cry IAb、Cry I Ac、Cry I B、Dy 1 C、Cry ID、Cry I Ea、Cry I Fa、Cry3A、Cry9A、Cry9C以及Cry9B；连同编码植物杀虫蛋白例如Vip1、Vip2和Vip3的基因)。可以在世界范围的网页at.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/找到Bt毒素的完整清单。

感兴趣的多肽还可以有用于控制许多种害虫，这些害虫包括，但并不局限于甘蔗黑穗病菌(Ustilago scitaminea)、甘蔗花叶病毒(sugar cane mosaicvirus)、非洲茎螟(Eldana saccharina)、小蔗螟(Diatraea saccharalis)、高粱花叶病毒(sorghum mosaic virus)、等。

适合于在甘蔗中表达的的感兴趣的多肽进一步包括改进或通过其他方式有助于所收获的甘蔗转化成为一种商业上有用的产品(包括例如增加的或改变的碳水化合物含量和/或分布、改进的发酵特性、增加的油含量、增加的蛋白含量、提高的可消化度、以及增加的营养成分含量(例如，增加的植物甾醇含量、增加的生育酚含量、增加的甾烷醇含量或增加的维生素含量))的那些多肽。感兴趣的多肽还包括，例如在一种收获的作物中导致或促成不需要的成分，例如植酸(phytic acid)、大豆胰蛋白酶抑制剂、或淀粉降解酶类的含量降低的那些多肽(取决于下游的用途)。“导致”或“促成”意指这种感兴趣的多肽可以直接地或间接地促成一种感兴趣的性状的存在(例如，通过异源表达一种淀粉降解酶来增加纤维素的降解)。

在一个实施方案中，感兴趣的多肽促成了改进的食品或饲料的可消化度。木聚糖酶是半纤维素分解酶，这些酶改进了植物细胞壁的分解，这导致动物更好地利用这些植物营养素。这导致了改进的生长率和饲料转化。同样，可以减小包含木聚糖的饲料的粘度。

已经鉴定和表征了很多来自真菌和细菌微生物的木聚糖酶。(参见例如美国专利号5,437,992；Coughlin，M.P.；Biely，et al.，Espoo 1993；Souminen andT.Reinikainen eds.，Foundation for Biotechnical and Industrial FermentationResearch 8：125-135(1993)；美国专利申请公开号2005/0208178；以及WO03/16654)。特别地，在里氏木霉(T.reesei)中已经鉴定出三个特异性的木聚糖酶(XYL-I、XYL-II、以及XYL-III)(Tenkanen et al.，Enzyme Microb.Technol.14：566(1992)；Torronen et al.，Bio/Technology 10：1461(1992)；以及Xu，et al.，Appl.Microbiol.Biotechnol.49：718(1998))。

在另一个实施方案中，该感兴趣的多肽是一种多糖降解酶。此类植物可以用于产生例如用于生物加工的发酵原料。在一些实施方案中，对于发酵工艺有用的酶类包括α淀粉酶类、蛋白酶类、支链淀粉酶类、异淀粉酶类、纤维素酶类、半纤维素酶类、木聚糖酶类、环糊精糖基转移酶类(glycotransferases)、脂肪酶类、植酸酶类、漆酶类、氧化酶类、酯酶类、角质酶类(cutinases)、颗粒淀粉水解酶类和其他葡糖淀粉酶类。

