KR102566555B1

KR102566555B1 - 델타-9-지방산불포화 효소를 암호화 하는 유전자 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102566555B1
Application number: KR1020200060516A
Authority: KR
Inventors: 황인택; 임희경; 한예진
Original assignee: 한국화학연구원
Priority date: 2020-05-20
Filing date: 2020-05-20
Publication date: 2023-08-14
Also published as: KR20210143571A

Abstract

본 발명은 델타-9-지방산불포화 효소를 암호화 하는 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 델타-9-지방산불포화 효소는 카르복실 말단으로부터 9번째 및 10번째 탄소 원자 사이에 이중결합을 생성함으로써 각종 기름 속에 존재하는 포화지방산을 불포화지방산으로 전환하기 때문에 장쇄 포화지방산의 산업적 이용성을 증대시켜준다. 특히 스테아르산(C18:0)을 올레산(C18:1, n-9)으로 전환 시킴으로써 에틸렌 복분해 기술을 이용하여 올레산 한 분자로부터 탄소 10개의 데센(dec-1-ene) 2분자를 생산할 수 있으므로 화학적으로 합성이 어렵고, 부가 가치가 높은 다양한 고분자 화학 산업 플랫폼으로 활용할 수 있다. 이는 천연 지질을 탄소 자원으로 활용하기 때문에, 지속 가능한 화학 기술이며, 이산화탄소 저감 녹색 화학 기술이다. 또한, 불포화지방산이 풍부한 기능성 식품과 천연의약품의 생산에도 적용할 수 있다.

Description

델타-9-지방산불포화 효소를 암호화 하는 유전자 및 이의 용도 {Nucleotide encoding delta-9-desaturase and use thereof}

본 발명은 델타-9-지방산불포화 효소를 암호화 하는 유전자 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 델타-9-지방산불포화 효소(△-9-desaturase) KRICT-Rt9 단백질을 암호화하는 유전자, 이를 포함하는 벡터, 상기 벡터로 형질 전환 된 형질전환체, 상기 형질전환체를 이용한 델타-9-지방산불포화 효소 KRICT-Rt9 단백질의 제조방법, 및 상기 형질전환체 또는 상기 델타-9-지방산불포화 효소 KRICT-Rt9 단백질을 이용한 포화지방산으로부터 불포화지방산의 제조방법에 관한 것이다.

델타-9-지방산불포화 효소(△-9-desaturase)는 지질을 구성하고 있는 다양한 트리글리세라이드(triglyceride)의 에스테르 결합을 가수분해하는 효소로 많은 종류의 동식물과 미생물이 생산하는 것으로 알려져 있으나, 아직은 많은 연구가 수행되지 않았다. 스테아로일-CoA 불포화 효소로도 알려진 델타-9-지방산불포화 효소는 인체 내 모든 세포의 단일 불포화 유비쿼터스 성분인 올레산을 합성하는 데 사용된다.

델타-9-지방산불포화 효소는 이들이 반응하는 지방산의 형태에 따라서 아실 전달 단백질, 아실-지질 및 아실-CoA 불포화 효소 등 3개의 그룹으로 분류된다(Murata and Wada, 1995). 고등 식물의 델타-9-지방산불포화 효소는 아실 전달 단백질에 속하고(Knutzon et al., 1992; Mckeon and Stumpf, 1982; Shanklin and Somerville, 1991; Moreau, 1981), 시아노박테리아(cyanobacteria)의 델타-9-지방산불포화 효소는 아실-지질 불포화 효소에 속하며(Sakamoto et al., 1994), 효모와 포유류의 아실-CoA 불포화 효소에 속하며(Holloway 1983) 상호 간에 구조적 관련이 없다 (Shanklin and Somerville, 1991).

생체 내에서 델타-9-지방산불포화 효소는 단일 불포화지방산(MUFA, monounsaturated fatty acid) 합성에 관여하는 첫 번째 효소로서 카르복실 말단으로부터 9번째 및 10번째 탄소 원자 사이에 이중결합을 생성함으로 다양한 종류의 불포화지방산 합성의 시발점으로서 매우 중요한 역할을 한다(Paton and Ntambi, 2009). 또한, 생체 내에서 델타-9-지방산불포화 효소에 이어서 델타-12-지방산불포화 효소(Δ-12-desaturase), 델타-15-지방산불포화 효소(Δ-15-desaturase) 등이 차례로 작용해서 다양한 다중불포화지방산(multi-unsaturated fatty acid)을 생합성 하게 된다. 이들 효소에 의해서 생합성된 불포화지방산들은 생체의 막을 구성하여 세포막의 필수 유동성을 부여한다(Mouritsen and Jorgensen, 1992). 델타-9-지방산불포화 효소에 기초하여 생합성된 불포화지방산은 살아있는 유기체의 생체막 기능을 조절하는 중요한 성분이기 때문에, 생물 생존의 필수 물질대사이다(Paton and Ntambi, 2009).

지금까지 여러 식물 종(Slocombe et al., 1994)은 물론 표고버섯(Sakai and Kajiwara, 2003), 곰팡이(Wan et al., 2013), 남극물고기(Porta et al., 2013), 조류(Masaki et al., 2013), 애기장대(Chen and Thelen, 2013), 가문비나무(Marillia et al., 2002), 곰팡이(Woelke et al., 2017), 기생충(Jung et al., 2016), 요각류(Kang et al., 2017) 등에서 델타-9-지방산불포화 효소가 확인되고 특성화되었다. 그러나 지금까지의 연구내용은 생체 내에서의 존재 확인, 효소를 코딩하는 유전자와 유전자의 존재 여부에 따른 기능만 확인되었을 뿐 이 효소를 대량생산하거나 생체 외에서 산업적으로 활용하려는 시도는 현재까지 보고된 바가 없다.

