CN105755017A

CN105755017A - 降低植物种子的饱和脂肪酸含量

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Publication number: CN105755017A
Application number: CN201610113323.0A
Authority: CN
Inventors: A.O.默洛; D.J.加科特; M.A.汤普森; T.A.沃尔什; S.贝文
Original assignee: Dow AgroSciences LLC
Current assignee: Corteva Agriscience LLC
Priority date: 2010-06-24
Filing date: 2011-06-24
Publication date: 2016-07-13
Also published as: CN103068986B; EP2585600B1; CL2016000902A1; MX338726B; TW201634696A; JP2013534826A; ZA201209083B; DK2862931T3; JP2016136957A; EP2585600A4; NZ700897A; CA2803098C; CN103068986A; TW201634694A; MX347113B; CA2999347A1; JP2016136958A; BR112012033112A2; AR081303A1; JP6301381B2

Abstract

本发明涉及降低植物种子的饱和脂肪酸含量。具体地，组合物和方法包括在植物细胞中遗传编码和表达新颖的delta?9去饱和酶。在一些实施方案中，在植物细胞中表达核酸以利用delta?9去饱和酶酶活性，使得植物种子中饱和脂肪酸的百分比组成降低，而且有伴随的ω?7脂肪酸增加的方法。在其它实施方案中，氨基酸序列具有delta?9去饱和酶活性。为了增加全植物、植物种子、和植物材料，例如种子中不常见脂肪酸的量,方法可以牵涉在植物细胞、植物材料、和全植物中表达delta?9去饱和酶。

Description

降低植物种子的饱和脂肪酸含量

本申请是2011年6月24日提交的申请号为201180040626.X(PCT申请号PCT/US2011/041897、发明名称为“降低植物种子的饱和脂肪酸含量”的发明专利申请的分案申请。

优先权要求

本申请是共同悬而未决的申请U.S.S.N.11/576,750(其是2005年10月7日提交，指定美国，并在2006年4月20日以PCT国际公开文本No.WO 2006/042049A2以英语公布的PCT国际专利申请No.PCT/US05/36052的进入国家阶段)的部分继续。PCT国际专利申请No.PCT/US05/36052是2004年10月8日提交的美国临时专利申请No.60/617,532的继续。本申请也是2010年6月24日提交的美国临时专利申请No.61/358,314的继续。

技术领域

一般而言，一些实施方案涉及某些delta-9去饱和酶酶、编码这些酶的核酸、和其在植物细胞中的表达方法。一些实施方案涉及利用某些delta-9去饱和酶酶的活性来降低植物材料(例如，种子)中饱和脂肪酸的百分比组成并增加ω-7脂肪酸的百分比组成。本文中还公开了通过具体实施方案中的方法生成的植物和植物材料。

背景技术

植物衍生的油已经逐渐替换动物衍生的油和脂肪作为饮食脂肪摄取的主要来源。然而，大多数工业化国家的饱和脂肪摄取仍然占总热量消费的约15％至20％。致力于促进更健康的生活方式，美国农业部(USDA)最近已经推荐饱和脂肪占日常热量摄取的小于10％。为了促进消费者意识，目前由USDA发布的标记准则现在要求每14g食物份(serving)小于1.0g的总饱和脂肪酸水平接受“低饱和”标签，而每14g食物份小于0.5g的总饱和脂肪酸水平接受“无饱和”标签。这意味着植物油的饱和脂肪酸含量分别需要小于7％和3.5％以接受“低饱和”(low-sat)或“无饱和”标签。由于这些准则的发布，消费者对“低饱和”和“无饱和”油的需要已经有猛增。至今，此需要已经主要以芸苔(canola)油，以及少得多的程度以向日葵和红花油满足。

虽然不饱和脂肪(单不饱和的和多不饱和的)是有益的(尤其在适度消费时)，但是饱和的和反式的脂肪不然。饱和脂肪和反式脂肪提高血液中不想要的LDL胆固醇水平。膳食胆固醇也提高LDL胆固醇，并且甚至可以在没有提高LDL的情况下促成心脏病。因此，可取的是，选择饱和脂肪、反式脂肪、和胆固醇低的食物作为健康饮食的一部分。

无论是植物还是动物起源的油的特征主要由油分子中碳和氢原子的数目，及脂肪酸链中包含的双键的数目和位置决定。自植物衍生的大多数油由不同量的棕榈酸(16:0)、硬脂酸(18:0)、油酸(18:1)、亚油酸(18:2)和亚麻酸(18:3)脂肪酸构成。常规地，棕榈酸和硬脂酸称为“饱和的”，这是因为其碳链以氢原子饱和，并且因此没有双键；它们含有有可能的最大数目的氢原子。然而，油酸、亚油酸、和亚麻酸是其中分别具有一个、两个和三个双键的18碳脂肪酸链。通常认为油酸单不饱和脂肪酸，而认为亚油酸和亚麻酸是多不饱和脂肪酸。U.S.D.A.将“无饱和”油产品定义为那些具有小于3.5％脂肪酸含量的产品，其以按重量计的组合饱和脂肪酸含量(与脂肪酸的总量相比)计算。

芸苔油具有所有植物油的最低水平饱和脂肪酸。“芸苔”指基于种子的总脂肪酸含量(优选地，至多0.5％(按重量计)，且最优选地，基本上为0％(按重量计))具有至多2％(按重量计)的芥酸(C22:1)含量，并且在压碎后生成含有小于30μmol/g脱脂(oil-free)粗粉的风干粗粉的油菜籽(芸苔属(Brassica))。与更传统的物种品种比较，这些类型的油菜籽根据其可食性区别。

假定在含油种子中，脂肪酸合成主要在质体中发生。脂肪酸合成的主要产物是棕榈酸酯(16:0)，其似乎有效延长为硬脂酸酯(18:0)。虽然仍在质体中，但是饱和脂肪酸然后可以受到称为酰基-ACP delta-9去饱和酶的酶去饱和，以引入一个或多个碳-碳双键。具体地，硬脂酸酯可以受到质体delta-9去饱和酶酶快速去饱和以产生油酸酯(18:1)。实际上，棕榈酸酯也可以被质体delta-9去饱和酶去饱和成棕榈油酸酯(16:1)，但是此脂肪酸在大多数植物油中仅以痕量(0-0.2％)出现。如此，质体中脂肪酸合成的主要产物是棕榈酸酯、硬脂酸酯、和油酸酯。在大多数油中，油酸酯是合成的主要脂肪酸，因为饱和脂肪酸以低得多的比例存在。

新合成的脂肪酸从质体输出至细胞质。随后植物脂肪酸在细胞质中的去饱和似乎限于油酸酯，其可以被微粒体去饱和酶去饱和成亚油酸酯(18:2)和亚麻酸酯(18:3)，所述微粒体去饱和酶对酯化为磷脂酰胆碱(PC)的油酰基或亚油酰基底物起作用。另外，根据植物，油酸酯可以通过延长(至20:1、22:1、和/或24:1)，或者通过添加官能团进一步修饰。然后，这些脂肪酸以及饱和脂肪酸棕榈酸和硬脂酸酯在内网状膜中装配成甘油三酯。

植物酰基-ACP delta-9去饱和酶酶是可溶的。它位于质体基质中，并且使用酯化为ACP(主要是硬脂酰-ACP)的新合成的脂肪酸作为底物。这与其它delta-9去饱和酶酶形成对比，所述其它delta-9去饱和酶酶位于内质网状膜(ER，或线粒体)中，使用酯化为Co-A的脂肪酸作为底物，并饱和脂肪酸棕榈酸酯和硬脂酸酯两者去饱和。美国专利5,723,595和6,706,950涉及植物去饱和酶。

已经将酵母delta-9去饱和酶基因自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)分离，克隆，并测序。Stukey等(1989)J.Biol.Chem.264:16537-44；Stukey等(1990)J.Biol.Chem.265:20144-9。已经将此酵母基因导入烟草叶组织中(Polashcok等(1991)FASEB J.5:A1157；Polashok等(1992)Plant Physiol.100:894-901)，并且在此组织中明显表达。此外，在马铃薯中表达此酵母基因。见Wang等(1996)J.Agric.Food Chem.44:3399-402；及Wang等(2001)Phytochemistry 58:227-32。虽然对使用此酵母delta-9去饱和酶基因的烟草和马铃薯两者报告了某些不饱和脂肪酸的一些增加及某些饱和脂肪酸的一些减少，但是烟草和马铃薯明显不是油类作物。也将此酵母基因导入油菜(Brassica napus)中。美国专利5,777,201。

已经将来自构巢曲霉(Aspergillus nidulans)的不同真菌酰基-CoA delta-9去饱和酶导入芸苔中，由此实现含油种子中降低的饱和脂肪酸水平。美国专利申请公开文本US 2008/0260933A1。构巢曲霉酰基-CoA delta-9去饱和酶在含油种子中对硬脂酸酯(61-90％)比对更丰富的棕榈酸酯脂肪酸(36-49％)提供更大的消减。

发明内容

本文中公开了新颖的真菌delta-9去饱和酶酶；包含编码此类去饱和酶的至少一种核苷酸序列的核酸；和包含前述物质之任一的植物、植物材料(例如，种子)、植物部分、和植物商品产品。一些实施方案的方面以自Magnaporthe grisea、颖枯小球腔菌(Leptosphaeria nodorum)、和美洲棉铃虫(Helicoverpa zea)分离的真菌delta-9去饱和酶酶例示。一些例子包括天然的和合成的delta-9去饱和酶，其对棕榈酸或硬脂酸具有底物偏爱。

一些实施方案包括编码包含与选自下组的序列至少80％相同的氨基酸序列的delta-9去饱和酶酶的分离的核酸分子：SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:72、和SEQ ID NO:73。在具体的例子中，核酸分子包含与选自下组的序列至少60％相同的序列：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQID NO:5、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:48、和SEQ ID NO:49。这些和其它实施方案可以包括包含与选自下组的序列至少80％相同的氨基酸序列的分离的delta-9去饱和酶多肽：SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:50、SEQID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:72、和SEQ ID NO:73。

还公开了在植物细胞中表达至少一种前述核酸和/或多肽的方法。具体的实施方案利用delta-9去饱和酶酶活性，使得饱和脂肪酸的百分比组成在自任何前述物质生成的植物、植物材料(例如，种子)、和/或包含植物细胞的植物部分、和/或植物商品产品中可以降低。在一些实施方案中，ω-7脂肪酸在植物、植物材料、植物部分、和/或植物商品产品中可以伴随增加。

一些实施方案包括用于减少植物、植物材料、植物部分、和/或植物商品产品中饱和脂肪酸量的方法，该方法包括用编码本发明的delta-9去饱和酶多肽的核酸分子转化植物细胞，使得细胞中的饱和脂肪酸量减少。一些实施方案包括用于创建遗传工程化植物的方法，所述遗传工程化植物与同一物种的野生型植物相比在植物中包含减少的饱和脂肪酸量。此类方法可以包括用编码本发明的delta-9去饱和酶多肽的核酸分子转化植物材料(或植物细胞)，并培养经转化的植物材料(或植物细胞)以获得植物。在具体的例子中，可以用编码本发明的delta-9去饱和酶多肽的核酸分子转化来自拟南芥物种的植物细胞和/或植物材料。

具体地，本申请提供如下各项：

1.一种分离的核酸分子，其编码包含与选自下组的序列至少80％相同的氨基酸序列的酶delta-9去饱和酶：SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:50、SEQID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:72、和SEQ ID NO:73。

2.项1的核酸分子，其中所述核酸分子包含与选自下组的序列至少60％相同的核苷酸序列：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:44、和SEQID NO:45。

3.项1的核酸分子，其进一步包含基因调节元件。

4.项3的核酸分子，其中所述基因调节元件选自下组：酿酒酵母delta-9去饱和酶启动子、delta-9去饱和酶3’UTR/终止子、ole1基因启动子、菜豆蛋白启动子、菜豆(Phaseolus vulgaris)菜豆蛋白5’非翻译区、菜豆菜豆蛋白3’非翻译区、菜豆菜豆蛋白基质附着区、根癌土壤杆菌ORF23 3’非翻译区、木薯叶脉花叶病毒启动子、根癌土壤杆菌ORF13’非翻译区、烟草(Nicotiana tabacum)RB7基质附着区、Overdrive、T链边界序列、LfKCS3启动子、FAE 1启动子、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、Myc标签、和血凝素标签。

5.一种分离的酶delta-9去饱和酶，其包含与选自下组的序列至少80％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQID NO:52、SEQ ID NO:72、和SEQ ID NO:73。

6.一种嵌合delta-9去饱和酶多肽，其包含SEQ ID NO:72和/或SEQ ID NO:73，其中所述多肽进一步包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:77和SEQ ID NO:78。

7.一种用于降低细胞中饱和脂肪酸量的方法，该方法包括：

用项1的核酸分子转化细胞，使得所述细胞中的饱和脂肪酸量降低。

8.依照项7的方法，其中所述细胞是酵母细胞。

9.依照项7的方法，其中所述细胞是植物细胞。

10.依照项9的方法，包括用项1的超过一种核酸分子转化所述植物细胞。

11.依照项9的方法，其中转化所述植物细胞将用于降低所述植物细胞中16:0-ACP水平的手段导入所述植物细胞中。

12.依照项11的方法，其中所述用于降低植物细胞中16:0-ACP水平的手段(mean)是质体外去饱和酶。

13.项12的方法，其中所述质体外去饱和酶是选自下组的去饱和酶：LnD9DS去饱和酶、AnD9DS去饱和酶、HzD9DS去饱和酶、和MgD9DS去饱和酶。

14.依照项9的方法，其中所述植物细胞选自自下组选择的属：拟南芥属(Arabidopsis)、琉璃苣属(Borago)、芸苔(Canola)、蓖麻属(Ricinus)、可可树属(Theobroma)、玉蜀黍属(Zea)、棉属(Gossypium)、两节荠属(Crambe)、萼距花属(Cuphea)、亚麻属(Linum)、小滨菊属(Lesquerella)、鲸油草(Limnanthes)、Linola、旱金莲属(Tropaeolum)、月见草属(Oenothera)、木樨榄属(Olea)、油棕属(Elaeis)、落花生属(Arachis)、油菜籽(rapeseed)、红花属(Carthamus)、大豆属(Glycine)、野生大豆(Soja)、向日葵属(Helianthus)、烟草属(Nicotiana)、斑鸠菊属(Vernonia)、小麦属(Triticum)、大麦属(Hordeum)、稻属(Oryza)、燕麦属(Avena)、高粱属(Sorghum)、黑麦属(Secale)、和禾本科(Gramineae)的其它成员。

15.一种含油种子植物，其包含项1的核酸序列。

16.一种植物种子，其表达选自下组的质体外去饱和酶：SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、和SEQ ID NO:52。

17.一种转基因油菜(Brassica napus)系的种子，所述种子相对于所述转基因油菜系的等基因型式具有降低的16:0水平。

18.一种用于创建遗传工程化植物的方法，所述遗传工程化植物与野生型植物相比在所述植物中包含降低的饱和脂肪酸量，所述方法包括：

用项1的核酸分子转化植物材料；并

培养经转化的植物材料以获得植物。

19.依照项18的方法，其中所述植物选自自下组选择的属：拟南芥属(Arabidopsis)、琉璃苣属(Borago)、芸苔(Canola)、蓖麻属(Ricinus)、可可树属(Theobroma)、玉蜀黍属(Zea)、棉属(Gossypium)、两节荠属(Crambe)、萼距花属(Cuphea)、亚麻属(Linum)、小滨菊属(Lesquerella)、鲸油草属(Limnanthes)、Linola、旱金莲属(Tropaeolum)、月见草属(Oenothera)、木樨榄属(Olea)、油棕属(Elaeis)、落花生属(Arachis)、油菜籽(rapeseed)、红花属(Carthamus)、大豆属(Glycine)、野生大豆(Soja)、向日葵属(Helianthus)、烟草属(Nicotiana)、斑鸠菊属(Vernonia)、小麦属(Triticum)、大麦属(Hordeum)、稻属(Oryza)、燕麦属(Avena)、高粱属(Sorghum)、黑麦属(Secale)、和禾本科(Gramineae)的其它成员。

20.通过项18的方法获得的植物。

21.自项20的植物获得的植物材料。

22.项21的植物材料，其中所述植物材料是种子。

前述和其它特征从几个实施方案的以下详细描述及参照进行的附图看会变得更加显而易见。

附图简述

图1包括对多种真菌去饱和酶蛋白质序列的示意性系统发生分析。将描绘的去饱和酶的完整蛋白质序列使用ClustalX比对，并使用MEGA展示。

图2a-图2d包括真菌delta-9去饱和酶基因序列的比对。大写字体代表此比对中的保守核苷酸。阴影字体代表此比对中的相同核苷酸。

图3a-图3b包括真菌delta-9去饱和酶多肽的比对。

图4-18包括包含可用于一些实施方案的真菌delta-9去饱和酶多肽编码核苷酸序列的例示性质粒的质粒图。图4明确包括包含LnD9DS-2编码(图4a；pDAB110110)和HzD9DS编码(图4b；pDAB110112)核苷酸序列且进一步包含PvPhas 5’UTR和PvPhas 3’UTR的例示性质粒的质粒图。

图19包括的数据显示了来自用某些例示性真菌delta-9去饱和酶基因序列转化的植物的例示性T₂拟南芥种子的总饱和脂肪酸含量(％FAMEs)。

图20包括的数据显示了来自用某些例示性真菌delta-9去饱和酶基因序列转化的植物的例示性T₂拟南芥种子的棕榈酸(C16:0)含量(％FAME)。

图21包括的数据显示了来自用某些例示性真菌delta-9去饱和酶基因序列转化的植物的例示性T₂拟南芥种子的硬脂酸(C18:0)含量(％FAME)。

图22包括的数据显示了来自用某些例示性真菌delta-9去饱和酶基因序列转化的植物的例示性T₂拟南芥种子的棕榈油酸(C16:1)含量(％FAME)。

图23包括来自用pDAB7319(AnD9DS v3和LnD9DS-2 v2)或pDAB7324(AnD9DS v3和HzD9DS v2)转化的芸苔植物的发育种子中HzD9DS和LnD9DS-2mRNA转录物(相对于AnD9DS转录物)积累的图示。相对于肌动蛋白转录物水平测定每种基因的qRT-PCR ΔΔCt，然后相对于每种样品中AnD9DS转录物的水平标准化HzD9DS和LnD9DS-2转录物的量。

序列表

所附序列表中列出的核酸序列使用如37C.F.R.§1.822中限定的核苷酸碱基的标准字母缩写显示。仅显示每种核酸序列的一条链，但是互补链理解为通过对展示链的任意提及而包括在内。在所附序列表中：

SEQ ID NO:1显示了用于PCR扩增Magnaporthe grisea酰基-CoA delta-9去饱和酶基因(在一些地方称为MgD9DS)片段的正向引物。

SEQ ID NO:2显示了用于PCR扩增M.grisea酰基-CoA delta-9去饱和酶基因(在一些地方称为MgD9DS)片段的反向引物。

SEQ ID NO:3显示了通过PCR扩增的M.grisea酰基-CoA delta-9去饱和酶基因(在一些地方称为MgD9DS)的例示性片段。

SEQ ID NO:4显示了例示性的无内含子的MgD9DS克隆。

SEQ ID NO:5显示了编码第一颖枯小球腔菌酰基-CoA delta-9去饱和酶(在一些地方称为LnD9DS-1)的例示性核酸序列。

SEQ ID NO:6和7显示了可以用于一些实施方案的引物序列。

SEQ ID NO:8显示了显示了编码第二例示性颖枯小球腔菌酰基-CoA delta-9去饱和酶(在一些地方称为LnD9DS-2)的例示性核酸序列。

SEQ ID NO:9显示了来自M.grisea的例示性天然delta-9去饱和酶基因(标记为MgD9DS v1)的编码区。

SEQ ID NO:10显示了来自美洲棉铃虫的例示性天然delta-9去饱和酶基因(标记为HzD9DS v1)的编码区。

SEQ ID NO:11显示了来自颖枯小球腔菌的例示性天然delta-9去饱和酶(LnD9DS-2 v1)基因的编码区。

SEQ ID NO:12显示了来自M.grisea的例示性天然delta-9去饱和酶(MgD9DS)的氨基酸序列。

SEQ ID NO:13显示了来自美洲棉铃虫的例示性天然delta-9去饱和酶(HzD9DS)的氨基酸序列.