多糖降解酶包括：淀粉降解酶类，例如，α-淀粉酶类(EC 3.2.1.1)、葡萄糖醛酸酶类(E.C.3.2.1.131)；外切-1，4-α-D葡聚糖酶类，例如淀粉糖化酶类以及葡糖淀粉酶(EC 3.2.1.3)、β-淀粉酶类(EC 3.2.1.2)、α-糖苷酶类(EC3.2.1.20)、以及其他的外切淀粉酶类；以及淀粉脱支酶类，例如a)异淀粉酶(EC 3.2.1.68)、支链淀粉酶(EC 3.2.1.41)、以及类似物；b)纤维素酶类，例如外切-1，4-3-纤维素二糖水解酶(EC 3.2.1.91)、外切-1，3-β-D-葡聚糖酶(EC3.2.1.39)、β-糖苷酶(EC 3.2.1.21)；c)L-阿拉伯糖酶类(arabinases)，例如内切-1，5-α-L-阿拉伯糖酶(EC 3.2.1.99)、α-阿拉伯糖苷酶类(EC 3.2.1.55)以及类似物；d)半乳聚糖酶类(galactanases)，例如内切-1，4-β-D-半乳聚糖酶(EC 3.2.1.89)、内切-1，3-β-D-半乳聚糖酶(EC 3.2.1.90)、α-半乳糖苷酶(EC3.2.1.22)、β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)以及类似物；e)甘露聚糖酶类(mannanases)，例如内切-1，4-β-D-甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)、β-甘露糖苷酶(EC 3.2.1.25)、α-甘露糖苷酶(EC 3.2.1.24)以及类似物；f)木聚糖酶类，例如内-1，4-β-木聚糖酶(EC 3.2.1.8)、β-D-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)、1，3-β-D-木聚糖酶、以及类似物；g)其他酶类，例如α-L-岩藻糖苷酶(EC 3.2.1.51)、α-L-鼠李糖苷酶(EC 3.2.1.40)、果聚糖酶(EC 3.2.1.65)、菊粉酶(inulanase)(EC 3.2.1.7)、以及类似物。

本发明的另一个实施方案涵盖了在所收获的植物材料中异源淀粉降解酶类(例如，葡糖淀粉酶以及淀粉酶)的表达，用于下游的用途(例如，乙醇生产)。葡糖淀粉酶类(α-1，4-葡聚糖葡萄糖水解酶类，E.C.3.2.1.3.)是淀粉水解外切糖酶类。葡糖淀粉酶类催化了连续的葡萄糖单元从淀粉或相关寡聚糖和多糖分子的非还原端去除，并且可以水解淀粉(直链淀粉和支链淀粉)的直链糖苷键和支链糖苷键二者。术语“α-淀粉酶(例如E.C.类3.2.1.1)”是指催化α-1，4-糖苷键的水解的酶。这些酶类也被描述为在含有1，4-α-连接的D-葡萄糖单元的多糖类中影响1，4-α-D-糖苷键的外水解或内水解的那些酶类。用于说明这些酶的另一术语是“糖原酶”。示例性的酶类包括α-1.4-葡聚糖4-葡聚糖水化酶葡聚糖水解酶。商业上，葡糖淀粉酶以及淀粉酶是非常重要的酶类，它们已经用于需要淀粉水解的多种多样的应用中。

其他可以使用的额外的酶类包括蛋白酶类，例如真菌和细菌蛋白酶类。真菌蛋白酶类包括例如从曲霉属、木霉属、毛霉属以及根霉属(例如黑曲霉、泡盛曲霉(A.awamori)、米曲霉、以及米黑毛霉(M.miehei))获得的那些酶类。在本发明中特别感兴趣的是纤维二糖水解酶(CBH)酶类(EC3.2.1.91)。

其他酶类包括但不限于：半纤维素酶类，例如甘露聚糖酶类以及阿拉伯呋喃糖酶类(EC 3.2.1.55)；木质酶类；脂肪酶类(例如，E.C.3.1.1.3)、葡萄糖氧化酶类、果胶酶类、木聚糖酶类、转葡萄糖苷酶类、α-1，6-糖苷酶类(例如，E.C.3.2.1.20)；酯酶类，例如阿魏酸酯酶(EC 3.1.1.73)以及乙酰木聚糖酯酶类(EC 3.1.1.72)；以及角质酶类(例如，E.C.3.1.1.74)。

还将认识到的是，可以将编码该感兴趣的多肽的核苷酸序列进行优化用于在转化的宿主细胞中增加表达。这就是说，可以使用甘蔗偏好的密码子来合成这些核苷酸序列用于改进表达，或可以按照甘蔗的偏好密码子使用频率来使用密码子进行合成。通常，这种基因的GC含量将会增加。参见例如Campbell和Gowri(1990)Plant Physiol.92：1-11关于宿主偏好密码子的使用的讨论。在本领域中用于合成植物偏好基因的多种方法是可获得的。参见例如美国专利号5,380,831和5,436,391，以及Murray et al.(1989)Nucleic Acids Res.17：477-498，通过引用结合在此。

