BR112014014125A2

BR112014014125A2 - molécula de ácido nucleico recombinante, produtos de plantas compreendendo a mesma, cultura, método de aumento da expressão de uma sequência de nucleotídeos de interesse em uma célula de planta

Info

Publication number: BR112014014125A2
Application number: BR112014014125-8A
Authority: BR
Inventors: Mark David Kinkema; Stacy Miles
Original assignee: Syngenta Participations Ag; Queensland University Of Technology
Priority date: 2011-12-15
Filing date: 2012-12-07
Publication date: 2020-12-01
Also published as: US20140366220A1; WO2013090137A1; ZA201403717B; CN104023521A; US9441234B2

Abstract

composições e métodos para expressão aumentada na cana-de-açúcar. a presente invenção refere-se a uma célula de planta de cana-de-açúcar compreendendo uma molécula de ácido nucleico recombinante, compreendendo a molécula de ácido nucleico recombinante uma sequência de nucleotídeos de interesse, um promotor e a sequência de nucleotídeos de seq id #no.1, em que o promotor está a jusante da e em associação operacional com a sequência de nucleotídeos de seq id #no.1 e a montante da e em associação operacional com a sequência de nucleotídeos de interesse, e a sequência de nucleotídeos de interesse é expressa a um nível pelo menos 6 vezes maior do que o nível de expressão da referida sequência de nucleotídeos de interesse em um controle. adicionalmente, é proporcionado um método de aumento da expressão de uma sequência de nucleotídeos de interesse em uma célula de planta de cana-de-açúcar usando a molécula de ácido nucleico recombinante da invenção.

Description

"MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO RECOMBINANTE, PRODUTOS DE PLANTAS COMPREENDENDO A MESMA, CULTURA, MÉTODO DE AUMENTO DA EXPRESSÃO DE UMA SEQUÊNCIA DE NUCLE- OTÍDEOS DE INTERESSE EM UMA CÉLULA DE PLANTA". DECLARAÇÃO DE PRIORIDADE

[001] Este pedido reivindica o benefício, sob 35 U.S.C. $ 119 (e), do Pedido Provisório dos EUA de tNo. 61/576,112; depositado em 15 de de- zembro, 2011, o conteúdo inteiro do qual é incorporado por referência aqui. DECLARAÇÃO DIZENDO RESPEITO AO ARQUIVAMENTO ELE-

TRÔNICO DE UMA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[002] Uma Listagem de Sequências em formato de texto ASCII|, submetida sob 37 C.F.R. 8 1.821, intitulada 9207-10 ST25.txt, 49.289 bytes de tamanho, gerada em 5 de dezembro, 2012 e depositada atra- vés de EFS-Web, é proporcionada em vez de uma cópia em papel. Esta Listagem de Sequências é deste modo incorporada aqui por refe- rência na especificação quanto às suas divulgações.

CAMPO DA INVENÇÃO

[003] A presente invenção se relaciona com composições e mé- todos para intensificação da expressão em plantas de cana-de-açúcar.

ANTECEDENTES

[004] A cana-de-açúcar é uma das culturas mais importantes a nível mundial. É a fonte primária de açúcar para alimentos e bebidas e para a produção de biocombustível. As dificuldades e limitações asso- ciadas ao melhoramento da cana-de-açúcar e o amplo potencial de manipulação genética torna a biotecnologia uma abordagem atrativa para a melhoria de traços de prioridade na cana-de-açúcar tais como conteúdo de açúcar aumentado e tolerância ao estresse abiótico e bió- tico (Lakshmanan et al. In vitro Cell. Dev. Biol. Plant, 44, 345-363 (2005)). Adicionalmente, pode ser usada biotecnologia para a diversifi- cação da indústria da cana-de-açúcar através da manipulação de plan-

tas capazes de produzirem produtos alternativos valiosos adicional- mente à sacarose. Por exemplo, cana-de-açúcar manipulada pode ser útil como uma biousina para a produção de produtos de elevado valor tais como farmacêuticos, anticorpos, produtos industriais, e açúcares alternativos (Lakshmanan et al. In vitro Cell. Dev. Biol. Plant, 41, 345- 363 (2005); Wang et al. Transgenic Research, 14, 167—178 (2005); Hamerli et al., Plant Biotech. J., 9, 32-37 (2011)).

[005] Um dos requerimentos-chave para a melhoria e diversifica- ção da cana-de-açúcar através da biotecnologia são níveis elevados de expressão de transgenes. No entanto, as ferramentas moleculares disponíveis para manipulação genética bem-sucedida e, em particular, para direcionamento de elevados níveis de expressão de genes, são relativamente limitadas na cana-de-açúcar em comparação com mui- tas outras plantas.

[006] Conformemente, a presente invenção ultrapassa as defici- ências na técnica pelo proporcionar de composições e métodos que intensificam a expressão de transgenes em plantas de cana-de- açúcar.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[007] Em um aspeto da invenção, é proporcionada uma célula de planta de cana-de-açúcar compreendendo uma molécula de ácido nu- cleico recombinante, compreendendo a molécula de ácido nucleico recombinante uma sequência de nucleotídeos de interesse, um promo- tor e a sequência de nucleotídeos de SEQ ID fNo.1, em que o promo- tor está a jusante da e em associação operacional com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID fNo.1 e a montante da e em associação com a sequência de nucleotídeos de interesse, em que adicionalmente o promotor é um promotor de poliubiquitina-1 do milho e/ou um promotor de fosfoenolpiruvato carboxilase (PepC) do milho e a sequência de nucleotídeos de interesse é expressa a um nível pelo menos 6 vezes maior do que o nível de expressão da referida sequência de nucleotí- deos de interesse em um controle.

[008] Em um segundo aspeto da invenção, é proporcionado um método de aumento da expressão de uma sequência de nucleotídeos de interesse em uma célula de planta de cana-de-açúcar, compreen- dendo: introdução na célula de planta de cana-de-açúcar de uma mo- lécula de ácido nucleico recombinante, compreendendo a molécula de ácido nucleico recombinante uma sequência de nucleotídeos de inte- resse, um promotor e a sequência de nucleotídeos de SEQ ID fNo.1, em que o promotor está a jusante da e em associação operacional com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID fNo.1 e a montante da e em associação com a sequência de nucleotídeos de interesse, sob condições onde a sequência de nucleotídeos de interesse é expressa, em que adicionalmente o promotor é um promotor de poliubiquitina-1 do milho e/ou um promotor de PepC do milho, aumentando desse mo- do a expressão da sequência de nucleotídeos de interesse para pelo menos 6 vezes mais do que a expressão da referida sequência de nu- cleotídeos de interesse em um controle.

[009] Em outras formas de realização, a presente invenção pro- porciona células de planta, plantas, e partes de planta de cana-de- açúcar, que compreendem uma molécula de ácido nucleico da inven- ção e/ou uma cultura compreendendo uma pluralidade de plantas de cana-de-açúcar da invenção. Ainda em outras formas de realização, a presente invenção proporciona também produtos coletados e produtos processados produzidos a partir de uma célula de planta de cana-de- açúcar, planta de cana-de-açúcar, e/ou parte de planta de cana-de- açúcar da invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0010] A Figura 1 mostra expressão de beta-glucuronidase (GUS) pelos diferentes constructos promotor-scoGUS na primeira folha de-

senrolada de plantas de cana-de-açúcar com seis meses de idade. SC11 (Zm-Ubil-scoGUS); SC27 (eFMVe35S-ZmUbi-scoGUS); SC24 (ZMPEPC-scoGUS); SC25 (eFMVe35S-ZmMPEPC-scoGUS); SC28(CMP-iUbi-scoGUS); SC29(eFMVe35S-pCMP-iUbi-scoGUS). É mostrada a média (+*SEM). Os dados com diferentes expoentes são significativamente diferentes (p<0,05).

[0011] A Figura 2 mostra expressão de GUS pelos diferentes constructos promotor-scoGUS na primeira folha desenrolada de plan- tas de rebentos de cana-de-açúcar associados a plantas mãe com a- proximadamente 11 meses de idade. SC11 (Zm-Ubi- scoGUS); SC27 (eFMVe35S-ZmUbi-scoGUS); SC24 (ZMPEPC-scoGUS); SC25 (eFM- Ve35S-ZmMPEPC-scoGUS); SC28(CMP-iUbi-scoGUS); SC29(eFMVe35S-pCMP-iUbi-scoGUS). É mostrada a média (+SEM; n=5). Os dados com diferentes expoentes são significativamente dife- rentes (p<0,05).

[0012] A Figura 3 mostra expressão de GUS pelos diferentes constructos promotor-scoGUS na haste (internodos 3 e 4) de rebentos de cana-de-açúcar associados a plantas mãe com aproximadamente 11 meses de idade. SC11 (Zm-Ubil-scoGUS); SC27 (eFMVe35S- ZmUbi-scoGUS); SC24 (ZmMPEPC-scoGUS); SC25 (eFMVe35S- ZmMPEPC-scoGUS); — SC28(CMP-iUbi-scoOGUS); — SC29(eFMVe35S- pCMP-iUbi-scoGUS). É mostrada a média (*SEM; n=5). Os dados com diferentes expoentes são significativamente diferentes (p<0,05).

[0013] As Figuras 4A-4B mostra expressão de GUS pelos cons- tructos Zm-Ubi1-scoGUS e eFMVe35S-ZmUbi-scoGUS em hastes de cana-de-açúcar (Figura 4A) tiradas de plantas aos 12 meses de idade (imaturas (internodos 3 e 4), em maturação (internodo 8), e maduras (internodo 20)) e na primeira folha desenrolada de plantas de cana-de- açúcar com seis meses de idade (Figura 4B). TSP=proteína solúvel total. É mostrada a média (+SEM; na Figura 4A, n=5; e na Figura 4B,

n=11 (controle) e n=12 (intensificador).

[0014] A Figura 5 mostra expressão de GUS na haste de cana-de- açúcar transgênica contendo os diferentes constructos promotor- scoGUS. Foram tiradas amostras de regiões da haste imatura (inter- nodos 384), em maturação (internodo 8) e maduras (internodo 20) aos 12 meses após transferência para o solo. A abundância de GUS foi medida usando gELISA. É mostrada a média (+SEM; n=7). Os dados com diferentes letras são significativamente diferentes (p<0,05).

[0015] A Figura 6 mostra uma comparação da expressão de GUS pelos diferentes constructos promotor-scoGUS na folha de plantas TO e rebentos (TOR1). A primeira folha, completamente desenrolada, de cada evento independente, transgênico foi analisada aos seis meses após a transferência para o solo (TO) ou cinco meses após germinação (TOR1; altura em que as plantas TOR1 estavam a uma altura compará- vel às plantas TO com seis meses de idade). A abundância de GUS foi medida usando qELISA. É mostrada a média (+*SEM ou SD (Zm-PepC; n=2-5). * indica uma diferença estatisticamente significativa em relação à TO (p<0,001).

[0016] Estes e outros aspetos da invenção são estabelecidos em mais detalhe na descrição da invenção em baixo.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0017] Esta descrição não se destina a ser um catálogo detalhado de todas as maneiras diferentes pelas quais a invenção pode ser im- plementada, ou todas as características que podem ser adicionadas à presente invenção. Por exemplo, as características ilustradas no que diz respeito a uma forma de realização podem ser incorporadas em outras formas de realização, e as características ilustradas no que diz respeito a uma forma de realização particular podem ser eliminadas dessa forma de realização. Assim, a presente invenção contempla que, em algumas formas de realização da invenção, qualquer caracte-

rística ou combinação de características estabelecida aqui possa ser excluída ou omitida. Adicionalmente, numerosas variações e adições às várias formas de realização sugeridas aqui serão aparentes àque- les peritos na técnica tendo em vista a presente divulgação, que não se afastam da presente invenção. Consequentemente, as seguintes descrições se destinam a ilustrar algumas formas de realização parti- culares da invenção, e não especificam exaustivamente todas as suas permutações, combinações e variações.

[0018] A não ser que definido de outro modo, todos os termos téc- nicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado como co- mummente entendido por um perito na técnica à qual a presente in- venção pertence. A terminologia usada na descrição da invenção aqui é para o propósito de descrever formas de realização particulares so- mente e não se destina a ser limitante da invenção.

[0019] Todas as publicações e pedidos de patente mencionados nesta especificação são indicativos do nível de perícia daqueles peri- tos na técnica à qual esta invenção pertence. Adicionalmente, as pu- blicações, pedidos de patentes, patentes, e outras referências mencio- nados aqui são incorporados por referência na sua totalidade.

