JP6096114B2 - 植物種子の飽和脂肪酸含量の低減 - Google Patents
植物種子の飽和脂肪酸含量の低減 Download PDFInfo
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Description
この出願は、2006年4月20日にPCT国際公開番号WO 2006/042049 A2として英語で公開され、アメリカ合衆国を指定する、2005年10月7日に出願されたPCT国際特許出願番号PCT/US05/36052の国内段階の移行である同時係属中の米国特許出願11/576,750の一部継続出願である。PCT国際特許出願番号PCT/US05/36052は、2004年10月8日に出願された米国仮特許出願番号60/617,532の継続出願である。この出願はまた、2010年6月24日に出願された米国仮特許出願番号61/358,314の継続出願である。
いくつかの実施形態は、一般的に特定のデルタ-9デサチュラーゼ酵素、これらの酵素をコードする核酸、植物細胞内で該核酸を発現する方法に関連している。いくつかの実施形態では、植物材料(plant material)(例えば、種子)中の飽和脂肪酸の%組成を減少させるために特定のデルタ-9デサチュラーゼ酵素の活性を利用して、ω-7脂肪酸の%組成を増加させることに関連している。また、特定の実施形態での方法によって製造された植物および植物材料が本明細書に開示されている。
植物由来の油が、徐々に食物脂肪摂取量の主要な供給源として、動物由来の油脂類を代替してきている。しかし、ほとんどの先進国では飽和脂肪の摂取量が総カロリー消費量の約15%から20%で推移している。健康的なライフスタイルを促進するための努力において、米国農務省(USDA)は最近、飽和脂肪が、毎日のカロリー摂取量の10%未満を構成することを推奨している。消費者の意識を促進するために、米国農務省が発行した現在の表示ガイドラインは現在、総飽和脂肪酸レベルは、「低飽和脂肪酸(low-sat)」のラベルを受けるためには、14グラム分量当たり1.0グラム未満であることを要求し、「無飽和脂肪酸(no-sat)」のラベルを受けるためには、14グラム分量当たり0.5グラム未満であることを要求する。これは、植物油の飽和脂肪酸含量は、「低飽和脂肪酸」または「無飽和脂肪酸」のラベルを受けるためには、それぞれ7%未満および3.5%未満である必要があることを意味する。これらのガイドラインの発行以来、「低飽和脂肪酸」油および「無飽和脂肪酸」油に対する消費者の需要の急増があった。現在までに、この需要はキャノーラ油で主に満たされ、ヒマワリおよびベニバナ油ではるかに低い程度で満たされている。
[1]配列番号:12、配列番号:13、配列番号:14、配列番号:50、配列番号:51、配列番号:52、配列番号:72、および配列番号:73から成る群から選択される配列と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含むデルタ-9デサチュラーゼ酵素をコードする単離された核酸分子。
[2]上記核酸分子が、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:15、配列番号:16、配列番号:17、配列番号:44、及び配列番号:45から成る群から選択される配列に対して少なくとも60%同一であるヌクレオチド配列を含む、上記[1]に記載の核酸分子。
[3]さらに遺伝子調節エレメントを含む、上記[1]に記載の核酸分子。
[4]上記遺伝子調節エレメントは、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)デルタ-9デサチュラーゼプロモーター、デルタ-9デサチュラーゼ3'UTR /ターミネーター、OLE1遺伝子プロモーター、ファゼオリンプロモーター、インゲンマメ(Phaseolus vulgaris)ファゼオリン5 '非翻訳領域、インゲンマメファゼオリン3'非翻訳領域、インゲンマメファゼオリンマトリックス結合領域、アグロバクテリウムツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)ORF23 3 '非翻訳領域、キャッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーター、アグロバクテリウムツメファシエンスORF1 3'非翻訳領域、タバコ(Nicotiana tabacum)RB7マトリックス結合領域、オーバードライブ、Tスタンドボーダー配列、LfKCS3プロモーター、FAE 1プロモーター、配列番号:40、配列番号:41、配列番号:42、配列番号:43、Mycタグ、およびヘマグルチン(hemagglutin)タグから成る群から選択される、上記[3]に記載の核酸分子。
[5]配列番号:12、配列番号:13、配列番号:14、配列番号:50、配列番号:51、配列番号:52、配列番号:72、および配列番号:73から成る群から選択される配列に対して少なくとも80%同一のアミノ酸配列を含む単離されたデルタ-9デサチュラーゼ酵素。
[6]配列番号:72および/または配列番号:73を含むキメラデルタ-9デサチュラーゼポリペプチドであって、配列番号:77および配列番号:78から成る群から選択されるアミノ酸配列をさらに含むことを特徴とする、ポリペプチド。
[7]細胞内の飽和脂肪酸の量を減少させるための方法であって、
細胞内の飽和脂肪酸の量が減少するように、上記[1]に記載の核酸分子で細胞を形質転換する工程を含む、方法。
[8]上記細胞は酵母細胞である、上記[7]に記載の方法。
[9]上記細胞は植物細胞である、上記[7]に記載の方法。
[10]上記[1]に記載の複数の核酸分子で植物細胞を形質転換する工程を含む、上記[9]に記載の方法。