实施例

实施例1：甘蔗幼苗的温室生产

在温室中易于生产的甘蔗幼苗作为用于实验室中的细胞培养的一种一致性高质量的、易于获得的并且较清洁的源材料。最初，在温室中将甘蔗节段植入装有适当的土壤混合物的单独的盆中。在更换土壤之前，这些植物生长12-18个月。每天灌溉植物并且在每周基础上施用液体肥料以保持养料的充足供应。在每两周的基础上，叶组织被修剪到在最高生长点上方一或两英寸的地方。为了诱导幼苗产生，一旦从该节段良好地建立了植株，将生长过大的初级苗以及任何幼苗(直径大于3/4英寸)修剪到土壤水平以诱导该植株产生更多的幼苗。控制沙子在土壤混合物中的百分比以促进幼苗产生。在土壤水平移除较大的幼苗。从幼苗上切下叶卷用作胚性培养物的目标材料或起始，这些胚性培养物随后被用作转化实验的目标材料。切下较大的幼苗还用于诱导从这些植株产生另外的幼苗。高质量幼苗的生产已经持续了一年，并且在对这些植物的适当照顾下，看起来它好像可以无限期地继续下去。

实施例2：胚性培养物的诱导

在温室中使甘蔗(甘蔗属(Saccharum)杂种，栽培变种将变化)母体植物生长。收集处在下部节间开始伸长的发育阶段的幼苗，通过或者喷洒70％乙醇，或者将其浸入20％CLOROX(R)漂白剂(每升含有3滴吐温-20)20分钟，并且用无菌自来水冲洗三次以给这些幼苗灭菌。然后，通过从刚好位于顶端分生组织上方高达2-3cm的地方切下1-2mm的横向区段而将叶卷从灭菌的幼苗上分离。在黑暗中，在28℃条件下，用含有0.75-3mg/L的2，4-D的基本MS培养基培养这些分离的叶卷持续2-3周。然后在新鲜的培养基中选择性地继代培养高质量的胚性培养物反应，以用作转化目标材料。

实施例3A：微弹轰击介导的甘蔗的转化

用于轰击的预处理说明

用于轰击的愈伤组织预处理

为了轰击转化，继代培养3-8日并在具有包含2mg/L 2，4-D的基本MS培养基的培养皿中的滤纸(Whatman #3滤纸)上临时培养过夜后，从3-6周龄的黄色致密愈伤组织中选择性地分离愈伤组织。第二天早晨，选择高质量的愈伤组织并且安排在渗透处理培养基(具有2mg/L 2，4-D+0.2M山梨醇和0.2M甘露醇或具有2mg/L 2，4-D+0.25M山梨醇的基本MS培养基)上约2cm半径的中心环内，用于在轰击之前进行4小时的预处理。

用于轰击的叶卷预处理

在愈伤组织诱导培养基(基本MS培养基+2mg/L 2，4-D)上预培养1、3、5、并且直到30天的叶卷被用于轰击。在轰击之前，将叶卷安排在渗透处理培养基(具有2mg/L 2，4-D+0.2M山梨醇和0.2M甘露醇的基本MS培养基)上约2cm半径的中心环内维持4小时。

颗粒洗涤和DNA包被

颗粒洗涤

称取60mg的0.3-1.0微米的金颗粒，并且通过声处理10秒将其悬浮在1ml的200酒精强度的乙醇中，并且小心地移除上清夜。用1ml的无菌水洗涤沉淀物两次，并且在50％无菌甘油中重新悬浮。均匀等分50微升的金-甘油浆，放入微量离心管，并在-20℃下储存这些颗粒。

DNA的包被

将1-5微升的DNA(浓度125-150ng/每枪)加入到50μl的金颗粒-甘油浆管中。在涡旋振动混合时，依次加入20微升的甘油、50μl的2.5M的CaCl2.2H2O、以及20微升的0.1-1M的亚精胺。保持涡旋振动混合3分钟并且在高速条件下(13,000rpm)旋转减速10秒。移除上清液并且通过涡旋振动混合2-3秒，并且用250微升的200酒精强度的乙醇进行洗涤。旋转减速并且移除上清液，并且最后悬浮在80微升的200酒精强度的乙醇中。

