KR20130098282A

KR20130098282A - 식물 종자의 포화 지방산 함량의 저하

Info

Publication number: KR20130098282A
Application number: KR1020137001766A
Authority: KR
Inventors: 앤 오웬스 멀로; 다니엘 제이 가쇼트; 마크 에이 톰슨; 테렌스 에이 월쉬; 스코트 베번
Original assignee: 다우 아그로사이언시즈 엘엘씨
Priority date: 2010-06-24
Filing date: 2011-06-24
Publication date: 2013-09-04
Also published as: EP2862931B1; NZ700897A; MX338726B; ZA201209083B; ES2620492T3; IL244003A0; IL223438A; WO2011163632A2; EP2585600A4; US20110302672A1; UA115302C2; CL2016000903A1; KR20180008885A; CL2012003665A1; JP6186462B2; KR20180008884A; ES2568803T3; EA029904B1; ES2623454T3; NZ700902A

Abstract

조성물 및 방법이 식물 세포에서 신규 델타-9 디새츄라제(desaturase)를 유전적으로 코딩하고 발현시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 식물 종자 내의 포화 지방산의 백분율 조성이 감소되고 ω-7 지방산의 부수적인 증가가 있도록, 델타-9 디새츄라제 효소의 활성을 활용하기 위해 식물 세포에서 핵산을 발현시키는 방법. 다른 실시양태에서, 아미노산 서열은 델타-9 디새츄라제 활성을 갖는다. 방법은 전체 식물, 식물 종자, 및 식물 물질, 예를 들어, 종자 내의 비일상적인 지방산의 양을 증가시키기 위한 목적의 식물 세포, 식물 물질, 및 전체 식물에서의 델타-9 디새츄라제의 발현을 수반할 수 있다.

Description

식물 종자의 포화 지방산 함량의 저하{LOWERING SATURATED FATTY ACID CONTENT OF PLANT SEEDS}

우선권 주장

본 출원은 미합중국을 지정하여 2005년 10월 7일에 출원된 PCT 국제 특허 출원 번호 PCT/US05/36052 (2006년 4월 20일에 PCT 국제 공개 번호 WO 2006/042049 A2로 영어로 공개됨)가 국내 단계에 진입된 것인, 공동 계류 중인 출원 U.S.S.N. 11/576,750의 일부 계속 출원이다. PCT 국제 특허 출원 번호 PCT/US05/36052는 2004년 10월 8일 출원된 미국 특허 가출원 번호 60/617,532의 계속 출원이다. 본 출원은 또한 2010년 6월 24일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 61/358,314의 계속 출원이다.

기술 분야

일부 실시양태는 일반적으로 특정 델타-9 디새츄라제(desaturase) 효소, 이러한 효소를 코딩하는 핵산, 및 이를 식물 세포에서 발현시키는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태는 특정 델타-9 디새츄라제 효소의 활성을 사용하여 식물 물질 (예를 들어, 종자) 내의 포화 지방산의 백분율 조성을 감소시키는 것 및 ω-7 지방산의 백분율 조성을 증가시키는 것에 관한 것이다. 특정 실시양태에서의 방법에 의해 생산된 식물 및 식물 물질이 또한 본원에서 개시된다.

배경

식물-유래 오일이 식이 지방 섭취의 주요 공급원으로서의 동물-유래 오일 및 지방을 점진적으로 교체하였다. 그러나, 대부분의 산업화 국가에서의 포화 지방 섭취는 여전히 총 칼로리 소비의 약 15％ 내지 20％이다. 더 건강한 생활 양식을 촉진하기 위한 노력으로, 최근 미국 농무부 (USDA)는 포화 지방이 일일 칼로리 섭취의 10％ 미만을 구성하는 것을 권장하였다. 소비자 지각을 용이하게 하기 위해, 현재 USDA가 승인한 현행 표지 지침은 총 포화 지방산 수준이 "저-포화(low-sat)" 표지를 받기 위해서는 14 g 서빙(serving) 당 1.0 g 미만, "포화 없음(no-sat)" 표지를 받기 위해서는 14 g 서빙 당 0.5 g 미만인 것을 요구한다. 이는 식물 오일의 포화 지방산 함량이 "저-포화" 또는 "포화 없음" 표지를 받기 위해서 각각 7％ 및 3.5％ 미만일 필요가 있음을 의미한다. 이러한 지침의 발행 이후로, "저-포화" 및 "포화 없음" 오일에 대한 소비자 수요가 급등하였다. 현재까지, 이러한 수요는 주로 캐놀라(canola) 오일로 충족되었고, 훨씬 더 적은 정도로 해바라기 및 홍화 오일로 충족되었다.

불포화 지방 (단일 불포화 및 다중불포화)은 이로운 반면 (특히 적당히 소비되는 경우), 포화 및 트랜스 지방은 그렇지 않다. 포화 지방 및 트랜스 지방은 혈액 내의 바람직하지 않은 LDL 콜레스테롤 수준을 상승시킨다. 식이성 콜레스테롤이 또한 LDL 콜레스테롤을 상승시키고, 심지어 LDL을 상승시키지 않으면서 심장 질환에 기여할 수 있다. 따라서, 건강에 좋은 식이의 일부로서 포화 지방, 트랜스 지방, 및 콜레스테롤이 낮은 식품을 선택하는 것이 현명하다.

식물성 기원이든 동물성 기원이든, 오일의 특성은 오일 분자 내의 탄소 및 수소 원자의 개수, 뿐만 아니라 지방산 사슬 내에 포함된 이중 결합의 개수 및 위치에 의해 우세하게 결정된다. 식물로부터 유래된 오일 대부분은 다양한 양의 팔미트 (16:0), 스테아르 (18:0), 올레 (18:1), 리놀레 (18:2) 및 리놀렌 (18:3) 지방산으로 구성된다. 통상적으로, 팔미트산 및 스테아르산은 "포화"로 지정되는데, 이는 이들의 탄소 사슬이 수소 원자로 포화되고, 따라서 이중 결합이 없기 때문이다; 이들은 최대로 가능한 개수의 수소 원자를 함유한다. 그러나, 올레산, 리놀레산 및 리놀렌산은 내부에 각각 1개, 2개 및 3개의 이중 결합이 있는 18-탄소 지방산 사슬이다. 올레산은 전형적으로 단일불포화 지방산으로 간주되는 한편, 리놀레산 및 리놀렌산은 다중불포화 지방산으로 간주된다. 지방산 함량이 3.5％ 미만인 것으로서의 "포화가 없는" 오일 제품의 U.S.D.A. 정의는 중량 기준의 조합된 포화 지방산 함량으로서 계산된다 (지방산의 총량에 비교됨).

캐놀라 오일은 모든 식물성 오일 중 포화 지방산 수준이 가장 낮다. "캐놀라"는 에루크산 (C22:1) 함량이 종자의 총 지방산 함량을 기초로 최대 2 중량％ (바람직하게는 최대 0.5 중량％, 가장 바람직하게는 본질적으로 0 중량％)이고, 분쇄 후, 30 μmol/g 미만의 탈지 (오일 없음) 박(meal)을 함유하는 공기-건조 박이 생산되는 평지씨 (브라시카(Brassica))를 지칭한다. 이러한 유형의 평지씨는 이러한 종의 더욱 전통적인 품종과 비교하여 이의 식용성에 의해 구별된다.

오일 종자에서, 주로 색소체에서 지방산 합성이 발생하는 것으로 가정된다. 지방산 합성의 주요 생성물은 팔미테이트 (16:0)이고, 이는 스테아레이트 (18:0)로 효율적으로 신장되는 것으로 보인다. 여전히 색소체 내에 있으면서, 그 후 이러한 포화 지방산이 아실-ACP 델타-9 디새츄라제로 공지된 효소에 의해 탈포화되어 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합이 도입될 수 있다. 구체적으로, 스테아레이트가 색소체 델타-9 디새츄라제 효소에 의해 신속하게 탈포화되어 올레에이트 (18:1)가 산출될 수 있다. 실제로는, 팔미테이트가 색소체 델타-9 디새츄라제에 의해 팔미톨레에이트 (16:1)로 또한 탈포화될 수 있지만, 이러한 지방산은 대부분의 식물성 오일에서 미량 (0-0.2％)으로만 나타난다. 따라서, 색소체에서의 지방산 합성의 주요 생성물은 팔미테이트, 스테아레이트, 및 올레에이트이다. 대부분의 오일에서, 포화 지방산들은 훨씬 더 낮은 비율로 존재하기 때문에, 올레에이트가 합성된 주요 지방산이다.

새롭게 합성된 지방산들은 색소체로부터 세포질로 수출된다. 이어지는 세포질에서의 식물 지방산의 탈포화는 올레에이트에 한정되는 것으로 보이고, 이는 포스파티딜 콜린 (PC)으로 에스테르화된 올레오일 또는 리놀레오일 기질 상에 작용하는 마이크로솜 디새츄라제에 의해 리놀레에이트 (18:2) 및 리놀레네이트 (18:3)로 탈포화될 수 있다. 또한, 식물에 따라, 올레에이트가 신장 (20:1, 22:1, 및/또는 24:1로의 신장)에 의해, 또는 관능기의 부가에 의해 추가로 변형될 수 있다. 그 후, 이러한 지방산들은, 포화 지방산인 팔미테이트 및 스테아레이트와 함께, 소포체 막에서 트리글리세리드로 조립(assembly)된다.

식물 아실-ACP 델타-9 디새츄라제 효소는 가용성이다. 이는 색소체 스트로마(stroma) 내에 위치하고, ACP, 주로 스테아릴-ACP로 에스테르화된 새롭게 합성된 지방산을 기질로 사용한다. 이는 다른 델타-9 디새츄라제 효소들과 대조적인데, 이들은 소포체 막 (ER, 또는 마이크로솜) 내에 위치하고, Co-A로 에스테르화된 지방산을 기질로 사용하며, 포화 지방산인 팔미테이트 및 스테아레이트 양쪽 모두를 탈포화시킨다. 미국 특허 5,723,595 및 6,706,950는 식물 디새츄라제에 관한 것이다.

효모 델타-9 디새츄라제 유전자가 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae)로부터 단리되어, 클로닝되고, 서열분석되었다. 문헌 [Stukey et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:16537-44]; [Stukey et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:20144-9]. 이러한 효모 유전자가 담배 잎 조직 내로 도입되었고 (문헌 [Polashcok et al. (1991) FASEB J. 5:A1157]; [Polashok et al. (1992) Plant Physiol. 100:894-901]), 이러한 조직에서 발현되는 것 같았다. 추가로, 이러한 효모 유전자가 토마토에서 발현되었다. 문헌 [Wang et al. (1996) J. Agric. Food Chem. 44:3399-402]; 및 [Wang et al. (2001) Phytochemistry 58:227-32] 참조. 특정 불포화 지방산의 약간의 증가 및 특정 포화 지방산의 약간의 증가가 이러한 효모 델타-9 디새츄라제 유전자를 사용하여 담배 및 토마토 양쪽 모두에 대해 보고되었지만, 명백하게 담배 및 토마토는 오일 작물이 아니다. 이러한 효모 유전자가 브라시카 나푸스(Brassica napus) 내로 또한 도입되었다. 미국 특허 5,777,201.

아스페르길루스 니둘란스(Aspergillus nidulans)로부터의 상이한 진균 아실-CoA 델타-9 디새츄라제가 캐놀라 내로 도입되었고, 이에 의해 종자 오일에서의 감소된 포화 지방산 수준이 달성되었다. 미국 특허 출원 공개 US 2008/0260933 A1. 에이. 니둘란스(A. nidulans) 아실-CoA 델타-9 디새츄라제는 종자 오일 내의 더 풍부한 팔미테이트 지방산 (36-49％)에 비하여 더 큰 스테아레이트 고갈 (61-90％)을 제공하였다.

발명의 개시

신규 진균 델타-9 디새츄라제 효소; 이같은 디새츄라제를 코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산; 및 상기의 것 중 하나를 포함하는 식물, 식물 물질 (예를 들어, 종자), 식물의 일부분, 및 식물 원자재 제품이 본원에서 개시된다. 일부 실시양태의 측면은 마그나포르테 그리세아(Magnaporthe grisea), 렙토스파에리아 노도룸(Leptosphaeria nodorum), 및 헬리코베르파 지아(Helicoverpa zea)로부터 단리된 진균 델타-9 디새츄라제 효소에 의해 예시된다. 일부 예는 팔미트산 또는 스테아르산에 대한 기질 선호도가 있는 천연 및 합성 델타-9 디새츄라제를 포함한다.

일부 실시양태는 서열 12, 서열 13, 서열 14, 서열 50, 서열 51, 서열 52, 서열 72 및 서열 73으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 80％ 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 델타-9 디새츄라제 효소를 코딩하는 단리된 핵산 분자를 포함한다. 특정 예에서, 이러한 핵산 분자는 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 8, 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 15, 서열 16, 서열 17, 서열 44, 서열 45, 서열 48 및 서열 49로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 60％ 이상 동일한 서열을 포함한다. 이러한 실시양태 및 추가적인 실시양태는 서열 12, 서열 13, 서열 14, 서열 50, 서열 51, 서열 52, 서열 72 및 서열 73으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 80％ 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단리된 델타-9 디새츄라제 폴리펩티드를 포함할 수 있다.

식물 세포에서 상기 언급된 핵산 및/또는 폴리펩티드 중 하나 이상을 발현시키는 방법이 또한 개시된다. 특정 실시양태는 식물, 식물 물질 (예를 들어, 종자), 및/또는 식물 세포를 포함하는 식물의 일부분, 및/또는 상기의 것들 중 임의의 것으로부터 생산된 식물 원자재 제품에서 포화 지방산의 백분율 조성이 감소될 수 있도록 델타-9 디새츄라제 효소의 활성을 활용한다. 특정 실시양태에서, ω-7 지방산이 식물, 식물 물질, 식물의 일부분, 및/또는 식물 원자재 제품에서 부수적으로 증가될 수 있다.

일부 실시양태는 세포 내의 포화 지방산의 양이 감소되도록 본 발명의 델타-9 디새츄라제 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자로 식물 세포를 형질전환시키는 단계를 포함하는, 식물, 식물 물질, 식물의 일부분, 및/또는 식물 원자재 제품 내의 포화 지방산의 양을 감소시키는 방법을 포함한다. 일부 실시양태는 동일한 종의 야생형 식물과 비교하여 식물 내에 감소된 양의 포화 지방산을 포함하는 유전자 조작 식물을 생성시키는 방법을 포함한다. 이같은 방법은 식물 물질 (또는 식물 세포)를 본 발명의 델타-9 디새츄라제 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자로 형질전환시키는 단계 및 형질전환된 식물 물질 (또는 식물 세포)을 배양하여 식물을 수득하는 단계를 포함한다. 특정 예에서, 아라비돕시스(Arabidopsis) 종으로부터의 식물 세포 및/또는 식물 물질이 본 발명의 델타-9 디새츄라제 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자로 형질전환될 수 있다.

상기 특색 및 기타 특색이 하기의 여러 실시양태의 상세한 설명으로부터 더욱 명확해질 것이고, 이는 첨부된 도면에 대한 언급과 함께 진행된다.