[11]上記植物細胞を形質転換することによって、上記植物細胞に、上記植物細胞内で16:0-ACPのレベルを減少させるための手段が導入される、上記[9]に記載の方法。
[12]上記植物細胞において16:0-ACPのレベルを減少させるための手段が、植物細胞小器官外(extraplastidial)デサチュラーゼである、上記[11]に記載の方法。
[13]上記植物細胞小器官外デサチュラーゼが、LnD9DSデサチュラーゼ、AnD9DSデサチュラーゼ、HzD9DSデサチュラーゼ、およびMgD9DSデサチュラーゼからなる群から選ばれるデサチュラーゼである、上記[12]に記載の方法。
[14]上記植物細胞が、シロイヌナズナ、ボラゴ(Borago)、キャノーラ、ヒマ、テオブロマ、トウモロコシ、ワタ、ハマナ、クフェア、アマ、レスケレーラ(Lesquerella)、リムナンテス(Limnanthes)、リノラ(Linola)、キンレンカ、マツヨイグサ、オレア、アブラヤシ、落花生、菜種、ベニバナ、大豆(Glycine)、ソヤ(Soja)、ヒマワリ、ニコチアナ、ベルノニア、コムギ、オオムギ、イネ、エンバク、ソルガム、ライムギ、及びイネ科の他のメンバーからなる群から選ばれる属から選択された植物から得られる、上記[9]に記載の方法。
[15]上記[1]に記載の核酸配列を含む油種子植物。
[16]配列番号:12、配列番号:13、配列番号:14、配列番号:50、配列番号:51、および配列番号:52から成る群から選択される植物細胞小器官外デサチュラーゼを発現する植物種子。
[17]トランスジェニックセイヨウアブラナ(Brassica napus)系統の種子であって、同質遺伝子系統バージョンのトランスジェニックセイヨウアブラナ系統に対して減少した16:0レベルを有する種子。
[18]野生型植物に比べて減少量の飽和脂肪酸をその植物において含むトランスジェニック植物を作製するための方法であって:
上記[1]に記載の核酸分子で植物材料を形質転換する工程;および
形質転換された植物素材を培養して、植物を得る工程
を含む、方法。
[19]上記植物が、シロイヌナズナ、ボラゴ(Borago)、キャノーラ、ヒマ、テオブロマ、トウモロコシ、ワタ、ハマナ、クフェア、アマ、レスケレーラ(Lesquerella)、リムナンテス(Limnanthes)、リノラ(Linola)、キンレンカ、マツヨイグサ、オレア、アブラヤシ、落花生、菜種、ベニバナ、大豆(Glycine)、ソヤ(Soja)、ヒマワリ、ニコチアナ、ベルノニア、コムギ、オオムギ、イネ、エンバク、ソルガム、ライムギ、及びイネ科の他のメンバーからなる群から選ばれる属から選択される、上記[18]に記載の方法。
[20]上記[18]に記載の方法により得られる植物。
[21]上記[20]に記載の植物から得られる植物材料。
[22]上記植物材料が種子である、上記[21]に記載の植物材料。
新規な真菌デルタ-9デサチュラーゼ酵素、そのようなデサチュラーゼをコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列を含む核酸、植物、植物材料(例えば、種子)、植物の部分、および上記のいずれかを含む植物コモディティ製品類が本明細書に開示される。いくつかの実施形態の側面は、イネいもち病菌(Magnaporthe grisea)、レプトスファエリアノドルム(Leptosphaeria nodorum)、およびオオタバコガトウモロコシ(Helicoverpa zea)から単離された真菌のデルタ-9デサチュラーゼ酵素によって例示される。いくつかの例は、パルミチン酸又はステアリン酸の基質選好(substrate preference)を有する天然のおよび合成デルタ-9デサチュラーゼを含む。
37 C.F.R. §1.822に定義されているように、添付の配列表に記載されている核酸配列は、ヌクレオチド塩基のための標準文字の略語を使用して示されている。各核酸配列の片方の鎖だけが示されているが、相補鎖が表示された鎖に対する参照によって含まれることが理解される。添付の配列表では:
本発明者らは以前に、アスペルギルスニデュランス由来の真菌アシルCoAデルタ-9デサチュラーゼをキャノーラに導入したことにより、種子油で飽和脂肪酸レベルの減少を達成した。米国特許出願公開US2008/0260933 A1。A.ニデュランスデルタ-9デサチュラーゼは、種子油中で、より豊富なパルミチン酸脂肪酸(36−49%)よりもステアリン酸の枯渇(61−90%)の方が大きかった。したがって、パルミチン酸が飽和する上で優先的に作用するデルタ-9デサチュラーゼの同時導入は、A. nidulansのデルタ-9デサチュラーゼのステアリン酸塩-優先的(stearate-preferring)活性を補完することで総飽和のさらなる削減を実現する。本発明のいくつかの実施形態では、様々な基質特異性を有する真菌デルタ-9デサチュラーゼポリペプチドが開示されている。特定の実施形態では、パルミチン酸塩優先的(palmiate-preferring)デルタ-9デサチュラーゼ(例えば本明細書で開示される天然のの真菌酵素、またはその機能的等価物;およびパルミチン酸基質に対して優先性を有するように設計された合成ポリペプチド)を含む。
x:yΔz x個の炭素およびカルボキシル末端から数えてZ位置においてy個の二重結合を含む脂肪酸
ACP アシルキャリアタンパク質
CoA 補酵素A
FA 脂肪酸
FAM フルオレセイン
FAS 脂肪酸合成酵素
FAME 脂肪酸メチルエステル
KASII b-ケトアシル-ACPシンターゼII
MUFA 一価不飽和脂肪酸
WT 野生型
脂肪酸:本明細書で使用する場合、用語「脂肪酸」は、長い鎖長および短い鎖長の両方の脂肪酸が知られているが、種々の鎖長、例えば、約C12−C22、の長鎖脂肪族酸(アルカン酸)を指す。脂肪酸の構造は、表記、x:yΔzで表される:ここで「x」は、特定の脂肪酸中の炭素(C)原子の総数であり、「y」はその酸のカルボキシル末端から数えて「Z」の位置にある炭素鎖中の二重結合の数である。