轰击

PDS-1000 Biolistc颗粒递送系统的设定：通过喷洒100％的乙醇对PDS氦-1000基因枪内部进行灭菌。用100％的乙醇对微载体支架和红盖塞进行灭菌，并且在灭菌的Petri盘上干燥。在Petri盘中用100％的乙醇对微载体进行灭菌，干燥，然后使用红盖塞将它们安装到微载体支架上。在Petri盘中用100％的乙醇对200 X 200的阻挡屏进行灭菌并干燥。在Petri盘中用100％的乙醇对破裂盘进行灭菌并干燥。Biolistic装置的设定如下：固定包含1100-1350psi，优选1100psi的破裂盘支架，破裂盘位于气体加速管的末端。设定破裂盘和微载体之间的距离为8mm，微载体和阻挡屏之间的距离为10mm，以及阻挡屏和目标之间的距离为7cm。设定氦气罐的压力至少比破裂盘高100psi。

为了轰击，将100ng至1μg的完整质粒DNA(消化的或未消化的)加载到每一颗粒管(3mg的金)中。每管等分为6次射击。

对于每一盘处理的愈伤组织进行两次射击。在渗透培养基中保存这些受轰击的愈伤组织1小时，并且然后转移到愈伤组织恢复培养基上或保留在渗透培养基上过夜后转移到恢复培养基(具有2mg/L2，4-D的MS基本培养基)上。

恢复和选择培养

将受轰击的愈伤组织置于恢复培养基上5-7天，进而转移到PMI选择培养基上，这些培养基分别含有20、15、10、和5g/L的蔗糖和3g/L、4g/L、5g/L、6g/L和7g/L的甘露糖。在相同选择水平(PMI)继代培养这些愈伤组织2-3周。所有培养都保持在黑暗中在28℃下。

从推定的转基因事件进行植物再生。

基于来自甘蔗的植物再生实验，从PMI选择培养基上的这些培养物中仔细分离抗PMI事件，并且转移到植物再生培养基(添加有2mg/L BAP的基本MS盐和B5维生素)上，并且保持在黑暗中2周或更多周，然后移到在28摄氏度条件下的光培养室(16/8的光-黑暗周期)中。在再生培养基中2-4周后，从这些稳定的愈伤组织事件中再生了推定的转基因植物。

实例3B：到此为止的微弹实验的结果和概要

已经进行了总计21次轰击实验(3个构建体和6个基因型)。在下表给出了结果。

不同的金颗粒大小

在甘蔗基因枪转化中使用3种金颗粒大小(见表1)。用每一颗粒大小进行三至五次实验。在2-3个月后，在一台UV显微镜下计数具有CFP荧光的稳定的愈伤组织事件。用ELISA和TaqMan分析了超过50个植物。将总计40个转基因植物(在所有植物中转基因植物的频率经分析为80％)送入温室。在表1中给出平均结果。

表1：不同的金颗粒大小对稳定的愈伤组织事件(构建体：p12672)的影响

^*通过目标盘x在轰击之后的转移盘x每盘的愈伤组织数量来评估在每一次转化中愈伤组织的数量。每一目标愈伤组织被转移到3-4个盘中，这取决于愈伤组织的大小。每盘包含16个愈伤组织。

^**ND：未测定

2.不同的基因型

在基因枪转化中检测了甘蔗的六个不同的基因型(见表2)。对于甘蔗的每一基因型，进行了一至两次转化实验。在表2中给出了平均结果。

表2：从不同的甘蔗基因型(构建体：p12672)恢复转基因植物。

^*通过目标盘x在轰击之后的转移盘x每盘的愈伤组织数量来评估在每一次转化中愈伤组织的数量。每一目标愈伤组织被转移到3-4个盘中，这取决于愈伤组织的大小。每盘包含16个愈伤组织。