도 1은 다양한 진균 디새츄라제 단백질 서열의 개략적인 계통발생학적 분석을 포함한다. 도시된 디새츄라제들의 완전한 단백질 서열들은 ClustalX를 사용하여 정렬되었고, MEGA를 사용하여 디스플레이되었다.
도 2(a-d)는 진균 델타-9 디새츄라제 유전자 서열들의 정렬을 포함한다. 대문자 글꼴은 이러한 정렬 내의 보존된 뉴클레오티드들을 나타낸다. 음영이 있는 글꼴은 이러한 정렬 내의 동일한 뉴클레오티드들을 나타낸다.
도 3(a-b)는 진균 델타-9 디새츄라제 폴리펩티드들의 정렬을 포함한다.
도 4-18은 일부 실시양태에서 유용할 수 있는 진균 델타-9 디새츄라제 폴리펩티드-코딩 뉴클레오티드 서열을 포함하는 예시적인 플라스미드들의 플라스미드 지도를 포함한다. 구체적으로 도 4는 PvPhas 5' UTR 및 PvPhas 3' UTR을 추가로 포함하는 LnD9DS-2-코딩 뉴클레오티드 서열 (도 4a; pDAB110110) 및 HzD9DS-코딩 뉴클레오티드 서열 (도 4b; pDAB110112)을 포함하는 예시적인 플라스미드들의 플라스미드 지도를 포함한다.
도 19는 특정한 예시적인 진균 델타-9 디새츄라제 유전자 서열로 형질전환된 식물로부터의 예시적인 T₂ 아라비돕시스 종자의 총 포화 지방산 함량 (％FAME)을 나타내는 데이터를 포함한다.
도 20은 특정한 예시적인 진균 델타-9 디새츄라제 유전자 서열로 형질전환된 식물로부터의 예시적인 T₂ 아라비돕시스 종자의 팔미트산 (C16:0) 함량 (％FAME)을 나타내는 데이터를 포함한다.
도 21은 특정한 예시적인 진균 델타-9 디새츄라제 유전자 서열로 형질전환된 식물로부터의 예시적인 T₂ 아라비돕시스 종자의 스테아르산 (C18:0) 함량 (％FAME)을 나타내는 데이터를 포함한다.
도 22는 특정한 예시적인 진균 델타-9 디새츄라제 유전자 서열로 형질전환된 식물로부터의 예시적인 T₂ 아라비돕시스 종자의 팔미톨레산 (C16:1) 함량 (％FAME)을 나타내는 데이터를 포함한다.
도 23은 pDAB7319 (AnD9DS v3 및 LnD9DS-2 v2) 또는 pDAB7324 (AnD9DS v3 및 HzD9DS v2)로 형질전환된 캐놀라 식물로부터의 발달 중인 종자 내의 HzD9DS 및 LnD9DS-2 mRNA 전사물의 축적 (AnD9DS 전사물에 비교됨)의 그래프식 표현을 포함한다. 각각의 유전자의 qRT-PCR ΔΔCt를 액틴 전사물 수준에 비교하여 결정하였고, 그 후, HzD9DS 및 LnD9DS-2에 대한 전사물의 양을 각각의 샘플 내의 AnD9DS 전사물의 수준에 대해 표준화하였다.
서열 목록
첨부된 서열 목록에 열거된 핵산 서열들은 37 C.F.R. § 1.822에서 규정된 바와 같은 뉴클레오티드 염기에 대한 표준 문자 약어를 사용하여 제시된다. 각각의 핵산 서열의 한쪽 가닥만 제시되지만, 디스플레이된 가닥에 대한 임의의 언급에 의해 상보적인 가닥이 포함되는 것으로 이해된다. 첨부된 서열 목록에서, 서열들은 하기와 같다:
서열 1은 마그나포르테 그리세아 아실-CoA 델타-9 디새츄라제 유전자 (일부 경우에 MgD9DS로 지칭됨)의 단편을 PCR 증폭시키는데 사용된 전방향 프라이머를 나타낸다.
서열 2는 엠. 그리세아(M. grisea) 아실-CoA 델타-9 디새츄라제 유전자 (일부 경우에 MgD9DS로 지칭됨)의 단편을 PCR 증폭시키는데 사용된 역방향 프라이머를 나타낸다.
서열 3은 PCR에 의해 증폭된 엠. 그리세아 아실-CoA 델타-9 디새츄라제 유전자 (일부 경우에 MgD9DS로 지칭됨)의 예시적인 단편을 나타낸다.
서열 4는 예시적인, 인트론이 없는 MgD9DS 클론을 나타낸다.
서열 5는 일부 경우에 LnD9DS-1로 지칭되는 제1 렙토스파에리아 노도룸 아실-CoA 델타-9 디새츄라제를 코딩하는 예시적인 핵산 서열을 나타낸다.
서열 6 및 7은 일부 실시양태에서 유용할 수 있는 프라이머 서열들을 나타낸다.
서열 8은 일부 경우에 LnD9DS-2로 지칭되는 제2의 예시적인 엘. 노도룸(L. nodorum) 아실-CoA 델타-9 디새츄라제를 코딩하는 예시적인 핵산 서열을 나타낸다.
서열 9는 엠. 그리세아로부터의 예시적인 천연 델타-9 디새츄라제 유전자 (MgD9DS v1로 표지됨)로부터의 코딩 영역을 나타낸다.
서열 10은 헬리코베르파 지아로부터의 예시적인 천연 델타-9 디새츄라제 유전자 (HzD9DS v1로 표지됨)로부터의 코딩 영역을 나타낸다.
서열 11은 엘. 노도룸으로부터의 예시적인 천연 델타-9 디새츄라제 (LnD9DS-2 v1) 유전자로부터의 코딩 영역을 나타낸다.
서열 12는 엠. 그리세아로부터의 예시적인 천연 델타-9 디새츄라제 (MgD9DS)의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 13은 에이치. 지아(H. zea)로부터의 예시적인 천연 델타-9 디새츄라제 (HzD9DS)의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 14는 엘. 노도룸으로부터의 예시적인 천연 델타-9 디새츄라제 (LnD9DS-2)의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 15는 엠. 그리세아로부터의 예시적인 캐놀라-최적화 델타-9 디새츄라제 유전자 (MgD9DS v2)의 서열을 나타낸다.
서열 16은 에이치. 지아로부터의 예시적인 캐놀라-최적화 델타-9 디새츄라제 유전자 (HzD9DS v2)의 서열을 나타낸다.
서열 17은 엘. 노도룸으로부터의 예시적인 캐놀라-최적화 델타-9 디새츄라제 유전자 (LnD9DS-2 v2)의 서열을 나타낸다.
서열 18-39는 일부 실시양태에서 유용할 수 있는 프라이머 및 프로브의 서열을 나타낸다.
서열 40-43은 일부 실시양태에서 발현을 증가시키는데 사용될 수 있는 예시적인 별법적인 코작(Kozak) 서열을 나타낸다.
서열 44는 엘. 노도룸으로부터의 추가적인 예시적인 캐놀라-최적화 델타-9 디새츄라제 유전자 (LnD9DS-2 v3)의 서열을 나타낸다.
서열 45는 에이치. 지아로부터의 추가적인 예시적인 캐놀라-최적화 델타-9 디새츄라제 유전자 (HzD9DS v3)의 서열을 나타낸다.
서열 46은 Myc 태그(tag)의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 47은 HA 태그의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 48은 일부 경우에 AnD9DS v2로 지칭되는, 아스페르길루스 니둘란스 델타-9 디새츄라제를 코딩하는 예시적인 핵산 서열을 나타낸다.
서열 49는 일부 경우에 AnD9DS v3으로 지칭되는, 에이. 니둘란스 델타-9 디새츄라제를 코딩하는 제2의 예시적인 핵산 서열을 나타낸다.
서열 50은 서열 48-49 (AnD9DS)로 예시된 바와 같은 핵산에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 51은 또 다른 예시적인 AnD9DS 디새츄라제의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 52는 사카로마이세스 세레비시아에로부터의 예시적인 천연 델타-9 디새츄라제 (ScOLE1)의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 53-66은 일부 실시양태에서 유용할 수 있는 플라스미드를 나타낸다.
서열 67-71은 일부 실시양태에서 유용할 수 있는 여러 핵산 조절 제어 요소를 포함한다.
서열 72는 예시적인 AnD9DS 디새츄라제의 N-말단의 68개의 잔기(1-68)를 나타낸다.
서열 73은 예시적인 AnD9DS 디새츄라제의 C-말단의 175개의 잔기 (281-455)를 나타낸다.
서열 74는 플라스미드 pDAB110110의 지도를 나타낸다.
서열 75는 플라스미드 pDAB110112의 지도를 나타낸다.
서열 76은 일부 경우에 MgD9DS로 지칭되는, 예시적인 엠. 그리세아 아실-CoA 델타-9 디새츄라제를 코딩하는 예시적인 핵산 서열을 나타낸다.
서열 77은 서열 14의 엘. 노도룸으로부터의 예시적인 천연 델타-9 디새츄라제 내에 포함된 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 78은 서열 13의 에이치. 지아로부터의 예시적인 천연 델타-9 디새츄라제 내에 포함된 아미노산 서열을 나타낸다.

발명을 수행하기 위한 방식(들)

I. 여러 실시양태의 개요

본 발명가들은 기존에 아스페르길루스 니둘란스로부터의 진균 아실-CoA 델타-9 디새츄라제를 캐놀라 내로 도입하였고, 이에 의해 종자 오일 내의 포화 지방산 수준 감소를 달성하였다. 미국 특허 출원 공개 US 2008/0260933 A1. 에이. 니둘란스 델타-9 디새츄라제는 종자 오일 내의 더 풍부한 팔미테이트 지방산 (36-49％)에 비하여 더 큰 스테아레이트 고갈 (61-90％)을 제공하였다. 따라서, 팔미테이트 포화물 상에 우선적으로 작용하는 델타-9 디새츄라제의 공동-도입은 에이. 니둘란스 델타-9 디새츄라제의 스테아레이트-선호 활성을 보완하는 것에 의해 총 포화물의 추가적인 감소를 달성할 것이다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 기질 특이성이 다양한 진균 델타-9 디새츄라제 폴리펩티드들이 개시된다. 특정 실시양태는 팔미테이트-선호 델타-9 디새츄라제 (예를 들어, 본원에 개시된 바와 같은 천연 진균 효소, 또는 이의 기능성 등가물; 및 팔미트산 기질을 선호하도록 디자인된 합성 폴리펩티드)를 포함한다.

서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 8, 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 15, 서열 16, 서열 17, 서열 44, 서열 45, 서열 48 및 서열 49로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 60％ 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 델타-9 디새츄라제 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자가 본원에서 개시된다. 일부 실시양태에서, 이러한 핵산 분자는 델타-9 디새츄라제 폴리펩티드-코딩 서열에 작동가능하게 연결된 유전자 조절 요소를 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 유전자 조절 요소는 파세올린 프로모터, 파세올린 5' 비번역 영역, 파세올린 3' 비번역 영역, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) ORF1 3' 비번역 영역, 카사바 베인 모자이크 바이러스(Cassava vein Mosaic Virus) 프로모터, 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum) RB7 매트릭스 부착 영역, T-가닥 경계 서열, LfKCS3 프로모터, 및 FAE 1 프로모터일 수 있다.

서열 12, 서열 13, 서열 14, 서열 50, 서열 52, 서열 72 및 서열 73으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 80％ 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 델타-9 디새츄라제 폴리펩티드, 뿐만 아니라 이같은 델타-9 디새츄라제 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자가 또한 개시된다.

일부 실시양태에서, 핵산 분자 및 델타-9 디새츄라제 폴리펩티드가 식물 물질, 세포, 조직, 또는 전체 식물에서 발현되어, 이러한 식물 물질, 세포, 조직, 또는 전체 식물 내의 포화 지방산의 양을 동일한 종의 야생형 식물에서 관찰되는 양에 비해 감소시킬 수 있다. 본 발명의 별법적인 실시양태는 식물 물질, 세포, 조직, 또는 전체 식물 내의 포화 지방산의 양을 감소시키는 방법을 포함한다. 이같은 방법은 식물 물질, 세포, 조직, 또는 전체 식물 내의 포화 지방산의 양이 감소되도록 식물 물질, 세포, 조직, 또는 전체 식물을 상기 언급된 핵산 분자들 중 하나 이상으로 형질전환시키는 것을 포함할 수 있다. 특정 실시양태는 식물 물질, 세포, 조직, 또는 전체 식물 내의 팔미트 및/또는 스테아르 지방산을 우선적으로 감소시키는 방법을 포함한다.

본원에 개시된 방법은, 예를 들어, 식물, 또는 식물 (예를 들어, 아라비돕시스 속의 식물, 또는 캐놀라)로부터 유래된 식물 물질 상에서 수행될 수 있다. 특정 실시양태는 식물 세포 또는 물질을 상기 언급된 핵산 분자 중 하나로 형질전환시키는 단계; 및 형질전환된 식물 물질을 배양하여 식물을 수득하는 단계를 포함하는, 동일한 종의 야생형 식물에 비교하여 식물 내에 감소된 양의 포화 지방산을 포함하는 유전자 조직 식물을 생성 또는 재생시키는 방법에 관한 것이다. 상기 언급된 방법 중 임의의 것에 의해 수득된 식물, 식물 물질, 식물 세포, 및 종자가 또한 개시된다.

II . 약어

III . 용어

지방산: 본원에서 사용되는 경우에, 용어 "지방산"은 다양한 사슬 길이, 예를 들어, 사슬 길이가 더 길거나 또는 더 짧은 산이 공지되어 있지만 약 C12 내지 C22의 장쇄 지방족 산 (알칸산)을 지칭한다. 지방산의 구조는 x:yΔ^z 표기법에 의해 표시되고, 이때 "x"는 특정 지방산 내의 탄소 (C) 원자의 총 개수이고, "y"는 산의 카르복실 말단으로부터 세었을 때 "z" 위치에 있는 탄소 사슬 내의 이중 결합의 개수이다.

대사 경로: 용어 "대사 경로"는 대사 생성물의 형성 또는 또 다른 대사 경로의 개시를 달성하기 위해 세포 내에서 일어나는, 효소에 의해 촉매되는 일련의 화학 반응을 지칭한다. 대사 경로는 몇몇 단계 또는 다수의 단계를 수반할 수 있고, 특이적인 반응 기질에 대해 상이한 대사 경로와 경쟁할 수 있다. 유사하게, 하나의 대사 경로의 생성물이 또 다른 대사 경로에 대한 기질일 수 있다.

대사 공학: 본 발명의 목적을 위해, "대사 공학"은 초기 물질이 정확한 원하는 화학 구조의 생성물로 단계적으로 변형되는 것이 세포 내에서 작동성인 총 대사 경로의 전체적인 계획 내에서 달성되도록, 세포 내의 하나 이상의 대사 경로를 변경하기 위한 전략들의 합리적인 디자인을 지칭한다.

디새츄라제: 본원에서 사용되는 경우에, 용어 "디새츄라제"는 관심 지방산 또는 전구체가 생산되도록 하나 이상의 지방산을 탈포화시킬 수 있는 (즉, 이중 결합을 도입할 수 있는) 폴리펩티드를 지칭한다. 식물-가용성 지방산 디새츄라제 효소는 이중 결합을 위치특이적으로 포화 아실-ACP 기질 내로 도입할 수 있다. 아실-CoA 디새츄라제는 이중 결합을 위치특이적으로 포화 지방 아실-CoA 기질 내로 도입한다. 이러한 반응은 디새츄라제 구조물의 코어(core)를 형성하는 4-나선 다발이 배위된 2-전자 환원형 2철 중심에 의한 분자 산소의 활성화를 수반한다. 일부 실시양태에서, 아실-CoA 델타-9 디새츄라제가 특히 흥미롭다.

델타-9-18:0¹-ACP 디새츄라제는 막 유동성의 유지를 위해 모든 식물이 이를 요구한다. 이러한 효소는 주로 스테아로일-ACP를 탈포화시키지만, 이는 미미한 정도로 팔미토일-ACP에 대해서도 또한 활성이다.

변이체 디새츄라제: 본원에서 사용되는 경우에, 용어 "변이체 디새츄라제"는 일반적이지 않은 지방산을 생산하는 것에서의 역할과 합치하는 특이적인 활성 프로파일을 나타내는 디새츄라제를 포함한다. 변이체 디새츄라제는 생물로부터 단리될 수 있거나, 지향성 진화 프로그램을 통해 조작될 수 있거나, 또는 하나 이상의 특성화된 디새츄라제로부터 보존된 아미노산들이 혼입된 합성 디새츄라제로서 조작될 수 있다.

자손 식물: 본 발명의 목적을 위해, "자손 식물"은 식물 육종 방법에 의해 수득될 수 있는 임의의 식물, 또는 이로부터 수득된 식물 물질을 지칭한다. 식물 육종 방법은 당업계에 주지되어 있고, 천연 육종, 인공 육종, DNA 분자 마커 분석을 수반하는 선별 육종, 트랜스제닉(transgenics), 및 상업 육종을 포함한다.

식물 물질: 본원에서 사용되는 경우에, 용어 "식물 물질"은 식물로부터 수득된 임의의 세포 또는 조직을 지칭한다.

핵산 분자: RNA, cDNA, 게놈 DNA, 및 상기의 것들의 합성 형태 및 혼합형 중합체의 센스 및 안티-센스 가닥 양쪽 모두를 포함할 수 있는, 중합체 형태의 뉴클레오티드. 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드, 데옥시뉴클레오티드, 또는 어느 한쪽 유형의 뉴클레오티드의 변형 형태를 지칭한다. 본원에서 사용된 경우에, "핵산 분자"는 "핵산" 및 "폴리뉴클레오티드"와 동의어이다. 이러한 용어는 단일-가닥 및 이중 가닥 형태의 DNA를 포함한다. 핵산 분자는 천연 발생 및/또는 비-천연 발생 뉴클레오티드 연결에 의해 함께 연결된 천연 발생 뉴클레오티드 및 변형 뉴클레오티드 중 어느 한 쪽 또는 양쪽 모두를 포함할 수 있다.

핵산 분자는, 당업자가 쉽게 이해할 바와 같이, 화학적으로 또는 생화학적으로 변형될 수 있거나, 또는 비-천연 또는 유도체화 뉴클레오티드 염기를 함유할 수 있다. 이같은 변형에는, 예를 들어, 표지, 메틸화, 천연 발생 뉴클레오티드 중 하나 이상이 유사체로 치환되는 것, 뉴클레오티드간 변형, 예컨대 전하를 띠지 않는 연결 (예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포르아미데이트, 카르바메이트 등), 전하를 띤 연결 (예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등), 펜던트(pendent) 모이어티(moiety) (예를 들어, 펩티드), 인터칼레이터(intercalator) (예를 들어, 아크리딘, 소랄렌 등), 킬레이터, 알킬화제, 및 변형된 연결 (예를 들어, 알파 아노머(anomeric) 핵산 등)이 포함된다. 용어 "핵산 분자"는 단일-가닥, 이중-가닥, 부분적 듀플렉스화, 트리플렉스화, 헤어핀, 원형 및 잠금(padlocked) 형상이 포함되는 임의의 토폴로지(topology) 형상을 또한 포함한다.

작동가능하게 연결됨: 제1 핵산 서열이 제2 핵산 서열과 기능적인 관계에 있는 경우에 제1 핵산 서열이 제2 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 것이다. 예를 들어, 프로모터가 코딩 서열의 전사 또는 발현에 영향을 미치면 프로모터가 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이다. 재조합에 의해 생산되는 경우에, 작동가능하게 연결된 핵산 서열들은 일반적으로 인접하고, 2개의 단백질-코딩 영역을 연결하기 위해 필요한 경우, 동일한 리딩 프레임(reading frame) 내에 있다. 그러나, 작동가능하게 연결되기 위해 핵산들이 인접할 필요는 없다.