SEQ ID NO:14显示了来自颖枯小球腔菌的例示性天然delta-9去饱和酶(LnD9DS-2)的氨基酸序列。

SEQ ID NO:15显示了例示性的经芸苔优化的来自M.grisea的delta-9去饱和酶基因(MgD9DS v2)的序列。

SEQ ID NO:16显示了例示性的经芸苔优化的来自美洲棉铃虫的delta-9去饱和酶基因(HzD9DS v2)的序列。

SEQ ID NO:17显示了例示性的经芸苔优化的来自颖枯小球腔菌的delta-9去饱和酶基因(LnD9DS-2 v2)的序列。

SEQ ID NO:18-39显示了可以用于一些实施方案的引物和探针的序列。

SEQ ID NO:40-43显示了可以在一些实施方案中用于提高表达的例示性备选Kozak序列。

SEQ ID NO:44显示了别的例示性的经芸苔优化的来自颖枯小球腔菌的delta-9去饱和酶基因(LnD9DS-2 v3)的序列。

SEQ ID NO:45显示了别的例示性的经芸苔优化的来自美洲棉铃虫的delta-9去饱和酶基因(HzD9DS v3)的序列。

SEQ ID NO:46显示了Myc标签的氨基酸序列。

SEQ ID NO:47显示了HA标签的氨基酸序列。

SEQ ID NO:48显示了编码构巢曲霉delta-9去饱和酶(在一些地方称为AnD9DSv2)的例示性核酸序列。

SEQ ID NO:49显示了编码构巢曲霉delta-9去饱和酶(在一些地方称为AnD9DSv3)的第二种例示性核酸序列。

SEQ ID NO:50显示了如以SEQ ID NO:48-49(AnD9DS)例示的核酸编码的氨基酸序列。

SEQ ID NO:51显示了另一种例示性AnD9DS去饱和酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO:52显示了来自酿酒酵母的例示性天然delta-9去饱和酶(ScOLE1)的氨基酸序列。

SEQ ID NO:53-66显示了可以用于一些实施方案的质粒。

SEQ ID NO:67-71包括可以用于一些实施方案的几种核酸调节控制元件。

SEQ ID NO:72显示了例示性AnD9DS去饱和酶的N端68个残基(1-68)。

SEQ ID NO:73显示了例示性AnD9DS去饱和酶的C端175个残基(281-455)。

SEQ ID NO:74显示了质粒pDAB110110的图。

SEQ ID NO:75显示了质粒pDAB110112的图。

SEQ ID NO:76显示了编码例示性M.grisea酰基-CoA delta-9去饱和酶(在一些地方称为MgD9DS)的例示性核酸序列。

SEQ ID NO:77显示了来自颖枯小球腔菌的例示性天然delta-9去饱和酶SEQ IDNO:14内包含的氨基酸序列。

SEQ ID NO:78显示了来自美洲棉铃虫的例示性天然delta-9去饱和酶SEQ ID NO:13内包含的氨基酸序列。

具体实施方案

I.几个实施方案的概述

我们先前将来自构巢曲霉的真菌酰基-CoA delta-9去饱和酶导入芸苔中，由此实现种子油中降低的饱和脂肪酸水平。美国专利申请公开文本US 2008/0260933A1。构巢曲霉delta-9去饱和酶在种子油中对硬脂酸酯(61-90％)比对更丰富的棕榈酸酯脂肪酸(36-49％)提供更大的消减。因此，优先对棕榈酸酯饱和物起作用的delta-9去饱和酶的共导入会通过互补构巢曲霉delta-9去饱和酶的硬脂酸酯优选活性来实现总饱和物的进一步降低。在本发明的一些实施方案中，公开了具有一定底物特异性范围的真菌delta-9去饱和酶多肽。具体的实施方案包括棕榈酸酯优选性delta-9去饱和酶(例如，如本文中公开的天然真菌酶，或其功能性等同物；和设计为具有棕榈酸底物偏爱的合成多肽)。

本文中公开了编码delta-9去饱和酶多肽的核酸分子，其包含与选自下组的序列至少60％相同的核苷酸序列：SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:8,SEQID NO:9,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:17,SEQID NO:44,SEQ ID NO:45,SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49。在一些实施方案中，核酸分子可以进一步包含与delta-9去饱和酶多肽编码序列可操作连接的基因调节元件。在具体的实施方案中，基因调节元件可以是菜豆蛋白启动子、菜豆蛋白5’非翻译区、菜豆蛋白3’非翻译区、根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)ORF1 3’非翻译区、木薯叶脉花叶病毒启动子、烟草(Nicotiana tabacum)RB7基质附着区、T链边界序列、LfKCS3启动子、和FAE 1启动子。

还公开了delta-9去饱和酶多肽及编码此类delta-9去饱和酶多肽的核酸分子，所述delta-9去饱和酶多肽包含与选自下组的序列至少80％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:50,SEQ ID NO:52,SEQ ID NO:72和SEQ IDNO:73。

在一些实施方案中，可以在植物材料、细胞、组织、或全植物中表达核酸分子和delta-9去饱和酶多肽，以相对于同一物种的野生型植物中观察到的量，减少植物材料、细胞、组织、或全植物中饱和脂肪酸的量。本发明的备选实施方案包括用于减少植物材料、细胞、组织、或全植物中饱和脂肪酸量的方法。此类方法可以包括用至少一种前述核酸分子转化植物材料、细胞、组织、或全植物，使得植物材料、细胞、组织、或全植物中饱和脂肪酸的量减少。具体的实施方案包括用于优先减少植物材料、细胞、组织、或全植物中棕榈酸和/或硬脂酸脂肪酸的方法。

例如，可以对植物、或自植物衍生的植物材料(例如，拟南芥属的植物，或芸苔)实施本文中所公开的方法。一个具体的实施方案涉及用于创建或再生遗传工程化植物的方法，所述遗传工程化植物与同一物种的野生型植物相比在植物中包含减少的饱和脂肪酸量，所述方法包括用至少一种前述核酸分子转化植物细胞或材料；并培养经转化的植物材料以获得植物。还公开了通过任何前述方法获得的植物、植物材料、植物细胞、和种子。

II.缩写

x:yΔ^z 含有x个碳和从羧基端开始数起第z位的y个双键的脂肪酸

ACP 酰基载体蛋白

COA 辅酶A

FA 脂肪酸

FAM 荧光素

FAS 脂肪酸合成

FAME 脂肪酸甲酯

KASII β-酮脂酰-ACP合酶II

MUFA 单不饱和脂肪酸

WT 野生型

III.术语

脂肪酸：如本文中使用的，术语“脂肪酸”指例如从约C12至C22的不同链长的长链脂肪族酸(链烷酸)，尽管更长和更短链长的酸两者是已知的。脂肪酸的结构以符号x:yΔ^z表示，其中“x”是特定脂肪酸中碳(C)原子的总数，且“y”是碳链中如从该酸的羧基端开始数起的第“z”位中的双键数目。

代谢途径：术语“代谢途径”指细胞内存在的、由酶催化以实现代谢产物转化或另一代谢途径启动的一系列化学反应。代谢途径可以牵涉几个或许多步骤，并且可以与不同代谢途径竞争特定反应底物。类似地，一种代谢途径的产物可以是又一代谢途径的底物。

代谢工程：出于本发明的目的，“代谢工程”指改变细胞中的一种或多种代谢途径，使得在细胞中运行的总代谢途径的总体方案内实现将初始底物逐步修饰为具有期望的精确化学结构的产物的理性策略设计。

去饱和酶：如本文中使用的，术语“去饱和酶”指可以在一种或多种脂肪酸中去饱和(即，引入双键)以生成感兴趣的脂肪酸或前体的多肽。植物可溶性脂肪酸去饱和酶酶可以将双键区域专一性引入饱和的酰基-ACP底物中。酰基-CoA去饱和酶将双键区域专一性引入饱和的脂肪酰基-CoA底物中。该反应牵涉通过由形成去饱和酶构造核心的四螺旋束配位的两电子还原性二铁中心活化分子氧。一些实施方案中特别感兴趣的是酰基-CoA delta-9去饱和酶。

delta-9-18:0¹-ACP去饱和酶是所有植物维持膜流动性需要的。虽然此酶主要使硬脂酰-ACP去饱和，但是它在棕榈酰-ACP的情况中也在微小的程度上有活性。

变体去饱和酶：如本文中使用的，术语“变体去饱和酶”涵盖展现出与在生成不常见的脂肪酸中的作用一致的比活谱的那些去饱和酶。变体去饱和酶可以自生物体分离，经由定向进化程序来工程化改造，或者工程化改造为掺入来自一种或多种表征过的去饱和酶的保守氨基酸的合成去饱和酶。

后代植物：出于本发明的目的，“后代植物”指可以通过植物育种方法获得的任何植物，或自其获得的植物材料。植物育种方法是本领域中公知的，并且包括天然育种、人工育种、牵涉DNA分子标志分析的选择育种、转基因学、和商业育种。

植物材料：如本文中使用的，术语“植物材料”指自植物获得的任何细胞或组织。

核酸分子：核苷酸的聚合形式，其可以包括RNA的有义和反义链两者、cDNA、基因组DNA、和上述物质的合成形式和混合的聚合物。核苷酸指核糖核苷酸、脱氧核苷酸、或任一类核苷酸的经修饰形式。如本文中使用的，“核酸分子”与“核酸”和“多核苷酸”是同义的。该术语包括DNA的单链和双链形式。核酸分子可以包括通过天然存在的和/或非天然存在的核苷酸联接连接在一起的天然存在的和经修饰的核苷酸之任一或两者。

核酸分子可以经过化学或生物化学修饰，或者可以含有非天然的或衍生化的核苷酸碱基，如本领域普通技术人员容易领会的。此类修饰包括例如标记物、甲基化、用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸、核苷酸间修饰，诸如不带电荷的连接(例如，膦酸甲酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯，等等)、带电荷的连接(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯，等等)、悬垂的模块(moiety)(例如，肽)、插入剂(例如，吖啶、补骨脂素，等等)、螯合剂、烷化剂(alkylator)、和经修饰的连接(例如，alpha异头核酸，等等)。术语“核酸分子”还包括任何拓扑学构象，包括单链、双链，部分双链体、三联体、发夹、环形和挂锁构象。

可操作连接的：当第一核酸序列在与第二核酸序列的功能性关系中时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作连接。例如，若启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子与编码序列可操作连接。在重组生成时，可操作连接的核酸序列一般是连续的，且在必需连接两个蛋白质编码区时，在同一阅读框中。然而，核酸为了可操作连接不需要是连续的。

调节元件：如本文中使用的，术语“调节元件”指具有基因调节活性的核酸分子；即具有影响可操作连接的可转录核酸分子的转录或翻译的能力的核酸分子。调节元件诸如启动子、前导物、内含子和转录终止区是具有基因调节活性的非编码核酸分子，其在活细胞的总体基因表达中发挥不可或缺的作用。因此，在植物中发挥功能的分离的调节元件可用于经由分子工程化技术修饰植物表型。“调节元件”意指决定是否表达特定基因、何时表达特定基因、及以何种水平表达特定基因的一系列核苷酸。调节DNA序列与调节蛋白或其它蛋白质特异性相互作用。

如本文中使用的，术语“基因调节活性”指能够影响可操作连接的核酸分子的转录或翻译的核酸分子。具有基因调节活性的分离的核酸分子可以提供可操作连接的核酸分子的时间或空间表达或调控表达水平和速率。具有基因调节活性的分离的核酸分子可以包括启动子、内含子、前导物、或3’转录终止区。

启动子：如本文中使用的，术语“启动子”指牵涉RNA聚合酶II或其它蛋白质诸如转录因子(调节转录的反式作用蛋白因子)的识别和结合以启动可操作连接的基因转录的核酸分子。启动子可以自身含有招致可操作连接的基因转录的亚元件诸如顺式元件或者增强子域。“植物启动子”是在植物细胞中功能性的天然的或非天然的启动子。可以使用植物启动子作为5’调节元件以调控一种或多种可操作连接的基因表达。植物启动子可以以其时间、空间、或发育表达模式限定。本文中所描述的核酸分子可以包含含有启动子的核酸序列。

序列同一性：如本文中在两种核酸或多肽序列的背景中所使用的，术语“序列同一性”或“同一性”可以指两种序列中在规定的比较窗里为了实现最大对应性而比对时相同的残基。

两种核酸序列间或两种氨基酸序列间的相似性按照序列间共享的序列同一性水平表示。序列同一性通常按照百分比同一性表示；百分比越高，两种序列越相似。用于比对比较序列的方法在下文详细描述。

在提及蛋白质使用序列同一性百分比时，认可的是，不相同的残基位置经常相差保守的氨基酸取代，其中氨基酸残基用具有类似化学特性(例如，电荷、疏水性或空间效应)的其它氨基酸残基取代，并且因此不改变分子的功能特性。

因此，在序列相差保守取代时，百分比序列同一性可以向上调节以校正不相同残基位点处取代的保守性质。相差此类保守取代的序列被说成具有“序列相似性”或“相似性”。用于进行此调节的技术是本领域普通技术人员公知的。通常，此类技术牵涉将保守取代评分为部分的，而不是完全的匹配，由此增加百分比序列同一性。例如，在对相同的氨基酸给予0-1的得分，而对非保守取代给予0得分的情况中，对保守取代给予0-1的得分。可以计算保守取代的得分，例如如程序PC/GENE(Intelligenetics,Mountain View,CA)中执行的。

如本文中所使用的，术语“序列同一性百分比”可以指在比对窗里比较两个最佳比对序列时测定的数值，其中为了两个序列的最佳比对，比较窗中序列的部分与参照序列(其不包含添加或缺失)相比可以包含添加或缺失(即，缺口)。通过测定两个序列中存在相同核苷酸或氨基酸残基的位置的数目以产生匹配位置数目，将匹配位置的数目除以比较窗中位置的总数，并将结果乘以100以产生序列同一性百分比来计算百分比。

氨基酸序列中的类似位置：可以通过前述段落中所描述的方法比对核酸和氨基酸序列。在比对时，若各位置在共有序列内是相同的，则一个序列中的位置与比对序列中的位置在“类似位置”中。

用于比对比较序列的方法是本领域中公知的。各种程序和比对算法记载于：Smith和Waterman,Adv.Appl.math.2:482,1981；Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.48:443,1970；Pearson和Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444,1988；Higgins和Sharp,Gene 73:237-44,1988；Higgins和Sharp,CABIOS 5:151-3,1989；Corpet等,Nucleic AcidsResearch 16:10881-10890,1988；Huang,等,Computer Applications in theBiosciences 8:155-65,1992；Pearson等,Methods in Molecular Biology 24:307-31,1994；Tatiana等,FEMS Microbiol.Lett.,174:247-50,1990.Altschul等,J.Mol.Biol.215:403-10,1990(详细考虑序列比对方法和同源性计算)。

国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)基本局部比对搜索工具(BLAST)在因特网上可获得(于blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，其与序列分析程序，例如blastp和blastn结合使用。关于如何使用此程序测定序列同一性的描述在因特网上经由NCBI于blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？CMD＝Web&PAGE_TYPE＝BlastDocs可获得。

为了比较氨基酸序列，使用缺省参数采用BLAST程序的“Blast 2种序列(Blast2sequence)”功能(bl2seq)。特定参数可以在本领域技术人员的判断内调节，以例如提供错配罚分或匹配奖励。

