KR20170098810A - 포화 지방산을 적게 함유하거나 전혀 함유하지 않는 트랜스제닉 카놀라의 생성 - Google Patents

Abstract

조성물 및 방법은 식물 세포에서 신규 델타-9 데새투라제를 유전적으로 코딩하고 발현하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 식물 종자 내의 포화 지방산의 퍼센트 조성이 감소되고 Δ9 지방산의 수반되는 증가가 있도록 델타-9 데새투라제 효소의 활성을 활용하기 위해 식물 세포에서 핵산을 발현하는 방법. 다른 실시양태에서, 아미노산 서열은 델타-9 데새투라제 활성을 갖는다. 방법은 전체 식물, 식물 종자, 및 식물 재료, 예를 들어, 종자 내의 모노 불포화 지방산의 양을 증가시키기 위한 목적으로 식물 세포, 식물 재료, 및 전체 식물에서의 델타-9 데새투라제의 발현을 수반할 수 있다.

Description

포화 지방산을 적게 함유하거나 전혀 함유하지 않는 트랜스제닉 카놀라의 생성 {GENERATION OF TRANSGENIC CANOLA WITH LOW OR NO SATURATED FATTY ACIDS}

일부 실시양태는 일반적으로 특정 델타-9 데새투라제 효소, 이들 효소를 코딩하는 핵산, 및 그를 식물 세포에서 발현하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태는 특정 델타-9 데새투라제 효소의 활성을 이용하여 식물 재료 (예를 들어, 종자) 내의 포화 지방산의 퍼센트 조성을 감소시키는 것 및 ω-7 지방산의 퍼센트 조성을 증가시키는 것에 관한 것이다. 추가 실시양태는 종자-특이적 프로모터를 이용하여 우선적으로 종자에서 델타-9 데새투라제 효소를 발현하는 것에 관한 것이다. 특정한 실시양태에서 방법에 의해 생산된 식물 및 식물 재료, 및 3.5% 미만 또는 2.7% 미만의 포화 지방산을 함유하는 이들 식물에 의해 생산된 오일이 또한 본원에 개시된다.

식물-유래 오일은 식이성 지방 섭취의 주요 공급원으로서 서서히 동물-유래 오일 및 지방을 대체해왔다. 그러나, 대부분의 산업화 국가에서의 포화 지방 섭취는 총 칼로리 소모량의 약 15% 내지 20%로 여전히 남아있다. 더 건강한 생활 양식을 촉진하기 위한 노력으로, 미국 농무부 (USDA)는 최근 포화 지방이 1일 칼로리 섭취의 10% 미만을 구성하는 것을 권장하였다. 소비자 인식을 용이하게 하기 위해, 현재 USDA가 승인한 현행 라벨링 지침은 총 포화 지방산 수준이 "저-포화(low-sat)" 라벨을 받기 위해서는 14 g 서빙 당 1.0 g 미만, "비-포화(no-sat)" 라벨을 받기 위해서는 14 g 서빙 당 0.5 g 미만인 것을 요구한다. 이는 식물 오일의 포화 지방산 함량이 "저-포화" 또는 "비-포화" 라벨을 받기 위해서는 각각 7% 미만 및 3.5% 미만일 필요가 있음을 의미한다. 이들 지침의 발행 이후로, "저-포화" 및 "비-포화" 오일에 대한 소비자 수요가 급등하고 있다. 지금까지, 이러한 수요는 주로 카놀라 오일로 충족되었고, 훨씬 더 낮은 정도로는 해바라기 및 홍화 오일로 충족되어 왔다.

불포화 지방 (단일불포화 및 다중불포화)이 유익하지만 (특히 적당히 소모되는 경우에), 포화 및 트랜스 지방은 그렇지 않다. 포화 지방 및 트랜스 지방은 혈액 중 바람직하지 않은 LDL 콜레스테롤 수준을 상승시킨다. 식이성 콜레스테롤이 또한 LDL 콜레스테롤을 상승시키고, 심지어 LDL을 상승시키지 않으면서 심장 질환에 기여할 수 있다. 따라서, 건강식의 일부로서 포화 지방, 트랜스 지방, 및 콜레스테롤이 낮은 식품을 선택하는 것이 권장된다.

오일의 특징은, 식물 기원이든 동물 기원이든, 오일 분자 내의 탄소 및 수소 원자의 수, 뿐만 아니라 지방산 쇄에 포함된 이중 결합의 수 및 위치에 의해 우세하게 결정된다. 식물로부터 유래된 대부분의 오일은 다양한 양의 팔미트 (16:0), 스테아르 (18:0), 올레 (18:1), 리놀레 (18:2) 및 리놀렌 (18:3) 지방산으로 구성된다. 통상적으로, 팔미트산 및 스테아르산은 "포화"로 지정되는데, 이는 그의 탄소 쇄가 수소 원자로 포화되고, 따라서 이중 결합이 없기 때문이고; 이들은 최대로 가능한 수의 수소 원자를 함유한다. 그러나, 올레산, 리놀레산 및 리놀렌산은 내부에 각각 1, 2, 및 3개의 이중 결합을 갖는 18-탄소 지방산 쇄이다. 올레산은 전형적으로 단일불포화 지방산으로 간주되는 한편, 리놀레산 및 리놀렌산은 다중불포화 지방산으로 간주된다. 3.5% 미만의 포화 지방산 함량을 갖는 것들을 의미하는 "비 포화" 오일 제품의 U.S.D.A. 정의는 중량 기준의 조합된 포화 지방산 함량으로서 계산된다 (지방산의 총량과 비교 시).

카놀라 오일은 모든 식물성 오일 중에서 가장 낮은 수준의 포화 지방산을 갖는다. "카놀라"는 종자의 총 지방산 함량을 기준으로 하여 최대 2 중량% (바람직하게는 최대 0.5 중량%, 가장 바람직하게는 본질적으로 0 중량%)의 에루스산 (C22:1) 함량을 갖고, 분쇄 후, 탈지 (오일-무함유) 박 중 30 μmol/g 미만의 글루코시놀레이트를 함유하는 공기-건조 박을 생산하는 평지씨 (브라시카(Brassica))를 지칭한다. 이들 유형의 평지씨는 상기 종의 보다 전통적인 품종과 비교 시 그의 식용성에 의해 구별된다.

오일종자에서, 주로 색소체에서 지방산 합성이 발생하는 것으로 가정된다. 지방산 합성의 주요 생성물은 팔미테이트 (16:0)이며, 이는 스테아레이트 (18:0)로 효율적으로 신장되는 것으로 보인다. 여전히 색소체 내에 있지만, 그 후 포화 지방산이 아실-ACP 델타-9 데새투라제로 공지된 효소에 의해 탈포화되어 1개 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 도입할 수 있다. 구체적으로, 스테아레이트가 색소체 델타-9 데새투라제 효소에 의해 신속하게 탈포화되어 올레에이트 (18:1)가 산출될 수 있다. 실제로, 팔미테이트가 색소체 델타-9 데새투라제에 의해 팔미트올레에이트 (16:1)로 또한 탈포화될 수 있지만, 이러한 지방산은 대부분의 식물성 오일에서 미량 (0-0.2%)으로만 나타난다. 따라서, 색소체에서의 지방산 합성의 주요 생성물은 팔미테이트, 스테아레이트, 및 올레에이트이다. 대부분의 오일에서, 올레에이트는, 포화 지방산이 훨씬 더 낮은 비율로 존재하기 때문에, 합성된 주요 지방산이다.

새롭게 합성된 지방산은 색소체로부터 세포질로 유출된다. 세포질에서의 식물 지방산의 후속 탈포화는 올레에이트에 한정되는 것으로 보이며, 이는 포스파티딜 콜린 (PC)으로 에스테르화된 올레오일 또는 리놀레오일 기질 상에 작용하는 마이크로솜 데새투라제에 의해 리놀레에이트 (18:2) 및 리놀레네이트 (18:3)로 탈포화될 수 있다. 또한, 식물에 따라, 올레에이트는 신장 (20:1, 22:1, 및/또는 24:1로의 신장)에 의해, 또는 관능기의 첨가에 의해 추가로 변형될 수 있다. 이어서, 이들 지방산은, 포화 지방산인 팔미테이트 및 스테아레이트와 함께, 내세망 막에서 트리글리세리드로 어셈블리된다.

식물 아실-ACP 델타-9 데새투라제 효소는 가용성이다. 이는 색소체 기질 내에 위치하고, ACP, 우세하게 스테아릴-ACP로 에스테르화된 새롭게 합성된 지방산을 기질로서 사용한다. 이는 다른 델타-9 데새투라제 효소와 대조적이며, 이는 내형질 세망 막 (ER, 또는 마이크로솜) 내에 위치하고, Co-A로 에스테르화된 지방산을 기질로서 사용하고, 포화 지방산인 팔미테이트 및 스테아레이트 둘 다를 탈포화시킨다. 미국 특허 5,723,595 및 6,706,950은 식물 데새투라제에 관한 것이다.

효모 델타-9 데새투라제 유전자는 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)로부터 단리되고, 클로닝되고, 서열분석된 바 있다. 문헌 [Stukey et al. (1989) J. Biol . Chem. 264:16537-44; Stukey et al. (1990) J. Biol . Chem. 265:20144-9]. 이러한 효모 유전자는 담배 잎 조직 내로 도입된 바 있고 (Polashcok et al. (1991) FASEB J. 5:A1157; Polashok et al. (1992) Plant Physiol. 100:894-901), 이러한 조직에서 분명하게 발현되었다. 추가로, 이러한 효모 유전자는 토마토에서 발현되었다. 문헌 [Wang et al. (1996) J. Agric. Food Chem. 44:3399-402; 및 Wang et al. (2001) Phytochemistry 58:227-32]을 참조한다. 특정 불포화 지방산에서의 일부 증가, 및 특정 포화 지방산에서의 일부 감소가 이러한 효모 델타-9 데새투라제 유전자를 사용하여 담배 및 토마토 둘 다에 대해 보고되었지만, 명백하게 담배 및 토마토는 오일 작물이 아니다. 이러한 효모 유전자가 또한 브라시카 나푸스(Brassica napus) 내로 도입되었다. 미국 특허 5,777,201.

아스페르길루스 니둘란스(Aspergillus nidulans)로부터의 상이한 진균 아실-CoA 델타-9 데새투라제는 카놀라 내로 도입된 바 있고, 이에 의해 종자 오일 내의 감소된 포화 지방산 수준을 달성하였다. 미국 특허 출원 공개 US 2008/0260933 A1. 에이. 니둘란스(A. nidulans) 아실-CoA 델타-9 데새투라제는 종자 오일 내의 보다 더 풍부한 팔미테이트 지방산의 고갈 (36-49%)보다 더 큰 스테아레이트의 고갈 (61-90%)을 제공하였다.

신규 진균 델타-9 데새투라제 효소; 이러한 데새투라제를 코딩하는 적어도 1종의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산; 및 상기의 것들 중 어느 하나를 포함하는 식물, 식물 재료 (예를 들어, 종자), 식물 부분, 및 식물 범용 제품이 본원에서 개시된다. 일부 실시양태의 측면은 마그나포르테 그리세아(Magnaporthe grisea), 렙토스파에리아 노도룸(Leptosphaeria nodorum), 및 헬리코베르파 제아(Helicoverpa zea)로부터 단리된 진균 델타-9 데새투라제 효소에 의해 예시된다. 일부 예는 팔미트산 또는 스테아르산에 대한 기질 선호도를 갖는 천연 및 합성 델타-9 데새투라제를 포함한다.

일부 실시양태는 서열식별번호(SEQ ID NO): 1, 서열식별번호: 26, 서열식별번호: 27, 서열식별번호: 28 서열식별번호: 29, 서열식별번호: 30, 서열식별번호: 31, 서열식별번호: 32, 및 서열식별번호: 33으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 델타-9 데새투라제 효소를 코딩하는 단리된 핵산 분자를 포함한다. 특정한 예에서, 핵산 분자는 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 12, 서열식별번호: 13, 서열식별번호: 14, 서열식별번호: 15, 서열식별번호: 16, 서열식별번호: 17, 서열식별번호: 18, 서열식별번호: 19, 서열식별번호: 20, 서열식별번호: 21, 서열식별번호: 22, 서열식별번호: 23, 서열식별번호: 24, 및 서열식별번호: 25로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 60% 동일한 서열을 포함한다. 이들 및 추가 실시양태는 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 26, 서열식별번호: 27, 서열식별번호: 28 서열식별번호: 29, 서열식별번호: 30, 서열식별번호: 31, 서열식별번호: 32, 및 서열식별번호: 33으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단리된 델타-9 데새투라제 폴리펩티드를 포함할 수 있다.

식물 세포에서 상기 언급된 핵산 및/또는 폴리펩티드 중 적어도 1종을 발현하는 방법이 또한 개시된다. 특정한 실시양태는 포화 지방산의 퍼센트 조성이 식물, 식물 재료 (예를 들어, 종자), 및/또는 식물 세포를 포함하는 식물 부분, 및/또는 상기의 것들 중 임의의 것으로부터 생산된 식물 범용 제품에서 감소될 수 있도록 델타-9 데새투라제 효소의 활성을 활용한다. 특정 실시양태에서, ω-7 지방산이 식물, 식물 재료, 식물 부분, 및/또는 식물 범용 제품에서 수반되어 증가될 수 있다. 추가 실시양태는 종자 오일 내의 포화 지방산의 수준을 추가로 저하시키기 위해 종자-특이적 발현을 활용한다.

일부 실시양태는 식물 세포 내의 포화 지방산의 양이 감소되도록 식물 세포를 본 발명의 델타-9 데새투라제 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자로 형질전환시키는 것을 포함하는, 식물, 식물 재료, 식물 부분, 및/또는 식물 범용 제품 내의 포화 지방산의 양을 감소시키는 방법을 포함한다. 일부 실시양태는 동일한 종의 야생형 식물과 비교 시 식물 내에 감소된 양의 포화 지방산을 포함하는 유전자 조작된 식물을 생성하는 방법을 포함한다. 이러한 방법은 식물 재료 (또는 식물 세포)를 1종 이상의 델타-9 데새투라제 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자, 또는 본 발명의 델타-9 데새투라제 폴리펩티드의 1개 이상의 카피로 형질전환시키는 것, 및 형질전환된 식물 재료 (또는 식물 세포)를 배양하여 식물을 수득하는 것을 포함한다. 특정한 예에서, 아라비돕시스(Arabidopsis) 종으로부터의 식물 세포 및/또는 식물 재료는 본 발명의 델타-9 데새투라제 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자로 형질전환될 수 있다. 다른 특정한 예에서, 델타-9 데새투라제 유전자의 2개 이상의 카피는 형질전환될 수 있으며, 여기서 각각의 델타-9 데새투라제 유전자는 상이한 프로모터에 의해 제어된다. 다른 특정한 예에서, 2종 이상의 프로모터는 종자 특정한 프로모터이다.

상기 및 다른 특색은 여러 실시양태의 하기의 상세한 설명으로부터 보다 더 명백해질 것이며, 이는 첨부 도면을 참조하여 진행된다.

도 1은 pDAB7305의 플라스미드 지도를 제시한다.
도 2는 넥세라 710™ 카놀라 대조군 식물 및 218-11.30HL 트랜스제닉 카놀라 식물로 구성된 양성 대조군 식물과 비교 시 분리하는 T₁ 카놀라 식물로부터의 벌크 T₂ 종자에서의 TSFA (%)의 분포를 예시한다.
도 3은 음성 대조군 넥세라 710™ 카놀라 식물과 비교 시 3종의 선택된 트랜스제닉 이벤트로부터의 T₂ 종자 집단에서의 TSFA의 분포를 제시한다. 짙은 점은 3.5% (짙은 선)보다 더 낮은 TSFA를 갖는 종자 자손을 나타낸다. 그래프에서 제시된 바와 같이, 3.5%보다 더 낮은 TSFA를 갖는 식물은 다양한 양의 수율을 생성하고, AnD9DS 트랜스진과 동일한 T-가닥 구성요소 상에 함유된 pat 트랜스진의 2 내지 10개의 카피수를 보유하였다.
도 4는 카놀라 단일 종자에서의 TSFA 및 포화 지방산 백분율의 분포를 예시한다 (야생형 대조군 식물은 그래프가 트랜스제닉 카놀라 이벤트의 TSFA 값을 도시하도록 제외됨).

서열 목록

첨부 서열 목록에 열거된 핵산 서열은 37 C.F.R. § 1.822에 정의된 바와 같이 뉴클레오티드 염기에 대한 표준 문자 약어를 사용하여 제시된다. 각각의 핵산 서열의 단지 1개의 가닥만이 제시되지만, 상보적 가닥은 표시된 가닥에 대한 임의의 언급에 의해 포함되는 것으로 이해된다. 첨부 서열 목록에서:

서열식별번호: 1은 아스페르길루스 니둘란스 아실-CoA 델타-9 데새투라제 단백질 (일부 경우에 AnD9DS로 지칭됨)의 아미노산 서열을 제시한다.

서열식별번호: 2는 아스페르길루스 니둘란스 아실-CoA 델타-9 데새투라제 유전자 (일부 경우에 AnD9DS로 지칭됨)의 v3의 핵산 서열을 제시한다.

서열식별번호: 3은 pDAB7305의 제1 식물 전사 유닛 (PTU) 핵산 서열을 제시한다.

서열식별번호: 4는 pDAB7305의 제2 PTU의 핵산 서열을 제시한다.

서열식별번호: 5는 pDAB7305의 제3 PTU의 핵산 서열을 제시한다.

서열식별번호: 6-11은 일부 실시양태에 유용할 수 있는 프라이머 및 프로브의 서열을 제시한다.

서열식별번호: 12는 PCR에 의해 증폭된 엠. 그리세아(M. grisea) 아실-CoA 델타-9 데새투라제 유전자 (일부 경우에 MgD9DS로 지칭됨)의 예시적인 단편이다.

서열식별번호: 13은 예시적인 인트론 없는 MgD9DS 클론이다.

서열식별번호: 14는 일부 경우에 LnD9DS-1로 지칭되는 제1 렙토스파에리아 노도룸(Leptosphaeria nodorum) 아실-CoA 델타-9 데새투라제를 코딩하는 예시적인 핵산 서열을 제시한다.

서열식별번호: 15는 일부 경우에 LnD9DS-2로 지칭되는 제2 예시적인 엘. 노도룸(L. nodorum) 아실-CoA 델타-9 데새투라제를 코딩하는 예시적인 핵산 서열을 제시한다.

서열식별번호: 16은 엠. 그리세아로부터의 예시적인 천연 델타-9 데새투라제 유전자 (MgD9DS v1로 표지됨)로부터의 코딩 영역을 제시한다.