조절 요소: 본원에서 사용되는 경우에, 용어 "조절 요소"는 유전자 조절 활성이 있는 핵산 분자, 즉 작동가능하게 연결된 전사성 핵산 분자의 전사 또는 번역에 영향을 미치는 능력이 있는 것이다. 조절 요소 예컨대 프로모터, 리더(leader), 인트론, 및 전사 종결 영역은 살아 있는 세포에서 유전자의 전체적인 발현에서 불가결한 역할을 하는, 유전자 조절 활성이 있는 비-코딩 핵산 분자이다. 따라서, 식물에서 기능하는 단리된 조절 요소는 분자 공학 기술을 통해 식물 표현형을 변형시키는데 유용하다. "조절 요소"는 특정 유전자가 발현될지, 언제 발현될지 및 어떠한 수준으로 발현될지를 결정하는 일련의 뉴클레오티드를 의미한다. 조절 DNA 서열은 조절 단백질 또는 기타 단백질과 특이적으로 상호작용한다.

본원에서 사용되는 경우에, 용어 "유전자 조절 활성"은 작동가능하게 연결된 핵산 분자의 전사 또는 번역에 영향을 미칠 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 유전자 조절 활성이 있는 단리된 핵산 분자는 작동가능하게 연결된 핵산 분자의 일시적인 발현 또는 공간적인 발현을 제공할 수 있거나 또는 작동가능하게 연결된 핵산 분자의 발현 수준 또는 속도를 조정할 수 있다. 유전자 조절 활성이 있는 단리된 핵산 분자는 프로모터, 인트론, 리더, 또는 3' 전사 종결 영역을 포함할 수 있다.

프로모터: 본원에서 사용되는 경우에, 용어 "프로모터"는 RNA 폴리머라제(polymerase) II 또는 기타 단백질 예컨대 전사 인자 (전사를 조절하는 트랜스(trans)- 작용 단백질 인자)의 인식 및 결합에서 수반되어, 작동가능하게 연결된 유전자의 전사를 개시시키는 핵산 분자를 지칭한다. 작동가능하게 연결된 유전자의 전사에 영향을 미치는 하위-요소 예컨대 시스(cis)-요소 또는 인핸서 도메인을 프로모터 자체가 함유할 수 있다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 기능성인 천연 또는 비-천연 프로모터이다. 식물 프로모터는 작동가능하게 연결된 유전자 또는 유전자들의 발현을 조정하기 위한 5' 조절 요소로서 사용될 수 있다. 식물 프로모터는 이의 일시적인 발현 패턴, 공간적인 발현 패턴 또는 발달에 따른 발현 패턴에 의해 정의될 수 있다. 본원에 기술된 핵산 분자는 프로모터를 포함하는 핵산 서열을 포함할 수 있다.

서열 동일성: 용어 "서열 동일성" 또는 "동일성"은, 본원에서 2개의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 정황에서 사용된 경우에, 특정 비교 창에 걸쳐 최대 상응성을 위해 정렬되었을 때 동일한, 2개의 서열 내의 잔기들을 지칭할 수 있다.

서열 동일성 백분율이 단백질에 대한 언급에서 사용되는 경우, 동일하지 않은 잔기 위치들이 종종 보존적 아미노산 치환에 의해 상이하다는 것이 인지되고, 이때 화학적 성질 (예를 들어, 전하, 소수성, 또는 입체 효과)이 유사한 다른 아미노산 잔기로 아미노산 잔기가 치환되고, 따라서 분자의 기능적 성질을 변화시키지 않는다.

따라서, 서열이 보존적 치환에 의해 상이한 경우, 동일하지 않은 잔기 부위에서의 치환의 보존적 성질에 대해 교정하기 위해 서열 동일성 백분율이 상향 조정될 수 있다. 이같은 보존적 치환에 의해 상이한 서열들을 "서열 유사성" 또는 "유사성"이 있다고 한다. 이러한 조정을 위한 기술이 당업자에게 주지되어 있다. 전형적으로, 이같은 기술은 보존적 치환을 완전한 미스매치보다는 부분적인 미스매치로 채점하고, 이에 의해 서열 동일성 백분율을 증가시키는 것을 수반한다. 예를 들어, 동일한 아미노산의 점수가 0 내지 1이고, 비-보존적 치환의 점수가 0인 경우에, 보존적 치환의 점수는 0 내지 1이다. 보존적 치환의 채점은, 예를 들어, PC/GENE 프로그램 (인텔리제네틱스(Intelligenetics), 캘리포니아주 마운틴 뷰)에서 실행된 바와 같이 계산될 수 있다.

본원에서 사용되는 경우에, 용어 "서열 동일성 백분율"은 2개의 최적으로 정렬된 서열들을 비교 창에 걸쳐 비교함으로써 결정된 값을 지칭할 수 있고, 이때 2개의 서열의 최적의 정렬을 위해 비교 창 내의 서열의 일부분이 기준 서열 (부가 또는 결실을 포함하지 않음)에 비교하여 부가 또는 결실 (즉, 갭(gap))을 포함할 수 있다. 이러한 백분율은 양쪽 서열에서 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기가 발생하는 위치의 개수를 결정하여 매칭되는 위치의 개수를 산출하고, 매칭되는 위치의 개수를 비교 창 내의 전체 위치 개수로 나누고, 결과에 100을 곱하여 서열 동일성 백분율을 산출하는 것에 의해 계산된다.

아미노산 서열 내의 유사한 위치: 하기 단락에 기술된 방법에 의해 핵산 및 아미노산 서열을 정렬할 수 있다. 정렬되었을 때, 위치들이 컨센서스(consensus) 서열 내에서 동일하면 한 서열 내의 위치가 정렬된 서열 내의 위치와 "유사한 위치"에 있는 것이다.

비교를 위해 서열들을 정렬하는 방법이 당업계에 주지되어 있다. 다양한 프로그램 및 정렬 알고리즘이 하기 문헌들에 기술되어 있다: 문헌 [Smith and Waterman, Adv. Appl. math. 2:482, 1981]; [Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970]; [Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988]; [Higgins and Sharp, Gene 73:237-44, 1988]; [Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3, 1989]; [Corpet et al., Nucleic Acids Research 16:10881-10890, 1988]; [Huang, et al., Computer Applications in the Biosciences 8:155-65, 1992]; [Pearson et al., Methods in Molecular Biology 24:307-31, 1994]; [Tatiana et al., FEMS Microbiol. Lett., 174:247-50, 1990]; [Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990] (서열-정렬 방법 및 상동성 계산의 상세한 고찰).

미국 국립 생물공학 정보 센터 (NCBI)의 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)가 서열-분석 프로그램, 예를 들어, blastp 및 blastn에 관하여 사용하기 위해 인터넷 (blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 상에서 입수가능하다. 이러한 프로그램을 사용하여 서열 동일성을 결정하는 방법의 설명이 NCBI를 통해 인터넷에서 blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD=Web&PAGE_TYPE=BlastDocs에서 입수가능하다.

아미노산 서열들의 비교를 위해, 디폴트 파라미터를 사용하여 BLAST 프로그램의 "Blast 2 서열" 기능 (bl2seq)을 이용한다. 예를 들어, 미스매치에 대한 감점 또는 매치에 대한 보상을 제공하기 위해, 당업자의 재량 내에서 특정 파라미터들을 조정할 수 있다.

형질전환됨: 본원에서 사용되는 경우에, 용어 "형질전환됨"은 외래 핵산 분자, 예컨대 구축물이 내부로 도입된 세포, 조직, 기관, 또는 생물을 지칭한다. 도입된 핵산 분자는 도입된 폴리뉴클레오티드 분자가 후속 자손에 의해 유전되도록 수용자 세포, 조직, 기관 또는 생물의 게놈 DNA 내로 통합될 수 있다. "트랜스제닉(transgenic)" 또는 "형질전환된" 세포 또는 생물은 이러한 세포 또는 생물의 자손, 및 이같은 트랜스제닉 식물을, 예를 들어 교배에서, 어버이로 사용하는 육종 프로그램으로부터 생산되고 외래 핵산 분자의 존재로부터 초래되는 변경된 표현형을 나타내는 자손을 또한 포함한다.

IV . 숙주 세포, 조직, 또는 생물 내의 포화 지방산을 감소시키는 것에 대한 대사 공학 접근법

A. 개관

본 발명의 실시양태는 특이적인 아실-CoA (예를 들어, 팔미트산 또는 스테아르산)를 선호하는 델타-9 디새츄라제를 식물 종자 내에 도입하는 것을 포함한다. 이러한 델타-9 디새츄라제의 특이적 아실-CoA 선호는 특정한 특이적 포화 지방산 풀(pool) (예를 들어, 단일불포화 생성물로의 전환을 위한 팔미테이트)의 표적화를 가능하게 한다. 아실-CoA 델타-9 디새츄라제는 일반적으로는 어떠한 인지가능한 정도로도 식물 시스템 내에서 생산되지 않기 때문에 식물 내의 포화 지방산 함량을 저하시키기 위해 이들이 선택되었다.

B. 폴리펩티드

본 발명의 일부 실시양태에 따른 폴리펩티드는 서열 12, 서열 13, 서열 14, 서열 50, 서열 52, 서열 72 및 서열 73으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 정렬되었을 때 증가성 백분율 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 실시양태 및 기타 실시양태에서의 특정한 아미노산 서열들은 상기 언급된 서열들과의 동일성이, 예를 들어, 적어도 약 70％, 약 75％, 약 80％, 81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％, 또는 100％인 서열을 포함할 수 있다. 다수의 실시양태에서, 상기 언급된 서열들과 정렬되었을 때 상기 언급된 서열 동일성을 지니는 아미노산 서열은 효소성 델타-9-18:0-ACP 디새츄라제 활성이 있는 펩티드, 또는 이같은 펩티드의 일부분을 코딩한다.

C. 핵산

일부 실시양태는 상기 기술된 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서의 핵산 서열은 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 8, 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 15, 서열 16, 서열 17, 서열 44, 서열 45, 서열 48 및 서열 49로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 정렬되었을 때 증가성 백분율 동일성을 나타낸다. 이러한 실시양태 및 기타 실시양태에서의 특정한 핵산 서열들은 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 8, 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 15, 서열 16, 서열 17, 서열 44, 서열 45, 서열 48 및 서열 49로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과의 동일성이, 예를 들어, 적어도 약 60％, 약 65％, 약 70％, 약 75％, 약 80％, 81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％, 또는 100％인 서열을 포함할 수 있다. 당업자는, 예를 들어, 코돈 축퇴성에 따라 허용가능한 뉴클레오티드 치환을 도입하는 것에 의해, 코딩되는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 실질적으로 변화시키지 않으면서 핵산 분자가 변형될 수 있다는 것을 이해한다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 핵산 분자는 유전자 조절 요소 (예를 들어, 프로모터)를 포함한다. 프로모터는 벡터 구축물이 삽입될 세포 유형을 기초로 선택될 수 있다. 박테리아, 효모 및 식물에서 기능하는 프로모터가 당업계에 주지되어 있다. 프로모터는 이의 조절 특색을 기초로 또한 선택될 수 있다. 이같은 특색의 예로는 전사 활성의 강화, 유도성, 조직-특이성, 및 발달 단계-특이성이 포함된다. 식물에서, 유도성이고, 바이러스 또는 합성 기원이며, 구성적으로 활성이고, 시간적으로 조절되고, 공간적으로 조절되는 프로모터들이 기술되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Poszkowski et al. (1989) EMBO J. 3:2719]; [Odell et al. (1985) Nature 313:810]; 및 [Chau et al. (1989) Science 244:174-81)] 참조.

유용한 유도성 프로모터에는, 예를 들어, 독성완화제(safener) (치환형 벤젠술폰아미드 제초제)의 적용에 의해 유도되는 살리실산 또는 폴리아크릴산에 의해 유도되는 프로모터, 열-충격 프로모터, 시금치 니트레이트 리덕타제(reductase) 전사성 핵산 분자 서열로부터 유래된 니트레이트-유도성 프로모터, 호르몬-유도성 프로모터, 및 RuBP 카르복실라제(carboxylase)의 소형 서브유닛 및 LHCP 패밀리와 연관된 광-유도성 프로모터가 포함된다.

유용한, 조직-특이적이고 발달에 따라 조절되는 프로모터의 예로는 β-콘글리시닌 7Sα 프로모터 및 종자-특이적 프로모터가 포함된다. 종자 색소체에서의 우선적인 발현에 유용한 식물의 기능성 프로모터에는 오일 종자에서의 지방산 생합성에서 수반되는 단백질 및 식물 저장 단백질로부터의 것들이 포함된다. 이같은 프로모터의 예로는 파세올린, 나핀, 제인, 대두 트립신 억제제, ACP, 스테아로일-ACP 디새츄라제, 및 올레오신과 같은 전사성 핵산 분자 서열로부터의 5' 조절 영역이 포함된다. 또 다른 예시적인 조직-특이적 프로모터는 렉틴 프로모터이고, 이는 종자 조직에 대해 특이적이다.

기타 유용한 프로모터에는 노팔린 신타제, 만노핀 신타제, 및 옥토핀 신타제 프로모터 (아그로박테리움 투메파시엔스의 종양-유도 플라스미드 상에서 운반됨); 컬리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 19S 및 35S 프로모터; 강화된 CaMV 35S 프로모터; 피그워트(Figwort) 모자이크 바이러스 35S 프로모터; 리불로스-1,5-비포스페이트 카르복실라제의 소형 서브유닛 (ssRUBISCO)으로부터의 광-유도성 프로모터; 담배로부터의 EIF-4A 프로모터 (문헌 [Mandel et al. (1995) Plant Mol. Biol. 29:995-1004]); 옥수수 수크로스 신쎄타제(synthetase); 옥수수 알콜 데히드로게나제(dehydrogenase) I; 옥수수 광 수확 복합체; 옥수수 열 충격 단백질; 아라비돕시스로부터의 키티나제(chitinase) 프로모터; LTP (지질 전달 단백질) 프로모터; 피튜니아 칼콘 이소머라제(isomerase); 콩 글리신 풍부 단백질 1; 감자 파타틴; 유비퀴틴 프로모터; 및 액틴 프로모터가 포함된다. 유용한 프로모터는 바람직하게는 종자-선택적, 조직 선택적, 또는 유도성이다. 종자-특이적 조절이, 예를 들어, EP 0 255 378에 논의되어 있다.

이종성 유전자(들)의 더 높은 발현을 수득하기 위해, 발현 숙주 세포 (예를 들어, 식물 세포, 예를 들어, 캐놀라, 벼, 담배, 옥수수, 면, 및 대두)에서 더욱 효율적으로 발현되도록 유전자(들)을 재조작하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 식물 발현을 위한 델타-9 디새츄라제를 코딩하는 유전자의 디자인에서의 임의적인 추가적인 단계 (즉, 하나 이상의 유전자 조절 요소의 제공에 더해지는 단계)는 최적의 발현을 위한 이종성 유전자 단백질 코딩 영역의 재조작이다. 특정 실시양태는 트랜스제닉 캐놀라 식물 세포 또는 아라비돕시스 식물 세포에서의 발현 수준을 천연 발생 이종성 유전자 서열로 형질전환된 캐놀라 식물 세포 또는 아라비돕시스 식물 세포에서보다 증가시키도록 (즉, 더 많은 단백질을 생산하도록) 최적화된 재디자인된 유전자를 포함한다.

유전자 코드의 여분성/축퇴성 (즉, 일부 아미노산이 1개를 초과하는 코돈에 의해 특정됨)에 의해 부여되는 유연성으로 인해, 상이한 생물 또는 생물 클래스에서의 게놈 진화는 동의성 코돈들의 상이한 용법을 초래하였다. 이러한 "코돈 편향"은 단백질 코딩 영역의 평균 염기 조성에서 반영된다. 예를 들어, 게놈의 G+C 함량이 비교적 낮은 생물은 동의성 코돈의 세 번째 위치에 A 또는 T가 있는 코돈을 더 많이 이용하는 반면, G+C 함량이 더 높은 것은 세 번째 위치에 G 또는 C가 있는 코돈을 더 많이 이용한다. 추가로, mRNA 내의 "소수(minor)" 코돈의 존재는, 특히 소수 코돈에 상응하는 충전된(charged) tRNA의 상대적인 풍부도가 낮을 때, 이러한 mRNA의 절대적인 번역 속도를 감소시킬 수 있는 것으로 생각된다. 이러한 추론은 개별적인 소수 코돈에 의한 번역 속도의 감소가 다중 소수 코돈에 대해 적어도 부가적일 것이라고 확대된다. 따라서, 특정 발현 숙주 내의 소수 코돈들의 상대적인 함량이 높은 mRNA는 이에 상응하여 번역 속도가 낮을 것이다. 이러한 속도는 이에 상응하여 낮은 수준의 코딩되는 단백질에 의해 반영될 수 있다.

캐놀라 또는 아라비돕시스 (또는 기타 식물, 예컨대 벼, 담배, 옥수수, 면 또는 대두)에서의 발현을 위해 델타-9 디새츄라제를 코딩하는 최적화된 유전자를 조작하는 것에서, 예상 숙주 식물(들)의 코돈 편향이 결정되어 있다면 유용하다. 다수의 공개적으로 입수가능한 DNA 서열 데이터베이스가 존재하고, 여기에서 다양한 식물 유전자의 단백질 코딩 영역 또는 식물 게놈의 코돈 분포에 관한 정보를 확인할 수 있다

코돈 편향은 발현 숙주 (예를 들어, 식물 예컨대 캐놀라 또는 아라비돕시스)가 이의 단백질의 아미노산을 코딩하는데 사용하는 코돈의 통계학적 분포이다. 모든 아미노산에 대한 코돈들에 비교하여 단일 코돈이 사용되는 빈도로서 코돈 편향을 계산할 수 있다. 별법적으로, 특정 아미노산에 대한 모든 다른 코돈들 (동의성 코돈)에 비교하여 단일 코돈이 이러한 특정 아미노산을 코딩하기 위해 사용되는 빈도로서 코돈 편향을 계산할 수 있다.

