MXPA06000275A - Elevacion de los niveles de aceite en vegetales. - Google Patents

Abstract

La presente invencion proporciona construcciones de ADN que comprenden polinucleotidos exogenos que codifican a una treonina desaminasa y/o a AHAS. Vegetales transgenicos transformados con las construcciones asi como tambien semillas y la descendencia derivada de estos vegetales, son tambien previstas; los vegetales transgenicos son tambien para tener un nivel creciente de uno o mas aminoacidos en comparacion con un vegetal no transgenico de la misma especie.

Description

ELEVACION DE LOS NIVELES DE ACEITE EN VEGETALES Esta solicitud reclama el beneficio de la fecha de presentación de la solicitud provisional de E.U.A., con número de serie 60/483,491 , presentada el 27 de junio de 2003, que se incorpora en la presente por referencia.

CAMPO DE LA INVENCION La presente invención concierne a los campos de la química de ácidos nucleicos y a la biotecnología agrícola. En particular, la presente invención está dirigida a la identificación de ácidos nucleicos que codifican a proteínas útiles para incrementar los niveles de aceite en plantas de maíz y crear plantas de maíz que incluyan dichos ácidos nucleicos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Los vegetales son una fuente importante de aceites para alimentación, alimentos y usos industriales. Aunque tejidos de la mayoría de las especies vegetales contienen poco aceite, el cultivo de ciertos tipos de vegetales, sobre muchos acres, permite que se produzcan grandes cantidades de aceites vegetales. Si el contenido de aceite de estas plantas pudiera ser aumentado, entonces los aceites vegetales podrían ser producidos más eficientemente. Por ejemplo, el contenido de aceite normal maíz dentado amarillo # 2 es de aproximadamente 4 %. Si el contenido de aceite del maíz pudiera ser incrementado al 8 % o aún al 2 %, sin afectar significativamente el rendimiento, la misma cantidad de aceite podría ser producida de la mitad o aún un tercio del número de acres. Actualmente, niveles de aceite en cultivos de semillas oleosas han aumentado incrementadamente por los métodos de selección y de reproducción tradicionales. Existen pocas referencias a vegetales transgénicos con niveles crecientes de aceite. En contraste, se ha logrado el aumento en las proporciones de algunos ácidos grasos estratégicos por medio de la introducción o la manipulación de genes para la biosíntesis de varios ácidos grasos vegetales en semillas oleosas. Por ejemplo, Voelcker y colaboradores, Science, 257: 72-74 (1992), demostraron que la expresión en Brassica ceaede una ACP tioestearasa.-Acilo graso de cadena media de la Bahía de California, incrementó el contenido de ácido láurico (12:0). Hitz y colaboradores, Proc. 9th International Cambridge Rapeseed Congress UK, pág. 470-472 (1995) incrementaron las proporciones de ácido oleico en Glycina max por co-supresión usando una construcción en el sentido que codifica a una FAD-2(A12) desaturasa microsómica vegetal. Aunque el uso de estos transgenes vegetales dio como resultado un incremento en la producción de ácido láurico en colza y proporciones alteradas de ácido oleico en soya, no hubo evidencia de incremento en el contenido de ácidos grasos totales, o de incremento en el rendimiento de aceite en estos transgénicos. Ciertos trabajadores han intentado incrementar o modular el contenido de aceite de vegetales por medio de la manipulación de los genes de la ruta biosintetica del aceite. Por ejemplo, la Patente U.S. 6,268,550 de Gengenbach y colaboradores proporciona ácidos nucleicos de acetil CoA carboxilasa de maíz por alteración del contenido de aceite de las plantas. De manera adicional, la Patente U.S. 5,925,805 de Ohlrogge y colaboradores proporciona un gen de acetil CoA carboxilasa de Arabidopsis que puede ser usado para incrementar el contenido de aceite de vegetales. Sin embargo, la síntesis de ácidos grasos requiere la actividad coordinada de muchas enzimas, ninguna de las cuales cuando solamente se ha encontrado sobre regulada incrementó sustancialmente el contenido de aceite. Por consiguiente existe una necesidad por un método mejorado para alterar el contenido de aceite de vegetales , y en particular para incrementar el contenido de aceite de vegetales y semillas. Además del aceite, el almidón del maíz es también significativo desde el punto de vista agrícola y comercial. El almidón comprende un componente importante de la alimentación animal y del alimento humano. El almidón es usado también industrialmente en la producción de papel, textiles, y adhesivos, así como también para proporcionar las materias primas para algunos bioreactores. En vegetales superiores, el almidón consiste de glucanos de cadena ramificada y de cadena lineal conocidos como amilasas y amilopectinas respectivamente. El almidón con varias cantidades de amilosa y amilopectina se encuentra en diferentes vegetales. Típicamente el almidón de maíz contiene aproximadamente 25 % de amilosa, siendo el remanente amilopectina. La amilopectina contiene cadenas cortas y cadenas largas, las cadenas cortas varían desde 5-30 unidades de glucosa y la cadena larga varía desde 30-100 unidades de glucosa. La proporción de amilopectina, así como también la distribución de cadenas cortas y largas en la fracción de amilopectina, afecta a las propiedades físicas del almidón, (por ejemplo, la estabilización térmica, la retrogradación, y la viscosidad). El locus WAXY de maíz determina el contenido de amilosa en polen y en el endosperma del grano, (Shure y colaboradores, Cell, 35(1):225-233 (1983)), dando como resultado almidón que tiene propiedades únicas. La mayoría de las mutaciones en el locus WAXY de maíz, que codifica a la sintasa del almidón enlazado al gránulo (GBSS), da como resultado un endosperma opaco y uniforme, almidón no córneo firme que comprende mayormente amilopectinas y una cantidad reducida de amilosa en el endosperma, polen y saco embrionario ("fenotipo WAXY") (ver, Okagaki y Wessler, Genetic, 120(4):1 137-1 143 (1988)). Cuando la GBSS no funcional es sintetizada en el muíante homozigótico de WAXY, carece también de amilosa (Echt & Schwartz, Genetics, 99:275-284 ( 981)). De manera adicional WAXY recesiva, clásica tiene un pequeño (aproximadamente un incremento de 0.5 %) efecto sobre el por ciento de aceite en el grano en comparación con el maíz amarillo # 2 (Pfahler y Linskens, Theoretical and Applied Genetics, 41(1): 2-4 (1971)). En comparación, la línea endógama HOI001, un muíante de WAXY dominante endógamo descrito en la Patente U.S. No. 20030172416, incorporada a la presente como referencia, tiene concentraciones de aceite en el grano entero mayores que cuatro veces la del maíz amarillo # 2.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención describe y proporciona moléculas de ácidos nucleicos aislados que codifican a un polipéptido de GBSS HO1001. Además, esta invención concierne a moléculas de ácidos nucleicos que son complementarias a la molécula de ácido nucleico que codifica a un polipéptido de GBSS HO1001. Además, esta invención concierne a "cassettes" de expresión que comprenden estas moléculas de ácidos nucleicos. Además, esta invención concierne a vegetales de maiz transgénico que contengan estos "cassettes" de expresión. Además, esta invención concierne a las semillas de estos vegetales de maíz transgénico. Esta invención concierne adicionalmente al aceite y al alimento animal obtenido de las semillas de estos vegetales de maíz transgénicos. En otra modalidad, la presente invención concierne a una construcción de ADN recombinante, asociada con la producción de aceite creciente en vegetales, que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica a un polipéptido de GBSS HO1001 operablemente unido a un promotor, el cual es funcional en una célula vegetal. La presente invención describe y proporciona un método de incrementar el aceite en un vegetal de maíz por expresión de un gen de GBSS HOI001. Esta invención proporciona adicionalmente un método de alterar la composición del grano en un vegetal de maíz por expresión de un gen de GBSS HOI001. Esta invención describe adicionalmente y proporciona secuencias de un gen de GBSS HOI001 de Zea mays. Esta invención proporciona adicionalmente construcciones de vector para transformación vegetal y expresión especifica de tejido de un gen de GBSS HOI001. Esta invención proporciona adicionalmente vegetales de maíz transformadas con el gen de GBSS con niveles superiores de aceite en comparación con vegetales con el mismo o similar fondo genético, peo que no contienen el gen de GBSS HOI001 insertado. Esta invención proporciona adicionalmente semillas de estos vegetales de maíz. Esta invención se proporciona adicionalmente para granos de maíz transformados con el gen de GBSS HOI001 que contengan un nivel alto de aceite en comparación con los granos de vegetales de maíz con el mismo o similar fondo genético, pero que no contengan el gen GBSS HOI001 insertado. Esta invención también proporciona aceite y alimento animal producidos de estas semillas y granos. La presente invención proporciona adicionalmente un método de reproducción auxiliada por marcador útil en la reproducción de niveles superiores de aceite en maíz.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La Figura 1 , muestra la alineación de la secuencia de ácidos nucleicos de gen de sintasa del almidón enlazado al gránulo aislado de HOI001 (HOI001 GBSS, pMON72506) [SEC ID NO: 1] en comparación con el gen de sintasa del almidón enlazado al gránulo (GBSS) de LH59 endógamo (pMON72510), y la secuencia publicada del gen de GBSS descrito en Shure y colaboradores, supra (X03935). Por comparación inicial, la secuencia codificadora para el gen de GBSS publicado se da (CDS22509). La Figura 2, muestra la alineación de las secuencias de aminoácidos predichas correspondientes, del gen de GBSS aislado de HOI001 (HOI001 GBSS de pMON72506) [SEC ID NO: 3] y el gen de GBSS descrito en Shure y colaboradores, supra, [SEC ID NO: 4], respectivamente. La Figura 3, muestra la alineación de las secuencias de aminoácidos predichas correspondientes del gen de GBSS de Zea mays aislado de LH59 endógama [SEC ID NO: 10], y el gen de sintasa del almidón enlazado a gránulo de Zea mays descrito en Shure y colaboradores, supra, respectivamente. La Figura 4 expone un mapa de plásmido de pMON72506. La Figura 5, expone un mapa de plásmido de pMON72510. Las Figuras 6A y 6B exponen gráficamente la diferencia en los niveles de aceite de vegetales transformado con pMON72506 que contiene el GBSS de HOI001 (SEC ID NO: 1 , 6A) y pMON72510 que contiene el GBSS de LH59 (SEC ID NO: 8, 6B). Los granos positivos al gen y negativos al gen se compararon a partir de cada evento. Solamente eventos con cambios significativos estadísticamente en aceite (14 de 29) se muestran en 6A. La Figura 7, expone un mapa de plásmido de pMON81464. La Figura 8, expone un mapa de plásmido de p ON68298. La Figura 9, expone un mapa de plásmido de pMON81465.

BREVE DESCRIPCION DE LAS SECUENCIAS La SEC ID NO: 1 , es la secuencia de ácido nucleico de la sintasa del almidón enlazado a gránulo de HOI001 (HOI001 GBSS de pMON72506). La SEC ID NO: 2, es la secuencia de ácido nucleico publicada de GBSS de Zea mays de Shure y colaboradores, supra. La SEC ID NO: 3 expone la secuencia de aminoácidos predicha de HOI001 GBSS de pMON72506. La SEC ID NO: 4 expone la secuencia de aminoácidos predicha de GBSS de Zea mays publicada por Shure y colaboradores, supra. La SEC ID NO: 5, es una secuencia de cebador para el Cebador número 14543. La SEC ID NO: 6 es una secuencia de cebador para el Cebador número 14547. La SEC ID NO: 7, expone una secuencia de ácidos nucleicos de una molécula de ADN que codifica a un GBSS de la línea LH59 de maíz.