经转化的：如本文中使用的，术语“经转化的”指已经接受外来核酸分子，诸如构建体导入的细胞、组织、器官、或生物体。可以将导入的核酸分子整合入接受细胞、组织、器官或生物体的基因组DNA中，使得导入的多核苷酸分子得到后续后代继承。“转基因”或“经转化”细胞或生物体还包括所述细胞或生物体的后代和自在例如杂交中采用此类转基因植物作为亲本的育种程序生成并展现出源自存在外来核酸分子的改变的表型的后代。

IV.减少宿主细胞、组织、或生物体中饱和脂肪酸的代谢工程方法

A.概述

本发明的一个实施方案包括在植物种子中引入具有特定酰基-CoA偏爱(例如，对于棕榈酸或硬脂酸)的delta-9去饱和酶。delta-9去饱和酶的特定酰基-CoA偏爱实现对某些特定饱和脂肪酸集合(例如，棕榈酸酯，用于转化成单不饱和产物)的靶向。选择酰基-CoAdelta-9去饱和酶来降低植物中的饱和脂肪酸含量，因为它们通常不以任何可察觉的程度在植物系统中生成。

B.多肽

依照本发明的一些实施方案的多肽包含如下的氨基酸序列，其在与选自下组的序列比对时显示增加的百分比同一性：SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:14,SEQ IDNO:50,SEQ ID NO:52,SEQ ID NO:72和SEQ ID NO:73。这些和其它实施方案内的特定氨基酸序列可以包含与前述序列具有例如至少约70％,约75％,约80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％96％,97％,98％,99％或100％同一性的序列。在许多实施方案中，在与前述序列比对时具有前述序列同一性的氨基酸序列编码具有delta-9-18:0-ACP去饱和酶酶促活性的肽，或此类肽的部分。

C.核酸

一些实施方案包括编码上文所描述的多肽的核酸分子。例如，一些实施方案中的核酸序列在与选自下组的序列比对是显示增加的百分比同一性：SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:44,SEQ ID NO:45,SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49。这些和其它实施方案内的特定核酸序列可以包含与选自下组的序列具有例如至少约60％,约65％,约70％,约75％,约80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％96％,97％,98％,99％或100％同一性的序列：SEQID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10,SEQ IDNO:11,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:44,SEQ ID NO:45,SEQ IDNO:48和SEQ ID NO:49。本领域普通技术人员理解的是，可以例如通过依照密码子简并性引入可允许的核苷酸取代在不实质性改变编码多肽的氨基酸序列的情况中修饰核酸分子。

在一些实施方案中，本发明的核酸分子包含基因调节元件(例如，启动子)。启动子可以基于会接受载体构建体插入的细胞类型选择。在细菌、酵母和植物中发挥功能的启动子是本领域中公知的。启动子也可以基于其调节特征进行选择。此类特征的例子包括增强转录活性、可诱导性、组织特异性、和发育阶段特异性。在植物中，已经描述了病毒或合成起源的诱导型、组成性活性、时间调节性、和空间调节性启动子。见例如Poszkowski等(1989)EMBO J.3:2719；Odell等(1985)Nature 313:810；及Chau等(1989)Science 244:174-81)。

有用的诱导型启动子包括例如由通过应用安全剂(取代的苯磺酰胺除草剂)诱导的水杨酸或聚丙烯酸诱导的启动子、热休克启动子、自菠菜硝酸盐还原酶可转录核酸分子序列衍生的硝酸盐诱导型启动子、激素诱导型启动子、和与RuBP羧化酶的小亚基和LHCP家族结合的光诱导型启动子。

有用的组织特异性、发育调节性启动子的例子包括β-伴大豆球蛋白(conglycinin)7Sα启动子和种子特异性启动子。可用于在种子质体中优先表达的植物功能性启动子包括那些来自牵涉含油种子中脂肪酸生物合成的蛋白质和来自植物储存蛋白的。此类启动子的例子包括来自可转录核酸分子序列诸如菜豆蛋白、油菜籽蛋白、玉米醇溶蛋白、大豆胰蛋白酶抑制剂、ACP、硬脂酰-ACP去饱和酶、和油质蛋白的5’调节区。另一种例示性的组织特异性启动子是种子组织特异性的凝集素启动子。

其它有用的启动子包括胭脂氨酸合酶、甘露氨酸合酶、和章鱼碱合酶启动子(其在根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的肿瘤诱导质粒上携带)；花椰菜花叶病毒(CaMV)19S和35S启动子；增强型CaMV 35S启动子；玄参花叶病毒35S启动子；来自核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(ssRUBISCO)小亚基的光诱导型启动子；来自烟草的EIF-4A启动子(Mandel等,(1995)Plant Mol.Biol.29:995-1004)；玉米蔗糖合成酶；玉米醇脱氢酶I；玉米光收获复合物(light harvesting compolex)；玉米热休克蛋白；来自拟南芥的几丁质酶启动子；LTP(脂质转移蛋白)启动子；矮牵牛查耳酮异构酶；豆富含甘氨酸的蛋白1；马铃薯patatin；泛素启动子；和肌动蛋白启动子。优选地，有用的启动子是种子选择性的、组织选择性的、或诱导型的。种子特异性调节在例如EP 0 255 378中有讨论。

为了获得更高的异源基因表达，可以优选的是再工程化改造基因，使得它在表达宿主细胞(例如，植物细胞，例如，芸苔、稻、烟草、玉米、棉、和大豆)中更有效地表达。因此，设计植物表达的编码delta-9去饱和酶的基因中任选的额外步骤(即，在提供一种或多种基因调节元件外)是为了最佳表达而再工程化改造异源基因蛋白质编码区。具体的实施方案包括再设计的基因，其经过优化以提高在转基因芸苔植物细胞或拟南芥植物细胞中，而不是在用天然存在的异源基因序列转化的芸苔植物细胞或拟南芥植物细胞中的表达水平(即，生成更多蛋白质)。

由于由遗传密码的冗余性/简并性提供的可塑性(即，一些氨基酸由超过一种密码子规定)，不同生物体或生物体类中的基因组进化已经导致同义密码子的差别选择。此“密码子偏爱”在蛋白质编码区的平均碱基组成中得到反映。例如，具有含相当较低G+C含量的基因组的生物体利用更多的在同义密码子的第三位具有A或T的密码子，而那些具有较高G+C含量的生物体利用更多的在第三位具有G或C的密码子。此外，认为mRNA内“次要”密码子的存在可以降低所述mRNA的绝对翻译速率，尤其在与次要密码子对应的带电荷的tRNA的相对丰度较低时。此推理的延伸是通过个别次要密码子降低翻译速率对于多种次要密码子至少会是叠加的。因此，在特定表达宿主中具有相对较高次要密码子含量的mRNA会具有相应较低的翻译速率。此速率可以通过编码蛋白质的相应低水平反映。

在工程化改造编码delta-9去饱和酶的优化基因以在芸苔或拟南芥(或其它植物，诸如稻、烟草、玉米、棉或大豆)中表达中，若已经测定预期的宿主植物的密码子偏爱，则其是有帮助的。存在多种公众可用的DNA序列数据库，其中可以寻找关于植物基因组的密码子分布或各种植物基因的蛋白质编码区的信息。

密码子偏爱是表达宿主(例如，植物，诸如芸苔或拟南芥)使用以编码其蛋白质的氨基酸的密码子的统计学分布。密码子偏爱可以以单一密码子相对所有氨基酸的密码子的使用频率计算。或者，密码子偏爱可以以单一密码子用于编码特定氨基酸，相对于所述氨基酸的所有其它密码子(同义密码子)的频率计算。

在为delta-9去饱和酶基因的植物表达设计优化的编码区中，应当确定植物优选的主要(“第一选择”)密码子，及优选密码子的第二、第三、第四选择等等(在存在多种选择时)。然后，可以设计新的编码delta-9去饱和酶基因氨基酸序列的DNA序列，其中新的DNA序列与天然DNA序列(编码去饱和酶)不同之处在于取代编码宿主优选性(第一优选性、第二优选性、第三优选性、或第四优选性，等等)密码子以规定氨基酸序列内每个位置处的氨基酸。然后，对新的序列分析限制酶位点，其可以已经通过修饰创建。通过将这些密码子用下一优选性密码子替换来进一步修饰鉴定的推定限制性位点以除去限制性位点。序列中可以影响异源序列的转录或翻译的其它位点是外显子:内含子接合(5’或3’)、多聚-A添加信号、和/或RNA聚合酶终止信号。可以进一步分析序列，并将其进行修饰以降低TA或CG双联体的频率。在这些双联体外，具有相同的超过约6个G或C核苷酸的序列区组也可以不利地影响序列的转录或翻译。因此，有利地，通过将第一或第二选择的密码子，等等用选择的下一优选性密码子替换来修饰这些区组。

上文所描述的方法使本领域技术人员能够修饰对于特定植物而言外来的基因，使得基因在植物中最佳地表达。所述方法在PCT申请WO 97/13402中进一步例示。如此，可以使用与一些实施方案的去饱和酶/基因在功能上等同的经优化的合成基因来转化宿主，包括植物。关于生成合成基因的更多指导可以参见例如美国专利5,380,831。

一旦在纸上或在计算机芯片中设计出经植物优化的DNA序列，可以在实验室中合成实际的DNA分子以在序列上精确对应于设计的序列。可以将此类合成的DNA分子克隆，并以其它方式操作，完全就像它们源自自然或天然来源那样。

D.用于遗传转化植物材料的方法

一些实施方案涉及生成包含一种或多种核酸分子的经转化的细胞的方法，所述核酸分子包含与选自下组的序列至少60％相同的核酸序列：SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQID NO:5,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:15,SEQ IDNO:16,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:44,SEQ ID NO:45,SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49。此类核酸分子还可以包含例如非编码调节元件，诸如启动子。也可以将其它序列与非编码调节元件和可转录核酸分子序列一起导入细胞中。这些其它序列可以包含3’转录终止子、3’多聚腺苷酸化信号、其它非翻译序列、转运或靶向序列、选择标志、增强子、和操纵基因。

一般地，转化方法包括下列步骤：选择合适的宿主细胞，用重组载体转化宿主细胞，并获得经转化的宿主细胞。用于将DNA导入细胞中的技术是本领域技术人员公知的。一般地，这些方法可以分成5类：(1)化学方法(Graham和Van der Eb(1973)Virology 54(2):536-9；Zatloukal等(1992)Ann.N.Y.Acad.Sci.660:136-53)；(2)物理方法，诸如微注射(Capechi(1980)Cell 22(2):479-88)、电穿孔(Wong和Neumann(1982)Biochim.Biophys.Res.Commun.107(2):584-7；Fromm等(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82(17):5824-8；美国专利5,384,253)、和颗粒加速(Johnston和Tang(1994)Methods CellBiol.43(A):353-65；Fynan等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(24):11478-82；(3)病毒载体(Clapp(1993)Clin.Perinatol.20(1):155-68；Lu等(1993)J.Exp.Med.178(6):2089-96；Eglitis和Anderson(1988)Biotechniques 6(7):608-14)；(4)受体介导的机制(Curiel等(1992)Hum.Gen.Ther.3(2):147-54；Wagner等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(13):6099-103)；和(5)细菌介导的机制，诸如用土壤杆菌。或者，可以通过直接注射植物的生殖器官来将核酸直接导入花粉中。Zhou等(1983)Methods in Enzymology 101:433；Hess(1987)Intern.Rev.Cytol.107:367；Luo等(1988)Plant Mol.Biol.Reporter 6:165；Pena等(1987)Nature 325:274。其它转化方法包括例如原生质体转化，如美国专利5,508,184中例示的。也可以将核酸分子注射入未成熟的胚中。Neuhaus等(1987)Theor.Appl.Genet.75:30。

最常使用的用于转化植物细胞的方法是：土壤杆菌介导的DNA转移方法(Fraley等(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:4803)(如美国专利5,824,877；美国专利5,591,616；美国专利5,981,840；和美国专利6,384,301中例示的)和生物射弹或微粒轰击介导的方法(即，基因枪)(诸如记载于美国专利5,550,318；美国专利5,538,880；美国专利6,160,208；美国专利6,399,861；和美国专利6,403,865)。通常，核转化是期望的，但是在期望特异性转化质体，诸如叶绿体或造粉体的情况中，可以对某些植物物种诸如拟南芥、烟草、马铃薯和芸苔物种利用期望的核酸分子的微粒介导的递送来转化植物质体。

经由使用属于土壤杆菌属的遗传工程化土壤细菌实现土壤杆菌介导的转化。几种土壤杆菌物种介导转移称为“T-DNA”的特定DNA，其可以遗传工程化改造为将任何期望的DNA部分携带入许多植物物种中。标记T-DNA介导的发病机制过程的主要事件是：诱导毒力基因、和加工并转移TDNA。此过程是许多综述的主题。见例如Ream(1989)Ann.Rev.Phytopathol.27:583-618；Howard和Citovsky(1990)Bioassays 12:103-8；Kado(1991)Crit.Rev.Plant Sci.10:1-32；Zambryski(1992)Annual Rev.PlantPhysiol.Plant Mol.Biol.43:465-90；Gelvin(1993)于Transgenic Plants,Kung和Wu编,Academic Press,San Diego,CA,第49页-第87页；Binns和Howitz(1994)于Bacterical Pathogenesis of Plants and Animals,Dang编,Berlin:Springer Verlag.,第119-38页；Hooykaas和Beijersbergen(1994)Ann.Rev.Phytopathol.32:157-79；Lessl和Lanka(1994)Cell 77:321-4；及Zupan和Zambryski(1995)Annual Rev.Phytopathol.27:583-618。

为了对经转化的植物细胞选择或评分(不管转化方法如何)，导入细胞中的DNA可以含有在可再生的植物组织中发挥功能以生成化合物的基因，所述化合物对植物组织赋予对否则有毒性的化合物的抗性。作为选择、筛选、或评分标准物使用的感兴趣的基因包括但不限于β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、绿色荧光蛋白(GFP)、萤光素酶、和抗生素或除草剂耐受性基因。抗生素抗性基因的例子包括赋予对青霉素、卡那霉素(和新霉素、G418、博来霉素)；甲氨蝶呤(和甲氧苄啶)；氯霉素；和四环素的抗性的基因。例如，草甘膦(glyphosate)抗性可以由除草剂抗性基因赋予。Della-Cioppa等(1987)Bio/Technology 5:579-84。也可以执行其它选择装置，包括例如但不限于对膦丝菌素(phosphinothricin)、双丙氨磷和正向选择机制的耐受性(Joersbro等(1998)Mol.Breed.4:111-7)，并且认为在本发明的实施方案的范围内。

然后，可以容许通过选择或筛选鉴定并在支持再生的合适培养基中培养的经转化的细胞成熟成植物。

目前公开的方法可以与任何可转化的植物细胞或组织一起使用。如本文中使用的，可转化的细胞和组织包括但不限于能够进一步增殖以产生植物的那些细胞或组织。本领域技术人员认可许多植物细胞或组织是可转化的，其中在插入外源DNA和适当的培养条件后植物细胞或组织可以形成分化的植物。适合于这些目的的组织可以包括但不限于未成熟的胚、小盾(scutellar)组织、悬浮细胞培养物、未成熟的花序、枝分生组织、节外植体、愈伤组织、下胚轴组织、子叶、根、和叶。

自经转化的植物原生质体或外植体再生、发育、和培养植物是本领域中已知的。Weissbach和Weissbach(1988)Methods for Plant Molecular Biology,(编)AcademicPress,Inc.,San Diego,CA；Horsch等(1985)Science 227:1229-31。此再生和生长方法通常包括下列步骤：选择经转化的细胞，并将那些细胞培养到胚发育的通常阶段到生根的小植物阶段。类似地，再生转基因的胚和种子。在此方法中，一般将转化体在存在选择培养基的情况中培养，所述选择培养基选择成功转化的细胞并诱导植物幼芽(shoot)的再生。Fraley等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:4803。这些幼芽通常在2至4个月内获得。此后，将所得的转基因生根幼芽在合适的植物生长培养基诸如土壤中种植。可以将幸免于暴露于选择剂的细胞，或已经在筛选测定法中得分为正的细胞在支持植物再生的培养基中培养。然后，可以将幼芽转移至合适的根诱导培养基中，所述根诱导培养基含有选择剂和防止细菌生长的抗生素。许多幼芽会形成根。然后，将这些移植至土壤或其它培养基以容许根的继续发育。一般地，如上文概述的方法会根据采用的特定植物品系而不同，并且因此，方法的细节在本领域技术人员的判断内。

再生的转基因植物可以自花传粉以提供纯合转基因植物。或者，可以将自再生的转基因植物获得的花粉与非转基因植物，优选地，农艺学重要的物种的近交系杂交。相反，可以使用来自非转基因植物的花粉来给再生的转基因植物传粉。

转基因植物可以将转化的核酸序列传递给其后代。优选地，转基因植物是在转化的核酸序列方面是纯合的，并在有性繁殖后且由于有性繁殖而将所述序列遗传给所有其后代。可以自由转基因植物生成的种子培养后代。然后，可以将这些其它植物自花传粉以生成真正的植物育种系。

可以对来自这些植物的后代评估基因表达，等等。可以通过几种常见的方法诸如Western印迹、Northern印迹、免疫沉淀、和ELISA(酶联免疫吸附测定法)检测基因表达。也可以对经转化的植物分析导入的DNA的存在和由本发明的核酸分子和氨基酸分子赋予的表达水平和/或脂肪酸谱。本领域技术人员知道可用于分析经转化的植物的许多方法。例如，用于植物分析的方法包括但不限于Southern印迹或Northern印迹、基于PCR的方法、生物化学测定法、表型筛选法、田间评估、和免疫诊断测定法。

用于特异性转化双子叶植物的方法是本领域技术人员公知的。已经对许多作物，包括但不限于拟南芥属的成员、棉(棉(Gossypium hirsutum))、大豆(大豆(Glycinemax))、花生(落花生(Arachis hypogaea))、和芸苔属的成员描述了使用这些方法的转化和植物再生。已经对棉(美国专利5,004,863；美国专利5,159,135；美国专利5,518,908)；大豆(美国专利5,569,834；美国专利5,416,011；McCabe等(1988)Biotechnology 6:923；Christou等(1988)Plant Physiol.87:671-4)；(美国专利5,463,174)；花生(Cheng等(1996)Plant Cell Rep.15:653-7；McKently等(1995)Plant Cell Rep.14:699-703)；蕃木瓜；和豌豆(Grant等(1995)Plant Cell Rep.15:254-8)发表了主要通过使用根癌土壤杆菌转化双子叶植物并获得转基因植物的方法。