한편, 전 세계적으로 식용 및 비식용 바이오 기름이 대량 생산되지만(Jeon et. al., 2019), 그 가치와 잠재력은 십분 활용되지 못하고 있다. 예를 들어 바이오디젤 생산에 효소를 사용하는 장점은 온화한 조건에서 저온에서 촉매 작용 할 수 있고 바이오디젤로부터 글리세롤을 쉽게 회수할 수 있다는 것이다. 그러나, 바이오 기름이 지방산 에스테르의 무차별 전환으로 인해 연료로만 사용되지 않고 불포화 장쇄 화학 원료로 사용될 수 있다면 부가 가치는 크게 향상될 것이다. 특히 에틸렌 복분해 기술을 이용하여 불포화지방산을 C₄-C₃₀의 다양한 물질로 변환시킬 경우 이들은 화학 산업 플랫폼 기술이자 지속 가능한 화학 기술로 이산화탄소 저감 녹색 화학 기술 및 석유 화학 대체물질로 사용될 수 있다. 이들 플랫폼 화학 물질은 자체 시장을 가지고 있을 뿐만 아니라 다른 제품(폴리머, 계면 활성제, 합성 윤활제, 가소제, 기타 특수 화학 물질, 일반 화학 물질, 바이오 연료 등)의 합성 원료로 사용된다. 특히 바이오 기름으로 제조한 폴리머는 선천적으로 생분해 특성과 생체 적합성을 가지고 있어서 치약, 비듬 샴푸, 멜라민 탈색 화장품, 의료 및 형상 기억 폴리머와 같은 다양한 고부가 가치 기능성 제품을 개발할 수 있다.

그러나 노벨상을 받았던 복분해 기술의 핵심 요구사항은 화학 물질 내부에 이중결합이 있어야 하므로 식물 기름 속에 존재하는 포화지방산을 불포화지방산으로 전환하는 기술은 매우 중요한 가치를 제공한다. 또한, 포화지방산은 다량 섭취 시 혈액 내의 콜레스테롤을 높여 심장질환의 발병률을 높이지만, 단일 불포화지방산인 올레산은 콜레스테롤 수치를 낮추고 위산의 분비 조절 작용이 있으며, 선옥 HDL-콜레스테롤을 줄이지 않으므로 동맥경화 예방을 기대할 수 있고, 체내에서 잘 산화되지 않기 때문에 건강 기능 식품으로서의 개발 가치도 매우 높다고 할 수 있다.

이에, 본 발명자들은 포화지방산을 이용 가치가 높은 불포화지방산으로 전환시킬 수 있는 방법을 개발하기 위해 노력하던 중, 몇 가지 유기체로부터 델타-9-지방산불포화 효소 유전자 정보를 확보하고, 대장균에서 델타-9-지방산불포화 효소가 잘 발현될 수 있도록 코돈 최적화(codon optimization)를 통하여 새로운 델타-9-지방산불포화 효소를 암호화 하는 유전자를 제시하였고, 이를 도입한 형질전환 대장균으로부터 델타-9-지방산불포화 효소가 산업적으로 이용할 수 있는 정도로 성공적으로 발현될 뿐 아니라, 나아가, 이 형질전환 대장균을 사용하여 포화지방산 스테아르산(stearic acid, C18:0)이 불포화지방산으로부터 올레산(oleic acid, C18:1, n-9)으로 성공적으로 생산됨을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 포화지방산을 이용 가치가 높은 불포화지방산으로 전환시킬 수 있는 방법을 제공하는 것으로서, 델타-9-지방산불포화 효소를 대장균에서 산업적으로 이용할 수 있는 정도로 성공적으로 발현시킬 수 있는 새로운 유전자 서열과 이를 도입한 형질전환체를 제공하는 것이며, 나아가 이를 이용하여 포화지방산으로부터 불포화지방산의 제조 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여,

본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 델타-9-지방산불포화 효소(△-9-desaturase) KRICT-Rt9 단백질을 암호화하는 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

나아가, 본 발명은 상기 재조합벡터를 숙주세포에 도입한 형질전환체를 제공한다.

또한, 본 발명은 1) 상기 형질전환체를 배양하는 단계; 및 2) 상기 배양된 형질전환체로부터 델타-9-지방산불포화 효소(△-9-desaturase) KRICT-Rt9 단백질을 회수하는 단계;를 포함하는 델타-9-지방산불포화 효소 KRICT-Rt9 단백질의 제조방법을 제공한다.

나아가, 본 발명은 상기 형질전환체 또는 상기 델타-9-지방산불포화 효소 KRICT-Rt9 단백질을 이용하여 포화지방산으로부터 불포화지방산의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 델타-9-지방산불포화 효소는 카르복실 말단으로부터 9번째 및 10번째 탄소 원자 사이에 이중결합을 생성함으로써 각종 기름 속에 존재하는 포화지방산을 불포화지방산으로 전환하기 때문에 장쇄 포화지방산의 산업적 이용성을 증대시켜준다. 특히 스테아르산(C18:0)을 올레산(C18:1, n-9)으로 전환 시킴으로써 에틸렌 복분해 기술을 이용하여 올레산 한 분자로부터 탄소 10개의 데센(dec-1-ene) 2분자를 생산할 수 있으므로 화학적으로 합성이 어렵고, 부가 가치가 높은 다양한 고분자 화학 산업 플랫폼으로 활용할 수 있다. 이는 천연 지질을 탄소 자원으로 활용하기 때문에, 지속 가능한 화학 기술이며, 이산화탄소 저감 녹색 화학 기술이다. 또한, 불포화지방산이 풍부한 기능성 식품과 천연의약품의 생산에도 적용할 수 있다.

도 1은 곰팡이 Rhodotorula toruloides NP11 유래의 기존 유전자 서열을 갖는 XP_016270987와 본 발명의 델타-9-지방산불포화 효소 KRICT-Rt9의 DNA 염기서열을 비교한 도면이다.
도 2는 본 발명의 새로운 델타-9-지방산불포화 효소 KRICT-Rt9의 PCR 결과도면이다.
도 3은 본 발명의 델타-9-지방산불포화 효소 KRICT-Rt9 유전자를 포함하는 벡터의 구조를 도식화한 도면이다(pET21a-6HGST-NusA-Rt9FAD).
도 4A는 기존 유전자(OriRt9FAD)를 포함하는 벡터로 형질 전환 된 형질전환체로부터 델타-9-지방산불포화 효소 단백질의 발현 유도 결과를 나타낸 도면이고 도 4B는 본 발명의 형질전환체 E. coli BL21(DE3)/pET21a-6HGST-NusA-Rt9FAD의 배양액으로부터 델타-9-지방산불포화 효소 KRICT-Rt9 단백질의 발현 유도 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명의 델타-9-지방산불포화 효소 KRICT-Rt9 단백질의 정제 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 형질전환 여부에 따른 대장균 체내의 지방산 GC 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 GC 분석 결과에 따른 스테아르산과 올레산의 함량을 형질전환 여부에 따라 비교하여 그래프로 나타낸 도면이다.
도 8은 델타-9-지방산불포화 효소 KRICT-Rt9을 이용하여 시험관내에서 Stearoyl CoA와 NADH로부터 올레산 생성을 확인한 도면이다.
도 9는 본 발명 델타-9-지방산불포화 효소 KRICT-Rt9의 제조부터 이를 이용한 올레산의 제조 및 올레산으로부터 에틸렌 복분해 기술을 이용한 탄소 10개의 데센(dec-1-ene) 2분자의 생성을 나타낸 개념도이다.