델타-9 디새츄라제 유전자의 식물 발현을 위한 최적화된 코딩 영역을 디자인하는 것에서, 식물이 선호하는 제1 ("첫 번째 선택권") 코돈, 뿐만 아니라, 다중 선택권이 존재하는 경우 선호 코돈의 두 번째, 세 번째, 네 번째 등의 선택권이 결정되어야 한다. 그 후, 델타-9 디새츄라제 유전자의 아미노 서열을 코딩하는 새로운 DNA 서열을 디자인할 수 있고, 이때 새로운 DNA 서열은 아미노산 서열 내의 각각의 위치에서의 아미노산을 특정하기 위한, 발현 숙주가 선호하는 (첫 번째로 선호하는, 두 번째로 선호하는, 세 번째로 선호하는, 또는 네 번째로 선호하는 등) 코돈의 치환에 의해 천연 DNA 서열 (디새츄라제를 코딩함)과 상이하다. 그 후, 새로운 서열을 변형에 의해 생성되었을 수 있는 제한 효소 부위에 대해 분석한다. 확인된 추정 제한 부위를 이러한 코돈을 다음으로 선호되는 코돈으로 교체하여 제한 부위를 제거하는 것에 의해 추가로 변형한다. 이종성 서열의 전사 또는 번역에 영향을 미칠 수 있는 서열 내의 기타 부위는 엑손:인트론 접합부 (5' 또는 3'), 폴리-A 부가 신호, 및/또는 RNA 폴리머라제 종결 신호이다. TA 또는 CG 더블릿(doublet)의 빈도를 감소시키기 위해 서열을 추가로 분석하고 변형시킬 수 있다. 이러한 더블릿들에 더하여, 약 6개를 초과하는 동일한 G 또는 C 뉴클레오티드가 있는 서열 블록 또한 서열의 전사 또는 번역에 불리하게 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 첫 번째 또는 두 번째 선택권 등의 코돈을 다음으로 선호되는 선택권의 코돈으로 교체하는 것에 의해 이러한 블록을 유리하게 변형시킨다.

상기 기술된 방법은 유전자가 식물에서 최적으로 발현되도록 당업자가 특정 식물에 외래인 유전자(들)을 변형시킬 수 있게 한다. 이러한 방법은 PCT 출원 WO 97/13402에서 추가로 설명된다. 따라서, 일부 실시양태의 디새츄라제/유전자와 기능적으로 등가인 최적화된 합성 유전자를 식물이 포함되는 숙주를 형질전환시키는데 사용할 수 있다. 합성 유전자의 생산에 관한 추가적인 지침을, 예를 들어, 미국 특허 5,380,831에서 확인할 수 있다.

일단 식물-최적화 DNA 서열이 문서 상으로 또는 인-실리코(in silico)로 디자인되었으면, 디자인된 서열에 서열 면에서 정확하게 상응하도록 실제 DNA 분자를 실험실에서 합성할 수 있다. 이같은 합성 DNA 분자를, 이들이 자연 또는 천연 공급원으로부터 유래된 것처럼, 클로닝하고 다른 방식으로 조작할 수 있다.

D. 식물 물질의 유전적 형질전환 방법

일부 실시양태는 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 8, 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 15, 서열 16, 서열 17, 서열 44, 서열 45, 서열 48 및 서열 49로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 60％ 이상 동일한 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 핵산 분자(들)를 포함하는 형질전환된 세포를 생산하는 방법에 관한 것이다. 이같은 핵산 분자는, 예를 들어, 비-코딩 조절 요소, 예컨대 프로모터를 또한 포함할 수 있다. 기타 서열이 비-코딩 조절 요소 및 전사성 핵산 분자 서열과 함께 세포 내로 또한 도입될 수 있다. 이러한 기타 서열에는 3' 전사 종결인자, 3' 폴리-아데닐화 신호, 기타 비번역 서열, 통과 또는 표적화 서열, 선별성 마커, 인핸서, 및 작동유전자(operator)가 포함될 수 있다.

형질전환 방법은 적절한 숙주 세포를 선별하는 단계, 숙주 세포를 재조합 벡터로 형질전환시키는 단계 및 형질전환된 숙주 세포를 수득하는 단계를 일반적으로 포함한다. DNA를 세포 내로 도입하는 기술은 당업자에게 주지되어 있다. 이러한 방법은 일반적으로 5가지 카테고리로 분류될 수 있다: (1) 화학적 방법 (문헌 [Graham and Van der Eb (1973) Virology 54(2):536-9]; [Zatloukal et al. (1992) Ann. N.Y. Acad. Sci. 660:136-53]); (2) 물리적 방법 예컨대 미세주입 (문헌 [Capechi (1980) Cell 22(2):479-88]), 전기천공 (문헌 [Wong and Neumann (1982) Biochim. Biophys. Res. Commun. 107(2):584-7]; [Fromm et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82(17):5824-8]; 미국 특허 5,384,253), 및 입자 가속 (문헌 [Johnston and Tang (1994) Methods Cell Biol. 43(A):353-65]; [Fynan et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(24):11478-82]); (3) 바이러스 벡터 (문헌 [Clapp (1993) Clin. Perinatol. 20(1):155-68]; [Lu et al. (1993) J. Exp. Med. 178(6):2089-96]; [Eglitis and Anderson (1988) Biotechniques 6(7):608-14]); (4) 수용체-매개 메커니즘 (문헌 [Curiel et al. (1992) Hum. Gen. Ther. 3(2):147-54]; [Wagner et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89(13):6099-103]); 및 (5) 박테리아-매개 메커니즘, 예컨대 아그로박테리움을 사용하는 메커니즘. 별법적으로, 식물의 생식 기관에 직접적으로 주사하는 것에 의해 핵산을 화분 내로 직접적으로 도입할 수 있다. 문헌 [Zhou et al. (1983) Methods in Enzymology 101:433]; [Hess (1987) Intern. Rev. Cytol. 107:367]; [Luo et al. (1988) Plant Mol. Biol. Reporter 6:165]; [Pena et al. (1987) Nature 325:274]. 기타 형질전환 방법에는, 예를 들어,미국 특허 5,508,184에 설명된 바와 같은 원형질체 형질전환이 포함된다. 또한 핵산 분자를 미성숙 배아 내로 주사할 수 있다. 문헌 [Neuhaus et al. (1987) Theor. Appl. Genet. 75:30].

식물 세포의 형질전환을 위한 가장 통상적으로 사용되는 방법은 아그로박테리움-매개 DNA 전달 프로세스 (문헌 [Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803]) (미국 특허 5,824,877; 미국 특허 5,591,616; 미국 특허 5,981,840; 및 미국 특허 6,384,301에 설명된 바와 같음) 및 생체탄도(biolistics) 또는 미세발사 포격-매개 프로세스 (즉, 유전자 총) (예컨대 미국 특허 5,550,318; 미국 특허 5,538,880; 미국 특허 6,160,208; 미국 특허 6,399,861; 및 미국 특허 6,403,865에 기술됨)이다. 전형적으로, 핵 형질전환이 바람직하지만, 특히 색소체, 예컨대 엽록체 또는 녹말체(amyloplast)를 형질전환시키는 것이 바람직한 경우, 특정 식물 종, 예를 들어, 아라비돕시스, 담배, 감자, 및 브라시카(Brassica) 종에서 원하는 핵산 분자의 미세발사체-매개 전달을 이용하여 식물 색소체를 형질전환시킬 수 있다.

아그로박테리움-매개 형질전환은 아그로박테리움 속에 속하는 유전자 조작된 토양 박테리아의 사용을 통해 달성된다. 여러 아그로박테리움 종이 "T-DNA"로 공지된 특이적 DNA의 전달을 매개하고, 이를 임의의 원하는 DNA 조각을 다수의 식물 종으로 운반하도록 유전자 조작할 수 있다. T-DNA 매개 발병기전의 프로세스를 표시하는 주요 이벤트는 발병능 유전자의 유도, 및 T-DNA의 프로세싱 및 전달이다. 이러한 프로세스는 다수의 리뷰의 주제이다. 예를 들어, 문헌 [Ream (1989) Ann. Rev. Phytopathol. 27:583-618]; [Howard and Citovsky (1990) Bioassays 12:103-8]; [Kado (1991) Crit. Rev. Plant Sci. 10:1-32]; [Zambryski (1992) Annual Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 43:465-90]; [Gelvin (1993) Transgenic Plants, Kung and Wu eds., Academic Press, San Diego, CA, pp. 49-87]; [Binns and Howitz (1994) Bacterical Pathogenesis of Plants and Animals, Dang, ed., Berlin]: [Springer Verlag., pp. 119-38]; [Hooykaas and Beijersbergen (1994) Ann. Rev. Phytopathol. 32:157-79]; [Lessl and Lanka (1994) Cell 77:321-4]; 및 [Zupan and Zambryski (1995) Annual Rev. Phytopathol. 27:583-618] 참조.

형질전환 방법과 관계없이 형질전환된 식물 세포를 선별 또는 채점하기 위해, 세포 내로 도입된 DNA가 그렇지 않은 경우에는 독성인 화합물에 대한 저항성을 식물 조직에 부여하는 화합물을 생산하도록 재생가능한 식물 조직에서 기능하는 유전자를 함유할 수 있다. 선별가능하거나, 스크리닝가능하거나 채점가능한 마커로서 사용하기 위한 흥미로운 유전자는 β-글루쿠로니다제(glucuronidase) (GUS), 녹색 형광 단백질 (GFP), 루시퍼라제(luciferase), 및 항생제 또는 제초제 내성 유전자를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 항생제 저항성 유전자의 예로는 페니실린, 카나마이신 (및 네오마이신, G418, 블레오마이신); 메토트렉세이트 (및 트리메토프림); 클로람페니콜; 밑 테트라사이클린에 대한 저항성을 부여하는 유전자가 포함된다. 예를 들어, 글리포세이트 저항성이 제초제 저항성 유전자에 의해 부여될 수 있다. 문헌 [Della-Cioppa et al. (1987) Bio/Technology 5:579-84]. 포스피노트리신, 비알라포스에 대한 내성, 및 양성 선별 메커니즘 (문헌 [Joersbro et al. (1998) Mol. Breed. 4:111-7])이 예를 들어 비제한적으로 포함되는 기타 선별 장치가 또한 실행될 수 있고, 본 발명의 실시양태의 범주 내인 것으로 간주된다.

그 후, 선별 또는 스크리닝에 의해 확인되고, 재생을 지지하는 적합한 배지에서 배양된 형질전환된 세포를 식물로 성숙되게 할 수 있다.

본원에 개시된 방법들은 임의의 형질전환가능한 식물 세포 또는 조직에 사용될 수 있다. 형질전환가능한 세포 및 조직은, 본원에서 사용되는 경우에, 식물이 발생되도록 추가적인 증식이 가능한 세포 또는 조직을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 당업자는 다수의 식물 세포 또는 조직이 형질전환가능하고, 이때 외인성 DNA의 삽입 및 적합한 배양 조건 후에 식물 세포 또는 조직이 분화된 식물을 형성할 수 있다는 것을 인지한다. 이러한 목적에 적절한 조직은 미성숙 배아, 배반 조직, 현탁 세포 배양물, 미성숙 꽃차례(inflorescence), 출아물 분열조직(shoot meristem), 마디 외식편, 캘러스(callus) 조직, 배축 조직, 떡잎, 뿌리, 및 잎을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다.

형질전환된 식물 원형질체 또는 외식편으로부터의 식물의 재생, 발달, 및 배양은 당업계에 공지되어 있다. 문헌 [Weissbach and Weissbach (1988) Methods for Plant Molecular Biology, (Eds.) Academic Press, Inc., San Diego, CA]; [Horsch et al. (1985) Science 227:1229-31]. 전형적으로 이러한 재생 및 성장 프로세스는 형질전환된 세포를 선별하는 단계 및 이러한 세포를 일반적인 배아 발달기들을 통해 뿌리가 있는 묘목 기로 배양하는 단계를 포함한다. 트랜스제닉 배아 및 종자가 유사하게 재생된다. 이러한 방법에서, 일반적으로 형질전환체는 성공적으로 형질전환된 세포를 선별하고 식물 출아물(shoot)의 재생을 유도하는 선별 배지의 존재 하에 배양된다. 문헌 [Fraley et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803]. 전형적으로 이러한 출아물은 2 내지 4개월 이내에 수득된다. 그 후, 생성된 뿌리내린 트랜스제닉 출아물을 적합한 식물 성장 배지 예컨대 토양 내에 심는다. 선별제에의 노출에서 생존한 세포, 또는 스크리닝 검정법에서 양성으로 채점된 세포를 식물의 재생을 지지하는 배지에서 배양할 수 있다. 그 후, 출아물을 이러한 선별제 및 박테리아 성장을 방지하는 항생제를 함유하는 적합한 뿌리-유도 배지로 옮길 수 있다. 다수의 출아물에서 뿌리가 발달될 것이다. 그 후, 이를 토양 또는 기타 배지로 이식하여, 뿌리가 계속 발달되게 한다. 상기 개요된 바와 같이, 일반적으로 이러한 방법은 사용된 특정한 식물 계통에 따라 변할 것이고, 따라서 방법의 상세사항은 당업자의 재량 내에 속한다.

재생된 트랜스제닉 식물을 자가 수분시켜 동종접합성 트랜스제닉 식물을 제공할 수 있다. 별법적으로, 재생된 트랜스제닉 식물로부터 수득된 화분을 비-트랜스제닉 식물, 바람직하게는 동계(inbred line)의 농업적으로 중요한 종과 교배시킬 수 있다. 반대로, 비-트랜스제닉 식물로부터의 화분을 재생된 트랜스제닉 식물을 수분시키는데 사용할 수 있다.

트랜스제닉 식물은 형질전환된 핵산 서열을 따라 이의 자손으로 넘어갈 수 있다. 트랜스제닉 식물은 바람직하게는 형질전환된 핵산 서열에 대해 동종접합성이고, 유성 생식 시, 그리고 유성 생식의 결과로서 이러한 서열을 자신의 후손 모두에게 전파한다. 트랜스제닉 식물에 의해 생산된 종자로부터 자손이 성장될 수 있다. 그 후, 이러한 추가적인 식물을 자가 수분시켜 순수 육종 계통의 식물을 생성시킬 수 있다.

이러한 식물로부터의 자손을, 특히, 유전자 발현에 대해 평가할 수 있다. 여러 통상적인 방법 예컨대 웨스턴(western) 블롯팅(blotting), 노던(northern) 블롯팅, 면역침전, 및 ELISA (효소-결합 면역흡착 검정법)에 의해 유전자 발현을 검출할 수 있다. 형질전환된 식물을 도입된 DNA의 존재 및 발현 수준, 및/또는 본 발명의 핵산 분자 및 아미노산 분자에 의해 부여되는 지방산 프로파일에 대해 또한 분석할 수 있다. 당업자는 형질전환된 식물의 분석에 이용가능한 수많은 방법을 인지한다. 예를 들어, 식물 분석 방법은 서던(Southern) 블롯 또는 노던 블롯, PCR-기재 접근법, 생화학적 검정법, 표현형 스크리닝 방법, 현장 평가, 및 면역진단 검정법을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.

쌍자엽식물을 특이적으로 형질전환시키는 방법이 당업자에게 주지되어 있다. 이러한 방법을 사용하는 형질전환 및 식물 재생이 아라비돕시스 속의 구성원, 면 (고시피움 히르수툼(Gossypium hirsutum)), 대두 (글리신 맥스(Glycine max)), 땅콩 (아라키스 히포가에아(Arachis hypogaea)), 및 브라시카 속의 구성원을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다수의 작물에 대해 기술되어 있다. 쌍자엽식물을, 주로 아그로박테리움 투메파시엔스를 사용하여, 형질전환시키고 트랜스제닉 식물을 수득하는 방법이 면 (미국 특허 5,004,863; 미국 특허 5,159,135; 미국 특허 5,518,908); 대두 (미국 특허 5,569,834; 미국 특허 5,416,011; 문헌 [McCabe et al. (1988) Biotechnology 6:923]; [Christou et al. (1988) Plant Physiol. 87:671-4]); 브라시카 (미국 특허 5,463,174); 땅콩 (문헌 [Cheng et al. (1996) Plant Cell Rep. 15:653-7]; [McKently et al. (1995) Plant Cell Rep. 14:699-703]); 파파야; 및 완두콩 (문헌 [Grant et al. (1995) Plant Cell Rep. 15:254-8])에 대해 공개되어 있다.

단자엽식물을 형질전환시키는 방법 또한 당업계에 주지되어 있다. 이러한 방법을 사용하는 형질전환 및 식물 재생이 보리 (호르데움 불가라에(Hordeum vulgarae)); 옥수수 (지아 메이스(Zea mays)); 귀리 (아베나 사티바(Avena sativa)); 오리새 (닥틸리스 글로메라타(Dactylis glomerata)); 벼 (오리자 사티바(Oryza sativa) (인디카(indica) 및 자포니카(japonica) 품종 포함)); 수수 (소르굼 바이칼라(Sorghum bicolor)); 사탕수수 (사카룸(Saccharum) 종); 톨 페스큐(tall fescue) (페스투카 아룬디나세아(Festuca arundinacea)); 잔디 종 (예를 들어, 아그로스티스 스톨로니페라(Agrostis stolonifera), 포아 프라텐시스(Poa pratensis), 스테노타프룸 세쿤다툼(Stenotaphrum secundatum)); 밀 (트리티쿰 아세스티붐(Triticum aestivum)); 및 알팔파 (메디카고 사티바(Medicago sativa))를 포함하지만 이에 한정되지 않는 다수의 작물에 대해 기술되어 있다. 관심 대상인 많은 표적 작물에 대한 안정적인 트랜스제닉 식물의 생산을 위해 다수의 형질전환 방법을 사용할 수 있고 이를 변형할 수 있다는 것이 당업자에게 명백하다.