[0020] Como notado previamente, as ferramentas moleculares disponíveis para manipulação genética bem-sucedida da cana-de- açúcar são relativamente limitadas em comparação com muitas outras plantas. Em particular, alcançar elevados níveis de expressão de áci- dos nucleicos heterólogos tem provado ser difícil e inconsistente. À evidência sugere que algumas das dificuldades associadas à expres- são de transgenes na cana-de-açúcar podem ser causadas por silen- ciamento de genes pós-transcricional (PTGS; Mudge et al., Planta, 229, 549-558 (2009); Birch et a/., Tropical Plant Biol., 3, 88-97 (2010)). Em estes casos, se tem mostrado que a atividade de um número de promotores é significativamente reduzida em cana-de-açúcar em ma-

turação. Se tem demonstrado que um número de promotores é capaz de expressar ácidos nucleicos heterólogos em cana-de-açúcar trans- gênica estável. Entre estes, o promotor de poliubiquitina-1 do milho (ZmM-Ubi1) é geralmente considerado o padrão de referência pois tem sido o promotor mais consistente, minuciosamente avaliado, e o mais comummente usado para manipulação genética da cana-de-açúcar (Grof et al., (1996) Molecular manipulation of sucrose phosphate syn- thase in sugarcane. Em J.R. Wilson et al. (ed) Sugarcane: Research towards efficient and sustainable production. CSIRO Division of Tropi- cal Crops and Pastures, Brisbane, Austrália. p. 124-126.; Hansom et al., (1999) Regulation of transgene expression in sugarcane. Em: Singh V (ed) Proc. Int. Soc. Sugarcane Technol. XXIll congresso. STAI, Nova Deli, 278-290; McQualter et al., Plant Biotech. J., 3, 29-41 (2005); Vickers et al., Crop Sci., 45, 354-362 (2005); Wang et al, Transgenic Research, 14, 167—178 (2005); Jain et al., Plant Cell Rep., 26, 581-590 (2007); Petrasovits et al., Plant Biotech. J., 5, 162-172 (2007); Wu e Birch, Plant Biotech. J. 5, 109-117 (2007); Christy et al. Plant Cell Rep., 28, 175-184 (2009); Weng et al., Transgen. Res., 20, 759-772 (2011)). Não obstante, melhorias no nível de expressão de transgenes na cana-de-açúcar em relação àquele correntemente al- cançado com Zm-Ubi1 e outros promotores testados até à data seriam muito benéficas para manipulação genética desta cultura.

[0021] Assim, a presente invenção se relaciona com a descoberta inesperada de que uma célula de planta, planta e/ou parte de planta de cana-de-açúcar transformada com uma molécula de ácido nucleico recombinante compreendendo uma sequência de nucleotídeos de inte- resse que está operacionalmente associada a um promotor e o promo- tor está adicionalmente operacionalmente associado à sequência de nucleotídeos de SEQ ID fNo.1 resulta em uma célula de planta, planta e/ou parte de planta de cana-de-açúcar transformada tendo um nível de expressão da sequência de nucleotídeos de interesse que é pelo menos cerca de 6 vezes maior (por exemplo, cerca de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 vezes maior etc.) do que o nível de expressão da sequência de nucleotídeos de interesse em uma célula de planta, plan- ta e/ou parte de planta de cana-de-açúcar de controle que compreen- de o constructo que difere daquele usado na planta de teste na medida em que não compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID tfNo.1 (isto é, a planta de controle compreende o promotor e a se- quência de nucleotídeos de interesse em associação operacional mas não compreende o intensificador (SEQ ID fNo.1)).

[0022] A sequência de nucleotídeos de SEQ ID fNo.1 é um inten- sificador dual da transcrição compreendendo sequências intensificado- ras do vírus do mosaico da escrofulária (eEFMV) e vírus do mosaico da couve-flor (e358S) como se segue:

[0023] Agctgacttatagggaccagacaaaaaaggaatagtgcagaattgttaggege acctaccaaaagcatctttacctttatigcaaagataaagcagattcctetagtacaagtggggaa caaaataacgtggaaaagagctgtectgacageccacteactaatgcgtatgacgaacgcagt gacgaccacaaaactcegagactttttaacaaagggtaatatceggaaacctecteggattccat tagcccagctatcetateactitattataaagatagtggaaaaggaagatagctectacaaatgccat cattgcgataaaggaaaggctatcegttgaagatgcetetacegacagtagteccaaagatggac cceccacecacgaggagcategtiggaaaaagaagacgttccaaccacgtetteaaageaagto gattgatgtgatatctecactgacgtaagggatgacgaacaatccecactatcettc (SEQ ID fNo.1)

[0024] Em algumas formas de realização, a sequência de nucleo- tídeos de SEQ ID ftNo.1 inclui sequências de nucleotídeos tendo cerca de 80 % a cerca de 100 % de identidade de sequência com a SEQ ID fNo.1. Assim, em algumas formas de realização, a sequência de nu- cleotídeos de SEQ ID ftNo.1 inclui sequências de nucleotídeos tendo 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 100 % de identidade de sequência com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID fNo.1.

[0025] Adicionalmente ao aumento da expressão de uma sequên- cia de nucleotídeos de interesse à qual está operacionalmente ligada (em comparação com um controle), foi inesperadamente descoberto que a sequência de nucleotídeos de SEQ ID fNo.1 (constructo eFM- Ve35S) intensifica a transcrição em plantas de cana-de-açúcar para um nível significativamente maior em comparação com a sua capaci- dade de intensificar a transcrição em outras espécies de planta, tais como milho. Assim, quando o constructo de ácido nucleico compreen- dendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID fNo.1 operacionalmen- te ligada a um promotor que está adicionalmente operacionalmente ligado a uma sequência de nucleotídeos de interesse é transformado em cana-de-açúcar, o nível resultante de expressão da sequência de nucleotídeos de interesse na planta de cana-de-açúcar (em compara- ção com um controle) é 2 a 3 vezes do que o nível de transcrição in- tensificada observado em milho (em comparação com um controle) que é transformado com o mesmo constructo de ácido nucleico. Esta descoberta surpreendente mostra que este intensificador dual eFM- Ve35S (SEQ ID fNo.1) é particularmente bem adequado para uso na intensificação da expressão na cana-de-açúcar e é uma melhoria sig- nificativa em relação a outros métodos para aumento da expressão de sequências de nucleotídeos na cana-de-açúcar.

[0026] Assim, em um aspeto da invenção, é proporcionada uma célula de planta de cana-de-açúcar compreendendo uma molécula de ácido nucleico recombinante, a molécula de ácido nucleico recombi- nante compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em uma sequência de nucleotídeos de interesse, um promotor e a se- quência de nucleotídeos de SEQ ID fNo.1, em que o promotor está a jusante da e em associação operacional com a sequência de nucleotí-

deos de SEQ ID fNo.1 e a montante da e em associação operacional com a sequência de nucleotídeos de interesse, e a sequência de nu- cleotídeos de interesse é expressa a um nível que é pelo menos cerca de 6 vezes maior (por exemplo, cerca de pelo menos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 vezes etc..) do que o nível de expressão da referida se- quência de nucleotídeos de interesse em um controle. Em algumas formas de realização, o promotor pode ser qualquer promotor como descrito em baixo. Em outras formas de realização, o promotor é um promotor de poliubiquitina-1 do milho e/ou um promotor de fosfoenolpi- ruvato carboxilase (PepC) do milho.

[0027] Assim, em um aspeto adicional da invenção, é proporcio- nada uma molécula de célula de planta de cana-de-açúcar compreen- dendo uma molécula de ácido nucleico recombinante, a molécula de ácido nucleico recombinante compreendendo, consistindo essencial- mente em, ou consistindo em uma sequência de nucleotídeos de inte- resse, um promotor e a sequência de nucleotídeos de SEQ ID fNo.1, em que o promotor está a jusante da e em associação operacional com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID fNo.1 e a montante da e em associação operacional com a sequência de nucleotídeos de inte- resse, em que adicionalmente o promotor é um promotor de poliubiqui- tina-1 do milho e/ou um promotor de PepC do milho e a sequência de nucleotídeos de interesse é expressa a um nível que é pelo menos cerca de 6 vezes maior (por exemplo, cerca de pelo menos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 vezes etc..) do que o nível de expressão da refe- rida sequência de nucleotídeos de interesse em um controle.

[0028] Em outro aspeto da invenção, é proporcionado um método de aumento da expressão de uma sequência de nucleotídeos de inte- resse em uma célula de planta de cana-de-açúcar, compreendendo o método: introdução na célula de planta de cana-de-açúcar de uma mo- lécula de ácido nucleico recombinante, a molécula de ácido nucleico recombinante compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em uma sequência de nucleotídeos de interesse, um pro- motor e a sequência de nucleotídeos de SEQ ID fNo.1, em que o promotor está a jusante da e em associação operacional com a se- quência de nucleotídeos de SEQ ID %No.1 e a montante da e em as- sociação operacional com a sequência de nucleotídeos de interesse, sob condições onde a sequência de nucleotídeos de interesse é ex- pressa, aumentando desse modo a expressão da sequência de nucle- otídeos de interesse para pelo menos 6 vezes (por exemplo, cerca de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 vezes mais etc.) mais do que a ex- pressão da referida sequência de nucleotídeos de interesse em um controle. Em algumas formas de realização, o promotor pode ser qual- quer promotor como descrito em baixo. Em outras formas de realiza- ção, o promotor é um promotor de poliubiquitina-1 do milho e/ou um promotor de PepC do milho.

[0029] Assim, em um aspeto adicional, é proporcionado um méto- do de aumento da expressão de uma sequência de nucleotídeos de interesse em uma célula de planta de cana-de-açúcar, compreenden- do: introdução na célula de planta de cana-de-açúcar de uma molécula de ácido nucleico recombinante, a molécula de ácido nucleico recom- binante compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consis- tindo em uma sequência de nucleotídeos de interesse, um promotor e a sequência de nucleotídeos de SEQ ID f%No.1, em que o promotor está a jusante da e em associação operacional com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID ffNo.1 e a montante da e em associação ope- racional com a sequência de nucleotídeos de interesse, sob condições onde a sequência de nucleotídeos de interesse é expressa, em que adicionalmente o promotor é um promotor de poliubiquitina-1 do milho e/ou um promotor de PepC do milho, aumentando desse modo a ex- pressão da sequência de nucleotídeos de interesse para pelo menos 6 vezes (por exemplo, cerca de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 vezes mais etc.) mais do que a expressão da referida sequência de nucleotí- deos de interesse em um controle.

[0030] Em formas de realização particulares, o controle é uma planta de cana-de-açúcar compreendendo a mesma molécula de ácido nucleico recombinante sem a sequência intensificadora (isto é, a mo- lécula de ácido nucleico recombinante compreende o promotor em as- sociação operacional com a sequência de nucleotídeos de interesse mas não compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID fNo.1 em associação operacional com o promotor).

[0031] Em alguns aspetos, uma molécula de ácido nucleico re- combinante da invenção compreende adicionalmente uma sequência Kozak. Assim, em uma forma de realização da invenção, a molécula de ácido nucleico recombinante compreende, consiste essencialmente em, ou consiste em uma sequência de nucleotídeos de interesse, um promotor, uma sequência Kozak e a sequência de nucleotídeos de SEQ ID fNo.1, em que o promotor está a jusante da e em associação operacional com a sequência de nucleótideos de SEQ ID HfNo.1 ea montante da e em associação operacional com a sequência de nucleo- tídeos de interesse, e a sequência Kozak está a montante (por exem- plo, imediatamente a montante) da sequência de nucleotídeos de inte- resse e a jusante do promotor e em associação operacional com tanto o promotor como a sequência de nucleotídeos de interesse. Pode ser usada qualquer sequência Kozak. Em algumas formas de realização particulares, a sequência de Kozak é gcggcecegcec.

[0032] Aspetos adicionais da presente invenção proporcionam cé- lulas, plantas e partes de planta de cana-de-açúcar transformadas com uma molécula de ácido nucleico recombinante da invenção e produtos coletados das plantas e partes de planta de cana-de-açúcar transfor- madas bem como produtos processados produzidos a partir dos pro-

dutos coletados da invenção. Assim, um aspeto particular da invenção proporciona uma planta compreendendo uma célula de planta, com- preendendo a célula de planta adicionalmente uma molécula de ácido nucleico recombinante da invenção.

[0033] Produtos coletados da cana-de-açúcar incluem, mas não estão limitados a, bagaço, canas, palha, e similares, e/ou qualquer sua combinação. Exemplos não limitantes de produtos processados pro- duzidos a partir dos produtos de cana-de-açúcar coletados incluem polpa, papel, placas de bagaço, furfural para uso em resinas, biocom- bustíveis, incluindo mas não limitados a etanol, ração animal, gêneros alimentares, incluindo mas não limitados a açúcar, suco de cana-de- açúcar, xarope, rum, melaços, e similares, e/ou qualquer sua combi- nação. Os produtos processados podem ser também produzidos a partir de cana-de-açúcar usada como uma biousina. Exemplos não limitantes de produtos de biousina incluem enzimas, farmacêuticos, açúcares alternativos, anticorpos, produtos industriais, e similares, e/ou qualquer sua combinação.

[0034] Ainda em uma forma de realização adicional, a presente invenção proporciona uma cultura de cana-de-açúcar compreendendo uma pluralidade das plantas de cana-de-açúcar transgênicas da in- venção plantadas em conjunto em um campo agrícola.

[0035] Como usadas na descrição das formas de realização da invenção e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um", "u- ma" e "o", "a" se destinam a incluir as formas plurais também, a não ser que o contexto dite claramente de outro modo.

[0036] Como usados aqui, "e/ou" se referem a e englobam qual- quer uma e todas as combinações possíveis de um ou mais dos itens listados associados.

[0037] O termo "cerca de", como usado aqui quando se refere a um valor mensurável tal como uma quantidade de um composto, dose,

tempo, temperatura, e similares, se destina a englobar variações de 20 %, 10 %, 5%, 1 %, 0,5 %, ou mesmo 0,1 % da quantidade especifica- da.