이하에서 본 발명을 상세히 설명한다.

상기 델타-9-지방산불포화 효소 KRICT-Rt9 단백질을 암호화하는 유전자는 본 발명의 델타-9-지방산불포화 효소 KRICT-Rt9 단백질과 동등한 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 범위 내에서, 하나 이상의 핵산 염기의 결실, 삽입, 치환 또는 이들의 조합에 의해서 상이한 서열을 가지는 변이체일 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 상기 서열번호 1 염기서열로 구성되는 유전자와 실질적으로 동일한 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드, 이의 변이체 또는 단편을 포함할 수 있다. 상기 실질적으로 동일한 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드는 본 발명의 유전자와 80％ 이상, 구체적으로 90％ 이상, 더욱 구체적으로 95％ 이상으로 상동성을 가질 수 있다.

본 발명의 일 측면에서, 상기 서열번호 1의 유전자는 인공적으로 합성된 서열이다. 바람직하게, 상기 서열번호 1의 유전자는 천연에서 분리된 델타-9-지방산불포화 효소 유전자 대비 형질전환체로부터 얻어지는 단백질 발현량이 증가되도록 인공적으로 합성된 새로운 서열을 갖는 유전자이다.

본 발명의 일 측면에서, 상기 서열번호 1의 유전자는 아래와 같은 과정으로부터 얻어진 유전자일 수 있다. 먼저, 천연 유래의, 예를 들어 곰팡이 유래의, 바람직하게 로도토룰라속 곰팡이 유래의, 가장 바람직하게 Rhodotorula toruloides NP11 곰팜이로부터 델타-9-지방산불포화 효소 단백질을 암호화하는 염기서열을 분리하거나 또는 이 천연 유래의 유전자를 인공적인 합성 방법으로 얻고, 이를 토대로 형질전환체, 예를 들어 대장균에서 보다 높은 수준의 발현량이 달성되도록 변형을 가하여 얻어진 유전자이다.

상기 변형은 델타-9-지방산불포화 효소와 동등한 기능의 단백질을 암호화하는 범위 내에서, 단백질의 높은 발현량이 달성되도록, 하나 이상의 핵산 염기의 결실, 삽입, 치환 또는 이들의 조합에 의해서 상이한 서열을 가지는 변형을 의미한다. 바람직하게 상기 변형은 코독 최적화 과정에 따른 변형이다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 유전자는 높은 수준의 델타-9-지방산불포화 효소 단백질 발현량을 갖는다. 바람직하게, 상기 발현량은 산업적으로 이용 가능한 수준의 높은 발현량을 의미한다. 여기서 상기 선업적으로 이용 가능한 수준의 높은 발현량은 예를 들어 형질전환체로부터 얻어지는 단백질을 분리 및 정제하여 포화지방산으로부터 불포화지방산을 생산하는 공정에 사용하기에 충분한 양을 의미하거나, 또는 상기 형질전환체 자체를 포화지방산으로부터 불포화지방산을 생산하는 공정에 사용하기에 충분한 양의 단백질 발현량을 의미한다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성되는 델타-9-지방산불포화 효소 KRICT-Rt9 단백질을 제공한다.

본 발명의 일 측면에서, 상기 델타-9-지방산불포화 효소 KRICT-Rt9 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성되는 것이나, 다르게는 상기 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성되는 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질, 이의 변이체 또는 단편을 포함할 수 있다. 상기 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질은 본 발명의 단백질과 80％ 이상, 구체적으로 90％ 이상, 더욱 구체적으로 95％ 이상으로 상동성을 가질 수 있다.

한편, 상기 변이체는 델타-9-지방산불포화 효소 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서, 아미노산 잔기의 결실, 삽입, 치환 또는 이들의 조합에 의해서 상이한 서열을 가지는 아미노산의 변이체일 수 있다. 예를 들어, 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 또는 펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation) 또는 파네실화(farnesylation) 등으로 수식(modification)될 수 있다.

한편, 상기 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성되는 델타-9-지방산불포화 효소 KRICT-Rt9 단백질은 본 발명의 서열번호 1의 유전자로부터 발현되는 단백질이거나 또는 당업계의 통상적인 화학적 합성 방법(Creighton, 1983)에 따라 액상 펩타이드 합성법(Solution Phase Peptide synthesis), 고상 펩타이드 합성법(solid-phase peptide syntheses), 단편 응축법 및 F-moc 또는 T-BOC 화학법 등으로 합성될 수 있다.

나아가, 본 발명은 상기 서열번호 1의 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 명세서에서 사용된 용어, "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 의미하며, 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 용어, "재조합 벡터"는 특정 숙주세포에서 목적 단백질 또는 목적 RNA를 발현할 수 있는 벡터로, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동할 수 있게 연결된 필수적인 조절요소를 포함하는 유전자 제작물을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "작동할 수 있게 연결된(operably linked)"은 핵산의 발현을 조절하는 서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 암호화하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것을 의미한다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동할 수 있게 연결되어 암호화하는 핵산 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 재조합 벡터와의 작위적 연결은 당해 기술 분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.

상기 재조합 벡터는 플라스미드 벡터, 코스미드(cosmid) 벡터, 포스미드(fosmid) 벡터, 박테리오파지 벡터 또는 바이러스 벡터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 재조합 벡터는 프로모터(promoter), 오퍼레이터(operator), 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 신호 및 인핸서(enhancer)와 같은 발현 조절 서열을 포함할 수 있고, 막 표적화 또는 분비를 위한 신호 서열 또는 리더 서열을 포함할 수 있으며, 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다.