La SEC ID NO: 8, expone la secuencia de aminoácidos predicha de GBSS de la línea LH59 de maíz. La SEC ID NO: 9, es una secuencia de cebador para el Cebador número 20095. La SEC ID NO: 10 es una secuencia de cebador para el Cebador número 20092. La SEC ID NO: 11 expone la región codificadora de la cADN de GBSS de HOI001.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Se proporcionan las siguientes definiciones como una ayuda para comprender la descripción detallada de la presente invención. Las frases "secuencia codificadora", "región codificadora", "secuencia estructural", y "secuencia estructural de ácidos nucleicos", se refiere a una estructura física que comprende una distribución ordenada de nucleótidos. Los nucleótidos son distribuidos en una serie de tripletos que cada uno forma un codón, cada codón codifica a un aminoácido específico. Por consiguiente, la secuencia codificadora, secuencia estructural, y secuencia de ácidos nucleicos estructural codifica a una serie de aminoácidos que forman una secuencia de proteína, polipéptido o péptido. La secuencia codificadora, secuencia estructural, y secuencia de ácidos nucleicos estructural puede estar contenida en una molécula de ácido nucleico más grande, vector, o los similares. Además, la distribución ordenada de nucleótidos en estas secuencias puede ser expuesta en la forma de un listado de secuencias, figura, medio electrónico, o los similares. La frase "degeneración del codón" se refiere a la divergencia en el código genético que permite la variación de la secuencia de nucleótidos sin afectar a la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado. Por consiguiente, la presente invención concierne a cualquier fragmento de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica a toda o a una porción sustancial de las secuencias de aminoácidos expuestas en la presente. El experto en la materia tendrá conciencia del "codón desviado" exhibido por una célula huésped específica en el uso de codones nucleótidos para especificar un aminoácido dado. Por consiguiente, cuando se sintetiza un fragmento de ácido nucleico para expresión mejorada en una célula huésped, es deseable diseñar el fragmento de ácido nucleico de modo que su frecuencia de uso de codón se aproxime a la frecuencia de uso de codón de la célula huésped. El término "cADN", se refiere a un ADN de doble hebra que es complementario a y derivado de mARN. La frase "secuencia de ADN", "secuencia de ácido nucleico", y "molécula de ácido nucleico", se refiere a una estructura física que comprende una distribución ordenada de nucleótidos. La secuencia de ADN o secuencia de nucleótidos puede estar contenida en una molécula de nucleótidos más grande, vector o los similares. Además, la distribución regular de ácidos nucleicos en estas secuencias puede ser expuesta en la forma de un listado de secuencias, figuras, cuadros, medios electrónicos, o los similares. "Expresión", se refiere a la transcripción de un gen para producir el mARN correspondiente y la traslación de este mARN para producir el producto genético correspondiente (es decir, un péptido, polipéptido o proteína). "Expresión de ARN antisentido", se refiere a la transcripción de un ADN para producir una primera molécula de ARN capaz de hibridizar a una segunda molécula de ARN, cuyo segunda molécula de ARN codifica a un producto genético que es deseablemente sub-regulada. Como se usa en la presente, "gen" se refiere a un fragmento de ácido nucleico que expresa a una proteína específica, incluyendo las secuencias reguladoras precedentes (secuencias no codificadoras en 5') y siguiendo (secuencias no codificadoras en 3') a la secuencia codificadora. "Gen nativo", se refiere a un gen como se encuentra en la naturaleza con sus propias secuencias reguladoras. "Gen quimérico", se refiere a cualquier gen que no sea un gen nativo, que comprende secuencias reguladoras y codificadoras que no se encuentran juntas en la naturaleza. Por consiguiente, un gen quimérico puede comprender secuencias reguladoras y secuencias codificadoras que se deriven de diferentes fuentes, o secuencias reguladoras y secuencias codificadoras derivadas de la misma fuente, pero distribuidas de una manera diferente a la encontrada en la naturaleza. "Gen endógeno", se refiere a un gen nativo en su localización natural en el genoma de un organismo. Un "gen exógeno" o "transgen", se refiere a un gen no nativo que ha sido introducido en el genoma por medio de un procedimiento de transformación. "Hemizigotos", se refiere a un diploide individual que tenga solamente una copia de un gen particular (por ejemplo, porque se ha perdido un cromosoma). "Homozigoto", se refiere a un par de genes que tengan alelos diferentes en dos cromosomas homólogos. "heterólogos", se refiere a la relación entre dos o más secuencias de ácidos nucleicos o de proteínas que se derivan de diferentes fuentes. Por ejemplo, un promotor es heterólogo con respecto a una secuencia codificadora si una combinación tal no se encuentra normalmente en la naturaleza. Además, una secuencia particular puede ser "heteróloga" con respecto a una célula u organismo en el cual es insertada (es decir, no se encuentra de manera natural en la célula u organismo particular). "Homología", se refiere al nivel de similaridad entre dos o más secuencias de ácidos nucleicos o de aminoácidos en términos de por ciento de identidad posicional (es decir, similaridad o identidad de secuencias). La homología también se refiere también al concepto de propiedades funcionales similares entre diferentes ácidos nucleicos o proteínas. "Hibridización", se refiere a la habilidad de una primera hebra de ácido nucleico para unir con una segunda hebra vía enlace de hidrógeno que empareja a la base cuando los dos hebras de ácidos nucleicos tienen suficiente complementaridad de secuencia). Como se usa en la presente, una molécula de ácido nucleico se dice que es el "complemento" de otra molécula de ácido nucleico si exhibe complementaridad completa. Como se usa en la presente, se dice que las moléculas exhiben "complementaridad completa" cuando cada nucleótido de una de las moléculas es complementaria de un nucleótido de la otra. Por consiguiente, se dice que dos hebras de ácido nucleico tienen suficiente complementaridad cuando pueden hibridizar a otra con suficiente estabilidad para permitirles reforzarse entre sí bajo condiciones apropiadas. Las frases "selección auxiliada por marcador" o "reproducción auxiliada por marcador", se refiere al uso de marcadores genéticos para identificar y seleccionar vegetales con potencial fenotípico superior. Marcadores genéticos determinados previamente para ser asociados con un rasgo locus o rasgo loci se usan para descubrir el genotipo en el rasgo loci en virtud del enlace entre el locus marcador y el rasgo locus. Vegetales que contienen alelos con el rasgo deseado son seleccionados con base en sus genotipos en el marcador loci enlazado. La frase "población de reproducción", se refiere a una colección heterogénea genéticamente de vegetales creados para el propósito de identificar a uno o más individuos con características fenotípicas deseadas. El término "fenotipo", se refiere a la expresión observada de uno o más vegetales característicos. Un "marcador genético" es cualquier diferencia fenotípica morfológica, bioquímica, o basada en ácidos nucleicos que revela un polimorfismo de ADN. Ejemplos de marcadores genéticos incluye pero no se limita a RFLPs, RAPDs, alozimas, SSRs, y AFLPs. La frase "locus marcador", se refiere a la localización de polimorfismos de ADN definidos genéticamente que se revelaron en medio de un marcador genético. U "rasgo locus", se refiere a una localización definida genéticamente por una colección de uno o más genes (alelos) que contribuyen a una característica observada. La frase "polimorfismo de la extensión del fragmento de restricción" (RFLP), se refiere a un marcador genético basado en ADN en el cual las diferencias de tamaño en la endonucleasa de restricción generaron fragmentos de ADN, son observados vía hibridización (Botstein y colaboradores, Am. J. Hum. Genet, 32:314-331 (1980)). La frase "ADN polimórfico amplificado aleatoriamente" (RAPD), se refiere a una amplificación de ADN basada marcador genético en los que son usados cebadores arbitrarios de secuencia, cortos y los productos de amplificación resultantes son separados por tamaño y diferencias en los patrones de amplificación observados (Williams y colaboradores, Nucleic Acids Res., 18: 6531-6535 (1990)). La frase "repetición de secuencia simple" (SSR), se refiere a un marcador genético basado en la amplificación de ADN en el cual son amplificados intervalos cortos de motivos de secuencia repetidos en tándem y los productos de amplificación resultantes son calibrados separadamente y se observan las diferencias de extensión de las repeticiones de nucleótidos (Tautz, Nucleic Acids Res, 112:4127-4138 (1989)). El término "AFLP", se refiere a un marcador genético basado en amplificación de ADN en el cual los fragmentos de ADN generados por la endonucleasa de restricción son ligados a fragmentos cortos de ADN que facilitan la amplificación de los fragmentos de ADN restringidos (Vos y colaboradores, Nucleic, Acids Res., 23:4407-4414 (1995)). Los fragmentos amplificados son separados por tamaño y se observan las diferencias en los patrones de amplificación. La frase "operablemente unido", se refiere a la distribución espacial funcional de dos o más regiones de ácidos nucleicos o secuencias de ácidos nucleicos. Por ejemplo, una región promotora puede ser posicionada en relación a una secuencia de ácidos nucleicos de modo que la transcripción de la secuencia de ácidos nucleicos es dirigida por la región promotora. Por consiguiente, una región promotora es "operablemente unida" a la secuencia de ácidos nucleicos. Los términos "promotor" o "región promotora", se refiere a una secuencia de ácido nucleico, usualmente encontrada hacia el extremo 3' en el sentido de la hebra de ADN dupleto (5') hasta una secuencia codificadora que es capaz de dirigir la transcripción de una secuencia de ácidos nucleicos en mARN. El promotor o región promotora proporciona típicamente un sitio de reconocimiento para ARN polimerasa y los otros factores necesarios para iniciación apropiada de transcripción. Como se contempla en la presente, un promotor o región promotora incluye variaciones de promotores derivados por inserción o eliminación de regiones reguladoras, someter el promotor a mutagénesis específica puntual o aleatoria, y los similares. La actividad o la fuerza de un promotor puede ser medida en términos de las cantidades de ARN producido, o la cantidad de acumulación de proteínas en una célula o tejido, en relación a un segundo promotor que es medido de manera similar. La frase "secuencias no codificadoras en 3"', se refiere a secuencias de nucleótidos localizadas desde el extremo 3' hacia el extremo 5' en el sentido de la hebra de ADN dupleto de una secuencia codificadora e incluye secuencias de reconocimiento de poliadenilación y otras secuencias que codifican a señales reguladoras capaces de afectar el procesamiento de mARN o la expresión genética. La señal de poliadenilación es caracterizada usualmente afectando la adición de tractos de ácido poliadenílico en el extremo 3' del precursor de mARN. EL uso de secuencias no codificadoras en 3' diferentes es ejemplificado por Ingelbrecht y colaboradores, Plant Cell, 1 :671-680 (1989). "Secuencia líder de translación" o "región sin trasladar 5"' o "5 -UTR" todos se refieren a una secuencia de nucleótidos localizada entre la secuencia promotora de un gen y la secuencia codificadora. La 5 -UTR está presente en el extremo 5' hacia el extremo 3' en el sentido de la hebra de ADN dupleto del mARN procesado totalmente de la secuencia inicial de traslación. La 5'-UTR puede afectar el procesamiento del transcrito primario a mARN, estabilidad de mARN, o eficiencia de traslación. Ejemplos de secuencias líderes de translación han sido descritos (Turner y Foster, Molecular Biotechnology, 3:225 (1995)). "Transcrito de ARN", se refiere al producto que resulta de la transcripción catalizada por ARN polimerasa de una secuencia de ADN. Cuando el transcrito de ARN es una copia complementaria perfecta de la secuencia de ADN, es mencionado como transcrito primario o puede ser una secuencia de ARN derivada del procesamiento post-translacional del primer transcrito y es mencionado como el ARN maduro. "ARN informador" (mARN), se refiere al ARN que está sin intrones y que puede ser transladado en polipéptido por la célula. "ARN en el sentido", se refiere a un transcrito de ARN que incluye el mARN y puede así ser transladado en un polipéptido por la célula. "ARN antisentido", se refiere a un transcrito de ARN que es complementario a un mARN objetivo, dando como resultado dupletos ARN:ARN específicos, que son formados por medio de emparejamiento de bases entre el sustrato de ARN antisentido y el mARN objetivo. "Vector recombinante", se refiere a cualquier agente por o en el cual un ácido nucleico de interés es amplificado, expresado, o almacenado, tal como un plásmido, cósmido, virus, secuencia replicadora autónomamente, fago, o secuencia de nucleótidos de ARN o de ADN de una sola hebra lineal, de una sola hebra circular, de doble hebra lineal o de doble hebra circular. El vector recombinante puede ser derivado de cualquier fuente y es capaz de integración genómica o de replicación autónoma. "Secuencia reguladora", se refiere a una secuencia de nucleótidos localizada desde el extremo 5' hacia el extremo 3' en el sentido de la hebra de ADN dupleto (5'), en, o desde el extremo 3' hacia el extremo 5' en el sentido de la hebra de ADN dupleto (3') con respecto a una secuencia codificadora. De manera adicional, los intrones pueden tener actividad reguladora. La transcripción y la expresión de la secuencia codificadora es típicamente impactada por la presencia o ausencia de la secuencia reguladora. "Sustancialmente homólogo", se refiere a dos secuencias que son al menos aproximadamente 90 % idénticas en secuencia, como se mide por el método de CLUSTAL W en el programa Omiga, usando los parámetros faltantes (Versión 2.0; Accelrys, San Diego, CA). "Sustancialmente purificado", se refiere a una molécula separada de sustancialmente todas las otras moléculas normalmente asociadas con ella en su estado nativo. Más preferiblemente, una molécula sustancialmente purificada es la especie predominante presente en una preparación. Una molécula sustancialmente purificada puede ser mayor que aproximadamente 60 % libre, preferiblemente de aproximadamente 75 % libre, más preferiblemente de aproximadamente 90 % libre, y mayormente se prefiere de aproximadamente 95 % libre de las otras moléculas (exclusivas del solvente) presentes en la mezcla natural. La frase "sustancialmente purificado" no se pretende que abarque moléculas presentes en su estado nativo. El término "transformación", se refiere a la introducción de ácido nucleico en un huésped recipiente. El término "huésped", se refiere a células bacterianas, hongos, animales o células animales, vegetales o semillas, o cualquier parte o tejido vegetal incluyendo células vegetales, protoplastos, calli, raíces, tubérculos, semillas, vástagos, hojas, plántulas, embriones y polen. Como se usa en la presente, un "vegetal transgénico", es un vegetal que tienen establemente introducido en su genoma, por ejemplo, los genomas de plástidos o nucleares, un ácido nucleico. El término "semillas" y "granos", se comprende que son equivalentes en significado. El término grano es usado frecuentemente al describir la semilla de un vegetal de maíz o arroz. En todos los vegetales la semilla es el óvulo maduro que consiste de una semilla recubierta, embrión, y en vegetales de la presente invención, un endospermo.

Acidos Nucleicos de GBSS HQI001 La presente invención proporciona ácidos nucleicos que codifican a polipéptidos sustancialmente homólogos a una sintasa de almidón enlazada al gránulo aislada del HOI001 vegetal endógamo (HOI001 GBSS). En una modalidad, estas moléculas de ácido nucleico se usan en el contexto de la presente invención para incrementar el contenido de aceite de tejidos vegetales. En una modalidad, la presente invención proporciona un ácido nucleico aislado que codifica una proteína de HO1001 GBSS, cuyo ácido nucleico es seleccionado del grupo que consiste de la SEC ID NO: 1 y complementos de la misma, y ácidos nucleicos que codifican a polipéptidos que tengan al menos 94 % de identidad de secuencia con la SEC ID NO: 3. El por ciento de identidad de secuencia de los polipéptidos codificados por ácidos nucleicos de esta invención son preferiblemente al menos 95 %, y más preferiblemente al menos aproximadamente 98 %. La presente invención también proporciona vectores que contienen ácidos nucleicos de HOI001 GBSS tales. Como se expone con más detalle posteriormente, los ácidos nucleicos preferidos incluyen elementos reguladores apropiados unidos operablemente a éstos. Que facilitan la expresión eficiente de los ácidos nucleicos de la invención en un huésped, incluyendo sin limitación bacterias, hongos, o huéspedes vegetales. Vectores útiles en el contexto de la presente invención puede incluir dichos elementos reguladores. Los ácidos nucleicos y vectores abarcados por la presente invención necesitan no tener las secuencias de ácidos nucleicos exactas descritas en la presente. Preferiblemente, las secuencias de estos ácidos nucleicos y vectores pueden variar, mientras que el ácido nucleico ya sea efectúa la función para la cual se previo o bien alguna otra utilidad, por ejemplo, como una sonda de ácido nucleico para ácidos nucleicos complementarios. Por ejemplo, se permite alguna variabilidad de secuencia en cualquier parte de un ácido nucleico de HOI001 GBSS mientras que la transformación de un vegetal con el polipéptido variante o mutante o polipéptidos que dan como resultado un fenotipo sustancialmente similar al de HOI001 GBSS. Mayormente se prefiere que, la variabilidad de secuencia anteriormente mencionada sea la acumulación de aceite creciente en tejidos vegetales, en comparación con vegetales del mismo o similar genotipo, pero sin el transgen. El fragmento y los ácidos nucleicos variantes de la SEC ID NO: 1, son también abarcados por la presente invención. Los fragmentos de ácido nucleico abarcados por la presente invención son de tres tipos generales. Primero, fragmentos de ácidos nucleicos que no son de extensión total pero que efectúan su función prevista son abracados en la presente invención. Segundo, fragmentos de ácidos nucleicos identificados en la presente que son útiles como sondas de hibridización, se incluyen también en la invención. Y tercero, fragmentos de ácidos nucleicos identificados en la presente pueden ser usados en tecnologías de supresión conocidas en el arte, tales como, por ejemplo, tecnología anti-sentido o de inhibición de ARN (ARNi), que se proporciona para reducir el flujo de carbono en un vegetal en aceite, haciendo más disponible el carbono para la acumulación de proteínas o almidón, por ejemplo, Por consiguiente, fragmentos de una secuencia de nucleótidos, tal como la SEC ID NO: 1 pueden variar desde al menos 15 nucleótidos, aproximadamente 17 nucleótidos, aproximadamente 18 nucleótidos, aproximadamente 50 nucleótidos, aproximadamente 100 nucleótidos o más. En general, un fragmento de ácido nucleico de la presente invención puede tener cualquier ¡imite superior de tamaño mientras que es relacionado en secuencia a los ácidos nucleicos de la presente invención pero no se incluye la extensión total. Como se usa en la presente, "variantes" tienen secuencias homologas sustancialmente o sustancialmeníe similares en comparación con la secuencia de tipo salvaje o de referencia. Para secuencias de nucleótidos que codifican a proteínas, las variantes también incluyen aquellas secuencias que, a causa de la degeneración del código genético, codifica a la secuencia de aminoácidos idéntica de la proteína de referencia. La variante de ácidos nucleicos también incluyen aquellas que codifican a polipéptidos que no tienen secuencias de aminoácidos idéntica s a la de las proteínas identificadas en la presente, pero que codifican a una proteína activa con cambios conservadores en la secuencia de aminoácidos. La presente invención no se limita a cambios silenciosos en las secuencias de nucleótidos de la presente. Sino que también incluye secuencias de ácidos nucleicos variantes que alteran conservadoramente la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de la presente invención. Porque es la capacidad interactiva y la naturaleza de una proteína que define que la actividad funcional biológica de la proteína, pueden hacerse ciertas sustituciones de secuencias de aminoácidos en una secuencia de proteína y, por supuesto, sus secuencias codificadoras de ADN subordinadas y, no obstante, una proteína con propiedades iguales puede aún ser obtenida. Los inventores contemplaron que pueden hacerse varios cambios en las secuencias de péptidos de las proteínas o fragmentos de la presente invención, o secuencias de ADN correspondientes que codifican a los péptidos, sin apreciable pérdida de su utilidad o actividad biológica. De conformidad con la presente invención, entonces, ácidos nucleicos de referencia y variantes de la presente invención pueden diferir en la secuencia de aminoácidos codificada por una o más sustituciones, adiciones, inserciones, eliminaciones, fusiones, y truncaciones, que pueden estar presentes en cualquier combinación, mientras que una proteína HOI001 HBSS activa es codificada por el ácido nucleico variante. Dichos ácidos nucleicos variantes, no codificarán exactamente a la misma secuencia de aminoácidos que el ácido nucleico de referencia, pero tienen cambios de secuencia conservadora. Los codones capaces de codificar para dichas sustituciones de aminoácidos conservadora son bien conocidos en el arte. Otro procedimiento para identificar sustituciones de aminoácidos conservadoras requieren análisis del índice hidropático de aminoácidos puede ser considerado. La importancia del índice hidropático de aminoácidos al conferir la función biológica interactiva sobre una proteína se entiende generalmente en el arte (Kyte y Doolittle, J. Mol. Biol., 157:105-132 (1982)). Se acepta que el carácter hidropático relativo del aminoácido contribuye a la estructura secundaria del polipéptido resultante, el cual a su vez define la interacción de la proteína con otras moléculas, por ejemplo, enzimas, sustratos, receptores, ADN, anticuerpos, antígenos, y los similares. A cada aminoácido se le ha asignado un índice hidropático con base en su hidrofobicidad y características de carga (Kyte y Doolittle, J. Mol. Biol. 157: 105-132 (1982)); estos son isoleucina (+4.5), valina (+4.2), leucina (+ 3.8), fenilalanina (+ 2.8), cisteina/cistina (+ 2.5), metionina (+ 1.9), alanina (+ 1.8), glicina (- 0.4), treonina (-0,7), serina (-0.8), triptofano (-0.9), tirosina (- 1.3), prolina (-1.6), hístidina (-3.2), glutamato (- 3.5), glutamina (-3.5), aspartato (-3.5), asparagina (-3.5), lisina (-3.9), y arginina (- 4.5). Al efectuar dichos cambios, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos están en ± 2, son particularmente preferidos aquellos que están en ± 1 , y son aún más particularmente preferidos aquellos que están en ± 0.5. Se comprende también en el arte que las sustituciones de aminoácidos iguales puede hacerse efectivamente con base en la hidrofobicidad. La Patente 4,554,101 , establece que la hidrofobicidad promedio local máxima de una proteína, que se rige por la hidrofilicidad de sus aminoácidos adyacentes, se correlaciona con una propiedad biológica de la proteína. Como se describe en la Patente U.S. 4,554,101 , s easignaron los valores siguientes de hidrofilicidad a residuos de aminoácidos: arginina (+ 3.0), lisina (+ 3.0), glutamato (+ 3.0 ± 1), serina (+ 0.3), asparagina (+ 0.2), glicina (0), treonina (- 0.4), prolina (- 0.5 ± 1), alanina (- 0.5), histidina (- 0.5), cisteina (- 1.0), metionina (- 1.3), valina (- 1.5), leucina (- 1.8), isoleucina (-1.8), tirosina (- 2.3), fenilalanina (- 2.5), y triptofano (- 3.4). Al hacer dichos cambios, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilicidad están en + 2,, son particularmente preferidos aquellos que están en ± 1 , y son aún más particularmente preferidos aquellos que están en ± 0.5. Acidos nucleicos variantes con cambios silenciosos y conservadores pueden ser definidos y caracterizados por el grado de homología con el ácido nucleico de referencia Acidos nucleicos variantes preferidos son sustancialmente homólogos a los ácidos nucleicos de referencia de la presente invención. Como reconocerán los expertos en la materia, dichos ácidos nucleicos sustancialmente similares pueden hibridizar bajo condiciones severas con los ácidos nucleicos de referencia identificados por la SEC ID NO: 1 , de la presente. Estos tipos de ácidos nucleicos sustancialmente homólogos están abarcados en esta invención. Acidos nucleicos variantes pueden ser detectados y aislados por medio procedimientos de hibridización estándares. La hibridización para detectar y asilar dichas secuencias se lleva a cabo bajo "severidad moderada" y preferiblemente bajo condiciones "severas", las condiciones de lavado de hibridización moderadamente severas e hibridización severa y moderadamente severa usadas en el contexto de experimentos de hibridización de ácidos nucleicos, tales como hibridización Northern y Southern, son dependientes de la secuencia, y son diferentes bajo parámetros ambientales diferentes. Las secuencias más largas hibridizan específicamente a temperaturas más altas. Una guía extensiva para la hibridización de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry ans Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, página, Capítulo 2 "Overview of principies of hybridization and the strategy os nucleic acid probé assays", Elsevier, NY (1993). Ver también, J. Sambrok y colaboradores, Moelcular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, NY, pásg 9.31-9.58 (1989) J. Sambrook y colaboradores Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, NY 3a. Ed. 2001). La presente invención también proporciona métodos para la detección y aislamiento de derivados o variantes de ácidos nucleicos que codifican a las proteínas proporcionadas en la presente. Los métodos involucran hibridizar al menos una porción de un ácido nucleico que comprende cualquier parte de la SEC ID NO: 1 con respecto a secuencias relacionadas con HOI001 GBSS, para un ácido nucleico muestra, formando así un complejo de hibridización; y detectar el complejo de hibridización. La presencia del complejo se correlaciona con la presencia de un derivado o variante de ácido nucleico que puede ser caracterizado adicionalmente por la secuenciación del ácido nucleico, expresión de ARN y/o proteína y prueba para determinar si el derivado o variante retiene la habilidad para incrementar niveles de aceite en tejido vegetal cuando se transforma en ese vegetal. En general, la porción de un ácido nucleico que comprende cualquier parte de la SEC ID NO: 1 usada para hibridización es preferiblemente al menos aproximadamente de quince nucleótidos, y la hibridización es bajo condiciones de hibridización que son suficientemente severas para permitir la detección y el aislamiento de ácidos nucleicos homólogos sustancialmente, preferiblemente, las condiciones de hibridización son "moderadamente severas", más preferiblemente las condiciones de hibridización son "severas", como se define en la presente y en el contexto de las técnicas de biología molecular convencionales, bien conocidas en el arte.