用于转化单子叶植物的方法也是本领域中公知的。已经对许多作物，包括但不限于大麦(大麦(Hordeum vulgarae))；玉蜀黍(玉蜀黍(Zea mays))；燕麦(燕麦(Avenasativa))；野茅(野茅(Dactylis glomerata))；稻(稻(Oryza sativa)，包括印度和日本变种)；高粱(高粱(Sorghum bicolor))；甘蔗(甘蔗(Saccharum sp))；苇状羊茅(苇状羊茅(Festuca arundinacea))；草地草(turfgrass)物种(例如，匍茎剪股颖(Agrostisstolonifera)、草地早熟禾(Poa pratensis)、锥穗钝叶草(Stenotaphrum secundatum))；小麦(小麦(Triticum aestivum))；和苜蓿(苜蓿(Medicago sativa))描述了使用这些方法的转化和植物再生。对于本领域技术人员显而易见的是，可以使用并修改许多转化方法以对许多感兴趣的目标作物生成稳定的转基因植物。

可以选择任何植物在目前公开的方法中使用。依照本发明修饰的优选的植物包括例如但不限于含有种子植物、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、琉璃苣(琉璃苣属(Borago)物种)、芸苔(Canola)(芸苔(Brassica)物种)、蓖麻(蓖麻(Ricinus communis))、可可豆(可可(Theobroma cacao))、玉米(玉蜀黍)、棉(棉属(Gossypium)物种)、两节荠属(Crambe)物种、萼距花属(Cuphea)物种、亚麻亚麻物种)、小滨菊属(Lesquerella)和鲸油草(Limnanthes)物种、Linola、旱金莲(旱金莲属(Tropaeolum)物种)、月见草属(Oenothera)物种、橄榄(olive)(木樨榄属(Olea)物种)、棕榈(油棕属(Elaeis)物种)、花生(花生属(Arachis)物种)、油菜籽(rapeseed)、红花(红花属(Carthamus)物种)、大豆(大豆属(Glycine)和野生大豆(Soja)物种)、向日葵(向日葵属(Helianthus)物种)、烟草(烟草属(Nicotiana)物种)、斑鸠菊属(Vernonia)物种、小麦(小麦属(Triticum)物种)、大麦(大麦属(Hordeum)物种)、稻(稻属(Oryza)物种)、燕麦(燕麦属(Avena)物种)、高粱(高粱属(Sorghum)物种)、和黑麦(黑麦属(Secale)物种)或禾本科(Gramineae)的其它成员。

对于本领域技术人员显而易见的是，可以使用并修改许多转化方法以对许多感兴趣的目标作物生成稳定的转基因植物。

E.转基因种子

在一些实施方案中，转基因种子可以包含delta-9去饱和酶多肽，其包含与选自下组的序列至少80％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:14,SEQID NO:50,SEQ ID NO:51,SEQ ID NO:52,SEQ ID NO:72和SEQ ID NO:73。在这些和其它实施方案中，转基因种子可以包含与选自下组的序列至少60％相同的核酸序列：SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:44,SEQ ID NO:45,SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49。在一些实施方案中，转基因种子可以展现出降低的饱和脂肪酸(例如，棕榈酸脂肪酸和/或硬脂酸脂肪酸)水平。可以自能育转基因植物收获种子，并可以用于培养经转化植物的后代世代，包括包含如上文所列的至少一种核酸序列，和任选地至少一种别的感兴趣的基因或核酸构建体的杂种植物系。

提供以下实施例来例示某些具体的特征和/或实施方案。这些实施例不应解释为将本发明限于所描述的具体特征或实施方案。

实施例

实施例I：酰基-CoA delta-9去饱和酶的克隆和在ole1缺陷型酵母中的功能性表征

Magnaporthe grisea酰基-CoA delta-9去饱和酶的克隆

使用引物自基因组DNA分离Magnaporthe grisea酰基-CoA delta-9去饱和酶基因(MgD9DS)，所述引物基于最初注释为“假设的蛋白质”，并且在核苷酸水平与酿酒酵母酰基-CoA delta-9去饱和酶(即，OLE1)具有55.4％同一性的发表的NCBI/Broad研究所序列。设计正向和反向引物，长度各为41个碱基对。正向引物MgΔ9F(SEQ ID NO:1)包括5’端的EcoRI位点。反向引物Mg9ΔR(SEQ ID NO:2)含有三个阅读框之每个中的终止密码子和末端XhoI位点。

使用Takara EZ Taq^TM PCR试剂盒(Takara Bio Inc.,Otsu,Shiga,Japan)遵循制造商的方案PCR扩增MgD9DS基因。扩增条件是94℃达1分钟，接着是94℃达30秒、60℃达60秒、和于72℃延伸90秒的30个循环。于72℃实施最终的延伸步骤达10分钟。自琼脂糖凝胶切出预期的1,425个碱基对PCR产物，并使用Montage旋转柱按照制造商的推荐(Millipore,Billerica,MA)纯化。将纯化的片段克隆入2.1克隆载体(Invitrogen,Carlsbad,CA)中。按照供应商条件将TOPO反应转化入化学感受态Top 10大肠杆菌细胞中。将含有推定的克隆的细菌菌落分离。用Macherey-Nagel Nucleospin DNA分离试剂盒(Machery-Nagel,Neumann-Neander-Strasse,Düren,Germany)实施微量质粒制备，并用EcoRI和XhoI限制性酶消化DNA。鉴定含有预期的1,425bp MgD9DS基因片段的阳性克隆。经由测序反应获得核苷酸序列。PCR扩增片段的序列以SEQ ID NO:3列出。

序列分析揭示位于MgD9DS基因的5’端中的小的(90bp)内含子。使用剪接重叠延伸(Splice Overlap Extension)PCR除去内含子。将所得的PCR扩增子进行凝胶纯化，克隆入2.1克隆载体中，并转化入Top 10大肠杆菌细胞中。经由分析来自单一转化体菌落的纯化的DNA的限制酶消化物来鉴定几个克隆。对这些克隆测序以确认无内含子的MgD9DS克隆的存在。所得的序列以SEQ ID NO:4列出。

将具有和没有内含子的MgD9DS基因各自以EcoRI/XhoI片段亚克隆入酵母表达载体中。此酵母表达载体含有构巢曲霉delta-9去饱和酶(AnD9DS)基因，其侧翼有酿酒酵母delta-9去饱和酶启动子和delta-9去饱和酶3’UTR/终止子。将构巢曲霉delta-9去饱和酶基因在EcoRI/XhoI片段上切除，所述EcoRI/XhoI片段用含有MgD9DS基因的片段或含有无内含子的MgD9DS基因的片段替换。将含有MgD9DS基因的两种克隆(一种具有内含子，而一种没有内含子)进行酿酒酵母转化。

使用碱-阳离子酵母转化试剂盒(Qbiogene,Montreal,Canada)转化delta-9去饱和酶缺陷型酿酒酵母菌株(OFY093)，其在具有80的酵母蛋白胨右旋糖(YPD)培养基上维持。根据在不含80(单不饱和脂肪酸补充物)或尿嘧啶的培养基(具有琼脂的Dropout Base及SC-URA)上生长鉴定互补菌株。将互补菌株在选择培养基上单菌落纯化三次。通过delta-9去饱和酶基因的PCR扩增，及对PCR产物的测序进一步确认互补菌株。另外，如下将含有MgD9DS克隆的菌株恢复成脂肪酸和尿嘧啶依赖性，即将菌株在YPD+Tween培养基上传代至少三次，然后将菌株补到不含80的DOBA SC-URA培养基。

含有内含子的MgD9DS编码序列的表达未获成功，指示酵母机器没有剪接内含子。通过FAME分析进一步表征含有无内含子的MgD9DS编码序列的酵母菌株的底物特异性。

颖枯小球腔菌酰基-CoA delta-9去饱和酶的克隆

通过使用BlastN搜索自颖枯小球腔菌EST集合将两种颖枯小球腔菌EST序列(分别为1,246和429个碱基对)鉴定为与酿酒酵母酰基-CoA delta-9去饱和酶(OLE1)共享高水平序列同一性(分别为54.0％和54.2％)。在比对时，这些序列彼此是64.6％相同的，提示两种独特的颖枯小球腔菌酰基-CoA delta-9去饱和酶的存在。通过用1,246bp基因探针筛选颖枯小球腔菌cDNA文库分离LnD9DS-1基因(SEQ ID NO:5)。获得此基因的序列，并分离编码序列。通过首先用429bp EST序列BLAST搜索发表的Broad研究所颖枯小球腔菌基因组序列来分离LnD9DS-2基因的整个序列。此搜索将超重叠群(Supercontig)Ln 1.4鉴定为含有与429bp片段具有100％同源性的基因，该基因注释为编码“假设的蛋白质”。接着，使用基于Ln1.4超重叠群序列的PCR引物自颖枯小球腔菌cDNA文库克隆LnD9DS-2基因。使用的引物序列是Lnd9FAD2F(SEQ ID NO:6)和Lnd9FAD2R(SEQ ID NO:7)。正向引物设计为具有5’BamHI位点，而反向引物含有三个阅读框中的终止密码子和末端NcoI位点。

将颖枯小球腔菌cDNA文库的等分试样以1/10稀释以为PCR反应提供400ng模板DNA。使用Takara EZ Taq^TM PCR试剂盒遵循推荐的扩增条件实施PCR扩增，所述推荐的扩增条件为94℃达1分钟，接着是94℃达30秒、60℃达60秒、和于72℃延伸90秒的30个循环。于72℃实施最终的延伸步骤达10分钟。自琼脂糖凝胶切出预期的1,370个碱基对产物，并使用Montage旋转柱按照制造商的推荐纯化。将纯化的片段克隆入2.1克隆载体中。依照制造商的推荐方案将连接反应转化入化学感受态Top 10大肠杆菌细胞中。将含有推定克隆的菌落分离。用Macherey-Nagel Nucleospin柱实施微量质粒制备，并用BamHI和NcoI限制酶消化DNA。将推定的LnD9DS-2克隆鉴定并测序。

测序后，通过与“假定的蛋白质”序列比较确认LnD9DS-2(SEQ ID NO:8)克隆。鉴定LnD9DS-2序列中的保守变化。通过在碱基位置271处用腺嘌呤替换胸苷将密码子TGC(半胱氨酸)改变为AGC(丝氨酸)，该密码子翻译成发表序列的氨基酸89。这是保守的变化，并且发现半胱氨酸不是多种丝状真菌间高度保守的氨基酸，因此未尝试改正。

将分别为SEQ ID NO:5和8的LnD9DS-1和LnD9DS-2基因克隆入酵母表达载体中。通过限制酶分析和DNA测序确认含有LnD9DS-1和LnD9DS-2编码序列之任一的克隆。

使用来自Qbiogene的碱-阳离子酵母转化试剂盒转化delta-9去饱和酶缺陷型酿酒酵母菌株(OFY093)，其在具有80的YPD培养基上维持。根据在不含80(单不饱和脂肪酸补充物)或尿嘧啶的培养基(DOBA sc-ura)上生长鉴定互补菌株。将互补菌株在选择培养基上单菌落纯化三次。通过delta-9去饱和酶基因的PCR扩增，及对PCR产物的测序进一步确认互补菌株。另外，如下将含有LnD9DS-2克隆的菌株恢复成脂肪酸和尿嘧啶依赖性，即将菌株在YPD+Tween培养基上传代至少三次，然后将菌株补到不含80的DOBA SC-URA培养基。通过FAME分析进一步表征含有LnD9DS-1或LnD9DS-2编码序列之任一的酵母菌株的底物特异性。

HzD9DS基因的克隆和对Delta-9去饱和酶缺陷型酿酒酵母的转化

自DASPICO89(下文描述)在BamHI/XhoI片段上切出植物优化的编码美洲棉铃虫酰基-CoA delta-9去饱和酶(HzD9DS)(在Rosenfield等(2001)Insect Biochem.Mol.Biol.31(10):949-64中鉴定为HzPGDS2)的合成基因，并使用Montage旋转柱进行凝胶纯化。将此片段连接入先前描述的酵母表达载体的相应限制酶位点中，并使用标准的分子生物学技术和供应商的方案(Invitrogen,Carlsbad,CA)转化入大肠杆菌菌株DH5α中。

在限制性分析和DNA测序后，选择含有HzD9DS基因的克隆来转化入delta-9去饱和酶缺陷型酿酒酵母菌株OFY093中。使用来自Qbiogene的碱-阳离子酵母转化试剂盒转化OFY093菌株，其在具有80的YPD培养基上维持。根据在不含80(脂肪酸补充物)和尿嘧啶的培养基(DOBA SC-URA)上的生长鉴定互补菌株。将推定的互补菌株在选择培养基上单菌落纯化三次。如下进一步确认互补菌株：i)使用Qbiogene酵母质粒纯化试剂盒提取质粒DNA，接着使用HzD9DS基因特异性引物进行PCR扩增；ii)对HzD9DS基因特异性PCR产物测序；及iii)通过将菌株在YPD+Tween培养基上传代至少三次，然后将菌株补到不含80的DOBA SC-URA培养基将菌株恢复成脂肪酸和URA-3依赖性。通过FAME分析进一步表征一种确认的互补HzD9DS酵母菌株的底物特异性。

分析OLE1缺陷型酵母菌株中表达的LnD9DS-1,LnD9DS-2,MgD9DS和HzD9DS

如上文所列的，自植物病原性真菌Magnaporthe grisea(MgD9DS)和颖枯小球腔菌(LnD9DS-1和LnD9DS-2)克隆三种例示性酰基-CoA delta-9去饱和酶(D9DS)基因。三种基因及其编码的蛋白质先前尚未表征。酰基-CoA delta-9去饱和酶催化辅酶A的饱和14-、16-、和18-碳脂肪酰基硫酯的碳原子9和10间的顺式双键形成，导致分别生成肉豆蔻脑酸(14:1)、棕榈油酸(16:1)、或油酸(18:1)。通过消除相同生物学背景中不同真菌酰基-CoAdelta-9去饱和酶基因来消除涉及生物体特异性生物学的效应。因此，使用棕榈酰基-硬脂酰基CoA去饱和酶(OLE1)缺陷型OFY093酵母菌株内的内源ole1基因启动子驱动真菌酰基-CoA delta-9去饱和酶基因的表达。如此，对此系统中脂肪酸底物特异性观察到的差异可归因于互补酿酒酵母菌株中表达的特定真菌delta-9去饱和酶。

将互补OYF093菌株中表达的MgD9DS、LnD9DS-1和LnD9DS-2 CoA去饱和酶的底物特异性表征，并与WO/1999/050430中描述的与AnD9DS(sdeA)互补的OFY093比较。使用上文所描述的方案将含有AnD9DS基因(其表达由ole1基因启动子驱动)的酵母表达构建体转化入酿酒酵母OFY093菌株中并表达。

将互补酿酒酵母菌株在没有脂肪酸补充的极限培养基中于30℃培养24小时。对清洗过的且冻干的细胞团粒实施定量FAME分析。表1中显示了此分析的结果。LnD9DS-2促进C14:1和C16:1的形成，而LnD9DS-1和MgD9DS对C18:0具有偏爱，如根据酵母脂肪酸组成分析中C16:1/18:1脂肪酸的比率指示的。

将新颖的去饱和酶与转移入相同重组表达环境中的天然酿酒酵母硬脂酰基-CoAdelta-9去饱和酶(ole1)进一步比较。构建酵母表达载体，其含有WO/2000/011012中描述的来自酿酒酵母的核苷酸序列。使用上文所描述的方案将含有天然酿酒酵母硬脂酰基-CoAdelta-9去饱和酶的酵母表达构建体转化入酿酒酵母OFY093菌株中并表达。还在这些实验中评估来自昆虫物种美洲棉铃虫的另一种非真菌酰基-CoA delta-9去饱和酶(HzD9DS)。

将含有MgD9DS、LnD9DS-2和HzD9DS基因之一的互补酿酒酵母菌株在Drop Out培养基SC-URA中培养。将对照菌株pDAB467EV-1(通过先前描述的酵母转化方法转化入OFY093中的pDAB467B/N)在DOB SC-URA+80中培养，并将亲本delta-9去饱和酶缺陷型酿酒酵母菌株OFY093在DOB scAA+80中培养。用来自含有1.5％琼脂的相同培养基的新鲜划线平板的一环细胞接种培养物。将菌株于30℃培养24小时。将培养物以6,000rpm旋转10分钟。将团粒在水中清洗，以6,000rpm再旋转10分钟，然后于-20℃冷冻，直至实施FAME分析。分析三组实验培养物。

将冷冻干燥的酵母团粒在含有10％(w/v)NaOH的甲醇中皂化。用己烷除去不可皂化的脂质污染物(固醇)。通过添加H₂SO₄酸化甲醇级分，并用己烷提取质子化的脂肪酸。将分离的己烷级分弄干，并将脂肪酸用0.5N MeOHCl于80℃甲基化30分钟。用含有十一酸甲酯作为内部标准品的己烷提取所得的FAME。用装备有来自SGE(Austin,TX)的毛细管柱BPX 70(15m x 0.25mm x 0.25μm)的HP6890气相层析-火焰离子化检测仪(Santa Clara,CA)分析FAME提取物。使用氦作为载气在温度梯度中分开FAME。通过保留时间鉴定每种FAME种类，并通过注射来自Matreya,LLC(Pleasant Gap,PA)的FAME油菜籽油参照混合物作为校正标准品来量化。