상기 신호 서열은 숙주세포가 에쉐리키아속(Escherichia) 균인 경우 PhoA 신호 서열 또는 OmpA 신호 서열 등을, 숙주세포가 바실러스속(Bacillus) 균인 경우 α-아밀라아제 신호 서열 또는 서브틸리신(subtilicin) 신호 서열 등을, 숙주세포가 효모인 경우에는 MFα 신호 서열 또는 SUC2 신호 서열 등을, 숙주세포가 동물 세포일 때 인슐린 신호 서열, α-인터페론 신호 서열, 또는 항체 분자 신호 서열 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 재조합 벡터는 재조합 벡터를 함유하는 숙주세포를 선별하기 위한 선택 마커를 포함할 수 있고, 복제 가능한 재조합 벡터인 경우, 복제원점을 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 본 발명에 따른 델타-9-지방산불포화 효소 KRICT-Rt9 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 숙주세포에 도입한 형질전환체는 델타-9-지방산불포화 효소 단백질 KRICT-Rt9 단백질이 숙주세포에서 높은 수준으로 발현되며, 그 활성과 기능을 나타내므로, 숙주세포의 배양 배지에 스테아르산(stearic acid)이나 Stearyl-CoA 등의 델타-9-지방산불포화 효소 기질을 첨가함으로써, 선택 마커 없이도 형질 전환된 숙주세포의 선별이 가능하도록 할 수 있다.

또한, 상기 재조합 벡터는 발현물의 정제를 용이하게 하기 위한 서열을 포함할 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에서, 6HGST-NusA 히스티딘-택(His-taq)과 GST(MBP), NusA 등을 C-말단에 위치시켜 효소 단백질의 정제를 용이하게 하였다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 숙주세포에 도입한 형질전환체를 제공한다.

본 명세서에서 사용된 용어, "형질전환"은 "도입"과 동등한 의미로 사용되며, 사용된 방법과 관계없이 외래 폴리뉴클레오타이드를 숙주세포로 전달하는 것을 의미한다.

상기 숙주세포는 외래 유전자가 도입되어 외래 유전자의 형질을 나타낼 수 있는 능력을 갖추는 세포로, 원핵세포 또는 진핵세포일 수 있고, 구체적으로, 상기 원핵세포는 대장균일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 형질전환체는 BL21(DE3)/pET21a-6HGST-NusA 균주(기탁번호 KCTC14127bp)일 수 있다.

상기 재조합 벡터를 숙주세포로 형질전환 하는 방법은 재조합 벡터가 숙주세포 안으로 삽입되는 것이라면 특별히 제한되지는 않으며, 예를 들어, CaCl2 방법, 전기천공방법, 미세주입법 등이 가능하다.

나아가, 본 발명은 1) 상기 형질전환체를 배양하는 단계; 및 2) 상기 배양된 형질전환체로부터 델타-9-지방산불포화 효소(△-9-desaturase) KRICT-Rt9 단백질을 회수하는 단계;를 포함하는 델타-9-지방산불포화 효소 KRICT-Rt9 단백질의 제조방법을 제공한다.

상기 단계 1)의 형질전환체를 배양하는 단계에 있어서, 상기 형질전환체는 본 발명의 델타-9-지방산불포화 효소(△-9-desaturase) KRICT-Rt9 단백질을 발현시킬 수 있는 형질전환체로서, 상기 배양은 통상적으로 알려진 배양방법이 적용될 수 있고, 예를 들어 LB(Luria broth) 배지에서 배양할 수 있고, 상기 형질전환체를 선별적으로 증식시킬 수 있는 항생제를 포함한 LB 배지에서 배양할 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 형질전환체는 암피실린을 포함하는 LB 배지에서 배양된다.

또한, 상기 단계 1)에서 형질전환체를 배양하는 단계는 본 발명의 델타-9-지방산불포화 효소(△-9-desaturase) KRICT-Rt9 단백질 발현을 유도하는 추가의 유도물질을 처리하여 배양하는 단계일 수 있고, 예를 들어 IPTG(isopropyl-α-D-thiogalacto pyranoside) 등의 유도물질을 처리하여 배양할 수 있고, 바람직하게 IPTG를 최종농도가 0.01 내지 1 mM, 또는 0.05 내지 0.5 mM이 되도록 처리하여 배양할 수 있다.

상기 단계 2)의 상기 배양된 형질전환체로부터 델타-9-지방산불포화 효소(△-9-desaturase) KRICT-Rt9 단백질을 회수하는 단계에 있어서, 단백질을 회수하는 단계는 당업계의 통상적인 방식으로 수행될 수 있다. 예를 들어 염석(황산암모늄 침전, 인산나트륨 침전 등), 용매 침전(아세톤, 에탄올 등을 이용한 단백질 분획 침전 등), 투석, 겔 여과, 이온 교환, 크로마토그래피 및 한외여과 등의 기법을 단독 또는 조합으로 적용하여 수행될 수 있다.

본 발명의 델타-9-지방산불포화 효소 KRICT-Rt9 단백질의 제조방법은, 단계 2)의 회수는 Δ-9-desaturase KRICT-Rt9 단백질을 정제하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 델타-9-지방산불포화 효소 KRICT-Rt9 단백질을 정제하는 단계는 당업계의 통상적인 단백질 정제 방법으로 수행될 수 있고, 예를 들어 이온 교환 크로마토그래피, 겔-투과 크로마토그래피, 역상-고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography, HPLC), 프렙용 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) 및 친화성 컬럼 크로마토그래피 등의 방법으로 수행될 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 델타-9-지방산불포화 효소 KRICT-Rt9 단백질의 정제는 Ni-NTA 컬럼을 이용하여 수행된다.

상기 형질전환체는 본 발명의 델타-9-지방산불포화 효소 KRICT-Rt9 단백질을 발현하는 것으로서, 통상의 천연 유래의 델타-9-지방산불포화 효소 발현량 대비 높은 발현량을 나타내는 것을 의미하고, 특히 산업적으로 이용 가능한 수준의 높은 발현량을 갖는 것이되, 예를 들어 포화지방산을 불포화지방산으로 제조할 수 있는 최소한의 양 이상의 단백질을 발현시키는 것이다.