[0038] Os termos "compreendem", "compreende" e/ou "compreen- dendo", quando usados nesta especificação, especificam a presença de características, inteiros, passos, operações, elementos, e/ou com- ponentes apresentados, mas não excluem a presença ou adição de um ou mais de outras suas características, inteiros, passos, opera- ções, elementos, componentes, e/ou grupos.

[0039] Como usada aqui, a frase transicional "consistindo essenci- almente em" significa que o escopo de uma reivindicação é para ser interpretado como englobando os materiais ou passos especificados enumerados na reivindicação e aqueles que não afetam materialmente a(s) característica(s) básica(s) e nova(s) da invenção reivindicada. As- sim, o termo "consistindo essencialmente em" quando usado em uma reivindicação desta invenção não se destina a ser interpretado como sendo equivalente a "compreendendo". Assim, o termo "consiste es- sencialmente em" (e variantes gramaticais), como aplicado a uma se- quência de polinucleotídeos ou polipeptídeos da invenção, significa um polinucleotídeo que consiste na sequência recitada (por exemplo, SEQ ID tNo.) e um total de dez ou menos (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6,7, 8, 9, ou 10) nucleotídeos adicionais nas extremidades 5' e/ou 3' da se- quência recitada tal que a função do polinucleotídeo não seja materi- almente alterada. O total de dez ou menos nucleotídeos adicionais in- clui o número total de nucleotídeos adicionais em ambas as extremi- dades adicionados em conjunto.

[0040] Os termos "sequência de nucleotídeos", "ácido nucleico", "molécula de ácido nucleico", "oligonucleotídeo" e "polinucleotídeo" são usados indistintamente aqui para se referirem a um heteropolíme- ro de nucleotídeos e englobam tanto RNA como DNA, incluindo cDNA,

DNA genômico, mRNA, DNA ou RNA sintético (por exemplo, quimica- mente sintetizado) e quimeras de RNA e DNA. O termo ácido nucleico se refere a uma cadeia de nucleotídeos sem ter em conta o compri- mento da cadeia. O ácido nucleico pode ser de fita dupla ou fita sim- ples. Onde é de fita simples, o ácido nucleico pode ser uma fita senso ou uma fita antissenso. O ácido nucleico pode ser sintetizado usando análogos ou derivados de oligonucleotídeos (por exemplo, nucleotí- deos de inosina ou fosforotioato). Tais oligonucleotídeos podem ser usados, por exemplo, para preparar ácidos nucleicos que têm capaci- dades de emparelhamento de bases alteradas ou resistência aumen- tada a nucleases. As sequências de ácido nucleico proporcionadas aqui são apresentadas aqui na direção 5' a 3', da esquerda para a di- reita e são representadas usando o código padrão para representação dos caracteres de nucleotídeos como estabelecido nas regras para sequências dos E.U.A., 37 CFR 881.821 - 1.825 e na World Intellectual Property Organization (WIPO) Padrão ST.25.

[0041] Como usado aqui, o termo "gene" se refere a uma molécula de ácido nucleico capaz de ser usada para produzir MRNA, RNA an- tissenso, miRNA, e similares. Os genes podem ou não ser capazes de ser usados para produzir uma proteína funcional. Os genes podem in- cluir tanto regiões codificantes como não codificantes (por exemplo, íntrons, elementos reguladores, promotores, intensificadores, sequên- cias de terminação e regiões não traduzidas 5º e 3”).

[0042] Uma molécula de ácido nucleico ou sequência de nucleotí- deos "isolada" ou um polipeptídeo "isolado" é uma molécula de ácido nucleico, sequência de nucleotídeos ou polipeptídeo que, pela mão do homem, existe separadamente de seu ambiente nativo e não é portan- to um produto da natureza. Uma molécula de ácido nucleico isolada ou polipeptídeo isolado pode existir em uma forma purificada ou pode e- xistir em um ambiente não nativo tal como, por exemplo, uma célula hospedeira recombinante. Assim, por exemplo, no que diz respeito a um polinucleotídeo, o termo "isolado" significa que está separado do cromossoma e/ou célula no qual ocorre naturalmente. Um polinucleo- tídeo está também isolado se estiver separado do cromossoma e/ou célula no qual ocorre naturalmente e for depois inserido em um contex- to genético, um cromossoma e/ou uma célula no qual não ocorre natu- ralmente. As moléculas de ácido nucleico recombinantes e sequências de nucleotídeos da invenção podem ser consideradas como estando "isoladas" como definido acima.

[0043] Assim, uma "molécula de ácido nucleico isolada" ou "se- quência de nucleotídeos isolada" é uma molécula de ácido nucleico ou sequência de nucleotídeos que não é imediatamente contígua com todas as sequências de nucleotídeos com as quais é imediatamente contígua (uma na extremidade 5' e uma na extremidade 3') no genoma que ocorre naturalmente do organismo do qual é derivada. Em uma forma de realização, uma molécula de ácido nucleico isolada ou se- quência de nucleotídeos isolada inclui algumas das ou todas as se- quências não codificantes 5' (por exemplo, promotor) que são imedia- tamente contíguas a uma sequência codificante. O termo inclui portan- to, por exemplo, uma molécula de ácido nucleico recombinante que é incorporada em um vetor, em um plasmídeo ou vírus com replicação autônoma, ou no DNA genômico de um procariota ou eucariota, ou que existe como uma molécula separada (por exemplo, um cDNA ou um fragmento de DNA genômico produzido por PCR ou tratamento com endonucleases de restrição), independentemente de outras se- quências. Inclui também um ácido nucleico recombinante que é parte de um ácido nucleico híbrido codificando um polipeptídeo ou sequên- cia de peptídeos adicional.

[0044] O termo "isolado" pode adicionalmente se referir a uma mo- lécula de ácido nucleico, sequência de nucleotídeos, polipeptídeo,

peptídeo ou fragmento que está substancialmente isento de material celular (incluindo mas não limitado a proteínas tais como histonas), material viral, e/ou meio de cultura (por exemplo, quando produzido por técnicas de DNA recombinante), ou precursores químicos ou ou- tros químicos (por exemplo, quando quimicamente sintetizado). Além do mais, um "fragmento isolado" é um fragmento de uma molécula de ácido nucleico, sequência de nucleotídeos ou polipeptídeo que não ocorre naturalmente como um fragmento e não seria encontrado como tal no estado natural. "Isolado" não significa necessariamente que a preparação é tecnicamente pura (homogênea), mas é suficientemente pura para proporcionar o polipeptídeo ou ácido nucleico em uma forma na qual possa ser usada para o propósito pretendido.

[0045] Em formas de realização representativas da invenção, uma molécula de ácido nucleico, sequência de nucleotídeos, e/ou polipeptí- deo "isolado" é pelo menos cerca de 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % puro (p/p) ou mais. Em outras formas de realização, um ácido nucleico, sequência de nucleotídeos, e/ou polipeptídeo "isolado" indica que é alcançado um enriquecimento de pelo menos cerca de 5 vezes, vezes, 25 vezes, 100 vezes, 1000 vezes, 10.000 vezes, 100.000 vezes ou mais do ácido nucleico (p/p) em comparação com o material de início.

[0046] Como usado aqui, "heterólogo" se refere a uma molécula de ácido nucleico ou sequência de nucleotídeos que ou tem origem em outra espécie ou é da mesma espécie ou organismo mas está modifi- cada em relação à sua forma original ou à forma principalmente ex- pressa na célula. Assim, uma sequência de nucleotídeos derivada de um organismo ou espécie diferente daquele da célula na qual a se- quência de nucleotídeos é introduzida é heteróloga no que diz respeito a essa célula e aos descendentes da célula. Adicionalmente, uma se-

quência de nucleotídeos heteróloga inclui uma sequência de nucleotí- deos derivada do e inserida no mesmo tipo celular original, natural, mas que está presente em uma forma não natural, por exemplo pre- sente em um número diferente de cópias, e/ou sob o controle de se- quências reguladoras diferentes do que aquelas encontradas no esta- do nativo da molécula de ácido nucleico.

[0047] Sequência de nucleotídeos ou sequência de aminoácidos de "tipo selvagem" se refere a uma sequência de nucleotídeos ou se- quência de aminoácidos que ocorre naturalmente ("nativa") ou endó- gena. Assim, por exemplo, um "mRNA de tipo selvagem" é um mMRNA que ocorre naturalmente no ou é endógeno ao organismo. Uma se- quência de nucleotídeos "homóloga" é uma sequência de nucleotídeos naturalmente associada a uma célula hospedeira na qual é introduzi- da.

[0048] Pelo termo "expressar" ou "expressão" de uma sequência codificante de polinucleotídeo, se significa que a sequência é transcri- ta, e opcionalmente traduzida. Assim, em algumas formas de realiza- ção particulares da presente invenção, a expressão de uma sequência codificante da invenção resultará na produção de um polipeptídeo.

[0049] "Sequência de nucleotídeos de interesse" se refere a qual- quer sequência de nucleotídeos que, quando introduzida em uma plan- ta, confere à planta uma característica desejada tal como resistência a antibióticos, resistência a vírus, resistência a insetos, resistência a do- enças, ou resistência a outras pragas, tolerância a herbicidas, valor nutricional melhorado, desempenho melhorado em um processo indus- trial ou capacidade reprodutora alterada. A "sequência de nucleotídeos de interesse" pode também ser uma que é transferida para plantas pa- ra a produção de produtos comercialmente valiosos tais como enzimas ou metabolitos na planta.

[0050] Como usadas aqui, as frases "operativamente ligado", "ope-

racionalmente ligado", "operacionalmente associado" ou "em associa- ção operacional" e similares significam que elementos de um construc- to de ácido nucleico tal como um cassete de expressão ou molécula de ácido nucleico estão configurados de modo a realizarem a sua fun- ção usual. Assim, as sequências reguladoras ou de controle (por e- xemplo, promotores) operacionalmente ligadas a uma sequência de nucleotídeos de interesse são capazes de efetuar a expressão da se- quência de nucleotídeos de interesse. Adicionalmente, as sequências de controle podem ser reguladas por sequências reguladoras tais co- mo as sequências de nucleotídeos da invenção, por exemplo, SEQ ID tNo.1, as quais quando operacionalmente ligadas a um promotor que está por seu turno operacionalmente ligado à sequência de nucleotí- deos de interesse podem resultar em expressão aumentada da se- quência de nucleotídeos de interesse em comparação com a expres- são da sequência de nucleotídeos de interesse em uma planta de con- trole (em que a planta de controle é uma planta de cana-de-açúcar compreendendo a mesma molécula de ácido nucleico recombinante com a exceção de que no caso do controle, a molécula de ácido nucle- ico recombinante compreende o promotor e a sequência de nucleotí- deos de interesse em associação operacional mas não compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID tNo.1, e portanto não compre- ende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID fNo.1 em associação operacional com o promotor).

[0051] As sequências reguladoras ou de controle não necessitam de ser contíguas com a sequência de nucleotídeos de interesse, desde que consigam dirigir a sua expressão. Assim, por exemplo, sequências intervenientes não traduzidas, mas transcritas, podem estar presentes entre um promotor e uma sequência codificante, e a sequência promo- tora pode ainda ser considerada "operacionalmente ligada" à sequên- cia codificante. Assim, em algumas formas de realização da invenção,

uma sequência de nucleotídeos de interesse pode estar operacional- mente ligada a um promotor que está operacionalmente ligado à se- quência de nucleotídeos de SEQ ID fNo.1, permitindo desse modo expressão aumentada da sequência de nucleotídeos de interesse em uma planta, parte de planta e/ou célula de planta.

[0052] Como usados aqui, os termos "transformado" ou "transgê- nico" se referem a qualquer planta, célula de planta, calo, tecido de planta, ou parte de planta que contém todo o ou parte de pelo menos um polinucleotídeo recombinante (por exemplo, heterólogo). Em algu- mas formas de realização, todo o ou parte do polinucleotídeo recombi- nante é estavelmente integrado em um cromossoma ou elemento ex- tracromossômico estável, tal que é passado para gerações sucessi- vas. Para os propósitos da invenção, o termo "polinucleotídeo recom- binante" se refere a um polinucleotídeo que foi alterado, rearranjado, ou modificado por manipulação genética. Exemplos incluem qualquer polinucleotídeo, ou polinucleotídeos, clonados que estão ligados ou unidos a sequências heterólogas. O termo "recombinante" não se refe- re a alterações de polinucleotídeos que resultem de eventos que ocor- ram naturalmente, tais como mutações espontâneas, ou de mutagêne- se não espontânea seguida por melhoramento seletivo.

[0053] "Introdução" no contexto de uma célula de planta, planta e/ou parte de planta significa contato de uma molécula de ácido nucle- ico com a planta, parte de planta, e/ou célula de planta de tal modo que a molécula de ácido nucleico ganha acesso ao interior da célula de planta e/ou uma célula da planta e/ou parte de planta. Onde mais do que uma molécula de ácido nucleico é para ser introduzida, estas moléculas de ácido nucleico podem ser montadas como parte de um único constructo de polinucleotídeo ou ácido nucleico, ou como cons- tructos de polinucleotídeo ou ácido nucleico separados, e podem estar localizadas no mesmo ou em diferentes constructos de ácido nucleico.

Conformemente, estes polinucleotídeos podem ser introduzidos em células de plantas em um único evento de transformação, em eventos de transformação separados, ou, por exemplo, como parte de um pro- tocolo de melhoramento. Assim, o termo "transformação" como usado aqui se refere à introdução de um ácido nucleico heterólogo em uma célula. A transformação de uma célula pode ser estável ou transiente.