De manera general, las condiciones de lavado y de hibridización muy severas son seleccionadas para ser de aproximadamente 5 °C más bajo que el punto de fusión térmica (Tm) para la secuencia de doble hebra específica a una fuerza iónica y pH definidas. Por ejemplo, bajo "condiciones muy severas" o "condiciones de hibridización muy severas" un ácido nucleico hibridizará a su complemento en un grado detectablemente mayor que otras secuencias (por ejemplo, al menos dos veces sobre el fondo). Por control de las condiciones de severidad de la hibridización y/o de lavado, pueden ser identificados y aislados ácidos nucleicos que tienen 100 % de complementaridad. Típicamente, condiciones de severidad serán aquellas en las cuales la concentración de sales es menor de aproximadamente concentración de 1.5 M de ión sodio, típicamente aproximadamente 0.01 a 1.0 M de ión sodio ( u otras sales) a pH de 7.0 a 8.3 y la temperatura es de al menos 30 °C para sondas cortas (por ejemplo, 10 a 50 nucleótidos) y al menos aproximadamente 60 °C para sondas largas (por ejemplo, mayor de 50 nucleótidos). Las condiciones de severidad pueden también lograrse con la adición de agentes desestabilizantes tales como formamida, en cuyo caso las temperaturas de hibridización pueden ser disminuidas. Sulfato de dextrano y/o solución de Denhardt (Denhardt 50X es Ficoll al 5 %, polivinilpirrolidona al 5 %, BSA al 5 %) pueden también ser incluidos en las reacciones de hibridización. Las condiciones de baja severidad ejemplares incluyen la hibidizaicón con una solución reguladora de 30 a 50 % de formamida, SSC 5X (SSC 20X es NaCI 3M, citrato trisódico 0.3 M), 50 mM de fosfato de sodio, pH de 7, 5 mM de EDTA, SDS al 0.1 % (dodecil sulfato de sodio), solución de Denhardt 5X con 100 g/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado a 37 °C, y un lavado en SSX 1X (SSX 20X definido como NaCI 3.0 M y citrato trisódico 0.3 M), SDS al 0.1 % a 37 °C. Las condiciones de severidad moderadas ejemplares incluyen la hibridización en 40 a 50 % de formamida, SSC 5X, 50 mM de fosfato de sodio, pH de 7, 5 mM de EDTA, SDS al 0.1 %, solución de Denhardt 5X con 100 µ?/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado a 42 °C, y un lavado en SSC 0.1X a 2X, SDS al 0.1 % a 42 a 55 °C. Las condiciones de alta severidad ejemplares incluyen la hibridización en formamida al 50 %, SSC 5X, 50 mM de fosfato de sodio, pH de 7.0, 5 mM de EDTA, SDS al 0.1 %, solución de Denhard 5X con 100 pg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado a 42 °C, y un lavado en SSC al 0.1X, SDS al 0.1 % a 60 a 65 °C. En otra modalidad de la presente invención, los ácidos nucleicos de la invención se definen por la relación del por ciento de identidad entre ácidos nucleicos particulares y otros elementos de la clase que usa protocolos analíticos bien conocidos en el arte. Dichos protocolos analíticos incluyen, pero no se limitan a: CLUSTAL en el programa de PC/Gene (disponible de Intelligenetics, Mountain View, CA o en el programa Omiga versión 2.0 Accelerys Inc., San Diego, CA); el programa ALIGN (Versión 2.0); y GAP, BESTFIT, BLAST; FASTA, y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Versión 8 (disponible de Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Drive, Madison, Wl). La alineación que usa estos programas pueden ser efectuados usando los parámetros faltantes. El programa CLUSTAL es descrito bien por Higgins y colaboradores, Gene, 73: 237-244 (1988), Higgins y colaboradores, CABIOS, 5:151-153 (1989); Corpet y colaboradores, Nucleic Acids Res., 16:10881-10890 (1988); Huang y colaboradores, CABIOS, 8: 155-165 (1992); y Pearson y colaboradores, Meth. Mol. Bio!. 24: 307-331 (1994). El programa ALIGN se basa en el algoritmo de Meyers y Miller, Computer Applic. Biol. Sci., 4:11-17 (1988). El programa BLAST de AltschuI y colaboradores, J. Mol. Biol., 215:403 (1990), se basan en el algoritmo de Karlin y AltschuI, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 87:2264-2268 (1990). Para obtener alineaciones espaciadas para propósitos de comparación, puede utilizarse Gapped BLAST (en BLAST 2.0) como se describe en AltschuI y colaboradores, Nucleic Acids Res., 25:3389 (1997). De manera alternativa, puede usarse PSI-BLAST (en BLAST 2.0) para efectuar una búsqueda iteractiva que detecta relaciones distantes entre moléculas. Ver, AltschuI y colaboradores, supra. Cuando se utiliza BLAST, Gapped BLAST, PSI-BLAST, los parámetros faltantes de los programas respectivos (por ejemplo, BLASTN para secuencias de nucleótidos, BLASTP para proteínas) pueden ser usados. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) usa como faltantes una extensión de palabra (W) de 11 , una esperanza (E) de 10, un límite de 00, M = 5, N = 4, y una comparación de ambas hebras. Por secuencias de aminoácidos, el programa BLAST usa como faltantes una extensión de palabra (W) de 3, una esperanza (E) de 10, y la matriz de calificación BLOSUM62 (ver, (Henikoff & Henikoff, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 89: 10915 (1989) (ver, http://www.ncbi.nlm.nih.gov.). La alineación puede también efectuarse manualmente por inspección. Para propósitos de la presente invención, la comparación de secuencias de nucleótidos para la determinación del por ciento de identidad de secuencias con secuencias de ácidos nucleicos descritos en la presente se hace preferiblemente usando el programa BLAST (versión 1.4.7 o posterior) con sus parámetros faitantes o cualquier otro programa equivalente. Por "programa equivalente" se quiere decir cualquier programa de comparación de secuencias que, para dos secuencias cualquiera en cuestión, genera una alineación que tenga parejas de aminoácidos o de nucleótidos idénticas y un por ciento de identidad de secuencias idéntico en comparación con la alineación correspondiente generada por medio del programa preferido.

Vectores y "Cassettes" de Expresión Los vectores y cassettes de expresión de la presente invención incluyen ácidos nucleicos que codifican a HOI001 GBSS. Un transgen que comprende un HOI001 GBSS puede ser subclonado en un vector o "cassette" de expresión, y la expresión de HOI001 GBSS puede ser detectada y/o cuantificada. Este método de cribado es útil para identificar transgenes que se proporcionan para una expresión de un HOI001 GBSS, y la expresión de HOI001 GBSS en una célula vegetal transformada.

Los vectores plásmidos que se proporcionan para facilidad de selección, amplificación, y transformación del transgen en células procarióticas y eucarióticas incluyen, por ejemplo, vectores derivados de pUC, vectores derivados de pSK, vectores derivados de pGEM, vectores derivados de pSP, vectores derivados de pBS, pFastBac (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) para expresión de baculovirus y pYES2 (Invitrogen) para expresión de levaduras. Los elementos adicionales pueden estar presentes en dichos vectores, incluyendo orígenes de replicación para proporcionar la replicación autónoma del vector, genes marcadores seleccionabas, preferiblemente que codifican la resistencia a antibióticos o herbicidas, sitios de clonación múltiple únicos que se proporcionan para sitios múltiples para insertar secuencias de ADN o genes que codifican en el transgen, y secuencias que mejoran la transformación de células procarióticas y eucarióticas. Un vector que es útil para la expresión tanto en vegetales como en células procarióticas es el plásmido binario ?? (como se describe en Shilperoot y colaboradores, Patente U.S. 4,940,838), como se ejemplifica por el vector pGA582. Este vector plásmido binario Ti ha sido caracterizado previamente por An., Method ¡n Enzymology, 153:292 (1987). Este vector binario Ti puede ser replicado en bacterias procarióticas, tales como E. coli y Agrobactenum. Los vectores plásmidos de Agrobactenum pueden también ser usados para transferir el transgen a células vegetales. Los vectores binarios T1 preferiblemente incluyen los límites derecho e izquierdo del ADN de T para proporcionar eficiente transformación de la célula vegetal, un gen marcador seleccionable, sitios de clonación múltiple únicos en las regiones limitantes de T, la replicación de colE1 de origen y un replicón de amplio intervalo de huésped. Los vectores binarios T-i que portan un transgen de la presente invención pueden ser usados para transformar tanto células procarióticas como eucarióticas, pero preferiblemente se usan para transformar células vegetales, (ver, Glassman y colaboradores, Patente U.S. 5,258,300). Ejemplos de vectores de expresión vegetal incluyen los vectores comerciales pBI101 , pBI101.2, pBI101.3, y pBIN19 (Clontech, Palo Alto, CA). En general, los vectores y "cassettes" de expresión de la presente invención contienen al menos un promotor capaz de expresar al ARN en una célula vegetal y un terminador, además de un ácido nucleico que codifica a un HOI001 GBSS. Pueden estar presentes otros elementos en los "cassettes" de expresión de la presente invención. Por ejemplo, los "cassettes" de expresión pueden contener también mejoradores, intrones, secuencias líderes sin trasladar, sitios de clonación, regiones de fijación de matriz para silenciar los efectos de los elementos de control cromosómico, y otros elementos conocidos por un experto en la materia. Los "cassettes" de expresión tienen promotores que regulan la expresión genética. Las regiones promotoras se encuentra típicamente en la secuencia de ADN de flanqueo de 5' a 3' de regiones codificadoras tanto en células procarióticas como eucarióticas. Se porporciona una secuencia promotora para la regulación de la transcripción de la secuencia del gen de 3' a 5' e incluye típicamente desde aproximadamente 50 a aproximadamente 2,000 pares base de nucleótidos. Las secuencias promotoras también contienen secuencias reguladoras, tales como secuencias mejoradoras que pueden influir el nivel de la expresión genética. Se pueden proporcionar algunas secuencias promotoras aisladas para la expresión genética de genes heterólogos, esto es, un gen diferente del gen nativo u homólogo. Las secuencias promotoras se conocen también por ser fuertes o débiles o inducibles. Un promotor fuerte se proporciona para un alto nivel de expresión genética, mientras que un promotor débil se proporciona para un nivel de expresión genética muy bajo. Un promotor inducible es un promotor que se proporciona para iniciar y detener la expresión genética en respuesta a un agente añadido exógenamente o a un estímulo ambiental o de desarrollo. Los promotores se pueden también proporcionar para regulación de desarrolla o específica de tejido. Una secuencia promotora aislada que es un promotor fuerte para genes heterólogos es ventajosa porque se proporciona para un nivel suficiente de expresión genética para facilitar la detección y la selección de células transformadas y se proporciona para un alto nivel de expresión genética cuando se desee. Las regiones de iniciación de la transcripción que se expresan preferentemente en tejido de semillas, y que son indetectables en otras partes vegetales, se consideran deseables para modificaciones en semillas oleosas a fin de minimizar cualquier efecto disruptivo o adverso del producto genético. Los promotores de la presente invención incluirán generalmente, pero no se limitarán a, promotores que funcionan en bacterias, células vegetales, o plástidos. Los promotores útiles para expresión bacteriana son los promotores C de lacZ, 17, T5 o glg de E coli. Los promotores útiles para células vegetales incluyen el promotor de gluteina de alto peso molecular de trigo (2647-3895 pb de No. de Acceso de GenBank X12928, versión X12928.3, descrito originalmente en Anderson y colaboradores, Nucleic Acids Res., 17: 461- 462 (1989), el promotor de globulina (ver, Belanger y Kriz, Genet, 129: 863-872, (1991)), promotor Z27 gama de ceína (ver, Número de Serie U.S. 08/763,705; también, López y colaboradores, Mol. Gen. Genet., 247: 603-613 (1995)), promotor de oleoresina L3 (patente U.S. 6,433,252), promotor 35S de CaMV (Odell y colaboradores, Nature, 313:810 (1985)), el 19S de CaMV (Lawton y colaboradores, Plant Mol. Biol., 9:31 F (1987)), nos (Ebert y colaboradores Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 84:5745 (1987)), Adh (Walker y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 84: 6624 (1987)), sacarosa sintasa (Yang y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 87:4144 (1990)), tubulina, actina (Wang y colaboradores, Mol. Cell. Biol., 12:3399 (1992)), cab (Sullivan y colaboradores, Mol. Gen. Genet., 215:431 (1989)), promotor de PEPCasa (Hudspeth y colaboradores, Plant Mol. Biol., 12:579 (1989)), o aquellos asociados con el complejo genético R (Chandler y colaboradores, The Plant Cell, 1: 175 (1989)). Realmente, en una modalidad preferida el promotor usado es altamente expresado en el endosperma. Los promotores ejemplares incluyen aquellos de las ceínas que son un grupo de proteínas de almacenamiento encontradas en endosperma de maíz. Los clones genómicos para genes de ceína han sido aislados (Pedersen y colaboradores, Cell, 29:1015-1026 (1982) y Russell y colaboradores, Transgenic Res., 6(2): 157-168 (1997) y los promotores de estos clones, incluyendo los genes de 15 kD, 16 kD, 19 kD, 22 kD, y 27 kD (Z27, Número de Serie U.S. 08/763,705; también Reina y colaboradores, Nucí. Acid. Res., 18:6426 (1990), Lopes y colaboradores, Mol. Gen. Genet., 247:603-613 (1995)), pueden también usarse. Otros promotores preferidos, conocidos por funcionar en maíz, y en otros vegetales, incluyen los promotores de los genes siguientes: WAXY (sintasa de almidón enlazada a granulo; Shure y colaboradores, Cell, 35: 225-233 (1983); Russell y colaboradores, Trangenic Res., 6(2): 157-168 (1997)), Brittie 2 y Shrunken 2 (glucosa pirofosforilasa ADP, Anderson y colaboradores, Gene, 97:199-205 (1991), Russell y colaboradores, Transgenic Res., 6(2): 157-168 (1997)), Shrunken 1 (sacarosa sintasa, Yang y Russell, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 87:4144-4148 (1990)), enzimas ramificadas I y II, promotor WAXY de arroz, (Terada y colaboradores, Plant Cell Physiology, 41 (7): 881-888 (2000)), enzimas desramificadas, glutelinas (Zheng y colaboradores, Plant J., 4: 357-366 (1993), Russell y colaboradores, Transgenic Res., 6(2): 157-168 (1997)), y BetU (capa de transferencia de endosperma basal: Hueros y colaboradores, Plant Physiol., 121 :1143-1 152 (1999)). Otros promotores útiles en la práctica de la presente invención que son conocidos por los expertos en la materia de contemplan también en la invención. Además, pueden ser usados mejoradores de transcripción o duplicados de mejoradores para incrementar la expresión de un promotor particular. Ejemplos de dichos mejoradore sincluyen, pero no se limitan a , elementos del promotor 35S de CaMV y genes de octopina sintasa (Last y colaboradores, Patente U.S. 5,290,924). Como la secuencia de ADN entre el sitio de iniciación de la transcripción y el de inicio de la secuencia codificadora, es decir, la secuencia líder no trasladada, puede influir la expresión del gen, uno puede también desear emplear una secuencia líder particular. Puede emplearse cualquier secuencia líder disponible para un experto en la materia. Las secuencias líderes preferidas dirigen niveles óptimos de expresión del gen fijado, por ejemplo, por incremento o mantenimiento de la estabilidad del mARN y/o por prevención de la iniciación inapropiada de traslación (Joshi, Nucí. Acid. Res., 15:6643 (1987)). La selección de dichas secuencias es a discreción de los expertos en la materia. Las secuencias que se derivan de genes que son muy expresados en vegetales superiores, y en soya, maíz, y en particular se contemplan en soya. Los "cassettes" de expresión de la presente invención también incluirán una secuencia cerca del extremo 3' del "cassette" que actúa como una señal para terminar la transcripción a partir de un ácido nucleico heterólogo y que dirige la poliadenilación del mARN resultante. Estos son mencionados comúnmente como regiones 3' no trasladadas o 3'UTRs. Algunos elementos de 3' que pueden actuar como señales de terminación de transcripción incluyen 31 3'UTR HSP17 de trigo, (532-741 pb de GenBank X13431 , versión X13431.1 , McElvan y Spiker, Nucleic Acid Res., 17: 1764 (1989)), las del gen de la nopalina sintasa de Agrobacterium tumefaciens (Bevan y colaboradores, Nucí. Acid Res., 11 :369 (1983)), un 3'UTR de napina (Kridl y colaboradores, Seed Sci. Res., 1 : 209-219 (1991)), un 3'UTR de globulina (Belanger y Kriz, Genetics, 129:863-872 (1991)), o una del gen de ceína, tal como Z27 (López y colaboradores, Mol. Gen Genet, 247: 603-613 (1995)). Otros elementos en 3' conocidos por los expertos en la materia también puden ser usados en los vectores de la presente invención. Elementos reguladores, tales como el intron I Adh (Callis y colaboradores, Genes Develop., 1:1183 (1987)), un intron de actina de arroz (McEIroy y colaboradores, Mol. Gen. Genet., 231 (1):150-160 (1991)), intron de sacarosa sintasa (Vasil y colaboradores, Plant Physiol., 91 :5175 (1989)), el intrón HSP70 de maíz (Rochester y colaboradores, EMBO J., 5:451-458 (1986)), o el elemento TMV omega (Gallie y colaboradores, The Plant Cell, 1 :301 (1989)) pueden adicionalmente ser incluidos donde se desee. Estas secuencias reguladoras no trasladadas en 30 pueden ser obtenidas como se describe en An, Methods in Enzymology, 153:292 (1987) o están ya presentes en plásmidos disponibles de fuentes comerciales, tales como Clontech, Palo alto, CA. Las secuencias reguladores no trasladadas 3' pueden ser operablemente unidas en el terminus 3' de cualquier ácido nucleico heterólog para ser expresadas por medio de los "cassettes" de expresión contenidos en los vectores de la presente. Otros elementos reguladores tales útiles en la práctica de la presente invención son conocidos por los expertos en la materia y pueden también colocarse en los vectores de la invención. Los vectores de la presente invención, así como también las regiones codificadoras reclamadas en la presente, pueden ser optimizadas para expresión en vegetales por tener uno o más codones reemplazados por otros codones que codifican a los mismos aminoácidos de modo que el polipéptido sea trasladado óptimamente por la maquinaria de traslación de la especie vegetal en la cual se usó el vector.