서열식별번호: 17은 헬리코베르파 제아(Helicoverpa zea)로부터의 예시적인 천연 델타-9 데새투라제 유전자 (HzD9DS v1로 표지됨)로부터의 코딩 영역을 제시한다.

서열식별번호: 18은 엘. 노도룸으로부터의 예시적인 천연 델타-9 데새투라제 (LnD9DS-2 v1) 유전자로부터의 코딩 영역을 제시한다.

서열식별번호: 19는 엠. 그리세아로부터의 예시적인 카놀라-최적화 델타-9 데새투라제 유전자 (MgD9DS v2)의 서열을 제시한다.

서열식별번호: 20은 에이치. 제아(H. zea)로부터의 예시적인 카놀라-최적화 델타-9 데새투라제 유전자 (HzD9DS v2)의 서열을 제시한다.

서열식별번호: 21은 엘. 노도룸으로부터의 예시적인 카놀라-최적화 델타-9 데새투라제 유전자 (LnD9DS-2 v2)의 서열을 제시한다.

서열식별번호: 22는 엘. 노도룸으로부터의 추가의 예시적인 카놀라-최적화 델타-9 데새투라제 유전자 (LnD9DS-2 v3)의 서열을 제시한다.

서열식별번호: 23은 에이치. 제아로부터의 추가의 예시적인 카놀라-최적화 델타-9 데새투라제 유전자 (HzD9DS v3)의 서열을 제시한다.

서열식별번호: 24는 일부 경우에 AnD9DS v2로 지칭되는 아스페르길루스 니둘란스 델타-9 데새투라제를 코딩하는 예시적인 핵산 서열을 제시한다.

서열식별번호: 25는 일부 경우에 AnD9DS v3으로 지칭되는 에이. 니둘란스 델타-9 데새투라제를 코딩하는 제2 예시적인 핵산 서열을 제시한다.

서열식별번호: 26은 엠. 그리세아로부터의 예시적인 천연 델타-9 데새투라제 (MgD9DS)의 아미노산 서열을 제시한다.

서열식별번호: 27은 에이치. 제아로부터의 예시적인 천연 델타-9 데새투라제 (HzD9DS)의 아미노산 서열을 제시한다.

서열식별번호: 28은 엘. 노도룸으로부터의 예시적인 천연 델타-9 데새투라제 (LnD9DS-2)의 아미노산 서열을 제시한다.

서열식별번호: 29는 서열식별번호: 24-25 (AnD9DS)에 의해 예시된 바와 같은 핵산에 의해 코딩된 아미노산 서열을 제시한다.

서열식별번호: 30은 또 다른 예시적인 AnD9DS 데새투라제의 아미노산 서열을 제시한다.

서열식별번호: 31은 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)로부터의 예시적인 천연 델타-9 데새투라제 (ScOLE1)의 아미노산 서열을 제시한다.

서열식별번호: 32는 예시적인 AnD9DS 데새투라제의 N-말단 68개 잔기(1-68)를 제시한다.

서열식별번호: 33은 예시적인 AnD9DS 데새투라제의 C-말단 175개 잔기 (281-455)를 제시한다.

I. 여러 실시양태의 개관

본 발명자들은 이전에 아스페르길루스 니둘란스로부터의 진균 아실-CoA 델타-9 데새투라제를 카놀라 내로 도입하였고, 이에 의해 종자 오일 내의 감소된 포화 지방산 수준을 달성하였다. 미국 특허 출원 공개 US 2008/0260933 A1. 에이. 니둘란스 델타-9 데새투라제는 종자 오일 내의 보다 더 풍부한 팔미테이트 지방산의 고갈 (36-49%)보다 더 큰 스테아레이트의 고갈 (61-90%)을 제공하였다. 에이. 니둘란스 델타-9 데새투라제의 다중 카피를 제공하는 것은 카놀라 내의 포화 지방산 수준을 3.5% 미만으로 감소시킬 수 있었던 것으로 발견되었다.

서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 5, 서열식별번호: 12, 서열식별번호: 13, 서열식별번호: 14, 서열식별번호: 15, 서열식별번호: 16, 서열식별번호: 17, 서열식별번호: 18, 서열식별번호: 19, 서열식별번호: 20, 서열식별번호: 21, 서열식별번호: 22, 서열식별번호: 23, 서열식별번호: 24, 및 서열식별번호: 25로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 60% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 델타-9 데새투라제 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자가 본원에 개시된다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 델타-9 데새투라제 폴리펩티드-코딩 서열에 작동가능하게 연결된 유전자 조절 요소를 추가로 포함할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 유전자 조절 요소는 파세올린 프로모터, 파세올린 5' 비번역 영역, 파세올린 3' 비번역 영역 ("UTR"), 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) ORF1 3' 비번역 영역, 카사바 베인 모자이크 바이러스(Cassava vein Mosaic Virus) 프로모터, 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum) RB7 매트릭스 부착 영역, T-가닥 경계 서열, LfKCS3 프로모터, 및 FAE 1 프로모터일 수 있다.

일부 실시양태에서, 델타-9 데새투라제 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 여러 카피가 있을 수 있고, 각각은 상이한 세트의 조절 요소의 조절 제어 하에 있을 수 있다. 보다 구체적으로, 유전자 조절 요소는 파세올린 프로모터 및 파세올린 5' UTR, 및 레스퀘렐라 펜들레리(Lesquerella fendleri) LfKCS3 프로모터일 수 있는데, AND9DS의 2개 카피가 존재하며, 1개 카피는 파세올린 프로모터 및 5'UTR에 의해 제어되고, 제2 카피는 LfKCS3 프로모터에 의해 제어된다. 다른 실시양태에서, 델타-9 데새투라제 폴리펩티드 (또는 다중 델타-9 데새투라제 폴리펩티드)를 코딩하는 핵산의 여러 카피는 사카로미세스 세레비지아에 델타-9 데새투라제 프로모터, 델타-9 데새투라제 3'UTR/종결인자, ole1 유전자 프로모터, 파세올루스 불가리스(Phaseolus vulgaris) 파세올린 3' 비번역 영역, 파세올루스 불가리스 파세올린 매트릭스 부착 영역, 아그로박테리움 투메파시엔스 만노핀 신타제 프로모터, 아그로박테리움 투메파시엔스 ORF23 3' 비번역 영역, 카사바 베인 모자이크 바이러스 프로모터, 아그로박테리움 투메파시엔스 ORF1 3' 비번역 영역, 니코티아나 타바쿰 RB7 매트릭스 부착 영역, 오버드라이브, T-가닥 경계 서열, LfKCS3 프로모터, FAE 1 프로모터, Myc 태그, 및 헤마글루틴 태그를 포함한, 다른 조절 요소의 제어 하에 있을 수 있다.

서열식별번호: 1 뿐만 아니라 이러한 델타-9 데새투라제 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자, 예컨대 서열식별번호: 2로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 델타-9 데새투라제 폴리펩티드가 또한 개시된다.

일부 실시양태에서, 핵산 분자 및 델타-9 데새투라제 폴리펩티드가 식물 재료, 세포, 조직, 또는 전체 식물에서 발현되어, 식물 재료, 세포, 조직, 또는 전체 식물 내의 포화 지방산의 양을 동일한 종의 야생형 식물에서 관찰되는 양에 비해 감소시킬 수 있다. 본 발명의 대안적 실시양태는 식물 재료, 세포, 조직, 또는 전체 식물 내의 포화 지방산의 양을 감소시키는 방법을 포함한다. 이러한 방법은 식물 재료, 세포, 조직, 또는 전체 식물 내의 포화 지방산의 양이 감소되도록 식물 재료, 세포, 조직, 또는 전체 식물을 상기 언급된 핵산 분자 중 적어도 1종으로 형질전환시키는 것을 포함할 수 있다. 특정한 실시양태는 식물 재료, 세포, 조직, 또는 전체 식물 내의 팔미트 및/또는 스테아르 지방산을 우선적으로 감소시키는 방법을 포함한다.

본원에 개시된 방법은, 예를 들어, 식물, 또는 식물 (예를 들어, 아라비돕시스 속의 식물, 또는 카놀라)로부터 유래된 식물 재료에 대해 수행될 수 있다. 특정한 실시양태는 식물 세포 또는 재료를 상기 언급된 핵산 분자 중 적어도 1종으로 형질전환시키는 것; 및 형질전환된 식물 재료를 배양하여 식물을 수득하는 것을 포함하는, 동일한 종의 야생형 식물과 비교 시 식물 내의 감소된 양의 포화 지방산을 포함하는 유전자 조작된 식물을 생성 또는 재생시키는 방법에 관한 것이다. 상기 언급된 방법 중 임의의 것에 의해 수득된 식물, 식물 재료, 식물 세포, 및 종자가 또한 개시된다.

II. 약어

x:yΔ^z 카르복실말단으로부터 카운팅한 위치 z에서 x 탄소 및 y 이중 결합을 함유하는 지방산

ACP 아실 담체 단백질

CoA 조효소 A

FA 지방산

FAS 지방산 신타제

FAME 지방산 메틸 에스테르

KASII β-케토아실-ACP 신타제 II

MUFA 단일불포화 지방산

PUFA 다중불포화 지방산

WT 야생형

III. 용어

지방산: 본원에 사용된 용어 "지방산"은 보다 긴 쇄 길이 및 보다 짧은 쇄 길이 둘 다의 산이 공지되어 있더라도, 예를 들어, 약 C12 내지 C22의 다양한 쇄 길이의 긴 쇄 지방산 (알칸산)을 지칭한다. 지방산의 구조는 표기법, x:yΔ^z에 의해 나타내어지고, 여기서 "x"는 특정한 지방산 내의 탄소 (C) 원자의 총수이고, "y"는 산의 카르복실 말단으로부터 카운팅된 바와 같은 위치 "z"에서의 탄소 쇄 내의 이중 결합의 수이다.

대사 경로: 용어 "대사 경로"는 대사 산물의 형성 또는 또 다른 대사 경로의 개시를 달성하기 위해, 효소에 의해 촉매되는, 세포 내에서 발생하는 일련의 화학 반응을 지칭한다. 대사 경로는 여러 또는 많은 단계를 수반할 수 있고, 특이적 반응 기질에 대해 상이한 대사 경로와 경쟁할 수 있다. 유사하게, 1종의 대사 경로의 생성물은 또 다른 대사 경로에 대한 기질일 수 있다.

대사 조작: 본 발명의 목적을 위해, "대사 조작"은 초기 물질이 정확한 목적하는 화학 구조를 갖는 생성물로 단계적으로 변형되는 것이 세포 내에서 작동성인 총 대사 경로의 전체적인 계획 내에서 달성되도록, 세포 내의 1종 이상의 대사 경로를 변경하기 위한 전략들의 합리적 설계를 지칭한다.

데새투라제: 본원에 사용된 용어 "데새투라제"는 관심 지방산 또는 전구체가 생산되도록 1종 이상의 지방산에서 탈포화시킬 수 있는 (즉, 이중 결합을 도입할 수 있는) 폴리펩티드를 지칭한다. 식물-가용성 지방산 데새투라제 효소는 이중 결합을 포화 아실-ACP 기질 내로 위치특이적으로 도입할 수 있다. 아실-CoA 데새투라제는 이중 결합을 포화 지방 아실-CoA 기질 내로 위치특이적으로 도입한다. 반응은 데새투라제 아키텍처의 코어를 형성하는 4-나선 다발에 의해 배위된 2-전자 환원 2철 중심에 의한 분자 산소의 활성화를 수반한다. 아실-CoA 델타-9 데새투라제가 일부 실시양태에서 특정한 관심 대상이다.

델타-9-18:0¹-ACP 데새투라제는 막 유동성의 유지를 위해 모든 식물에 의해 요구된다. 이러한 효소는 주로 스테아로일-ACP를 탈포화시키지만, 이는 경미한 정도로 팔미토일-ACP에 대해서도 또한 활성이다.

자손 식물: 본 발명의 목적을 위해, "자손 식물"은 식물 육종 방법에 의해 수득될 수 있는 임의의 식물, 또는 이로부터 수득된 식물 재료를 지칭한다. 식물 육종 방법은 관련 기술분야에 널리 공지지되어 있고, 천연 육종, 인공 육종, DNA 분자 마커 분석을 수반하는 선택 육종, 트랜스제닉, 및 상업 육종을 포함한다.

식물 재료: 본원에 사용된 용어 "식물 재료"는 식물로부터 수득된 임의의 세포 또는 조직를 지칭한다.

핵산 분자: RNA, cDNA, 게놈 DNA, 및 상기의 것들의 합성 형태 및 혼합 중합체의 센스 및 안티-센스 가닥 둘 다를 포함할 수 있는, 중합체 형태의 뉴클레오티드. 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드, 데옥시뉴클레오티드, 또는 어느 1종 유형의 뉴클레오티드의 변형 형태를 지칭한다. 본원에 사용된 "핵산 분자"는 "핵산" 및 "폴리뉴클레오티드"와 동의어이다. 상기 용어는 DNA의 단일- 및 이중-가닥 형태를 포함한다. 핵산 분자는 자연 발생 및/또는 비-자연 발생 뉴클레오티드 연결에 의해 함께 연결된 자연 발생 및 변형된 뉴클레오티드 중 어느 1종 또는 둘 다를 포함할 수 있다.

핵산 분자는, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 인지될 바와 같이, 화학적으로 또는 생화학적으로 변형될 수 있거나, 또는 비-천연 또는 유도체화 뉴클레오티드 염기를 함유할 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어, 표지, 메틸화, 자연 발생 뉴클레오티드 중 1종 이상의 유사체로의 치환, 뉴클레오티드간 변형, 예컨대 비하전된 연결 (예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포르아미데이트, 카르바메이트 등), 하전된 연결 (예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등), 펜던트 모이어티 (예를 들어, 펩티드), 인터칼레이터 (예를 들어, 아크리딘, 소랄렌 등), 킬레이터, 알킬화제, 및 변형된 연결 (예를 들어, 알파 아노머 핵산 등)을 포함한다. 용어 "핵산 분자"는 또한, 단일-가닥, 이중-가닥, 부분적 듀플렉스화, 트리플렉스화, 헤어핀형, 원형 및 패드록형 입체형태를 포함한, 임의의 위상 입체형태를 포함한다.

작동가능하게 연결된: 제1 핵산 서열은 제1 핵산 서열이 제2 핵산 서열과 기능적 관계에 있는 경우에 제2 핵산 서열과 작동가능하게 연결된다. 예를 들어, 프로모터는 프로모터가 코딩 서열의 전사 또는 발현에 영향을 미치는 경우에 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 재조합적으로 생산된 경우에, 작동가능하게 연결된 핵산 서열은 일반적으로 인접하고, 2개의 단백질-코딩 영역을 연결하는 것이 필요한 경우에는 동일한 리딩 프레임 내에 있다. 그러나, 핵산은 작동가능하게 연결되기 위해 인접해 있을 필요는 없다.

조절 요소: 본원에 사용된 용어 "조절 요소"는 유전자 조절 활성을 갖는 핵산 분자; 즉 작동가능하게 연결된 전사가능한 핵산 분자의 전사 또는 번역에 영향을 미치는 능력이 있는 것을 지칭한다. 조절 요소 예컨대 프로모터, 리더, 인트론, 및 전사 종결 영역은 살아있는 세포에서 유전자의 전체 발현에서 필수 역할을 하는, 유전자 조절 활성을 갖는 비-코딩 핵산 분자이다. 따라서, 식물에서 기능하는 단리된 조절 요소는 분자 조작 기술을 통해 식물 표현형을 변형시키는데 유용하다. "조절 요소"란, 특정한 유전자가 발현될지 여부, 언제 발현될지 및 어떠한 수준으로 발현될지를 결정하는 일련의 뉴클레오티드를 의도한다. 조절 DNA 서열은 조절 단백질 또는 다른 단백질과 특이적으로 상호작용한다.

본원에 사용된 용어 "유전자 조절 활성"은 작동가능하게 연결된 핵산 분자의 전사 또는 번역에 영향을 미칠 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 유전자 조절 활성을 갖는 단리된 핵산 분자는 작동가능하게 연결된 핵산 분자의 일시적 또는 공간적 발현을 제공할 수 있거나 또는 작동가능하게 연결된 핵산 분자의 발현 수준 및 속도를 조정할 수 있다. 유전자 조절 활성을 갖는 단리된 핵산 분자는 프로모터, 인트론, 리더, 또는 3' 전사 종결 영역을 포함할 수 있다.

프로모터: 본원에 사용된 용어 "프로모터"는 RNA 폴리머라제 II 또는 다른 단백질 예컨대 전사 인자 (전사를 조절하는 트랜스-작용 단백질 인자)의 인식 및 결합에 수반되어 작동가능하게 연결된 유전자의 전사를 개시하는 핵산 분자를 지칭한다. 프로모터 자체는 작동가능하게 연결된 유전자의 전사에 영향을 미치는 하위-요소 예컨대 시스-요소 또는 인핸서 도메인을 함유할 수 있다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 기능적인 천연 또는 비-천연 프로모터이다. 식물 프로모터는 작동가능하게 연결된 유전자 또는 유전자들의 발현을 조정하기 위한 5' 조절 요소로서 사용될 수 있다. 식물 프로모터는 그의 일시적, 공간적, 또는 발생적 발현 패턴에 의해 정의될 수 있다. 본원에 기재된 핵산 분자는 프로모터를 포함하는 핵산 서열을 포함할 수 있다.

서열 동일성: 2종의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 문맥에서 본원에 사용된 용어 "서열 동일성" 또는 "동일성"은 명시된 비교 윈도우에 걸쳐 최대 상응성으로 정렬된 경우에 동일한 2종의 서열 내 잔기를 지칭할 수 있다.

서열 동일성의 백분율이 단백질에 대한 언급에서 사용되는 경우에, 동일하지 않은 잔기 위치가 종종 보존적 아미노산 치환에 의해 상이하며, 여기서 아미노산 잔기는 유사한 화학적 특성 (예를 들어, 전하, 소수성, 또는 입체 효과)을 갖는 다른 아미노산 잔기로 치환되고, 따라서 분자의 기능적 특성을 변화시키지 않는다는 것이 인식된다.