[0054] O termo "parte de planta", como usado aqui, inclui mas não está limitado a embriões, pólen, óvulos, sementes, folhas, flores, ra- mos, fruto, miolos, espigas, sabugos, cascas, caules, raízes, pontas de raízes, anteras, células de planta incluindo células de planta que estão intactas nas plantas e/ou partes de plantas, protoplastos de plantas, tecidos de plantas, culturas de células de tecidos de plantas, calos de plantas, tufos de plantas, e similares. Adicionalmente, como usado a- qui, "célula de planta" se refere a uma unidade estrutural e fisiológica da planta, que compreende uma parede celular e pode também se re- ferir a um protoplasto. Em algumas formas de realização, uma célula de planta pode estar na forma de uma única célula isolada ou pode ser uma célula cultivada ou pode ser uma parte de uma unidade de orga- nização superior tal como, por exemplo, um tecido de planta ou um órgão de planta.

[0055] "Transformação transiente" no contexto de um polinucleotí- deo significa que um polinucleotídeo é introduzido na célula e não se integra no genoma da célula.

[0056] Como usado aqui, "introdução estável", "estavelmente in- troduzido", "transformação estável" ou "estavelmente transformado" no contexto de um polinucleotídeo introduzido em uma célula significa que o polinucleotídeo introduzido é estavelmente integrado no genoma da célula, e logo a célula é estavelmente transformada com o polinu- cleotídeo. Como tal, o polinucleotídeo integrado é capaz de ser herda- do pela sua descendência, mais particularmente, pela descendência de múltiplas gerações sucessivas. "Genoma" como usado aqui inclui o genoma nuclear e/ou do plastídeo, e inclui portanto integração de um polinucleotídeo, por exemplo, no genoma do cloroplasto. Transforma- ção estável como usada aqui pode também se referir a um polinucleo- tídeo que é mantido de forma extracromossômica, por exemplo, como um minicromossomo.

[0057] A transformação transiente pode ser detectada por, por e- xemplo, um ensaio imunoasborvente ligado a enzima (ELISA) ou transferência de Western, que pode detectar a presença de um peptí- deo ou polipeptídeo codificado por uma ou mais moléculas de ácido nucleico introduzidas em um organismo. A transformação estável de uma célula pode ser detectada por, por exemplo, um ensaio de hibri- dação de transferência de Southern de DNA genômico da célula com sequências de ácido nucleico que hibridam especificamente com uma sequência de nucleotídeos de uma molécula de ácido nucleico intro- duzida em um organismo (por exemplo, uma planta). A transformação estável de uma célula pode ser detectada por, por exemplo, um ensaio de hibridação de transferência de Northern de RNA da célula com se- quências de ácido nucleico que hibridam especificamente com uma sequência de nucleotídeos de uma molécula de ácido nucleico intro- duzida em uma planta ou outro organismo. A transformação estável de uma célula pode ser também detectada por, por exemplo, uma reação em cadeia da polimerase (PCR) ou outras reações de amplificação como são bem conhecidas na técnica, empregando sequências inicia- doras específicas que hibridam com sequência(s) alvo de uma molécu- la de ácido nucleico, resultando em amplificação da(s) sequência(s) alvo, que pode ser detectada de acordo com métodos padrão. A trans- formação pode ser também detectada por sequenciação direta e/ou protocolos de hibridação bem conhecidos na técnica.

TRANSFORMAÇÃO

[0058] Os procedimentos para transformação de plantas são bem conhecidos e de rotina na técnica e são descritos ao longo da literatu- ra. Exemplos não limitantes de métodos para transformação de plan- tas incluem transformação através de distribuição de ácido nucleico mediada por bactérias (por exemplo, através de Agrobacteria), distri- buição de ácido nucleico mediada por vírus, distribuição de ácido nu- cleico mediada por carboneto de silício e fibras de ácido nucleico, dis- tribuição de ácido nucleico mediada por lipossoma, microinjeção, bombardeamento de micropartículas, transformação mediada por fos- fato de cálcio, transformação mediada por ciclodextrina, eletroporação, transformação mediada por nanopartículas, sonicação, infiltração, transformação mediada por polímeros, incluindo mas não limitada a captação de ácido nucleico mediada por polietileno glicol (PEG), bem como qualquer outro mecanismo elétrico, químico, físico (mecânico) e/ou biológico que resulte na introdução de ácido nucleico na célula de planta, incluindo qualquer sua combinação. Guias gerais para vários métodos de transformação de plantas conhecidos na técnica incluem Miki et al. ("Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants" em Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B. R. e Thompson, J. E., Eds. (CRC Press, Inc., Boca Raton, 1993), páginas 67-88) e Rakowoczy-Trojanowska (Cell. Mol. Biol. Lett. 7:849-858 (2002)).

[0059] A transformação mediada por Agrobacterium é um método comummente usado para transformar plantas, em particular plantas dicot, devido à sua elevada eficácia de transformação e devido à sua ampla utilidade com muitas espécies diferentes. A transformação me- diada por Agrobacterium envolve tipicamente a transferência do vetor binário transportando o DNA estranho de interesse para uma estirpe de Agrobacterium apropriada que pode depender do complemento de genes vir transportados pela estirpe de Agrobacterium hospedeira em um plasmídeo Ti corresidente ou em termos cromossômicos (Uknes et al. (1993) Plant Cell 5:159-169). A transferência do vetor binário re- combinante para Agrobacterium pode ser conseguida por um procedi- mento de acoplamento triparental usando Escherichia coli transportan- do o vetor binário recombinante, uma estirpe ajudante de E. coli que transporta um plasmídeo que é capaz de mobilizar o vetor binário re- combinante para a estirpe de Agrobacterium alvo. Alternativamente, o vetor binário recombinante pode ser transferido para Agrobacterium por transformação com ácido nucleico (Hófgen & Willmitzer (1988) Nu- cleic Acids Res. 16:9877).

[0060] A transformação de uma planta por Agrobacterium recom- binante envolve usualmente cocultivo da Agrobacterium com explantes da planta e segue métodos bem conhecidos na técnica. O tecido trans- formado é regenerado em meio de seleção transportando um marca- dor de resistência a antibiótico ou herbicida entre as fronteiras do T- DNA de plasmídeo binário.

[0061] Outro método para transformação de plantas, partes de plantas e células de plantas envolve impelir partículas inertes ou biolo- gicamente ativas para tecidos e células de plantas. Ver, por exemplo, Patentes dos EUA Nos. 4,945,050; 5,036,006 e 5,100,792. Geralmen- te, este método envolve impelir partículas inertes ou biologicamente ativas para células de plantas sob condições eficazes para penetrar a superfície exterior da célula e originar incorporação no seu interior. Quando são utilizadas partículas inertes, o vetor pode ser introduzido na célula por revestimento das partículas com o vetor contendo o áci- do nucleico de interesse. Alternativamente, uma célula ou células po- dem estar rodeadas pelo vetor tal que o vetor seja transportado para dentro da célula pela esteira da partícula. Partículas biologicamente ativas (por exemplo, uma célula de levedura seca, uma bactéria seca ou um bacteriófago, cada um contendo um ou mais ácidos nucleicos que precisam ser introduzidos) podem ser também impelidas para te- cido de planta.

[0062] Assim, em formas de realização particulares da presente invenção, uma célula de planta pode ser transformada por qualquer método conhecido na técnica e plantas intactas podem ser regenera- das a partir destas células transformadas usando qualquer uma de uma variedade de técnicas conhecidas. Assim, em algumas formas de realização, uma célula de planta transformada com uma molécula de ácido nucleico da invenção pode ser regenerada por métodos bem co- nhecidos para produzir uma planta ou parte de planta transformada da invenção. A regeneração de plantas a partir de células de plantas, cul- tura de tecidos de plantas e/ou protoplastos cultivados é descrita, por exemplo, em Evans et al. (Handbook of Plant Cell Cultures, Vol. 1, MachMilan Publishing Co. Nova lorque (1983)); e Vasil |. R. (ed.) (Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Acad. Press, Orlando, Vol. 1 (1984), e Vol. 11 (1986)). Métodos de seleção de plantas, células de plantas e/ou cultura de tecidos de plantas transgênicas, transfor- madas são rotina na técnica e podem ser empregues nos métodos da invenção proporcionados aqui.

[0063] Da mesma forma, em algumas formas de realização, as propriedades genéticas manipuladas nas sementes e plantas, partes de plantas, e/ou células de plantas transgênicas da presente invenção descritas acima podem ser passadas por reprodução sexuada ou crescimento vegetativo e podem, portanto ser mantidas e propagadas em plantas da descendência. Geralmente, a manutenção e propaga- ção fazem uso de métodos agrícolas conhecidos desenvolvidos para se ajustarem a propósitos específicos tais como colheita, semeadura ou crescimento de rebentos.

[0064] Uma sequência de nucleotídeos pode, portanto ser introdu- zida na planta, parte de planta e/ou célula de planta em qualquer nú-

mero de maneiras que são bem conhecidas na técnica. Os métodos da invenção não dependem de um método em particular para introdu- ção de uma ou mais sequências de nucleotídeos em uma planta, ape- nas na medida em que ganham acesso ao interior de pelo menos uma célula da planta. Onde mais do que uma sequência de nucleotídeos é para ser introduzida, as sequências de nucleotídeos respectivas po- dem ser montadas como parte de um único constructo/molécula de ácido nucleico, ou como constructos/moléculas de ácido nucleico se- parados, e podem estar localizadas no mesmo ou diferentes construc- tos/moléculas de ácido nucleico. Conformemente, as sequências de nucleotídeos podem ser introduzidas em uma célula em um único e- vento de transformação, em eventos de transformação separados ou, por exemplo, em plantas, como parte de um protocolo de melhoramen- to.

[0065] Em algumas formas de realização desta invenção, a molé- cula de ácido nucleico introduzida pode ser mantida estavelmente na célula de planta se for incorporada em um replicon autônomo não cromossômico ou integrada no(s) cromossomo(s) da planta. Alternati- vamente, a molécula de ácido nucleico introduzida pode estar presente em um vetor não replicado extracromossômico e ser transientemente expressa ou estar transientemente ativa. Quer esteja presente em um vetor não replicante extracromossômico ou um vetor que esteja inte- grado em um cromossoma, a molécula de ácido nucleico pode estar presente em um cassete de expressão de planta.

CONSTRUCTOS DE ÁCIDO NUCLEICO

[0066] Um cassete de expressão de planta ou molécula de ácido nucleico pode conter sequências reguladoras (adicionalmente à se- quência de nucleotídeos de SEQ ID fNo.1) que dirigem a expressão de genes em células de planta que estão operacionalmente ligadas tal que cada sequência cumpra a sua função, por exemplo, terminação da transcrição por sinais de poliadenilação. Sinais de poliadenilação e- xemplares podem ser aqueles tendo origem em T-DNA de Agrobacte- rium tumefaciens tal como o gene conhecido como octopina sintase do plasmídeo Ti pTiACH5 (Gielen et al. EMBO J. 3:835 (1984)) ou seus equivalentes funcionais, mas também são adequados todos os outros terminadores funcionalmente ativos em plantas.

[0067] Assim, algumas formas de realização da invenção estão dirigidas a cassetes de expressão desenhados para expressarem as sequências de nucleotídeos e moléculas de ácido nucleico da presente invenção. Como usada aqui, "cassete de expressão" significa uma mo- lécula de ácido nucleico tendo pelo menos uma sequência de controle operacionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos de interes- se. Desta forma, por exemplo, promotores de plantas em interação operacional ou associados às sequências de nucleotídeos a serem expressas são proporcionados em cassetes de expressão para ex- pressão em uma planta, parte de planta e/ou célula de planta.

[0068] Como usado aqui, o termo "promotor" se refere a uma regi- ão de uma sequência de nucleotídeos que incorpora os sinais neces- sários para a expressão eficiente de uma sequência codificante opera- cionalmente associada ao promotor. Isto pode incluir sequências às quais uma RNA polimerase se liga, mas não está limitado a tais se- quências e pode incluir regiões às quais outras proteínas reguladoras se ligam, em conjunto com regiões envolvidas no controle da tradução de proteínas e pode também incluir sequências codificantes. Além do mais, um "promotor" desta invenção é um promotor (por exemplo, uma sequência de nucleotídeos) capaz de iniciar a transcrição de uma mo- lécula de ácido nucleico em uma célula de uma planta.

[0069] A escolha de promotores usáveis com a presente invenção pode ser feita entre muitos diferentes tipos de promotores. Assim, a escolha de promotores depende de vários fatores, incluindo, mas não limitados a, expressão específica quanto a células ou tecidos, nível de expressão desejado, eficácia, inducibilidade e/ou seletividade. Por e- xemplo, onde é desejada expressão em um tecido ou órgão específico adicionalmente à inducibilidade, pode ser usado um promotor específi- co quanto a tecidos (por exemplo, um promotor específico quanto a raízes). Em contraste, onde é desejada expressão em resposta a um estímulo, pode ser usado um promotor induzível por outros estímulos ou químicos. Onde é desejada expressão contínua ao longo das célu- las de uma planta, pode ser escolhido um promotor constitutivo.