实例4：在甘蔗中的土壤杆菌介导的转化

1.转化载体和土壤杆菌菌株：根癌土壤杆菌菌株(例如LB4404或EHA101)中的二元载体被用于转化。用无菌的一次性塑料接种环从在-80℃储存的瓶中取少量的土壤杆菌并置于盘上。用该环或细胞涂布器涂布土壤杆菌，以在生长培养基表面上产生薄层的细胞。在使用之前，将盘置于28℃的培养箱中约2天。使用一次性塑料接种环从该盘中收集土壤杆菌细胞，并悬浮在无菌的一次性塑料管中的液体感染培养基(例如SCInoc)中。涡旋振动该管直到土壤杆菌细胞在该悬浮液中均匀分散。在一台分光光度计中测量该细菌悬浮液的光吸收，并且稀释至A660的光吸收为0.1-0.85。添加乙酰丁香酮至最终浓度为40-80mg/L(200-400μM)以诱导毒力基因的表达。

2.胚性培养物转化目标的制备：如在实例2中的描述诱导胚性培养物。从用于转化的胚性培养系中靠视觉选择最好质量的目标片。

3.转染和共培养：用土壤杆菌立即感染制备的外植体(通过将分离的胚性培养外植体与细菌悬浮液混合)。可以将不同的预处理(例如热休克等)施用于目标组织，以使植物细胞更利于基因递送。在室温下孵育该混合物至少1分钟或直至过夜。在接种期间可以施用不同的处理以改进细菌与植物细胞间的接触，例如声处理、真空渗入等。感染之后，从土壤杆菌悬浮液中移出这些外植体，并且置于一种共培养培养基(例如具有或不具有滤纸的SCCoCult)上。在黑暗中，在20℃-28℃下孵育该共培养盘3至5天。

4.转基因植物的再生和选择：在共培养之后，胚性目标片被转移到恢复培养基中，该培养基不具有选择剂(例如SCRecov)，但具有适当的抑制土壤杆菌生长的抗生素。在黑暗中，在28℃下孵育具有这些外植体的这些恢复盘2-10天。在恢复期之后，这些外植体被转移到预再生选择培养基(例如SCM，并具有适当的抗生素)中，并且在黑暗中在28℃下培养3周。在预再生/选择培养基中3-5周后，将任何增殖性区转移到再生/选择培养基SCManRegen(具有适当的抗生素)进行选择性地继代培养，用于再生诱导。在黑暗中在28℃下培养这些培养物1周。然后将再生诱导盘移出，在28℃下在光照(16小时/天光照)中培养。两周后，为了使苗伸长和生根，将发育中的苗转移到具有SCR培养基的植物容器中。

5.转化结果

使用胚性培养物作为外植体获得了转基因甘蔗苗。在一个实施方案中，其中使用了包含CFP基因的根癌土壤杆菌转化甘蔗胚性培养物，从250个愈伤组织中挑出10个产生CFP阳性的稳定的愈伤组织。从这些稳定的事件使苗再生。

培养基配方：

在本说明书中提到的所有公开文件和专利申请对于本发明所涉及的本领域的普通技术人员的技术水平而言是指示性的。所有公开物和专利申请都通过引用以相同程度结合在此，如同各个单独的公开物或专利申请都专门地并且单独地表明要通过引用进行结合。