A. 概要
本発明の一実施形態は、植物の種子の中の特定のアシル-CoA優先性(例えば、パルミチン酸又はステアリン酸)を有するデルタ-9デサチュラーゼを導入することを含む。デルタ-9デサチュラーゼの特定のアシル-CoA優先性は、ある特定の飽和脂肪酸プール(例えば、一価不飽和の生成物への変換のためのパルミチン酸)のターゲティングを可能にする。アシルCoAデルタ-9デサチュラーゼは、それらが正常に感知できる程度にまで植物系で生産されていないことから、植物の飽和脂肪酸含量を低下させるために選択した。
本発明のいくつかの実施形態に係るポリペプチドは、配列番号:12、配列番号:13、配列番号:14、配列番号:50、配列番号:52、配列番号:72、および配列番号:73からなる群から選択される配列と整列したときに増加する割合の同一性を示すアミノ酸配列を含む。これらおよび他の実施形態内の特定のアミノ酸配列は、例えば、上記配列と少なくとも約70%、約75%、約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一性を有する配列を含んでもよい。多くの実施形態では、上記の配列と整列された場合、上記の配列同一性を有するアミノ酸配列は、酵素δ-9−18 :0-ACPデサチュラーゼ活性を有するペプチドまたはそのようなペプチドの一部をコードする。
いくつかの実施形態は、上記のポリペプチドをコードする核酸分子を含む。例えば、いくつかの実施形態では、核酸配列は、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:15、配列番号:16、配列番号:17、配列番号:44、配列番号:45、配列番号: 48、および配列番号:49からなる群から選択される配列と整列するときのパーセント同一性の増加を示す。これらおよび他の実施形態における特定の核酸配列は、例えば、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列11、配列番号:15、配列番号:16、配列番号:17、配列番号:44、配列番号:45、配列番号:48、および配列番号:49から成る群から選択される配列と、少なくとも約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有する配列を含むことができる。これは、核酸分子は、例えば、コドンの縮重に応じて許容される塩基置換を導入することによって、実質的にコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変えずに変更できることは、当業者によって理解される。
種子特異的調節は、例えば、EP 0 255 378に記載されている。
いくつかの実施形態は、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:15、配列番号:16、配列番号:17、配列番号:44、配列番号:45、配列番号:48、および配列番号:49からなる群から選択される配列に対して少なくとも60%同一である核酸配列を含む1つまたは複数の核酸分子を含む形質転換細胞を製造する方法に関する。このような核酸分子はまた、例えば、プロモーターなどの非コーディング調節エレメントを含むことができる。他の配列もまた、非コーディング調節エレメントおよび転写可能な核酸分子の配列と共に細胞に導入することができる。これらの他の配列は、3'転写ターミネーター、3'ポリアデニル化シグナル、他の非翻訳配列、トランジット、または標的配列、選択マーカー、エンハンサー、およびオペレーターを含むことができる。
いくつかの実施形態では、トランスジェニック種子は、配列番号:12、配列番号:13、配列番号:14、配列番号:50、配列番号:51、配列番号:52、配列番号:72、および配列番号:73からなる群から選択される配列と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドデルタ-9デサチュラーゼを含んでもよい。これらおよび他の態様において、トランスジェニック種子は、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:15、配列番号:16、配列番号:17、配列番号:44、配列番号:45、配列番号:48、および配列番号:49からなる群から選択される配列に対して少なくとも60%同一である核酸配列を含んでもよい。特定の実施態様において、トランスジェニック種子は、飽和脂肪酸(例えば、パルミチン脂肪酸及び/又はステアリン脂肪酸)レベルの低下を示すことができる。種子は、肥沃なトランスジェニック植物から収穫することができ、上述したように少なくとも1つの核酸配列、および場合によって少なくとも1つの付加的な対象の遺伝子または核酸構築物を含むハイブリッド植物系統を含む形質転換植物の子孫世代を成長させるために使用することができる。
イネいもち病菌アシルCoAデルタ-9デサチュラーゼ遺伝子(MgD9DS)は、「仮想タンパク質」として当初注釈付きの公開されているNCBI/Broad研究所(Institute)の配列であって、S.セレビシエアシルCoAデルタ-9デサチュラーゼ(すなわち、OLE1)にヌクレオチドレベルで55.4%の同一性を有する配列に基づいてプライマーを用いてゲノムDNAから単離された。フォワードおよびリバースプライマー(長さはそれぞれ41塩基対)が、設計された。フォワードプライマーMgD9F(配列番号:1)は、5'末端にEcoRI部位が含まれていた。リバースプライマーMg9DR(配列番号:2)は、3つのリーディングフレームおよび末端XhoI部位の各々に終止コドンを含んでいた。