Marcadores Seleccionables Genes marcadores seleccionables o genes informadores don también útiles en la presente invención. Dichos genes pueden impartir un fenotipo distinto a células que expresan al gen marcador y permitir así que dichas células transformadas sean diferenciadas de las células que no tengan el marcador. Los genes marcadores seleccionables confieren un rasgo que uno puede "seleccionar" por cualquier medio químico, es decir, a través del uso de un agente selectivo (por ejemplo, un herbicida, o los similares). Genes informadores, o genes cribables, confieren un rasgo que uno puede identificar a través de observación o prueba, es decir, por "cribado" (por ejemplo, el rasgo de locus-R). Pos supuesto, muchos ejemplos de genes marcadores adecuados son conocidos en la materia y pueden ser empelados en la práctica de la presente invención. Numerosos genes marcadores seleccionables son conocidos en la materia y pueden ser usados en la presente invención. Un gen marcador seieccionable para uso en la presente invención podría incluir genes que confieran resistencia a herbicidas como glifosato, tales como EPSP (Della- Ciopa y colaboradores, Bio/Technology, 5(6):579-84(1987)). Un marcador seleccionable preferido particularmente incluiría un gen que codifica a una proteína de EPSP sintasa alterada (Hinchee y colaboradores, Biotech., 6:915 (1988). Otros posibles marcadores seleccionares para uso en conexó'n con 5 la presente invención incluyen, pero no se limitan a, un gen neo (Potrykus y colaboradores, Mol. Gen Genet., 199:183(1985)) que codifica para resistencia a kanamicina y puede ser seleccionado por aplicación de kanamicina, un análogo de kanamicina tal como geneticina (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO), y los similares, un gen bar que codifica para resistencia a bialafos, í o un gen de nitrilasa, tal como bxn de Klebsiella azaenae, que confiere resistencia a bromoxinilo (Stalker y colaboradores, Science, 242:419 (1988)); un gen de acetolasa sintasa muíante (ALS) que confiere resistencia a imidazolinona, sulfonilurea u otros productos químicos que inhiben a ALS (EP 154 204a1 (1985)), un gen de DHFR resistente a metotrexate (Thillet y 15 colaboradores, J. Biol. Chem., 263: 12500 (1988)); un gen de dalapon deshalogenasa que confiere resistencia al herbicida dalapon. Donde un gen de EPSP sintasa muíante se emplea, pueden realizarse beneficios adicionales a través de la incorporación de un péptido de tránsito a plástido adecuado (CTP). 0 Los marcadores cribables que pueden ser empleados incluyen, pero no se limitan a, una ß-glucuronidasa o gen uidA (GUS), que codifica a una enzima para la cual se conocen varios sustratos cromogénicos; y gen de locus-R, que codifica a un producto que regula la producción de pigmentos de antocianina (color rojo) en tejidos vegetales (Dellaporta y colaboradores, In Chromosome Structure and Function, pág. 263-282 (1988)); un gen de ß-lactamasa (Sutcliffe, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A, 75: 3737 (1978)), que codifica a una enzima para la cual se conocen varios sustratos cromogénicos (por ejemplo, PADAC, una cefalosporina cromogénica); un gen xylE (Zukowsky y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 80:1101 (1983)) que codifica a un catecol dioxigenasa que puede convertir catecoles cromogénicos; un gen de a-amilasa (Ikuta y colaboradores, Biotech., 8:241 (1990)); un gen de tirosinasa (Katz y colaboradores, J. Gen. Micorbiol., 129:2703 (1983)) que codifica a una enzima capaz de oxidar tirosina a DOPA y dopaquinona, que a su vez se condensa para formar el compuesto de melanina fácilmente detectable; un gen de ß-galactosidasa, que codifica a una enzima para la cual hay sustratos cromogénicos, un gen de luciferasa (lux) (Ow y colaboradores, Science, 234:856 (1986)), que permite la detección por bioluminiscencia; o un gen de aequorina (Prasher y colaboradores, Biochem. Biophys. Res. Común., 126:1259 (1985)), que puede ser empleado en detección por bioluminscencia sensible al calcio, o un gen de proteína verde fluorescente (Niedz y colaboradores, Plant Cell Reports, 14:403 (1995). En una modalidad preferida, el gen marcador cribable es operablemente unido a un promotor específico de aleurona como se describe en Kriz y colaboradores, en la Patente U.S. 6,307,123. Además de la transformación vegetal nuclear, la presente invención también se extiende para dirigir la trasnformación del genoma plástido de vegetales. Por consiguiente, la terminación del producto genético en un compartimento intracelular en células vegetales puede lograrse también por liberación directa de un gen en el compartimento intracelular. En algunas modalidades, la transformación directa del genoma del plástido pueden proporcionar beneficios adicionales sobre la transformación nuclear. Por ejemplo la transformación del plástido directa de HOI001 GBSS elimina el requerimiento de un péptido que termina en plástido y el transporte post-traslacional y el procesamiento de la pre-proteína derivada de los trasformantes nucleares correspondientes. La transformación del plástido de vegetales ha sido descrita por P. Maliga, Current Opinión in Plant Biology, 5: 164- 172 (2002), Heifetz, Biochimie, 82:655-666 (2000), Bock, J. Mol. Biol., 312: 425-438 (2001), y Daniell y colaboradores, Trends in Plant Science, 7:84-91 (2002), y referencias citadas en la presente. Después de construir un trasngen que contenga un HOI001 GBSS, el vector o "cassette" de expresión puede entonces ser introducido en una célula vegetal. Dependiendo del tipo de célula vegetal, el nivel de expresión del gen, y la actividad de la enzima codificada por el gen, introducción del ADN que codifica a un HOI001 GBSS en la célula vegetal puede conducir a contenido de aceite creciente en tejidos vegetales.

Transformación Vegetal Las técnicas para transformar una célula vegetal, un tejido vegetal, un órgano vegetal, o un vegetal con una construcción de ácido nucleico, tal como un vector son conocidas en el arte. Dichos métodos involucran técnicas de cultivo de tejido vegetal, por ejemplo. Como se usa en la presente, "transformar", se refiere a la introducción de un ácido nucleico en un huésped recipiente y a la expresión en éste. La célula vegetal, tejido vegetal, órgano vegetal; o vegetal pueden ser puestos en contacto con el vector por medios adecuados que se conocen en el arte. Preferiblemente, se produce un vegetal transgénico que expresa a la proteína deseada. Varios métodos para la introducción de una secuencia de polinucleótidos deseada que codifica a la proteína deseada en células vegetales incluye, pero no se limita a: (1) métodos físicos tales como microinyección (Capecchi, Cell, 22(2):479-488 (1980), electroporación (Fromm y colaboradores, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 82(17): 5824-5828 (1985); Patente U.S. 5,384,253), y liberación mediada por bombardeo de microproyectiles (Christou y colaboradores, Bio/Technology, 9:957 (1991); Fynan y colaboradores, Proc. Acad. Sci. U.S.A., 90(24):11478-1 1482 (1993)); (2)métodos de liberación mediada por virus (Clapp, Clin, Perinatol., 20(1):155-168 81993); Lu y colaboradores, J. Exp. Med., 178(6):2089-2096 (1993); Eglitis y Anderson, Biotechniques, 6(7): 608-614 (1988); y (3) métodos de transformación mediada por Agrobacteríum. La mayoría de los métodos de transformación de células vegetales usados comúnmente son el proceso de transferencia de ADN mediado por Agrobacteríum (Fraley y colaboradores, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 80:4803 (1983) y el proceso mediado por bombardeo de microproyectiles. Típicamente, se desea la transformación nuclear pero donde es deseable para transformar específicamente plástidos, tales como cloroplastos, o amiloplastos, plástidos vegetales pueden ser transformados utilizando la liberación mediada por bombardeo de microproyectiles del polinucleótido deseado para ciertas especies vegetales tales como tabaco, Arabidopsis, papa, y Brassica napus. Se logró la transformación mediada por Agrobacterium a través del uso de una bacteria del suelo diseñada genéticamente que pertenece al género Agrobacterium. Varias especies de Agrobacterium median la transferencia de un ADN específico conocido como "ADN-T", que puede ser genéticamente diseñado para portar cualquier pieza de ADN deseada en muchas especies vegetales. Los eventos principales que marcan el proceso de patogénesis mediada por ADN-T son: introducción de genes de virulencia, procesamiento, y transferencia de ADN-T. Este proceso es el objeto de muchas publicaciones (Ream, Ann. Rev. Phytopathol., 27:583-618 (1989); Howard y Citovsky, Bioassays, 12: 103-108 (1990). Kado, Crit. Rev. Plant. ScL, 10:1-32 (1991); Zambriski, Annual Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 43:465-490 (1992); Geivin, In Transgenic Plants, Kung y Wu, (eds.), Academic Press, San Diego, CA, pág. 49-87 (1993); Binns y Howitz, In Bacterial Pathogenesis of Plants and Animáis, Dang (ed.) . Berlín: Springer Verlag, pág. 119-138 (1994); Hooykaas y Beijersbergen, Ann. Rev. Phytopathol., 32:157-179 (1994); Lessl y Lanka, Cell, 77:321-324 (1994); Zupan yZambryski, Annual Rev. Phytopathol., 27: 583-618 (1995)).

La transformación de vegetales mediada por Agrobacterium involucra varias etapas. La primera etapa, en la cual el Agrobacterium virulento y las células vegetales son primero puestas en contacto entre sí, es generalmente denominada "inoculación". La solución que contiene Agrobacterium en entonces retirada del contacto con el tejido extirpado por dren o por aspiración. Después de la inoculación, el Agrobacterium y las células/tejidos vegetales son cultivados juntos por un período de varias horas a varios días o más bajo condiciones adecuadas para cultivo y transferencia de ADN-T. Esta etapa es denomina "co-cultivo". Después del co-cultivo y de liberación del ADN-T, las células vegetales son tratadas con agentes bactericidas o bacteriostáticos para destruir el Agrobacterium remanente en contacto con el tejido extirpado y/o el recipiente que contiene el tejido extirpado. Si se hace esto en ausencia de cualquier agente selectivo para promover el cultivo preferencial de células vegetales transgénicas o no transgénicas, entonces esto es típicamente mencionado como la etapa de "retardo". Si se hace esto en presencia de presión selectiva que favorece las células vegetales transgénicas, entonces se menciona como etapa de "selección". Cuando hay un "retardo", es típicamente seguido por una o más etapas de "selección". Ambas etapas de "retardo" y de "selección" incluyen típicamente agentes bactericidas o bacteriostáticos para destruir cualquier célula de Agrobacteríum remanente porque el cultivo de células de Agrobacterium es indeseable después del proceso de infección (inoculación y co-cultivo).