본 발명의 델타-9-지방산불포화 효소 KRICT-Rt9 단백질은 지방산의 말단 카복실기 작용기로부터 9번째 및 10번째 탄소 원자 사이에 이중결합을 생성함으로써 각종 기름 속에 존재하는 포화지방산을 불포화지방산으로 전환시킨다.

여기서, 상기 포화지방산은 예를 들어 적어도 탄소 수 10개 이상을 갖는 포화지방산을 가르키는 것일 수 있고, 바람직하게 12개 이상, 14개 이상 16개 이상, 18개 이상 또는 20개 이상의 탄소수를 갖는 포화지방산을 가르키는 것일 수 있고, 또는 10 - 30개, 10 - 25개, 또는 10 - 20개의 탄소수를 갖는 포화지방산, 또는 12 - 30개, 12 - 25개, 또는 12 - 20개의 탄소수를 갖는 포화지방산, 또는 14 - 30개, 14 - 25개, 또는 14 - 20개의 탄소수를 갖는 포화지방산, 16 - 30개, 16 - 25개, 또는 16 - 20개의 탄소수를 갖는 포화지방산 또는 16 - 18개의 탄소수를 갖는 포화지방산일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서 상기 포화지방산은 스테아르산(C18:0)이다. 한편, 상기 포화지방산은 상술한 탄소수에 대한 정의 이외에 추가적인 작용기를 갖거나, 방사성 동위원소로 치환된 형태 등에 특별히 제한되지 않고, 본 발명의 델타-9-지방산불포화 효소 KRICT-Rt9 단백질에 의하여 말단 카복실기 작용기로부터 9번째 및 10번째 탄소 원자 사이에 이중결합을 생성할 수 있는 것이라면 제한 없이 포함된다.

본 발명의 델타-9-지방산불포화 효소 KRICT-Rt9 단백질에 의하여 포화지방산은 말단 카복실기 작용기로부터 9번째 및 10번째 탄소 원자 사이에 이중결합을 갖는 불포화지방산으로 전환된다.

여기서, 상기 불포화지방산은 상술한 포화지방산의 말단 카복실기 작용기로부터 9번째 및 10번째 탄소 원자 사이에 이중결합을 갖는 형태의 불포화지방산인 것으로 이해될 수 있고, 예를 들어 포화지방산인 스테아르산(C18:0)을 불포화지방산인 올레산(C18:1, n-9)으로 전환 시킨다.

본 발명의 불포화지방산의 제조방법을 통하여 제조된 불포화지방산은 다양한 산업 공정에 원료 물질로 사용될 수 있고, 예를 들어, 에틸렌 복분해 기술을 이용하여 올레산 한 분자로부터 탄소 10개의 데센(dec-1-ene) 2분자를 생산하는 공정에 원료가 되는 올레산을 제공하는 등, 화학적으로 합성이 어렵고, 부가 가치가 높은 다양한 고분자 화학 산업 플랫폼으로 활용할 수 있다.

본 발명의 불포화지방산의 제조방법은 포화지방산인 천연 지질을 탄소 자원으로 활용하여 이를 산업적으로 고부가 가치를 갖는 불포화지방산으로 전환시키는 기술인 바, 지속 가능한 화학 기술이며, 이산화탄소 저감 녹색 화학 기술이다. 또한, 불포화지방산이 풍부한 기능성 식품과 천연의약품의 생산에도 적용할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기에 의해서 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 델타-9-지방산불포화 효소(△-9-desaturase) DNA 합성

곰팡이 Rhodotorula toruloides NP11로부터 델타-9-지방산불포화 효소(△-9-desaturase) 유전자(XP_016270987)를 주식회사 바이오니아에서 자체 개발한 HT-oligo™ 합성기를 사용해서 합성하였다.

XP_016270987 염기서열은 다음과 같다:

XP_016270987 아미노산 서열은 다음과 같다(서열번호 2):

기존의 XP_016270987 아미노산으로 구성된 단백질을 대장균에서 보다 효과적으로 발현시킬 수 있도록 상기 DNA 염기서열을 바탕으로, 코돈 최적화(codon optimization)를 수행하였다(Thermo-GeneArt).

새로운 DNA 염기서열은 서열번호 1과 같고, 델타-9-지방산불포화 효소(△-9-desaturase) KRICT-Rt9로 명명하였다.

도 1에 기존유전자 (XP_016270987Rt9FAD)와 새로운 델타-9-지방산불포화 효소(△-9-desaturase) KRICT-Rt9 (Thermo-GeneArt)의 DNA 염기서열을 비교하여 나타내었다.

도 1을 살펴보면, 마지막 열(concensus)의 빨간색으로 표기한 곳이 코돈 최적화 과정을 통하여 변형시킨 DNA 염기서열을 나타낸다. 전체적으로 본 발명의 새로운 델타-9-지방산불포화 효소(△-9-desaturase) KRICT-Rt9 (Thermo-GeneArt)의 DNA 염기서열은 기존유전자 XP_016270987Rt9FAD와 비교하여 21.8%가 변화된 새로운 DNA 염기서열을 나타낸다.

<실시예 2> 친화성 태그를 가진 GST (Gluathione S-transferase)와 NusA 유전자의 제작

본 발명의 델타-9-지방산불포화 효소(△-9-desaturase) KRICT-Rt9 단백질의 정제의 편의성을 위하여, 아래와 같은 유전자를 제작하였다.

N-말단에 6개의 히스티딘을 가지는 GST-NusA 유전자의 제작을 위하여 ㈜바이오프로젠에서 보유하고 있는 pB6HGST-NusA를 모형 사슬로 PCR(Polymerase Chain Reaction)을 수행하였다(Bio-Rad, GeneAmp PCR 2400, USA). PCR에 사용된 프라이머는 DNA 합성기(㈜바이오니아, HT-oligo™ 합성기, 한국)로 합성하였으며 염기서열은 다음과 같다.