二つレプトスファエリア ノドルム(Leptosphaeria nodorum) EST配列(それぞれ1246および429塩基対)を、S.セレビシエアシルCoAデルタ-9デサチュラーゼ(OLE1)と配列同一性の高いレベル(それぞれ54.0%および54.2%)を共有するものとしてBLASTN検索を使用して、L. nodorumのESTのコレクションから同定した。アラインメントすると、これらの配列は互いに64.6%同一であった。これは、2つの別個のレプトスファエリア ノドルム(Leptosphaeria nodorum)アシルCoAデルタ-9デサチュラーゼの存在を示唆する。LnD9DS-1遺伝子(配列番号:5)を、1246 bpの遺伝子プローブを用いてL. nodorum cDNAライブラリーをスクリーニングすることによって単離した。この遺伝子の配列が得られ、コード配列を単離した。LnD9DS-2遺伝子の配列全体を、429 bpのEST配列を使用して公開されているブロード研究所のレプトスファエリア ノドルム(Leptosphaeria nodorum)のゲノム配列をまずBLAST検索することによって単離した。この検索では、Supercontig Ln 1.4を、429塩基対の断片に対して100%の相同性(homology)を有する遺伝子を含むものとして同定し、その遺伝子を「仮想タンパク質」をコードするものとして注釈した。次に、LnD9DS-2遺伝子を、Ln1.4 supercontig配列に基づいてPCRプライマーを用いてレプトスファエリア ノドルム(Leptosphaeria nodorum) cDNAライブラリーからクローニングした。使用したプライマー配列はLnd9FAD2F(配列番号:6および)Lnd9FAD2R(配列番号:7)であった。フォワードプライマーは、5 'BamHI部位に設計されており、リバースプライマーは、3つのリーディングフレームと端末のNcoI部位に停止コドンを含んでいた。
オオタバコガトウモロコシアシルCoAデルタ-9デサチュラーゼ(HzD9DS)(Rosenfield et al. (2001) Insect Biochem. Mol. Biol. 31(10):949-64においてHzPGDS2として識別されている)をコードする植物に最適化された合成遺伝子をDASPICO89(後述)からBamHI/XhoI断片上に切り出し、モンタージュスピンカラムを用いてゲル精製した。この断片を、前述した酵母発現ベクターの対応する制限酵素部位にライゲーションし、大腸菌株DH5aへ標準的な分子生物学技術とサプライヤーのプロトコル(インビトロジェン、Carlsbad、CA)を用いて形質転換した。
上記のように、3つの例示的なアシルCoAデルタ-9デサチュラーゼ(D9DS)遺伝子は、植物病原性真菌、イネいもち病菌(MgD9DS)、およびレプトスファエリア ノドルム(Leptosphaeria nodorum)(LnD9DS-1とLnD9DS-2)からクローニングされた。これらの遺伝子およびそのコードされたタンパク質は、これまでに特徴付けされていない。アシルCoAデルタ-9デサチュラーゼは、コエンザイムAの飽和14-、16-、および18-炭素脂肪酸アシルチオエステルの炭素原子9と10の間のシス二重結合の形成を触媒し、その結果、それぞれミリストレイン酸(14:1)、パルミトレイン酸(16:1)、またはオレイン酸(18:1)を産生する。生物特異的な生物学に関連した影響は、同じ生物学的コンテキスト内で異なる真菌アシルCoAデルタ-9デサチュラーゼ遺伝子を発現することによって解消される。それ故に、真菌アシルCoAデルタ-9デサチュラーゼ遺伝子の発現が、パルミトイル-ステアロイルCoAデサチュラーゼ(OLE1)欠損OFY093酵母菌株内の内在ole1遺伝子プロモーターを用いて駆動された。したがって、このシステムにおける脂肪酸基質特異性に観察された相違は、特定の真菌デルタ-9補完S.セレビシエ株で発現デサチュラーゼに起因するものである。
複数の真菌アシルCoAデルタ-9デサチュラーゼのアミノ酸配列の系統解析は、LnD9DS-2が18:0-優先性デルタ-9デサチュラーゼと異なっていることを示唆している。従って、本発明者らは、18:0-優先性デルタ-9デサチュラーゼまたはLnD9DS-2と密接に関連付けられた他の真菌デルタ-9デサチュラーゼの特徴付けにより、種々の18:0または16:0活性を有するデサチュラーゼを同定し得るという仮説を立てた。本発明者らの仮説は、より密接にLnD9DS-2に関連付けられている真菌デルタ-9デサチュラーゼは、16:0活性を増加しているだろうと予測している。
キャノーラにおける真菌デルタ-9デサチュラーゼ遺伝子の高い発現を得るためには、それらがより効率的に異種遺伝子を含むトランスジェニックキャノーラ細胞で発現されるように、これらの遺伝子を設計した。配列番号:9、配列番号:10および配列番号:11としてそれぞれ本明細書に開示される、天然のいもち(Magnaporthe grisea)、オオタバコガトウモロコシ、およびレプトスファエリア ノドルム(Leptosphaeria nodorum)デルタ-9デサチュラーゼコード領域のDNA配列の広範な分析により、最適な植物発現、ならびにそのような最適な植物発現用の非最適コドン組成に対して有害であると考えられるいくつかの配列モチーフの存在が明らかになった。デルタ-9デサチュラーゼのタンパク質をコードする最適化された遺伝子を設計するために、本発明者らは、配列の変更が翻訳を妨げず、またはmRNAの不安定性を生じない、性質がより「植物のような」(具体的には、より「キャノーラ様の」)DNA配列をin silicoで作成した。
C1の加重平均%= 1 /(%C1 +%C2 + %C3 +等)×%C1×100、
ここで、C1は、問題のコドンであり、%C2、%C3、等は、表5の残りの同義コドンのセイヨウアブラナについての%値の平均値を表している(関連コドンの平均%値が列CおよびGから取得される)。