表2显示了表达多种例示性酰基Co-A delta-9去饱和酶的ole1缺陷型OFY093酵母细胞的脂肪酸组成(以％FAME计)。所有菌株生长良好，并且在不需要任何外源MUFA(单不饱和脂肪酸)的情况中通过导入的去饱和酶完全互补。

这些数据显示互补酵母菌株的脂肪酸组成随导入的基因而变化。LnD9DS-2生成相对较高量的C16:1，HzD9DS和ole1亦然，而AnD9DS和MgD9DS生成相对较高量的C18:1。

可以通过相对于每种脂肪酸链长；C14、C16、或C18的总脂肪酸计算MUFA的比例进一步显示基于链长的差别转化水平。这些数据显示对C16:1(对于LnD9DS-2和HzD9DS)及对C18:1(对于AnD9DS和MgD9DS)的相对较高转化。表3。底部四行代表与添加的Tergitol、不饱和脂肪酸、或互补的对照样品。具有不同字母的样品是显著不同的，如经由JMP统计学软件包(SAS Institute Inc.,Cary,NC)中实施的Tukey-Kramer检验测定的。

表3：MUFA占每种链长的总脂肪酸的比例(Cxx:1/(Cxx:0+Cxx:1)。

去饱和酶	C14	C16*	C18
				LnD9DS-2	0.49	0.60(b)	0.81(b)
HzD9DS	0.30	0.52(b)	0.75(c)
				ole1	0.34	0.79(a)	0.81(b)
AnD9DS	0.25	0.28(c)	0.97(a)
				MgD9DS	0.07	0.36(c)	0.98(a)
无+tergitol	0.06	0	0
				无+Tergitol+蓖麻油酸	0.07	0	0.01
无+Tergitol+蓖麻油酸	0	0	0.04
				无+Tween	0.65	0.23	0.87

*C16MUFA包括顺式-十八碳烯酸(C18:1Δ11)，因为它源自棕榈油酸(C16:1Δ9)的延长。

真菌酰基-CoA去饱和酶的系统发生论

对多种真菌酰基-CoA delta-9去饱和酶氨基酸序列的系统发生分析提示了LnD9DS-2与18:0优选性delta-9去饱和酶截然不同。如此，我们假设表征与18:0优选性delta-9去饱和酶，或与LnD9DS-2紧密有关的其它真菌delta-9去饱和酶可以鉴定具有一定范围的18:0或16:0活性的去饱和酶。我们的假设预测与LnD9DS-2更紧密有关的真菌delta-9去饱和酶会具有升高的16:0活性。

搜索公共DNA序列数据库(Broad研究所，NCBI等)没有鉴定出在Magnaporthegrisea或颖枯小球腔菌中明确注释为delta-9去饱和酶的任何基因序列。在此公开内容内鉴定的Broad研究所序列的Pfam分析指示这些蛋白质含有细胞色素B5和去饱和酶基序，其也存在于其它真菌酰基-CoA delta-9去饱和酶中。然而，所述蛋白质先前尚未鉴定为酰基-CoA delta-9去饱和酶。我们已经通过酵母中的互补、逆向研究、和DNA序列分析证明这些蛋白质的此功能。

经由MEGA软件包使用邻接法系统发生分析几种真菌去饱和酶基因序列的关系。Tamura等(2007)Mol.Biol.and Evolution 24:1596-9。图1显示了真菌去饱和酶序列的此系统发生分析。使用AnD9DS(sdeA)氨基酸序列通过对NCBI序列数据库的BlastN搜索回收这些序列。与LnD9DS-2相比，LnD9DS-1和MgD9DS彼此共享更高水平的序列同一性。另外，LnD9DS-1、LnD9DS-2和MgD9DS的ClustalW比对显示LnD9DS-2与LnD9DS-1和MgD9DS的趋异。图2。LnD9DS-1和MgD9DS的核苷酸序列共享较高数目的共同碱基对。

表4和图3进一步显示新鉴定的蛋白质LnD9DS-1、LnD9DS-2、和MgD9DS，及AnD9DS与酵母去饱和酶ScOLE1的系统发生关系。与LnD9DS-2相比，LnD9DS-1、MgD9DS、和AnD9DS(sdeA)氨基酸序列彼此共享更大百分比的同一性。氨基酸同一性的保守容许我们预测18:0酰基-CoA的底物特异性依赖于LnD9DS-1、MgD9DS、和AnD9DS(sdeA)之间共享的保守序列。比较而言，LnD9DS-2的酰基-CoA底物特异性由于其趋异的氨基酸序列而对16:0是优先的。

表4：使用ClustalW比对的多种真菌去饱和酶序列的氨基酸同一性。

实施例2：设计并合成经优化的来自Magnaporthe grisea、美洲棉铃虫、和颖枯小球腔菌的delta-9去饱和酶基因

为了在芸苔中获得更高的真菌delta-9去饱和酶基因表达，我们工程化这些基因，使得它们在含有异源基因的转基因芸苔细胞中更有效地表达。对本文中分别以SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11公开的天然Magnaporthe grisea、美洲棉铃虫和颖枯小球腔菌delta-9去饱和酶编码区的DNA序列的广泛分析揭示，认为对于最佳的植物表达不利的几种序列基序的存在及对于此类最佳的植物表达而言的非最佳的密码子组成。为了设计经优化的编码delta-9去饱和酶蛋白质的基因，我们在计算机芯片上生成性质上更“像植物”(且具体地，更“像芸苔”)的DNA序列，其中序列修饰并不阻碍翻译或产生mRNA不稳定性。

为了工程化改造经植物优化的编码delta-9去饱和酶的基因，DNA序列设计为编码蛋白质去饱和酶的氨基酸序列，其利用从自特定宿主植物(即，芸苔)的蛋白质编码序列汇编的密码子偏爱表建立的冗余遗传密码进行。表5中显示了芸苔的优选密码子选择。表5的栏C和G呈现每种氨基酸的同义密码子的分布(以选择占所述氨基酸的所有密码子的％计)，如存在于油菜编码区中的。明显的是，一些氨基酸的一些同义密码子仅罕见地存在于植物基因中(例如，CGG在芸苔汇中)。若密码子在任一植物类型的基因中以编码相关氨基酸的次数的约10％或更少呈现，则认为它不常使用的(以表5的栏D和H中的“DNU”标示)。为了平衡氨基酸的剩余密码子选择的分布，使用下式计算每种密码子的加权平均值呈现：

C1的加权平均值％＝1/(％C1+％C2+％C3+等等)x％C1x 100，

其中C1是所讨论的密码子，而％C2,％C3等等代表表5的剩余同义密码子的％值平均值(对于油菜)(在栏C和G取得相关密码子的平均％值)。

在表5的栏D和H中给出每种密码子的加权平均％值。

表5：芸苔(芸苔)基因的编码区中的同义密码子呈现(栏C和G)。用于植物优化的合成基因设计的平衡的-偏爱的密码子代表组的数值在栏D和H中。

使用芸苔基因中存在的最常使用的密码子的第一和第二选择密码子分布设计分别实质上编码SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14的Magnaporthe grisea、美洲棉铃虫、和颖枯小球腔菌delta-9去饱和酶的氨基酸序列的新DNA序列以实现芸苔中的最佳表达。新的DNA序列与编码delta-9去饱和酶蛋白质的天然DNA序列的不同之处在于取代植物优选性(即，第一优选性、第二优选性、第三优选性、或第四优选性)密码子以在蛋白质氨基酸序列内的每个位置处规定合适的氨基酸。

使用自表5栏D和H构建的芸苔密码子偏爱表通过逆翻译SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:13和SEQ ID NO:14的蛋白质序列启动经植物优化的DNA序列的设计。然后，通过补偿密码子变化(同时保留总体加权平均值密码子呈现)修饰初始序列以除去限制酶识别位点，除去高度稳定的链内二级结构，并除去对于克隆操作或在植物中表达工程化基因可能不利的其它序列。然后，对DNA序列再分析限制酶识别位点，其可以已经通过修饰创建。然后，通过用第一、第二、第三或第四选择优选性密码子替换相关密码子来进一步修饰鉴定的位点。将经修饰的序列进一步分析，并进一步修饰以降低TA和CG成对物(双联体)的频率，并增加TG和CT成对物的频率。在这些成对物外，通过将第一或第二选择等的密码子用其它优选的选择密码子替换来修饰具有[G+C]或[A+T]的超过约6个连续残基的序列区组。不常使用的密码子在基因设计中以实质性程度不包括在内，并且仅在必需适应不同设计标准，而不是密码子组成本身(例如，添加或删除限制酶识别位点)时使用。通过此过程设计的例示性合成的经芸苔优化的去饱和酶DNA序列在SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17中列出。

如以SEQ ID NO:15-17呈现的所得的DNA序列具有较高程度的密码子多样性和期望的碱基组成。此外，这些序列含有策略性放置的限制酶识别位点，并且缺乏可能干扰基因转录，或者产物mRNA翻译的序列。表6-8呈现如存在于天然基因及经植物优化的型式中的delta-9去饱和酶蛋白质的编码区的密码子组成的比较，并且将这两者与如自表5栏D和H计算的经植物优化的序列的密码子组成推荐比较。

包含SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、和SEQ ID NO:17的DNA片段的合成由商业供应商(PicoScript,Houston,TX和Blue Heron Biotechnology,Bothell,WA)实施。这些经芸苔优化的序列标记为型式2(v2)。然后，将合成的DNA片段克隆入表达载体中，并转化入土壤杆菌和芸苔中，如下文实施例中所描述的。

实施例3：质粒构建

使用标准分子生物学技术构建以下质粒。构建含有植物转录单位(由启动子及其连接的感兴趣的基因、其末端的3’UTR构成)，或“PTU”的多核苷酸片段，并在二元载体的T链区与其它植物转录单位组合。

pDAB7318的描述：使用标准的分子生物学技术构建pDAB7318(图6；SEQ ID NO:58)。此质粒含有两个去饱和酶PTU序列。第一去饱和酶PTU含有菜豆(Phaseolus vulgaris)菜豆蛋白启动子(PvPhas启动子v2(SEQ ID NO:67)；Genbank:J01263)、菜豆5’非翻译区(PvPhas 5’UTR(SEQ ID NO:68)；Genbank:J01263)、AnD9DS v3基因(SEQ ID NO:49)、菜豆3’非翻译区(PvPhas 3’UTR v1(SEQ ID NO:69)；Genbank:J01263)和菜豆基质附着区(PvPhas 3’MAR v2(SEQ ID NO:70)；Genbank:J01263)。第二去饱和酶PTU含有PvPhas启动子v2、PvPhas 5’UTR、LnD9DS-2 v2(SEQ ID NO:17)、和根癌土壤杆菌ORF23 3’非翻译区(AtuORF23 3’UTR(SEQ ID NO:71)；Huang等(1990)J.Bacteriol.172:1814-22)。

通过额外的短的居间序列连接去饱和酶PTU中的元件。两个去饱和酶PTU序列侧翼有Invitrogen的重组位点，其用于促进将这些PTU表达盒转移入土壤杆菌转化质粒中。另外，质粒含有复制起点、和卡那霉素选择标志。

pDAB7319的描述：经由pDAB7318和pDAB7309(图5；SEQ ID NO:53)之间的重组构建pDAB7319(图7；SEQ ID NO:60)。此质粒含有前面“pDAB7318的描述”中列出的两个去饱和酶PTU序列。这些PTU在植物转化二元载体pDAB7309的T链DNA边界区内以头至尾取向定向。在其它调节元件诸如烟草RB7基质附着区(RB7MARv2；Genbank:U67919)、Overdrive(Toro等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85(22):8558-62)和T链边界序列(T-DNA Border A and T-DNA Border B；Gardner等(1986)Science 231:725-7,及PCT国际专利公开文本No.WO2001/025459A1)外，此二元载体含有膦丝菌素乙酰基转移酶PTU，其由木薯叶脉花叶病毒启动子(CsVMV启动子v2；Verdaguer等(1996)Plant Mol.Biol.31:1129-39)；膦丝菌素乙酰基转移酶(PAT v5；Wohlleben等(1988)Gene 70:25-37)；和根癌土壤杆菌ORF1 3’非翻译区(AtuORF1 3’UTR v4；Huang等(1990),见上文)构成。将含有上文所描述的PTU的质粒分离，并经由限制酶消化和DNA测序来确认。

pDAB7320的描述：使用标准分子生物学技术构建pDAB7320(图8；SEQ ID NO:55)。此质粒含有一个去饱和酶PTU序列。去饱和酶PTU含有PvPhas启动子v2、PvPhas 5’UTR、LnD9DS-2 v2(SEQ ID NO:17)、和AtuORF23 3’UTR。通过额外的短的居间序列连接去饱和酶PTU中的元件。去饱和酶PTU序列侧翼也有Invitrogen的重组位点以促进其转移入土壤杆菌转化质粒中。另外，质粒含有复制起点和卡那霉素选择标志。

pDAB7321的描述：经由pDAB7320和pDAB7309之间的重组构建pDAB7321(图9；SEQ ID NO:61)。此质粒含有前面“pDAB7319的描述”中所列的去饱和酶PTU序列。此PTU在植物转化二元载体pDAB7309的T链DNA边界区内以头至尾取向定向。在其它调节元件诸如Overdrive和T链边界序列(T-DNA边界A和T-DNA边界B)外，此二元载体含有膦丝菌素乙酰基转移酶PTU：CsVMV启动子v2；PAT v5；和AtuORF1 3’UTR v4。将含有上文所描述的PTU的质粒分离，并经由限制酶消化和DNA测序来确认。

pDAB7323的描述：使用标准分子生物学技术构建pDAB7323(图10；SEQ ID NO:56)。此质粒含有两个去饱和酶PTU序列。第一去饱和酶PTU含有PvPhas启动子v2、PvPhas 5’UTR、AnD9DS v3(SEQ ID NO:47)、PvPhas 3’UTR、和PvPhas 3’MAR v2。第二去饱和酶PTU含有PvPhas启动子v2、PvPhas 5’UTR、HzD9DS v2(SEQ ID NO:16)、和AtuORF23 3’UTR。通过额外的短的居间序列连接去饱和酶PTU中的元件。两个去饱和酶PTU序列侧翼有Invitrogen的重组位点以促进其转移入土壤杆菌转化质粒中。另外，质粒含有复制起点和卡那霉素选择标志。

pDAB7324的描述：经由pDAB7323和pDAB7309之间的重组构建pDAB7324(图11；SEQ ID NO:62)。此质粒含有前面“pDAB7323的描述”中所列的两个去饱和酶PTU序列。这些PTU在植物转化二元载体pDAB7309的T链DNA边界区内以头至尾取向定向。在其它调节元件诸如Overdrive和T链边界序列(T-DNA边界A和T-DNA边界B)外，此二元载体含有膦丝菌素乙酰基转移酶PTU：CsVMV启动子v2；PAT v5；和AtuORF1 3’UTR v4。将含有上文所描述的PTU的质粒分离，并经由限制酶消化和DNA测序来确认。

pDAB7325的描述：使用标准分子生物学技术构建pDAB7325(图12；SEQ ID NO:57)。此质粒含有一个去饱和酶PTU序列。此去饱和酶PTU含有PvPhas启动子v2、PvPhas 5’UTR、HzD9DS v2(SEQ ID NO:16)、和AtuORF23 3’UTR。通过额外的短的居间序列连接去饱和酶PTU中的元件，并且去饱和酶PTU序列侧翼有Invitrogen的重组位点以促进其转移入土壤杆菌转化质粒中。另外，质粒含有复制起点和卡那霉素选择标志。

pDAB7326的描述：经由pDAB7325和pDAB7309之间的重组构建pDAB7326(图13；SEQ ID NO:63)。此质粒含有前面“pDAB7325的描述”中所列的去饱和酶PTU序列。PTU在植物转化二元载体pDAB7309的T链DNA边界区内以头至尾取向定向。在其它调节元件诸如Overdrive和T链边界序列(T-DNA边界A和T-DNA边界B)外，此二元载体含有膦丝菌素乙酰基转移酶PTU：CsVMV启动子v2；PAT v5；和AtuORF1 3’UTR v4。将含有上文所描述的PTU的质粒分离，并经由限制酶消化和DNA测序来确认。

pDAB7327的描述：使用标准分子生物学技术构建pDAB7327(图14；SEQ ID NO:58)。此质粒含有一个去饱和酶PTU序列。去饱和酶PTU含有PvPhas启动子v2、PvPhas 5’UTR、AnD9DS v3基因(SEQ ID NO:49)、和AtuORF23 3’UTR。通过额外的短的居间序列连接去饱和酶PTU中的元件。去饱和酶PTU序列侧翼也有Invitrogen的重组位点以促进其转移入土壤杆菌转化质粒中。另外，质粒含有复制起点和卡那霉素选择标志。

pDAB7328的描述：经由pDAB7327和pDAB7309之间的重组构建pDAB7328(图15；SEQ ID NO:64)。此质粒含有前面“pDAB7327的描述”中所列的去饱和酶PTU序列。此PTU在植物转化二元载体pDAB7309的T链DNA边界区内以头至尾取向定向。在其它调节元件诸如Overdrive和T链边界序列(T-DNA边界A和T-DNA边界B)外，此二元载体含有膦丝菌素乙酰基转移酶PTU：CsVMV启动子v2；PAT v5；和AtuORF1 3’UTR v4。将含有上文所描述的PTU的质粒分离，并经由限制酶消化和DNA测序来确认。

pDAB7329的描述：使用标准分子生物学技术构建pDAB7329(图16；SEQ ID NO:59)。此质粒含有一个去饱和酶PTU序列，其含有PvPhas启动子v2、PvPhas 5’UTR、MgD9DS v2(SEQID NO:15)、和AtuORF23 3’UTR。通过额外的短的居间序列连接此去饱和酶PTU中的元件。去饱和酶PTU序列侧翼有Invitrogen的重组位点以促进其转移入土壤杆菌转化质粒中。另外，质粒含有复制起点和卡那霉素选择标志。

pDAB7330的描述：经由pDAB7329和pDAB7309之间的重组构建pDAB7330(图17；SEQ ID NO:65)。此质粒含有前面“pDAB7325的描述”中所列的去饱和酶PTU序列。此PTU在植物转化二元载体pDAB7309的T链DNA边界区内以头至尾取向定向。在其它调节元件诸如Overdrive和T链边界序列(T-DNA边界A和T-DNA边界B)外，此二元载体含有膦丝菌素乙酰基转移酶PTU：CsVMV启动子v2；PAT v5；和AtuORF1 3’UTR v4。将含有上文所描述的PTU的质粒分离，并经由限制酶消化和DNA测序来确认。

pDAB7331的描述：在前述物质外，构建不含去饱和酶PTU的对照质粒(SEQ ID NO:66)。图18。在pDAB7309中描述的其它调节元件外，此构建体仅含有膦丝菌素乙酰基转移酶PTU。