[0070] Exemplos não limitantes de promotores constitutivos inclu- em o promotor do vírus de Cestrum (cmp) (Patente dos E.U.A. fNo. 7,166,770), o promotor de actina 1 de arroz (Wang et al. (1992) Mol. Cell. Biol. 12:3399-3406; bem como Patente dos EUA tNo. 5,641,876), o promotor de 358 do CaMV (Odell et a/. (1985) Nature 313:810-812), o promotor de 198 do CaMV (Lawton et al. (1987) Plant Mol. Biol. 9:315-324), o promotor nos (Ebert et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci USA 84:5745-5749), o promotor de Adh (Walker et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:6624-6629), o promotor de sacarose sintase (Yang & Russell (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4144-4148) e o promotor de ubiquitina.

[0071] Alguns exemplos não limitantes de promotores específicos quanto a tecidos usáveis com a presente invenção incluem aqueles codificando as proteínas de armazenamento de sementes (tais como B-conglicinina, cruciferina, napina e faseolina), zeína ou proteínas de corpos oleosos (tais como oleosina), ou proteínas envolvidas na bios- síntese de ácidos graxos (incluindo a proteína transportadora de acila, estearoíl-ACP dessaturase e desaturases de ácidos graxos (fad 2-1)), e outros ácidos nucleicos expressos durante o desenvolvimento do embrião (tais como Bce4, ver, por exemplo, Kridl et a/. (1991) Seed Sci. Res. 1:209-219; bem como Patente EP No. 255378). Assim, em algumas formas de realização, os promotores associados a estes áci- dos nucleicos específicos quanto a tecidos podem ser usados na pre- sente invenção.

[0072] Exemplos adicionais de promotores específicos quanto a tecidos incluem os, mas não estão limitado aos, promotores especiífi- cos quanto a raízes RCc3 (Jeong et al. Plant Physiol. 153:185-197 (2010)) e RB7 (Patente dos E.U.A. No. 5459252), o promotor de lecti- na (Lindstrom et a/. (1990) Der. Genet. 11:160-167; e Vodkin (1983) Prog. Clin. Biol. Res. 138:87-98), o promotor da álcool desidrogenase 1 do milho (Dennis et a/. (1984) Nucleic Acids Res. 12:3983-4000), S- adenosil-L-metionina sintetase (SAMS) (Vander Miinsbrugge et al. (1996) Plant and Cell Physiology, 37(8):1108-1115), o promotor do complexo de coleta de luz do milho (Bansal et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3654-3658), o promotor da proteína de choque tér- mico do milho (O'Dell et al. (1985) EMBO J. 5:451-458; e Rochester et al. (1986) EMBO J. 5:451-458), o promotor da subunidade pequena da RuBP carboxilase de ervilha (Cashmore, "Nuclear genes encoding the small subunit of ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase" 29-39 Em: Genetic Engineering of Plants (Hollaender ed., Plenum Press 1983); e Poulsen et a/. (1986) Mol. Gen. Genet. 205:193-200), promotor da ma- nopina sintase do plasmídeo Ti (Langridge et a/. (1989) Proc. Natl. A- cad. Sci. USA 86:3219-3223), promotor da nopalina sintase do plasmí- deo Ti (Langridge et a/. (1989), supra), o promotor da calcona isome- rase da petúnia (van Tunen et a/. (1988) EMBO J. 7:1257-1263), o promotor da proteína rica em glicina 1 do feijão (Keller et a/. (1989) Genes Dev. 3:1639-1646), promotor de 358 do CaMV truncado (O'Dell et al. (1985) Nature 313:810-812), o promotor da patatina da batata (Wenzler et a/. (1989) Plant Mol. Biol. 13:347-354), promotor de células de raízes (Yamamoto et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18:7449), pro- motor da zeína do milho (Kriz et al. (1987) Mol. Gen. Genet. 207:90-

98; Langridge et a/. (1983) Cell 34:1015-1022; Reina et a/. (1990) Nu- cleic Acids Res. 18:6425; Reina et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18:7449; e Wandelt et a/. (1989) Nucleic Acids Res. 17:2354), o pro- motor da globulina-1 (Belanger et a/. (1991) Genetics 129:863-872), o promotor cab da a-tubulina (Sullivan et al. (1989) Mol. Gen. Genet. 215:431-440), o promotor da PEPCase (Hudspeth & Grula (1989) Plant Mol. Biol. 12:579-589), os promotores associados ao complexo do gene R (Chandler et a/. (1989) Plant Cell 1:1175-1183), e promoto- res da calcona sintase (Franken et a/. (1991) EMBO J. 10:2605-2612). Particularmente úteis para expressão específica quanto a sementes é o promotor da vicilina da ervilha (Czako et al. (1992) Mol. Gen. Genet. 235:33-40; bem como Patente dos EUA No. 5,625,136). Outros promo- tores úteis para expressão em folhas maduras são aqueles que são ativados aquando do início da senescência, tais como o promotor de SAG de Arabidopsis (Gan et al. (1995) Science 270:1986-1988).

[0073] Adicionalmente, podem ser usados promotores funcionais em plastídeos. Exemplos não limitantes de tais promotores incluem a UTR 5' do gene 9 do bacteriófago T3 e outros promotores divulgados na Patente dos E.U.A. tNo. 7,579,516. Em outras formas de realiza- ção, promotores úteis com a presente invenção incluem mas não es- tão limitados ao promotor da subunidade pequena da RuBP carboxila- se S-E9 e o promotor do gene do inibidor da tripsina Kunitz (Kti3).

[0074] Em alguns casos, promotores induzíveis são usáveis com a presente invenção. Exemplos de promotores induzíveis usáveis com a presente invenção incluem, mas não estão limitados a, promotores do sistema repressor da tetraciclina, promotores do sistema repressor Lac, promotores do sistema induzível por cobre, promotores do siste- ma induzível por salicilato (por exemplo, o sistema PR1a), promotores induzíveis por glicocorticoide (Aoyama et al. (1997) Plant J. 11:605- 612), e promotores do sistema induzível por ecdisona. Outros exem-

plos não limitantes de promotores induzíveis incluem promotores indu- zíveis por ABA e turgor, o promotor do gene da proteína de ligação à auxina (Schwob et a/. (1993) Plant J. 4:423-432), o promotor da glicosil transferase de UDP glicose flavonoide (Ralston et a/. (1988) Genetics 119:185-197), o promotor do inibidor de proteinase MPI (Cordero et al. (1994) Plant J. 6:141-150), o promotor da gliceraldeído-3-fosfato desi- drogenase (Kohler et a/. (1995) Plant Mol. Biol. 29:1293-1298; Marti- nez et al. (1989) J. Mol. Biol. 208:551-565; e Quigley et a/. (1989) J. Mol. Evol. 29:412-421), os promotores induzíveis por benzeno sulfo- namida (Patente dos EUA No. 5,364,780) e os promotores da glutatio- na S-transferase. Da mesma forma, se pode usar qualquer promotor induzível apropriado descrito em Gatz (1996) Current Opinion Biotech- nol. 7:168-172 e Gatz (1997) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48:89-108.

[0075] Como descrito acima, o intensificador (por exemplo, SEQ ID fNo.1) pode ser usado com qualquer promotor conhecido daqueles com perícia na técnica para expressão de uma sequência de nucleotí- deos de interesse em uma planta de cana-de-açúcar. Em formas de realização particulares, um intensificador da invenção (por exemplo, SEQ ID ttNo.1) está operacionalmente ligado a um promotor de poliu- biquitina-1 do milho e/ou um promotor de PepC do milho, que por seu turno está operacionalmente ligado a uma sequência de nucleotídeos de interesse.

[0076] Adicionalmente ao intensificador (por exemplo, SEQ ID fNo.1) e promotores descritos acima, o cassete de expressão pode também incluir outras sequências reguladoras. Como usado aqui, "se- quências reguladoras" significam sequências de nucleotídeos localiza- das a montante (sequências 5' não codificantes), dentro ou a jusante (sequências 3' não codificantes) de uma sequência codificante, e que influenciam a transcrição, processamento ou estabilidade de RNA, ou tradução da sequência codificante associada. Adicionalmente aos promotores, as sequências reguladoras incluem, mas não estão limita- das a, intensificadores adicionais, íntrons, sequências Kozak, sequên- cias líder da tradução e sequências de sinal de poliadenilação.

[0077] Se sabe que um número de sequências líder não traduzi- das derivadas de vírus intensifica a expressão de genes. Especifica- mente, se mostrou que sequências líder do Vírus do Mosaico do Ta- baco (TMV, a "sequência wW"), Vírus do Mosqueado Clorótico do Milho (MCMV) e Vírus do Mosaico da Alfafa (AMV) são eficazes na intensifi- cação da expressão (Gallie et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:8693- 8711; e Skuzeski et al. (1990) Plant Mol. Biol. 15:65-79). Outras se- quências líder conhecidas na técnica incluem, mas não estão limitadas a, líderes de picornavírus tais como um líder de região não codificante 5' da encefalomiocardite (EMCV) (Elroy-Stein et a/. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6126-6130); líderes de potivírus tais como um líder do Vírus Etch do Tabaco (TEV) (Allison et a/. (1986) Virology 154:9- 20); líder do Vírus do Mosaico Anão do Milho (MDMV) (Allison et al. (1986), supra); líder da proteína de ligação da cadeia pesada da imu- noglobulina humana (BiP) (Macejak & Samow (1991) Nature 353:90- 94); líder não traduzido do mMRNA da proteína de revestimento do AMV (AMV RNA 4; Jobling & Gehrke (1987) Nature 325:622-625); líder do TMV do mosaico do tabaco (Gallie et al. (1989) Molecular Biology of RNA 237-256); e líder do MCMV (Lommel et al. (1991) Virology 81:382-385). Ver também, Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968.

[0078] Um cassete de expressão pode também opcionalmente in- cluir uma região de terminação transcricional e/ou translacional (isto é, região de terminação) que é funcional em plantas. Uma variedade de terminadores transcricionais está disponível para uso em cassetes de expressão e é responsável pela terminação da transcrição para além da sequência de nucleotídeos heteróloga e a poliadenilação correta do MRNA. A região de terminação pode ser nativa em relação à região de iniciação transcricional, pode ser nativa em relação à sequência de nucleotídeos de interesse operacionalmente ligada, pode ser nativa em relação à planta hospedeira, ou pode ser derivada de outra fonte (isto é, estrangeira ou heteróloga em relação ao promotor, à sequência de nucleotídeos de interesse, à planta hospedeira, ou qualquer sua combinação). Terminadores transcricionais apropriados incluem o, mas não estão limitados ao, terminador de 358 do CAMV, o termina- dor de tml, o terminador da nopalina sintase e o terminador de rbcs E9 da ervilha. Estes podem ser usados tanto em monocotiledôneas como em dicotiledôneas. Adicionalmente, pode ser usado um terminador da transcrição nativo de uma sequência codificante.

[0079] Em algumas formas de realização particulares, uma se- quência sinal pode estar operacionalmente ligada a uma molécula de ácido nucleico da presente invenção para dirigir a molécula de ácido nucleico para um compartimento celular. Desta forma, o cassete de expressão pode compreender uma molécula de ácido nucleico da pre- sente invenção operacionalmente ligada a uma sequência de nucleotí- deos da sequência sinal. A sequência sinal pode estar operacional- mente ligada na extremidade N- ou C-terminal da molécula de ácido nucleico.

[0080] Como descrito acima, em algumas formas de realização, o cassete de expressão ou molécula de ácido nucleico da presente in- venção pode incluir uma sequência Kozak, em que a sequência Kozak está imediatamente a montante (por exemplo, imediatamente a mon- tante) da sequência de nucleotídeos de interesse e a jusante do pro- motor e em associação operacional com ambos o promotor e a se- quência de nucleotídeos de interesse. Em algumas formas de realiza- ção particulares, a sequência de Kozak é gcggceegcec.

[0081] O cassete de expressão pode também incluir uma sequên- cia de nucleotídeos para um marcador selecionável, que pode ser u- sado para selecionar uma planta, parte de planta e/ou célula de planta transformadas. Como usado aqui, "marcador selecionável" significa uma sequência de nucleotídeos que quando expressa fornece um fe- nótipo distinto à planta, parte da planta e/ou célula da planta expres- sando o marcador e permite assim que tais plantas, partes da planta e/ou células da planta transformadas sejam distinguidas daquelas que não têm o marcador. Uma tal sequência de nucleotídeos pode codifi- car ou um marcador selecionável ou marcador rastreável, dependendo de se o marcador confere um traço que pode ser selecionado por mei- os químicos, tal como por uso de um agente seletivo (por exemplo, um antibiótico, herbicida, ou similares), ou se o marcador é simplesmente um traço que se pode identificar através de observação ou teste, tal como por rastreamento (por exemplo, o traço do lócus R). Obviamen- te, muitos exemplos de marcadores selecionáveis adequados são co- nhecidos na técnica e podem ser usados nos cassetes de expressão descritos aqui.