본원에 개시된 방법에서 사용하기 위해 임의의 식물을 선택할 수 있다. 본 발명에 따른 변형을 위한 바람직한 식물에는, 예를 들어 그리고 비제한적으로, 오일종자 식물인 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana), 보리지(borage) (보라고(Borago) 종), 캐놀라 (브라시카 종), 캐스터(castor) (리시누스 코무니스(Ricinus communis)), 카카오콩 (테오브로마 카카오(Theobroma cacao)), 옥수수 (지아 메이스), 면 (고시피움(Gossypium) 종), 크람베(Crambe) 종, 쿠페아(Cuphea) 종, 아마 (리눔(Linum) 종), 레스퀘렐라(Lesquerella) 및 림난테스(Limnanthes) 종, 리놀라(Linola), 한련 (트로파에올룸(Tropaeolum) 종), 오에노테라(Oenothera) 종, 올리브 (올레아(Olea) 종), 야자 (엘라에이스(Elaeis) 종), 땅콩 (아라키스(Arachis) 종), 평지씨, 잇꽃 (카르타무스(Carthamus) 종), 대두 (글리신(Glycine) 및 소자(Soja) 종), 해바라기 (헬리안투스(Helianthus) 종), 담배 (니코티아나(Nicotiana) 종), 베르노니아(Vernonia) 종, 밀 (트리티쿰(Triticum) 종), 보리 (호르데움(Hordeum) 종), 벼 (오리자(Oryza) 종), 귀리 (아베나(Avena) 종), 수수 (소르굼(Sorghum) 종), 및 호밀 (세칼레(Secale) 종) 또는 벼과(Gramineae)의 기타 구성원이 포함된다.

관심 대상인 많은 표적 작물로부터의 안정적인 트랜스제닉 식물의 생산을 위해 다수의 형질전환 방법을 사용할 수 있고 이를 변형할 수 있다는 것이 당업자에게 명백하다.

E. 트랜스제닉 종자

일부 실시양태에서, 트랜스제닉 종자는 서열 12, 서열 13, 서열 14, 서열 50, 서열 51, 서열 52, 서열 72 및 서열 73으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 80％ 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 델타-9 디새츄라제 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 이러한 실시양태 및 기타 실시양태에서, 트랜스제닉 종자는 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 8, 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 15, 서열 16, 서열 17, 서열 44, 서열 45, 서열 48 및 서열 49로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 60％ 이상 동일한 핵산 서열을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 트랜스제닉 종자는 감소된 수준의 포화 지방산 (예를 들어, 팔미트 지방산 및/또는 스테아르 지방산)을 나타낼 수 있다. 이러한 종자는 임성(fertile) 트랜스제닉로부터 수확될 수 있고, 하나 이상의 상기 기재된 바와 같은 핵산 서열, 및 임의적인 하나 이상의 추가적인 관심 유전자 또는 핵산 구축물을 포함하는 잡종 식물 계통이 포함되는, 형질전환된 식물의 자손 세대를 성장시키는데 사용될 수 있다.

하기의 실시예는 다소 특정한 특색 및/또는 실시양태를 설명하기 위해 제공된다. 이러한 실시예는 기술된 특정한 특색 또는 실시양태에 본 발명을 한정하는 것으로 해석되지 않아야 한다.

실시예

실시예 I: 아실- CoA 델타-9 디새츄라제의 클로닝 및 ole1 -결핍 효모에서의 기능적 특성화

마그나포르테 그리세아 아실- CoA 델타-9 디새츄라제의 클로닝

마그나포르테 그리세아 아실-CoA 델타-9 디새츄라제 유전자 (MgD9DS)를 처음에는 "가설 단백질"로 주해되었고 에스. 세레비시아에(S. cerevisiae) 아실-CoA 델타-9 디새츄라제 (즉, OLE1)에 대한 뉴클레오티드 수준에서의 동일성이 55.4％인 공개된 NCBI/브로드 인스티튜트(Broad Institute) 서열을 기초로 하는 프라이머를 사용하여 게놈 DNA로부터 단리하였다. 각각 염기쌍 41개 길이의 전방향 및 역방향 프라이머를 디자인하였다. 전방향 프라이머인 MgΔ9F (서열 1)는 5' 끝부분에 EcoRI 부위를 포함하였다. 역방향 프라이머인 Mg9ΔR (서열 2)는 3개의 리딩 프레임 각각 내의 정지 코돈 및 말단 XhoI 부위를 함유하였다.

MgD9DS 유전자를 다카라 이지 택(Takara EZ Taq)™ PCR 키트 (다카라 바이오 인크(Takara Bio Inc.), 일본 시가 오츠)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 PCR 증폭시켰다. 증폭 조건은 1분 동안 94℃, 이어서 30초 동안 94℃, 60초 동안 60℃ 및 90초 동안 72℃에서의 확장의 사이클 30회였다. 72℃에서 10분 동안 최종 확장 단계를 수행하였다. 예상되는 염기쌍 1,425개의 PCR 생성물을 아가로스 겔로부터 절제하고, 몽타주(Montage) 스핀 칼럼을 사용하여 제조사의 권고사항 (밀리포어(Millipore), 매사추세츠주 빌레리카)에 따라 정제하였다. 정제된 단편을 pCR®2.1 TOPO® 클로닝 벡터 (인비트로젠(Invitrogen), 캘리포니아주 칼스배드) 내로 클로닝하였다. TOPO 반응물을 화학적으로 수용성인 탑(Top) 10 이. 콜라이(E. coli) 세포 내로 공급사의 조건에 따라 형질전환시켰다. 추정 클론을 함유하는 박테리아 콜로니를 단리하였다. 미니-플라스미드 프렙(prep)을 마헤라이-나겔(Macherey-Nagel)의 뉴클레오스핀(Nucleospin) DNA 단리 키트 (마헤라이-나겔, 독일 뒤렌 노이만-니안더-스트라쎄)로 수행하였고, DNA를 EcoRI 및 XhoI 제한 효소로 소화시켰다. 예상되는 1,425 bp MgD9DS 유전자 단편을 함유하는 양성 클론을 확인하였다. 뉴클레오티드 서열을 서열분석 반응을 통해 수득하였다. PCR 증폭 단편의 서열이 서열 3으로 열거된다.

서열 분석에서, MgD9DS 유전자의 5' 끝부분에 위치하는 소형 (90 bp) 인트론이 드러났다. 이러한 인트론을 스플라이스 오버랩 익스텐션(Splice Overlap Extension) PCR을 사용하여 제거하였다. 생성된 PCR 앰플리콘(amplicon)을 겔 정제하고, pCR®2.1 TOPO® 클로닝 벡터 내로 클로닝하고, 탑 10 이. 콜라이 세포 내로 형질전환시켰다. 단일 형질전환체 콜로니로부터의 정제된 DNA의 제한효소 소화물의 분석을 통해 여러 클론을 확인하였다. 이러한 클론들을 서열분석하여, 인트론이 없는 MgD9DS 클론의 존재를 확증하였다. 생성된 서열이 서열 4로 열거된다.

인트론이 있는 MgD9DS 유전자 또는 인트론이 없는 MgD9DS 유전자를 EcoRI/XhoI 단편으로서 효모 발현 벡터 내로 각각 서브클로닝하였다. 이러한 효모 발현 벡터는 에스. 세레비시아에 델타-9 디새츄라제 프로모터 및 델타-9 디새츄라제 3'UTR/종결인자가 플랭킹(flanking)된 아스페르길루스 니둘란스 델타-9 디새츄라제 (AnD9DS) 유전자를 함유한다. 아스페르길루스 니둘란스 델타-9 디새츄라제 유전자를 EcoRI / XhoI 단편 상에서 절제하고, 이를 MgD9DS 유전자-함유 단편 또는 인트론이 없는 MgD9DS 유전자-함유 단편으로 교체하였다. MgD9DS 유전자를 함유하는 2개의 클론 (인트론이 있는 것 1개 및 인트론이 없는 것 1개)을 에스. 세레비시아에 형질전환을 위해 진행시켰다.

효모 펩톤 덱스트로스 (YPD) 배지 + 트윈(Tween)® 80 상에서 유지되는 델타-9 디새츄라제 결핍 에스. 세레비시아에 균주 (OFY093)를 알칼리-양이온 효모 형질전환 키트(Alkali-Cation Yeast Transformation Kit) (큐바이오진(Qbiogene), 캐나다 몬트리올)를 사용하여 형질전환시켰다. 보완된 균주를 트윈® 80 (단일불포화 지방산 보충물)을 함유하지 않는 배지 또는 우라실을 함유하지 않는 배지 (드랍아웃 베이스(Dropout Base) + 한천 + SC-URA) 상에서의 성장에 의해 확인하였다. 보완된 균주는 선별 배지 상에서 3회 정제된 단일 콜로니였다. 보완된 균주를 델타-9 디새츄라제 유전자의 PCR 증폭 및 PCR 생성물의 서열분석에 의해 추가로 확인하였다. 또한, 균주를 3회 이상 YPD + 트윈 80® 배지 상에서 계대시킨 후 균주를 DOBA SC-URA 마이너스 트윈® 80 배지로 패치(patch)하는 것에 의해 MgD9DS 클론을 함유하는 균주가 지방산 및 우라실 의존성으로 복귀되었다.

인트론-함유 MgD9DS 코딩 서열의 발현은 실패하였고, 이는 인트론이 효모 기구에 의해 스플라이싱되지 않았음을 가리킨다. 인트론이 없는 MgD9DS 코딩 서열을 함유하는 효모 균주의 기질 특이성을 FAME 분석에 의해 추가로 특성화하였다.

렙토스파에리아 노도룸 아실- CoA 델타-9 디새츄라제의 클로닝

2개의 렙토스파에리아 노도룸 EST 서열 (각각 1,246개 및 429개의 염기쌍)이 에스. 세레비시아에 아실-CoA 델타-9 디새츄라제 (OLE1)와 높은 수준의 서열 동일성 (각각 54.0％ 및 54.2％)을 공유하는 것으로 BlastN 검색을 사용하는 것에 의해 엘. 노도룸 EST의 선집으로부터 확인되었다. 정렬되었을 때, 이러한 서열들은 서로 64.6％ 동일하였고, 이는 2개의 별개의 렙토스파에리아 노도룸 아실-CoA 델타-9 디새츄라제의 존재를 시사한다. 엘. 노도룸 cDNA 라이브러리를 1,246 bp 유전자 프로브로 스크리닝함으로써 LnD9DS-1 유전자 (서열 5)를 단리하였다. 이러한 유전자의 서열을 수득하였고, 코딩 서열을 단리하였다. 공개된 브로드 인스티튜트 렙토스파에리아 노도룸 게놈 서열을 429 bp EST 서열로 1차로 BLAST 검색함으로써 LnD9DS-2 유전자의 전체 서열을 단리하였다. 이러한 검색으로 429 bp 단편에 대한 상동성이 100％인 유전자를 함유하는 것으로 수퍼콘티그(Supercontig) Ln 1.4가 확인되었고, 이러한 유전자는 "가설 단백질"을 코딩하는 것으로 주해되었다. 다음으로, LnD9DS-2 유전자를 Ln1.4 수퍼콘티그 서열을 기초로 하는 PCR 프라이머를 사용하여 렙토스파에리아 노도룸 cDNA 라이브러리로부터 클로닝하였다. 사용된 프라이머 서열은 Lnd9FAD2F (서열 6) 및 Lnd9FAD2R (서열 7)이었다. 전방향 프라이머는 5' BamHI 부위가 있게 디자인되었고, 역방향 프라이머는 3개의 리딩 프레임 내의 정지 코돈 및 말단 NcoI 부위를 함유하였다.

분취량의 렙토스파에리아 노도룸 cDNA 라이브러리를 1/10 희석하여 PCR 반응을 위한 400 ng의 주형 DNA를 제공하였다. 다카라 이지 택™ PCR 키트를 사용하여 1분 동안 94℃에 30초 동안 94℃, 60초 동안 60℃ 및 90초 동안 72℃에서의 확장의 사이클 30회가 이어지는 권장 증폭 조건에 따라 PCR 증폭을 수행하였다. 72℃에서 10분 동안 최종 확장 단계를 수행하였다. 예상되는 염기쌍 1,370개의 생성물을 아가로스 겔로부터 절제하고, 몽타주 스핀 칼럼을 사용하여 제조사의 권고사항에 따라 정제하였다. 정제된 단편을 pCR®2.1 TOPO® 클로닝 벡터 내로 클로닝하였다. 결찰 반응물을 화학적으로 수용성인 탑 10 이. 콜라이 세포 내로 제조사의 권장 프로토콜에 따라 형질전환시켰다. 추정 클론을 함유하는 콜로니를 단리하였다. 미니-플라스미드 프렙을 마헤라이-나겔의 뉴클레오스핀 칼럼으로 수행하였고, DNA를 BamHI 및 NcoI 제한 효소로 소화시켰다. 추정 LnD9DS-2 클론을 확인하고, 서열분석하였다.

서열분석 시, "가설 단백질" 서열과의 비교에 의해 LnD9DS-2 (서열 8)의 클론이 확증되었다. LnD9DS-2의 서열에서의 보존적 변화가 확인되었다. 염기 위치 271에서 티미딘을 아데닌이 치환하는 것에 의해 코돈 TGC (시스테인)가 AGC (세린)으로 변화되었고, 이러한 코돈은 공개된 서열의 아미노산 89로 번역된다. 이는 보존적 변화이고, 시스테인은 여러 필라멘트형 진균에서 고도로 보존되는 아미노산인 것으로 발견되지 않아서, 수정이 시도되지 않았다.

각각 서열 5 및 8의 LnD9DS-1 및 LnD9DS-2 유전자를 효모 발현 벡터 내로 클로닝하였다. LnD9DS-1 및 LnD9DS-2 코딩 서열 중 하나를 함유하는 클론을 제한 효소 분석 및 DNA 서열분석에 의해 확증하였다.

YPD 배지 + 트윈® 80에서 유지되는 델타-9 디새츄라제 결핍 에스. 세레비시아에 균주 (OFY093)를 큐바이오진으로부터의 알칼리-양이온 효모 형질전환 키트를 사용하여 형질전환시켰다. 보완된 균주를 트윈® 80 (단일불포화 지방산 보충물)을 함유하지 않는 배지 또는 우라실을 함유하지 않는 배지 (DOBA sc-ura) 상에서의 성장에 의해 확인하였다. 보완된 균주는 선별 배지 상에서 3회 정제된 단일 콜로니였다. 보완된 균주를 델타-9 디새츄라제 유전자의 PCR 증폭 및 PCR 생성물의 서열분석에 의해 추가로 확인하였다. 또한, 각각의 균주를 3회 이상 YPD + 트윈 80® 배지 상에서 계대시킨 후 균주를 DOBA SC-URA 마이너스 트윈® 80 배지로 패치하는 것에 의해 LnD9DS-2 클론을 함유하는 균주가 지방산 및 우라실 의존성으로 복귀되었다. LnD9DS-1 또는 LnD9DS-2 코딩 서열 중 하나를 함유하는 효모 균주의 기질 특이성을 FAME 분석에 의해 추가로 특성화하였다.

HzD9DS 유전자로의 델타-9 디새츄라제 결핍 에스 . 세레비시아에의 클로닝 및 형질전환

헬리코베르파 지아 아실-CoA 델타-9 디새츄라제 (HzD9DS)를 코딩하는 식물-최적화 합성 유전자 (문헌 [Rosenfield et al. (2001) Insect Biochem. Mol. Biol. 31(10):949-64]에서 HzPGDS2로 확인됨)를 DASPICO89 (하기 기술됨)로부터 BamHI/XhoI 단편 상에 절제하고, 몽타주 스핀 칼럼을 사용하여 겔 정제하였다. 이러한 단편을 상응하는 앞서 기술된 효모 발현 벡터의 제한 효소 부위 내로 결찰시키고, 이. 콜라이 균주 DH5α 내로 표준 분자 생물학 기술 및 공급자 프로토콜 (인비트로젠, 캘리포니아주 칼스배드)을 사용하여 형질전환시켰다.

제한 분석 및 DNA 서열분석 후, HzD9DS 유전자를 함유하는 클론을 델타-9 디새츄라제 결핍 에스. 세레비시아에 균주인 OFY093 내로의 형질전환을 위해 선별하였다. YPD 배지 + 트윈® 80에서 유지되는 OFY093 균주를 큐바이오진으로부터의 알칼리-양이온 효모 형질전환 키트를 사용하여 형질전환시켰다. 보완된 균주를 트윈® 80 (단일불포화 지방산 보충물)을 함유하지 않는 배지 또는 우라실을 함유하지 않는 배지 (DOBA SC-URA) 상에서의 성장에 의해 확인하였다. 추정되는 보완된 균주는 선별 배지 상에서 3회 정제된 단일 콜로니였다. 보완된 균주를 i) 큐바이오젠의 효모 플라스미드 정제 키트를 사용하여 플라스미드 DNA를 추출한 후, HzD9DS 유전자-특이적 프라이머를 사용하여 PCR 증폭시키고; ii) HzD9DS 유전자-특이적 PCR 생성물을 서열분석하고; iii) 균주를 3회 이상 YPD + 트윈 80® 배지 상에서 계대시킨 후 균주를 DOBA SC-URA 마이너스 트윈® 80 배지로 패치하는 것에 의해 균주를 지방산 및 URA-3 의존성으로 복귀시킴으로써 추가로 확인하였다. 1개의 확인된 보완된 HzD9DS 효모 균주의 기질 특이성을 FAME 분석에 의해 추가로 특성화하였다.