以下のプラスミドは、標準的な分子生物学的技術を用いて構築した。植物の転写単位(目的の遺伝子に連結されたプロモーターから構成され、3'UTRによって終了する)または「PTU」を含むポリヌクレオチド断片を構築し、バイナリーベクターのT-ストランド領域内で、付加的な植物の転写ユニットと組み合わせた。
エレクトロコンピテントな(electro-competent)アグロバクテリウム細胞(表9)を、ヴァイゲルおよびグレーズブルック(2002)(Weigel and Glazebrook (2002) “How to Transform Arabidopsis,” Ch. 5, in Arabidopsis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.)からのプロトコルを用いて調製した。コンピテントなアグロバクテリウム細胞50μLを氷上で解凍し、バイナリベクタープラスミドDNAの300−400 ngを使用して形質転換した。細胞ミックスは、あらかじめ冷却したエレクトロポレーションキュベット(0.2 cm)およびバイオ・ラッドジーンパルサー(登録商標)エレクトロ(ヘラクレス、CA)を、次の条件:電圧:2.5kVで、パルスの長さ: 5ミリ秒、静電容量出力25μF、抵抗200Ωの下で用いて、DNAの存在下でエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後、YEP液体培地(broth)(酵母エキス(10 g/L)、ペプトン(10 g/L)、およびNaCl(5g/L)の1mLを各キュベットに添加し、細胞YEP懸濁液を15 mLの培養管に移した。細胞を、28℃で4時間穏やかに攪拌しながらインキュベートした後、培養を表9に応じて適切に選択してYEP +寒天上に播種した。プレートを28℃で2-4日間インキュベートし、コロニーを選択し、抗生物質選択を含んだ新鮮なYEP +寒天プレート上に画線し、1〜3日間28℃でインキュベートした。コロニーを、Ketolactoseテストを使用してアグロバクテリウムとして検証し、Ketolactose陽性コロニーを、さらに単コロニー分離の二つの経路を用いて単離した。単コロニー分離が完了した後に、最終的なパッチプレートはコロニーでできていた。
シロイヌナズナ形質転換:シロイヌナズナを、CloughおよびBent(1998)Plant J. 16:735-743の方法に基づいてフローラルディップ法を用いて形質転換した。選択されたアグロバクテリウムのコロニーを用いて、選択のための適切な抗生物質を含む一つ以上の30mLのYEP培地の予備培養(pre-culture)を播種した。培養を、220rpmで一定に撹拌しながら28℃で一晩インキュベートした。それぞれの予備培養を、選択のための抗生物質を含むYEP培地の2つの 500mLの培養液を播種するために使用し、培養を一定に撹拌しながら28℃で一晩インキュベートした。次に、細胞を播種した。約8700gで室温で10分間遠心し、得られた上清を捨てた。細胞ペレットを、1/2 x MurashigeおよびSkoogの塩/Gamborg B5ビタミン、10%(w/v)スクロース、0.044μMのベンジルアミノプリン(DMSO中の1 mg/mLのストックを10μL/リットル)および300リットル/μLのSilwet(登録商標)L-77を含む500ml浸透培地中に穏やかに再懸濁した。約1ヶ月齢の植物を、最新の花序を水中に沈めるように注意して、15秒間培地に浸漬した。その後、植物をそれらの両側に敷設し、(透明または不透明で)24時間覆い、その後、水で洗浄し、直立に配置した。植物を16時間の明/8時間の暗の光周期で、22℃で増殖させた。約4週間浸漬した後、種子を植物から採取した。
アグロバクテリウムの準備:pDAB7319、pDAB7321、pDAB7324、pDAB7326、pDAB7328、pDAB7330またはpDAB7331のいずれかを含有するアグロバクテリウム株を用いて、ストレプトマイシン(100 mg/mL)およびスペクチノマイシン(50 mg/mL)を含有するYEP(バクトペプトン(20.0 g/L)プレートおよび酵母抽出物(10.0 g/L)プレートに画線し、28℃で2日間インキュベートした。2日間の画線プレートのループを、滅菌500mLのバッフルフラスコ(s)中、ストレプトマイシン(100 mg/ml)およびスペクチノマイシン(50 mg/ml)を含む150mLの改変YEP液に播種し、28℃、200rpmで振盪した。培養物を、キャノーラ胚軸の形質転換を行う前に、M-培地(LS塩; 3%グルコース、改変B5ビタミン、1μMのカイネチン、1μMの2,4-D、pH5.8)に再懸濁し、適切な密度(50クレット単位)に希釈した。
種子の発芽:キャノーラの種子(品種Nexera 710)を、10%クロロックスで10分間の表面滅菌し、滅菌蒸留水で鋼ストレーナーで3回リンスした。種子は、発芽するために、Phytatrays(Phytatrayあたり25種子)に含まれた1/2 MSキャノーラ培地(1/2MS、2%ショ糖、0.8%寒天)植えられた。トレイを、25℃に設定された成長管理体制、16時間明/8時間暗の光周期で環境成長チャンバー(パーシバルサイエンティフィック社は、ペリー、アイオワ州)内に置き、5日間発芽させた。
T0キャノーラ植物およびT1シロイヌナズナ植物を、PTUの発現カセットを含んでいた植物を同定するために分析した。Invader(登録商標)アッセイを、推定的に形質転換した植物のサンプルを最初にスクリーニングするために行い、pat PTUの単一のコピーが含まれていたイベントを識別した。単一コピーのイベントとして同定されたイベントを保存し、さらにPCRによるデサチュラーゼPTU(s)の存在について分析した。デサチュラーゼの発現カセットPTU(s)についてPCR陽性であったイベントを、さらにサザンブロット分析により分析した。サザンブロット分析を、植物を形質転換するために使用されるバイナリーベクターからの遺伝子発現カセットPTUsを植物が含むことを確認するために完了した。PTUsすべてを含む単一コピーのイベントを、さらに進めるために選択した。