[0082] Exemplos de marcadores selecionáveis incluem, mas não estão limitados a, uma sequência de nucleotídeos codificando neo ou nptll, que confere resistência à canamicina, G418, e similares (Potry- kus et al. (1985) Mol. Gen. Genet. 199:183-188); uma sequência de nucleotídeos codificando bar, que confere resistência à fosfinotricina; uma sequência de nucleotídeos — codificando uma 5- enolpiruvilshikimato-3-fosfato (EPSP) sintase, que confere resistência ao glifosato (Hinchee et a/. (1988) Biotech. 6:915-922); uma sequência de nucleotídeos codificando uma nitrilase tal como bxn de Klebsiella ozaenae que confere resistência ao bromoxinil (Stalker et a/. (1988) Science 242:419-423); uma sequência de nucleotídeos codificando uma acetolactato sintase (ALS) alterada que confere resistência à imi-

dazolinona, sulfonilureia ou outros produtos químicos inibidores da ALS (Pedido de Patente EP No. 154204); uma sequência de nucleotí- deos codificando uma diidrofolato redutase (DHFR) resistente a meto- trexato (Thillet et a/. (1988) J. Biol. Chem. 263:12500-12508); uma se- quência de nucleotídeos codificando uma dalapon dehalogenase que confere resistência ao dalapon; uma sequência de nucleotídeos codifi- cando uma manose-6-fosfato isomerase (também referida com fosfo- manose isomerase (PMI)) que confere uma capacidade de metabolizar a manose (Patentes dos EUA Nos. 5,767,378 e 5,994,629); uma se- quência de nucleotídeos codificando uma antranilato sintase alterada que confere resistência ao 5-metil triptofano; e/ou uma sequência de nucleotídeos codificando hph que confere resistência à higromicina. Um com perícia na técnica é capaz de escolher um marcador selecio- nável adequado para uso em um cassete de expressão desta inven- ção.

[0083] Marcadores selecionáveis adicionais incluem, mas não es- tão limitados a, uma sequência de nucleotídeos codificando B- glucuronidase ou uidA (GUS) que codifica uma enzima para a qual são conhecidos vários substratos cromogênicos; uma sequência de nucle- otídeos do lócus R que codifica um produto que regula a produção de pigmentos de antocianina (cor vermelha) em tecidos de plantas (Della- porta et al., "Molecular cloning of the maize R-nj allele by transposon- tagging with Ac" 263-282 Em: Chromosome Structure and Function: Impact of New Concepts, 18th Stadler Genetics Symposium (Gustaf- son & Appels eds., Plenum Press 1988)); uma sequência de nucleotí- deos codificando B-lactamase, uma enzima para a qual são conheci- dos vários substratos cromogênicos (por exemplo, PADAC, uma cefa- losporina cromogênica) (Sutcliffe (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:3737-3741); uma sequência de nucleotídeos codificando xy/E que codifica uma catecol dioxigenase (Zukowsky et al. (1983) Proc. Natl.

Acad. Sci. USA 80:1101-1105); uma sequência de nucleotídeos codifi- cando tirosinase, uma enzima capaz de oxidar a tirosina em DOPA e dopaquinona, que por seu turno condensa para formar melanina (Katz et al. (1983) J. Gen. Microbiol. 129:2703-2714); uma sequência de nu- cleotídeos codificando B-galactosidase, uma enzima para a qual exis- tem substratos cromogênicos; uma sequência de nucleotídeos codifi- cando luciferase (lux) que permite detecção por bioluminescência (Ow et al. (1986) Science 234:856-859); uma sequência de nucleotídeos codificando aequorina que pode ser empregue em detecção por bio- luminescência sensível ao cálcio (Prasher et a/. (1985) Biochem. Bio- bphys. Res. Comm. 126:1259-1268); ou uma sequência de nucleotí- deos codificando uma proteína verde fluorescente (Niedz et al. (1995) Plant Cell Reports 14:403-406). Um com perícia na técnica é capaz de escolher um marcador selecionável adequado para uso em um casse- te de expressão desta invenção.

SEQUÊNCIAS DE NUCLEOTÍDEOS DE INTERESSE

[0084] Uma molécula de ácido nucleico ou cassete de expressão pode também incluir uma sequência codificante de um ou mais poli- peptídeos quanto a traços agronômicos que têm principalmente bené- ficos para uma empresa de sementes, produtor e processador de grãos. Um polipeptídeo de interesse pode ser qualquer polipeptídeo codificado por uma sequência de nucleotídeos de interesse. Exemplos não limitantes de polipeptídeos de interesse que são adequados para produção em plantas incluem aqueles que resultam em traços agro- nomicamente importantes tais como a resistência a herbicidas (tam- bém por vezes referida como "tolerância herbicida"), resistência a ví- rus, resistência a patogênios bacterianas, resistência a insetos, resis- tência a nematódeos e/ou resistência a fungos. Ver, por exemplo, Pa- tentes dos E.U.A. tNos. 5,569,823; 5,304,730; 5,495,071; 6,329,504; e 6,337,431. O polipeptídeo pode ser também um que aumenta o vigor ou rendimento da planta (incluindo traços que permitem que uma plan- ta cresça em diferentes temperaturas, condições de solo e de níveis de luz solar e precipitação), ou um que permite identificação de uma planta exibindo um traço de interesse (por exemplo, um marcador se- lecionável, cor do revestimento da semente etc..). Vários polipeptídeos de interesse, bem como métodos para introdução destes polipeptídeos em uma planta, são descritos, por exemplo, nas Patentes dos EUA Nos. 4,761,373; 4,/769,061; 4,810,648; 4,940,835; 4,975,374; 5,013,659; 5,162,602; 5,276,268; 5,304,730; 5,495,071; 5,554,798; 5,561,236; 5,569,823; 5,767,366; 5,879,903, 5,928,937; 6,084,155; 6,329,504 e 6,337,431; bem como Publicação de Patente dos EUA fNo. 2001/0016956. Ver também, na Internet em |lifes- ci.sussex.ac.uk/home/Neil Crickmore/Bt/.

[0085] Sequências de nucleotídeos conferindo resistên- cia/tolerância a um herbicida que inibe o ponto de cultivo ou meriste- ma, tal como uma imidazalinona ou uma sulfonilureia, podem ser tam- bém adequadas em algumas formas de realização da invenção. Se- quências de nucleotídeos exemplares nesta categoria codificam enzi- mas ALS e AHAS mutantes como descrito, por exemplo, nas Patentes dos E.U.A. fNos. 5,/767,366 e 5,928,937. As Patentes dos E.U.A. tNos. 4,761,373 e 5,013,659 são dirigidas a plantas resistentes a vá- rios herbicidas de imidazalinona ou sulfonamida. A Patente dos E.U.A. tNo. 4,975,374 se relaciona com células de plantas e plantas conten- do um ácido nucleico codificando uma glutamina sintetase (GS) mu- tante resistente à inibição por herbicidas que se sabem que inibem a GS, por exemplo, fosfinotricina e metionina sulfoximina. A Patente dos E.U.A. tNo. 5,162,602 divulga plantas resistentes à inibição pelos her- bicidas ciclohexanodiona e ácido ariloxifenoxipropanoico. A resistência é conferida por uma acetilcoenzima A carboxilase (ACCase) alterada.

[0086] Polipeptídeos codificados por sequências de nucleotídeos conferindo resistência ao glifosato são também adequados para uso com a presente invenção. Ver, por exemplo, Patente dos E.U.A. tNo. 4,940,835 e Patente dos E.U.A. tfNo. 4,769,061. A Patente dos E.U.A: tNo. 5,554,798 divulga plantas de milho transgênicas resistentes ao glifosato, cuja resistência é conferida por um gene da 5-enolpiruvil-3- fosfoshikimato (EPSP) sintase alterado.

[0087] Sequências de nucleotídeos codificando resistência a com- postos fosfono tais como glufosinato de amônio ou fosfinotricina, e á- cidos piridinoxi ou fenoxi propiônicos e ciclohexonas são também ade- quadas. Ver, Pedido de Patente Europeia fNo. O 242 246. Ver tam- bém, Patentes dos E.U.A. Nos. 5,879,903, 5,276,268 e 5,561,236.

[0088] Outras sequências de nucleotídeos adequadas incluem a- quelas codificando resistência a herbicidas que inibem a fotossíntese, tais como uma triazina e uma benzonitrila (nitrilase). Ver, Patente dos E.U.A. No. 4,810,648. Sequências de nucleotídeos adequadas adicio- nais codificando resistência a herbicidas incluem aquelas codificando resistência ao ácido 2,2-dicloropropiônico, setoxidim, haloxifop, herbi- cidas de imidazolinona, herbicidas de sulfonilureia, herbicidas de tria- zolpirimidina, herbicidas de s-triazina e bromoxinil. Também adequa- das são sequências de nucleotídeos conferindo resistência a uma en- zima protox, ou que proporcionam resistência intensificada a doenças de plantas; tolerância intensificada a condições ambientais adversas (estresse abiótico), incluindo mas não se limitando a seca, frio exces- sivo, calor excessivo, salinidade do solo excessiva ou acidez ou alcali- nidade extrema; e alterações na arquitetura ou desenvolvimento da planta, incluindo mudanças no tempo de desenvolvimento. Ver, por exemplo, Publicação de Patente dos E.U.A. tNo. 2001/0016956 e Pa- tente dos E.U.A. tNo. 6,084,155.

[0089] Proteínas inseticidas úteis na invenção podem ser produzi- das em uma quantidade suficiente para controlar pragas de insetos,

isto é, quantidades de controle de insetos. É reconhecido que a quan- tidade de produção de proteína inseticida em uma planta necessária para controle de insetos pode variar dependendo do cultivar, tipo de inseto, factores ambientais e similares. Sequências de nucleotídeos úteis para resistência a insetos ou pragas incluem, por exemplo, aque- las que codificam toxinas identificadas em organismos Bacillus. Se- quências de nucleotídeos codificando toxinas de Bacillus thuringiensis (Bt) de várias subespécies foram clonadas e se descobriu que clones recombinantes eram tóxicos para larvas de insetos lepidópteros, cole- ópteros e dípteros (por exemplo, vários genes de delta-endotoxina tais como Cry1Ãa, Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1B, Cry1C, Cry1D, CryfEa, Cry1Fa, Cry3A, Cry9A, Cry9C e Cry9B; bem como genes codificando proteínas inseticidas vegetativas tais como Vip1, Vip2 e Vip3). Uma lista completa de toxinas Bt pode ser encontrada na internet na Base de Dados de Nomenclatura de Toxinas de Bacillus thuringiensis man- tida pela Universidade de Sussex (ver também, Crickmore et a/. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:807-813).

[0090] Polipeptídeos que são adequados para produção em plan- tas incluem adicionalmente aqueles que melhoram ou de outro modo facilitam a conversão de plantas coletadas e/ou partes de plantas em um produto comercialmente útil, incluindo, por exemplo, conteúdo e/ou de distribuição de carboidratos aumentado ou alterado, propriedades de fermentação melhoradas, conteúdo de óleo aumentado, conteúdo de proteínas aumentado, digestibilidade melhorada, conteúdo de nu- tracêuticos aumentado, por exemplo, conteúdo de fitoesterol aumenta- do, conteúdo de tocoferol aumentado, conteúdo de estanol aumentado e/ou conteúdo de vitaminas aumentado. Polipeptídeos de interesse incluem, por exemplo, aqueles resultando em ou contribuindo para um reduzido conteúdo de um componente indesejável em uma cultura co- letada, por exemplo, ácido fítico, ou enzimas de degradação de açú-

car. Por "resultando em" ou "contribuindo para" se pretende que o po- lipeptídeo de interesse possa diretamente ou indiretamente contribuir para a existência de um traço de interesse (por exemplo, aumento da degradação da celulose pelo uso de uma enzima celulase heteróloga).

[0091] Em uma forma de realização, o polipeptídeo de interesse contribui para digestibilidade melhorada de alimentos ou rações. As xilanases são enzimas hemicelulolíticas que melhoram a degradação das paredes celulares da planta, o que leva a uma melhor utilização dos nutrientes da planta por um animal. Isto leva a uma taxa de cres- cimento e conversão das rações aumentadas. Igualmente, a viscosi- dade das rações contendo xilano pode ser reduzida por xilanases. À produção heteróloga de xilanases em células de plantas pode também facilitar a conversão lignocelulósica em açúcares fermentáveis no pro- cessamento industrial.

[0092] Numerosas xilanases de microrganismos fúngicos e bacte- rianos foram identificadas e caracterizadas (ver, por exemplo, Patente dos E.U.A. tNo. 5,437,992; Coughlin et al. (1993) "Proceedings of the Second TRICEL Symposium on Trichoderma reesei Cellulases and Other Hydrolases" Espoo; Souminen e Reinikainen, eds. (1993) Foun- dation for Biotechnical and Industrial Fermentation Research 8:125- 135; Publicação de Patente dos E.U.A. fNo. 2005/0208178; e Publicação PCT fNo. WO 03/16654). Em particular, três xilanases es- pecíficas (XYL-Il, XYL-Il, e XYL-III) foram identificadas em T. reesei (Tenkanen et al. (1992) Enzyme Microb. Technol. 14:566; Torronen et al. (1992) Bio/Technology 10:1461; e Xu et al. (1998) Appl. Microbiol. Biotechnol. 49:718).

[0093] Em outra forma de realização, um polipeptídeo útil para a presente invenção pode ser uma enzima de degradação de polissaca- rídeos. As plantas desta invenção produzindo uma tal enzima podem ser úteis para geração de, por exemplo, matérias-primas de fermenta-

ção para bioprocessamento. Em algumas formas de realização, as en- zimas úteis para um processo de fermentação incluem alfa-amilases, proteases, pululanases, isoamilases, celulases, hemicelulases, xilana- ses, ciclodextrina glicotransferases, lipases, fitases, lacases, oxidases, esterases, cutinases, enzima da hidrólise do amido granular ou outras glucoamilases.