5‘- GAT ATA CAT ATG CAT CAT CAT CAT CAT CAC TCC CCT ATA CTA GGT (N-말단 프라이머 : 프라이머 1, 서열번호 3)

5‘- CGG CGA TGT CCA TGG TGT GTT TAT CTT CAT CCA CCA CGA (C-말단 프라이머: 프라이머 2, 서열번호 4)

프라이머는 발현 벡터에 삽입될 수 있도록 Nde I 제한효소 절단 부위를 도입하였고 히스티딘 태그 6개와 GST(672 bp)와 NusA(909 bp) 일부가 발현될 수 있도록 설계하였으며 최종적으로 Nco I로 절단될 수 있도록 제한효소 절단 부위를 도입하였다. PCR로 얻어진 단편(단편 1:1,602bp)은 아가로오스 젤에서 분리하여 준비하였다(도 2).

<실시예 3> NusA와 Rt9FAD 유전자의 제작

실시예 2에서 제작된 단편 1과 연결하여 NusA-Rt9FAD 발현될 수 있도록 사용된 프라이머는 다음과 같다.

5‘- ATA AAC ACA CCA TGG ACA TCG CCG TTG AAG CCG GTA ATC (N-말단 프라이머 : 프라이머 3, 서열번호 5)

5‘- GTG GTG GTG CTC GAG TTA TGC TTT AAC TTT CAG GCT CAG (C-말단 프라이머 : 프라이머 4, 서열번호 6)

pET21a-NusA-Rt9FAD를 모형 사슬로 각각의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 프라이머는 6HGST-NusA에 연결될 수 있도록 Nco I 제한효소 절단 부위를 도입하였고 최종적으로 Xho I로 절단될 수 있도록 제한효소 절단 부위를 도입하였다. PCR로 얻어진 단편(단편 2:2,232 bp)은 아가로오스 젤에서 분리하여 준비하였다.

<실시예 4> 융합 Rt9FAD 발현 벡터의 제작

실시예 2와 3에서 PCR로 얻어진 두 단편(단편 1, 2 : 1,602bp, 2,232bp)은 제한효소 Nde I과 Nco I 그리고 Nco I과 Xho I으로 각각 절단하여 아가로오스 젤로 분리 후 준비하였다. 한편 pET21a(Merck Millipore사, 미국)를 Nde I과 Xhol I으로 절단하여 얻어진 약 5,500 염기쌍의 단편 3과 상기의 아가로오스 젤 상에서 분리한 단편 1, 2를 함께 리가아제로 연결하였다. 완성된 벡터는 T7 촉진인자와 T7 종결 인자에 의해 유전자의 번역이 이루어지고 GST-NusA와 융합된 Rt9FAD 유전자가 발현될 수 있도록 제작되었으며 플라스미드 pET21a-6HGST-NusA-Rt9FAD라고 명명하였다.

도 3과 같이 구축된 벡터는 대장균 BL21(DE3)에 형질전환 시켰다(Sambrook et al., 1989). 얻어진 형질전환체 E. coli BL21(DE3)/pET21a-6HGST-NusA-Rt9FAD는 생명공학연구소 유전자은행에 기탁번호 KCTC14127bp로 기탁 하였다.

<실시예 5> 융합 폴리펩타이드의 발현

형질전환체 E. coli BL21(DE3)/pET21a-6HGST-NusA-Rt9FAD는 LB(효모 추출물 0.5%, 트립톤 1%, NaCl 1%) 고체배지에서 배양하였다. 배양된 균체는 암피실린(ampicillin)이 50μg/mL 들어있는 LB 액체배지에 접종하여 OD₆₀₀ = 0.6까지 배양시킨 후 1mM 농도의 IPTG(Isopropyl-B-D-thiogalactopyranoside)를 첨가한 다음 4시간 더 배양하여 융합 Rt9FAD 유전자가 발현되도록 하였다.

<실시예 6> 융합 폴리펩타이드의 발현

실시예 5에서 얻은 배양액을 5,000rpm에서 5분간 원심분리하여 균체를 각각 회수하였다. 발현된 융합 Rt9FAD의 용해도를 알아보기 위하여 각각의 균체를 초음파 파괴(Branson사 Sonifier 450, 3 KHz, 3 watts, 5 min)하여 용해성 분획과 비용해성 분획으로 나누어 발현을 확인하였다.

구체적으로, 분리된 균체는 전체 분획, 용해성 분획, 비용해성 분획으로 나누어 단백질 용해 완충액(12mM Tris-Cl, pH 6.8, 5% glycerol, 2.88mM 머캅토 에탄올, 0.4% SDS, 0.02% 브로모페놀 블루) 100μl에 녹이고 100℃에서 5분간 가열하여 생성된 용액 중 각 10μl씩을 1mm 두께의 10% 분리 젤(separating gel; pH 8.8, 가로 20cm, 세로 10cm) 위에 5% 저장 젤(stacking gel; pH 6.8, 가로 10cm, 세로 12.0cm)을 덮은 폴리아크릴아마이드 젤에 로딩한 후 100~300V, 25mA로 1시간 동안 전기영동하고 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue R250) 염색액으로 염색하였다.

융합 Rt9FAD는 젤 스캐닝 결과(BioRad, Imaging Densitometer GS-700, USA) IPTG 유도 후 발현율은 약 18.3%였고 대부분이 용해성 분획에 존재하여 전체 발현량 중 80%가 용해성 분획에 존재하였다(도 4B). 그러나 기존 유전자(OriRt9FAD)를 대상으로 형질 전환시킨 경우, 동일한 벡터를 사용하여도 발현율은 약 3%로 확인되었으며, 발현 정도가 매우 적어 희미한 띠로 확인되었다(도 4A).

따라서, 기존 유전자로 형질 전환된 형질전환체의 단백질 발현 정도로는 해당 단백질을 산업적으로 이용하기에는 부적합하고, 특히 포화지방산으로부터 불포화지방산의 전환시켜 고부가 가치의 불포화지방산을 제공하는 공정에 사용하기에는 부적합했던 반면 본 발명의 융합 Rt9FAD는 산업적 이용에 적합하고, 불포화지방산을 제공하는 공정에 사용하기에도 적합한 수준의 높은 발현량을 갖는 것으로 확인되었다.