OLE1 -결핍 효모 균주에서 발현된 LnD9DS -1, LnD9DS -2, MgD9DS , 및 HzD9DS 의 분석

상기 기재된 바와 같이, 3개의 예시적인 아실-CoA 델타-9 디새츄라제 (D9DS) 유전자를 식물 병원체성 진균인 마그나포르테 그리세아 (MgD9DS) 및 렙토스파에리아 노도룸 (LnD9DS-1 및 LnD9DS-2)으로부터 클로닝하였다. 이러한 유전자들 및 이들의 코딩 단백질은 이전에 특성화되어 있지 않았다. 아실-CoA 델타-9 디새츄라제는 조효소 A의 포화 14-, 16-, 및 18-탄소 지방 아실 티오에스테르의 9번과 10번 탄소 원자 사이의 시스 이중 결합의 형성을 촉매하여, 각각 미리스톨레산 (14:1), 팔리톨레산 (16:1), 또는 올레산 (18:1)의 생산을 초래한다. 생물-특이적 생물학에 관련된 효과는 이러한 상이한 아실-CoA 델타-9 디새츄라제 유전자들을 동일한 생물학적 정황에서 발현시킴으로써 제거된다. 그러므로, 진균 아실-CoA 델타-9 디새츄라제 유전자의 발현이 팔미토일-스테아로일 CoA 디새츄라제 (OLE1)-결핍 OFY093 효모 균주 내에서 내인성 ole1 유전자 프로모터를 사용하여 구동되었다. 따라서, 이러한 시스템에서의 지방산 기질 특이성에서의 관찰된 차이는 보완된 에스. 세레비시아에 균주에서 발현된 특이적인 진균 델타-9 디새츄라제에 기인한다.

보완된 OYF093 균주에서 발현된 MgD9DS, LnD9DS-1 및 LnD9DS-2 CoA 디새츄라제의 기질 특이성을 특성화하고, WO/1999/050430에 기술된 AnD9DS (sdeA)가 보완된 OFY093과 비교하였다. ole1 유전자 프로모터에 의해 유전자의 발현이 구동되는 AnD9DS 유전자를 함유하는 효모 발현 구축물을 상기 기술된 프로토콜을 사용하여 에스. 세레비시아에 OFY093 균주 내로 형질전환시키고 발현시켰다.

보완된 에스. 세레비시아에 균주를 지방산이 보충되지 않은 최소 배지에서 30℃에서 24시간 동안 성장시켰다. 세정 및 동결건조된 세포 펠릿에서 정량적 FAME 분석을 수행하였다. 이러한 분석의 결과가 표 1에서 제시된다. 효모 지방산 조성 분석에서 C16:1/18:1 지방산의 비에 의해 지시되는 바와 같이, LnD9DS-2는 C14:1 및 C16:1의 형성을 촉진하는 한편, LnD9DS-1 및 MgD9DS는 C18:0을 선호한다.

신규 디새츄라제를 동일한 재조합 발현 환경 내로 전달된 천연 에스. 세레비시아에 스테아로일-CoA 델타-9 디새츄라제 (ole1)에 추가로 비교하였다. WO/2000/011012에 기술된 에스. 세레비시아에로부터의 뉴클레오티드 서열을 함유하는 효모 발현 벡터를 구축하였다. 천연 에스. 세레비시아에 스테아로일-CoA 델타-9 디새츄라제를 함유하는 효모 발현 구축물을 상기 기술된 프로토콜을 사용하여 에스. 세레비시아에 OFY093 균주 내로 형질전환시키고 발현시켰다. 곤충 종인 헬리코베르파 지아로부터의 또 다른 비-진균 아실-CoA 델타-9 디새츄라제 (HzD9DS)를 이러한 실험에서 또한 평가하였다.

MgD9DS, LnD9DS-2 및 HzD9DS 유전자 중 하나를 함유하는 보완된 에스. 세레비시아에 균주를 드랍 아웃 브로쓰(Drop Out Broth) SC-URA에서 성장시켰다. 대조군 균주인 pDAB467EV-1 (앞서 기술된 효모 형질전환 방법에 의해 pDAB467B/N가 OFY093 내로 형질전환됨)는 DOB SC-URA + 트윈® 80에서 성장시켰고, 어버이 델타-9 디새츄라제-결핍 에스. 세레비시아에 균주인 OFY093는 DOB scAA + 트윈® 80에서 성장시켰다. 1.5％ 한천을 함유하는 동일한 배지의 신선한 스트리크(streak) 플레이트로부터의 세포를 루프로 배양물에 접종하였다. 균주를 24시간 동안 30℃에서 성장시켰다. 배양물을 6,000 rpm에서 10분 동안 회전시켰다. 펠릿을 물에서 세정하고, 다시 6,000 rpm에서 10분 동안 회전시킨 후, FAME 분석을 수행할 때까지 -20℃에서 동결시켰다. 3개의 발현 배양물 세트를 분석하였다.

동결 건조된 효모 펠릿을 10％ (w/v) NaOH를 함유하는 메탄올에서 비누화시켰다. 비누화될 수 없는 지질 오염물 (스테롤)을 헥산으로 제거하였다. 메탄올 분획을 H₂SO₄를 첨가하여 산성화시키고, 양성자화 지방산을 헥산으로 추출하였다. 단리된 헥산 분획을 건조 침강시키고, 지방산을 0.5 N MeOHCl로 80℃에서 30분 동안 메틸화시켰다. 생성된 FAME를 내부 표준으로서의 운데카노에이트 메틸 에스테르를 함유하는 헥산으로 추출하였다. FAME 추출물을 SGE (텍사스주 오스틴)로부터의 모세관 칼럼 BPX 70 (15 m × 0.25 ㎜ × 0.25 ㎛)이 장착된 HP6890 기체 크로마토그래프-불꽃 이온화 검출기 (캘리포니아주 산타클라라)로 분석하였다. 헬륨을 캐리어 기체로 사용하여 온도 구배에서 FAME을 분리하였다. 각각의 FAME 종을 체류 시간에 의해 확인하였고, 보정 표준물로서의 매트레야 엘엘씨(Matreya, LLC) (펜실베이니아주 플레즌트 갭)로부터의 FAME 평지씨 오일 기준물 믹스(mix)의 주입에 의해 정량하였다.

표 2는 다양한 예시적인 아실 Co-A 델타-9 디새츄라제를 발현하는 ole1-결핍 OFY093 효모 세포의 지방산 조성 (％ FAME로서의 조성)을 나타낸다. 모든 균주는 잘 성장하였고, 외인성 MUFA (단일불포화 지방산)에 대한 어떠한 요구도 없이 도입된 디새츄라제에 의해 충분히 보완되었다.

이러한 데이터는 보완된 효모 균주의 지방산 조성이 도입된 유전자에 따라 달랐음을 나타낸다. LnD9DS-2는 HzD9DS 및 ole1이 그러한 바와 같이 C16:1을 비교적 높은 양으로 생산하는 반면, AnD9DS 및 MgD9DS는 C18:1을 비교적 높은 양으로 생산한다.

사슬 길이를 기초로 하는 차별적인 전환 수준이 C14, C16 또는 C18의 각각의 지방산 사슬 길이에 대해 총 지방산에 비교된 MUFA의 비율을 계산함으로써 추가로 제시될 수 있다. 이러한 데이터는 LnD9DS-2 및 HzD9DS에 대해서는 C16:1, AnD9DS 및 MgD9DS에 대해서는 C18:1로의 비교적 높은 전환을 나타낸다. 표 3. 아래쪽의 4줄은 테르기톨, 불포화 지방산 또는 트윈®이 첨가되어 보완된 대조군 샘플을 나타낸다. JMP 통계 소프트웨어 스위트 (에스에이에스 인스티튜트 인크(SAS Institute Inc.), 노스캐놀라이나주 캐리)에서 수행된 튜키-크래머(Tukey-Kramer) 테스트를 통해 결정된 바와 같이, 문자가 상이한 샘플은 유의하게 상이하다.

진균 아실- CoA 디새츄라제의 계통발생학

여러 진균 아실-CoA 델타-9 디새츄라제 아미노산 서열의 계통발생학적 분석은 LnD9DS-2가 18:0-선호 델타-9 디새츄라제와 별개임을 시사한다. 따라서, 본 발명가들은 18:0-선호 델타-9 디새츄라제, 또는 LnD9DS-2와 밀접하게 연관된 다른 진균 델타-9 디새츄라제의 특성화로 다양한 18:0 또는 16:0 활성이 있는 디새츄라제들이 확인될 수 있을 것으로 가정하였다. 본 발명가들의 가정은 LnD9DS-2와 더욱 밀접하게 연관된 진균 델타-9 디새츄라제는 16:0 활성이 증가되어 있을 것으로 예측한다.

공공 DNA 서열 데이터베이스 (브로드 인스티튜트, NCBI 등)의 검색에서, 마그나포르테 그리세아 또는 렙토스파에리아 노도룸에서 델타-9 디새츄라제로 명확하게 주해된 어떠한 유전자 서열도 확인되지 않았다. 본 개시내용에서 확인된 브로드 인스티튜트 서열들의 Pfam 분석은 이러한 단백질들이 다른 진균 아실-CoA 델타-9 디새츄라제에서 또한 발견되는 사이토크롬 B5 및 디새츄라제 모티프를 함유한다는 것을 가리킨다. 그러나, 이러한 단백질들은 이전에 아실-CoA 델타-9 디새츄라제로 확인되지 않았다. 본 발명가들은 효모에서의 보완, 역전 연구, 및 DNA 서열 분석에 의해 이러한 단백질들의 이러한 기능을 실연하였다.

여러 진균 디새츄라제 유전자 서열들의 관계를 MEGA 소프트웨어 패키지에 의해 이웃-연결 방법을 사용하여 계통발생학적으로 분석하였다. 문헌 [Tamura et al. (2007) Mol. Biol. and Evolution 24:1596-9]. 도 1은 진균 디새츄라제 서열들의 이러한 계통발생학적 분석을 도해한다. 이러한 서열들은 AnD9DS (sdeA) 아미노산 서열을 사용하여 NCBI 서열 데이터베이스의 BlastN 검색에 의해 회수되었다. LnD9DS-2에 비교했을 때, LnD9DS-1 및 MgD9DS는 더 높은 수준의 서열 동일성을 서로 공유한다. 추가적으로, LnD9DS-1, LnD9DS-2, 및 MgD9DS의 ClustalW 정렬은 LnD9DS-1 및 MgD9DS로부터의 LnD9DS-2의 일탈을 나타낸다. 도 2. LnD9DS-1 및 MgD9DS의 뉴클레오티드 서열은 더 높은 개수의 염기쌍을 공통적으로 공유한다.

표 4 및 도 3은 새롭게 확인된 단백질인 LnD9DS-1, LnD9DS-2, 및 MgD9DS, 뿐만 아니라 AnD9DS 및 효모 디새츄라제인 ScOLE1의 계통발생학적 관계를 추가로 도해한다. LnD9DS-1, MgD9DS, 및 AnD9DS (sdeA) 아미노산 서열은 LnD9DS-2에 비교했을 때 더 큰 동일성 백분율을 서로 공유한다. 아미노산 동일성의 보존은 18:0 아실-CoA에 대한 기질 특이성이 LnD9DS-1, MgD9DS 및 AnD9DS (sdeA) 사이에 공유된 보존된 서열에 의존적이라는 것을 예측하게 한다. 반면에, LnD9DS-2의 아실-CoA 기질 특이성은 이의 일탈 아미노산 서열의 결과로서 16:0에 대해 우선적이다.

실시예 2: 마그나포르테 그리세아 , 헬리코베르파 지아 , 및 렙토스파에리아 노도룸으로부터의 최적화된 델타-9 디새츄라제 유전자의 디자인 및 합성

캐롤라에서의 진균 델타-9 디새츄라제 유전자의 더 높은 발현을 수득하기 위해, 본 발명가들은 이러한 유전자를 이들이 이종성 유전자를 함유하는 트랜스제닉 캐놀라 세포에서 더욱 효율적으로 발현되도록 조작하였다. 각각 서열 9, 서열 10 및 서열 11로 본원에서 개시된 천연 마그나포르테 그리세아, 헬리코베르파 지아 및 렙토스파에리아 노도룸 델타-9 디새츄라제 코딩 영역의 DNA 서열의 광범위한 분석에서, 최적의 식물 발현에 해로운 것으로 생각되는 몇몇 서열 모티프의 존재, 뿐만 아니라 이같은 최적의 식물 발현에 대한 비-최적 코돈 조성이 밝혀졌다. 델타-9 디새츄라제 단백질을 코딩하는 최적화된 유전자를 디자인하기 위해, 본 발명가들은 성질 면에서 더욱 "식물과 유사"한 (특히, 더욱 "캐놀라와 유사"한) DNA 서열을 인-실리코로 생성시켰고, 이때 서열 변형은 번역을 방해하거나 mRNA 불안정성을 일으키지 않는다.

델타-9 디새츄라제를 코딩하는 식물-최적화 유전자를 조작하기 위해, 특정 숙주 식물 (즉, 캐놀라)에 대한 단백질 코딩 서열로부터 편집된 코돈 편향 표로부터 확립된 중복성 유전자 코드를 이용하여, 단백질 디새츄라제의 아미노산 서열을 코딩하도록 DNA 서열을 디자인하였다. 캐놀라에 대한 선호되는 코돈 용법이 표 5에서 제시된다. 표 5의 C열 및 G열은 브라시카 나푸스의 코딩 영역에서 확인된 바와 같은, 각각의 아미노산에 대한 동의성 코돈들의 분포 (이러한 아미노산에 대한 모든 코돈에 대한 사용 ％ 단위)를 나타낸다. 일부 아미노산에 대한 일부 동의성 코돈은 식물 유전자에서 드물게만 발견된다는 것이 명백하다 (예를 들어, 캐놀라에서의 CGG). 코돈이 어느 식물 유형의 유전자에서 관련 아미노산을 코딩하도록 약 10％ 미만의 경우로 나타난다면, 이는 드물게 사용된 것으로 간주되었다 (표 5의 D열 및 H열에서 "DNU"로 표시됨). 아미노산에 대한 나머지 코돈 선택권의 분포의 균형을 맞추기 위해, 각각의 코돈에 대한 가중 평균 표시를 하기 식을 사용하여 계산하였다:

C1의 가중 평균 ％ = 1/(％C1 + ％C2 + ％C3 + 등) × ％C1 × 100

[식 중, C1은 당해 코돈이고, ％C2, ％C3 등은 나머지 동의성 코돈의 브라시카 나푸스에 대한 ％ 값의 평균을 나타낸다 (관련 코돈들에 대한 평균 ％ 값은 표 5의 C열 및 G열로부터 취해진다)].

각각의 코돈에 대한 가중 평균 ％ 값이 표 5의 D열 및 H열에서 제공된다.

캐놀라 유전자에서 발견된 빈번하게 사용되는 코돈의 제1 및 제2 선택권 코돈 분포를 사용하여 캐놀라에서의 최적의 발현을 위해 각각 서열 12, 서열 13 및 서열 14의 마그나포르테 그리세아, 헬리코베르파 지아, 및 렙토스파에리아 노도룸 델타-9 디새츄라제의 아미노산을 본질적으로 코딩하는 새로운 DNA 서열을 디자인하였다. 이러한 새로운 DNA 서열은 단백질 아미노산 서열 내의 각각의 위치에서 적합한 아미노산을 특정하도록 식물이 선호하는 (즉, 첫 번째로 선호하는, 두 번째로 선호하는, 세 번째로 선호하는, 또는 네 번째로 선호하는) 코돈으로 치환하는 것에 의해 델타-9 디새츄라제 단백질을 코딩하는 천연 DNA 서열과 상이하다.

표 5의 D열 및 H열로부터 구축된 캐놀라 코돈 편향 표를 사용하여, 서열 12, 서열 13 및 서열 14의 단백질 서열의 역-번역에 의해 식물-최적화 DNA 서열의 디자인을 시작하였다. 그 후, 제한 효소 인식 부위를 제거하고, 고도로 안정적인 가닥내 2차 구조를 제거하며, 클로닝 조작 또는 식물에서의 조작된 유전자의 발현에 해로울 수 있는 기타 서열을 제거하도록, 코돈 변화를 보정함 (전체적인 가중 평균 코돈 표시를 유지하면서)으로써 처음 서열을 변형시켰다. 그 후, 변형에 의해 생성되었을 수 있는 제한 효소 인식 부위에 대해 DNA 서열을 다시 분석하였다. 그 후, 확인된 부위를 관련 코돈을 첫 번째, 두 번째, 세 번째 또는 네 번째 선택권의 선호되는 코돈으로 교체함으로써 추가로 변형시켰다. 변형된 서열을 추가로 분석하고, 추가로 변형시켜 TA 및 CG 더블릿의 빈도를 감소시키고 TG 및 CT 더블릿의 빈도를 증가시켰다. 이러한 더블릿에 더하여, [G+C] 또는 [A+T]의 약 6개를 초과하는 연속적인 잔기가 있는 서열 블록을 첫 번째 또는 두 번째 선택권 등의 코돈을 다른 선호되는 코돈 선택권으로 교체함으로써 변형시켰다. 드물게 사용되는 코돈은 유전자 디자인에서 실질적인 정도로 포함되지 않았고, 코돈 조성 자체 이외의 상이한 디자인 기준 (예를 들어, 제한 효소 인식 부위의 부가 또는 결실)에 맞추기 위해 필요한 경우에만 사용되었다. 이러한 프로세스에 의해 디자인된 예시적인 캐놀라-최적화 합성 디새츄라제 DNA 서열이 서열 15, 서열 16, 및 서열 17에서 열거된다.