尽管已经为了清楚理解的目的通过解释和实例详细地描述了以上发明，显而易见的是在所附权利要求的范围内可以实施某些改变和变更。

1.一种生产转化的甘蔗植物细胞的方法，包括将感兴趣的核苷酸序列导入从甘蔗幼苗(immature shoot)获得的至少一种细胞中。

2.如权利要求1所述的方法，其中该感兴趣的核苷酸序列是经由粒子轰击导入的。

3.如权利要求1所述的方法，其中该感兴趣的核苷酸序列是经由土壤杆菌介导的基因递送导入的。

4.如权利要求1所述的方法，其中从甘蔗幼苗获得的细胞是从所述幼苗上切下的叶卷部分(leaf roll segment)获得的。

5.如权利要求1所述的方法，其中从甘蔗幼苗获得的细胞是从所述幼苗上切下的叶鞘部分获得的。

6.如权利要求4或5所述的方法，其中所述部分的厚度是从约0.1mm至约3cm(about 0.1 to about 3.0cm)。

7.如权利要求6所述的方法，其中所述部分的厚度是从约0.5mm至约3cm。

8.如权利要求1所述的方法，其中从该甘蔗幼苗获得的细胞是通过在转化之前或之后培养所述甘蔗幼苗的部分持续一段时间获得的。

9.如权利要求8所述的方法，其中所述时间是从约0天至约90天。

10.如权利要求9所述的方法，其中所述时间是从约5天至约21天。

11.如权利要求8所述的方法，其中所述细胞是在包括细胞分裂素的培养基中培养的。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述细胞分裂素是激动素、TDZ、玉米素、或N₆-苄基腺嘌呤(BA)。

13.如权利要求8所述的方法，其中所述细胞是在包括茁长素的培养基中培养的。

14.如权利要求13所述的方法，其中所述茁长素是1-萘乙酸(NAA)、二氯甲氧苯酸、吲哚-3-乙酸(IAA)、吲哚-3-丁酸(IBA)或2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)。

15.如权利要求1所述的方法，其中所述感兴趣的核苷酸序列包含在表达盒之内。

16.如权利要求15所述的方法，其中所述表达盒进一步包括选择性标记基因。

17.如权利要求16所述的方法，其中所述选择性标记基因是磷酸甘露糖异构酶(PMI)。

18.如权利要求1所述的方法，其中所述幼苗是在一周龄与六个月龄之间。

19.如权利要求8所述的方法，其中所述培养产生胚性培养物，并且所述细胞是从所述愈伤组织获得的。

20.一种产生转化的甘蔗植物细胞的方法，包括：

a)从甘蔗幼苗上获得植物组织的部分；

b)在足以形成胚性培养物的条件下培养所述部分；

c)将包括感兴趣的核苷酸序列的表达盒导入所述胚性培养物；

d)在选择性条件下培养(c)的胚性培养物，其中所述条件足以从非转化的细胞中区别出转化的细胞；以及，

e)使转化的植物再生。

21.如权利要求20所述的方法，其中该感兴趣的核苷酸序列是经由粒子轰击导入的。

22.如权利要求20所述的方法，其中该感兴趣的核苷酸序列是经由土壤杆菌介导的基因递送导入的。

23.如权利要求20所述的方法，其中从甘蔗幼苗获得的细胞是从所述幼苗上切下的叶卷部分获得的。

24.如权利要求20所述的方法，其中从甘蔗幼苗获得的细胞是从所述幼苗上切下的叶鞘部分获得的。

25.如权利要求23或24所述的方法，其中所述部分的厚度是从约0.1mm至约1.0mm。

26.如权利要求25所述的方法，其中所述部分的厚度是从约0.5mm至约1mm。

27.如权利要求20所述的方法，其中步骤(b)中的培养是从约1天至约30天。

28.如权利要求27所述的方法，其中步骤(b)中的培养是从约14天至约21天。

29.如权利要求20所述的方法，其中步骤(b)中的培养是在包括细胞分裂素的培养基中进行的。

30.如权利要求29所述的方法，其中所述细胞分裂素是激动素、TDZ、玉米素、或N₆-苄基腺嘌呤(BA)。

31.如权利要求29或30所述的方法，其中所述培养基进一步包括茁长素。

32.如权利要求31所述的方法，其中所述茁长素是1-萘乙酸(NAA)、二氯甲氧苯酸、吲哚-3-乙酸(IAA)、吲哚-3-丁酸(IBA)或2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)。

33.如权利要求20所述的方法，其中所述表达盒进一步包括选择性标记基因。

34.如权利要求33所述的方法，其中所述选择性标记基因是磷酸甘露糖异构酶(PMI)。

35.如权利要求34所述的方法，其中所述幼苗是在一周龄与六个月龄之间。

Claims (35)