Numerosas cepas desarmadas y de tipo salvaje de Agrobacterium tumefaciens y de Agrobacterium rhizogenes que albergan plásmidos Ti o R¡ pueden ser usadas para transferencia genética en vegetales. Los huéspedes Agrobacterium contienen plásmidos de Ti y Ri desamados que no contienen los oncógenos que causan la tumorigénesis o rhizogénesis, respectivamente, que son usados como los vectores y contienen los genes de interés que son subsecuentemente introducidos en vegetales. Las cepas preferidas podrían incluir pero no limitarse a Agrobacterium tumefaciens cepa C57, una cepa de tipo nopalina que es usada para mediar la transferencia de ADN en una célula vegetal, cepas de tipo octopina tales como LBA4404 o cepas de tipo succinamopina, por ejemplo, ???10? o EHA105. La molécula de ácido nucleico, preparada como una composición de ADN in vitro, es introducida en un huésped adecuado tal como E. coli y emparejada en el Agrobacterium, o transformada directamente en Agrobacterium competente. Estas técnicas con bien conocidas por los expertos en el arte. El Agrobacterium puede ser preparado ya sea por inoculación de un líquido tal como modelo de Luria Burtani (LB) directamente de una solución madre de glicerol o estriar el Agrobacterium sobre un medio sólido de una solución madre de glicerol, permitiendo el cultivo de las bacterias bajo las condiciones selectivas adecuadas, generalmente desde aproximadamente 26 °C a 30 °C, o aproximadamente 28 °C, y tomar una colonia individual o una pequeña azada de Agrobacterium desde la placa e inocular un medio de cultivo líquido que contenga los agentes seleccionados. Los expertos en la materia están familizarizados con procedimientos de crecimiento y de cultivo adecuados para Agrobacterium así como también con los procedimientos de inoculación adecuados, La densidad del cultivo de Agrobacterium usada para inoculación y la proporción de células de Agrobacterium para extirpar puede variar de un sistema al siguiente, y por consiguiente se espera la optimización de estos parámetros para cualquier método de transformación. Típicamente, un cultivo de Agrobacterium es inoculado desde una placa estriada o solución madre de glicerol y es cultivada toda la noche y las células bacterianas son lavadas y re-suspendidas en un medio de cultivo adeucado para inoculación de los tejidos extirpados. Con respecto al bombardeo de microproyectiles (Patentes U.S 5,550,318; 5,538,880; y 5,610,042; y publicaciones de PCT WO 95/06128; cada una de las cuales es específicamente incorporada íntegramente a la presente como referencia), las partículas son recubiertas con ácidos nucleicos y liberadas en células por medio de una fuerza propelente. Partículas ejemplares incluyen las que comprenden tungsteno, platino, y preferiblemente, oro. Se contempla que en algunos casos la precipitación de ADN sobre partículas metálicas no sería necesaria para liberar ADN en una célula recipiente usando el bombardeo de microproyectiles. No obstante, se contempló que partículas pueden contener ADN preferiblemente al recubrimiento con ADN. Por consiguiente, se propuso que las partículas de ADN puede incrementar el nivel de liberación de ADN vía bombardeo de partículas pero no están en y no son por sí mismas necesarias. Para el bombardeo, células en suspensión son concentradas sobre filtros o medio de cultivo sólido. Alternativamente, embriones inmaduros u otras células objetivo pueden ser distribuidos sobre medio de cultivo sólido. Las células a ser bombardeadas son posicionadas e a una distancia apropiada posteriormente a la placa de detención de los microproyectiles. Una modalidad ilustrativa de un método para liberar ADN en células vegetales por bombardeo de microproyectiles es el Biolistics Particle Delivery System (BioRad, Hercules, CA), que puede ser usada para propulsar partículas recubiertas con ADN o células a través de un protector tal como un protector de Nytex o de acero inoxidable, sobre una superficie de filtro recubierta con células vegetales monocotiledóneas cultivadas en suspensión. El protector dispersa Is partículas de modo que no sean liberadas a células recipientes en aglutinados grandes. Se cree que un protector que interviene entre el equipo de proyectiles y las células a ser bombardeadas reduce el tamaño de los aglutinados de proyectiles y puede contribuir a una mayor frecuencia de transformación por reducción del daño infringido sobre las células recipientes por los proyectiles que son demasiado grandes. Para bombardeo de microproyectiles, se fijará (es decir, "recurbirá") ADN a los microproyectiles de modo que sea liberado a células recipientes en una forma adecuada para transformación de éste. A este respecto, al menos alguno de loa ADN transformantes deben de estar disponibles para la célula objetivo para que tenga lugar la transformación, mientras que al mismo tiempo durante la liberación el ADN pueda ser fijado al microproyectil. Por consiguiente, la disponibilidad el ADN transformante desde el microproyectil pueda comprender el reverso físico de enlaces entre ADN transformante y el microproyectil después de la liberación del microproyectil en la célula objetivo. Esta necesidad no es el caso, no obstante cuando la disponibilidad de una célula objetivo puede tener lugar como un resultado de la desintegración de segmentos no enlazados de ADN o de otras moléculas que comprendan la fijación física al microproyectil. La disponibilidad puede tener lugar como un resultado de la desintegración de enlaces entre el ADN transformante y otras moléculas, que son fijadas ya sea directa o indirectamente a los microproyetciles. Se contempló adicionalmente que la transformación de una célula objetivo puede tener lugar a manera de recombinación directa entre el ADN transformante y el ADN genómico de la célula recipiente. Por consiguiente, como se usa en la presente, un microporyectil "recubierto" será uno que sea capaz de ser usado para transformar una célula objetivo, en la que el ADN transformante será liberado a la célula objetivo, aún será accesible a la célula objetivo de modo que la transformación pueda tener lugar. Puede usarse cualquier técnica para recubrir microproyectiles, que permitan la liberación de ADN transformante a las células objetivo. Métodos para recubrir microproyectiles, que han sido demostrados para trabajar bien con la presente invención, han sido específicamente descritos en la presente. No obstante, el ADN puede ser enlazado a partículas de microproyectiles usando técnicas alternativas. Por ejemplo, las partículas pueden ser recubiertas con estreptavidina y marcadas finalmente con ADN con cadenas de nucleótidos biotinilados fragmentables a tioles de cadena larga. El ADN se adhiere a las partículas debido a la interacción de biotina-estreptavidina, pero es liberado en la célula por reducción del enlace tiol por medio de agentes reductores presentes en la célula. De manera alternativa, las partículas pueden ser preparadas por funcionalización de la superficie de una partícula de óxido de oro, que proporciona los grupos amino libres. El ADN que tiene una fuerte carga negativa, enlaza a las partículas funcionalizadas. Además, las partículas cargadas pueden ser depositadas en distribuciones controladas sobre la superficie de discos voladores de Mylar en el dispositivo PDS-1000 Biolistics, facilitando así la distribución controlada de las partículas liberadas al tejido objetivo. Como se describió anteriormente, se propuso adicionalmente, que la concentración de ADN usado para recubrir los microproyectiles puede influir la recuperación de transformantes que contengan una copia individual del transgen. Por ejemplo, una concentración inferior de ADN no puede cambiar necesariamente la eficiencia de la transformación, pero preferiblemente incrementa la proporción de eventos de inserción de la copia individual. A este respecto, aproximadamente 1 ng a 2000 ng de ADN transformante puede ser usado por cada 1.8 mg de microproyectiles iniciales. En otras modalidades de la presente invención aproximadamente 2.5 ng a 1000 ng, 2. ng a 750 ng, 2.5 ng a 750 ng, 2.5 a 500 ng, 2.5 ng a 250 ng, 2.5 a 100 ng, o 2.5 ng a 50 ng de ADN transformante pueden ser usados por cada 1.8 mg de microproyectiles iniciales. Las técnicas de bombardeo de microproyectiles son ampliamente aplicables, y pueden ser usadas para transformar virtualmente cualquier especie vegetal. Ejemplos de especies que han sido transformadas por bombardeo de microproyectiles incluyen especies mococotiledóneas tales como maíz (Publicación de PCT No. WO 95/06128), cebada, trigo (Patente U.S. No. 5,563,055, específicamente incorporada íntegramente a la presente como referencia), arroz, avena, centeno, caña de azúcar y sorgo, así como también numerosas dicotiledóneas que incluyen tabaco, soya (Patente U.S. 5,322,783, específicamente incorporada íntegramente a la presente como referencia), cártamo, cacahuate, algodón, tomate y legumbres en general (Patente U.S. 5,563,055, específicamente incorporada íntegramente a la presente como referencia). Para bombardeo de microproyectiles de conformidad con la presente invención tanto los parámetros físicos como los biológicos pueden ser optimizados. Los factores físicos son aquellos que involucran manipular el ADN/ microproyectil precipitado o aquellos que afecten al vuelo y velocidad ya sea de los macro- o bien de los micro-proyectiles. Los factores biológicos incluyen todas las etapas en la manipulación de células antes e inmediatamente después del bombardeo, tales como el ajuste osmótico de células objetivo para ayudar a aliviar el trauma asociado con el bombardeo, la orientación de un embrión inmaduro o de otro tejido objetivo en relación a la trayectoria de la partícula, y también la naturaleza del ADN transformante, tal como ADN linealizado o plásmidos superhelicoidales intactos. Se cree que las manipulaciones pre-bombardeo son especialmente importantes para la transformación exitosa de embriones inmaduros. Por consiguiente, se contempló que se puede desear ajustar varios parámetros del bombardeo en estudios a pequeña escala para optimizar a fondo las condiciones. Se pude desear particularmente ajustar parámetros físicos tales como la concentración de ADN, distancia de espacios, distancia de vuelo, distancia de tejido, y presión de helio. Adicionalmente se contempló que el grado de helio puede afectar la eficiencia de la transformación. También se puede optimizar la reducción de los factores de traumatismo TRFs) por medio de la modificación de las condiciones que influyen el estado fisiológico de las células recipientes y que por consiguiente pueden influir a la transformación y eficiencias de integración. Por ejemplo, el estado osmótico, la hidratación del tejido, y la etapa de sub-cultivo o el ciclo celular de las células recipientes pueden ser ajustados para transformación óptima. Otros métodos de transformación celular pueden también ser usados e incluyen pero no se limitan a la introducción de ADN en vegetales por medio de la transferencia directa de ADN en polen (Hess y colaboradores, Intern Rev, Cytol., 107: 367 (1987); Luo y colaboradores, Plant Mol. Biol. Repórter, 6: 165 (1988)), por inyección directa de ADN en órganos reproductores de un vegetal (Pena y colaboradores, Nature, 325:274 (1987)), o por inyección directa de ADN en células de embriones inmaduros seguido por la rehidratación de embriones desecados (Neuhaus y colaboradores, Theos. Appl. Genet., 75:30 (1987)). La regeneración, desarrollo, y cultivo de vegetales a partir de la transformación del protoplasto vegetal individual o a partir de varrios tejidos extirpados y mantenidos en cultivo transformados es bien conocida en el arte (Weissbach y Weissbach, In: Methods for Plant Molecular Biology, academic Press, San Diego, CA, (1988)). Esta regeneración y proceso de cultivo incluye típicamente las etapas de selección de células transformadas, cultivo de las células individualizadas a través de las etapas usuales de desarrollo embrionario por medio de la etapa enraízamiento de la plántula. Los vástagos enraizados transgénicos resultantes son después de eso plantados en un medio de crecimiento vegetal apropiado, tal como el suelo. El desarrollo o regeneración de vegetales que contienen el exógeno que codifica a una proteína de interés es bien conocido en el arte. Preferiblemente, los vegetales regenerados son auto-polinizados para proporcionar vegetales transgénicos homozigóticos. Por otro lado, el polen obtenido a partir de los vegetales regenerados son cruzados a vegetales cultivados de semillas de líneas importantes agrícolamente. Inversamente, el polen de vegetales de las líneas importantes es usado para polinizar vegetales regenerados. Un vegetal transgénico de la presente invención que contenga un polipéptido deseado es cultivado usando métodos bien conocidos por un experto en el arte. Hay una variedad de métodos para la regeneración de vegetales a partir de tejido vegetal. El método de regeneración particular dependerá del tejido vegetal inicial y de la especie vegetal particular a ser regenerados. Se han desarrollado ensayos para expresión genética basados en la expresión transitoria de construcciones de ácidos nucleicos clonados por introducción de moléculas de ácidos nucleicos en células vegetales por medio de tratamiento con polietilen glicoi, electroporación, o bombardeo de partículas (Marcotte y colaboradores, y Nature, 335:454-457 (1988); Marcotte y colaboradores, Plant Cell, 1 : 523-532 (1989); Me Carty y colaboradores, Cell, 66: 895-905 (1991);Hattori y colaboradores, Genes Dev., 6:609-618 (1992); Goff y colaboradores, EMBO J., 9: 2517-2522 (1990)). Pueden usarse sistemas de expresión transitoria para disectar transitoriamente construcciones genéticas (ver generalmente, Maliga y colaboradores , Methods in Plant Molecular Biology, Cold Spring Harbor Press (1995)). Cualquiera de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención puede ser introducidas en una célula vegetal de una manera permanente o transitoria en combinación con otros elementos genéticos tales como vectores, promotores, mejoradores, etc. Adicionalmente, cualquiera de las moléculas de ácidos nucleicos de la presente invención pueden ser introducidas en una célula vegetal en una manera que permita la expresión o la sobre-expresión de la proteína o del fragmento de la misma codificado por la molécula de ácido nucleico.

Los vegetales transgénicos pueden encontrar uso en la fabricación comercial de proteínas o de otras moléculas, tales como aceites, donde las moléculas de interés son extraídas o purificadas a partir de partes vegetales, semillas, y los similares. Las células o tejido de los vegetales pueden también ser cultivados, desarrollados in vitro, o fermentados para fabricar dichas moléculas. Los mejoramientos codificados por el ADN recombinante pueden ser transferidos, por ejemplo, a partir de células de una especie a células de otras especies, por ejemplo, por fusión protoplástica. Los vegetales transgénicos pueden también ser usados en programas de reproducción comercial, o pueden ser cruzados o cultivados con vegetales de especies de cultivo relacionadas. Por ejemplo, un ácido nucleico de la presente invención, unido operablemente a un promotor puede ser introducido en una variedad vegetal particular por cruza sin la necesidad de transformar aún directamente un vegetal de la variedad dada. Por consiguiente, la presente invención no solamente abarca un vegetal regenerado directamente a partir de células que han sido transformadas de conformidad con la presente invención, sino también la descendencia de dichos vegetales. La presente invención también proporciona un método de expresar establemente un HOI001 GBSS de interés en un vegetal, lo cual incluye, poner en contacto a la célula vegetal con un vector de la presente invención que tiene un ácido nucleico que codifica al HOI001 GBSS de interés, bajo condiciones efectivas para transferir e integrar al vector en el genoma nuclear de la célula. Un promotor en el "cassette" de expresión puede ser cualquiera de los promotores proporcionados en la presente, por ejemplo, un promotor constitutivo, un promotor ¡nducible, un promotor específico de tejido, o un promotor específico de semilla. Dichos promotores pueden proporcionar expresión de un HOI001 GBSS codificado en un momento deseado, oen una etapa de desarrollo deseada, o en un tejido deseado. El vector puede también incluir un gen marcador seleccionable. Cuando se usa el vector con Agrobacterium tumefaciens, el vector puede tener un origen de replicación de Agrobacterium tumefaciens.

Vegetales Los vegetales para uso con los vectores de la presente invención incluyen preferiblemente monocotiledóneos, especialmente especies productoras de aceite, mayormente se prefiere maíz (Zea mays). Otras especies contempladas por la presente invención incluyen alfalfa ( edicago sativa), arroz (Oryza sativa), cebada (Hordeum vulgare), mijo (panicum miliaceum), centeno (Sécale cereale), trigo (Tritivum aestivum), y sorgo (Sorghum bicolor). Cualquiera de los vegetales o partes de vegetales de la presente invención pueden ser procesados para producir una preparación de alimento, harina, proteína o aceite. Una parte vegetal particularmente preferida para este propósito es una semilla. Los métodos para producir preparaciones de alimento, harina, proteína y aceite son conocidos en el arte. Ver, por ejemplo, Patentes U.S. 4,957,748; 5,100679; 5,219,596; 5,936,069; 6,005,076; 6,146,669; y 6,156,227.

Caracterización de los Vegetales Transformados Para confirmar la presencia del transgen en el vegetal regenerado, están disponibles una variedad de técnicas que son conocidas en el arte. Ejemplos de estas técnicas incluyen pero no se limitan a: (a) ensayos moleculares de integración de ADN o de expresión de ARN tales como tinción Southern o Northern, tecnología TAQMAN® Applied Biosystems, Foster City, CA) y RCP; (b) ensayos bioquímicos que detectan la presencia del producto proteinico tal como ELISA, tinción Western por medio de la función enzimáíica; o (c) análisis químico de la parte vegetal objetivo, tal como tejido de semilla para determinación cuantitativa o cualitativa de aceite, proteína o almidón. Los siguientes ejemplos son proporcionados para ilustrar la presente invención y no se pretende que limiten la invención en manera alguna.