따라서, 서열이 보존적 치환에 의해 상이한 경우에, 동일하지 않은 잔기 부위에서 치환의 보존적 성질에 대해 교정하기 위해 퍼센트 서열 동일성이 상향 조정될 수 있다. 이러한 보존적 치환에 의해 상이한 서열을 "서열 유사성" 또는 "유사성"을 갖는다고 한다. 이러한 조정을 이루기 위한 기술은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 전형적으로, 이러한 기술은 보존적 치환을 완전한 미스매치보다는 부분적인 미스매치로 점수화하고, 이에 의해 백분율 서열 동일성을 증가시키는 것을 수반한다. 예를 들어, 동일한 아미노산이 0 내지 1의 점수로 주어지고, 비-보존적 치환이 0의 점수로 주어지는 경우에, 보존적 치환은 0 내지 1의 점수로 주어진다. 보존적 치환의 점수화는, 예를 들어, 프로그램 PC/GENE (인텔리제네틱스(Intelligenetics), 캘리포니아주 마운틴 뷰)에서 구현된 바와 같이 계산될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "서열 동일성의 백분율"은 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교 윈도우에 걸쳐 비교함으로써 결정된 값을 지칭할 수 있고, 여기서 비교 윈도우 내의 서열의 일부분이 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 참조 서열 (부가 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교 시 부가 또는 결실 (즉, 갭)을 포함할 수 있다. 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기가 둘 다의 서열에서 발생하는 위치의 수를 결정하여 매칭되는 위치의 수를 산출하고, 매칭되는 위치의 수를 비교 윈도우 내의 위치의 총수로 나누고, 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로서 백분율이 계산된다.

아미노산 서열 내의 유사한 위치: 핵산 및 아미노산 서열은 하기 단락에 기재된 방법에 의해 정렬될 수 있다. 정렬된 경우에, 하나의 서열 내의 위치는 위치가 컨센서스 서열 내에서 동일한 경우에 정렬된 서열 내의 위치와 "유사한 위치"에 있는 것이다.

비교를 위해 서열을 정렬하는 방법은 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있다. 다양한 프로그램 및 정렬 알고리즘은 하기에 기재되어 있다: 문헌 [Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981; Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970; Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988; Higgins and Sharp, Gene 73:237-44, 1988; Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3, 1989; Corpet et al., Nucleic Acids Research 16:10881-10890, 1988; Huang, et al., Computer Applications in the Biosciences 8:155-65, 1992; Pearson et al., Methods in Molecular Biology 24:307-31, 1994; Tatiana et al., FEMS Microbiol. Lett., 174:247-50, 1990; Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990 (서열-정렬 방법 및 상동성 계산의 상세한 고려사항)].

국립 생물 정보 센터 (NCBI) 베이직 로컬 얼라인먼트 서치 툴 (BLAST)은 서열-분석 프로그램, 예를 들어, blastp 및 blastn과 관련하여 사용하기 위해 인터넷 (blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 상에서 입수가능하다. 이러한 프로그램을 사용하여 서열 동일성을 결정하는 방법의 설명은 NCBI를 통해 인터넷 상에서 blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD=Web&PAGE_TYPE=BlastDocs에서 입수가능하다.

아미노산 서열의 비교를 위해, 디폴트 파라미터를 사용하는 BLAST 프로그램의 "Blast 2 서열" 함수 (bl2seq)가 이용된다. 특정 파라미터는, 예를 들어, 미스매치에 대한 패널티 또는 매치에 대한 보상을 제공하기 위해, 관련 기술분야의 통상의 기술자의 판단 내에서 조정될 수 있다.

형질전환된: 본원에 사용된 용어 "형질전환된"은 외래 핵산 분자, 예컨대 구축물이 내부로 도입된 세포, 조직, 기관, 또는 유기체를 지칭한다. 도입된 핵산 분자는 도입된 폴리뉴클레오티드 분자가 후속 자손에 의해 유전되도록 수용자 세포, 조직, 기관, 또는 유기체의 게놈 DNA 내로 통합될 수 있다. "트랜스제닉" 또는 "형질전환된" 세포 또는 유기체는 세포 또는 유기체의 자손, 및 이러한 트랜스제닉 식물을, 예를 들어, 교배에서, 어버이로 이용하는 육종 프로그램으로부터 생산되고 외래 핵산 분자의 존재로부터 초래되는 변경된 표현형을 나타내는 자손을 또한 포함한다.

IV. 숙주 세포, 조직, 또는 유기체 내의 포화 지방산을 감소시키기 위한 대사 조작 접근법

A. 개관

본 발명의 한 실시양태는 특이적 아실-CoA 선호도 (예를 들어, 팔미트산 또는 스테아르산)를 갖는 델타-9 데새투라제를 식물 종자 내에 도입하는 것을 포함한다. 델타-9 데새투라제의 특이적 아실-CoA 선호도는 특정의 특이적 포화 지방산 풀 (예를 들어, 단일불포화 생성물로의 전환을 위한 팔미테이트)의 표적화를 가능하게 한다. 아실-CoA 델타-9 데새투라제는 이들이 통상적으로는 임의의 인지가능한 정도로 식물 시스템 내에서 생산되지 않기 때문에 식물 내의 포화 지방산 함량을 저하시키기 위해 선택되었다.

B. 폴리펩티드

본 발명의 일부 실시양태에 따른 폴리펩티드는 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 26, 서열식별번호: 27, 서열식별번호: 28 서열식별번호: 29, 서열식별번호: 30, 서열식별번호: 31, 서열식별번호: 32, 및 서열식별번호: 33으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 정렬되는 경우에 증가하는 백분율 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함한다. 이들 및 다른 실시양태 내에서의 특정 아미노산 서열은, 예를 들어, 상기 언급된 서열과 적어도 약 70%, 약 75%, 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. 많은 실시양태에서, 상기 언급된 서열과 정렬된 경우에 상기 언급된 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열은 효소적 델타-9-18:0-ACP 데새투라제 활성을 갖는 펩티드, 또는 이러한 펩티드의 일부를 코딩한다.

C. 핵산

일부 실시양태는 상기 기재된 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 예를 들어, 핵산 서열은 일부 실시양태에서 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 5, 서열식별번호: 12, 서열식별번호: 13, 서열식별번호: 14, 서열식별번호: 15, 서열식별번호: 16, 서열식별번호: 17, 서열식별번호: 18, 서열식별번호: 19, 서열식별번호: 20, 서열식별번호: 21, 서열식별번호: 22, 서열식별번호: 23, 서열식별번호: 24, 및 서열식별번호: 25로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 정렬된 경우에 증가하는 백분율 동일성을 나타낸다. 이들 및 다른 실시양태 내에서의 특정 핵산 서열은, 예를 들어, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 5, 서열식별번호: 12, 서열식별번호: 13, 서열식별번호: 14, 서열식별번호: 15, 서열식별번호: 16, 서열식별번호: 17, 서열식별번호: 18, 서열식별번호: 19, 서열식별번호: 20, 서열식별번호: 21, 서열식별번호: 22, 서열식별번호: 23, 서열식별번호: 24, 및 서열식별번호: 25로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. 핵산 분자는, 예를 들어, 코돈 축중성에 따라 허용가능한 뉴클레오티드 치환을 도입하는 것에 의해, 코딩되는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 실질적으로 변화시키지 않으면서 변형될 수 있는 것으로 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해된다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 핵산 분자는 유전자 조절 요소 (예를 들어, 프로모터)를 포함한다. 프로모터는 벡터 구축물이 삽입될 세포 유형을 기초로 하여 선택될 수 있다. 박테리아, 효모 및 식물에서 기능하는 프로모터가 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 프로모터는 그의 조절 특색을 기초로 하여 선택될 수도 있다. 이러한 특색의 예는 전사 활성, 유도성, 조직-특이성, 및 발생 스테이지-특이성의 증진을 포함한다. 식물에서, 유도성이고, 바이러스 또는 합성 기원이고, 구성적으로 활성이고, 일시적으로 조절되고, 공간적으로 조절되는 프로모터가 기재된 바 있다. 예를 들어, 문헌 [Poszkowski et al. (1989) EMBO J. 3:2719; Odell et al. (1985) Nature 313:810; 및 Chau et al. (1989) Science 244:174-81)]을 참조한다.

유용한 유도성 프로모터는, 예를 들어, 완화제 (치환된 벤젠술폰아미드 제초제)의 적용에 의해 유도된 살리실산 또는 폴리아크릴산에 의해 유도되는 프로모터, 열-쇼크 프로모터, 시금치 니트레이트 리덕타제 전사가능한 핵산 분자 서열로부터 유래된 니트레이트-유도성 프로모터, 호르몬-유도성 프로모터, 및 RuBP 카르복실라제 및 LHCP 패밀리의 소형 서브유닛과 연관된 광-유도성 프로모터를 포함한다.

유용한 조직-특이적, 발생-조절 프로모터의 예는 β-콘글리시닌 7Sα 프로모터 및 종자-특이적 프로모터를 포함한다. 종자 색소체에서의 우선적 발현에 유용한 식물 기능적 프로모터는 오일종자에서의 지방산 생합성에 수반되는 단백질 및 식물 저장 단백질로부터의 것을 포함한다. 이러한 프로모터의 예는 파세올린, 나핀, 제인, 대두 트립신 억제제, ACP, 스테아로일-ACP 데새투라제, 및 올레오신과 같은 전사가능한 핵산 분자 서열로부터의 5' 조절 영역을 포함한다. 또 다른 예시적인 조직-특이적 프로모터는 종자 조직에 특이적인 렉틴 프로모터이다.

보다 구체적으로, 프로모터는 파세올루스 불가리스 파세올린 프로모터, (단독으로 또는 파세올루스 불가리스 파세올린 3' 비번역 영역 및 파세올루스 불가리스 파세올린 3' 매트릭스 부착 영역과 함께), 레스퀘렐라 펜들레리 KCS3 프로모터, 또는 아그로박테리움 투메파시엔스 만노핀 신타제 프로모터를 포함할 수 있다.

다른 유용한 프로모터는 아그로박테리움 투메파시엔스의 종양-유도 플라스미드 상에 보유된, 노팔린 신타제, 마노핀 신타제, 및 옥토핀 신타제 프로모터; 콜리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 19S 및 35S 프로모터; 증진된 CaMV 35S 프로모터; 현삼 모자이크 바이러스 35S 프로모터; 리불로스-1,5-비포스페이트 카르복실라제의 소형 서브유닛 (ssRUBISCO)으로부터의 광-유도성 프로모터; 담배로부터의 EIF-4A 프로모터 (Mandel et al. (1995) Plant Mol. Biol. 29:995-1004); 옥수수 수크로스 신테타제; 옥수수 알콜 데히드로게나제 I; 옥수수 광 수확 복합체; 옥수수 열 쇼크 단백질; 아라비돕시스로부터의 키티나제 프로모터; LTP (지질 전달 단백질) 프로모터; 피튜니아 칼콘 이소머라제; 콩 글리신 풍부 단백질 1; 감자 파타틴; 유비퀴틴 프로모터; 및 액틴 프로모터를 포함한다. 유용한 프로모터는 바람직하게는 종자-선택적, 조직 선택적, 또는 유도성이다. 종자-특이적 조절은, 예를 들어, EP 0 255 378에 논의되어 있다.

이종 유전자(들)의 더 높은 발현을 수득하기 위해, 발현 숙주 세포 (예를 들어, 식물 세포, 예를 들어, 카놀라, 벼, 담배, 옥수수, 목화, 및 대두)에서 보다 효율적으로 발현되도록 유전자(들)를 재조작하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 식물 발현을 위한 델타-9 데새투라제를 코딩하는 유전자의 설계에서의 임의적인 추가의 단계 (즉, 1종 이상의 유전자 조절 요소의 제공에 더해지는 단계)는 최적의 발현을 위한 이종 유전자 단백질 코딩 영역의 재조작이다. 특정한 실시양태는 트랜스제닉 카놀라 식물 세포 또는 아라비돕시스 식물 세포에서의 발현 수준을 자연 발생 이종 유전자 서열로 형질전환된 카놀라 식물 세포 또는 아라비돕시스 식물 세포에서보다 증가시키도록 (즉, 보다 많은 단백질을 생산하도록) 최적화된 재설계된 유전자를 포함한다.

유전자 코드의 중복/축중성에 의해 부여되는 가소성 (즉, 일부 아미노산이 1개 초과의 코돈에 의해 특정화됨)으로 인해, 상이한 유기체 또는 유기체 부류에서 게놈의 진화는 동의 코돈의 차등 용법을 생성하였다. 이러한 "코돈 편향"은 단백질 코딩 영역의 평균 염기 조성에 반영된다. 예를 들어, 비교적 낮은 G+C 함량으로 게놈을 갖는 유기체는 동의 코돈의 제3 위치에서 A 또는 T를 갖는 보다 많은 코돈을 이용하는 반면, 보다 높은 G+C 함량을 갖는 유기체는 제3 위치에서 G 또는 C를 갖는 보다 많은 코돈을 이용한다. 추가로, mRNA 내의 "마이너" 코돈의 존재는, 특히 마이너 코돈에 상응하는 하전된 tRNA의 상대적 풍부도가 낮은 경우에, 그 mRNA의 절대적 번역 속도를 감소시킬 수 있다고 생각된다. 이러한 추론의 확장은 개별적인 마이너 코돈에 의한 번역 속도의 감소가 다중 마이너 코돈의 경우에 적어도 상가적일 것이라는 것이다. 따라서, 특정한 발현 숙주에서 마이너 코돈의 높은 상대적 함량을 갖는 mRNA는 상응하게 낮은 번역 속도를 가질 것이다. 이러한 속도는 상응하게 낮은 수준의 코딩 단백질에 의해 반영될 수 있다.

카놀라 또는 아라비돕시스 (또는 다른 식물, 예컨대 벼, 담배, 옥수수, 목화 또는 대두)에서의 발현을 위해 델타-9 데새투라제를 코딩하는 최적화된 유전자를 조작하는데 있어서, 예상 숙주 식물(들)의 코돈 편향이 결정되어 있다면 도움이 된다. 다중 공개적-입수가능한 DNA 서열 데이터베이스가 존재하며, 여기서 식물 게놈의 코돈 분포 또는 다양한 식물 유전자의 단백질 코딩 영역에 관한 정보를 찾을 수 있다.

코돈 편향은 발현 숙주 (예를 들어, 식물 예컨대 카놀라 또는 아라비돕시스)가 그의 단백질의 아미노산을 코딩하는데 사용하는 코돈의 통계적 분포이다. 코돈 편향은 모든 아미노산을 위한 코돈에 대해 단일 코돈이 사용되는 빈도로서 계산될 수 있다. 대안적으로, 코돈 편향은 단일 코돈이 아미노산을 위한 모든 다른 코돈 (동의 코돈)에 대해 특정한 아미노산을 코딩하는데 사용되는 빈도로서 계산될 수 있다.

델타-9 데새투라제 유전자의 식물 발현을 위한 최적화된 코딩 영역을 설계하는데 있어서, 식물에 의해 선호되는 1차 ("제1 선택") 코돈, 뿐만 아니라, 다중 선택이 존재하는 경우에 선호되는 코돈의 제2, 제3, 제4 등의 선택이 결정되어야 한다. 이어서, 델타-9 데새투라제 유전자의 아미노 서열을 코딩하는 새로운 DNA 서열이 설계될 수 있고, 여기서 새로운 DNA 서열은 아미노산 서열 내의 각각의 위치에서의 아미노산을 특정하기 위한 발현 숙주-선호되는 (제1 선호되는, 제2 선호되는, 제3 선호되는, 또는 제4 선호되는 등) 코돈의 치환에 의해, 천연 DNA 서열 (데새투라제를 코딩함)과 상이하다. 이어서, 새로운 서열은 변형에 의해 생성될 수 있는 제한 효소 부위에 대해 분석된다. 확인된 추정 제한 부위는 이들 코돈을 다음으로 선호되는 코돈으로 대체하여 제한 부위를 제거하는 것에 의해 추가로 변형된다. 이종 서열의 전사 또는 번역에 영향을 미칠 수 있는 서열 내의 다른 부위는 엑손:인트론 접합부 (5' 또는 3'), 폴리-A 부가 신호, 및/또는 RNA 중합효소 종결 신호이다. 서열은 TA 또는 CG 이중염기의 빈도가 감소되도록 추가로 분석 및 변형될 수 있다. 이들 이중염기에 더하여, 약 6개를 초과하는 동일한 G 또는 C 뉴클레오티드를 갖는 서열 블록이 또한 서열의 전사 또는 번역에 불리하게 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 이들 블록은 제1 또는 제2 선택 등의 코돈을 다음으로 선호되는 선택 코돈으로 대체하는 것에 의해 유리하게 변형된다.

상기 기재된 방법은 유전자가 식물에서 최적으로 발현되도록 관련 기술분야의 통상의 기술자가 특정한 식물에 외래인 유전자(들)를 변형시키는 것을 가능하게 한다. 방법은 PCT 출원 WO 97/13402에 추가로 예시된다. 따라서, 일부 실시양태의 데새투라제/유전자와 기능적으로 등가인 최적화된 합성 유전자는 식물을 포함한 숙주를 형질전환시키는데 사용될 수 있다. 합성 유전자의 생산에 관한 추가의 지침은, 예를 들어, 미국 특허 5,380,831에서 찾을 수 있다.

식물-최적화 DNA 서열이 서면상 또는 인 실리코로 일단 설계되면, 서열면에서 설계된 서열에 정확하게 상응하도록 실제 DNA 분자가 실험실에서 합성될 수 있다. 이러한 합성 DNA 분자는 클로닝되고 이들이 자연 또는 천연 공급원으로부터 유래된 것처럼 정확하게 달리 조작될 수 있다.

D. 식물 재료의 유전자 형질전환을 위한 방법

일부 실시양태는 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 5, 서열식별번호: 12, 서열식별번호: 13, 서열식별번호: 14, 서열식별번호: 15, 서열식별번호: 16, 서열식별번호: 17, 서열식별번호: 18, 서열식별번호: 19, 서열식별번호: 20, 서열식별번호: 21, 서열식별번호: 22, 서열식별번호: 23, 서열식별번호: 24, 및 서열식별번호: 25로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 60% 동일한 핵산 서열을 포함하는 1종 이상의 핵산 분자(들)를 포함하는 형질전환된 세포를 생산하는 방법에 관한 것이다. 이러한 핵산 분자는 또한, 예를 들어, 비-코딩 조절 요소, 예컨대 프로모터를 포함할 수 있다. 다른 서열은 또한 비-코딩 조절 요소 및 전사가능한 핵산 분자 서열과 함께 세포 내로 또한 도입될 수 있다. 이들 다른 서열은 3' 전사 종결인자, 3' 폴리-아데닐화 신호, 다른 비번역 서열, 전이 또는 표적화 서열, 선택 마커, 인핸서, 및 오퍼레이터를 포함할 수 있다.