서열 15-17로 표시되는 바와 같은 생성된 DNA 서열은 코돈 다양성의 정도가 더 높고, 염기 조성이 바람직하다. 또한, 이러한 서열들은 전략적으로 배치된 제한 효소 인식 부위를 함유하고, 유전자의 전사 또는 mRNA 생성물의 번역을 방해할 수 있는 서열이 없다. 표 6-8은 천연 유전자 및 식물-최적화 버전에서 발견된 바와 같은 델타-9 디새츄라제 단백질에 대한 코딩 영역의 코돈 조성의 비교를 나타내고, 이들 양쪽 모두를 표 5의 D열 및 H열로부터 계산된 바와 같은 식물-최적화 서열에 대한 코돈 조성 권장물에 비교한다.

서열 15, 서열 16, 및 서열 17을 포함하는 DNA 단편들의 합성을 상업적인 공급원 (텍사스주 휴스턴의 피코스크립트(PicoScript), 및 워싱턴주 보델의 블루 헤론 바이오테크놀러지(Blue Heron Biotechnology))에 의해 수행하였다. 이러한 캐놀라-최적화 서열들을 버전 2 (v2)로 표지하였다. 그 후, 하기 실시예에 기술된 바와 같이, 합성 DNA 단편을 발현 벡터 내로 클로닝하고, 아그로박테리움 및 캐놀라 내로 형질전환시켰다.

실시예 3: 플라스미드 구축

하기의 플라스미드들을 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 구축하였다. 식물 전사 유닛(unit) (관심 유전자에 연결된 프로모터로 구성되고, 3' UTR로 종결됨), 또는 "PTU"를 함유하는 폴리뉴클레오티드 단편을 구축하고, 이원성(binary) 벡터의 T-가닥 영역 내에서 추가적인 식물 전사 유닛와 함께 조합시켰다.

pDAB7318 의 설명: pDAB7318 (도 6; 서열 58)을 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 구축하였다. 이러한 플라스미드는 2개의 디새츄라제 PTU 서열을 함유한다. 제1 디새츄라제 PTU는 파세올루스 불가리스(Phaseolus vulgaris) 파세올린 프로모터 (PvPhas 프로모터 v2 (서열 67); 진뱅크(Genbank): J01263), 파세올루스 불가리스 5' 비번역 영역 (PvPhas 5' UTR (서열 68); 진뱅크: J01263), AnD9DS v3 유전자 (서열 49), 파세올루스 불가리스 3' 비번역 영역 (PvPhas 3' UTR v1 (서열 69); 진뱅크: J01263) 및 파세올루스 불가리스 매트릭스 부착 영역 (PvPhas 3' MAR v2 (서열 70); 진뱅크: J01263)을 함유한다. 제2 디새츄라제 PTU는 PvPhas 프로모터 v2, PvPhas 5' UTR, LnD9DS-2 v2 (서열 17), 및 아그로박테리움 투메파시엔스 ORF23 3' 비번역 영역 (AtuORF23 3' UTR (서열 71); 문헌 [Huang et al. (1990) J. Bacteriol. 172:1814-22])을 함유한다.

디새츄라제 PTU 내의 요소들은 추가적인 짧은 개재(intervening) 서열들에 의해 연결된다. 2개의 디새츄라제 PTU 서열에 인비트로젠의 게이트웨이® 재조합(Gateway® Recombination) 부위가 플랭킹되고, 이들은 이러한 PTU 발현 카세트들을 아그로박테리움 형질전환 플라스미드 내로 전달하는 것을 용이하게 하는데 사용된다. 추가적으로, 플라스미드가 복제 기원, 및 카나마이신 선별성 마커를 함유한다.

pDAB7319 의 설명: pDAB7318과 pDAB7309 (도 5; 서열 53) 사이의 게이트웨이® 재조합을 통해 pDAB7319 (도 7; 서열 60)를 구축하였다. 이러한 플라스미드는 이전의 "pDAB7318의 설명"에서 기재된 2개의 디새츄라제 PTU 서열을 함유한다. 이러한 PTU들은 식물 형질전환 이원성 벡터인 pDAB7309의 T-가닥 DNA 경계 영역들 내에 머리에서 꼬리(head-to-tail) 배향으로 배향되었다. 이러한 이원성 벡터는 카사바 베인 모자이크 바이러스 프로모터 (CsVMV 프로모터 v2; 문헌 [Verdaguer et al. (1996) Plant Mol. Biol. 31:1129-39]); 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 (PAT v5; 문헌 [Wohlleben et al. (1988) Gene 70:25-37]); 및 아그로박테리움 투메파시엔스 ORF1 3' 비번역 영역 (AtuORF1 3'UTR v4; 문헌 [Huang et al. (1990), 상기 문헌])으로 이루어지는 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제(transferase) PTU를 함유하고, 추가적으로 니코티아나 타바쿰 RB7 매트릭스 부착 영역 (RB7 MARv2; 진뱅크: U67919), 오버드라이브(Overdrive) (문헌 [Toro et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85(22):8558-62]), 및 T-가닥 경계 서열 (T-DNA 경계 A 및 T-DNA 경계 B; 문헌[Gardner et al. (1986) Science 231:725-7], 및 PCT 국제 특허 공개 번호 WO2001/025459A1)과 같은 기타 조절 요소를 함유한다. 상기 기술된 PTU들을 함유하는 플라스미드들을 단리하고, 제한 효소 소화 및 DNA 서열분석을 통해 확증하였다.

pDAB7320 의 설명: pDAB7320 (도 8; 서열 55)을 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 구축하였다. 이러한 플라스미드는 1개의 디새츄라제 PTU 서열을 함유한다. 디새츄라제 PTU는 PvPhas 프로모터 v2, PvPhas 5' UTR, LnD9DS-2 v2 (서열 17), 및 AtuORF23 3' UTR을 함유한다. 디새츄라제 PTU 내의 요소들은 추가적인 짧은 개재 서열들에 의해 연결된다. 디새츄라제 PTU 서열에 인비트로젠의 게이트웨이® 재조합 부위가 또한 플랭킹되어, 아그로박테리움 형질전환 플라스미드 내로의 이의 전달을 용이하게 한다. 추가적으로, 플라스미드가 복제 기원 및 카나마이신 선별성 마커를 함유한다.

pDAB7321 의 설명: pDAB7321 (도 9; 서열 61)을 pDAB7320과 pDAB7309 사이의 게이트웨이® 재조합을 통해 구축하였다. 이러한 플라스미드는 이전의 "pDAB7319의 설명"에 기재된 디새츄라제 PTU 서열을 함유한다. 이러한 PTU는 식물 형질전환 이원성 벡터인 pDAB7309의 T-가닥 DNA 경계 영역들 내에 머리에서 꼬리 배향으로 배향되었다. 이러한 이원성 벡터는 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU: CsVMV 프로모터 v2; PAT v5; 및 AtuORF1 3'UTR v4를 함유하고, 추가적으로 오버드라이브 및 T-가닥 경계 서열 (T-DNA 경계 A 및 T-DNA 경계 B)과 같은 기타 조절 요소를 함유한다. 상기 기술된 PTU를 함유하는 플라스미드들을 단리하고, 제한 효소 소화 및 DNA 서열분석을 통해 확증하였다.

pDAB7323 의 설명: pDAB7323 (도 10; 서열 56)을 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 구축하였다. 이러한 플라스미드는 2개의 디새츄라제 PTU 서열을 함유한다. 제1 디새츄라제 PTU는 PvPhas 프로모터 v2, PvPhas 5' UTR, AnD9DS v3 (서열 47), PvPhas 3' UTR, 및 PvPhas 3' MAR v2를 함유한다. 제2 디새츄라제 PTU는 PvPhas 프로모터 v2, PvPhas 5' UTR, HzD9DS v2 (서열 16), 및 AtuORF23 3' UTR을 함유한다. 디새츄라제 PTU 내의 요소들은 추가적인 짧은 개재 서열에 의해 연결된다. 2개의 디새츄라제 PTU 서열에 인비트로젠의 게이트웨이® 재조합 부위가 플랭킹되어, 아그로박테리움 형질전환 플라스미드 내로의 이들의 전달을 용이하게 한다. 추가적으로, 플라스미드가 복제 기원 및 카나마이신 선별성 마커를 함유한다.

pDAB7324 의 설명: pDAB7324 (도 11; 서열 62)를 pDAB7323과 pDAB7309 사이의 게이트웨이® 재조합을 통해 구축하였다. 이러한 플라스미드는 이전의 "pDAB7323의 설명"에 기재된 2개의 디새츄라제 PTU 서열을 함유한다. 이러한 PTU들은 식물 형질전환 이원성 벡터인 pDAB7309의 T-가닥 DNA 경계 영역들 내에 머리에서 꼬리 배향으로 배향되었다. 이러한 이원성 벡터는 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU: CsVMV 프로모터 v2; PAT v5; 및 AtuORF1 3'UTR v4를 함유하고, 추가적으로 오버드라이브 및 T-가닥 경계 서열 (T-DNA 경계 A 및 T-DNA 경계 B)과 같은 기타 조절 요소를 함유한다. 상기 기술된 PTU들을 함유하는 플라스미드들을 단리하고, 제한 효소 소화 및 DNA 서열분석을 통해 확증하였다.

pDAB7325 의 설명: pDAB7325 (도 12; 서열 57)를 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 구축하였다. 이러한 플라스미드는 1개의 디새츄라제 PTU 서열을 함유한다. 이러한 디새츄라제 PTU는 PvPhas 프로모터 v2, PvPhas 5' UTR, HzD9DS v2 (서열 16), 및 AtuORF23 3' UTR을 함유한다. 디새츄라제 PTU 내의 요소들은 추가적인 짧은 개재 서열들에 의해 연결되고, 디새츄라제 PTU 서열에 인비트로젠의 게이트웨이® 재조합 부위가 플랭킹되어 아그로박테리움 형질전환 플라스미드 내로의 이의 전달을 용이하게 한다. 추가적으로, 플라스미드가 복제 기원 및 카나마이신 선별성 마커를 함유한다.

pDAB7326 의 설명: pDAB7326 (도 13; 서열 63)을 pDAB7325와 pDAB7309 사이의 게이트웨이® 재조합을 통해 구축하였다. 이러한 플라스미드는 이전의 "pDAB7325의 설명"에 기재된 디새츄라제 PTU 서열을 함유한다. 이러한 PTU는 식물 형질전환 이원성 벡터인 pDAB7309의 T-가닥 DNA 경계 영역들 내에 머리에서 꼬리 배향으로 배향되었다. 이러한 이원성 벡터는 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU: CsVMV 프로모터 v2; PAT v5; 및 AtuORF1 3'UTR v4를 함유하고, 추가적으로 오버드라이브 및 T-가닥 경계 서열 (T-DNA 경계 A 및 T-DNA 경계 B)과 같은 기타 조절 요소를 함유한다. 상기 기술된 PTU를 함유하는 플라스미드들을 단리하고, 제한 효소 소화 및 DNA 서열분석을 통해 확증하였다.

pDAB7327 의 설명: pDAB7327 (도 14; 서열 58) 를 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 구축하였다. 이러한 플라스미드는 1개의 디새츄라제 PTU 서열을 함유한다. 디새츄라제 PTU는 PvPhas 프로모터 v2, PvPhas 5' UTR, AnD9DS v3 유전자 (서열 49), 및 AtuORF23 3' UTR을 함유한다. 디새츄라제 PTU 내의 요소들은 추가적인 짧은 개재 서열들에 의해 연결된다. 디새츄라제 PTU 서열에 인비트로젠의 게이트웨이® 재조합 부위가 또한 플랭킹되어 아그로박테리움 형질전환 플라스미드 내로의 이의 전달을 용이하게 한다. 추가적으로, 플라스미드가 복제 기원 및 카나마이신 선별성 마커를 함유한다.

pDAB7328 의 설명: pDAB7328 (도 15; 서열 64)을 pDAB7327과 pDAB7309 사이의 게이트웨이® 재조합을 통해 구축하였다. 이러한 플라스미드는 이전의 "pDAB7327의 설명"에 기재된 디새츄라제 PTU 서열을 함유한다. 이러한 PTU는 식물 형질전환 이원성 벡터인 pDAB7309의 T-가닥 DNA 경계 영역들 내에 머리에서 꼬리 배향으로 배향되었다. 이러한 이원성 벡터는 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU: CsVMV 프로모터 v2; PAT v5; 및 AtuORF1 3'UTR v4를 함유하고, 추가적으로 오버드라이브 및 T-가닥 경계 서열 (T-DNA 경계 A 및 T-DNA 경계 B)과 같은 기타 조절 요소를 함유한다. 상기 기술된 PTU를 함유하는 플라스미드들을 단리하고, 제한 효소 소화 및 DNA 서열분석을 통해 확증하였다.

pDAB7329 의 설명: pDAB7329 (도 16; 서열 59)를 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 구축하였다. 이러한 플라스미드는 1개의 디새츄라제 PTU 서열을 함유하고,이는 PvPhas 프로모터 v2, PvPhas 5' UTR, MgD9DS v2 (서열 15), 및 AtuORF23 3' UTR을 함유한다. 이러한 디새츄라제 PTU 내의 요소들은 추가적인 짧은 개재 서열들에 의해 연결된다. 디새츄라제 PTU 서열에 인비트로젠의 게이트웨이® 재조합 부위가 플랭킹되어, 아그로박테리움 형질전환 플라스미드 내로의 이의 전달을 용이하게 한다. 추가적으로, 플라스미드가 복제 기원 및 카나마이신 선별성 마커를 함유한다.

pDAB7330 의 설명: pDAB7330 (도 17; 서열 65)을 pDAB7329와 pDAB7309 사이의 게이트웨이® 재조합을 통해 구축하였다. 이러한 플라스미드는 이전의 "pDAB7325의 설명"에 기재된 디새츄라제 PTU 서열을 함유한다. 이러한 PTU는 식물 형질전환 이원성 벡터인 pDAB7309의 T-가닥 DNA 경계 영역들 내에 머리에서 꼬리 배향으로 배향되었다. 이러한 이원성 벡터는 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU: CsVMV 프로모터 v2; PAT v5; 및 AtuORF1 3'UTR v4를 함유하고, 추가적으로 오버드라이브 및 T-가닥 경계 서열 (T-DNA 경계 A 및 T-DNA 경계 B)과 같은 기타 조절 요소를 함유한다. 상기 기술된 PTU를 함유하는 플라스미드들을 단리하고, 제한 효소 소화 및 DNA 서열분석을 통해 확증하였다.

pDAB7331 의 설명: 상기에 더하여, 디새츄라제 PTU를 함유하지 않은 대조군 플라스미드를 구축하였다 (서열 66). 도 18. 이러한 구축물은 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU만 함유하였고, 추가적으로 pDAB7309에 기술된 기타 조절 요소를 함유하였다.

실시예 4: 아그로박테리움 형질전환

전기-수용성(electro-competent) 아그로박테리움 투메파시엔스 세포 (표 9)를 문헌 [Weigel and Glazebrook (2002) "How to Transform Arabidopsis", Ch. 5, Arabidopsis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY]로부터의 프로토콜을 사용하여 제조하였다. 50 ㎕의 수용성 아그로박테리움 세포를 얼음 상에서 해동시키고, 300 내지 400 ng의 이원성 벡터 플라스미드 DNA를 사용하여 형질전환시켰다. 세포 혼합물을 하기의 조건 하에 바이오-래드(Bio-Rad) (캘리포니아주 에르쿨레스)의 진 펄서(Gene Pulser)® 전기천공기 및 미리 냉각된 전기천공 큐벳 (0.2 cm)을 사용하여 DNA의 존재 하에 전기천공시켰다: 전압: 2.5 kV, 펄스 길이: 5 msec, 정전 용량 출력 25 μF, 저항 200 Ω. 전기천공 후, 1 ㎖의 YEP 브로쓰 (효모 추출물 (10 g/L), 펩톤 (10 g/L), 및 NaCl (5 g/L))를 각각의 큐벳에 첨가하고, 세포-YEP 현탁액을 15 ㎖ 배양 튜브로 옮겼다. 세포를 부드럽게 진탕하면서 4시간 동안 28℃에서 인큐베이션한 후, 배양물을 표 9에 따른 적합한 선별물이 있는 YEP + 한천 상에 플레이팅하였다. 플레이트를 2-4일 동안 28℃에서 인큐베이션하고, 콜로니를 선별하고, 항생제 선별물이 있는 신선한 YEP + 한천 플레이트 상에 스트리킹(streaking)하고, 28℃에서 1-3일 동안 인큐베이션하였다. 케토락토스 테스트를 사용하여 아그로박테리움으로서 콜로니를 확인하였고, 케로락토스 양성 콜로니들을 단일 콜로니 단리물의 2회의 계대를 사용하여 추가로 단리하였다. 단일 콜로니 단리를 완료한 후의 콜로니로 최종 패치 플레이트를 제조하였다.

아그로박테리움 균주 및 항생제 선별
균주	게놈 선별	Ti 헬퍼 선별	이원성 벡터 선별
Z707S	스트렙토마이신	카나마이신	스펙티노마이신
DA2569	에리트로마이신	카나마이신	스펙티노마이신
EHA105	스트렙토마이신	입수가능하지 않음	스펙티노마이신
DA2552	에리트로마이신	없음	스펙티노마이신

아그로박테리움 콜로니 확인: 벡터 특이적 제한 소화 효소를 사용함으로써 무손상 플라스미드의 존재를 확인하기 위해 제한 소화 분석을 사용하였다. 마헤라이-나겔의 뉴클레오본드(NucleoBond)® 플라스미드 DNA 키트를 제조사의 권장 프로토콜에 따라 사용하여, 선별된 형질전환된 아그로박테리움 콜로니로부터 플라스미드 DNA를 정제하였다. 아그로박테리움 형질전환에서 사용된 이원성 벡터로부터의 플라스미드 DNA가 대조군으로서 포함되었다. 4개의 분리된 소화 반응을 0.75-1 ㎍의 DNA를 사용하여 실행하였다. 1-2시간 동안 반응이 실행되게 한 후, 아가로스 겔 전기영동 및 에티듐 브로마이드 염색에 의해 분석하였다. 모든 효소에 대한 소화물이 플라스미드 대조군과 동일하고 예상되는 밴드 크기에 매칭되는 콜로니들을 선별하였다.