实施例4：土壤杆菌转化

使用来自Weigel和Glazebrook(2002)“How to Transform Arabidopsis,”第5章,于Arabidopsis,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY的方案制备电感受态根癌土壤杆菌细胞(表9)。将50μL感受态土壤杆菌细胞在冰上融化，并使用300至400ng二元载体质粒DNA转化。在以下条件下使用预先冷却的电穿孔小杯(0.2cm)和Bio-Rad Gene电穿孔仪(Hercules,CA)在存在DNA的情况中电穿孔细胞混合物：电压：2.5kV，脉冲长度：5msec，输出电容25μF，电阻200Ω。在电穿孔后，将1mL YEP培养基(酵母提取物(10g/L)、蛋白胨(10g/L)、和NaCl(5g/L))添加至每个小杯，并将细胞-YEP悬浮液转移至15mL培养管。将细胞于28℃在温和搅动的情况中温育4小时，之后，将培养物在具有依照表9的合适选择的YEP+琼脂上铺板。将板于28℃温育2-4天，将菌落选出，并划线到具有抗生素选择的新鲜YEP+琼脂板上，并于28℃温育1-3天。使用酮乳酸(Ketolactose)测试将菌落确认为土壤杆菌，并使用单一菌落隔离群的两次传代进一步分离酮乳酸阳性菌落。在完成单一菌落分离后对菌落生成最终的接合板(patch plate)。

表9.土壤杆菌菌株和抗生素选择。

土壤杆菌菌落验证：通过使用载体特异性限制性消化酶使用限制性消化分析来验证完整质粒的存在。依照制造商推荐的方案来使用Macherey-Nagel质粒DNA试剂盒以自选定的经转化的土壤杆菌菌落纯化质粒DNA。包括土壤杆菌转化中使用的二元载体的质粒DNA作为对照。使用0.75-1μg DNA运行四个分开的消化反应。容许反应运行1-2小时，然后通过琼脂糖凝胶电泳和溴化乙啶染色来分析。选择所有酶的消化物与质粒对照相同并且与预期的条带大小匹配的菌落。

使用根癌土壤杆菌菌株LBA404(Invitrogen Carlsbad,California)进行土壤杆菌转化，并使用根癌土壤杆菌菌株Z707S(Hepburn等(1985)J.Gen.Microbiol.131:2961-9)进行芸苔转化。

实施例5：土壤杆菌介导的对拟南芥的转化

拟南芥转化：使用基于Clough和Bent(1998)Plant J.16:735-743的方法的浸花法转化拟南芥。使用选择的土壤杆菌菌落来接种含有适合于选择的抗生素的YEP培养基的一个或多个30mL预培养物。将培养物于28℃在以220rpm不断搅动的情况中温育过夜。使用每个预培养物接种含有供选择用的抗生素的YEP培养基的两个500mL培养物，并将培养物于28℃在不断搅动的情况中温育过夜。然后，将细胞以约8700g于室温沉淀10分钟，并弃去所得的上清液。将细胞团粒在500mL渗透培养基中温和重悬，所述渗透培养基含有：1/2xMurashige和Skoog盐/Gamborg氏B5维生素、10％(w/v)蔗糖、0.044μM苄氨基嘌呤(10μL/升DMSO中的1mg/mL储液)、和300μL/升L-77。将约1个月龄的植物浸入培养基中达15秒，注意浸没最新的花序。然后，将植物在其侧放下，并覆盖(透明或不透明)24小时，然后用水清洗，并直立放置。将植物于22℃以16小时光照/8小时黑暗光周期培养。浸入后约4周，自植物收获种子。

拟南芥生长条件：将新鲜收获的种子于室温在存在干燥剂的情况中干燥7天。干燥后，将种子在0.1％琼脂糖(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)溶液中悬浮。将悬浮的种子于4℃贮存2天以完成休眠需要，并确保同步种子萌发(层积)。将Sunshine混合物LP5(SunGro Horticulture Inc.,Bellevue,WA)用细蛭石覆盖，并用霍格兰(Hoaglan)氏溶液地下灌溉，直至湿润。将土壤混合物排干24小时。将分层种子播种至蛭石上，并用湿度罩(KORDProducts,Bramalea,Ontario,Canada)覆盖7天。使种子萌发，并将植物在Conviron控制器(CMP4030和CMP3244型,Controlled Environments Limited,Winnipeg,Manitoba,Canada)中在长日照条件(16小时光照/8小时黑暗)下以120-150μmol/m²sec的光强在恒定的温度(22℃)和湿度(40-50％)下培养。最初，用霍格兰氏溶液，随后用去离子水给植物浇水，以保持土壤润而不湿。将接近种子收获(收获前1-2周)的植物弄干。

T ₁ 转化植物的选择：将T₁种子在10.5”x 21”萌发盘(T.O.Plastics Inc.,Clearwater,MN)上播种，如上文所描述的，并在概述的条件下培养。播种后5-6天将罩除去。播种后5天，及播种后再过10天，使用每次应用投递有效率280g/ha草铵膦的DeVilbiss压缩空气喷雾尖端，用喷雾体积10mL/盘(703L/ha)的0.20％草铵膦(glufosinate)除草剂(Liberty)溶液喷雾幼苗。对于要喷雾的每个盘，将10mL草铵膦除草剂溶液移液入20mL闪烁瓶中。使用水平和垂直应用模式投递喷雾。每次喷雾后，将具有除草剂名称、应用速率、和应用日期的喷雾标签添加至每个选择盘。第二次喷雾后4至7天，将除草剂抗性植物鉴定，并移植入用Sunshine混合物LP5制备的盆中。将移植的植物在具有上文提及的生长条件的温室中放置。移植后6至8周，将来自每个植物的种子收获，并用独特的标识号分开贮存。

实施例7：土壤杆菌介导的对芸苔的转化

土壤杆菌制备：使用含有pDAB7319,pDAB7321,pDAB7324,pDAB7326,pDAB7328,pDAB7330或pDAB7331的土壤杆菌菌株对含有链霉素(100mg/mL)和壮观霉素(50mg/mL)的YEP(细菌用蛋白胨(20.0g/L)和酵母提取物(10.0g/L))板划线，并于28℃温育2天。将一环2天划线板接种入150mL进入无菌500mL带有挡板的烧瓶中的具有链霉素(100mg/mL)和壮观霉素(50mg/mL)的改良YEP液体中，并以200rpm于28℃摇动。将培养物在M-培养基(LS盐；3％葡萄糖；改良的B5维生素；1μM细胞分裂素；1μM 2,4-D；pH 5.8)中重悬，并稀释至合适的浓度(50个Klett单位)，之后转化芸苔下胚轴。

芸苔转化：

种子萌发：将芸苔种子(品种Nexera 710)在10％Clorox中表面灭菌10分钟，并在钢滤网中用无菌蒸馏水漂洗三次。将种子在Phytatray中含有的1/2MS芸苔培养基(1/2MS、2％蔗糖、0.8％琼脂)(每个Phytatray为25粒种子)上种植以进行萌发。将盘在具有设置为25℃和16小时光照/8小时黑暗光周期的生长方案的环境生长室(Percival Scientific,Inc.,Perry,IA)中放置，并萌发5天。

预处理：在第5天，将约3mm下胚轴段在无菌情况下切出，弃去根和幼芽部分(通过在切出过程期间将它们放入10mL无菌milliQ水中放置下胚轴干燥)。在具有设置为22-23℃和16小时光照/8小时黑暗光周期的生长方案的环境生长室中预处理前，将下胚轴段在无菌滤纸上在愈伤组织诱导培养基MSK1D1(MS；1mg/L细胞分裂素；1mg/L 2,4-D；3％蔗糖；0.7％植物琼脂(Phytagar))上水平放置3天。

与土壤杆菌的共培养：在土壤杆菌处理前一天，接种含有合适抗生素的YEP培养基的烧瓶。将下胚轴段从滤纸转移至含有10mL液体M培养基的空100x 25mm培养皿以防止下胚轴段干燥。在此阶段时使用刮刀挖出该段，并转移。用移液管除去液体M培养基，并将40mL土壤杆菌悬浮液添加至培养皿(500个段及40mL土壤杆菌溶液)。将各段在周期性涡旋振荡培养皿的情况下处理30分钟，使得下胚轴在土壤杆菌溶液中保持浸没。在处理期结束时，将土壤杆菌溶液移液入废物烧杯中，用高压灭菌器处理，并弃去(将土壤杆菌溶液完全除去以放置土壤杆菌生长过度)。将经处理的下胚轴用镊子返回转移至含有MSK1D1及滤纸的初始板，注意确保各段不干燥。与对照段一起将下胚轴段返回降低的光强(通过用铝箔覆盖板)下的环境生长室，并将经处理的下胚轴与土壤杆菌共培养3天。

在选择培养基上的愈伤组织诱导：在共培养3天后，将下胚轴段用镊子个别转移至愈伤组织诱导培养基MSK1D1H1(MS；1mg/L细胞分裂素；1mg/L 2,4-D；0.5g/L MES；5mg/LAgNO₃；300mg/L特美汀(Timentin)；200mg/L羧苄西林(Carbenicillin)；1mg/L Herbiace；3％蔗糖；0.7％植物琼脂)上。将下胚轴段在培养基上锚定，但是不包埋于培养基中。

选择和幼芽再生：在愈伤组织诱导培养基上7天后，将生成愈伤组织的(callusing)下胚轴段转移至具有选择的幼芽再生培养基1MSB3Z1H1(MS；3mg/L BAP；1mg/L玉米素；0.5g/L MES；5mg/L AgNO₃；300mg/L特美汀；200mg/L羧苄西林；1mg/L Herbiace；3％蔗糖；0.7％植物琼脂)上。在14天后，将具有幼芽的下胚轴转移至具有升高的选择的再生培养基2MSB3Z1H3(MS；3mg/L BAP；1mg/L玉米素；0.5gm/L MES；5mg/L AgNO₃；300mg/L特美汀；200mg/L羧苄西林；3mg/L3％蔗糖；0.7％植物琼脂)。

幼芽伸长：在14天后，将具有幼芽的段转移至幼芽伸长培养基MSMESH5(MS；300mg/L特美汀；5mg/L2％蔗糖；0.7％TC琼脂)。将已经伸长的幼芽分离，并转移至MSMESH5。在14天后，将在第一轮中尚未伸长的剩余幼苗置于MSMESH5上，并转移至相同组成的新鲜选择培养基。在此阶段时，弃去所有剩余的下胚轴段。

将在2周后在MSB3Z1H3培养基上伸长的幼芽分离，并转移至MSMESH5培养基。将在MSMESH5上在第一轮中尚未伸长的剩余幼芽分离，并转移至相同组成的新鲜选择培养基。在此阶段时，弃去所有剩余的下胚轴段。

根诱导：在14天后，将根转移至MSMEST培养基(MS；0.5g/L MES；300mg/L特美汀；2％蔗糖；0.7％TC琼脂)以进行根诱导。将在MSMEST培养基上在第一次转移中没有生根的幼芽在MSMEST培养基上转移第二或第三个循环，直至获得生根的植物。将在MSMEST培养基上在第一次转移中没有伸长/生根的幼芽在MSMEST培养基上转移第二或第三个循环，直至获得生根的植物。发送在MSMESH5或MSMEST上生根并且呈PCR阳性的植物以移植入土壤中。在锻炼后，对T₀芸苔植物进一步分析含有转基因PTU盒的事件。然后，将植物转移至温室，培养至成熟，并收获种子以进行别的分析。

实施例8：对T₁拟南芥叶组织和T₀芸苔叶组织的DNA分析

分析T₀芸苔植物和T₁拟南芥植物以鉴定含有PTU表达盒的植物。实施测定法以最初筛选推定经转化的植物的样品，并鉴定含有单拷贝的pat PTU的事件。将鉴定为单拷贝事件的事件保持，并经由PCR进一步分析去饱和酶PTU的存在。经由Southern印迹分析进一步分析对去饱和酶表达盒PTU呈PCR阳性的事件。完成Southern印迹分析以确认植物含有来自用于转化植物的二元载体的基因表达盒PTU。选择含有所有PTU的单拷贝事件以进行推进。

DNA分离：使用Qiagen的96植物试剂盒(Qiagen,Valencia,CA)自冻干的叶组织提取总基因组DNA(gDNA)。然后，对于拷贝数，将此gDNA稀释至10ng/μL(芸苔)或0.7ng/μL(拟南芥)以用于PCR和测定法。

分析：使用测定法(Third Wave Technologies,Madison,WI)完成选择标志pat的拷贝数分析。将基因组DNA于95℃变性10分钟，在冰上冷却，并依照制造商推荐的方案与试剂主混合物(master mix)混合，所述试剂主混合物含有寡核苷酸探针、能够荧光共振能量转移(FRET)的染料、和酶切割酶。反应含有内部参照基因的探针。使用1-脱氧木酮糖-5-磷酸还原异构酶(DXR1)基因作为拟南芥测定反应的内部参照基因，并使用高速泳动族蛋白基因(HMGa)作为芸苔测定反应的内部参照基因。另外，板含有1个拷贝、2个拷贝、和4个拷贝标准品，及野生型对照样品和不含样品的空白孔。将整个反应用矿物油覆盖，之后在热循环仪中于63℃温育1.5小时。在荧光读板仪(Synergy^TM 2,BioTek Instruments,Winooski,VT)上阅读所得的反应。对FAM(λ485-528nm)和RED(λ560-620nm)通道两者收集读数。通过这些，通过用样品原始信号除以无模板原始信号对每份样品测定每个通道的比零(即，背景)倍数(fold-over-zero)。通过此数据，构建标准曲线，并通过线性回归分析确定最佳拟合。使用自此拟合鉴定的参数，然后，对每份样品测定表观pat拷贝数。

PCR分析：使用扩增每种植物转录单元的引物完成PCR分析。这些引物位于启动子(菜豆蛋白)和3’UTR(菜豆蛋白或ORF23)中。使用这些相同引物组对芸苔和拟南芥两者进行PCR分析。对于PCR分析pDAB7319和pDAB7324事件，使用引物MAS414(SEQ ID NO:18)和MAS415(SEQ ID NO:19)来扩增第一PTU。此PTU由菜豆蛋白启动子、来自构巢曲霉的酰基-CoA delta-9去饱和酶基因的功能等同物(AnD9DS v3；SEQ ID NO:49)、和菜豆蛋白3’UTR终止子组成。对于PCR扩增构建体pDAB7319中的第二PTU，使用引物MAS415和MAS413(SEQ IDNO:20)。此PTU由菜豆蛋白启动子、来自颖枯小球腔菌的酰基-CoA delta-9去饱和酶基因的功能性等同物(LnD9DS-2 v2；SEQ ID NO:17)、和ORF23 3’UTR组成。也使用MAS415和MAS413引物对来扩增通过用pDAB7324(菜豆蛋白启动子、美洲棉铃虫酰基-CoA delta-9去饱和酶基因v2(HzD9DS v2；SEQ ID NO:16)、和ORF23 3’UTR)转化生成的事件的第二PTU。另外，使用MAS415和MAS413引物对来扩增构建体pDAB7321和pDAB7326中的PTU。

使用20ng基因组DNA、5个单位Ex Taq(Takara)、1x反应缓冲液、0.2μM每种dNTP、和0.8μM每种引物在25μL体积中实施PCR反应。在DNA Engine2热循环仪(BioRad,Hercules,CA)中实施扩增反应。对引物MAS413和MAS415使用以下循环条件：于94℃持续3分钟；接着是于94℃持续30秒、于63℃持续30秒、和于72℃持续3分钟的35个循环；和于72℃最终延伸10分钟。对引物MAS414和MAS415使用的循环条件是相同的，唯一的差别在于退火温度从63℃下降至60℃。将反应产物在1％琼脂糖凝胶上运行，用溴化乙啶染色，并在Gel-Doc^TM上显现。

Southern印迹分析：使用Southern印迹分析来建立芸苔事件的整合样式。这些实验产生的数据表明芸苔基因组内去饱和酶转基因的整合和完整性。选定的事件表征为含有来自用于植物转化的二元载体的单拷贝去饱和酶转基因的全长、简单整合事件。

使用对去饱和酶基因特异性的探针和描述的限制酶(其在位于质粒内的位点处切割)进行详细的Southern印迹分析。这些消化物生成在质粒内部的杂交片段，或跨越质粒与芸苔基因组DNA的接合的片段(边界片段)。通过限制酶和探针的组合的Southern杂交指示的分子大小对于每种事件而言是独特的。这些分析还显示了已经将质粒片段在没有T链DNA重排的情况中插入芸苔基因组DNA中。

对于Southern印迹分析，使用植物微型试剂盒(Plant Mini Kit)(Qiagen)提取100mg冻干的芸苔叶组织。用SpeI和PacI限制性内切核酸酶(New England Biolabs,Ipswich,MA)同时消化每份样品5微克(5μg)gDNA以获得含有感兴趣的PTU，和/或选择标志(PAT)的片段，从而测定拷贝数。将经消化的DNA在0.8％琼脂糖凝胶上分离。