형질전환 방법은 일반적으로 적합한 숙주 세포를 선택하는 단계, 숙주 세포를 재조합 벡터로 형질전환시키는 것, 및 형질전환된 숙주 세포를 수득하는 것을 포함한다. DNA를 세포 내로 도입하는 기술은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 이들 방법은 일반적으로 5종의 카테고리로 분류될 수 있다: (1) 화학적 방법 (Graham and Van der Eb (1973) Virology 54(2):536-9; Zatloukal et al. (1992) Ann. N.Y. Acad. Sci. 660:136-53); (2) 물리적 방법 예컨대 미세주입 (Capechi (1980) Cell 22(2):479-88), 전기천공 (Wong and Neumann (1982) Biochim. Biophys. Res. Commun. 107(2):584-7; Fromm et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82(17):5824-8; 미국 특허 5,384,253), 및 입자 가속 (Johnston and Tang (1994) Methods Cell Biol. 43(A):353-65; Fynan et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(24):11478-82; (3) 바이러스 벡터 (Clapp (1993) Clin. Perinatol. 20(1):155-68; Lu et al. (1993) J. Exp. Med. 178(6):2089-96; Eglitis and Anderson (1988) Biotechniques 6(7):608-14); (4) 수용체-매개 메카니즘 (Curiel et al. (1992) Hum. Gen. Ther. 3(2):147-54; Wagner et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89(13):6099-103); 및 (5) 박테리아-매개 메카니즘, 예컨대 아그로박테리움을 사용하는 메카니즘. 대안적으로, 핵산은 식물의 생식 기관에 직접적으로 주입하는 것에 의해 화분 내로 직접적으로 도입될 수 있다. 문헌 [Zhou et al. (1983) Methods in Enzymology 101:433; Hess (1987) Intern. Rev. Cytol. 107:367; Luo et al. (1988) Plant Mol. Biol. Reporter 6:165; Pena et al. (1987) Nature 325:274]. 다른 형질전환 방법은, 예를 들어, 미국 특허 5,508,184에 예시된 바와 같은 원형질체 형질전환을 포함한다. 핵산 분자는 또한 미성숙 배아 내로 주입될 수 있다. 문헌 [Neuhaus et al. (1987) Theor. Appl. Genet. 75:30].

식물 세포의 형질전환을 위한 가장 통상적으로 사용되는 방법은 아그로박테리움-매개 DNA 전달 프로세스 (Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803) (미국 특허 5,824,877; 미국 특허 5,591,616; 미국 특허 5,981,840; 및 미국 특허 6,384,301에 예시된 바와 같음) 및 바이오리스틱 또는 미세발사체 충격-매개 프로세스 (즉, 유전자 총) (예컨대 미국 특허 5,550,318; 미국 특허 5,538,880; 미국 특허 6,160,208; 미국 특허 6,399,861; 및 미국 특허 6,403,865에 기재된 바와 같음)이다. 전형적으로, 핵 형질전환이 바람직하지만, 구체적으로 색소체, 예컨대 엽록체 또는 전분체를 형질전환시키는 것이 바람직한 경우에, 식물 색소체는 특정 식물 종, 예컨대 예를 들어, 아라비돕시스, 담배, 감자, 및 브라시카 종에서 목적하는 핵산 분자의 미세발사체-매개 전달을 이용하여 형질전환될 수 있다.

아그로박테리움-매개 형질전환은 아그로박테리움 속에 속하는 유전자 조작된 토양 박테리아의 사용을 통해 달성된다. 여러 아그로박테리움 종은 "T-DNA"로 공지된 특정 DNA의 전달을 매개하고, 이는 DNA의 임의의 목적하는 조각을 많은 식물 종으로 운반하도록 유전자 조작될 수 있다. T-DNA 매개 발병기전의 프로세스를 표시하는 주요 이벤트는 병독성 유전자의 유도, 및 T-DNA의 프로세싱 및 전달이다. 이러한 프로세스는 많은 종설논문의 주제이다. 예를 들어, 문헌 [Ream (1989) Ann. Rev. Phytopathol. 27:583-618; Howard and Citovsky (1990) Bioassays 12:103-8; Kado (1991) Crit. Rev. Plant Sci. 10:1-32; Zambryski (1992) Annual Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 43:465-90; Gelvin (1993) in Transgenic Plants, Kung and Wu eds., Academic Press, San Diego, CA, pp. 49-87; Binns and Howitz (1994) In Bacterical Pathogenesis of Plants and Animals, Dang, ed., Berlin: Springer Verlag., pp. 119-38; Hooykaas and Beijersbergen (1994) Ann. Rev. Phytopathol. 32:157-79; Lessl and Lanka (1994) Cell 77:321-4; 및 Zupan and Zambryski (1995) Annual Rev. Phytopathol. 27:583-618]을 참조한다.

형질전환 방법론과 관계없이 형질전환된 식물 세포를 선택 또는 점수화하기 위해, 세포 내로 도입된 DNA는 그렇지 않은 경우에는 독성인 화합물에 대한 저항성을 식물 조직에 부여하는 화합물을 생산하도록 재생가능한 식물 조직에서 기능하는 유전자를 함유할 수 있다. 선택가능한, 스크리닝가능한 또는 점수화가능한 마커로서 사용하기 위한 관심 유전자는 β-글루쿠로니다제 (GUS), 녹색 형광 단백질 (GFP), 루시페라제, 및 항생제 또는 제초제 저항성 유전자를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 항생제 저항성 유전자의 예는 페니실린, 카나마이신 (및 네오마이신, G418, 블레오마이신); 메토트렉세이트 (및 트리메토프림); 클로람페니콜; 및 테트라시클린에 대한 저항성을 부여하는 유전자를 포함한다. 예를 들어, 글리포세이트 저항성이 제초제 저항성 유전자에 의해 부여될 수 있다. 문헌 [Della-Cioppa et al. (1987) Bio/Technology 5:579-84]. 예를 들어 및 비제한적으로, 포스피노트리신, 비알라포스에 대한 내성, 및 양성 선택 메카니즘 (Joersbro et al. (1998) Mol. Breed. 4:111-7)을 포함한 다른 선택 디바이스는 또한 구현될 수 있고, 본 발명의 실시양태의 범주 내인 것으로 간주된다.

이어서, 선택 또는 스크리닝에 의해 확인되고 재생을 지지하는 적절한 배지에서 배양된 형질전환된 세포는 식물로 성숙되도록 할 수 있다.

본원에 개시된 방법은 임의의 형질전환가능한 식물 세포 또는 조직에 사용될 수 있다. 형질전환가능한 세포 및 조직은, 본원에 사용되는 경우에, 식물이 발생되도록 추가의 증식이 가능한 세포 또는 조직을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 다수의 식물 세포 또는 조직이 형질전환가능하고, 여기서 외인성 DNA의 삽입 및 적절한 배양 조건 후에 식물 세포 또는 조직이 분화된 식물을 형성할 수 있다는 것을 인식한다. 이들 목적에 적합한 조직은 미성숙 배아, 배반 조직, 현탁 세포 배양물, 미성숙 화서, 싹 분열조직, 마디 외식편, 캘러스 조직, 배축 조직, 자엽, 뿌리, 및 잎을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

형질전환된 식물 원형질체 또는 외식편으로부터의 식물의 재생, 발생, 및 배양은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 문헌 [Weissbach and Weissbach (1988) Methods for Plant Molecular Biology, (Eds.) Academic Press, Inc., San Diego, CA; Horsch et al. (1985) Science 227:1229-31]. 이러한 재생 및 성장 프로세스는 전형적으로 형질전환된 세포를 선택하는 단계 및 이들 세포를 배아 발생의 통상적 스테이지를 통해 발근된 소식물체 스테이지로 배양하는 단계를 포함한다. 트랜스제닉 배아 및 종자가 유사하게 재생된다. 이러한 방법에서, 형질전환체는 일반적으로 성공적으로 형질전환된 세포를 선택하고 식물 싹의 재생을 유도하는 선택 배지의 존재 하에 배양된다. 문헌 [Fraley et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803]. 이들 싹은 전형적으로 2 내지 4개월 이내에 수득된다. 생성된 트랜스제닉 발근된 싹을 이어서 적절한 식물 성장 배지 예컨대 토양에 식재한다. 선택 작용제에 대한 노출에서 생존한 세포, 또는 스크리닝 검정에서 양성으로 점수화된 세포는 식물의 재생을 지지하는 배지에서 배양될 수 있다. 이어서, 싹은 선택 작용제 및 박테리아 성장을 방지하는 항생제를 함유하는 적절한 뿌리-유도 배지로 전달될 수 있다. 많은 싹은 뿌리를 발생할 것이다. 이어서, 이들은 토양 또는 다른 배지로 이식되어, 뿌리의 지속적인 발생을 가능하게 한다. 방법은, 상기 개략된 바와 같이, 일반적으로 이용된 특정한 식물 계통에 따라 달라질 것이고, 따라서 방법의 상세사항은 관련 기술분야의 통상의 기술자의 판단 내에 속한다.

재생된 트랜스제닉 식물은 자가-수분되어 동형접합 트랜스제닉 식물을 제공할 수 있다. 대안적으로, 재생된 트랜스제닉 식물로부터 수득된 화분은 비-트랜스제닉 식물, 바람직하게는 농경학상 중요한 종의 근교계와 교배될 수 있다. 역으로, 비-트랜스제닉 식물로부터의 화분은 재생된 트랜스제닉 식물을 수분시키는데 사용될 수 있다.

트랜스제닉 식물은 형질전환된 핵산 서열을 따라 그의 자손으로 넘어갈 수 있다. 트랜스제닉 식물은 바람직하게는 형질전환된 핵산 서열에 대해 동형접합성이고, 유성 생식 시, 및 유성 생식의 결과로서 이러한 서열을 자신의 후손 모두에게 전파한다. 자손은 트랜스제닉 식물에 의해 생산된 종자로부터 성장될 수 있다. 이어서, 이들 추가의 식물은 자가 수분되어 식물의 순수 육종 계통을 생성할 수 있다.

이들 식물로부터의 자손은, 특히, 유전자 발현에 대해 평가될 수 있다. 유전자 발현은 여러 통상의 방법 예컨대 웨스턴 블롯팅, 노던 블롯팅, 면역침전, 및 ELISA (효소-연결 면역흡착 검정)에 의해 검출될 수 있다. 형질전환된 식물은 또한 도입된 DNA의 존재 및 본 발명의 핵산 분자 및 아미노산 분자에 의해 부여되는 발현 수준 및/또는 지방산 프로파일에 대해 분석될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 형질전환된 식물을 분석하는데 이용가능한 다수의 방법을 알고 있다. 예를 들어, 식물 분석을 위한 방법은 서던 블롯 또는 노던 블롯, PCR-기반 접근법, 생화학적 검정, 표현형 스크리닝 방법, 현장 평가, 및 면역진단 검정을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

쌍자엽식물을 특이적으로 형질전환시키는 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 이들 방법을 사용하는 형질전환 및 식물 재생은 아라비돕시스 속의 구성원, 목화 (고시피움 히르수툼(Gossypium hirsutum)), 대두 (글리신 맥스(Glycine max)), 땅콩 (아라키스 히포가에아(Arachis hypogaea)), 및 브라시카 속의 구성원을 포함하나 이에 제한되지 않는 다수의 작물에 대해 기재되어 있다. 쌍자엽식물을, 주로 아그로박테리움 투메파시엔스를 사용하여, 형질전환시키고 트랜스제닉 식물을 수득하는 방법은 목화 (미국 특허 5,004,863; 미국 특허 5,159,135; 미국 특허 5,518,908); 대두 (미국 특허 5,569,834; 미국 특허 5,416,011; 문헌 [McCabe et al. (1988) Biotechnology 6:923; Christou et al. (1988) Plant Physiol. 87:671-4]); 브라시카 (미국 특허 5,463,174); 땅콩 (문헌 [Cheng et al. (1996) Plant Cell Rep. 15:653-7; McKently et al. (1995) Plant Cell Rep. 14:699-703]); 파파야; 및 완두콩 (문헌 [Grant et al. (1995) Plant Cell Rep. 15:254-8])에 대해 공개된 바 있다.

단자엽식물을 형질전환시키는 방법은 또한 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 이들 방법을 사용하는 형질전환 및 식물 재생은 보리 (호르데움 불가라에(Hordeum vulgarae)); 옥수수 (제아 메이스(Zea mays)); 귀리 (아베나 사티바(Avena sativa)); 오리새 (닥틸리스 글로메라타(Dactylis glomerata)); 벼 (오리자 사티바(Oryza sativa), 인디카(indica) 및 자포니카(japonica) 품종 포함); 수수 (소르굼 비콜로르(Sorghum bicolor)); 사탕수수 (사카룸(Saccharum) 종); 톨 페스큐 (페스투카 아룬디나세아(Festuca arundinacea)); 잔디 종 (예를 들어, 아그로스티스 스톨로니페라(Agrostis stolonifera), 포아 프라텐시스(Poa pratensis), 스테노타프룸 세쿤다툼(Stenotaphrum secundatum)); 밀 (트리티쿰 아세스티붐(Triticum aestivum)); 및 알팔파 (메디카고 사티바(Medicago sativa))를 포함하나 이에 제한되지 않는 다수의 작물에 대해 기재되어 있다. 다수의 형질전환 방법론이 임의의 수의 관심 표적 작물에 대한 안정한 트랜스제닉 식물의 생산을 위해 사용될 수 있고 변형될 수 있는 것으로 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백하다.

임의의 식물이 본원에 개시된 방법에 사용하기 위해 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 변형을 위한 바람직한 식물은, 예를 들어 및 비제한적으로, 오일종자 식물, 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana), 보리지 (보라고(Borago) 아종), 카놀라 (브라시카 아종), 캐스터 (리시누스 코무니스(Ricinus communis)), 코코아 콩 (테오브로마 카카오(Theobroma cacao)), 옥수수 (제아 메이스), 목화 (고시피움(Gossypium) 아종), 크람베(Crambe) 아종, 쿠페아(Cuphea) 아종, 아마 (리눔(Linum) 아종), 레스퀘렐라(Lesquerella) 및 림난테스(Limnanthes) 아종, 리놀라, 한련 (트로파에올룸(Tropaeolum) 아종), 오에노테라(Oenothera) 아종, 올리브 (올레아(Olea) 아종), 야자 (엘라에이스(Elaeis) 아종), 땅콩 (아라키스(Arachis) 아종), 평지씨, 황화 (카르타무스(Carthamus) 아종), 대두 (글리신(Glycine) 및 소야(Soja) 아종), 해바라기 (헬리안투스(Helianthus) 아종), 담배 (니코티아나(Nicotiana) 아종), 베르노니아(Vernonia) 아종, 밀 (트리티쿰(Triticum) 아종), 보리 (호르데움(Hordeum) 아종), 벼 (오리자(Oryza) 아종), 귀리 (아베나(Avena) 아종), 수수 (소르굼(Sorghum) 아종), 및 호밀 (세칼레(Secale) 아종) 또는 그라미네아에(Gramineae)의 다른 구성원을 포함한다.

다수의 형질전환 방법론이 임의의 수의 관심 표적 작물에 대한 안정한 트랜스제닉 식물의 생산을 위해 사용될 수 있고 변형될 수 있는 것으로 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백하다.

E. 트랜스제닉 종자

일부 실시양태에서, 트랜스제닉 종자는 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 26, 서열식별번호: 27, 서열식별번호: 28 서열식별번호: 29, 서열식별번호: 30, 서열식별번호: 31, 서열식별번호: 32, 및 서열식별번호: 33으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 델타-9 데새투라제 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 이들 및 다른 실시양태에서, 트랜스제닉 종자는 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 5, 서열식별번호: 12, 서열식별번호: 13, 서열식별번호: 14, 서열식별번호: 15, 서열식별번호: 16, 서열식별번호: 17, 서열식별번호: 18, 서열식별번호: 19, 서열식별번호: 20, 서열식별번호: 21, 서열식별번호: 22, 서열식별번호: 23, 서열식별번호: 24, 및 서열식별번호: 25로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 60% 동일한 핵산 서열을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 트랜스제닉 종자는 포화 지방산 (예를 들어, 팔미트산 지방산 및/또는 스테아르산 지방산)의 감소된 수준을 나타낼 수 있다. 종자는 생식력 있는 트랜스제닉 식물로부터 수확될 수 있고, 상기 제시된 바와 같은 적어도 1종의 핵산 서열, 및 임의로 적어도 1종의 추가의 관심 유전자 또는 핵산 구축물을 포함하는 잡종 식물 계통을 포함한, 형질전환된 식물의 자손 세대를 성장시키기 위해 사용될 수 있다.

하기 실시예는 특정의 특정한 특색 및/또는 실시양태를 예시하기 위해 제공된다. 이들 실시예는 본 발명을 기재된 특정한 특색 또는 실시양태로 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.

실시예

실시예 1: pDAB7305의 구축물 설계

아스페르길루스 니둘란스 Δ-9 데새투라제 (AnD9DS) 효소는 이전에 미국 특허 출원 번호 2008/0260933에 개시되었고, 서열식별번호: 1로서 본원에 제시된다. AnD9DS v3 코딩 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열 (서열식별번호: 2)를 합성하고, 아그로박테리움-매개 식물 형질전환을 위해 플라스미드 구축물 pDAB7305 (도 1)에 혼입하였다. 생성된 구축물은 3개의 식물 전사 유닛 (또한 유전자 발현 카세트로도 기재되고 상호교환가능하게 사용됨)을 함유하였다. 제1 식물 전사 유닛 (PTU) (서열식별번호: 3)은 RB7 매트릭스 부착 영역 (RB7 MAR; 국제 특허 출원 번호 WO9727207), 파세올루스 불가리스 파세올린 프로모터 (Pv Phas 프로모터; 미국 특허 번호 5,504,200), AnD9DS 코딩 서열 (An 델타 9 데새투라제 v3), 파세올루스 불가리스 파세올린 3' 비번역 영역 (Pv Phas 3'UTR; 미국 특허 번호 5,504,200), 및 파세올루스 불가리스 파세올린 3'매트릭스 부착 영역 (Pv Phas 3'MAR; 미국 특허 번호 5,504,200)으로 구성되었다. 제2 PTU (서열식별번호: 4)는 레스퀘렐라 펜들레리 KCS3 프로모터 (LfKCS3 프로모터; 미국 특허 번호 7,253,337), AnD9DS 코딩 서열 (An 델타 9 데새투라제 v3), 및 아그로박테리움 투메파시엔스 ORF 23 3' 비번역 영역 (AtuORF23 3'UTR; 미국 특허 번호 5,428,147)으로 구성되었다. 제3 PTU (서열식별번호: 5)는 아그로박테리움 투메파시엔스 만노핀 신타제 프로모터 (AtuMas 프로모터; Barker, R. F., Idler, K. B., Thompson, D. V., Kemp, J. D., (1983), a polynucleotide sequence of the T-DNA region from the Agrobacterium tumefaciens octopine Ti plasmid pTi15955, Plant Molecular Biology, 2(6), 335-50), 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 유전자 (PAT; Wohlleben et al., (1988) Gene, 70: 25-37), 및 아그로박테리움 투메파시엔스 ORF 1 3' 비번역 영역 (AtuORF1 3'UTR; Huang et al., (1990) J. Bacteriol., 172:1814-1822)으로 구성되었다. 구축물은 제한 효소 소화 및 서열분석을 통해 확인하였다. 마지막으로, 구축물을 아그로박테리움 투메파시엔스 내로 형질전환시키고, 글리세롤 스톡으로서 저장하였다.