[0094] Enzimas que degradam polissacarídeos incluem: enzimas de degradação do amido tais como a-amilase (EC 3.2.1.1), glucuroni- dases (E.C. 3.2.1.131), exo-1,4-a-D-glucanases tais como amilogluco- sidases e glucoamilase (EC 3.2.1.3), B-amilases (EC 3.2.1.2), o- glucosidases (EC 3.2.1.20), e outras exo-amilases; enzimas de des- ramificação do amido, tais como: a) isoamilase (EC 3.2.1.68), pulula- nase (EC 3.2.1.41), e similares, b) celulases tais como exo-1,4-3- celobiohidrolase (EC 3.2.1.91), exo-1,3-B-D-glucanase (EC 3.2.1.39), B-glucosidase (EC 3.2.1.21), c) L-arabinases, tais como endo-1,5-a-L- arabinase (EC 3.2.1.99), a-arabinosidases (EC 3.2.1.55) e similares; d) galactanases tais como endo-1,4-B-D-galactanase (EC 3.2.1.89), en- do-1,3-B-D-galactanase (EC 3.2.1.90), a-galactosidase (EC 3.2.1.22), B-galactosidase (EC 3.2.1.23) e similares; e) mananases, tais como endo-1,4-B-D-mananase (EC 3.2.1.78), B-manosidase (EC 3.2.1.25), a-manosidase (EC 3.2.1.24) e similares, f) xilanases, tais como endo- 1,4-B-xilanase (EC 3.2.1.8), B-D-xilosidase (EC 3.2.1.37), 1,3-B-D- xilanase, e similares; e g) outras enzimas tais como a-L-fucosidase (EC 3.2.1.51), a-L-ramnosidase (EC 3.2.1.40), levanase (EC 3.2.1.65), inulanase (EC 3.2.1.7), e similares.

[0095] Enzimas adicionais que podem ser usadas com a presente invenção incluem proteases, tais como proteases fúngicas e bacteria- nas. As proteases fúngicas incluem aquelas, mas não estão limitadas àquelas, obtidas a partir de Aspergillus, Trichoderma, Mucor e Rhizo- bus, tais como A. niger, A. awamori, A. oryzae e M. miehei. Em algu-

mas formas de realização, os polipeptídeos desta invenção podem ser enzimas celobiohidrolase (CBH) (EC 3.2.1.91). Em uma forma de rea- lização, a enzima celobiohidrolase pode ser CBH1 ou CBH2.

[0096] Outras enzimas úteis incluem, mas não estão limitadas a, hemicelulases, tals como manases e arabinofuranosidases (EC

3.2.1.55); ligninases; lipases (por exemplo, E.C. 3.1.1.3), glucose oxi- dases, pectinases, xilanases, transglucosidases, alfa-1,6-glucosidases (por exemplo, E.C. 3.2.1.20); celobiohidrolases; esterases tais como esterase de ácido ferúlico (EC 3.1.1.73) e acetil xilano esterases (EC

3.1.1.72); e cutinases (por exemplo, E.C, 3.1.1.74).

[0097] As sequências de nucleotídeos de interesse podem tam- bém incluir sequências de nucleotídeos codificando ácidos nucleicos funcionais incluindo, mas não limitadas a, ribozimas, siRNA, sGRNA e/ou miRNA.

[0098] A presente invenção será agora descrita com referência aos seguintes exemplos. Deve ser apreciado que estes exemplos não se destinam a limitar o escopo das reivindicações à invenção, mas se destinam ao invés a ser exemplares de certas formas de realização. Quaisquer variações nos métodos exemplificados que ocorram ao es- pecialista perito se destinam a estar dentro do escopo da presente in- venção.

EXEMPLOS EXEMPLO 1. PRODUÇÃO DE CONSTRUCTOS

[0099] Todas as reações em cadeia da polimerase (PCR) foram levadas a cabo usando KAPAHIFi DNA polymerase (Geneworks), e os produtos de PCR resultantes foram clonados em pGEM-T (Promega) e a sequência verificada antes de subclonagem.

[00100] Cada um dos constructos possui as seguintes característi- cas:

[00101] A sequência codificante de beta-glucoronidase (GUS) que está otimizada quanto à expressão na cana-de-açúcar (scoGUS; oti- mização Geneartº)

[00102] Uma sequência Kozak (gcggccegcc), que foi colocada ime- diatamente a montante da sequência codificante de scoOGUS

[00103] Uma sequência intensificadora translacional TMVO, que foi colocada imediatamente a montante da Kozak (gtatttttacaacaattaccaacaa- aacaaacaacaaacaacattacaattactatttacaattaca, SEQ ID fNo.2)

[00104] As sequências scoOGUS, TMVO e Kozak, em conjunto com o terminador de nopalina sintase (nos), foram feitas sinteticamente, e incluíram locais de enzimas de restrição em cada extremidade para clonagem. Os genes de TMVO, Kozak, scoGUS, e terminador nos fo- ram subclonados em pBluescript usando Pstl e Sacll para gerar sco- GUS/pBS. As sequências intensificadoras transcricionais duais do ví- rus do mosaico da escapulária (eFMV) e vírus do mosaico da couve- flor (e35S) foram feitas sinteticamente, e incluíram locais de enzimas de restrição em cada extremidade para clonagem.

[00105] O constructo SC11 foi gerado como se segue: O promotor de ubiquitina do milho (ZmMUbi), que consiste em 1993 bp da sequência diretamente a montante do local de início translacional da poliubiquiti- na e inclui o íntron de 1010 bp na região não traduzida 5' (UTR), foi amplificado usando PCR (adicionando um local Hindlll na extremidade 5' e um local Pstl site na extremidade 3'), clonado em pGEM-T, e a sequência verificada. ZmMUbi foi subsequentemente subclonado em scoGUS/pBS usando Hindlll e Pstl para gerar o plasmídeo ZmUbi- scoGUS. O ZmUbi-scoGUS e a sequência nos foram subclonados no constructo binário UbinptlINos(S) usando Hindlll e Ascl para gerar o constructo SC11.

[00106] O constructo SC24 foi gerado como se segue: O promotor de fosfoenolpiruvato carboxilase do milho (ZMPEPC), que consiste em

2423 bp da sequência diretamente a montante do local de início trans- lacional da PepC, o primeiro éxon, o primeiro íntron, e 20 bp do se- gundo éxon, foi amplificado usando PCR (adicionando um local Hindlll na extremidade 5' e um local Pst|l site na extremidade 3'), clonado em PGEM-T, e a sequência verificada. ZMPEPC foi subsequentemente subclonado em scoGUS/pBS usando Hindlll e Pstl para gerar o plas- mídeo ZMPEPC-scoGUS. O ZMPEPC-scoGUS e a sequência nos fo- ram subclonados no constructo binário UbinptlINos(S) usando Hindlll e Ascl para gerar o constructo SC24.

[00107] O constructo SC25 foi gerado como se segue: O intensifi- cador transcricional dual (eFMVe35S) foi subclonado no plasmídeo ZmMPEPC-scoGUS usando Hindlll e Swal para gerar o plasmídeo eFMVe35S-ZmMPEPC-scoGUS. O eFMVe35S-ZmPEPC-scoGUS e a sequência nos foram subclonados no constructo binário UbinptlINos(S) usando Hindlll e Ascl para gerar o constructo SC25.

[00108] O constructo SC27 foi gerado como se segue: O intensifi- cador transcricional dual (eFMVe35S) foi subclonado no plasmídeo ZmUbi-scoGUS usando Hindlll e Swal para gerar o plasmídeo eFM- Ve35S-ZmUbi-scoGUS. O eFMVe35S-ZmUbi-scoGUS e a sequência nos foram subclonados no constructo binário UbinptlINos(S) usando Hindlll e Ascl para gerar o constructo SC27.

[00109] O constructo SC28 foi gerado como se segue: O íntron de ubiquitina do milho (1010 bp), em conjunto com 40 bp da sequência de éxon flanqueante 5' (iUbi), foi excisado como um fragmento de Balll e BamHlI e clonado no local BamHI do plasmídeo pCMP-PMI/pBS (con- tendo a sequência promotora viral de Cestrum, pCMP, de 397 bp) para gerar pCMP-iUbi-PMI/pBS. A sequência de pCMP-iUbi foi clonada por PCR a partir de pCMP-iUbi-PMI/pBS (adicionando locais de enzimas de restrição para Hindlll e Swal na extremidade 5º e um local Pstl na extremidade 3'). A sequência de pCMP-iUbi foi subclonada em sco-

GUS/pBS usando Hindll e Pstl. O pCMP-iUbi-scoGUS e a sequência nos foram subclonados no constructo binário UbinptlINos(S) usando Hindlll e Ascl para gerar o constructo SC28.

[00110] O constructo SC29 foi gerado como se segue: O intensifi- cador transcricional dual (eFMVe35S) foi subclonado no plasmídeo pCMP-iUbi-scoGUS usando Hindlll e Swal para gerar o plasmídeo eFMVe35S-pCMP-iUbi-scoGUS. O eFMVe35S-pCMP-iUbi-scoGUS e a sequência nos foram subclonados no constructo binário Ubinptll- Nos(S) usando Hindlll e Ascl para gerar o constructo SC29.

[00111] Umalistados constructos é proporcionada na Tabela 1. Tabela 1. Lista de constructos otimizados por promotor GUS EXEMPLO 2. TRANSFORMAÇÃO MEDIADA POR AGROBACTERI- UM DA CANA-DE-AÇÚCAR

[00112] Os constructos binários foram transferidos para a estirpe AGL1 de Agrobacterium usando um método de transformação por choque térmico padrão. Agrobacterium contendo cada um dos cons- tructos binários foram usadas para transformar cana-de-açúcar usando os seguintes métodos.

[00113] Fontee material de planta: Material espiral da folha de plan- tas de cana-de-açúcar cultivadas em campo foi coletado e iniciado em meio EM3 (ver em baixo). Seções transversais (aproximadamente 20) de espiral de folha imatura entre 1-3 mm de espessura foram tiradas imediatamente acima do meristema e colocadas na orientação virada para cima. As culturas foram mantidas no escuro a 25 € durante 28 a 42 dias. O calo utilizado para a transformação foi no espaço de 4 a 10 dias da última subcultura. O calo foi selecionado quanto às caracterís- ticas morfológicas tais como estrutura compacta e cor amarela. Calos embriogênicos amarelos foram selecionados sempre que possível, pois eles proporcionavam boa regeneração, transformação consisten- te, e fragmentavam em pequenos aglomerados (2 a 4 mm).

[00114] Infecção e cocultivo: O tecido caloso foi aquecido por calor a 45 C durante 5 minutos por adição de 50 mL de meio MS de é for- ça pré-aquecido (sem sacarose) e depois manutenção do calo em um banho de água a 45 C. O meio MS foi depois drenado do tecido calo- so, e 25 mL da suspensão de inoculação de Agrobacterium foram adi- cionados a cada vaso e misturados gentilmente. A mistura ca- lo/Agrobacterium foi infiltrada a vácuo por sua colocação em uma câ- mara de vácuo durante 10 minutos a -27,5 mmHg. A mistura ca- lo/Agrobacterium foi depois repousada durante 5 a 10 minutos no es- curo.

[00115] A suspensão de inoculação de Agrobacterium foi depois drenada do calo, e a cultura de calos restante foi seca com papel ab- sorvente para remover suspensão de inoculação de Agrobacterium em excesso. Tecidos da planta foram secos com papel de filtro tal como papel de Grau 1 da Whatman, até a suspensão de inoculação de A- grobacterium ser substancialmente removida. O calo foi depois trans- ferido para cocultivo para placas de Petri de 90 x 25 mm não contendo nenhum meio de cocultura ou contendo papéis de filtro secos umede- cidos com água estéril, e selado com fita NESCOFILMº, MICROPO- REY (3M; Minneapolis, MN) ou material similar. As placas foram incu- badas no escuro a 22 C durante 2 a 3 dias.

[00116] Pós-transformação: Após o cocultivo, o tecido caloso foi transferido para meio MS 1 (ver em baixo) contendo com 200 mg/L de timentina (meio de "repouso") e mantido no escuro a 25 “C durante 4 dias. O primeiro passo de seleção foi feito em meio MS 2 (ver em bai- xo) contendo 50 mg/L de geneticina e 200 mg/L de timentina durante 14 a 15 dias no escuro a 25 €.

[00117] Regeneração e enraizamento: A regeneração foi conduzida em meio MS 3 (ver em abixo) suplementado com 50 mg/L de genetici- na e 200 mg/L de timentina a 25 C em 16 hr de luz. Foram requeridas aumentos graduais na intensidade da luz. Durante a primeira semana, a cultura foi deixada em uma bancada de laboratório sob iluminação de sala normal, e durante as 3 semanas seguintes, a cultura foi culti- vada a intensidade de luz moderada. A formação dos rebentos foi vista entre 2 a 4 semanas. Quando as primeiras folhas apareceram, os re- bentos foram transferidos para meio MS 4 (ver em baixo) até as plan- tas crescerem até 4 a 5 cm em altura.

[00118] As plantas transformadas foram inicialmente removidas da cultura de tecido e colocadas em bandejas de plântulas e incubadas em uma câmara de crescimento. A aproximadamente seis a oito se- manas de idade, as plantas foram movidas para vasos de 30 cm até à maturidade.