EJEMPLO 1 Este ejemplo describe el aislamiento y la formación de secuencias del gen de HOI001 GBSSa partir de la línea HOI001 de maíz. HOI001 es un vegetal endógamo derivado de MG5C 9 5E (Maize Genetic Stock Center, Urbana, IL) y se describe más a fondo en las Publicaciones de Patente U.S. Nos. 20030172416 y 20030154524, ambas de las cuales se incorporan a la presente como referencia. Se extrajo ADN gene-mico de tejido germinal de maíz a partir de HOI001 , 22 días después de polinización usando el procedimiento siguiente. Entre 500 - 100 mg de tejido germinal disectado se colocaron en un tubo ultimix Bio101 (Qiagen, Carlsbad, CA, No. de Cat. 657-601) con regulador de extracción y perlas de vidrio. El regulador de extracción consistió de 100 mM de Tris-HCI (pH 8.0), 50 mM de EDTA, 100 mM de NaCI, 5 mM de DTT, y SDS al 1 %, El tejido fue entonces disruptado usando la máquina Bio 101 FASTPREP® (Qiagen) con 3 impulsos de 20 segundo cada uno. Siguiendo una incubación de 15 minutos a 65 °C, se añadieron 330 µ? de acetato de potasio 5M a cada tubo. Los tubos fueron entonces incubados a 0 °C por 20 minutos para precipitar el SDS, seguido por centrifugación a 12,000 rpm (Modelo 54172 Eppendorf) por 10 minutos. El sobrenadante se transfirió a un nuevo tubo y se añadieron 100 µ? de acetato de amonio 5 M (pH de 7.0) y 700 µ? de isopropanol para precipitar el ADN. Los tubos fueron mezclados por inversión y fueron centrifugados a 14,000 rpm por 10 minutos. Después de descartar el sobrenadante, los compactados se resuspendieron en 500 µ? de etanol al 70 % y se recuperaron por centrifugación a 14,000 rpm por 5 minutos. El compactado recuperado que contenía el ADN fue resuspendido en 50 µ? de regulador TE y almacenado a 4 °C. El gen de HOI001 GBSS fue aislado a partir del ADN genómico extraído usando la metodología de RCP que fue adaptada a partir de Advantage GC (BD Biosciences Clontech, Palo alto, CA). Se dieseñaron los siguientes cebadores con base en la secuencia de GBSS de Zea mays publicada de Shure y colaboradores, Cell 35 (1): 225-233 (1983) [SEC ID NO: 2]: Cebador en 5' (Número de cebador 14543) 5'-TCAGCCGTTCGTGTGGCAAGATTCATCTGTTGTCTC-3' [SEC ID NO: 5] Cebador en 3' (Número de cebador 14547) 5'-TCAGCGGGATTATTTACTCCACCACTACAGGTCCATTT-3' [SEC ID NO: 5] Se dispuso la siguiente reacción de RCP para un volumen total de 50 µ?; 37 µ? de agua grado RCP 5 µ? de regulador para CG RCP Advantaje 5X 1 µ? de dNTP Mix 50X (10 mM cada uno) 1 µ? de Advantage GC GC Polymerase Mix 2.5 µ? de cebador 14543 2.5 µ? de cebador 14547 1 µ? de AND genómico Los parámetros del ciclo fueron: 95 °C por 1 minuto, 35 cíelos de 95 °C por 30 segundos y 68 °C por 3 minutos. Se separaron los productos de RCP por electroforesis en agarosa y se observó un fragmento de 4.7 kB que contenía el gen de interés. Se utilizaron cinco microlitros de la reacción de RCP original como modelo para amplificación adicional usando los mismos cebadores y condiciones descritas anteriormente. Los productos de amplificación de 4.7 kB de las reacciones de amplificación independientes fueron aislados por eiectroforesis sobre gel de agarosa, fueron clonados en el vector de clonación 2.1 para RCP usando ei equipo de clonación TOPO TA (Invitrogen), luego se transformó en un huésped E . coli. El ADN del plásmido fue preparado de cultivos desarrollados a partir de cada colonia, y luego los insertos de 3 preparaciones de plásmidos separados se secuenciaron. La alineación de estas secuencias generó una secuencia consensúe muy homologa pero no idéntica a la del gen de GBSS publicada, aunque la secuencia del inserto no específica fue equivalente al consensus. Un clon /designado pCGN9480-2) tuvo una secuencia de inserto con cambios mínimos de secuencia en relación al consensus. Un clon que contenía el consensus se generó entonces por medio de excisión mediada por enzimas de restricción de la secuencia no-consensus y la religación con fragmentos que contenían la secuencia consensus, obtenida por digestión de los otros clones o por amplificación por RCO del ADN genómico de HOI001. La secuencia consensus, que incluye 1.5 kB de 5' a 3' del sitio de inicio de transcripción y aproximadamente 300 pares de bases de 3' a 5' del codón de detención, se enlistan como la SEC ID NO: 1. Se aisló el gen de GBSS a partir de la línea endógama de maíz élite LH59 [SEC ID NO: 7], usando los procedimientos y cebadores descritos anteriormente, y se clonó en el vector binario pMON68203. El plásmido resultante que contenía el GBSS de LH59 se denominó pMON72510 (Figura 5). La Figura 1 muestra la alineación de la secuencia de ácidos nucleicos del GBSS de HOI001 [SEC ID NO: 1] en comparación con la secuencia publicada de Shure y colaboradores, supra [SEC ID NO: 2] y el GBSS a partir de LH59 [SEC ¡D NO: 7], usando el paquete de "software" Omiga 2.0, (Accelrys Inc., San Diego, CA). La alineación mostró que hunieron los siguientes polimorfismos únicos en la secuencia de GBSS de HOI001 , que no se encontraron ya sea en la secuencia GBSS de LH59 o en la secuencia publicada de Shure y colaboradores, supra. 1. Polimorfismos del nucleótido individual: a. T > C en la posición 158 b. G > A en la posición 337 c. C > A en la posición 343 d. C > A en la posición 349 e. G > A en la posición 441 f. C > T en la posición 666 g. G > C en ia posición 777 h. T > A en la posición 878 i. C > T en la posición 980 j. T > A en la posición 12 0 k. C > T en la posición 1216 I. A > T en la posición 1450 m. T > C en la posición 1709 n. A > G en la posición 1720 o. T > A en la posición 1721 p. G > C en la posición 1722 q. C > T en la posición 1761 r. G > A en la posición 1836 s. C > T en la posición 1852 t. G > A en la posición 1953 u. C > T en la posición 2043 v. C > T en la posición 2109 w. C > G en la posición 2110 x. G > C en la posición 2115 y. A > T en la posición 2448 z. C > T en la posición 2454 aa. T > G en la posición 2609 bb. A > G en la posición 2929 ce. G > T en la posición 2933 dd. C > T en la posición 2946 ee. G > T en la posición 3875 ff. T > A en la posición 4008 gg. T > C en la posición 4018 hh. T > G en la posición 4023 ii. C > A en la posición 4025 jj. C > T en la posición 4169 kk. A > T en la posición 4225 II. C > A en la posición 4562 2. Inserciones: a. La secuencia g en posición 632 b. La secuencia atgc en posición 1185-1 89 c. La secuencia tgcaccagcagc en posición 1456-1467 d. La secuencia atgca en posición 1746-1750 e. La secuencia catcaca en posición 1868-1874 f. La secuencia ct en posición 2100-2101 g. La secuencia ccat en posición 2488-2491 h. La secuencia tat en posición 3810-3812 3. Eliminaciones a. La secuencia cgt en posición 288-290 b. La secuencia aa en posición 704-705 c. La secuencia c en posición 882 d. La secuencia atccg en posición 1139-1143 e. La secuencia ctctctg en posición 1256-1262 f. La secuencia te en posición 1714-1715 g. La secuencia tgcaactgcaaatgca en posición 1917-1932 h. La secuencia g en posición 3790 i. La secuencia cgagccaggggt (t o gaaggcgaggagatcgcgccgctcgccaaggagaacgtggcgcgccctgaagagttcggcct en posición 4393-4467 La Figura 2 muestra la alineación de las secuencias de aminoácidos predichas correspondientes del gen de GBSS aislados de HOI001 [SEC ID NO: 3], y el gen de GBSS descrito en Shure y colaboradores, supra [SEC ID NO: 4]. Respectivamente. Los resultados indican que hay un secuencia de residuos de aminoácidos adicional en el terrninus carboxi de GBSS de HOI001 que inicia en aproximadamente la posición 1441 y un área de no alineación en la región del residuo de aminoácidos 55-60. La Figura 3, muestra la alineación de las secuencias de aminoácidos predichas correspondientes del gen de GBSS de Zea mays aislado de LH50 endógamo [SEC ID NO: 8], y el gen de sintasa de almidón enlazado a gránulo descrito en Shure y colaboradores supra, respectivamente. Los resultados indican que es una secuencia de residuos de aminoácidos adicionales en el terrninus carboxi de GBSS de HOI001 que comienza en aproximadamente la posición 1441 y área de no alineación en la región del residuo de aminoácido 55-60.

EJEMPLO 2 Este ejemplo expone la construcción de vectores de transformación vegetal que contienen las secuencias del GBSS de HOI001 y el GBSS de la línea LH endógama, [SEC ID NO: 1 y 7, respectivamente].

La secuencia de GBSS de HOI001 fue cortada de la versión corregida del consensus de pMON9480-2 usando la enzima de restricción EcoR1. El fragmento de 4.7 kB resultante fue purificado siguiendo el protocolo del fabricante para el equipo Qiagen miniprep (Qiagen, Inc., Valencia, CA). Los extremos del fragmento fueron enromados siguiendo el protocolo del fabricante en el equipo de pulido de RCP Stratagene (Stratagene, Inc. La Jolla, CA). El fragmento fue entonces purificado sobre gel usando el equipo Qiagen Gel extraction (Qiagen), y fue clonado en pMON68203, un vector binario para transformación vegetal. El vector binario, pMON68203, contiene los límites izquierdo y derecho para transferir ADN-T, un elemento marcador seleccionare vegetal 3'UTR de promotor CaMV 35S::nptll::nos (descrito en la Patente U.S. 6,255,560), y secuencias del "cassette" de expresión vegetal que incluye un promotor Z27 de 1.1 kb (19-1117 pb de # de Acceso S78780, López y colaboradores, Mol. Gen. Genet., 247(5): 603-613 (1995)) por expresión del endosperma, un intrón hsp 70 de maíz (pares de base 4- 53 del gen de maíz por choque térmico en 2 exones Hsp 70, # de Acceso X03679, Rochester y colaboradores, EMBO J., 5:451-458 (1986)), y un 3'UTR de nos, (pares base 2924-2671 del plásmido TI de la cepa C58 de Agrobacterium tumefaciens, # de Acceso AE009420, Wood y colaboradores, Science, 294: 2317-2323 (2001)). El vector binario pMON68203 fue digerido con Stu1 , fue desdosforilado por incubación con fosfatasa alcalina de camarón (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) a 37 °C por 60 minutos y se ligó con el fragmento purificado por el gel de 4.7 kb de GBSS de HOI001 , descrito anteriormente. El plásmido resultante se denominó pMON72506 (Figura 4). El GBSS de ia línea LH59 de maíz, [SEC ID NO: 7], fue clonado de manera similar en ei vector binario pMON68203 pMON72510.

EJEMPLO 3 Este ejemplo describe la transformación de maíz con el GBSS de HOI001 y el GBSS de la línea LH59 de maíz, usando el vector descrito en el Ejemplo 2. Los vectores de transformación pMON72506 y pMON72510 fueron usados para transformar vegetales de maíz usando el procedimiento siguiente. Se cultivaron plantas de maíz en un invernadero bajo las prácticas estándares. Se hicieron las polinizaciones controladas. Las espigas de las plantas se cosecharon cuando los embriones híbridos resultantes fueron de 1.5 a 2.0 mm de longitud, usualmente 10 - 15 días después de polinizaicón. Después de retirar las cáscaras, los granos sobre las mazorcas fueron esterilizados en la superficie por aspersión con o impregnado en etanol al 80 %. Las cepas ABI de Agrobacterium, y se usó un sistema vector binario de Agrobacterium tumefaciens para la transformación. Los plásmidos pMON72506 y pMON72510 fueron transformados en Agrobacterium tumefaciens de conformidad con métodos bien conocidos en el arte. Antes de inoculación de células de maíz las células de Agrobacterium se cultivaron toda la noche a temperatura ambiente en medio AB (Chilton y colaboradores, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 71 :3672-3676 (1974)) que comprende antibióticos apropiados para mantenimiento del plásmido y 200 µ? de acetosiringona. Inmediatamente antes de inoculación las células de Agrobacterium fueron compactadas por centrifugación, y se resuspendieron en ya sea sales básales del medio CRN122 (2.2 g/l de MS (Murashige y Skoog, Physiol. Plant, 15: 473-497 (1962)) 2 mg/l de glicina, 0.5 g/l de niacina, 0.5 g/l de L-piridoxina-HCI, 0.1 g/l de tiamina, 115 mg/l de L-prolina, 36 g/l de glucosa, y 68.5 g/l de sacarosa, pH de 5.4) o medio CRN347 (medio CRN 122 excepto con 0.44 g/l de sales de MS, 10 g/l de glucosa, 20 g/l de sacarosa, y 100 mg/l de ácido ascórbico) que contenía 200 pM. de acetosiringona y 20 µ? de AgNÜ3. Los embriones de maíz fueron excisados de granos individuales, fueron sumergidos en una suspensión de Agrobacterium, y fueron incubados a temperatura ambiente por 5-15 minutos. La solución de Agrobacterium es entonces retirada y los embriones inmaduros inoculados fueron transferidos a la parte superior del escutelo a partir de la inoculación del medio CRN122 al medio CRN 123 de co-cultivo (medio CRN 122 excepto con 0.5 mg/l de tiamina HCI adicional, 20 g/l de sacarosa, 10 g/l de glucosa y 3 mg/l de 2,4-D) que contenía 200 µ? de acetosiringosa y 20 µ? de nitrato de plata y se incubó a 23 °C por 1 día. De manera alternativa, embriones excisados fueron cultivados por 8-11 días en medio 211V (3.98 g/l de Sal N6 de Chu (Chu, C. C, The N6 médium and its application to another culture of cereal crops, en Plant Tissue Culture Proceeding of the Peking Symposium, Boston, MA (1981), 43-50), 0.5 mg/l de tiamina HCI, 0.5 mg/l de ácido nicotínico; 1.0 mg/l de 2,4-D, 20 g/l de sacarosa, 0.69 g/l de L-prolina, 0.91 g/L de monohidrato de L-asparagina, 1.6 g/l de MgCI2 hexahidratado, 0.1 g/l de hidrolisado de caseína, 0.5 g/l de MES, 0.1 g/lde mio-inositol, y 16.9 mg/l de nitrato de plata, pH 5.8 se solidifcó con 2 g/l de Gelgro) y se inocularon los calli con suspensiones de medio CRN347 de Agrobacterium a 23 °C por 3 días sin añadir medio adicional. Los embriones fueron entonces transferidos a medio de selección CRN220 (4.4 g/l de sales de MS, 1.3 mg/l de ácido nicotínico, 0.25 mg/l de piridoxina HCI, 0.25 mg/l de tiamina HCI, 0.25 mg/l de pantotenato de calcio, 30 g/l de sacarosa, 12 mM de prolina, 0.05 g/l de ácidos casamino, 500 mg/l de carbecilina, 200 mg/l de paromomicina, 2.2 mg/l de picloram, 0.5 mg/l de 2,4-D y 3.4 mg/l de nitrato de plata, pH de 5.6 solidificado con 7 g/l de Phytagar), o los calli son transferidos a medio de selección CRN344 (3.98 g/l de sales N6 de Chu. 1.0 mg/l de tiamina HCI, 0.5 mg/l de ácido nicotínico, 1.0 mg/l de 2,4-D, 20 g/l de sacarosa, 0.69 g/l de L-prolina, 0.91 g/l de L-asparagina monohidratada, 1.6 g/l de MgCI2 hexahidratado, 0.1 g/l de hidrolizado de caseína, 0.5 g/l de MES, 0.1 g/l de mio-inositol, 500 mg/l de carbecilina, 200 mg/l de paromomicina y 16.9 mg/l de nitrato de plata, pH de 5.8 solidificado con 6 g/l de Phytagar). Después de 2-3 semanas a 27 °C en la oscuridad, los tejidos supervivientes fueron transferidos al mismo medio de selección y fueron cultivados por hasta 2 semanas adicionales o transferidos a medio de regeneración como se describe posteriormente.

La regeneración vegetal se logró por transferencia del callus transgénico putativo desde medio CRN220 a CRN232 (el medio CRN220 carece de picloram, 2,4-D, y nitrato de plata, y que contiene 3.52 mg/l de bencilaminopurina (BAP) y 250 mg/l de carbecilina) o desde medio CRN344 a medio 217a (211 RTTV que carece de nitrato de plata, 2,4-D y paromomicina y que contiene 3.52 mg/l de BAP y 250 mg/l de carbecilina) y se incubó npor 5-7 días a 27 °C. el tejido es entonces transferido de medio CRN232 a medio CRN264 (4.4 g/l de sales de MS, 1.3 g/l de ácido nicotínico, 0.25 mg/l de piridoxina HCI, 0.25 mg/l de tiamina HCI, 0.25 mg/l de pantoteanto de calcio, 10 g/l de glucosa, 20 g/l de maltosa, 1 mM de L-asparagina, 0.1 g/l de mio-inositol, 250 mg/l de carbecilina y 100 mg/l de paromomicina, pH de 5.8, se solidificó con 6 g/l de Phytagar) o desde medio 217a a medio CRN346 (4.4 g/l de sales de MS, vitaminas de MS, 60 g/l de sacarosa, 0.05 g/l de mio-inositol, 250 mg/l de carbenicilina, 75 mg/l de paromomicina, pH de 5.8, se solidificó con 6 g/l de KOH) en Phytatray, y se incubó a la luz a 28 °C hasta que se produjeron vástagos con raíces bien desarrolladas (típicamente 2-3 semanas). Estas plántulas que desarrollaron fueron entonces transferidas al suelo, fortalecidas en una cámara de cultivo a 27 °C, humedad de 80 %, y baja intensidad de luz por aproximadamente 1 semana, y luego se transfirieron a un invernadero y los vegetales R0 se cultivaron bajo condiciones de invernadero estándares. Los vegetales R0 fueron recíprocamente cruzados y ambos granos que desarrollaron/inmaduros y granos maduros fueron colectados a partir de cada uno de los vegetales resultantes para análisis subsecuente. Los resultados de los análisis se describen posteriormente en el Ejemplo 6. Estas plántulas que desarrollaron fueron entonces transferidas al suelo, fortalecidas en una cámara de cultivo a 27 °C, humedad de 80 %, y baja intensidad de luz por aproximadamente 1 semana, y luego se transfirieron a un invernadero. Los vegetales RO fueron entonces cultivados bajo condiciones de invernadero estándares. Los vegetales RO fértiles fueron cruzados a un endógamo recurrente no transgénico, con el vegetal RO que sirva ya sea como hembra o como macho (u ocasionalmente ambos) en la cruza. Ambos granos F1 maduros y desarrollados fueron colectados y analizados, desde cada una de las espigas resultantes como se describe en ei Ejemplo 4, Los resultados del análisis se reportaron posteriormente en el Ejemplo 5.

EJEMPLO 4 Este ejemplo proporciona los procedimientos analíticos para determinar niveles de aceite, proteína, y almidón en granos de vegetales transgénicos que contienen el gen de GBSS de HOI001 o el gen de GBSS de LH59.