실시예 2: 카놀라 (브라시카 나푸스) 배축의 아그로박테리움-매개 형질전환

아그로박테리움 제제

pDAB7305 이원 플라스미드를 함유하는 아그로박테리움 균주를 스트렙토마이신 (100 mg/ml) 및 스펙티노마이신 (50 mg/mL)을 함유하는 YEP 배지 (박토 펩톤(Bacto Peptone)™ 20.0 gm/L 및 효모 추출물 10.0 gm/L) 플레이트 상에 스트리킹하고, 28℃에서 2일 동안 인큐베이션하였다. pDAB7305 이원 플라스미드를 함유하는 증식된 아그로박테리움 균주를 멸균 접종 루프를 사용하여 2-일 스트리크 플레이트로부터 스크레이핑하였다. 이어서, pDAB7305 이원 플라스미드를 함유하는 스크레이핑된 아그로박테리움 균주를 멸균 500 mL 배플형 플라스크(들) 내의 스트렙토마이신 (100 mg/ml) 및 스펙티노마이신 (50 mg/ml)을 갖는 150 mL 변형된 YEP 액체 내로 접종하고, 28℃에서 200 rpm으로 진탕시켰다. 배양물을 원심분리하고, M-배지 (LS 염; 3% 글루코스; 변형된 B5 비타민; 1 μM 키네틴; 1 μM 2,4-D, pH 5.8) 중에 재현탁시키고, 카놀라 배축의 형질전환 전에 적절한 밀도 (분광광도계를 사용하여 50 클렛(Klett) 유닛)로 희석하였다.

카놀라 형질전환

종자 발아: 카놀라 종자 (품종 넥세라(NEXERA) 710™)를 10분 동안 10% 클로록스(Clorox)™에서 표면-멸균하고, 멸균 증류수로 3회 헹구었다 (종자는 이러한 과정 동안 스틸 스트레이너에 함유됨). 종자를 피타트레이(Phytatray)™에 함유된 ½ MS 카놀라 배지 (1/2 MS, 2% 수크로스, 0.8% 한천) 상에서 발아시키기 위해 식재하고 (피타트레이™ 당 25개의 종자), 발아 5일 동안 16시간 명기 및 8시간 암기의 광주기, 25℃로 설정한 성장 요법 하에 페르시발(Percival)™ 성장 챔버에 놓아두었다.

전처리: 제5일에, 약 3 mm 길이의 배축 절편을 무균 절개하고, 남아있는 뿌리 및 싹 부분을 폐기하였다 (배축 절편의 건조는 절개 과정 동안 멸균 밀리큐(milliQ)™ 물 10 mL 내로 배축 절편을 침지시킴으로써 방지됨). 배축 절편을 22-23℃ 및 16시간 명기, 8시간 암기의 광주기의 성장 요법 하에 페르시발™ 성장 챔버에서 3일 전처리 동안 캘러스 유도 배지 MSK1D1 (MS, 1 mg/L 키네틴, 1 mg/L 2,4-D, 3.0% 수크로스, 0.7% 피트아가) 상의 멸균 여과지 상에 수평으로 놓아두었다.

아그로박테리움과의 공동-배양: 아그로박테리움 공동-배양 전일에, 적절한 항생제를 함유하는 YEP 배지의 플라스크에 pDAB7305 이원 플라스미드를 함유하는 아그로박테리움 균주를 접종하였다. 배축 절편을 캘러스 유도 배지 MSK1D1의 여과지로부터 액체 M-배지 10 mL를 함유하는 빈 100 x 25 mm 페트리(Petri)™ 접시로 옮겨 배축 절편이 건조되는 것을 방지하였다. 이러한 스테이지에서 스패튤라를 사용하여 절편을 떠내어 새로운 배지로 절편을 옮겼다. 액체 M-배지를 피펫으로 제거하고, 40 mL의 아그로박테리움 현탁액을 페트리™ 접시에 첨가하였다 (500개의 절편과 40 mL의 아그로박테리움 용액). 배축 절편이 아그로박테리움 용액 내에 침지되어 유지되도록 페트리™ 접시를 주기적으로 회전시키면서 30분 동안 배축 절편을 처리하였다. 처리 기간 말미에, 아그로박테리움 용액을 폐기물 비커 내로 피펫팅하고, 오토클레이빙하고, 폐기하였다 (아그로박테리움 용액을 완전히 제거하여 아그로박테리움 과도성장을 방지함). 처리된 배축을, 겸자를 이용하여 여과지가 오버레이된 MSK1D1 배지를 함유하는 본래의 플레이트로 다시 옮겼다 (절편이 건조되지 않도록 반드시 주의해야 함). 형질전환된 배축 절편 및 비-형질전환된 대조군 배축 절편을 감소된 광 강도 (플레이트를 알루미늄 호일로 덮는 것에 의함) 하의 페르시발™ 성장 챔버로 복귀시키고, 처리된 배축 절편을 아그로박테리움과 함께 3일 동안 공동-배양하였다.

선택 배지 상에서의 캘러스 유도: 공동-배양 3일 후에, 배축 절편을 22-26℃로 설정한 성장 요법 하의 캘러스 유도 배지, MSK1D1H1 (MS, 1 mg/L 키네틴, 1 mg/L 2,4-D, 0.5 gm/L MES, 5 mg/L AgNO₃, 300 mg/L 티멘틴(Timentin)™, 200 mg/L 카르베니실린, 1 mg/L 허비에이스(Herbiace)™, 3% 수크로스, 0.7% 피트아가) 상으로 겸자를 사용하여 개별적으로 옮겼다. 배축 절편을 배지 상에 고정시켰지만, 배지 내로 깊숙히 포매시키지는 않았다.

선택 및 싹 재생: 캘러스 유도 배지 상에서의 7일 후에, 캘러스화 배축 절편을 선택물이 있는 싹 재생 배지 1, MSB3Z1H1 (MS, 3 mg/L BAP, 1 mg/L 제아틴, 0.5 gm/L MES, 5 mg/L AgNO₃, 300 mg/L 티멘틴™, 200 mg/L 카르베니실린, 1 mg/L 허비에이스™, 3% 수크로스, 0.7% 피트아가)로 옮겼다. 14일 후에, 싹이 발생한 배축 절편을 22-26℃로 설정한 성장 요법 하에 증가된 선택물이 있는 재생 배지 2, MSB3Z1H3 (MS, 3 mg/L BAP, 1 mg/L 제아틴, 0.5 gm/L MES, 5 mg/L AgNO₃, 300 mg/l 티멘틴™, 200 mg/L 카르베니실린, 3 mg/L 허비에이스™, 3% 수크로스, 0.7% 피트아가)로 옮겼다.

싹 신장: 14일 후에, 싹이 발생한 배축 절편을 22-26℃로 설정한 성장 요법 하에 재생 배지 2로부터 싹 신장 배지, MSMESH5 (MS, 300 mg/L 티멘틴™, 5 mg/l 허비에이스™, 2% 수크로스, 0.7% TC 한천)로 옮겼다. 이미 신장된 싹을 배축 절편으로부터 단리하고, MSMESH5로 옮겼다. 14일 후에, 싹 신장 배지 상에서의 제1 라운드 배양에서 신장되지 않은 남아있는 싹을 신선한 싹 신장 배지, MSMESH5로 옮겼다. 이러한 스테이지에서 싹을 생산하지 않은 모든 남아있는 배축 절편을 폐기하였다.

뿌리 유도: 싹 신장 배지 상에서의 배양 14일 후에, 단리된 싹을 22-26℃에서의 뿌리 유도를 위해 MSMEST 배지 (MS, 0.5 g/L MES, 300 mg/L 티멘틴™, 2% 수크로스, 0.7% TC 한천)로 옮겼다. MSMEST 배지로의 제1 전달에서 인큐베이션한 후에 뿌리를 생산하지 않은 임의의 싹은, 싹이 뿌리를 발생할 때까지 MSMEST 배지 상에서의 제2 또는 제3 라운드의 인큐베이션을 위해 옮겨졌다.

PCR 분석: 뿌리를 포함하는 싹으로 재생된 형질전환된 카놀라 배축 절편을 PCR 분자 확증 검정을 통해 추가로 분석하였다. 잎 조직을 녹색 싹으로부터 수득하고 pat 선택 마커 유전자의 존재에 대해 PCR을 통해 시험하였다. 임의의 황백화 싹은 폐기하고 PCR 분석에 적용하지 않았다. pat 선택 마커 유전자의 존재에 대해 양성으로서 확인된 샘플을 유지하고, 싹 및 뿌리가 계속 발생 및 신장하도록 MSMEST 배지 상에서 배양하였다. PCR 분석에 따라 pat 선택 마커 유전자 음성을 함유하지 않는 것으로서 확인된 샘플은 폐기하였다.

pat 선택 마커 유전자의 존재에 대해 PCR-양성인 싹 및 뿌리를 포함하는 형질전환된 카놀라 식물을 온실 내 토양으로 이식하였다. 토양 내 카놀라 식물의 정착 후에, 카놀라 식물을 추가로 분석하여 인베이더(Invader)™ 정량적 PCR 검정 및 서던 블롯팅을 통해 pat 유전자 발현 카세트의 카피수를 정량화하였다. pat 유전자 발현 카세트의 적어도 1개 카피를 함유하는 것으로 확증된 트랜스제닉 T₀ 카놀라 식물을 종자 지방산 프로파일의 추가의 분석을 위해 진행시켰다. 이들 트랜스제닉 T₀ 카놀라 식물로부터 수득된 종자, 즉, T₁ 카놀라 종자는 대조군 식물과 비교 시 총 포화 지방산 (총 포화 지방산 함량은 짧은 쇄 및 긴 쇄 지방산을 포함한 모든 포화 지방산을 합산함으로써 결정되었음)에서의 감소를 포함하는 이벤트를 확인하기 위한 FAME 분석 방법을 통해 분석하였다.

실시예 3: 트랜스제닉 pDAB7305 카놀라 식물로부터 수득된 T₁ 카놀라 종자의 FAME 분석

분리하는 T₁ 카놀라 종자는 동일한 조건에서 성장된 대조군 식물로부터 수득된 종자와 비교 시 총 포화 지방산 (C14:0, C16:0, C18:0, C20:0, C22:0, C24:0)에서의 감소를 포함하는 T₁ 카놀라 종자를 생산한 T₀ 카놀라 이벤트를 확인하기 위한 FAME 분석 방법을 통해 분석하였다. 모든 총 포화 지방산 (TSFA)의 합계를 정량화하고, 음성 대조군 식물과 비교하였다. FAME 분석은 단일 T₁ 카놀라 종자 상에서 하기 기재된 프로토콜을 사용하여 완료하였다. 각각의 개별 카놀라 T₀ 이벤트로부터의 총 24개의 단일 T₁ 카놀라 종자를 분석하고, 각각의 단일로부터 TSFA 결과를 정량화하였다.

단일 카놀라 종자 샘플은 강철 볼 밀을 사용하여, 트리아실글리세롤 내부 표준으로서 트리헵타데카노인 (누-체크 프렙(Nu-Chek prep))을 함유하는 헵탄 중에 균질화하였다. 균질화 전에, 메탄올 중 0.25 M의 신선하게 제조된 소듐 메톡시드 (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 미주리주 세인트 루이스) 용액을 첨가하였다. 추출은 일정한 진탕 하에 40℃에서 수행하였다. 내인성 지방산 회수는 메틸화된 대용물 C17 지방산의 회수에 의해 정규화하였다. FAME (지방산 메틸 에스테르)의 추출을 3회 반복하고, 헵탄 층을 분석 전에 풀링하였다. 생성된 FAME는 SGE로부터의 모세관 칼럼 BPX 70 (15 m x 0.25 mm x 0.25 μm)을 사용하여 GC-FID에 의해 분석하였다. 각각의 FAME를 체류 시간에 의해 확인하고, 적절한 긴 쇄 지방산 (누-체크 프렙; 미네소타주 엘리시안)을 첨가하면서 보정 표준으로서 매트레야 엘엘씨(Matreya LLC) (펜실베니아주 플레전트 갭)로부터의 평지씨 오일 참조 혼합물을 주입함으로써 정량화하였다.

벌크 종자 분석은 50 mg 분취물 (조합된 10 내지 15개의 종자)로 이루어졌고, 경미한 변형을 갖는 상기 기재된 동일한 프로토콜을 따랐다. 유도체화 반응이 완료되도록 구동하기 위해, 오일을 먼저 헵탄으로 3회 추출하였다. 이어서, 1개의 종자에 상응하는 조합된 오일 추출물의 분취물을 상기 단일 종자 프로토콜에 기재된 바와 같이 FAME에서 유도체화하였다. 반응의 완료는 제4 추출/유도체화에서 내인성 FAME의 존재를 검사함으로써 검증하였다.

3종의 트랜스제닉 카놀라 이벤트 (이벤트 2182[12]-138.001, 이벤트 2182[12]-125.001, 및 이벤트 2182[12]-156.001)는 대조군 카놀라 식물과 비교 시 TSFA의 유의한 감소를 나타내는 FAME 결과를 기반으로 T₁ 세대로의 진행을 위해 확인하고 선택하였다. 식물 지방산 함량의 2종의 추가의 카테고리를 검정하였다. 모노 불포화 지방산 (MUFA: C16:1, C18:1 및 C20:1) 및 폴리 불포화 지방산 (PUFA: C18:2 및 C18:3) 농도를 포함한 이들 카테고리는 T₁ 종자에서 TSFA를 저하시키는 효과를 제시하기 위해 열거된다. (표 1).

표 1: 여러 넥세라 710™ 비-형질전환된 대조군 식물과 비교 시 3종의 트랜스제닉 카놀라 이벤트로부터 수득된 단일 T₁ 종자 TSFA, MUFA 및 PUFA 축적의 요약 조성. N*는 각각의 식물 자손에 대해 분석된 개별 T₁ 종자의 수를 나타낸다.

트랜스제닉 카놀라 이벤트의 평균 TSFA는 넥세라 710™ 비-형질전환된 대조군 식물과 비교 시 유의하게 감소된다. TSFA의 감소에 수반하여 MUFA 함량 (C18:1 및 C16:1)에서의 증가가 관찰되었다. MUFA 함량에서의 증가는 포화 지방산의 카르복실산 기능으로부터 제9 탄소 (Δ9)에서 이중 결합을 도입하는 AnD9DS의 과다-발현으로부터의 직접 결과이다. 흥미롭게도, PUFA 함량은 C18:2를 합성하는 포스포글리세롤리피드 데새투라제 FAD2의 MUFA 기질의 축적에 의해 증가하지 않았다.

T₁ 카놀라 식물 이벤트를 온실에서 성장시키고, 유전자이입된 트랜스진을 자손 식물에 고정시키기 위해 자가-수정하였다. 인베이더™ 정량적 PCR 검정을 각각의 트랜스제닉 이벤트로부터의 다중 T₁ 카놀라 식물에 대해 완료하였다. 이들 결과는 각각의 3종의 이벤트로부터 수득된 T₁ 카놀라 식물이 약 2 또는 3개 카피의 pDAB7305 T-가닥 통합을 함유하였음을 나타내었다 (도 3 상단 패널). 카피수의 구체적 결정은 pDAB7305 T-가닥 구성요소가 3종의 이벤트를 가로질러 다양한 카피수로 분리되기 때문에 수득가능하지 않았다. T₁ 카놀라 식물 이벤트를 온실에서 성숙상태로 성장시키고, 자가-수정하였다. 생성된 T₂ 카놀라 종자는 FAME 검정을 통한 지방산 프로파일 분석을 위해 수확하였다.

실시예 4: 트랜스제닉 pDAB7305 카놀라 식물로부터 수득된 T₂ 카놀라 종자의 FAME 분석

벌크 T₂ 카놀라 종자는 대조군 식물 (넥세라 710™)과 비교 시 총 포화 지방산에서의 감소를 포함한 T₁ 카놀라 식물 계통을 확인하기 위해 이전에 기재된 FAME 분석 방법을 통해 분석하였다. (도 2). 각각의 식물의 수율은 식물 당 종자의 그램으로서 기록하였다. 수율 결과는 본 개시내용의 트랜스제닉 식물과 나란히 성장된 안정하게 통합된 아스페르길루스 니둘란스 델타-9 데새투라제 트랜스진 (WO 2006/042049 참조)을 함유하는 트랜스제닉 양성 대조군 이벤트, 218-11.30 (본원에서 218-11.30HS50 또는 218-11.30HL로도 기재됨)의 수율과 비교하였다. 본 개시내용의 218-11.30 식물 및 트랜스제닉 카놀라 식물 둘 다는 유사한 트랜스진을 발현한다. 그러나, 본 개시내용에서 2182[12]-125.Sx001, 2182[12]-138.Sx001 및 2182[12]-156.Sx00 카놀라 식물의 형질전환에 사용된 구축물은 그것이 AnD9DS 코딩 서열의 발현을 구동하는 레스퀘렐라 펜들레리 KCS3 프로모터로 구성되고 아그로박테리움 투메파시엔스 ORF 23 3' 비번역 영역에 플랭킹된 제2 PTU를 함유하기 때문에 상이하다.

본 개시내용의 트랜스제닉 식물의 TSFA (%)를 정량화하고 양성 대조군, 218-11.30HL 트랜스제닉 카놀라 식물 및 음성 대조군, 넥세라 710™ 식물로부터 수득된 TSFA (%)와 비교하였다. 본 개시내용의 소수의 트랜스제닉 식물은 음성 대조군 넥세라 710™ 식물과 유사한 수준에서, 보다 높은 수준의 TSFA를 함유하는 것으로 확인되었다. 이들 식물은 자가-수정 동안 트랜스진의 분리로부터 유래하는 동기 널이고, 본 개시내용의 트랜스진의 임의의 활동적 발현 카피를 함유하지 않는다. 이들 결과는 벌크 T₂ 카놀라 종자의 총 포화 지방산 함량이 확인된 T₁ 카놀라 식물에서 3.5% 미만으로 감소되었다는 것을 확인하였다.

T₂ 카놀라 계통은 어떠한 카놀라 계통이 pDAB7305 T-가닥 구성요소의 낮은 카피수를 함유하고 높은 T₂ 종자 수율을 생산했는지 결정하기 위해 추가로 분석하였다. (도 3).