<실시예 7> 금속 친화성 크로마토그래피를 이용한 융합 Rt9FAD의 정제 및 한외여과

용해성 분획으로부터 융합 Rt9FAD를 분리하기 위해 6개의 히스티딘을 이용한 금속 친화성 크로마토그래피를 수행하였다. 레진은 QIAGEN사(독일)의 Ni-NTA를 사용하였고 칼럼은 Merck Millipore사(미국)의 G 20 X 250을 사용하였다. 충진 부피가 15mL가량 되도록 레진을 넣고 증류수로 충분히 씻어준 후 니켈용액(NiSO4)을 통과시키면 레진과 금속이온 간의 결합이 이루어진다. 결합을 이루지 못한 금속이온은 다시 증류수로 제거하였으며 50mM Tris-HCl, 0.15 M NaCl, pH 7.4 완충용액으로 평형화 시켰다. 여기에 4.0 mL/min의 유속으로 시료를 로딩한 후 완충용액으로 충분히 세척하고 0-500mM 이미다졸(imidazole) 농도 기울기를 주어 융합 단백질 분획을 회수하였다. 금속 친화성 칼럼에서 정제된 융합 Rt9FAD는 정제 중에 사용된 이미다졸 제거를 포함한 buffer 교환 및 농축을 위하여 한외여과를 수행하였다. 한외여과는 Merck Millipore사의 Amicon stirred cell system을 사용하였고 한외여과 막은 Merck Millipore사의 Biomax 50 kDa을 사용하였다(도 5).

<실시예 8> △-9-desaturase KRICT-Rt9 형질전환체 내의 지방산 분석

본 발명 △-9-desaturase KRICT-Rt9 도입 대장균 및 음성 대조군의 체내 지방산의 조성 변화를 GC(가스 크로마토그래피)를 이용하여 조사하였다. 불꽃이온화검출기(flame ionization detector) 및 모세관 컬럼(DB-1HT, capillary column)이 장착된 가스 크로마토그래피(Agilent Technologies, USA)를 이용하여 지방산 구성을 조사하였다.

실시예 5에서 배양한 대장균 및 음성 대조군의 대장균을 각각 원심분리 후, LB broth를 완전히 제거하고. 동결건조(freeze-dried) 시켜 각 시료 10mg을 지방산 분석에 이용하였다. 벡터만 발현하는 E. coli (음성 대조군)와 Δ-9-desaturase KRICT-Rt9 도입 대장균의 전체 지방산을 에탄올로 추출, 농축 분석하였고, 스테아르산과 올레산의 함량변화를 중심으로 표시하였다.

GC 분석은 DB-1HT 컬럼 (30 m x 0.32 mm x 0.1 m)으로 Agilent Technologies 7820A에서 수행되었다. 오븐 온도를 40 ℃에서 1분 동안 유지한 다음 12 ℃/분의 속도로 28.167분 동안 350℃로 조절하였다. 캐리어 가스는 유량 350 ml/분의 공기이고, 주입기는 1μL의 주입 부피로 1:20씩 분할되었고, 검출기는 350℃에서 불꽃 이온화 검출기(FID)를 사용하였다. 그 결과를 도 6에 표시하였고, 도 6의 결과를 정량하여 도 7에 그래프로 도시하였다.

도 6 및 도 7을 살펴보면, 분석결과 음성 대조군에 내재하였던 스테아르산은 본 발명 △-9-desaturase KRICT-Rt9 도입과 함께 피크가 사라졌고, 올레산은 음성 대조군에 내재하였던 양과 비교해서 Δ-9-desaturase KRICT-Rt9 도입 대장균에서는 3.25배 증가한 것으로 확인되었다. 이는 대장균에 내재하였던 포화지방산인 스테아르산(stearic acid, C18:0)이 Δ-9-desaturase KRICT-Rt9에 의해 불포화지방산인 올레산(oleic acid, C18:1, n-9)으로 전환되었음을 의미한다.

따라서, 본 발명에 따른 델타-9-지방산불포화 효소와 이를 발현하는 형질전환체로부터 각종 기름 속에 존재하는 포화지방산을 불포화지방산으로 전환할 수 있는 바, 장쇄 포화지방산의 산업적 이용성을 증대되며, 특히 스테아르산(C18:0)을 올레산(C18:1, n-9)으로 전환 시킴으로써 고부가 가치의 올레산 원료를 제공할 수 있는 바, 화학적으로 합성이 어렵고, 부가 가치가 높은 다양한 고분자 화학 산업 플랫폼으로 활용할 수 있다.