Invader(登録商標)分析:選択マーカーpatのコピー数解析を、Invader(登録商標)アッセイ(Third Wave Technologies、マディソン、WI)を使用して完了した。ゲノムDNAを、製造業者の推奨プロトコルに従って、10分間95℃で変性し、氷上で冷却し、オリゴヌクレオチドプローブ、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)が可能な色素分子、および切断(cleavase)酵素を含有する試薬のマスターミックスと混合した。反応には、内部リファレンス遺伝子に対するプローブが含まれていた。1-deoxyxylulose-5-リン酸メラーゼ(DXR1)遺伝子をシロイヌナズナInvader(登録商標)アッセイ反応に対する内部参照遺伝子として使用し、高移動度群蛋白質遺伝子(HMGa)を、キャノーラInvader(登録商標)アッセイ反応の内部参照遺伝子として用いた。また、プレートは、1コピー、2コピー、4コピーの基準だけでなく、野生型のコントロールサンプルおよびサンプルが格納されていないブランクのウェルを含んでいた。全体の反応は、1.5時間、63℃でのサーモサイクラーでのインキュベーション前にミネラルオイルを重層した。得られた反応物を蛍光プレートリーダー(Synergy(商標)2、バイオテック・インスツルメンツ、Winooski、バーモント州)で読み取った。読みを、FAM(λ485−528 nm)およびRED(λ560−620 nm)の両方のチャネルについて収集した。これらから、各チャネルごとに折り返しゼロ(つまり背景)は、テンプレートなしの生の信号によってサンプルの生の信号を割り算することによって、それぞれのサンプルについて測定した。このデータから、標準曲線を構築し、最高の適合を線形回帰分析によって決定した。その後、この適合から同定されたパラメータを使用して、見かけ上のpatのコピー数を、各試料について決定した。
シロイヌナズナ植物を、LnD9DS-2 v2(pDAB7321;配列番号:61)、HzD9DS v2(pDAB7326;配列番号:63)またはMgD9DS v2(pDAB7330;配列番号:65)用の遺伝子を含むアグロバクテリウムベクターで形質転換した。植物もAnD9DS遺伝子(pDAB7328;配列番号:64)を含むベクターで形質転換した。選択マーカーpat遺伝子(pDAB7331、配列番号:66)のみを含む空のベクターを、陰性コントロールとして用いた。形質転換もまた、ステアロイル-優先性デサチュラーゼ(AnD9DS)を、LnD9DS-2(pDAB7319;配列番号:60)またはHzD9DS(pDAB7324;SEQ ID NO:62)のいずれかのパルミトイル優先性デサチュラーゼと組み合わせて、2つのデサチュラーゼを組み合わせて用いて行った。すべての場合において、デサチュラーゼ遺伝子は、種子特異的PvPhasプロモーター(米国特許5504200)によって駆動された。バルクT2種子は、Invader(登録商標)アッセイの分析によってpat遺伝子、およびPCR分析によってデサチュラーゼPTUを含むことが確認された除草剤耐性のT1植物から収穫した。
抗体などの診断ツールは、植物においてトランスジェニックデルタ-9デサチュラーゼのタンパク質の発現を特徴付けるために望ましい。アシルCoAデルタ-9デサチュラーゼは、膜結合タンパク質であるため、大腸菌で過剰発現ルーチンは困難である。しかし、抗体は、タンパク質の膜貫通ドメインのいずれも含んでいない各デルタ-9デサチュラーゼタンパク質のC末端断片の過剰発現によって首尾良く生成された。
デルタ-9デサチュラーゼのポリペプチドを、ウェスタンブロット法により成熟トランスジェニック種子サンプルで検出した。種子を分析のために、Kleco(商標)Bead Beater(Garcia Machine、ヴァイセーリア、カリフォルニア州)においてステンレススチール製ビーズを用いて乾燥した種子を分解することによって調製した。抽出緩衝液(50mMトリス、10mMのEDTA、2%SDS)を添加し、サンプルチューブを30分間静かに振盪した。サンプルを3000 RCFで15分間遠心分離した。その後、上清を回収し、分析のために使用した。種子抽出物中の総可溶性タンパク質の量を、Lowryアッセイ(BioRad、Hercules、カリフォルニア州)によって決定した。サンプルを、1.55 mg/mLの総可溶性タンパク質に正規化し、レーン当たり20μgの全可溶性タンパク質の標準ロードのために、40mMのDTTを含むLDSサンプルバッファー(Invitrogen、Carlsbad、CA)を中で調製した。サンプルを、4-12%Bis-Trisゲル(Invitrogen社)で電気泳動し、ニトロセルロース膜に移した。ブロットをブロッキングバッファーでブロックし、4つの異なるデルタ-9デサチュラーゼポリペプチド(AnD9DS、LnD9DS-2、HzD9DS、およびMgD9DS)(実施例10参照)に対する抗体でプローブした。
一連のトランスジェニックキャノーライベントを、pDAB7321(配列番号:61)およびpDAB7326(配列番号:63)(種子特異PvPhasプロモーターによって駆動されるそれぞれLnD9DS-2とHzD9DSの遺伝子を含む)を用いて実施した形質転換から得た。LnD9DS-2遺伝子を含む39個のpDAB7321イベントを、ゲノムDNAのPCR解析により同定し、温室内で生育させて、T1種子を生産した。同様に、80個のpDAB7326イベントがHzD9DS遺伝子を有することが確認され、T1種子を生産した。キャノーラもpDAB7319(配列番号:60)またはpDAB7324(配列番号:62)で形質転換し、これらはLnD9DS-2またはHzD9DS遺伝子と結合したAnD9DS遺伝子(全てPvPhasプロモーターによって駆動される)を含んでいる。44および76個のイベントをそれぞれ回収し、PCR分析によって両方のデサチュラーゼ遺伝子を含んでいることを確認し、温室内で生育させ、T1種子を生産した。