3.5% 미만의 TSFA를 함유하고, 10 g 초과의 수율을 생산하고, 가장 낮은 T-가닥 카피수를 함유한 본 개시내용의 개별 카놀라 식물을 선택하였다. 이들 3종 기준 (3.5% 미만의 TSFA의 수준, 높은 종자 수율, 및 낮은 카피수)을 기반으로 하여 7개의 카놀라 식물을 TSFA 프로파일의 추가의 특징화를 위해 선택하고 진행시켰다. 카피수는 인베이더 검정을 사용하여, T₁ 계통 당 1개의 식물로부터 결정하였다. 표 2. 이들 T₂ 카놀라 식물 계통을 온실에 옮기고, 성숙상태로 성장시키고, 자가-수정하였다. T₂ 카놀라 식물 계통을 분자적으로 추가로 분석하고, FAME 검정을 통한 지방산 프로파일 분석을 위해 T₃ 종자를 수확하였다.

표 2: 최고 수율 (종자 중량), 최저 PAT 카피수 (T₁ 식물) 및 최저 TSFA를 기반으로 하여 선택된 T₂ 카놀라 계통이 열거된다.

실시예 5: T₂ 카놀라 계통의 분자 확인

pat 유전자 발현 카세트 (및 밀접하게 연결된 AnD9DS 유전자 발현 카세트)를 함유하는 선택된 T₂ 카놀라 이벤트는 정량적 PCR 및 서던 블롯 분석을 사용하여 그의 분자 통합 패턴에 대해 특징화하였다.

가수분해 프로브 검정을 통한 AnD9DS 통합 확인

AnD9DS 유전자 발현 카세트의 존재는 가수분해 프로브 검정을 통해 확인하였다. 단리된 T₂ 카놀라 식물은 먼저 택맨(TAQMAN)™과 유사한 가수분해 프로브 검정을 통해 스크리닝하여 pat 트랜스진의 존재를 확인하였다. 이들 연구로부터 생성된 데이터를 사용하여 트랜스진 카피수를 결정하고, 역교배 및 후속 세대로의 진행을 위한 트랜스제닉 카놀라 이벤트를 선택하였다.

조직 샘플을 96-웰 플레이트에 수집하고, 퀴아젠(Qiagen) RLT™ 완충제 중에서 클레코(KLECO)™ 조직 미분쇄기 및 스테인리스 스틸 비드 (후버 프리시젼 프로덕츠(Hoover Precision Products), 조지아주 커밍)를 이용하여 조직 온침을 수행하였다. 조직 온침 후, 게놈 DNA를 바이오스프린트 96(Biosprint 96)™ 식물 키트(퀴아젠, 메릴랜드주 저먼타운)를 사용하여 제조업체가 제안한 프로토콜에 따라 고처리량 포맷으로 단리시켰다. 게놈 DNA를 콴트-잇 피코 그린 DNA 검정 키트(Quant-IT Pico Green DNA assay kit)™ (몰레큘라 프로브스(Molecular Probes), 인비트로겐(Invitrogen), 캘리포니아주 칼스배드)에 의해 정량화하였다. 정량화된 게놈 DNA는 바이오로봇3000(BIOROBOT3000)™ 자동 액체 핸들러 (퀴아젠, 메릴랜드주 저먼타운)를 사용하여 가수분해 프로브 검정을 위해 대략 2 ng/μL로 조정하였다. 택맨® 검정과 유사한 가수분해 프로브 검정에 의한 트랜스진 카피수 결정은 라이트사이클러(LIGHTCYCLER)®480 시스템(로슈 어플라이드 사이언스(Roche Applied Science), 인디애나주 인디애나폴리스)을 사용하여 실시간 PCR에 의해 수행하였다. 검정은 라이트사이클러® 프로브 설계 소프트웨어 2.0을 사용하여 pat 및 내부 참조 유전자 HMG1 (Weng et al. (2005). J. AOAC Int. 88(2):577-84)에 대해 설계하였다. 증폭을 위해, 라이트사이클러®480 프로브스 마스터 믹스 (로슈 어플라이드 사이언스, 인디애나주 인디애나폴리스)를 AnD9DS 및 pat에 대한 0.4 μM의 각각의 프라이머 및 0.2 μM의 각각의 프로브를 함유하는 10 μL 부피 멀티플렉스 반응물 중 1X 최종 농도로 제조하였다 (표 3). 2-단계 증폭 반응은 형광 수득과 함께 60℃에서 40초 동안 연장으로 수행하였다. 모든 샘플을 실행시키고, 각각의 샘플 분석을 위해 사이클 역치(Ct) 평균값을 사용하였다. 상대 정량 모듈을 사용하는 라이트사이클러® 소프트웨어 릴리즈 1.5를 사용하여 실시간 PCR 데이터의 분석을 수행하였으며, 이는 ΔΔCt 방법을 기반으로 한다. 대조군은 각각의 실행에 포함된 단일 카피 교정기 및 기지의 2개의 카피 체크로부터의 게놈 DNA의 샘플을 포함하였다. 표 4는 가수분해 프로브 검정의 결과를 열거한다. 카피수는 qPCR 검정을 사용하여, T₁ 계통 당 N개의 식물로부터 결정하였다 (그리고 평균하여 표 4에 값을 제공함).

표 3: pat 및 내부 참조 (HMG1)의 가수분해 프로브 검정에 사용된 프라이머 및 프로브 서열.

표 4: 가수분해 프로브 검정을 사용하여 결정된 바와 같은 AnD9DS 이벤트 (T₂ 식물)에 대한 카피 양 결과.

가수분해 프로브 검정의 결과는 양성 대조군 식물 (218-11.30(HL))과 대등한 상대 표준 편차 (SD로서 표 4에 제시됨) 및 변동 계수 (CV %로서 표 4에 제시됨)의 조합을 갖는 2개의 계통 (2182[12]-138.Sx001.Sx094 및 2182[12]-138.SX001.Sx090)를 확인하였다. 218-11.30(HL) 대조군 식물은 이전에 AnD9DS 유전자 삽입의 2개의 고정된 카피를 함유하는 것으로 확인되었다 (WO 2006042049). 선택된 카놀라 계통 (2182[12]-138.Sx001.Sx094 및 2182[12]-138.SX001.Sx090)을 218-11.30(HL) 대조군 식물과 비교함으로써, pDAB7305 T-가닥 구성요소의 고정된 카피를 함유할 특정 카놀라 계통이 확인되었다.

서던 블롯 분석을 통한 AnD9DS 게놈 통합 확인.

서던 블롯 분석을 사용하여 삽입된 T-가닥 DNA 단편의 통합 패턴을 확립하고 전장 AnD9DS 유전자 발현 카세트를 함유한 카놀라 계통을 확인하였다. 데이터를 생성하여 카놀라 게놈 내의 트랜스진 삽입체의 통합 및 완전성을 증명하였다. 상세한 서던 블롯 분석은 AnD9DS 유전자 발현 카세트에 특이적인 PCR 증폭된 프로브를 사용하여 수행하였다. 프로브와 특이적 제한 효소로 소화된 게놈 DNA의 혼성화를 통해 특정 분자량의 게놈 DNA 단편을 확인하였으며, 그의 패턴을 사용하여 다음 세대로의 진행을 위한 트랜스제닉 이벤트를 특징화하였다.

조직 샘플을 2 mL 원추형 튜브에 수집하고, 2일 동안 동결건조시켰다. 클렉코™ 조직 미분쇄기 및 텅스텐 비드를 사용하여 조직 온침을 수행하였다. 조직 온침 후, 게놈 DNA를 CTAB 단리 절차를 사용하여 단리시켰다. 게놈 DNA는 퀴아젠 게노믹 팁스(Qiagen Genomic Tips)™ 키트를 사용하여 추가로 정제하였다. 게놈 DNA는 콴트-잇 피코 그린 DNA™ 검정 키트 (몰레큘라 프로브스, 인비트로겐, 캘리포니아주 칼스배드)에 의해 정량화하였다. 정량화된 게놈 DNA는 일정한 농도로 조정하였다.

각각의 샘플에 대해, 4 μg의 게놈 DNA를 제한 효소 BamHI (뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs), 매사추세츠주 비벌리))로 완전히 소화시켰다. 제조업체가 제안한 프로토콜에 따라 퀵 프리시피테이션 솔루션(Quick Precipitation Solution)™ (에지 바이오시스템즈(Edge Biosystems), 메릴랜드주 게이더스버그)으로 침전시켜 소화된 DNA를 농축시켰다. 이어서, 게놈 DNA를 65℃에서 1시간 동안 25 μL의 물 중에 재현탁시켰다. 재현탁된 샘플을 1X TAE에서 제조된 0.8% 아가로스 겔 상에 로딩하고, 1X TAE 완충제 중 1.1 V/cm로 밤새 전기영동시켰다. 겔은 순차적으로 30분 동안 변성 (0.2 M NaOH / 0.6 M NaCl), 및 30분 동안 중화 (0.5 M 트리스-HCl (pH 7.5) / 1.5 M NaCl)에 적용하였다.

DNA 단편의 나일론 막으로의 전달은 크로마토그래피 페이퍼 윅 및 페이퍼 타월을 사용함으로써, 처리된 임모빌론(IMMOBILON)™ NY+ 전달 막 (밀리포어(Millipore), 매사추세츠주 빌러리카) 상의 겔을 통해 20X SSC 용액을 밤새 수동적으로 흡상시킴으로써 수행하였다. 전달 후, 2X SSC를 사용하여 막을 간략하게 세척하고, 스트라타링커(STRATALINKER)™ 1800 (스트라타진(Stratagene), 캘리포니아 라졸라)와 가교시키고, 80℃에서 3시간 동안 진공 베이킹하였다.

블롯은 모델 400 혼성화 인큐베이터 (로빈스 사이언티픽(Robbins Scientific), 캘리포니아주 서니베일)를 사용하여 유리 롤러 병 중 65℃에서 1시간 동안 사전 혼성화 용액 (퍼펙트 Hyb 플러스(Perfect Hyb plus), 시그마(Sigma), 미주리주 세인트 루이스)과 함께 인큐베이션하였다. 전체 코딩 서열을 함유하는 PCR 단편으로부터 프로브를 제조하였다. PCR 앰플리콘은 QIAEX II 겔 추출 키트™를 사용하여 정제하고, DIG DNA 라벨링 키트™ (로슈 어플라이드 바이오사이언시스, 인디애나주 인디애나폴리스)로 표지화하였다. 블롯은 혼성화 완충제에 직접 첨가된 변성된 프로브와 함께 65℃에서 밤새 혼성화시켰다. 혼성화시킨 후, 블롯을 65℃에서 0.1X SSC / 0.1% SDS로 40분 동안 순차적으로 세척하였다. 최종적으로, 블롯을 저장 포스포르 영상화 스크린에 노출시키고, 몰레큘라 다이나믹스 스톰 860(Molecular Dynamics Storm 860)™ 영상화 시스템을 사용하여 영상화하였다.

본 연구에서 완료된 서던 블롯 분석을 사용하여 카피수를 결정하고, 선택된 이벤트가 카놀라의 게놈 내에 AnD9DS 유전자 발현 카세트를 함유하였다는 것을 확인하였다. 표 5는 표 2에서 상기 정의된 기준을 기반으로 하여 선택된 계통으로부터 다중 T₂ 식물의 밴딩 프로파일을 제공한다. 대조군 계통은 PCR 데이터를 확인하는 선택 마커를 함유하지 않았다. 3종의 이벤트에서 선택된 대부분의 계통은 이벤트 2182[12]-125.Sx001.Sx014로부터의 계통을 제외하고는 균질 밴드 패턴 (수 및 크기)을 제시한다. 이벤트 2182[12]-138.Sx001로부터의 모든 3개의 T₂ 계통은 일관된 밴딩 패턴을 갖는 T₂ 집단을 나타낸다.

표 5: 4종의 트랜스제닉 이벤트 및 넥세라 710™ 카놀라 대조군 식물로부터의 다중 T₂ 카놀라 계통에 대해 완료된 서던 분석의 요약. 각각의 샘플에 대한 관찰된 밴드의 크기는 아가로스 겔 상의 샘플과 나란한 기지의 표준 실행에 대한 비교에 의해 크기측정하였다.

실시예 6: 선택된 카놀라 계통의 T₃ 종자 수율

T₂ 카놀라 계통으로부터의 선택된 식물을 온실에서 성숙상태로 성장시켰다. 종자를 식물로부터 수확하였다. 종자를 세정하고, T₂ 카놀라 계통 당 종자의 수율을 결정하였다 (표 6). 각각의 계통으로부터의 종자의 수율을 동일한 조건에서 성장된 비형질전환된 대조군 식물 (넥세라™ 710GS)로부터 수득된 종자의 수율과 비교하였다. 표 6은 각각의 T₂ 카놀라 계통으로부터 수득된 다양한 식물에 대한 수율 결과를 제시한다. 이들 결과는 수율이 시험된 각각의 식물 및 계통에 대해 가변적이라는 것을 예시한다. 그러나 T₂ 카놀라 계통 (2182[12]-125.Sx001.Sx014, 2182[12]-138.Sx001.Sx085, 2182[12]-138.Sx001.Sx090, 2182[12]-138.Sx001.Sx094, 및 2182[12]-156.Sx001.Sx049)의 수율의 평균 양은 비교적 유사하고, 대조군 식물 (넥세라™ 710G5 및 218-11.30(HL))로부터 유의하게 벗어나지 않았다.

표 6: 카놀라 트랜스제닉 계통 및 비형질전환된 넥세라™ 710GS 대조군 식물로부터의, 총 그램으로서 측정된, 종자 수율의 ANNOVA 분석. 수율 결과는 괄호 내 동일한 문자에 의해 연결된 식물에 대해 유의하게 상이하지 않았다 (p<0.05).

실시예 7: 트랜스제닉 pDAB7305 카놀라 식물로부터 수득된 T₃ 카놀라 종자의 FAME 분석

단일 및 벌크 T₃ 카놀라 종자 둘 다는, 대조군 식물과 비교 시 총 포화 지방산에서의 감소를 생성하는 특정 계통을 확인하기 위해 계통의 지방산 프로파일을 특징화하는 이전에 기재된 FAME 분석 방법을 통해 분석하였다. 총 포화 지방산의 합계를 정량화하고, 양성 대조군 및 음성 대조군 식물과 비교하였다. 결과는 단일 및 벌크 T₃ 카놀라 종자의 총 포화 지방산 및 포화 지방산 (팔미트산 및 스테아르산 함량의 합계로부터 결정된 바와 같음) 함량이 선택된 카놀라 식물 계통에서 3.5% 미만으로 감소하였음을 확인하였다.

놀랍게도, 2개의 계통, 2182[12]-138.Sx001.Sx085 및 2182[12]-138.Sx001.Sx094는 3.0% 아래로 평균되는 TSFA 수준을 누적하였다. 처음으로 3.0% 미만의 포화 지방산을 함유하는 벌크 종자로 구성된 카놀라 계통에 대해 기재되었다. 표 7 및 표 8.

또한, 단일 카놀라 종자에서 수득될 수 있는 총 포화 지방산 및 포화 지방산 수준의 최저 수준을 결정하기 위해 카놀라 계통의 하위-세트를 종자 FAME 분석에 사용하였다. 단일 종자 FAME 분석은 벌크 종자의 최저 총 포화 지방산 및 식물 수율의 높은 수준을 기반으로 하여 선택된 카놀라 계통으로부터 수득된 종자에 대해 완료하였다. 총 288개의 개별 종자를 FAME 방법을 사용하여 계통 당 분석하였다. 분석의 요약은 표 9에 제공된다. 선택된 식물로부터의 모든 단일 종자는 3.5% TSFA 수준보다 유의하게 낮은 2.8% 미만의 평균 TSFA를 갖는다. 최저 TSFA 수준은 단일 종자 카놀라 수준에서 2.25%이다. 이는 넥세라™ 710G5 대조군 식물에서 수득된 5.11%의 TSFA 수준보다 유의하게 더 낮았다. 최종적으로, 트랜스제닉 카놀라 계통의 최대 TSFA 백분율은 3.5%를 초과하지 않고, 단일 종자에서의 평균 포화 수준은 3.5%보다 훨씬 더 낮은 2.52%이다. 표 9 및 도 4.

표 7은 비형질전환된 넥세라™ 710G5 대조군 및 형질전환된 218-11.30(HL) 양성 대조군 식물과 비교 시 유전적으로 균질한 카놀라 계통의 5개 집단에 대한 T₂ 성숙한 종자 벌크 FAME 분석의 분포를 제시한다. 모든 개별 측정치 (N)의 평균은 카놀라 식물의 집단에 대한 TSFA 및 포화 백분율을 제공하기 위해 결정하였다. 카놀라 계통, 2182[12]-138.Sx001.Sx085 및 2182[12]-138.Sx001.Sx094는 이들 계통이 3.00 퍼센트 미만의 평균 TSFA 백분율을 갖는 것으로서 볼드체 인쇄를 통해 확인된다.

표 7

표 8은 넥세라™ 710G5 대조군과 비교 시 이벤트 2182[12]-138.Sx001로부터 수득된 단일 T₂ 자손 식물의 최저 T₃ 성숙한 종자 벌크 FAME 및 식물 수율을 제시한다. 나타낸 결과는 오일의 백분율, TSFA의 백분율, 포화 지방산의 백분율 (팔미트산 및 스테아르산 함량을 합산함으로써 결정된 바와 같음), 및 종자 수율에 대한 것이다.

표 8

표 9는 선택된 T₂ 계통으로부터의 T₃ 단일 종자 FAME 분석 결과의 분포를 제시한다. 표는 동일한 조건에서 성장된 넥세라™ 710G5 대조군 카놀라 식물과 비교 시, 평균값 (평균), 최소 (Min), 및 최대 (Max) TSFA 및 포화 지방산 백분율을 제시한다. 넥세라™ 710G5 대조군 카놀라 식물과 비교 시 선택된 이벤트의 T₃ 종자에서의 총 포화 지방산 (TSFA) 및 포화 지방산 수준에서의 감소가 있었다.