Análisis dei Contenido de Aceite: Los niveles de aceite (sobre una base de masa y como un por ciento de peso de tejido) de granos de maíz individuales de primera generación y el gérmen se disectó y se determinó el endosperma por medio de resonancia magnética nuclear 1 H de baja resolución (NMR) (Tiwan y colaboradores, JAOCS, 51 :104-109 (1974); o Rubel, JAOCS, 71: 1057- 062 (1994)), con lo cual se midieron los tiempos de relajación de NMR de muestras de grano individuales, y los niveles de aceite se calcularon con base en el análisis de regresión usando una curva estándar generada del análisis de granos de maíz con niveles variables de aceite que se determinaron gravimétricamente después de extracciones de solvente aceleradas. Para comparar los análisis de aceite de granos transgénicos y no transgénicos, la presencia o ausencia del transgen se determinó por detección (o falta de éste) de un producto de RCP de 517 pb específico del transgen, usando una secuencia en el intrón Hsp 70 como un cebador en 5', y una secuencia en el gen de GBSS de HOI001 como un cebador en 3': Cebador en 5' (cebador No. 19056) 5'-ATCTTGCTCGATGCCTTCTC-3' [sec id no: 16], Cebador en 3' (cebador No. 18986): 5'-G CCTTC G CTTGTC GTG G GT-3 ' [SEC ID NO: 17]. Los niveles de aceite en la semilla de generación adelantada se determinaron por espectroscopia de NIT, con lo cual se midieron el espectro NIT de muestras de semillas conjuntadas cosechadas de vegetales individuales, y se calcularon los niveles de aceite con base en el análisis de regresión usando una curva estándar generada del análisis de granos de maíz con niveles de aceite variables, que se determinaron gravimétricamente después de extracciones por solvente aceleradas o por análisis elemental (% de N), respectivamente. El análisis unilateral de varianza y la prueba T de Student se efectuaron para identificar diferencias significativas en el aceite (% en peso de grano) entre semillas de vegetales positivos al marcador y negativas al marcador. De manera alternativa, niveles de aceite de granos conjuntados de mazorcas individuales se determinaron por medio de resonancia magnética nuclear 1 H de baja resolución (NMR) (Tiwari y colaboradores, JAOCS, 51 :104-109 (1974); o Rubel, JAOCS, 71 :1057-1062 (1994)), con lo cual se midieron los tiempos de relajación de NMR de conjuntados de granos, y los niveles de aceite se calcularon con base en el análisis de regresión usando una curva estándar generada del análisis de granos de maíz con niveles variables de aceite que se determinó gravimétricamente después de extracción por solvente acelerada.

Análisis de proteínas: Para análisis de las proteínas del grano, muestras a granel pequeñas que consisten de 50-100 granos para cada tratamiento se midieron usando espectroscopia de reflejancia cercana al infrarrojo (InfraTec modelo 1221 , Teccator, Hogannas Suecia). Este procedimiento está basado en la observación de que existe una relación lineal entre la absorción de la radiación cercana al infrarrojo y la cantidad de constituyentes químicos comprendidos en una muestra de grano típica. Antes de analizar muestras desconocidas, se colectaron los datos espectrales con muestras de calibración que son analizadas subsecuentemente usando una técnica de análisis por combustión de nitrógeno (Murray, I., y P.C Williams, 1987, Chemical Principies of Near-infrared Technology, In Near-lnfrared Technology ¡n the Agricultural and Food Industries, P. Williams & K. Norris Eds:). Un modelo multivariante es desarrollado usando los datos espectrales del espectrómetro y los datos primarios. En el caso presente se construyó un modelo multivariante PLS-1 (Partial Least Squares Regression Type I) usando 152 muestras de calibración. Cada muestra desconocida es explorada en el espectrómetro al menos 5 veces y se predijo su contenido de proteínas con cada exploración. Cada vez la muestra explorada es retro-añadida a la celda de muestra para minimizar los efectos de dispersión multiplicativa, el cual no se correlaciona con la propiedad química de interés. Las proteínas predichas son promediadas para las exploraciones múltiples y luego reportadas por cada muestra.

Análisis de Almidón: Para el análisis del almidón de los granos, pequeñas muestras a granel que consistieron de 50-100 granos para cada tratmiento se midieron usando la espectroscopia de reflejancia cercana al infrarrojo (InfraTec modelo 1221 , Teccator, Hogannas Suecia). Este procedimiento está basado en la observación de que existe una relación lineal entre la absorción de la radiación cercana al infrarrojo y la cantidad de constituyentes químicos comprendidos en una muestra de grano típica. Antes de analizar muestras desconocidas, se colectaron los datos espectrales con muestras de calibración que son analizadas subsecuentemente usando técnicas analíticas de química vía húmeda estándares (Murray, I., y P.C Williams, 1987, Chemical Principies of Near-infrared Technology, In Near-Infrared Technology in the Agricultural and Food Industries, P. Williams & K. Norris Eds.). Un modelo multivaríante es desarrollado usando los datos espectrales del espectrómetro y los datos primarios. Cada muestra desconocida es explorada en el espectrómetro al menos 5 veces y se predijo su contenido de almidón con cada exploración. Cada vez la muestra explorada es retro-añadida a la celda de muestra para minimizar los efectos de dispersión multiplicativa, los cuales no se correlacionan con la propiedad química de interés. El almidón predicho se promedió para las exploraciones múltiples y luego se reportó para cada muestra.

EJEMPLO 5 Este ejemplo describe ei análisis de granos de vegetales transformados con el GBSS de HOI001 y GBSS de LH59. Los granos de 54 eventos transgénicos que expresan al alelo transgénico de GBSS de HOI001 se analizaron usando los procedimientos expuestos en el Ejemplo 4. El Cuadro 1 muestra niveles de aceite en el grano entero de granos F1 transgénico (positivos) y no transgénicos (negativos) de mazorcas de 20 eventos transgénicos analizados por el procedimiento de NMR del grano individual descrito en el Ejemplo 4. Solamente se muestran los resultados de eventos con un incremento en aceite significativo estadísticamente (p < 0.5). Los resultados demuestran que granos transgénicos de mazorcas de 20 de los 54 eventos tuvieron incrementos significativos estadísticamente en el contenido de aceite del grano entero (% en peso seco) en relación a granos no transgénicos sobre el mismo mazorca. Ningún evento tuvo una disminución significativa estadísticamente en el aceite.

CUADRO 1 Los granos transgénicos de vegetales R0 polinizados por polen endógamo no transgénico (por ejemplo, ascendencia ZM_S67336/LH172, positivo) tuvo tanto una alta frecuencia de un incremento de aceite significativo (15/29 vegetales analizados) y un promedio más alto de incremento de aceite significativo (0.61 %) en relación a granos de vegetales no transgénicos endógamos polinizados por polen transgénico (por ejemplo, ascendencia 72/ZM_S66817, negativo) de un precursor macho R0 (5/37 vegetales analizados, incremento de aceite significativo de 0.34 %) Estos resultados sugieren que la mayor dosificación del transgen encontrada en el endospermo de granos de vegetales R0, debido a efectos de herencia material puede dar como resultado un mayor incremento en el aceite. De manera similar, se analizaron granos de un total de 15 eventos transgénicos que contenían el alelo transgénico de GBSS de LH59. Ninguno de los granos de las mazorcas de cualquiera de los eventos tuvo 5 incrementos significativos estadísticamente en el contenido de aceite de granos enteros (% en peso base seca) en relación a granos no transgénicos sobre la misma mazorca, lo que indica que el incremento en el aceite fue único para el alelo de GBSS de HOI001. í o EJEMPLO 6 Este ejemplo describe el incremento en los niveles de aceite obtenido en granos F2 transgénicos de plantas cultivadas en campo. Para averiguar el impacto del gen de GBSS HOI001 sobre los 15 niveles de aceite del grano de vegetales cultivados en capo, se segregaron 24-48 semillas F1 a partir de cada 1 de 40 eventos, fueron plantados en un vivero. Los vegetales que desarrollaron fueron cribados por la presencia del "cassette" transgénico por medio de un ensayo de resistencia a la kanamicina no letal, con lo cual una solución antibiótica (0.1 % en peso/volumen) de 0 kanamicina y 0.1 % en peso/volumen de paromomicina) es aplicada a la superficie de la hoja y evaluada por la presencia (no transgénica) o ausencia (transgénica) de lesiones necróticas 1 semana después de aplicación del antibiótico. Los granos fueron aislados de las mazorcas de ambos vegetales transgénicos y vegetales no transgénicos, y luego fueron ensayados para aceite, proteína y almidón en el grano por medio de Espectroscopia de Transmitancia Cercana al Infrarrojo. El Cuadro 2 muestra los niveles medios de aceite en grano entero y el incremento en los niveles de aceite en el grano entero (Delta) en mazorcas de vegetales que contenían (positivo) y carecían (negativo) el "cassette" transgénico que contenía el marcador seleccionable y el gen de GBSS de HOI001. Los niveles de aceite fueron determinados por medio del procedimiento NIT en el Ejemplo 4, y solamente se muestran eventos con un incremento significativo estadísticamente en aceite (p < 0.05).

CUADRO 2 Los resultados muestran que el nivel de aceite del grano entero aumentó en mazorcas transgénicas en relación a mazorcas no transgénicas (p < 0.05) en 16 de los 36 eventos analizados.

El Cuadro 3 muestra los niveles medios de almidón en granos (%) y el cambio en los niveles de almidón en mazorcas de vegetales que contenían (positiva) y que carecían (negativa) el "cassette" transgénico que contenía el marcador seleccionable y el gen de HBSS de HOI001. Solamente se muestran los eventos con un incremento en el aceite significativo estadísticamente (p < 0.05). El Cuadro 4, muestra los niveles medios de proteína en granos (%) y el cambio en los niveles de proteína en mazorcas de vegetales que contenían (positiva) y que carecían (negativa) el "cassette" transgénico que contenía el marcador seleccionable y el gen de HBSS de HOI001. Solamente se muestran los eventos con un incremento en el aceite significativo estadísticamente (p < 0.05). Con base en análisis de NIT, los niveles de almidón en eventos con aceite disminuyeron ligeramente, (Cuadro 3), y los niveles de proteína fueron en su mayoría sin cambio (Cuadro 4).

CUADRO 3 Positivo Negativo. Evento n Media n Media Delta Prob>F ZM_S67359 8 69.15 7 70.94 -1.79 0.0004 ZM_S71548 5 70.10 3 71.33 -1.23 0.0451 ZM_S67354 2 69.50 · . 13 71.12 -1.62 0.?024 ZM_S66817 3 69.73 1. 70.00 -0.27 0.5286 ZM_S71577 3 71.47 8 71.40 0.07 0.8702 ZM_S67343 5 69.92 4 71.20 -1.28 0.0187 ZM_S71555 5 70.30 3 71.23 -0.93 0.118 ZM_S71551 9 70.49 6 71.23 -0.74 0.117 ZM_S69437 3 69.77 8 71.40 -1.63 0.0018 ZM_S66804 7 71.19 . 7 72.27 -1.09 0.0073 ZM_S67338 7 69.81 6 71.25 -1.44 0.0009 ZM_S71573 3 69.77 3 70.67 -0.90 0.1352 ZM_S67331 4 70.10 12 71.23 -1. 3 0.0026 ZM_S71594 2 70.75 8 71.40 -0.65 . 0.1906 ZM_S67340 12 70.82 11 71.35 -0.53 0.0257 ZM_S66800 1 70.50 8 71.40 -0.90 0.16 CUADRO 4 Positivo Negativo Evento n Media n Media Delta Prob>F ZM_S67359 8 11.84 7 11.29 0.55 0.2942 ZM_S71546 5 12.86 3 12.30 0.56 0.1775 ZM_S67354 2 . 12.55 13 12.07 0.48 0.2885 ZM_S6681 3 12.70 1 14.40 -1.70 0.1336 ZM_S71577 . 3 9.50 8 12.03 -2.53 0.0005 ZM_S67343 5 11.46 4 11.40 0.06 0.929 ZM_S71555 5 • 12.58 3 12.43 0.15 0.G995 ZM_S71551 9 12.23 6 11.97 0.27 0.4938 ZM_S69437 3 11.80 8 12.03 -0.23 0.7384 ZIVLS66804 7 12,14 7 11.07 1.07 0.0304 ZM_S67338 7 12.26 6 11.87 0.39 0.452 ZM_S7 573 3 1.37 3 11.30 0.07 0.8416 ZM_S67331 4 12.18 12 12.23 -0.05 0.9133 ZWLS7 594 2 11,80 8 12.03 -0.23 0.6682 ZM__S67340 12 11.44 11 11.28 0.16 0.578 ZM_S66800 1 11.40 8 12.03 -0.63 0:412 EJEMPLO 7 Este ejemplo describe el incremento en los niveles de aceite obtenido en granos híbridos F2 transgénicos de vegetales cultivados en campo. Para averiguar el impacto del gen GBSS de HOI001 sobre los niveles de aceite en grano de vegetales híbridos cultivados en campo, 24 - 28 semillas F1 que se segregaron de 14 eventos, que tengan suficiente semilla, fueron plantados en un vivero. El desarrollo de los vegetales fueron cribados por la presencia del "cassette" transgénico por medio del ensayo de resistencia a la kanamicina no letal, descrito anteriormente en el Ejemplo 6. Se usó el polen de vegetales transgénicos para polinizar ai LH244 endógamo de vaina rígida. La semilla transgénica segregadora F1 generada fue entonces plantada y los vegetales resultantes fueron cribados por la presencia del transgen por medio del ensayo de resistencia a la kanamicina no letal,. Los granos híbridos F2 fueron aislados de las mazorcas de vegetales transgénico y de vegetales no transgénicos, y se ensayaron por aceite en el grano por Espectroscopia de Resonancia Magnética Nuclear, como se describe en el Ejemplo 4. El Cuadro 5, muestra los niveles de aceite en el grano entero y el incremento (delta) en los niveles de aceite en el grano entero en mazorcas de vegetales híbridos que contienen (positivo) y que carecen (negativo) del "cassette" transgénico" que contenía el marcador seleccionare y el gen de GBSS de HOI001. Los niveles de aceite fueron determinados por medio del procedimiento por NMR adaptado a granel descrito en el Ejemplo 4, y solamente se muestran los eventos con un incremento en aceite significativo estadísticamente (p < 0.05). Los datos indican que el nivel de aceite en el grano entero incrementó en mazorcas transgénicas en relación a las mazorcas no transgénicas (p < 0.05) en 9 de los 14 eventos analizados.

CUADRO 5 EJEMPLO 8 Este ejemplo describe la elevación de la actividad de GBSS en tejido de endosperma de maíz que expresa al gen de GBSS de HOI001. Mazorcas desarrolladas de vegetales F1 cribados por la presencia del "cassette" transgénico por el ensayo de resistencia a la kanamicina no letal fueron cosechadas e inmediatamente congeladas a 24 días post polinización. Los granos F2 segregados fueron retirados de la mazorca, luego se separaron en fracciones de gérmen y endosperma. Los granos individuales disectados fueron identificados como transgénicos y no transgénicos por cribado por la habilidad para amplicar por RCP una porción 5 del "cassette" transgénico del ADN genómico aislado de gérmenes individuales usando cebadores específicos para el transgen, como se describe en el Ejemplo 4. Para cada uno de seis eventos, aproximadamente 10 endospermas de los granos transgénicos y no transgénicos fueron conjuntados separadamente. í o Cada conjunto de endosperma fue triturado a un polvo fino con un mortero y pistilo bajo nitrógeno líquido, y los gránulos de almidón fueron aislados por triplicado de acuerdo con el procedimiento de Shure y colaboradores, Cell, 35(1):225-23 (1985). Se ensayó la actividad sintasa del almidón enlazado a gránulo sobre los gránulos aislados usando el método de 15 Vos-Scheperkeuter y colaboradores, Plant Physiol., 82:4 1-416 (1986). El Cuadro 6 muestra la actividad sintasa del almidón enlazado a grano (pmol/mm/mg de almidón) en el endosperma F2 desarrollado que contiene o que carece del "cassette" transgénico de GBSS de ???00? . Los valores mostrados son medias y error estándar de ensayos por triplicado. Los 0 datos indican que los gránulos de almidón de granos transgénicos generalmente tuvieron actividad de GBSS elevada, indicando que el efecto del alelo de HOI001 sobre los niveles de aceite no es una función de la reducción total en la actividad de GBSS, pero funciona por la adición de una actividad únicamente codificada por el gen de GBSS de HOI001.