LnD9DS-2、HzD9DS、およびMgD9DSタンパク質をコードする遺伝子(群)を発現するために付加的な転写調節領域を使用することにより、キャノーラ内でこれらのデルタ-9デサチュラーゼの含有量をさらに増大させ得る。発達の初期に、より長い期間にわたって発現する転写調節領域の同定と利用により、種子開発の初期段階で異種遺伝子の堅牢な種子特異的転写を促進することにより、キャノーラ種子内で異種デルタ-9デサチュラーゼのレベルを向上させることができる。このような転写調節領域の例としては、LfKCS3プロモーター(米国特許7253337)およびFAE 1プロモーター(米国特許6784342)が含まれるが、これらに限定されない。これらのプロモーターは、プラスミドpDAB7319;pDAB7321; pDAB7324; pDAB7326; pDAB7328;およびpDAB7330に以前に記載されているような遺伝子との作動可能な連結を通じて、例えば、LnD9DS-2、HzD9DS、およびMgD9DS発現カセットの発現を駆動するために、単独で、または組み合わせて使用されている。プラスミド内の転写調節領域を交換する方法は、当該技術分野において周知である。このように、PvPhasプロモーターを含むポリヌクレオチドフラグメントは、pDAB7319、pDAB7321、pDAB7324、pDAB7326、pDAB7328、またはpDAB7330(またはpDAB7319、pDAB7321、pDAB7324、pDAB7326、pDAB7328、またはpDAB7330を構築するために使用される先述のプラスミド)から削除され、LfKCS3またはFAE 1プロモーター領域のいずれかと置き換えられる。新しく構築されたプラスミドは、前の実施例で説明された手順にしたがって、安定した植物をキャノーラ変換するために使用される。トランスジェニックキャノーラ植物が単離され、分子的に特徴付けされる。結果として得られるデルタ-9デサチュラーゼの蓄積が決定され、デルタ-9デサチュラーゼを堅牢に(robustly)発現するキャノーラ植物が同定される。
小胞体(ER)における膜結合蛋白質の蓄積と安定性は、それらのN末端とC末端のアミノ酸配列モチーフおよび改変の影響を受けることがある。Ravid および Hochstrasser (2008) Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 9:679-90。特に、N-およびC-末端のモチーフおよび改変は、菌類および植物ならびに動物の脂質デサチュラーゼの蓄積および安定性を調節することが示されている。McCartney et al. (2004) Plant J. 37:156-73; Mziaut et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97:8883-8。
mRNAの発現が安定化し、mRNAの蓄積を増加させる遺伝子エレメントを組み込むことによって向上させることができることは当該技術分野で公知である。HzD9DsまたはLnD9DS-2コーディング配列の近接への、5 'および3'非翻訳領域(例えば、タバコオスモチン5 'および3' UTR配列(Liuら(2003)Nat. Biotechnol. 21:1222-8)、およびタバコモザイクウイルスのΩ配列(Gallie et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:8693-711)、またはイントロン(Koziel et al. (1996) Plant Mol. Biol. 32:393-405))の組み込みは、上記の遺伝子エレメントを欠いている同じコード配列の発現と比較した場合の導入遺伝子の発現レベルを増加させるために使用されている。デサチュラーゼPTU内にこれらの遺伝子エレメントを1以上加えることは、当技術分野で周知の方法に従って行われる。5 '非翻訳領域、3'非翻訳領域、および/またはイントロンを含むポリヌクレオチド断片が、植物発現プラスミド(例えば、pDAB7319、pDAB7321、pDAB7324、pDAB7326、pDAB7328、pDAB7330、またはpDAB7319、pDAB7321、pDAB7324、pDAB7326、pDAB7328、もしくはpDAB7330を構築するために使用された前出のプラスミド)に標準的なクローニング方法を介して追加される。新しく構築されたプラスミドを、シロイヌナズナおよび/またはキャノーラ植物細胞、材料、または組織を安定に形質転換するために使用する。トランスジェニック植物を、形質転換植物細胞、材料、または組織から再生する。トランスジェニック植物を単離し、分子的に特徴づける。トランスジェニック植物の種子において得られるデルタ-9デサチュラーゼの蓄積が決定され、HzD9DSまたはLnD9DS-2ポリペプチドを堅牢に発現する植物を特定する。
代替的な3 '非翻訳領域ターミネーターの使用
植物内のデルタ-9デサチュラーゼの安定な発現のために
利用可能な3 'UTR-ターミネーターの数が限られていることにより、通常、アグロバクテリウムのORF 23の3'UTR-ターミネーター(AtuORF23 3'UTR)が、転写を終結するために使用される。最近、他の3'UTR-ターミネーターがシロイヌナズナで転写リードスルーを終結することにおいてより効果的であることが示された。したがって、インゲンマメファゼオリン3'UTR-teminator(配列番号:69)を、上流遺伝子の転写リードスルーを減らし、それによって転写干渉を低減するために、インゲンマメのゼオリンプロモーターと組み合わせて使用する。