표 9

SEQUENCE LISTING <110> Dow AgroSciences LLC Thompson, Mark Stoltz, Ginger Simpson, Matthew Walker, Alicia Walsh, Terry Gachotte, Daniel Welter, Mary <120> Generation of Transgenic Canola With Less Than 3.5% Total Saturated Fatty Acids <130> 71671 <160> 33 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 455 <212> PRT <213> Aspergillus nidulans <400> 1 Met Ser Ala Pro Thr Ala Asp Ile Arg Ala Arg Ala Pro Glu Ala Lys 1 5 10 15 Lys Val His Ile Ala Asp Thr Ala Ile Asn Arg His Asn Trp Tyr Lys 20 25 30 His Val Asn Trp Leu Asn Val Phe Leu Ile Ile Gly Ile Pro Leu Tyr 35 40 45 Gly Cys Ile Gln Ala Phe Trp Val Pro Leu Gln Leu Lys Thr Ala Ile 50 55 60 Trp Ala Val Ile Tyr Tyr Phe Phe Thr Gly Leu Gly Ile Thr Ala Gly 65 70 75 80 Tyr His Arg Leu Trp Ala His Cys Ser Tyr Ser Ala Thr Leu Pro Leu 85 90 95 Arg Ile Trp Leu Ala Ala Val Gly Gly Gly Ala Val Glu Gly Ser Ile 100 105 110 Arg Trp Trp Ala Arg Asp His Arg Ala His His Arg Tyr Thr Asp Thr 115 120 125 Asp Lys Asp Pro Tyr Ser Val Arg Lys Gly Leu Leu Tyr Ser His Leu 130 135 140 Gly Trp Met Val Met Lys Gln Asn Pro Lys Arg Ile Gly Arg Thr Asp 145 150 155 160 Ile Ser Asp Leu Asn Glu Asp Pro Val Val Val Trp Gln His Arg Asn 165 170 175 Tyr Leu Lys Val Val Phe Thr Met Gly Leu Ala Val Pro Met Leu Val 180 185 190 Ala Gly Leu Gly Trp Gly Asp Trp Leu Gly Gly Phe Val Tyr Ala Gly 195 200 205 Ile Leu Arg Ile Phe Phe Val Gln Gln Ala Thr Phe Cys Val Asn Ser 210 215 220 Leu Ala His Trp Leu Gly Asp Gln Pro Phe Asp Asp Arg Asn Ser Pro 225 230 235 240 Arg Asp His Val Ile Thr Ala Leu Val Thr Leu Gly Glu Gly Tyr His 245 250 255 Asn Phe His His Glu Phe Pro Ser Asp Tyr Arg Asn Ala Ile Glu Trp 260 265 270 His Gln Tyr Asp Pro Thr Lys Trp Ser Ile Trp Ala Trp Lys Gln Leu 275 280 285 Gly Leu Ala Tyr Asp Leu Lys Lys Phe Arg Ala Asn Glu Ile Glu Lys 290 295 300 Gly Arg Val Gln Gln Leu Gln Lys Lys Leu Asp Arg Lys Arg Ala Thr 305 310 315 320 Leu Asp Trp Gly Thr Pro Leu Asp Gln Leu Pro Val Met Glu Trp Asp 325 330 335 Asp Tyr Val Glu Gln Ala Lys Asn Gly Arg Gly Leu Val Ala Ile Ala 340 345 350 Gly Val Val His Asp Val Thr Asp Phe Ile Lys Asp His Pro Gly Gly 355 360 365 Lys Ala Met Ile Ser Ser Gly Ile Gly Lys Asp Ala Thr Ala Met Phe 370 375 380 Asn Gly Gly Val Tyr Tyr His Ser Asn Ala Ala His Asn Leu Leu Ser 385 390 395 400 Thr Met Arg Val Gly Val Ile Arg Gly Gly Cys Glu Val Glu Ile Trp 405 410 415 Lys Arg Ala Gln Lys Glu Asn Val Glu Tyr Val Arg Asp Gly Ser Gly 420 425 430 Gln Arg Val Ile Arg Ala Gly Glu Gln Pro Thr Lys Ile Pro Glu Pro 435 440 445 Ile Pro Thr Ala Asp Ala Ala 450 455 <210> 2 <211> 1368 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized nucleodtide encoding Aspergillus nidulas Delta 9 desaturase v3 <400> 2 atgtctgctc caaccgctga catcagggct agggctccag aggctaagaa ggttcacatc 60 gctgataccg ctatcaacag gcacaattgg tacaagcacg tgaactggct caacgtcttc 120 ctcatcatcg gaatcccact ctacggatgc atccaagctt tctgggttcc acttcaactc 180 aagaccgcta tctgggctgt gatctactac ttcttcaccg gacttggaat caccgctgga 240 taccacaggc tttgggctca ctgctcatac tctgctactc ttccacttag gatctggctt 300 gctgctgttg gaggaggagc tgttgaggga tctatcagat ggtgggctag ggatcacagg 360 gctcatcata ggtacaccga taccgacaag gacccatact ctgttaggaa gggacttctc 420 tactctcacc ttggatggat ggtgatgaag cagaacccaa agaggatcgg aaggaccgac 480 atctctgatc tcaacgagga cccagttgtt gtttggcaac acaggaacta cctcaaggtt 540 gtgttcacca tgggacttgc tgttccaatg cttgttgctg gacttggatg gggagattgg 600 cttggaggat tcgtgtacgc tggaatcctt aggatcttct tcgttcaaca agctaccttc 660 tgcgtgaact ctcttgctca ctggcttgga gatcaaccat tcgatgatag gaactctcct 720 agggatcacg tgatcaccgc tcttgttacc cttggagagg gataccacaa cttccaccac 780 gagttcccat ctgactacag gaacgctatc gagtggcacc agtacgatcc taccaagtgg 840 tctatctggg cttggaagca acttggattg gcttacgatc tcaagaagtt cagggctaac 900 gagatcgaga agggaagggt tcaacaactt cagaagaagc ttgataggaa gagggctact 960 cttgattggg gaaccccact tgatcaactt ccagtgatgg aatgggatga ctacgttgag 1020 caagctaaga acggaagggg acttgttgct atcgctggag ttgttcacga tgttaccgac 1080 ttcatcaagg atcacccagg aggaaaggct atgatctctt ctggaatcgg aaaggatgct 1140 accgctatgt tcaacggagg agtgtactac cactctaacg cagctcacaa ccttcttagc 1200 accatgaggg tgggagtgat caggggagga tgcgaggttg agatctggaa gagggctcag 1260 aaggagaacg ttgagtacgt tagggatgga tctggacaaa gggtgatcag ggctggagag 1320 caaccaacca agatcccaga gccaatccca accgctgatg ctgcttga 1368 <210> 3 <211> 2912 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The first plant transcription unit comprising Aspergillus nidulans delta 9 desaturase v3 <400> 3 ctcccagtat cattatagtg aaagttttgg ctctctcgcc ggtggttttt tacctctatt 60 taaaggggtt ttccacctaa aaattctggt atcattctca ctttacttgt tactttaatt 120 tctcataatc tttggttgaa attatcacgc ttccgcacac gatatcccta caaatttatt 180 atttgttaaa cattttcaaa ccgcataaaa ttttatgaag tcccgtctat ctttaatgta 240 gtctaacatt ttcatattga aatatataat ttacttaatt ttagcgttgg tagaaagcat 300 aatgatttat tcttattctt cttcatataa atgtttaata tacaatataa acaaattctt 360 taccttaaga aggatttccc attttatatt ttaaaaatat atttatcaaa tatttttcaa 420 ccacgtaaat ctcataataa taagttgttt caaaagtaat aaaatttaac tccataattt 480 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Aspergillus nidulans delta 9 desaturase v3 <400> 4 gaattcggaa atgggccaag tgaaatggaa atagagcttc aatccattta gtcccactca 60 aaatggtgct cgaattatat ttagttacgt tcgaatcaga caaccaagta tttggttaat 120 aaaaaccact cgcaacaaag gaaaaacacc aagcgcgtgc gtccaacatc cgacggaagg 180 ggggtaatgt ggtccgaaaa ccttacaaaa atctgacgtc atctaccccc gaaaacgttg 240 aatcgtcaac gggggtagtt ttcgaattat ctttttttta ggggcagttt tattaatttg 300 ctctagaaat tttatgattt taattaaaaa aagaaaaaga atatttgtat atttattttt 360 tatactcttt ttttgtccaa ctatttctct tattttggca actttaacta gactagtaac 420 ttatgtcaat gtgtatggat gcatgagagt gagtatacac atgtctaaat gcatgcctta 480 tgaaagcaac gcaccacaaa acgaagaccc ctttacaaat acatctcatc ccttagtacc 540 ctcttactac tgtcccgaca caaactcaaa acaaggtacc ctgcagggat ccaacaatgt 600 ctgctccaac cgctgacatc agggctaggg ctccagaggc taagaaggtt cacatcgctg 660 ataccgctat caacaggcac aattggtaca agcacgtgaa ctggctcaac gtcttcctca 720 tcatcggaat cccactctac ggatgcatcc aagctttctg ggttccactt caactcaaga 780 ccgctatctg ggctgtgatc tactacttct 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cctttgccaa catgggagtc caaggtt 2517 <210> 5 <211> 1828 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Plant transcription unit comprising phospinothricin acetyl transferase <400> 5 cctgcaggga gatttttcaa atcagtgcgc tagacgtgac gtaagtatcc gagtcagttt 60 ttatttttct actaatttgg tcgtttattt cggcgtgtag gacatggcaa ccgggcctga 120 atttcgcggg tattctgttt ctattccaac tttttcttga tccgcagcca ttaacgactt 180 ttgaatagat acgtctaggg tcgagggggg atccgtcgag ggggtccacc aaaaacgtaa 240 gcgcttacgt acatggtcga gggggtccac caaaaacgta agcgcttacg tacatggtcg 300 agggggtcca ccaaaaacgt aagcgcttac gtacatggtc gagggggtcc accaaaaacg 360 taagcgctta cgtacatggt cgactagagc gtgacgctcg cggtgacgcc atttcgcctt 420 ttcagaaatg gataaatagc cttgcttcct attatatctt cccaaattac caatacatta 480 cactagcatc tgaatttcat aaccaatctc gatacaccaa atcgcagatc tggatcccaa 540 accatgtctc cggagaggag accagttgag attaggccag ctacagcagc tgatatggcc 600 gcggtttgtg atatcgttaa ccattacatt gagacgtcta cagtgaactt taggacagag 660 ccacaaacac cacaagagtg gattgatgat ctagagaggt 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<400> 18 atggcggcct tggacagcat tccagaggat aaggctacct cgtcgaaatc gactcatatt 60 caatatcaag aagtaacttt tcggaactgg tataagaaga taaattggct caacacgacg 120 ctggtggtgc tcatacccgc tcttggactc tacctaacac gcaccacgcc acttacacga 180 cctacgctca tctggtccgt cctgtactac ttctgcacag ctttcggcat cacaggcgga 240 tatcatcgac tatggagtca tcgcagctac tccgctcgtc taccgctacg cttattccta 300 gccttcacag gcgccggagc catccaaggt agtgctcgat ggtggagcgc aaatcaccgc 360 gcccaccacc gatggaccga cacaatgaag gacccctact ccgttatgcg cggcctatta 420 ttctcgcaca tcggatggat ggtattgaac agcgacccca aagtcaaagg ccgaacagac 480 gtcagtgatc tcgacagcga ccccgtcgta gtctggcagc acaagcacta cggcaagtgc 540 ctgctgttcg ccgcgtggat attccccatg atcgtagccg gcctcggatg gggagattgg 600 tggggaggcc ttgtctacgc cggcatcatt cgagcgtgtt tcgtccagca ggcgacattt 660 tgcgtgaact ctctcgcgca ttggatcggc gagcagccgt tcgacgacag acgcacgcct 720 cgagaccacg ttttgacagc gttggtaacg atgggagaag gatatcataa cttccaccac 780 gaattcccaa gcgattatcg caacgcgatc atctggtacc aatacgaccc taccaaatgg 840 ctcatttacc 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Val Arg Lys His 145 150 155 160 Pro Asp Leu Lys Glu Lys Gly Lys Gly Leu Asp Met Ser Asp Leu Leu 165 170 175 Ala Asp Pro Ile Leu Arg Phe Gln Lys Lys Tyr Tyr Leu Ile Leu Met 180 185 190 Pro Leu Ala Cys Phe Val Met Pro Thr Val Ile Pro Val Tyr Phe Trp 195 200 205 Gly Glu Thr Trp Thr Asn Ala Phe Phe Val Ala Ala Met Phe Arg Tyr 210 215 220 Ala Phe Ile Leu Asn Val Thr Trp Leu Val Asn Ser Ala Ala His Lys 225 230 235 240 Trp Gly Asp Lys Pro Tyr Asp Lys Ser Ile Lys Pro Ser Glu Asn Leu 245 250 255 Ser Val Ala Met Phe Ala Leu Gly Glu Gly Phe His Asn Tyr His His 260 265 270 Thr Phe Pro Trp Asp Tyr Lys Thr Ala Glu Leu Gly Asn Asn Lys Leu 275 280 285 Asn Phe Thr Thr Thr Phe Ile Asn Phe Phe Ala Lys Ile Gly Trp Ala 290 295 300 Tyr Asp Leu Lys Thr Val Ser Asp Asp Ile Val Lys Asn Arg Val Lys 305 310 315 320 Arg Thr Gly Asp Gly Ser His His Leu Trp Gly Trp Gly Asp Glu Asn 325 330 335 Gln Ser Lys Glu Glu Ile Asp Ala Ala Ile Arg Ile Asn Pro Lys Asp 340 345 350 Asp <210> 28 <211> 449 <212> PRT <213> Leptosphaeria nodorum <400> 28 Met Ala Ala Leu Asp Ser Ile Pro Glu Asp Lys Ala Thr Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr His Ile Gln Tyr Gln Glu Val Thr Phe Arg Asn Trp Tyr Lys 20 25 30 Lys Ile Asn Trp Leu Asn Thr Thr Leu Val Val Leu Ile Pro Ala Leu 35 40 45 Gly Leu Tyr Leu Thr Arg Thr Thr Pro Leu Thr Arg Pro Thr Leu Ile 50 55 60 Trp Ser Val Leu Tyr Tyr Phe Cys Thr Ala Phe Gly Ile Thr Gly Gly 65 70 75 80 Tyr His Arg Leu Trp Ser His Arg Ser Tyr Ser Ala Arg Leu Pro Leu 85 90 95 Arg Leu Phe Leu Ala Phe Thr Gly Ala Gly Ala Ile Gln Gly Ser Ala 100 105 110 Arg Trp Trp Ser Ala Asn His Arg Ala His His Arg Trp Thr Asp Thr 115 120 125 Met Lys Asp Pro Tyr Ser Val Met Arg Gly Leu Leu Phe Ser His Ile 130 135 140 Gly Trp Met Val Leu Asn Ser Asp Pro Lys Val Lys Gly Arg Thr Asp 145 150 155 160 Val Ser Asp Leu Asp Ser Asp Pro Val Val Val Trp Gln His Lys His 165 170 175 Tyr Gly Lys Cys Leu Leu Phe Ala Ala Trp Ile Phe Pro Met Ile Val 180 185 190 Ala Gly Leu Gly Trp Gly Asp Trp Trp Gly Gly Leu Val Tyr Ala Gly 195 200 205 Ile Ile Arg Ala Cys Phe Val Gln Gln Ala Thr Phe Cys Val Asn Ser 210 215 220 Leu Ala His Trp Ile Gly Glu Gln Pro Phe Asp Asp Arg Arg Thr Pro 225 230 235 240 Arg Asp His Val Leu Thr Ala Leu Val Thr Met Gly Glu Gly Tyr His 245 250 255 Asn Phe His His Glu Phe Pro Ser Asp Tyr Arg Asn Ala Ile Ile Trp 260 265 270 Tyr Gln Tyr Asp Pro Thr Lys Trp Leu Ile Tyr Leu Phe Ser Leu Gly 275 280 285 Pro Phe Pro Leu Ala Tyr Ser Leu Lys Thr Phe Arg Ser Asn Glu Ile 290 295 300 Glu Lys Gly Arg Leu Gln Gln Gln Gln Lys Ala Leu Asp Lys Lys Arg 305 310 315 320 Ser Gly Leu Asp Trp Gly Leu Pro Leu Phe Gln Leu Pro Val Ile Ser 325 330 335 Trp Asp Asp Phe Gln Ala Arg Cys Lys Glu Ser Gly Glu Met Leu Val 340 345 350 Ala Val Ala Gly Val Ile His Asp Val Ser Gln Phe Ile Glu Asp His 355 360 365 Pro Gly Gly Arg Ser Leu Ile Arg Ser Ala Val Gly Lys Asp Gly Thr 370 375 380 Gly Met Phe Asn Gly Gly Val Tyr Glu His Ser Asn Ala Ala His Asn 385 390 395 400 Leu Leu Ser Thr Met Arg Val Gly Val Leu Arg Gly Gly Gln Glu Val 405 410 415 Glu Val Trp Lys Lys Gln Arg Val Asp Val Leu Gly Lys Ser Asp Ile 420 425 430 Leu Arg Gln Val Thr Arg Val Glu Arg Leu Val Glu Gly Ala Val Ala 435 440 445 Ala <210> 29 <211> 455 <212> PRT <213> Aspergillus nidulans <400> 29 Met Ser Ala Pro Thr Ala Asp Ile Arg Ala Arg Ala Pro Glu Ala Lys 1 5 10 15 Lys Val His Ile Ala Asp Thr Ala Ile Asn Arg His Asn Trp Tyr Lys 20 25 30 His Val Asn Trp Leu Asn Val Phe Leu Ile Ile Gly Ile Pro Leu Tyr 35 40 45 Gly Cys Ile Gln Ala Phe Trp Val Pro Leu Gln Leu Lys Thr Ala Ile 50 55 60 Trp Ala Val Ile Tyr Tyr Phe Phe Thr Gly Leu Gly Ile Thr Ala Gly 65 70 75 80 Tyr His Arg Leu Trp Ala His Cys Ser Tyr Ser Ala Thr Leu Pro Leu 85 90 95 Arg Ile Trp Leu Ala Ala Val Gly Gly Gly Ala Val Glu Gly Ser Ile 100 105 110 Arg Trp Trp Ala Arg Asp His Arg Ala His His Arg Tyr Thr Asp Thr 115 120 125 Asp Lys Asp Pro Tyr Ser Val Arg Lys Gly Leu Leu Tyr Ser His Leu 130 135 140 Gly Trp Met Val Met Lys Gln Asn Pro Lys Arg Ile Gly Arg Thr Asp 145 150 155 160 Ile Ser Asp Leu Asn Glu Asp Pro Val Val Val Trp Gln His Arg Asn 165 170 175 Tyr Leu Lys Val Val Phe Thr Met Gly Leu Ala Val Pro Met Leu Val 180 185 190 Ala Gly Leu Gly Trp Gly Asp Trp Leu Gly Gly Phe Val Tyr Ala Gly 195 200 205 Ile Leu Arg Ile Phe Phe Val Gln Gln Ala Thr Phe Cys Val Asn Ser 210 215 220 Leu Ala His Trp Leu Gly Asp Gln Pro Phe Asp Asp Arg Asn Ser Pro 225 230 235 240 Arg Asp His Val Ile Thr Ala Leu Val Thr Leu Gly Glu Gly Tyr His 245 250 255 Asn Phe His His Glu Phe Pro Ser Asp Tyr Arg Asn Ala Ile Glu Trp 260 265 270 His Gln Tyr Asp Pro Thr Lys Trp Ser Ile Trp Ala Trp Lys Gln Leu 275 280 285 Gly Leu Ala Tyr Asp Leu Lys Lys Phe Arg Ala Asn Glu Ile Glu Lys 290 295 300 Gly Arg Val Gln Gln Leu Gln Lys Lys Leu Asp Arg Lys Arg Ala Thr 305 310 315 320 Leu Asp Trp Gly Thr Pro Leu Asp Gln Leu Pro Val Met Glu Trp Asp 325 330 335 Asp Tyr Val Glu Gln Ala Lys Asn Gly Arg Gly Leu Val Ala Ile Ala 340 345 350 Gly Val Val His Asp Val Thr Asp Phe Ile Lys Asp His Pro Gly Gly 355 360 365 Lys Ala Met Ile Ser Ser Gly Ile Gly Lys Asp Ala Thr Ala Met Phe 370 375 380 Asn Gly Gly Val Tyr Tyr His Ser Asn Ala Ala His Asn Leu Leu Ser 385 390 395 400 Thr Met Arg Val Gly Val Ile Arg Gly Gly Cys Glu Val Glu Ile Trp 405 410 415 Lys Arg Ala Gln Lys Glu Asn Val Glu Tyr Val Arg Asp Gly Ser Gly 420 425 430 Gln Arg Val Ile Arg Ala Gly Glu Gln Pro Thr Lys Ile Pro Glu Pro 435 440 445 Ile Pro Thr Ala Asp Ala Ala 450 455 <210> 30 <211> 455 <212> PRT <213> Aspergillus nidulans <400> 30 Met Ser Ala Pro Thr Ala Asp Ile Arg Ala Arg Ala Pro Glu Ala Lys 1 5 10 15 Lys Val His Ile Ala Asp Thr Ala Ile Asn Arg His Asn Trp Tyr Lys 20 25 30 His Val Asn Trp Leu Asn Val Phe Leu Ile Ile Gly Ile Pro Leu Tyr 35 40 45 Gly Cys Ile Gln Ala Phe Trp Val Pro Leu Gln Leu Lys Thr Ala Ile 50 55 60 Trp Ala Val Ile Tyr Tyr Phe Phe Thr Gly Leu Gly Ile Thr Ala Gly 65 70 75 80 Tyr His Arg Leu Trp Ala His Cys Ser Tyr Ser Ala Thr Leu Pro Leu 85 90 95 Arg Ile Trp Leu Ala Ala Val Gly Gly Gly Ala Val Glu Gly Ser Ile 100 105 110 Arg Trp Trp Ala Arg Asp His Arg Ala His His Arg Tyr Thr Asp Thr 115 120 125 Asp Lys Asp Pro Tyr Ser Val Arg Lys Gly Leu Leu Tyr Ser His Leu 130 135 140 Gly Trp Met Val Met Lys Gln Asn Pro Lys Arg Ile Gly Arg Thr Asp 145 150 155 160 Ile Ser Asp Leu Asn Glu Asp Pro Val Val Val Trp Gln His Arg Asn 165 170 175 Tyr Leu Lys Val Val Phe Thr Met Gly Leu Ala Val Pro Met Leu Val 180 185 190 Ala Gly Leu Gly Trp Gly Asp Trp Leu Gly Gly Phe Val Tyr Ala Gly 195 200 205 Ile Leu Arg Ile Phe Phe Val Gln Gln Ala Thr Phe Cys Val Asn Ser 210 215 220 Leu Ala Leu Trp Leu Gly Asp Gln Pro Phe Asp Asp Arg Asn Ser Pro 225 230 235 240 Arg Asp His Val Ile Thr Ala Leu Val Thr Leu Gly Glu Gly Tyr His 245 250 255 Asn Phe His His Glu Phe Pro Ser Asp Tyr Arg Asn Ala Ile Glu Trp 260 265 270 His Gln Tyr Asp Pro Thr Lys Trp Ser Ile Trp Ala Trp Lys Gln Leu 275 280 285 Gly Leu Ala Tyr Asp Leu Lys Lys Phe Arg Ala Asn Glu Ile Glu Lys 290 295 300 Gly Arg Val Gln Gln Leu Gln Lys Lys Leu Asp Arg Lys Arg Ala Thr 305 310 315 320 Leu Asp Trp Gly Thr Pro Leu Asp Gln Leu Pro Val Met Glu Trp Asp 325 330 335 Asp Tyr Val Glu Gln Ala Lys Asn Gly Arg Gly Leu Val Ala Ile Ala 340 345 350 Gly Val Val His Asp Val Thr Asp Phe Ile Lys Asp His Pro Gly Gly 355 360 365 Lys Ala Met Ile Ser Ser Gly Ile Gly Lys Asp Ala Thr Ala Met Phe 370 375 380 Asn Gly Gly Val Tyr Tyr His Ser Asn Ala Ala His Asn Leu Leu Ser 385 390 395 400 Thr Met Arg Val Gly Val Ile Arg Gly Gly Cys Glu Val Glu Ile Trp 405 410 415 Lys Arg Ala Gln Lys Glu Asn Val Glu Tyr Val Arg Asp Gly Ser Gly 420 425 430 Gln Arg Val Ile Arg Ala Gly Glu Gln Pro Thr Lys Ile Pro Glu Pro 435 440 445 Ile Pro Thr Ala Asp Ala Ala 450 455 <210> 31 <211> 510 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 31 Met Pro Thr Ser Gly Thr Thr Ile Glu Leu Ile Asp Asp Gln Phe Pro 1 5 10 15 Lys Asp Asp Ser Ala Ser Ser Gly Ile Val Asp Glu Val Asp Leu Thr 20 25 30 Glu Ala Asn Ile Leu Ala Thr Gly Leu Asn Lys Lys Ala Pro Arg Ile 35 40 45 Val Asn Gly Phe Gly Ser Leu Met Gly Ser Lys Glu Met Val Ser Val 50 55 60 Glu Phe Asp Lys Lys Gly Asn Glu Lys Lys Ser Asn Leu Asp Arg Leu 65 70 75 80 Leu Glu Lys Asp Asn Gln Glu Lys Glu Glu Ala Lys Thr Lys Ile His 85 90 95 Ile Ser Glu Gln Pro Trp Thr Leu Asn Asn Trp His Gln His Leu Asn 100 105 110 Trp Leu Asn Met Val Leu Val Cys Gly Met Pro Met Ile Gly Trp Tyr 115 120 125 Phe Ala Leu Ser Gly Lys Val Pro Leu His Leu Asn Val Phe Leu Phe 130 135 140 Ser Val Phe Tyr Tyr Ala Val Gly Gly Val Ser Ile Thr Ala Gly Tyr 145 150 155 160 His Arg Leu Trp Ser His Arg Ser Tyr Ser Ala His Trp Pro Leu Arg 165 170 175 Leu Phe Tyr Ala Ile Phe Gly Cys Ala Ser Val Glu Gly Ser Ala Lys 180 185 190 Trp Trp Gly His Ser His Arg Ile His His Arg Tyr Thr Asp Thr Leu 195 200 205 Arg Asp Pro Tyr Asp Ala Arg Arg Gly Leu Trp Tyr Ser His Met Gly 210 215 220 Trp Met Leu Leu Lys Pro Asn Pro Lys Tyr Lys Ala Arg Ala Asp Ile 225 230 235 240 Thr Asp Met Thr Asp Asp Trp Thr Ile Arg Phe Gln His Arg His Tyr 245 250 255 Ile Leu Leu Met Leu Leu Thr Ala Phe Val Ile Pro Thr Leu Ile Cys 260 265 270 Gly Tyr Phe Phe Asn Asp Tyr Met Gly Gly Leu Ile Tyr Ala Gly Phe 275 280 285 Ile Arg Val Phe Val Ile Gln Gln Ala Thr Phe Cys Ile Asn Ser Met 290 295 300 Ala His Tyr Ile Gly Thr Gln Pro Phe Asp Asp Arg Arg Thr Pro Arg 305 310 315 320 Asp Asn Trp Ile Thr Ala Ile Val Thr Phe Gly Glu Gly Tyr His Asn 325 330 335 Phe His His Glu Phe Pro Thr Asp Tyr Arg Asn Ala Ile Lys Trp Tyr 340 345 350 Gln Tyr Asp Pro Thr Lys Val Ile Ile Tyr Leu Thr Ser Leu Val Gly 355 360 365 Leu Ala Tyr Asp Leu Lys Lys Phe Ser Gln Asn Ala Ile Glu Glu Ala 370 375 380 Leu Ile Gln Gln Glu Gln Lys Lys Ile Asn Lys Lys Lys Ala Lys Ile 385 390 395 400 Asn Trp Gly Pro Val Leu Thr Asp Leu Pro Met Trp Asp Lys Gln Thr 405 410 415 Phe Leu Ala Lys Ser Lys Glu Asn Lys Gly Leu Val Ile Ile Ser Gly 420 425 430 Ile Val His Asp Val Ser Gly Tyr Ile Ser Glu His Pro Gly Gly Glu 435 440 445 Thr Leu Ile Lys Thr Ala Leu Gly Lys Asp Ala Thr Lys Ala Phe Ser 450 455 460 Gly Gly Val Tyr Arg His Ser Asn Ala Ala Gln Asn Val Leu Ala Asp 465 470 475 480 Met Arg Val Ala Val Ile Lys Glu Ser Lys Asn Ser Ala Ile Arg Met 485 490 495 Ala Ser Lys Arg Gly Glu Ile Tyr Glu Thr Gly Lys Phe Phe 500 505 510 <210> 32 <211> 68 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N-terminal residues 1-68 of AnD9DS <400> 32 Met Ser Ala Pro Thr Ala Asp Ile Arg Ala Arg Ala Pro Glu Ala Lys 1 5 10 15 Lys Val His Ile Ala Asp Thr Ala Ile Asn Arg His Asn Trp Tyr Lys 20 25 30 His Val Asn Trp Leu Asn Val Phe Leu Ile Ile Gly Ile Pro Leu Tyr 35 40 45 Gly Cys Ile Gln Ala Phe Trp Val Pro Leu Gln Leu Lys Thr Ala Ile 50 55 60 Trp Ala Val Ile 65 <210> 33 <211> 175 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminal residues 281-455 of AnD9DS <400> 33 Ser Ile Trp Ala Trp Lys Gln Leu Gly Leu Ala Tyr Asp Leu Lys Lys 1 5 10 15 Phe Arg Ala Asn Glu Ile Glu Lys Gly Arg Val Gln Gln Leu Gln Lys 20 25 30 Lys Leu Asp Arg Lys Arg Ala Thr Leu Asp Trp Gly Thr Pro Leu Asp 35 40 45 Gln Leu Pro Val Met Glu Trp Asp Asp Tyr Val Glu Gln Ala Lys Asn 50 55 60 Gly Arg Gly Leu Val Ala Ile Ala Gly Val Val His Asp Val Thr Asp 65 70 75 80 Phe Ile Lys Asp His Pro Gly Gly Lys Ala Met Ile Ser Ser Gly Ile 85 90 95 Gly Lys Asp Ala Thr Ala Met Phe Asn Gly Gly Val Tyr Tyr His Ser 100 105 110 Asn Ala Ala His Asn Leu Leu Ser Thr Met Arg Val Gly Val Ile Arg 115 120 125 Gly Gly Cys Glu Val Glu Ile Trp Lys Arg Ala Gln Lys Glu Asn Val 130 135 140 Glu Tyr Val Arg Asp Gly Ser Gly Gln Arg Val Ile Arg Ala Gly Glu 145 150 155 160 Gln Pro Thr Lys Ile Pro Glu Pro Ile Pro Thr Ala Asp Ala Ala 165 170 175