<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF CHEMICAL TECHNOLOGY <120> Nucleotide encoding delta-9-desaturase and use thereof <130> 2020P-02-038 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 395 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence encoding delta-9-desaturase KRICT-Rt9 obtainde after codon optimization <400> 1 mtassatshs vgaatttakr armrhdyttd vdssdsdaas dsgttavddg tyddnyvrkv 60 skktwknhrn wstatvayga ttkwtavwsv vyyyytggta gyhrwahrsy tasyaggsga 120 vgsvkwwsrg hrahhrytdt ddysakgwwa hgwmvkrrrg vadvsdnnnv vkwhryygmg 180 vtvaggwgdr ggagaarvhh stcvnsahwg tddkhtkdhw taatvggyhn hhsdyrnarw 240 wydtkwtmsk gasktdnkkg yamtkavara nwkssnhvtw ddacktrvva ghdvstdhgg 300 agktrgrdat tayggyydhs ngaanayrvg vggyvhmkky svvnkkhgad gvagksadvk 360 gktsvkgdks aetlakpptf setnllggls lkvka 395 <210> 2 <211> 545 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence for delta-9-desaturase KRICT-Rt9 <400> 2 Met Thr Ala Ser Ser Ala Leu Glu Thr Ser Leu Pro His Ser Val Gly 1 5 10 15 Pro Glu Ala Ala Thr Thr Thr Ala Lys Pro Pro Arg Ala Pro Leu Arg 20 25 30 Met Arg His Pro Asp Tyr Thr Gln Thr Asp Val Leu Asp Ser Ser Asp 35 40 45 Ser Asp Ala Ala Ser Asp Ser Glu Gly Glu Thr Thr Ala Val Asp Asp 50 55 60 Gly Thr Tyr Glu Asp Asp Asn Tyr Val Arg Lys Val Leu Ser Lys Glu 65 70 75 80 Lys Pro Leu Pro Pro Ile Thr Trp Lys Asn Ile His Arg Asn Ile Gln 85 90 95 Trp Ile Ser Thr Leu Ala Leu Thr Ile Val Pro Leu Leu Ala Ile Tyr 100 105 110 Gly Ala Phe Thr Thr Pro Leu Lys Trp Gln Thr Ala Val Trp Ser Val 115 120 125 Val Tyr Tyr Tyr Tyr Thr Gly Leu Gly Ile Thr Ala Gly Tyr His Arg 130 135 140 Leu Trp Ala His Arg Ser Tyr Thr Ala Ser Leu Pro Leu Gln Tyr Phe 145 150 155 160 Leu Ala Leu Gly Gly Ser Gly Ala Val Glu Gly Ser Val Lys Trp Trp 165 170 175 Ser Arg Gly His Arg Ala His His Arg Tyr Thr Asp Thr Asp Leu Asp 180 185 190 Pro Tyr Ser Ala Gln Lys Gly Phe Trp Trp Ala His Leu Gly Trp Met 195 200 205 Ile Val Lys Pro Arg Arg Arg Pro Gly Val Ala Asp Val Ser Asp Leu 210 215 220 Asn Asn Asn Pro Val Val Lys Trp Gln His Arg Tyr Tyr Leu Pro Leu 225 230 235 240 Ile Leu Gly Met Gly Phe Val Phe Pro Thr Ile Val Ala Gly Leu Gly 245 250 255 Trp Gly Asp Phe Arg Gly Gly Phe Phe Phe Ala Gly Ala Ala Arg Leu 260 265 270 Leu Phe Val His His Ser Thr Phe Cys Val Asn Ser Leu Ala His Trp 275 280 285 Leu Gly Glu Thr Pro Phe Asp Asp Lys His Thr Pro Lys Asp His Trp 290 295 300 Leu Thr Ala Leu Ala Thr Val Gly Glu Gly Tyr His Asn Phe His His 305 310 315 320 Glu Phe Pro Ser Asp Tyr Arg Asn Ala Leu Arg Trp Trp Gln Tyr Asp 325 330 335 Pro Thr Lys Leu Phe Ile Trp Thr Met Ser Lys Leu Gly Leu Ala Ser 340 345 350 Gln Leu Lys Thr Phe Pro Asp Asn Glu Ile Lys Lys Gly Gln Tyr Ala 355 360 365 Met Thr Leu Lys Ala Val Ala Arg Glu Ala Glu Asn Ile Glu Trp Pro 370 375 380 Lys Ser Ser Asn His Leu Pro Val Leu Thr Trp Asp Glu Phe Gln Asp 385 390 395 400 Ala Cys Lys Thr Arg Gln Leu Leu Val Val Ala Gly Phe Ile His Asp 405 410 415 Val Ser Thr Phe Ile Asp Gln His Pro Gly Gly Ala Gly Leu Ile Lys 420 425 430 Thr Arg Leu Gly Arg Asp Ala Thr Thr Ala Phe Tyr Gly Gly Tyr Tyr 435 440 445 Asp His Ser Asn Gly Ala Ala Asn Leu Leu Ala Gln Tyr Arg Val Gly 450 455 460 Val Ile Glu Gly Gly Tyr Glu Val Glu His Met Lys Lys Tyr Ser Glu 465 470 475 480 Val Val Glu Asn Leu Lys Lys His Gly Ala Asp Gly Val Ala Gly Lys 485 490 495 Ser Ala Asp Leu Val Lys Gly Pro Lys Gln Thr Ser Val Ile Lys Gly 500 505 510 Asp Pro Gln Leu Lys Ser Ala Pro Leu Glu Thr Leu Ala Lys Pro Pro 515 520 525 Thr Phe Ser Glu Thr Asn Leu Leu Gly Gly Leu Ser Leu Lys Val Lys 530 535 540 Ala 545 <210> 3 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N-terminal primer; primer 1 <400> 3 gatatacata tgcatcatca tcatcatcac tcccctatac taggt 45 <210> 4 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminal primer: primer 2 <400> 4 cggcgatgtc catggtgtgt ttatcttcat ccaccacga 39 <210> 5 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N-terminal primer: primer 3 <400> 5 ataaacacac catggacatc gccgttgaag ccggtaatc 39 <210> 6 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminal primer: primer 4 <400> 6 gtggtggtgc tcgagttatg ctttaacttt caggctcag 39

Claims

서열번호 1의 염기서열로 구성되는 로도토룰라(Rhodotorula) 속 유래 델타-9-지방산불포화 효소(△-9-desaturase) KRICT-Rt9 단백질을 암호화하는 유전자.
제1항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
제2항의 재조합 벡터를 숙주세포에 도입한 형질전환체로서, 상기 숙주세포는 대장균인 것을 특징으로 하는 형질전환체.
삭제
삭제
수탁번호 KCTC14127bp로 기탁된 대장균.
제6항에 있어서,
상기 대장균은 델타-9-지방산불포화 효소(△-9-desaturase) KRICT-Rt9 단백질을 발현하는 것을 특징으로 하는, 수탁번호 KCTC14127bp로 기탁된 대장균.
1) 제3항의 형질전환체를 배양하는 단계; 및
2) 상기 배양된 형질전환체로부터 델타-9-지방산불포화 효소(△-9-desaturase) KRICT-Rt9 단백질을 회수하는 단계;를 포함하는 델타-9-지방산불포화 효소 KRICT-Rt9 단백질의 제조방법.
제8항에 있어서, 상기 단계 2)의 회수는 델타-9-지방산불포화 효소 KRICT-Rt9 단백질을 정제하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 델타-9-지방산불포화 효소 KRICT-Rt9 단백질의 제조방법.
제3항의 형질전환체 또는 제8항의 제조방법으로부터 얻어진 델타-9-지방산불포화 효소 KRICT-Rt9 단백질을 이용하여 포화지방산으로부터 불포화지방산의 제조방법.
제10항에 있어서,
상기 포화지방산은 탄소 수 10개 이상의 포화지방산인 것을 특징으로 하는, 불포화지방산의 제조방법.
제10항에 있어서,
상기 제조방법은 상기 형질전환체 또는 상기 델타-9-지방산불포화 효소 KRICT-Rt9에 의해 포화지방산인 스테아르산(C18:0)을 불포화지방산인 올레산(C18:1, n-9)으로 전환시키는 것을 특징으로 하는, 불포화지방산의 제조방법.