1.一种生产转化的甘蔗植物细胞的方法，包括将感兴趣的核苷酸序列导入从甘蔗幼苗(immature shoot)获得的至少一种细胞中。

2.如权利要求1所述的方法，其中该感兴趣的核苷酸序列是经由粒子轰击导入的。

3.如权利要求1所述的方法，其中该感兴趣的核苷酸序列是经由土壤杆菌介导的基因递送导入的。

4.如权利要求1所述的方法，其中从甘蔗幼苗获得的细胞是从所述幼苗上切下的叶卷部分(leaf roll segment)获得的。

5.如权利要求1所述的方法，其中从甘蔗幼苗获得的细胞是从所述幼苗上切下的叶鞘部分获得的。

6.如权利要求4或5所述的方法，其中所述部分的厚度是从约0.1mm至约3cm。

7.如权利要求6所述的方法，其中所述部分的厚度是从约0.5mm至约3cm。

8.如权利要求1所述的方法，其中从该甘蔗幼苗获得的细胞是通过在转化之前或之后培养所述甘蔗幼苗的部分持续一段时间获得的。

9.如权利要求8所述的方法，其中所述时间是从约0天至约90天。

10.如权利要求9所述的方法，其中所述时间是从约5天至约21天。

11.如权利要求8所述的方法，其中所述细胞是在包括细胞分裂素的培养基中培养的。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述细胞分裂素是激动素、TDZ、玉米素、或N₆-苄基腺嘌呤(BA)。

13.如权利要求8所述的方法，其中所述细胞是在包括茁长素的培养基中培养的。

14.如权利要求13所述的方法，其中所述茁长素是1-萘乙酸(NAA)、二氯甲氧苯酸、吲哚-3-乙酸(IAA)、吲哚-3-丁酸(IBA)或2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)。

15.如权利要求1所述的方法，其中所述感兴趣的核苷酸序列包含在表达盒之内。

16.如权利要求15所述的方法，其中所述表达盒进一步包括选择性标记基因。

17.如权利要求16所述的方法，其中所述选择性标记基因是磷酸甘露糖异构酶(PMI)。

18.如权利要求1所述的方法，其中所述幼苗是在一周龄与六个月龄之间。

19.如权利要求8所述的方法，其中所述培养产生胚性培养物，并且所述细胞是从所述愈伤组织获得的。

20.一种产生转化的甘蔗植物细胞的方法，包括：

a)从甘蔗幼苗上获得植物组织的部分；

b)在足以形成胚性培养物的条件下培养所述部分；

c)将包括感兴趣的核苷酸序列的表达盒导入所述胚性培养物；

d)在选择性条件下培养(c)的胚性培养物，其中所述条件足以从非转化的细胞中区别出转化的细胞；以及，

e)使转化的植物再生。

21.如权利要求20所述的方法，其中该感兴趣的核苷酸序列是经由粒子轰击导入的。

22.如权利要求20所述的方法，其中该感兴趣的核苷酸序列是经由土壤杆菌介导的基因递送导入的。

23.如权利要求20所述的方法，其中从甘蔗幼苗获得的细胞是从所述幼苗上切下的叶卷部分获得的。

24.如权利要求20所述的方法，其中从甘蔗幼苗获得的细胞是从所述幼苗上切下的叶鞘部分获得的。

25.如权利要求23或24所述的方法，其中所述部分的厚度是从约0.1mm至约1.0mm。

26.如权利要求25所述的方法，其中所述部分的厚度是从约0.5mm至约1mm。

27.如权利要求20所述的方法，其中步骤(b)中的培养是从约1天至约30天。

28.如权利要求27所述的方法，其中步骤(b)中的培养是从约14天至约21天。

29.如权利要求20所述的方法，其中步骤(b)中的培养是在包括细胞分裂素的培养基中进行的。

30.如权利要求29所述的方法，其中所述细胞分裂素是激动素、TDZ、玉米素、或N₆-苄基腺嘌呤(BA)。

31.如权利要求29或30所述的方法，其中所述培养基进一步包括茁长素。

32.如权利要求31所述的方法，其中所述茁长素是1-萘乙酸(NAA)、二氯甲氧苯酸、吲哚-3-乙酸(IAA)、吲哚-3-丁酸(IBA)或2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)。

33.如权利要求20所述的方法，其中所述表达盒进一步包括选择性标记基因。

34.如权利要求33所述的方法，其中所述选择性标记基因是磷酸甘露糖异构酶(PMI)。

35.如权利要求34所述的方法，其中所述幼苗是在一周龄与六个月龄之间。