简言之，在电泳分离和显现DNA片段后，用0.25N HCl将凝胶脱嘌呤约20分钟，然后暴露于变性溶液达约30分钟，接着是中和溶液持续至少30分钟。用10×SSC使用芯吸系统向尼龙膜(Millipore,Billerica,MA)上实施Southern转移过夜。转移后，用2×SSC溶液清洗膜，并通过UV交联将DNA与膜结合。此过程生成准备好杂交的Southern印迹膜。

生成探针，并将PCR片段自质粒DNA扩增，并使用凝胶提取试剂盒(Qiagen)经由凝胶提取纯化。用于创建LnD9DS探针的引物是arw008(SEQ ID NO:21)和arw009(SEQ ID NO:22)。用于创建HzD9探针的引物是arw010(SEQ ID NO:23)和arw011(SEQID NO:24)。所有三种反应的PCR条件由具有退火温度63℃和延伸时间1分钟的35循环构成。使用RmT随机引物标记试剂盒(Stratagene,La Jolla,CA)用³²P标记PCR片段。

将杂交步骤于约65℃在杂交炉中进行过夜。将尼龙膜印迹漂洗，并将印迹在磷光体图像屏(phosphor image screen)上暴露过夜，并在Storm^TM 860扫描仪(MolecularDynamics,Sunnyvale,CA)上扫描。

实施例9：来自含有酰基-CoA delta-9去饱和酶的转基因拟南芥的种子的脂肪酸组成

用含有LnD9DS-2 v2(pDAB7321；SEQ ID NO:61)、HzD9DS v2(pDAB7326；SEQ IDNO:63)或MgD9DS v2(pDAB7330；SEQ ID NO:65)基因的土壤杆菌载体转化拟南芥植物。也用含有AnD9DS基因(pDAB7328；SEQ ID NO:64)的载体转化植物。使用仅含有选择标志pat基因(pDAB7331；SEQ ID NO:66)的空载体作为阴性对照。也使用组合的两种去饱和酶实施转化，以组合硬脂酰优选性去饱和酶(AnD9DS)与棕榈酰优选性去饱和酶，即LnD9DS-2(pDAB7319；SEQ ID NO:60)或HzD9DS(pDAB7324；SEQ ID NO:62)。在所有情况中，去饱和酶基因由种子特异性PvPhas启动子(美国专利5,504,200)驱动。自除草剂抗性T₁植物收获大批T₂种子，所述除草剂抗性T₁植物确认为含有pat基因(根据测定法分析)和去饱和酶PTU(根据PCR分析)。

使用钢球和球磨机在作为替代物的含有庚烷的十七烷酸甘油三酯(Nu-Chekprep,Elysian,MN)中将种子样品均质化。在均质化前，将MeOH中的0.25M新鲜制备的MeONa(Sigma)溶液添加至样品。在适度加热(40℃)和不断摇动下进行反应。通过回收甲基化替代物证实反应。将FAME的提取重复三次，并在分析前合并所有庚烷层。通过检查第四次提取/衍生化中FAME的存在证实提取的完全性。使用来自SGE的毛细管柱BPX 70(15m x 0.25mm x0.25μm)通过GC-FID分析所得的FAME。通过保留时间鉴定每种FAME，并通过注射来自Matreya,LLC(Pleasant Gap,PA)的油菜籽油参照混合物作为校正标准品量化。

对来自转基因事件的T₂种子的FAME分析显示了每种去饱和酶的表达对降低种子的总饱和脂肪酸含量具有显著影响，如自每组事件的均值饱和脂肪酸含量测定的。表10和图19。在此表和以下表中，不以相同字母连接的数值是显著不同的，如使用统计学软件包(SAS Institute Inc.,Cary,NC)中实施的Tukey-Kramer HSD检验测定的。AnD9DS与LnD9DS-2或HzD9DS的组合产生最低的均值总饱和脂肪酸含量。

表10：T₂拟南芥种子的总饱和脂肪酸含量

虽然去饱和酶都降低拟南芥种子的总饱和脂肪酸含量，但是它们对棕榈酸和硬脂酸脂肪酸含量具有不同影响，如自酵母实验预测的。表11和图20显示了每组事件的均值棕榈酸含量。表12和图21显示了每组事件的T₂种子的均值硬脂酸含量。

表11：T₂拟南芥种子的棕榈酸含量

表12：T₂拟南芥种子的硬脂酸含量

AnD9DS和MgD9DS比LnD9DS-2和HzD9DS具有更大的对硬脂酸含量的影响。相反，LnD9DS-2和HzD9DS比AnD9DS和MgD9DS具有更大的对棕榈酸含量的影响。去饱和酶的组合对这两种脂肪酸具有最大的影响。在去饱和酶对增加棕榈油酸(其是棕榈酸的delta-9去饱和的主要产物)的种子含量的影响中也观察到这些结果。表13和图22。

表13：T₂拟南芥种子的棕榈油酸含量

由于位置和拷贝数效应，在分析的事件间存在着去饱和酶对饱和脂肪酸含量的影响的预期变化。与来自野生型和经对照转化的植物的种子的谱并排，表14中显示了具有最低总饱和脂肪酸含量的事件的完整脂肪酸谱(5个最低事件的平均值)的比较。

表14：具有最低总饱和脂肪酸含量的T₂转基因拟南芥的脂肪酸谱。标准差在圆括号中。

*Vacc.＝顺式异油酸(18:1n-7)

在降低饱和棕榈酸和硬脂酸脂肪酸的含量和增加单不饱和脂肪酸含量(棕榈油酸和油酸)外，去饱和酶的存在还降低种子中的花生酸(C20:0)量。这推测是因为此脂肪酸源自硬脂酸和棕榈酸的伸长。似乎没有导入的去饱和酶对C20:0的直接去饱和，因为没有作为C20:1Δ9的二十碳烯酸(C20:1)的伴随增加。

实施例10：Delta-9去饱和酶抗体制备

诊断工具诸如抗体对于表征植物中转基因delta-9去饱和酶蛋白质表达是期望的。因为酰基-CoA delta-9去饱和酶是膜结合蛋白，所以大肠杆菌中的常规过表达是困难的。然而，通过过表达每种delta-9去饱和酶蛋白质的C端片段成功生成抗体，所述C端片段不包含蛋白质的任何跨膜域。

聚合酶链式反应：PCR引物设计为扩增每种去饱和酶的等同C端片段。3’引物设计为编码具有C端6x His标签的蛋白质片段。将Ndel和BamHI限制性位点分别掺入5’和3’引物中，以促进克隆。下文在表15中给出引物序列。预期的扩增产物是659bp(对于LnD9DS-2)、683bp(对于MgD9DS)、和335bp(对于HzD9DS)。使用Takara Ex Taq^TM PCR试剂盒(Clontech,Mountain View,CA)使用供应商的条件实施PCR反应。总PCR反应体积是50μL。每个反应含有200ng质粒DNA和50pmol每种引物。将DNA于94℃变性1分钟，接着是94℃达30秒，60℃达1分钟，和72℃达30秒的30个循环。于72℃实施最终的延伸达10分钟。将每种PCR产物在两孔间在无菌0.75％琼脂糖凝胶上运行，并使用Montage旋转柱将DNA进行凝胶纯化，并在15μL TE缓冲液中洗脱。

表15：用于来自LnD9DS-2、MgD9DS、和HzD9DS的C端片段的PCR扩增的寡核苷酸引物的序列。

TOPO克隆：将纯化的C端片段TA克隆入2.1载体(Invitrogen,Carlsbad,CA)中，并遵循制造商的方案(Invitrogen)转化入Top 10大肠杆菌细胞中。选择转化，并使用柱(Macherey-Nagel GmbH&Co,Duren,Germany)纯化质粒DNA。将3微升(3μL)DNA用NdeI和BamHI在总体积20μL中于37℃消化90分钟，并在0.8％琼脂糖凝胶上运行。在每种情况中，基因特异性片段(加上3.9kb载体条带)是可见的。对每种克隆基因选择三个阳性克隆，并测序以确认扩增的PCR片段没有错误。每个MgD9DS克隆含有碱基对45处的沉默点突变，指示发表序列和PCR模板之间的单核苷酸多态性，或沉默PCR错误。因为突变是沉默的，所以没有必要改正，并且选择一个克隆进行亚克隆。

delta-9去饱和酶C端片段表达质粒的制备：将PCR扩增的delta-9去饱和酶片段用NdeI和BamHI限制酶消化，并连接入pET30b(+)表达载体内相应的限制性位点中。克隆步骤导致添加15个C端氨基酸，构成C端6x His标签以促进全长蛋白质纯化。预期这些额外的氨基酸不影响蛋白质表达。获得阳性克隆，并经由限制酶消化和测序反应确认。

在大肠杆菌中表达delta-9去饱和酶C端肽片段：依照制造商推荐的方案(Novagen,Madison,WI)将delta-9去饱和酶/pET30b(+)表达质粒转化入BL21(DE3)大肠杆菌细胞中。将细胞含有卡那霉素(50μg/mL)和葡萄糖(1.25M)的LA板上铺板。将板于37℃温育过夜。从板刮出完整的一环细胞，并接种入含有250mL LB和卡那霉素(50μg/mL)及异丙基-P-D-硫代半乳糖苷(0.75mM)诱导物的500mL烧瓶中。测试三种诱导条件。如下将培养物于不同温度诱导，并在不同时间时收获：于28℃过夜(约18小时)；于16℃过夜；或于37℃4小时。通过在250mL瓶中以6,000rpm离心15分钟收获细胞，然后于-20℃冷冻。

delta-9去饱和酶C端肽片段的蛋白质纯化：将来自250mL培养物的细胞团粒融化，并使用手持式匀浆器在含有10％甘油和0.5mL蛋白酶抑制剂混合物(Sigma,St.Louis,MO)的50mL冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中悬浮。使用Branson 450型超声波仪(Danbury,CT)将细胞在冰上破坏约10分钟。通过以10,000x g离心15分钟沉淀包含体，并用含有0.5％TritonX-100的PBS提取2-3次，直至上清液的蛋白质浓度达到基线，如通过Bradford蛋白质测定法测量的。将回收的包含体在含有6M尿素和5mM DTT的PBS溶液中于室温在搅拌的情况中溶解约1小时。通过以30,000x g离心15分钟将溶解的蛋白质与不溶性材料分开，并将保留的上清液应用于5mL Ni亲和柱(GE Healthcare,HiTrap Chelating,Piscataway,NJ)上。C端delta-9去饱和酶肽的组氨酸标签结合金属树脂，并且使用Explorer 100(GEHealthcare,Piscataway,NJ)用50-200mM咪唑梯度洗脱每种片段。将级分(各3mL)收集，并通过SDS-PAGE分析洗脱峰。将含有C端delta-9去饱和酶肽的级分合并，并使用Ultra 10,000MWCO滤器装置(Millipore,Billerica,MA)浓缩至小于5mL体积。然后，将蛋白质样品注射至Hi Load^TM XK16/60Superdex^TM 200大小排阻柱(GE Healthcare,Piscataway,NJ)上，并用20mM Tris-HCI、150mM NaC1、和1mM DTT中的6M尿素平衡。将含有纯的C端delta-9去饱和酶肽的峰级分(各4mL)保留(通过SDS-PAGE分析和其它生物化学表征验证后)，并用于抗体生成。生成具有预期大小27kDa(对于LnD9DS-2肽)、15kDa(对于HzD9DS肽)、和28kDa(对于MgD9DS肽)的肽。诱导条件生成足以通过SDS-PAGE凝胶的考马斯蓝染色显现的蛋白质。

多克隆抗体生成：约定劳务(contract service)(Strategic BioSolutions,Newark,DE)生成针对三种C端delta-9去饱和酶肽之每种的兔抗体。在其标准规程后，获得三种蛋白质片段之每种的高效价(通过使用ELISA验证)抗血清。将每种纯化的C端delta-9去饱和酶肽用20mM Tris-HC1、150mM NaC1、1mM DTT缓冲液，及用终浓度2-3M尿素洗脱，以在溶液中保持蛋白质。将约10mg蛋白质发送至Strategic BioSolutions以生成多克隆抗体。对每种免疫原选择两只兔，并使用标准方案(70天免疫)。购买称作金的新佐剂以制备乳剂。免疫期间和在方案结束时也实施ELISA滴定以确保抗体生成的成功。将抗血清在两个分开的时间点投递；一个来自标准的2个月规程，而另一个来自放血。

为了自兔血清分离总IgG，将约20-30mL高效价抗血清应用于5mL碱耐受性蛋白A柱(GE Healthcare,HiTrap^TM MabSelect SuRe^TM,产品目录编号11-0034-94)。在用PBS缓冲液的标准清洗后，通过对0.1M柠檬酸钠、0.3M NaC1，pH 3.3的短暴露自树脂洗脱结合的IgG，并通过将1/10体积的2M Tris-HCI,pH 9缓冲液添加至每个级分来立即中和。通过遵循标准原位清洗(cleaning-in-place,CIP)规程用0.5N NaOH处理清洁亲和柱以避免IgG的交叉污染。于4℃针对50个体积的PBS将来自每种样品的最终回收IgG透析过夜，并使用BSA标准品(Pierce,产品编号23208)通过Bradford测定法测定蛋白质浓度。将1mL等分试样转移至单独的管，并于-80℃贮存。

这些抗体是用于测量转基因植物材料中去饱和酶蛋白质表达的诊断工具。使用抗体来形成低饱和脂肪酸油表型变化与delta-9去饱和酶蛋白质表达水平之间的关联。

实施例11：T₂拟南芥种子中酰基-CoA delta-9去饱和酶蛋白质的水平

通过Western印迹在成熟的转基因种子样品中检出delta-9去饱和酶多肽。通过在Kleco^TM珠磨器(Bead Beater)(Garcia Machine,Visalia,CA)中用不锈钢珠破裂干种子将种子准备进行分析。添加提取缓冲液(50mM Tris,10mMEDTA,2％SDS)，并将样品管温和摇动30分钟。将样品以3,000rcf离心15分钟。然后，将上清液收集，并用于分析。通过Lowry测定法(BioRad,Hercules,CA)测定种子提取物中总的可溶性蛋白质的量。对于每道20μg总可溶性蛋白质的标准化加载，将样品相对于1.55mg/mL总的可溶性蛋白质标准化，并且在具有40mM DTT的LDS样品缓冲液(Invitrogen,Carlsbad,CA)中制备。将样品在4-12％Bis-Tris凝胶(Invitrogen)中电泳，并转移至硝酸纤维素膜。将印迹在封闭缓冲液中封闭，并用针对四种不同delta-9去饱和酶多肽(AnD9DS,LnD9DS-2,HzD9DS和MgD9DS)的抗体(见实施例10)探查。

在所有情况中，在兔中针对His标签纯化的个别去饱和酶的C端肽片段形成多克隆抗体，如上文所描述的。使用纯化的C端片段作为参照抗原以定量Western印迹。使用抗兔荧光标记的二抗(山羊抗兔AF 633；Invitrogen)进行检测。在Typhoon^TM Trio Plus荧光成像器(GE Healthcare)上显现印迹。用二次曲线拟合生成标准曲线，并使用线性回归量化表达。

来自拟南芥事件的成熟T₂种子的提取物的SDS-PAGE Western印迹在用特异性抗血清探查时显示了合适大小的条带。针对特定的参照抗原量化这些条带。用合适抗血清的拟南芥T₂种子提取物的定量Western印迹指示在成熟种子中检出平均值63ng LnD9DS-2/mg总蛋白质(tp)(最大值228ng/mg tp)，而对于HzD9DS，检出平均值34ng/mg tp(最大值100ng/mg tp)。对于MgD9DS，在T₂种子中检出平均值58ng/mg tp(最大值1179ng/mg tp)。对于AnD9DS事件，在成熟T₂种子中检出平均值625ng/mg tp(最大值1.5μg/mg tp)。如此，相对于AnD9DS，在转基因种子中表达的棕榈酰基优选性去饱和酶LnD9DS-2和HzD9DS少10-18倍。因此，这些去饱和酶的表达水平较高会驱动饱和物，尤其是棕榈酸的进一步降低。

实施例12：在芸苔中表达delta-9去饱和酶基因

自用pDAB7321(SEQ ID NO:61)和pDAB7326(SEQ ID NO:63)(分别含有由种子特异性PvPhas启动子驱动的LnD9DS-2和HzD9DS基因)实施的转化获得一系列转基因芸苔事件。通过PCR分析基因组DNA鉴定含有LnD9DS-2基因的39个pDAB7321事件，并在温室中培养以生成T₁种子。类似地，鉴定80个pDAB7326事件，其含有HzD9DS基因，并生成T₁种子。也用pDAB7319(SEQ ID NO:60)或pDAB7324(SEQ ID NO:62)(其含有AnD9DS基因及偶联的LnD9DS-2或HzD9DS基因，它们均由PvPhas启动子驱动)转化芸苔。分别回收44和76个事件(它们通过PCR分析确认为含有这两种去饱和酶基因)，并将它们在温室中培养以生成T₁种子。

相对于未转化的芸苔植物或用空载体对照转化的植物，对来自用pDAB7321(LnD9DS-2 v2)或pDAB7326(HzD9DS v2)转化的事件的T₁种子样品的FAME分析没有显示饱和脂肪酸水平的显著降低。T₁种子的Western印迹没有显示delta-9去饱和酶蛋白质的可检出水平。另外，在来自用pDAB7319(AnD9DS v3和LnD9DS-2 v2)或pDAB7324(AnD9DS v3和HzD9DS v2)转化的植物的T₁种子中没有检出LnD9DS-2或HzD9DS的可检出蛋白质，而可以容易地检出AnD9DS蛋白。在这些事件中，相对于对照植物观察到饱和脂肪酸的减少，但是这可归因于AnD9DS的表达。

为了评估delta-9去饱和酶基因的相对mRNA水平，自来自用双重去饱和酶构建体(pDAB7319和pDAB7324)转化的事件的形成的芸苔种子提取总RNA，并通过定量实时PCR分析。将种子在干冰上在传粉后20,25,29,32,39或41天时自几个芸苔植物收获，并于-80℃贮存。使用植物RNA提取试剂盒(Qiagen)依照制造商推荐的方案自50mg合并的冷冻种子制备总RNA。使用用于qRT-PCR的III第一链合成Supermix(Invitrogen)依照制造商推荐的方案使用提取的RNA作为模板进行cDNA合成。