CUADRO 6 Transgénico No transgénica Evento Media SE Media SE p>F S67338 585 41 455 15 0.0392 S67359 583 20 521 15 0.0665 S71546 635 16 540 23 0.0281 S66804 587 50 454 20 0.0702 S71551 588 9 574 . 11 0.3712 S71555 486 24 464 12 0.4641 EJEMPLO 9 Este ejemplo describe el aislamiento y la secuenciación de la región codificadora del cADN de GBSS de la línea HOI001 de maíz. Se extrajo el mARN de teido de endosperma de maíz desarrollado de HOI001 , 22 días después de polinización, usando un procedimiento adaptado de Opsahl-Ferstad y colaboradores, Plant J., 12(10):235-246 (1997). Resumiendo, se conjuntó el endosperma desarrollado de 3 granos separados se congeló en nitrógeno líquido, y luego se pulverizó con un morteto y pistilo. Aproximadamente 50 mg de endosperma congelado pulverizado fue extraído con 0.5 mi de regulador (LiCI 0.5 M, 10 mM de EDTA, 5 mM de ditiotreitol, 100 mM de Tris-HCI, pH de 8.0, SDS al 1 % en peso volumen). Este extracto acuoso fue entonces extraído con fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:21), y la fracción orgánica fue descartada. Se precipitaron los ácidos nucleicos de la fracción acuosa por adición de un volumen igual de alcohol isopropílico seguido por centrifugación. El sobrenadante resultante fue descartado. El compactado que contenía el mARN fue lavado dos veces con etanol al 70 %, se secó, y luego se resuspendió en 50 µ? de agua que contenía dietilpirocarbonato al 0.1 % en volumen. Se sintetizó el cADN de primera hebra a partir del mARN aislado usando el sistema de síntesis de cADN Clontech S ART® (BD Biosciences). Este cADN de primera hebra se usó como modelo para amplificar secuencias de cADN de GBSS de HOI001 usando el cebador que contiene un sitio de restricción EcoRV seguido por 18 pb del sitio de inicio traslacional predicho (cebador en 5') y un sitio de restricción Sse83871 seguido por 17 pb del extremo 3' hasta el sitio de detención de traslación (cebador en 3'): Cebador en 5' (número de cebador 20095): 5'-GGATATCACCATGGCGGCTCTGGCACG-3' [SEC ID NO: 9] Cebador en 3' (número de cebador 20092): 5'-GTCCTGCAGGCTACACATACTTGTCCA-3' [SEC ID NO: 10] Los productos de amplificación de 1.8 kB resultantes de reacciones de amplificación independientes fueron aislados por electroforesís sobre gel de agarosa, se clonaron independientemente en el vector de clonación 2.1 de RCP, usando el equipo de clonación TOPO TA (Invitrogen), y luego se transformó en un huésped E . coli. Se aislaron múltiples colonias de cada transformación, se preparó el ADN plásmido de cultivos desarrollados de cada colonia, y luego el inserto en cada preparación de plásmido fue secuenciado. La alineación de estas secuencias generó una secuencia consensus que contenía un marco de lectura abierto equivalente a la predicha para ser codificada por medio del gen de GBSS de HOI001 , aunque la secuencia del inserto no específica fue equivalente al consensus. Un clon (designado 7345705-10) tuvo una secuencia inserta con eliminación de pares de bases únicas en relación al consensus. Este clon fue usado para generar un plásmido (designado pMON81463) que contenga la secuencia consensus por inserción del nucléotido adicional usando el equipo para mutagénesis Quick-Change (Stratagene). Esta secuencia, que representa la región codificadora del cADN de GBSS de HOI001, se enlista en la SEC ID NO: 11.

EJEMPLO 10 Este ejemplo describe la construcción de vectores de transformación vegetal que contienen la región codificadora del cADN de GBSS HOI001 , [SEQ ID NO:11], designada para obtener diferentes niveles, control de tiempo y patrones de espacio de expresión, y la transformación subsecuente de maíz. Se construyó un vector de transformación vegetal que contneía la región codificadora de GBSS de HOI001 conducida por el promotor Z27. La región codificadora de GBSS de HOI001 fue aislado de pMON81463 por digestión de restricción con EcoRV y Sse83871 , y se clonó en el vector binario pMON71274. Este vector binario que contenía los límites izquierdo y derecho para transferencia del ADN T; un 3'UTR de promotor de Actina de arroz :: intrón de Actina de arrox :: CP4 :: nos, elemento marcador seleccionable vegetal; y secuencias del "cassette" de expresión vegetal que incluyem un promotor Z227 de 1.1 kb (19-1117 pb) de No. de Acceso a Genbank S578780, López y colaboradores, Mol. Gen. Gent. 247 (5): 603-613 (1995)) para expresión del endosperma; un intrón hsp 70 de maíz 4-153 pares de bases del gen de maíz por choque térmico 70 exón 2, # deAcceso de Genebank X03679, Rochester y colaboradores, EMBO J., 5:451-458 (1986)), y una 3'UTR de globulina. El plásmido resultante de denominó pMON81464 (Figura 7). Se construyó un segundo vector binario de expresión vegetal que contenía el promotor de glutenina de alto peso molecular de trigo fusionado al intrón hsp70 de maíz fue amplificado a partir del vector intermediario usando cebadores 5' y 3' que contenían los sitios de restricción Ascl y Notl, respectivamente: Cebador en 5' (número de cebador 21084): 5'- GGCGCGCCGTCGACGGTATCGATAA GCTTGC-3' [SEC ID NO: 12] Cebador en 3' (número de cebador 21085): 5'- GCGGCCGCCCGCTTGGTATCTGCATTACAATG- 3' [SEC ID NO: 13].

Se purificó el producto de amplificación, que contenía el promotor y el fragmento del intrón con sitios de restricción introducidos, por electroforesis sobre gel de agarosa y se clonó en pCR2.1 TOPO (Invitrogen) para generar un vector plásmido para transformación de E. coli (pOP28). Después de transformación en un vector de E. coli, se aisló el ADN plásmido, se digirió con AscI y Notl, y el fragmento purificado fue clonado en el vector binario pMON71272 para generar un vector (pOP29) que contenía un "cassette" con el promotor de glutenina de alto peso molecular de trigo fusionado al intrón HSP70 de maíz fusionado al 3'UTR de globulina. La región codificadora de GBSS de HOI001 fue aislada por digestión de pMON81464 con Notl/Sse83871 y se clonó en pOP29 para generar el vector binario pOP31 que contenía un "cassette" de expresión con el promotor de glutenina de alto peso molecular de trigo fusionado al intrón HSP70 de maíz fusionado a la región codificadora de GBSS de HOI001 fusionada a 3'UTR de globulina. El promotor/intrón/fragmento de la región codificadora de GBSS de HOI001 fue entonces aislado de pOP31 por digestión con Ascl/See83871 y luego se clonó en el vector binario vegetal pMON71290 que contenía un gen del "cassette" de interés con el 3'UTR de TR7 para generar pOP35, que contenía un "cassette" de expresión con el promotor de glutenina de alto peso molecular de trigo fusionado al intrón HSP70 de maíz fusionado a la región codificadora de GBSS de HOI001 fusionada al 3'UTR de TR7. El promotor/intrón /fragmento de la región codificadora de GBSS de HOI001 fue entonces aislado de pOP35 por digestión con Asc1/Sse83871 y luego se clonó en el vector binario vegetal p ON67647, que contenía un gen del "cassette" de interés con el 3'UTR de HSP17. El plásmido resultante contuvo un "cassette" de expresión con el promotor de glutenina de alto peso molecular fusionado al intrón HSP70 fusionado a la región codificadora de GBSS de HOI001 fusionado a 3'UTR de HSP17. El plásmido fue denominado pMON68298, se muestra en la Figura 8. Se construyó un tercer vector binario de expresión vegetal que contenía el promotor y 5'UTR del gen de GBSS de HOI001 fusionado a la región codificadora de GBSS de HOI001 , fusionado a 3'UTR de globulina de maíz. El promotor de GBSS de HOI001 y 5'UTR (que también contuvo el primer intrón predicho) fue aislado por amplificación por RCP de pMON72506, usando un cebador en 5' que contiene el sitio de restricción para Pmel. Cebador en 5' (número de cebador 20362): 5'- GATCGTTTAAACGTTCGTGTGGCAGATTCATC- 3' [SEC ID NO: 14] Cebador n 3' (número de cebador 20363): 5'-GACGTGGCCAGAGCCGCCATGCCGATAATCCACTGCATA G - 3' [SEC ID NO: 15] El producto de amplificación, un fragmento que contenía de 5' a 3? 125 pb del sitio de inicio traslacional de GBSS de HOI001 predicho y 20 pb de la secuencia codificadora predicha de pMON72506 (correspondiente a 17-1162 pb de la SEC ID NO: 1), fue purificado por electroforesis sobre gel de agarosa y se clonó en pCR2.1 TOPO (Invitrogen) para generar pMON81466.

La región codificadora de GBSS de HOI001 fue retirada de pMON81463 y clonada en el vector pMON81466 para generar pMON81468, que contenía el promotor GBSS de ??????/5'UTR fusionado a la región codificadora de GBSS de HOI001 , con la secuencia polienlazadora a extraña de 45 pb entre el promotor/UTR y los elementos de la región codificadora. Esta secuencia extraña fue entonces eliminada por digestión de pMON81468 con Mlul para eliminar el fragmento de 780 pb que separa la secuencia extraña, luego se refortalecieron con el fragmento análogo de 735 pb (que carece de la secuencia extraña), generando pMON81469. Este fragmento de 735 pb fue generado por digestión de pMON72506 con Muil y aislamiento del fragmento resultante. Este promotor/UTR/secuencia de la región codificadora fue entonces aislada de pMON81469 por digestión con Pmel y Sse83871 , y se clonó en el vector binario pMON71274 para generar el vector binario p ON81465. Este vector contuvo un "cassette" de expresión con el promotor y 5'UTR del gen de GBSS de HOI001 fusionado a la región codificadora de GBSS fusionada al 3'UTR de globulina de maíz (Figura 9). Estos tres vectores de transformación vegetal son transformados en un endógamo de maíz élite (LH244) (Corn States Hybrid Serv., LLC, Des oines, IA). Resumiendo, mazorcas que contengan embriones inmaduros se cosecharon aproximadamente 10 días después de polinización y se conservaron refrigeradas a 4 °C hasta uso (hasta 5 días post-cosecha). El tamaño del embrión preferido para este método de transformación es ~ 1.0 -2.0 mm. Este tamaño se logra usualmente 10 días después de polinización en el invernadero con las condiciones de cultivo de una temperatura promedio de 87 °F, la duración del día de 14 horas con suministro suplementario de iluminación por medio de lámparas de GE 1000 Watt High Pressure Sodium. Se aislaron embriones inmaduros de mazorcas esterilizadas en la superficie y se gotearon directamente en la suspensión celular de Agrobacterium preparada en un tubo de microcentrífuga de 1.5 m!. el aislamiento duró continuamente por 15 minutos. El tubo es entonces apartado por 5 minutos, dando como resultado un tiempo total de inoculación por embrión individual de 5 a 20 minutos. Después de que la suspensión celular de Agrobacterium es retirada usando una pipeta de transferencia estéril de punta fina, los embriones inmaduros son transferidos sobre un medio de co-cultivo (Cuadro 7). Los embriones son entonces colocados sobre el medio con el escutelo hacia arriba. Los embriones se cultivaron en una incubadora en la oscuridad (23 °C) por aproximadamente 24 horas. Los embriones se transfirieron entonces sobre un medio de MS modificado MSW50, Cuadro 7) suplementado con 0.1 o 0.25 mM de glifosato y 250 mg/l de carbecilina para inhibir Agrobacterium en placas de Petri (100 mm x 25 mm). Los cultivos se incubaron en un cuarto de cultivo oscuro a 27 °C por 2-3 semanas. Todas las piezas de callus se transfirieron entonces individualmente sobre el primer medio de regeneración (MS/6BA, Cuadro 7) suplementado con los mismos niveles de glifosato. Los cultivos se desarrollaron sobre este medio y en un cuarto de cultivo con un fotoperíodo de 16 horas de luz/8 horas de oscuridad y 27 °C por 5-7 días. Se transfirieron entonces sobre el segundo medio de regeneración (MSOD, Cuadro 7), en placas de Petri (100 mm x 25 mm) por aproximadamente 2 semanas. Todas las piezas de callus con regeneración de vástagos y tejido viviente se transfirieron sobre el mismo medio contenido en el fitoconjunto para desarrollo de vástagos adicionalmente antes de ser transferidos al suelo (aproximadamente 2-4 semanas). El medio de regeneración (MS6BA y MSOD) son todos suplementados con 250 mg/l de carbenicilina y 0.1 o 0.25 mM de glifosato. Estas plántulas en desarrollo se transfirieron entonces al suelo, se fortalecieron en una cámara de cultivo a 27 °C, humedad de 80 %, y baja intensidad luminosa por aproximadamente 1 semana, y luego se transfirieron a un invernadero y se cultivaron bajo condiciones de invernadero estándares. Se colectaron los granos resultantes y se analizaron cornos e describe en el Ejemplo 4. Los resultados indican que los promotores diferentes tuvieron diferente impacto sobre la acumulación del suelo con base en la resistencia y la duración de la expresión de la región codificadora de GBSS de HOI001.

CUADRO 7 Composición del medios usado en la transformación de maíz Se solidificó el medio de co-cultivo con 5.5 mg/l con 5.5 mg/l de EEO. Todos los otros medios fueron solidificados con 7 g/l de Phytagar para selección de NPTII y con 3 g/l de fitogel para selección de glifosato.

EJEMPLO 11 Este ejemplo expone el uso de los polimorfismos en el gen de GBSS de HOI001 como marcadores moleculares para acelerar la incorporación del polimorfismo de la secuencia de GBSS de HO1001 en otros germoplasmas de maíz con el resultado de incrementar el aceite en el grano. La presente invención proporciona un vegetal de maíz con aceite en el grano creciente seleccionado por el uso de la reproducción asistida por el marcador en donde una población de vegetales son seleccionados por la presencia de una secuencia de polimorfismo única para el gen de GBSS de HOI001 (SEC ID NO: 1). El Ejemplo 1, anterior, lista de polimorfismo única a la secuencia de GBSS de HOI001 , que no se encontró en la secuencia de GBSS de LH59 (Shure y colaboradores, supra). La selección de vegetales que tengan el gen de GBSS de HOI001 por alto contenido de aceite comprende sondear el ADN genómico de los vegetales resultantes, mediante el proceso de selección, por la presencia del marcador molecular para el gen de GBSS de HOI001. El marcador molecular es una molécula de ADN que representa un polimorfismo único en el gen de GBSS de HOI001 que funciona como una sonda o cebador para un GBSS de HOI001 objetivo en un genoma vegetal. El polimorfismo seleccionado puede ser de una región codificadora del gen. Los vegetales que contienen el gen. Los vegetales que contiene el gen de GBSS de HOI001 son continuos en el proceso de reproducción y de selección.

Claims (20)

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1.- Una molécula de ácido nucleico sustancialmente purificada seleccionada del grupo que consiste de: (a) una molécula de ácido nucleico que comprende la SEC ID NO: 1 o el complemento de la misma, (b) una molécula de ácido nucleico que comprende la SEC ID NO: 11 o el complemento de la misma, (c) una molécula de ácido nucleico que codifica a un polipéptido que tenga al menos aproximadamente 94 % de identidad de secuencia de a (SEC ID NO: 3).aminoácido con la SEC ID NO. 3.

2. - Un "cassette" de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1 , en donde la molécula de ácido nucleico está operablemente unida a un promotor, el cual es funcional en una célula vegetal.

3. - Una célula vegetal que comprende el "cassette" de expresión de conformidad con la reivindicación 2.

4. - Un vegetal que comprende la célula vegetal de conformidad con la reivindicación 3.

5.- El vegetal de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque el vegetal es un monocotiledóneo.

6.- El vegetal de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque el vegetal monocotiledóneo es maíz.

7. - Semillas obtenidas de un vegetal de maíz, en donde las semillas comprenden la molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1.

8. - Un alimento animal caracterizado porque es obtenido de las semillas de la reivindicación 7

9. - Un vegetal que tenga incorporado en su genoma una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de: (a) una molécula de ácido nucleico que comprende la SEC ID NO: 1 o el complemento de la misma, (b) una molécula de ácido nucleico que comprende la SEC ID NO: 11 o el complemento de la misma, (c) una molécula de ácido nucleico que codifica a un polipéptido que tenga al menos aproximadamente 94 % de identidad de secuencia de a (SEC ID NO: 3).aminoác¡do con la SEC ID NO. 3.

10. - El vegetal de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque el vegetal es un monocotiledóneo.

11. - El vegetal monocotiledóneo de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque el vegetal es maíz.

12. - Semillas obtenidas del vegetal de conformidad con la reivindicación 11.

13.- Aceite obtenido de semillas de conformidad con la reivindicación 12.

14.- Un alimento animal obtenido de las semillas de conformidad con la reivindicación 12.

15. - Un método de producir un vegetal que tenga niveles crecientes de producción de aceite, en donde el método comprende: (a) transformar un vegetal con un "cassette" de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de: i) una molécula de ácido nucleico que comprende la SEC ID NO: 1 o el complemento de la misma, ii) una molécula de ácido nucleico que comprende la SEC ID NO: 11 o el complemento de la misma; y ¡ii) una molécula de ácido nucleico que codifica a un polipéptido que tiene al menos 94 % de identidad de aminoácidos con la SEC ID NO: 3; en donde el "cassette" de expresión comprende una región promotora funcional en un célula vegetal unida operablemente a la molécula de ácido nucleico; y (b) cultivar el vegetal transformado.

16. - El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque el vegetal es un monocotiledóneo

17.- El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque el vegetal monocotiledóneo es maíz.

18.-EI método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque la región promotora es una región promotora de endospermo.

19. -El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque la región promotora es el promotor Z27.

20.- Un método de seleccionar germoplasma de maíz, que comprende las etapas de: a) identificar a! menos un polimorfismo único en la secuencia de GBSS de HOI001 , representada por ia SEC ID NO: 1 ; b) seleccionar un fragmento de la SEC ID NO: 1 , que contiene al menos parte de uno de los polimorfismos a ser usados como se usa un marcador c) ensayar vegetales de maíz por la presencia de agua; d) seleccionar vegetales que contengan el marcador.