[00119] Meios: Os componentes dos meios referidos acima são como se segue:

[00120] EM3: Sais e vitaminas de MS; hidrolisato de caseína a 0,5 g/L; água de coco a 100 mL/L; sacarose a 20 g/L e 24-D a 3 mg/L, solidificado com ágar a 7 g/L.

[00121] LB básico: NaCl a 10 g/L; extrato de levedura a 5 g/L; e trip- tona a 10 g/L.

[00122] LB sólido: LB básico com 15 g/L de ágar.

[00123] MS básico: Sais e vitaminas de meio MS, com sacarose a g/L.

[00124] MS1:MS básico suplementado com hidrolisato de caseína a 0,25 g/L; 40 mL de água de coco; 2,4-D a 3,0 mg/L e Timetina a 200 mg/L solidificado com ágar a 7 g/L.

[00125] MS2:MS básico suplementado com hidrolisato de caseína a 0,25 g/L; 40 mL de água de coco; 2,4-D a 3,0 mg/L, Geneticina a 50 mg/L e Timetina a 200 mg/L, solidificado com ágar a 7 g/L.

[00126] MS3:MS básico suplementado com 40 mL de água de co- co e CuSO, a 0,5 mg/L, BAP a 1,0-2,0 mg/L (dependente de cultivar, logo não requerido para todos os cultivares) e Geneticina a 50 mg/L

[00127] eTimentina a 200 mg/L, solificado com ágar a 7 g/L.

[00128] MS4: MS básico suplementado com carvão vegetal a 1,0 g/L e 1,0 mg de IBA (ácido indol-3-butírico, não requerido para todos os cultivares) e Geneticina a 50 mg/L, solidificado com ágar a 7 g/L. EXEMPLO 3. CARACTERIZAÇÃO DE PLANTAS DE CANA-DE-

AÇÚCAR TRANSGÊNICAS

[00129] As plantas foram rastreadas quanto à presença dos genes nNptll e scoGUS usando análise TagManº. Somente as plantas que se determinou que continham ou 1 ou 2 cópias do constructo transgênico foram selecionadas para análise adicional.

[00130] As amostras de tecido de cana-de-açúcar usadas para aná- lise quantitativa da expressão de GUS foram obtidas ou da folha (pri- meira folha desenrolada de plantas com 6 meses de idade ou primeira folha desenrolada de rebentos de cana-de-açúcar de plantas com 11 meses de idade) ou da haste (aos 12 meses). Os padrões da expres- são de genes e atividade metabólica variam ao longo do comprimento da haste de cana-de-açúcar, com os internodos mais novos investidos em processos relacionados com crescimento e desenvolvimento, e internodos maduros na base da planta principalmente focados no ar- mazenamento da sacarose (Casu et al., Plant Mol. Biol. 52:371-386 (2003); Casu et al., Plant Mol. Biol., 54:503-517 (2004); Casu et al. Funct. Int. Genomics 7:153-167 (2007)). Portanto, para entender com-

pletamente o valor de um promotor transgênico para a biotecnologia da cana-de-açúcar, a atividade do promotor foi avaliada ao longo de diferentes etapas de desenvolvimento presentes dentro da haste de plantas maduras. Para fazer isto, foram tiradas amostras de hastes de cana-de-açúcar nos internodos 3 e 4 (imaturas), internodos 8 (em ma- turação), e internodo 20 (maduras).

[00131] Uma amostra de folha igual a aproximadamente quatro fu- radores padrão foi tirada e colocada em um poço de um bloco de a- mostras com 96 poços mantido em gelo. Cada planta foi amostrada em duplicado da mesma folha. As amostras foram subsequentemente congeladas a

[00132] -807C,ecriodessecadas antes da análise. As amostras de haste foram tiradas, colocadas em gelo, e subsequentemente conge- ladas a -80 (C. A haste congelada foi triturada até um pó usando um triturador de café padrão ou dispositivo similar, e criodessecada. Apro- ximadamente 40 mg do tecido de haste criodessecado, pulverizado foram colocados em um poço de um bloco de amostras com 96 poços. Cada amostra foi analisada em duplicado. A expressão de GUS na folha e haste foi subsequentemente quantificada por ELISA.

[00133] Paraa ELISA de GUS, placas com 96 poços de elevada ligação (Nunc Maxisorp) foram revestidos a 4 ºC durante a noite com IgG anti-GUS de coelho (Sigma G5545) a 2 ug/iml em borato a 25 MM, NaCl a 75 mM, pH 8,5 (100 ul/poço). As placas foram lavadas três vezes com Tris a 10 mM, pH 8,0 contendo Tween-20 a 0,05% e NaN; a 0,2 %. As amostras ou padrões (GUS Type VII-A, Sigma G7646) foram adicionados à placa (100 ul/poço), incubados durante 1 hr à temperatura ambiente com agitação, e lavados cinco vezes. 100 uL/poço de IgG anti-GUS de coelho marcada com peroxidase de rába- no-silvestre (HRP) a 2 ug/mL (Invitrogen A5790 conjugada com HRP) foram depois adicionados à placa, incubados durante 1 hr à tempera-

tura ambiente com agitação, e lavados como antes. O anticorpo conju- gado com HRP foi detectado por adição de 100 ul/poço de tetrametil- benzidina (TMB, Sigma TO440) e desenvolvimento durante 30 min à temperatura ambiente. A reação foi parada pela adição de 100 ul/poço de HCI a 0,1N. A absorvância foi medida a 450 nm com 620 como uma referência usando um leitor de microplacas (Tecan Sunrise, Research Triangle Park, NC). A curva padrão de GUS usa um ajuste de curva com 4 parâmetros. A curva é representada graficamente line- ar versus log com uma gama de O a 320 ng/mL.

[00134] Adicionalmente, para avaliar se os níveis de expressão de transgenes alcançados nas plantas TO eram mantidos no rebento, seis plantas para cada constructo foram selecionadas para análise adicio- nal. Na maturidade (aproximadamente 12 meses após transferência para o solo), a haste principal e quaisquer rebentos associados destas plantas foram cortados na base, e as plantas de rebento resultantes foram analisadas após aproximadamente cinco meses (momento em que elas eram aproximadamente equivalentes em tamanho às plantas TO com seis meses de idade). Das 42 plantas que foram selecionadas para germinação, 28 plantas germinaram com sucesso, consistindo em entre dois a cinco plantas para cada um dos constructos. EXEMPLO 4. EXPRESSÃO DE GUS NAS PLANTAS DE CANA-DE-

AÇÚCAR TRANSFORMADAS

[00135] A expressão de beta-glucuronidase (GUS) na primeira folha desenrolada de plantas de cana-de-açúcar com seis meses de idade para cada um dos constructos é mostrada na Figura 1. Os constructos tendo o intensificador dual, eEFfFMVe35S (SEQ ID fNo.1) em associação operacional com o promotor mostraram expressão de GUS significati- vamente intensificada em comparação com o nível de expressão de GUS obervado para o mesmo constructo sem o intensificador dual. Assim, o constructo SC27 com o intensificador dual e o promotor de fosfoenolpiruvato carboxilase (PEPC) mostrou, em comparação com o constructo SC24 somente com o promotor de PEPC, uma intensifica- ção da produção de proteínas de mais do que 6 vezes. Os resultados para o promotor de ubiquitina do milho (ZMUbi) (SC11 v. SC27) mos- traram uma intensificação da produção de proteínas de mais do que 7 Vezes.

[00136] A expressão de GUS na primeira folha desenrolada de re- bentos de cana-de-açúcar (Figura 2) e em hastes de rebentos (Figura 3) mostrou resultados similares àqueles da primeira folha desenrolada de plantas de cana-de-açúcar com seis meses de idade descrita acima (Figura 1). Os níveis de produção global de proteínas foram geralmen- te mais elevados nas plantas mais velhas (tanto nas hastes (Figura 2) como nas folhas (Figura 3)) mas os níveis relativos de produção de proteínas por plantas tendo constructos com o intensificador versus aqueles sem o intensificador foram significativamente mais elevados.

[00137] Evidência adicional da intensificação da expressão de GUS pelo intensificador dual (eEFMVe35S, SEQ ID fNo.1) é proporcionada nas Figs. 4A4B. Especificamente, a Figura 4A mostra expressão de GUS em hastes de cana-de-açúcar (imaturas (internodos 3 e 4), em maturação (internodos 8), e maduras (internodo 20)) usando o promo- tor de ubiquitina do milho (ZMUbi) com e sem o intensificador, eEFM- Ve35S. Quando o intensificador estava operacionalmente ligado ao promotor de ZmUbi, foi observada uma intensificação de mais do que 7 vezes. A expressão nas folhas é mostrada na Figura 4B onde o constructo tendo o intensificador ligado operacionalmente ao promotor de ubiquina do milho mostrou um aumento de mais do que 8 vezes na expressão em comparação com a expressão com o promotor sozinho.

[00138] Similar à Figura 4, a Figura 5 mostra intensificação da ex- pressão de GUS na haste de cana-de-açúcar transgênica contendo cada um dos diferentes constructos de promotor-scoGUS. Foram tira-

das amostras de regiões da haste imatura (internodos 3 e 4), em matu- ração (internodo 8) e maduras (internodo 20) aos 12 meses após transferência para o solo. Interessantemente, o promotor Zm-PEPC, que é um promotor preferencial quanto a folhas, mostra expressão quando associado operacionalmente com o intensificador dual (eFM- Ve35S, SEQ ID fNo.1). Assim, o intensificador dual parece alterar a expressão preferencial quanto a folhas do promotor ZMm-PEPC, resul- tando em níveis de expressão similares ao promotor de ubiquitina do milho sem o intensificador.

[00139] A expressão de transgenes no rebento foi também exami- nada e os resultados mostrados na Figura 6. A expressão de GUS em cada uma das plantas de rebento (TOR1) foi mais elevada do que a expressão observada na geração TO, resultando em um aumento substancial na expressão média para cada um dos constructos. Plan- tas TORI transgênicas contendo o constructo Enh-CMP-Zm-iUbi1 mostraram os níveis mais elevados de expressão de GUS (Figura 5; expressão média=15,5 ug/mg proteína). Adicionalmente, um dos even- tos Enh-CMP-Zm-iUbi1l teve também os níveis globais de expressão mais elevados (24,5 ug/mg proteína), com os níveis de GUS alcan- çando aproximadamente 2,5 % da proteína da folha solúvel total.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Molécula de ácido nucleico recombinante, caracterizada pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico recombi- nante uma sequência de nucleotídeos de interesse, um promotor e a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1, em que o promotor está a jusante da e em associação operacional com a sequência de nucleo- tídeos de SEQ ID NO: 1 e a montante da e em associação operacional com a sequência de nucleotídeos de interesse, e a sequência de nu- cleotídeos de interesse é expressa a um nível pelo menos 6 vezes maior do que o nível de expressão da referida sequência de nucleotí- deos de interesse em um controle, em que adicionalmente o promotor é um promotor de poliubiquitina-1 do milho e/ou um promotor de PepC do milho.

2. Molécula de ácido nucleico recombinante de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende adicio- nalmente uma sequência Kozak.

3. Planta de cana-de-açúcar ou parte de planta de cana-de- açúcar, caracterizada pelo fato de que compreende a molécula de áci- do nucleico recombinante como definida na reivindicação 1 ou 2.

4. Produto, caracterizado pelo fato de que é coletado da planta de cana-de-açúcar ou parte de planta de cana-de-açúcar como definida na reivindicação 3.

5. Produto processado, caracterizado pelo fato de que é produzido a partir do produto coletado como definido na reivindicação

4.

6. Cultura, caracterizada pelo fato de que compreende uma pluralidade das plantas de cana-de-açúcar como definidas na reivindi- cação 3, plantadas em conjunto em um campo agrícola.

7. Método de aumento da expressão de uma sequência de nucleotídeos de interesse em uma célula de planta de cana-de-açúcar,

caracterizado pelo fato de que compreende: introdução na célula de planta de cana-de-açúcar de uma molécula de ácido nucleico recombinante como definida na reivindica- ção 1, aumentando, desse modo, o nível de expressão da sequência de nucleotídeos de interesse para pelo menos 6 vezes mais do que o nível de expressão da referida sequência de nucleotídeos de interesse em um controle.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a molécula de ácido nucleico recombinante compre- ende adicionalmente uma sequência Kozak.

9. Método de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracteri- zado pelo fato de que compreende, adicionalmente, a regeneração de uma planta a partir da célula de planta.

10. Célula de planta de cana-de-açúcar, caracterizada pelo fato de que é produzida pelo método como definido na reivindicação 7 ou 8.

11. Planta de cana-de-açúcar, caracterizada pelo fato de que é produzida pelo método como definido na reivindicação 9.

12. Produto coletado, caracterizado pelo fato de que é cole- tadoa partirda planta como definida na reivindicação 11.

13. Produto processado, caracterizado pelo fato de que é produzido a partir do produto coletado como definido na reivindicação

12.

14. Cultura, caracterizada pelo fato de que compreende uma pluralidade das plantas de cana-de-açúcar como definidas na rei- vindicação 11 plantadas em conjunto em um campo agrícola.

15. Invenção, caracterizada por quaisquer de suas concre- tizações ou categorias de reivindicação englobadas pela matéria inici- almente revelada no pedido de patente ou em seus exemplos aqui apresentados.