使用Roche测定设计中心(Assay Design Center)(Roche Diagnostics,Indianapolis,IN)针对去饱和酶靶物设计RT-PCR测定法。表16中描述了用于测定法的引物。靶测定法利用FAM标记的UPL探针(Roche Diagnostics)。用由Integrated DNATechnologies合成的德克萨斯红标记的芸苔肌动蛋白参照测定法在双重反应中执行这些测定法。

表16：q-RT-PCR测定法详情

靶物	标记物
		AnD9Ds	FAM
HzD9Ds	FAM
		LnD9Ds	FAM
肌动蛋白	Tx-Red

在480II实时PCR热循环仪(Roche)上运行RT-PCR反应。使用533nm发射滤光器和483nm激发信号收集靶UPL测定法的数据。使用610nm滤光器和558nm激发信号收集肌动蛋白参照测定法的数据。使用LC480II软件的“高级相对量化(Advanced RelativeQuantification)”分析工作流自动计算循环时间数值和靶物与参照比率。使用标准ΔΔCt法(Roche)计算每种样品内去饱和酶转录物水平的相对积累。

对于来自pDAB7319(AnD9DS v3和LnD9DS-2 v2)和pDAB7324(AnD9DS v3和HzD9DSv2)的每种芸苔种子样品，HzD9DS或LnD9DS-2转基因的转录物积累显著低于相同事件中AnD9DS的转录物。对转录物积累观察到的差异在少3和20倍间变化。图23。如此，HzD9DS和LnD9DS-2的不充分表达可以造成缺乏多肽的检出和可归因于这些基因的表型的缺乏。

实施例13：通过备选启动子表达delta-9去饱和酶PTU

使用别的转录调节区来表达编码LnD9DS-2、HzD9DS、和MgD9DS蛋白的基因可以进一步增加芸苔内这些delta-9去饱和酶的含量。在发育的较早期表达一段较长的时间的转录调节区的鉴定和使用可以通过促进种子发育的较早阶段时异源基因的强力的种子特异性转录来提高芸苔种子内异源delta-9去饱和酶的水平。此类转录调节区的例子包括但不限于LfKCS3启动子(美国专利7,253,337)和FAE 1启动子(美国专利6,784,342)。单独或组合使用这些启动子以驱动LnD9DS-2、HzD9DS、和MgD9DS表达盒的表达，例如经由与基因诸如那些先前记载于质粒pDAB7319；pDAB7321；pDAB7324；pDAB7326；pDAB7328；和pDAB7330中的基因的可操作连接实现。替换质粒内的转录调节区的方法是本领域内公知的。因而，将包含PvPhas启动子的多核苷酸片段自pDAB7319,pDAB7321,pDAB7324,pDAB7326,pDAB7328或pDAB7330(或用于构建pDAB7319,pDAB7321,pDAB7324,pDAB7326,pDAB7328或pDAB7330的前述质粒)除去，并用LfKCS3或FAE 1启动子区替换。依照前述实施例中所列的规程，使用新构建的质粒来稳定转化芸苔植物。将转基因芸苔植物分离并分子表征。测定所得的delta-9去饱和酶积累，并鉴定强力表达delta-9去饱和酶的芸苔植物。

为了delta-9去饱和酶表达增加而对转录调节区的进一步修饰包括用表17中所描述的任何序列替换现有的Kozak序列。使用标准分子生物学技术完成在delta-9去饱和酶的起始位点上游的备选Kozak序列的工程化改造。将合成的多核苷酸片段合成，并使用本领域内已知的技术在delta-9去饱和酶编码序列的上游克隆。起始密码子的背景对转基因的表达水平具有强烈的影响。将Kozak序列修饰为表17中所列的序列提高异源delta-9去饱和酶的表达水平。

表17：在异源delta-9去饱和酶基因上游掺入以提高表达的Kozak序列。

Kozak序列	SEQ ID NO:	序列
			Kozak#1	SEQ ID NO:40	ggatccaacaATG
Kozak#2	SEQ ID NO:41	acaaccaaaaATG
			Kozak#3	SEQ ID NO:42	acaaccaacctaccATGG
Kozak#4	SEQ ID NO:43	acaaccaaaaaATG

实施例14：设计并合成来自美洲棉铃虫和颖枯小球腔菌的delta-9去饱和酶基因

为了获得植物中更高的异源基因表达水平，修改实施例2中所描述的密码子优化策略，并使用新设计方案再工程化HzD9DS和LnD9DS-2的异源基因蛋白质编码区。

使用已经计算预期宿主植物(其在此情况中是芸苔)的密码子偏爱的表进行密码子选择。在设计delta-9去饱和酶基因的植物表达的编码区中，测定植物优选的主要(“第一选择”)密码子，并以约95％的次数使用。少量使用地，“第二选择”密码子以约5％的频率使用。因而，设计编码每种delta-9去饱和酶的氨基酸序列的新DNA序列，其中新DNA序列与天然delta-9去饱和酶基因相差植物第一优选性和第二优选性密码子的取代以规定氨基酸序列内每个位置处的合适氨基酸。然后，对新序列分析可以已经通过修饰创建的限制酶位点。然后，通过用第一或第二选择优选性密码子替换密码子来除去鉴定的限制酶位点。还除去序列中可以影响感兴趣的基因转录或翻译的其它位点，尤其是高度稳定的茎环结构。

从自芸苔蛋白质编码序列汇编的密码子偏爱表确定自芸苔遗传密码选择优选的密码子选择(第一和第二选择)。在表18和19中，标记为“天然基因％”的栏呈现(每种氨基酸的同义密码子的分布(以所述氨基酸的选择占所有密码子的％计)，如存在于油菜(芸苔)编码区中的。使用存在于芸苔基因中的第一和第二选择密码子的优选密码子分布设计实质上编码M.grisea、美洲棉铃虫和颖枯小球腔菌delta-9去饱和酶的氨基酸序列的新DNA序列以在芸苔中最佳的表达。使用构建的芸苔密码子偏爱表通过逆翻译蛋白质序列SEQ ID NO:12(M.grisea)、SEQ ID NO:13(美洲棉铃虫)、和SEQ ID NO:14(颖枯小球腔菌)启动经植物优化的DNA序列的设计。标记为“植物优化基因(Plnt Opt Gene)％”的栏标示优选的密码子和它们掺入delta-9去饱和酶基因设计中的频率。SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45分别列出新的芸苔优化的LnD9DS-2和HzD9DS去饱和酶的核苷酸序列。这些新的芸苔优化的序列标记为LnD9DS-2 v3和HzD9DS v3。

表18：HzD9DS蛋白的编码区的密码子组成。将天然美洲棉铃虫去饱和酶编码区与植物优化的型式比较。

表19：LnD9DS-2蛋白的编码区的密码子组成。将天然颖枯小球腔菌去饱和酶编码区与植物优化型式比较。

包含SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45的DNA片段的合成由PicoScript和Blue HeronBiotechnology实施。然后，将合成的DNA克隆入表达载体中，并转化入芸苔中，基本上如前述实施例中所描述的。

实施例15：增加植物中酰基-CoA去饱和酶多肽积累的N和C端修饰

内质网(ER)中膜结合蛋白的积累和稳定性可以受到其N和C端的氨基酸序列基序和修饰影响。Ruavid和Hochstrasser(2008)Nat.Rev.Mol.Cell.Biol.9:679-90。具体地，已经显示了N和C端基序和修饰调控真菌和植物，及动物中脂质去饱和酶的积累和稳定性。McCartney等(2004)Plant J.37:156-73；Mziaut等(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97:8883-8。

将Myc或血凝素(HA)表位标签添加至FAD2或FAD3的N端显著提高酵母内这些酶的稳态水平。O’Quin等(2009)Appl Microbiol Biotechnol 83:117-25。因而，利用将这些或类似的表位添加至本发明的delta-9去饱和酶的N端来提高植物中多肽的表达。将编码Myc标签(SEQ ID NO:46)或HA标签(SEQ ID NO:47)的多核苷酸接头在delta-9去饱和酶(例如，HzD9DS,MgD9DS,AnD9DS,LnD9DS-1和LnD9DS-2)编码序列的5’端内以连续的阅读框克隆。使用实施例3中所描述的克隆策略将所得的编码序列在植物表达质粒内克隆。使用新构建的质粒来稳定转化拟南芥和/或芸苔植物细胞、材料或组织。自经转化的植物细胞、材料或组织再生转基因植物。将转基因植物分离并分子表征。测定转基因植物种子中所得的delta-9去饱和酶积累，并鉴定稳健表达delta-9去饱和酶多肽的植物。

来自拟南芥和芸苔中AnD9DS表达(实施例11和12)的证据指示相对于HzD9DS和LnD9DS-2，此特定的去饱和酶酶的显著较高的表达水平。如此，可以使用位于AnD9DS的核心去饱和酶域(含有跨膜区段和保守的催化组氨酸残基)外部的整个或部分N和C端来替换较低表达的去饱和酶中的等同残基，并增加其表达。因而，使用AnD9DS的整个或部分N端残基1-68和C端残基281-455(分别为SEQ ID NO:72和SEQ ID NO:73)来替换整个或部分的LnD9DS-2(SEQ ID NO:14)的68个N端残基(1-68)和168个C端残基(281-449)和/或HzD9DS(SEQ ID NO:13)的76个N端残基(1-76)和60个C端残基(293-353)。使用实施例3中所描述的克隆测序将所得的编码序列在植物表达质粒内克隆。使用新构建的质粒来稳定转化拟南芥和/或芸苔植物细胞、材料、或组织。自经转化的植物细胞、材料或组织再生转基因植物。将转基因植物分离并分子表征。测定转基因植物的种子中所得的delta-9去饱和酶积累，并鉴定稳健表达经修饰的HzD9DS或经修饰的LnD9DS-2多肽的植物。

实施例16：增强植物内酰基-CoA去饱和酶的mRNA表达的修饰

本领域内已知的是，可以通过掺入稳定并提高mRNA积累的遗传元件来增强mRNA的表达。使用在HzD9Ds或LnD9DS-2编码序列的紧密相邻内的5’和3’非翻译区(例如，烟草渗透蛋白5’和3’UTR序列(Liu等(2003)Nat.Biotechnol.21:1222-8)，和烟草花叶病毒Ω序列(Gallie等(1987)Nucleic Acids Res.15:8693-711))或内含子(Koziel等(1996)PlantMol.Biol.32:393-405)掺入来提高在与缺乏前述遗传元件的相同编码序列的表达相比时的转基因表达水平。依照本领域中公知的方法实施在去饱和酶PTU内添加一种或多种这些遗传元件。经由标准的克隆方法将包含5’非翻译区、3’非翻译区、和/或内含子的多核苷酸片段添加至植物表达质粒(例如pDAB7319,pDAB7321,pDAB7324,pDAB7326,pDAB7328,pDAB7330，或用于构建pDAB7319,pDAB7321,pDAB7324,pDAB7326,pDAB7328或pDAB7330的前述质粒)。使用新构建的质粒来稳定转化拟南芥和/或芸苔植物细胞、材料、或组织。自经转化的植物细胞、材料、或组织再生转基因植物。将转基因植物分离，并分子表征。测定转基因植物的种子中所得的delta-9去饱和酶积累，并鉴定稳健表达HzD9DS或LnD9DS-2多肽的植物。

此外，本领域中已知的是，酵母去饱和酶基因诸如OLE1是高度调节的。删除编码跨膜区，并且作为细胞色素b5域的一部分的序列降低OLE1转录物的稳定性。Vemula等(2003)J.Biol.Chem.278(46):45269-79。OLE1内的这些序列的存在充当mRNA稳定序列。因而，利用编码跨膜区和细胞色素b5域的OLE1序列对LnD9DS-2或HzD9DS编码序列中的掺入来提高编码序列的mRNA转录物的稳定性，由此导致更高的表达水平及随后LnD9DS-2或HzD9DS多肽的增加。使用本领域中已知的方法构建包含OLE1跨膜区和细胞色素b5域序列的嵌合LnD9DS-2或HzD9DS编码序列。将由此生成的编码序列掺入植物表达质粒中(例如，如前述实施例中所描述的)，并用于经由土壤杆菌介导的植物转化生成转基因植物。将转基因植物分离并表征。测定所得的delta-9去饱和酶积累，并鉴定稳健表达delta-9去饱和酶的植物。

实施例17

使用备选3’非翻译区终止子以在植物中稳定表达delta-9去饱和酶

由于有限数目的可用3'UTR终止子，通常使用土壤杆菌ORF 23 3'UTR终止子(AtuORF23 3’UTR)来终止转录。最近显示了其它3’UTR终止子更有效地终止拟南芥中的转录读过(read-through)。因此，与菜豆菜豆蛋白启动子组合使用菜豆菜豆蛋白3’UTR终止子(SEQ ID NO:69)以降低上游基因的转录读过，由此降低转录干扰。

将菜豆菜豆蛋白3’UTR终止子(PvPhas 3’UTR v1)在LnD9DS-2 v2表达盒内，及在HzD9DS v2表达盒(其先前在质粒pDAB7321和pDAB7326中描述)内导入。依照本领域技术人员公知的方法，将包含PvPhas 3’UTR v1的多核苷酸片段在LnD9DS-2 v2基因的下游放置以创建二元质粒pDAB110110(图4a；SEQ ID NO:74)。也将包含PvPhas 3’UTR v1的多核苷酸片段在HzD9DS v2基因的下游放置以创建二元质粒pDAB110112(图4b；SEQ ID NO:75)。

经由限制酶消化和测序来确认所得的二元质粒。各使用新构建的质粒来稳定转化拟南芥和/或芸苔植物细胞、材料、或组织、自经转化的植物细胞、材料或组织再生转基因植物。将转基因植物分离并分子表征。测定转基因植物种子中所得的delta-9去饱和酶积累，并鉴定稳健表达HzD9DS或LnD9DS-2多肽的植物。

Claims

1.一种分离的核酸分子，其编码包含与SEQ ID NO:13至少80％相同的氨基酸序列的delta-9去饱和酶，其中该核酸分子包含与选自SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:16,和SEQ IDNO:45的序列至少60％相同的核苷酸序列；其进一步包含基因调节元件。

2.一种分离的核酸分子，其编码包含与SEQ ID NO:13至少80％相同的氨基酸序列的delta-9去饱和酶，其中该核酸分子进一步包含选自下组的基因调节元件：酿酒酵母delta-9去饱和酶启动子、delta-9去饱和酶3’UTR/终止子、ole1基因启动子、菜豆蛋白启动子、菜豆(Phaseolus vulgaris)菜豆蛋白5’非翻译区、菜豆菜豆蛋白3’非翻译区、菜豆菜豆蛋白基质附着区、根癌土壤杆菌ORF233’非翻译区、木薯叶脉花叶病毒启动子、根癌土壤杆菌ORF13’非翻译区、烟草(Nicotiana tabacum)RB7基质附着区、Overdrive、T链边界序列、LfKCS3启动子、FAE 1启动子、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、Myc标签、和血凝素标签。

3.一种嵌合delta-9去饱和酶多肽，其包含SEQ ID NO:72和/或SEQ ID NO:73，其中所述多肽进一步包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列。

4.一种用于降低细胞中饱和脂肪酸量的方法，该方法包括：

用权利要求1的核酸分子转化植物细胞，使得所述细胞中的饱和脂肪酸量降低。

5.依照权利要求4的方法，包括用至少一种编码包含与SEQ ID NO:13至少80％相同的氨基酸序列的delta-9去饱和酶的核酸分子进一步转化所述植物细胞。

6.依照权利要求5的方法，其中进一步转化所述植物细胞将用于降低所述植物细胞中16:0-ACP水平的手段导入所述植物细胞中。

7.依照权利要求6的方法，其中所述用于降低植物细胞中16:0-ACP水平的手段是质体外去饱和酶，所述去饱和酶优选为HzD9DS去饱和酶。

8.一种含油种子植物，包含权利要求1的核酸序列。

9.一种植物种子，其表达包含与SEQ ID NO:13至少80％相同的氨基酸序列的质体外去饱和酶。

10.权利要求9的植物种子，其中所述质体外去饱和酶包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列。

11.权利要求9的种子，其中所述种子是转基因油菜(Brassica napus)系的种子，所述种子相对于所述转基因油菜系的等基因型式具有降低的16:0水平。

12.一种用于创建遗传工程化植物的方法，所述遗传工程化植物与野生型植物相比在所述植物中包含降低的饱和脂肪酸量，所述方法包括：

用编码包含与SEQ ID NO:13至少80％相同的氨基酸序列的delta-9去饱和酶的核酸分子转化植物材料；并

培养经转化的植物材料以获得植物，其中该植物的种子表达delta-9去饱和酶。

13.权利要求4或12的方法，其中所述植物细胞或植物选自自下组选择的属：拟南芥属(Arabidopsis)、琉璃苣属(Borago)、芸苔(Canola)、蓖麻属(Ricinus)、可可树属(Theobroma)、玉蜀黍属(Zea)、棉属(Gossypium)、两节荠属(Crambe)、萼距花属(Cuphea)、亚麻属(Linum)、小滨菊属(Lesquerella)、鲸油草(Limnanthes)、Linola、旱金莲属(Tropaeolum)、月见草属(Oenothera)、木樨榄属(Olea)、油棕属(Elaeis)、落花生属(Arachis)、油菜籽(rapeseed)、红花属(Carthamus)、大豆属(Glycine)、野生大豆(Soja)、向日葵属(Helianthus)、烟草属(Nicotiana)、斑鸠菊属(Vernonia)、小麦属(Triticum)、大麦属(Hordeum)、稻属(Oryza)、燕麦属(Avena)、高粱属(Sorghum)、黑麦属(Secale)、和禾本科(Gramineae)的其它成员。

14.通过依照权利要求12的方法获得的植物。

15.自权利要求14的植物获得的植物材料，所述植物材料优选是种子。