Claims (28)

1. 서열식별번호: 2와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 델타-9 데새투라제 효소를 코딩하는 단리된 핵산 분자.
2. 제1항에 있어서, 적어도 1종의 유전자 조절 요소를 추가로 포함하는 핵산 분자.
3. 제2항에 있어서, 유전자 조절 요소가 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) 델타-9 데새투라제 프로모터, 델타-9 데새투라제 3'UTR/종결인자, ole1 유전자 프로모터, 파세올루스 불가리스(Phaseolus vulgaris) 파세올린 프로모터, 파세올루스 불가리스 파세올린 5' 비번역 영역, 파세올루스 불가리스 파세올린 3' 비번역 영역, 파세올루스 불가리스 파세올린 매트릭스 부착 영역, 레스퀘렐라 펜들레리(Lesquerella fendleri) KCS3 프로모터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 만노핀 신타제 프로모터, 아그로박테리움 투메파시엔스 ORF23 3' 비번역 영역, 카사바 베인 모자이크 바이러스 프로모터, 아그로박테리움 투메파시엔스 ORF1 3' 비번역 영역, 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum) RB7 매트릭스 부착 영역, 오버드라이브, T-가닥 경계 서열, LfKCS3 프로모터, FAE 1 프로모터, Myc 태그, 및 헤마글루틴 태그로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 핵산 분자.
4. 제3항의 제1 핵산 분자 및 제3항의 제2 핵산 분자를 포함하며, 여기서 제1 핵산 분자는 제1 유전자 조절 요소를 추가로 포함하고, 제2 핵산 분자는 제2 유전자 조절 요소를 포함하는 것인 구축물.
5. 제4항에 있어서, 제1 또는 제2 핵산 분자가 적어도 2종의 유전자 조절 요소를 함유하는 것인 구축물.
6. 세포 내의 포화 지방산의 양이 감소되도록 세포를 제1항의 핵산 분자로 형질전환시키는 것
   을 포함하는, 세포 내의 포화 지방산의 양을 감소시키는 방법.
7. 세포 내의 포화 지방산의 양이 감소되도록 세포를 제5항의 구축물로 형질전환시키는 것
   을 포함하는, 세포 내의 포화 지방산의 양을 감소시키는 방법.
8. 제7항에 있어서, 세포가 효모 세포인 방법.
9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 세포가 식물 세포인 방법.
10. 제9항에 있어서, 식물 세포를 1종 초과의 제1항의 핵산 분자로 형질전환시키는 것을 포함하는 방법.
11. 제9항에 있어서, 식물 세포를 형질전환시키는 것이 식물 세포 내의 16:0-CoA의 수준을 감소시키기 위한 수단을 식물 세포 내로 도입하는 것인 방법.
12. 제11항에 있어서, 식물 세포 내의 16:0-CoA의 수준을 감소시키기 위한 수단이 색소체외 데새투라제인 방법.
13. 제12항에 있어서, 색소체외 데새투라제가 LnD9DS 데새투라제, AnD9DS 데새투라제, HzD9DS 데새투라제, 및 MgD9DS 데새투라제로 이루어진 군으로부터 선택된 데새투라제인 방법.
14. 제12항에 있어서, 색소체외 데새투라제가 AnD9DS 데새투라제인 방법.
15. 제9항에 있어서, 식물 세포가 아라비돕시스(Arabidopsis), 보라고(Borago), 카놀라(Canola), 리시누스(Ricinus), 테오브로마(Theobroma), 제아(Zea), 고시피움(Gossypium), 크람베(Crambe), 쿠페아(Cuphea), 리눔(Linum), 레스퀘렐라(Lesquerella), 림난테스(Limnanthes), 리놀라(Linola), 트로파에올룸(Tropaeolum), 오에노테라(Oenothera), 올레아(Olea), 엘라에이스(Elaeis), 아라키스(Arachis), 평지씨, 카르타무스(Carthamus), 글리신(Glycine), 소야(Soja), 헬리안투스(Helianthus), 니코티아나(Nicotiana), 베르노니아(Vernonia), 트리티쿰(Triticum), 호르데움(Hordeum), 오리자(Oryza), 아베나(Avena), 소르굼(Sorghum), 세칼레(Secale), 및 그라미네아에(Gramineae)의 다른 구성원으로 이루어진 군으로부터 선택된 속으로부터 선택된 식물로부터 수득되는 것인 방법.
16. 제1항의 핵산 서열을 포함하는 오일 종자 식물.
17. 제5항 또는 제6항의 구축물을 포함하는 오일 종자 식물.
18. 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 14, 서열식별번호: 15, 서열식별번호: 16, 서열식별번호: 17, 서열식별번호: 18, 서열식별번호: 19, 서열식별번호: 20, 서열식별번호: 21, 서열식별번호: 22, 서열식별번호: 23, 서열식별번호: 24, 서열식별번호: 25, 서열식별번호: 26, 서열식별번호: 27, 또는 서열식별번호: 28로 이루어진 군으로부터 선택된 색소체외 데새투라제를 발현하는 식물 종자.
19. 동질유전자 버전의 트랜스제닉 브라시카 나푸스(Brassica napus) 계통에 비해 감소된 수준의 포화 지방산을 갖는, 트랜스제닉 브라시카 나푸스 계통의 종자.
20. 식물 재료를 제1항의 핵산 분자로 형질전환시키는 것; 및
    형질전환된 식물 재료를 배양하여 식물을 수득하는 것
    을 포함하는, 야생형 식물과 비교 시 식물 내에 감소된 양의 포화 지방산을 포함하는 유전자 조작된 식물을 생성하는 방법.
21. 식물 재료를 제4항의 구축물로 형질전환시키는 것; 및
    형질전환된 식물 재료를 배양하여 식물을 수득하는 것
    을 포함하는, 야생형 식물과 비교 시 식물 내에 감소된 양의 포화 지방산을 포함하는 유전자 조작된 식물을 생성하는 방법.
22. 제21항에 있어서, 식물이 아라비돕시스, 보라고, 카놀라, 리시누스, 테오브로마, 제아, 고시피움, 크람베, 쿠페아, 리눔, 레스퀘렐라, 림난테스, 리놀라, 트로파에올룸, 오에노테라, 올레아, 엘라에이스, 아라키스, 평지씨, 카르타무스, 글리신, 소야, 헬리안투스, 니코티아나, 베르노니아, 트리티쿰, 호르데움, 오리자, 아베나, 소르굼, 세칼레, 및 그라미네아에의 다른 구성원으로 이루어진 군으로부터 선택된 속으로부터 선택된 것인 방법.
23. 제21항의 방법에 의해 수득된 식물.
24. 제23항의 식물로부터 수득된 식물 재료.
25. 제23항에 있어서, 종자인 식물 재료.
26. 제23항의 식물로부터의 오일.
27. 제23항에 있어서, 오일이 3.5% 미만의 포화 지방산을 함유하는 것인 식물로부터의 오일.
28. 제23항에 있어서, 오일이 3.0% 미만의 포화 지방산을 함유하는 것인 식물로부터의 오일.

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