Claims (18)
- 配列番号:12の配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含むデルタ-9デサチュラーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された遺伝子調節エレメントを含み、前記ポリヌクレオチドが配列番号:15に対して少なくとも60%同一である、単離された核酸分子。
- 前記遺伝子調節エレメントは、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)デルタ-9デサチュラーゼプロモーター、デルタ-9デサチュラーゼ3'UTR /ターミネーター、OLE1遺伝子プロモーター、ファゼオリンプロモーター、インゲンマメ(Phaseolus vulgaris)ファゼオリン5 '非翻訳領域、インゲンマメファゼオリン3'非翻訳領域、インゲンマメファゼオリンマトリックス結合領域、アグロバクテリウムツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)ORF23 3 '非翻訳領域、キャッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーター、アグロバクテリウムツメファシエンスORF1 3'非翻訳領域、タバコ(Nicotiana tabacum)RB7マトリックス結合領域、オーバードライブ、Tスタンドボーダー配列、LfKCS3プロモーター、FAE 1プロモーター、配列番号:40、配列番号:41、配列番号:42、配列番号:43、Mycタグ、およびヘマグルチン(hemagglutin)タグから成る群から選択される、請求項1に記載の核酸分子。
- 細胞内の飽和脂肪酸の量を減少させるための方法であって、
細胞内の飽和脂肪酸の量が減少するように、請求項1に記載の核酸分子で細胞を形質転換する工程を含む、方法。 - 前記細胞は酵母細胞である、請求項3に記載の方法。
- 前記細胞は植物細胞である、請求項3に記載の方法。
- 請求項1に記載の複数の核酸分子で植物細胞を形質転換する工程を含む、請求項5に記載の方法。
- 前記植物細胞を形質転換することによって、前記植物細胞に、前記植物細胞内で16:0-ACPのレベルを減少させるためのさらなる手段が導入される、請求項5に記載の方法。
- 前記植物細胞において16:0-ACPのレベルを減少させるための前記さらなる手段が、植物細胞小器官外(extraplastidial)デサチュラーゼである、請求項7に記載の方法。
- 前記植物細胞小器官外デサチュラーゼが、LnD9DSデサチュラーゼ、AnD9DSデサチュラーゼ、HzD9DSデサチュラーゼ、およびMgD9DSデサチュラーゼからなる群から選ばれるデサチュラーゼである、請求項8に記載の方法。
- 前記植物細胞が、シロイヌナズナ、ボラゴ(Borago)、キャノーラ、ヒマ、テオブロマ、トウモロコシ、ワタ、ハマナ、クフェア、アマ、レスケレーラ(Lesquerella)、リムナンテス(Limnanthes)、リノラ(Linola)、キンレンカ、マツヨイグサ、オレア、アブラヤシ、落花生、菜種、ベニバナ、大豆(Glycine)、ソヤ(Soja)、ヒマワリ、ニコチアナ、ベルノニア、コムギ、オオムギ、イネ、エンバク、ソルガム、ライムギ、及びイネ科の他のメンバーからなる群から選ばれる属から選択された植物から得られる、請求項5に記載の方法。
- 請求項1に記載の核酸配列を含む油種子植物。
- 配列番号:12の配列に少なくとも90%同一である植物細胞小器官外デサチュラーゼを発現する植物種子であって、前記デサチュラーゼをコードするポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドが配列番号:15に対して少なくとも60%同一である、植物種子。
- トランスジェニックセイヨウアブラナ(Brassica napus)系統の植物に由来し、同質遺伝子系統バージョンのトランスジェニックセイヨウアブラナ系統に対して減少した16:0レベルを有する、請求項12に記載の種子。
- 野生型植物に比べて減少量の飽和脂肪酸をその植物において含む遺伝子操作された植物を作製するための方法であって:
請求項1に記載の核酸分子で植物材料を形質転換する工程;および
形質転換された植物素材を培養して、植物を得る工程
を含む、方法。 - 前記植物が、シロイヌナズナ、ボラゴ(Borago)、キャノーラ、ヒマ、テオブロマ、トウモロコシ、ワタ、ハマナ、クフェア、アマ、レスケレーラ(Lesquerella)、リムナンテス(Limnanthes)、リノラ(Linola)、キンレンカ、マツヨイグサ、オレア、アブラヤシ、落花生、菜種、ベニバナ、大豆(Glycine)、ソヤ(Soja)、ヒマワリ、ニコチアナ、ベルノニア、コムギ、オオムギ、イネ、エンバク、ソルガム、ライムギ、及びイネ科の他のメンバーからなる群から選ばれる属から選択される、請求項14に記載の方法。
- 請求項14に記載の方法により得られる植物であって、デルタ-9 デサチュラーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドを含む、植物。
- 請求項16に記載の植物から得られる植物材料であって、デルタ-9 デサチュラーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドを含む、植物材料。
- 前記植物材料が種子である、請求項17に記載の植物材料。
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