에이. 투메파시엔스(A. tumefaciens) 균주 LBA404 (인비트로젠, 캘리포니아주 칼스배드)를 아라비돕시스 형질전환에 사용하였고, 에이. 투메파시엔스 균주 Z707S (문헌 [Hepburn et al. (1985) J. Gen. Microbiol. 131:2961-9])를 캐놀라 형질전환에 사용하였다.

실시예 5: 아라비돕시스 탈리아나의 아그로박테리움-매개 형질전환

아라비돕시스 형질전환: 아라비돕시스를 문헌 [Clough and Bent (1998) Plant J. 16:735-743]의 방법을 기초로 하는 꽃 침지(floral dip) 방법을 사용하여 형질전환시켰다. 선별된 아그로박테리움 콜로니를 사용하여 선별을 위한 적합한 항생제를 함유하는 YEP 브로쓰의 1개 이상의 30 ㎖의 예비-배양물에 접종하였다. 배양물(들)을 220 rpm에서 일정하게 진탕시키면서 하룻밤 동안 28℃에서 인큐베이션하였다. 각각의 예비-배양물을 사용하여 선별용 항생제를 함유하는 YEP 브로쓰의 2개의 500 ㎖ 배양물에 접종하고, 배양물을 일정하게 진탕시키면서 28℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 10분 동안 실온에서 약 8700 g에서 세포를 펠릿화하고, 생성된 상층액을 폐기하였다. 세포 펠릿을 1/2× 무라시게(Murashige) & 스쿠그(Skoog) 염/갬보르그(Gamborg)의 B5 비타민, 10％ (w/v) 수크로스, 0.044 μM 벤질아미노 퓨린 (10 ㎕/ℓ의, DMSO 내의 1 mg/㎖ 모액), 및 300 ㎕/ℓ의 실?(Silwet)® L-77을 함유하는 500 ㎖ 침윤 배지 내에 부드럽게 재현탁시켰다. 약 1개월령의 식물을 가장 최신의 꽃차례가 잠기도록 주의하면서 15초 동안 배지에 침지시켰다. 그 후, 식물을 옆으로 눕히고, 24시간 동안 덮고 나서 (투명 또는 불투명), 물로 세정하고, 수직으로 놓았다. 식물을 16시간 명/8시간 암의 광주기로 22℃에서 성장시켰다. 침지 약 4주 후, 식물로부터 종자를 수확하였다.

아라비돕시스 탈리아나 성장 조건: 신선하게 수확된 종자를 7일 동안 실온에서 건조제의 존재 하에 건조시켰다. 건조 후, 종자를 0.1％ 아가로스 (시그마 케미컬 컴패니(Sigma Chemical Co.), 미주리주 세인트 루이스) 용액에 현탁시켰다. 현탁된 종자를 4℃에서 2일 동안 저장하여, 휴지 요건을 달성하였고, 동시의 종자 발아 (층화)를 확실하게 하였다. 선샤인 믹스(Sunshine Mix) LP5 (선 그로 호르티컬처 인크(Sun Gro Horticulture Inc.), 워싱턴주 벨뷰)를 미세 질석(vermiculite)으로 덮고, 젖을 때까지 호글란(Hoaglan) 용액을 아래쪽에서 관개하였다. 토양 혼합물을 24시간 동안 배수시켰다. 층화된 종자를 질석 상에 파종하고, 7일 동안 습도 돔 (코드 프로덕츠(KORD Products), 캐나다 온타리오주 브라말리아)으로 덮어 놓았다. 종자가 발아되었고, 식물을 일정한 온도 (22℃) 및 습도 (40-50％) 하에 120-150 μmol/㎡초의 빛 강도의 장일(long day) 조건 (16시간 명/8시간 암) 하에 컨바이론(Conviron) 제어기 (CMP4030 및 CMP3244 모델, 컨트롤드 인바이런먼츠 리미티드(Controlled Environments Limited), 캐나다 마니토바주 위니펙)에서 성장시켰다. 초기에는 식물에 호글란 용액을 급수하였고, 이어서 탈이온수를 급수하여, 토양을 수분이 있지만 젖지는 않게 유지시켰다. 종자 수확에 가까운 식물 (수확 1-2주 전)을 마르게 하였다.

T ₁ 형질전환 식물의 선별: T₁ 종자를 상기 기술된 바와 같이 10.5" × 21" 발아 트레이 (티.오. 플라스틱스 인크(T.O. Plastics Inc.), 미네소타주 클리어워터)에 파종하고, 개요된 조건 하에 성장시켰다. 파종 5-6일 후에 돔을 제거하였다. 파종 5일 후, 그리고 다시 파종 10일 후, 적용 당 280 g/ha 글루포시네이트의 유효 속도로 전달하도록 데빌비스(DeVilbiss) 압축 공기 분무기 팁을 사용하여 글루포시네이트 제초제 (리버티(Liberty))의 0.20％ 용액을 10 ㎖/트레이 (703 L/ha)의 분무 부피로 묘목에 분무하였다. 분무할 각각의 트레이에 대해 20 ㎖ 섬광 바이알 내로 10 ㎖의 글루포시네이트 제초제 용액을 피펫팅하였다. 수직 및 수평 적용 패턴을 사용하여 분무를 전달하였다. 각각의 분무 후, 제초제 명칭, 적용 속도 및 적용일이 기록된 분무 표지를 각각의 선별 트레이에 부가하였다. 2차로 분무하고 나서 4 내지 7일 후, 제초제-저항성 식물을 확인하고, 선샤인 믹스 LP5로 제조된 화분 내로 이식하였다. 이식된 식물을 상기 언급된 성장 조건의 온실 내에 놓았다. 이식하고 나서 6 내지 8주 후, 각각의 식물로부터의 종자를 수확하고, 독특한 확인 번호로 따로따로 보관하였다.

실시예 7: 캐놀라의 아그로박테리움-매개 형질전환

아그로박테리움 제조: pDAB7319, pDAB7321, pDAB7324, pDAB7326, pDAB7328, pDAB7330 또는 pDAB7331을 함유하는 아그로박테리움 균주를 사용하여, 스트렙토마이신 (100 mg/㎖) 및 스펙티노마이신 (50 mg/㎖)을 함유하는 YEP (박토 펩톤(Bacto Peptone) (20.0 g/L) 및 효모 추출물 (10.0 g/L)) 플레이트에 스트리킹하고, 이를 2일 동안 28℃에서 인큐베이션하였다. 2일 스트리크 플레이트의 루프를 무균성 500 ㎖ 배플(baffled) 플라스크(들) 내의 150 ㎖ 변형 YEP 액체 + 스트렙토마이신 (100 mg/㎖) 및 스펙티노마이신 (50 mg/㎖) 내에 접종하고, 200 rpm에서 28℃에서 진탕시켰다. 배양물을 M-배지 (LS 염; 3％ 글루코스; 변형 B5 비타민; 1 μM 키네틴; 1 μM 2,4-D; pH 5.8)에 재현탁시키고, 캐놀라 배축의 형질전환 전에 적합한 밀도 (50 클렛(Klett) 유닛)로 희석하였다.

캐놀라 형질전환:

종자 발아: 캐놀라 종자 (넥세라(Nexera) 710 품종)를 10분 동안 10％ 클로록스(Clorox)에서 표면-멸균하고, 강철 여과기에서 무균성 증류수로 3회 헹궜다. 발아를 위해 종자를 파이타트레이(Phytatray) 내에 함유된 ½ MS 캐놀라 배지 (1/2 MS, 2％ 수크로스, 0.8％ 한천) 상에 심었다 (파이타트레이 당 25개의 종자). 트레이를 25℃ 및 16시간 명/8시간 암의 광주기로 설정된 성장 체계의 환경 성장 챔버 (퍼시벌 사이언티픽 인크(Percival Scientific, Inc.), 아이오와주 페리)에 놓고, 5일 동안 발아시켰다.

예비-처리: 제5일에, 약 3 ㎜의 배축 절편을 무균적으로 절제하고, 뿌리 및 출아물 부분을 폐기하였다 (절제 과정 동안 배축을 10 ㎖의 무균성 밀리큐(milliQ) 물 내에 놓음으로써 배축의 건조를 방지하였다). 배축 절편을 22-23℃ 및 16시간 명/8시간 암의 광주기로 설정된 성장 체계의 환경 성장 챔버 내에 3일 예비-처리를 위해 캘러스 유도 배지인 MSK1D1 (MS; 1 ㎎/ℓ 키네틴; 1 ㎎/ℓ 2,4-D; 3％ 수크로스; 0.7％ 파이트아가(Phytagar)) 상의 무균성 여과지 상에 수직으로 놓았다.

아그로박테리움과의 공동-배양: 아그로박테리움 처리 전날, 적합한 항생제를 함유하는 YEP 배지의 플라스크에 접종하였다. 배축 절편을 여과지에서 배축 절편의 건조를 방지하기 위해 10 ㎖의 액체 M 배지를 함유하는 빈 100 × 25 ㎜ 페트리 접시로 옮겼다. 이러한 단계에서 주걱을 사용하여 절편을 떠내어 옮겼다. 액체 M 배지를 피펫으로 제거하고, 40 ㎖의 아그로박테리움 현탁액을 페트리 접시에 첨가하였다 (500개의 분절 + 40 ㎖의 아그로박테리움 용액). 배축이 아그로박테리움 용액 내에 함침되어 유지되도록 페트리 접시를 주기적으로 회전시키면서 30분 동안 절편을 처리하였다. 처리 기간 말기에, 아그로박테리움 용액을 폐기물 비커 내로 피펫팅하고, 오토클레이빙(autoclaving)하고, 폐기하였다 (아그로박테리움 용액을 완전히 제거하여 아그로박테리움 과성장을 방지하였다). 절편이 건조되지 않는 것을 확실히 하기 위해 주의하면서, 처리된 배축을 여과지와 함께 MSK1D1를 함유하는 원래의 플레이트로 핀셋으로 다시 옮겼다. 대조군 절편과 함께, 배축 절편을 (플레이트를 알루미늄 호일로 덮는 것에 의해) 광 강도가 감소된 환경 성장 챔버로 돌려보내고, 처리된 배축을 아그로박테리움과 함께 3일 동안 공동-배양하였다.

선별 배지 상에서의 캘러스 유도: 공동-배양 3일 후, 배축 절편들을 개별적으로 핀셋으로 캘러스 유도 배지인 MSK1D1H1 (MS; 1 ㎎/ℓ 키네틴; 1 ㎎/ℓ 2,4-D; 0.5 g/L MES; 5 ㎎/ℓ AgNO₃; 300 ㎎/ℓ 티멘틴(Timentin); 200 ㎎/ℓ 카르베니실린(Carbenicillin); 1 ㎎/ℓ 허비어스(Herbiace); 3％ 수크로스; 0.7％ 파이트아가)로 옮겼다. 배축 절편이 배지 상에 고정되었지만, 배지 내에 매립되지는 않았다.

선별 및 출아물 재생: 캘러스 유도 배지 상에서의 7일 후, 캘러스화 배축 절편을 선별물이 있는 출아물 재생 배지 1인 MSB3Z1H1 (MS; 3 ㎎/ℓ BAP; 1 ㎎/ℓ 지아틴(Zeatin); 0.5 g/L MES; 5 ㎎/ℓ AgNO₃; 300 ㎎/ℓ 티멘틴; 200 ㎎/ℓ 카르베니실린; 1 ㎎/ℓ 허비어스; 3％ 수크로스; 0.7％ 파이트아가)로 옮겼다. 14일 후, 출아물이 있는 배축을 선별물이 증가된 재생 배지 2인 MSB3Z1H3 (MS; 3 ㎎/ℓ BAP; 1 ㎎/ℓ 지아틴; 0.5 gm/L MES; 5 ㎎/ℓ AgNO₃; 300 ㎎/ℓ 티멘틴; 200 ㎎/ℓ 카르베니실린; 3 ㎎/ℓ 허비어스®; 3％ 수크로스; 0.7％ 파이트아가)로 옮겼다.

출아물 신장: 14일 후, 출아물이 있는 절편을 출아물 신장 배지인 MSMESH5 (MS; 300 ㎎/ℓ 티멘틴; 5 ㎎/ℓ 허비어스®; 2％ 수크로스; 0.7％ TC 아가(Agar)로 옮겼다. 이미 신장된 출아물을 단리하고, MSMESH5로 옮겼다. 14일 후, 1차 라운드에서 신장되지 않은 나머지 출아물을 MSMESH5 상에 놓았고, 동일한 조성의 신선한 선별 배지로 옮겼다. 이러한 단계에서, 나머지 배축 절편을 모두 폐기하였다.

2주 후 MSB3Z1H3 상에서 신장된 출아물을 단리하였고, MSMESH5 배지로 옮겼다. MSMESH5 상에서의 1차 라운드에서 신장되지 않은 나머지 출아물을 단리하였고, 동일한 조성의 신선한 선별 배지로 옮겼다. 이러한 단계에서, 나머지 배축 절편을 모두 폐기하였다.

뿌리 유도: 14일 후, 출아물을 뿌리 유도를 위해 MSMEST 배지 (MS; 0.5 g/L MES; 300 ㎎/ℓ 티멘틴; 2％ 수크로스; 0.7％ TC 아가)로 옮겼다. MSMEST 배지 상에서의 1차 옮김에서 뿌리내리지 않은 출아물을 뿌리내린 식물을 수득할 때까지 MSMEST 배지 상에서의 2차 또는 3차 사이클로 옮겼다. MSMEST 배지 상에서의 1차 옮김에서 신장하지/뿌리내리지 않은 출아물을 뿌리내린 식물을 수득할 때까지 MSMEST 배지 상에서의 2차 또는 3차 사이클로 옮겼다. MSMESH5 또는 MSMEST에서 뿌리내렸고 PCR-양성인 식물을 토양으로의 이식을 위해 보냈다. 경화(hardening) 후, T₀ 캐놀라 식물을 트랜스진(transgene) PTU 카세트를 함유한 이벤트에 대해 추가로 분석하였다. 그 후, 식물을 온실로 옮기고, 성숙할 때까지 성장시키고, 추가적인 분석을 위해 종자를 수확하였다.

실시예 8: T ₁ 아라비돕시스 잎 조직 및 T ₀ 캐놀라 잎 조직의 DNA 분석

T₀ 캐놀라 식물 및 T₁ 아라비돕시스 식물을 분석하여, PTU 발현 카세트를 함유한 식물을 확인하였다. 인베이더(Invader)® 검정법을 수행하여, 형질전환된 것으로 추정되는 식물의 샘플을 초기에 스크리닝하고, pat PTU의 단일 카피를 함유한 이벤트를 확인하였다. 단일 카피 이벤트로 확인된 이벤트를 보존하였고, PCR을 통해 디새츄라제 PTU(들)의 존재에 대해 추가로 분석하였다. 디새츄라제 발현 카세트 PTU(들)에 대해 PCR 양성인 이벤트를 서던 블롯 분석을 통해 추가로 분석하였다. 식물을 형질전환시키는데 사용된 이원성 벡터로부터의 유전자 발현 카세트 PTU를 식물이 함유하였음을 확증하기 위해 서던 블롯 분석을 완료하였다. 모든 PTU를 함유하는 단일 카피 이벤트를 개선용으로 선별하였다.

DNA 단리: 동결건조된 잎 조직으로부터 퀴아젠(Qiagen)의 DNeasy® 96 플랜트 키트(DNeasy® 96 Plant Kit) (퀴아젠, 캘리포니아주 발렌시아)를 사용하여 총 게놈 DNA (gDNA)를 추출하였다. 그 후, 이러한 gDNA를 PCR 및 카피수에 대한 인베이더® 검정법에서 사용하기 위해 10 ng/㎕ (캐놀라) 또는 0.7 ng/㎕ (아라비돕시스)로 희석하였다.

인베이더 ® 분석: 인베이더® 검정법 (써드 웨이브 테크롤러지즈(Third Wave Technologies), 위스콘신주 매디슨)을 사용하여 선별성 마커인 pat의 카피수 분석을 완료하였다. 게놈 DNA를 95℃에서 10분 동안 변성시키고, 얼음 상에서 냉각하고, 제조사의 권장 프로토콜에 따라, 올리고뉴클레오티드 프로브, 형광 공명 에너지 전달 (FRET)이 가능한 염료 분자 및 클리바제(cleavase) 효소를 함유하는 시약들의 마스터 믹스(master mix)와 혼합하였다. 반응은 내부 기준 유전자에 대한 프로브를 함유하였다. 1-데옥시자일룰로스-5-포스페이트 리덕토이소머라제(reductoisomerase) (DXR1) 유전자가 아라비돕시스 인베이더® 검정법 반응에 대한 내부 기준 유전자로서 사용되었고, 고-이동성 군 단백질 유전자 (HMGa)가 캐놀라 인베이더® 검정법 반응에 대한 내부 기준 유전자로서 사용되었다. 또한, 플레이트는 1-카피, 2-카피 및 4-카피 표준물, 뿐만 아니라 야생형 대조군 샘플, 및 샘플을 함유하지 않는 블랭크(blank) 웰을 함유하였다. 전체 반응에 미네랄 오일을 덮은 후, 1.5시간 동안 63℃에서 써모사이클러(thermocycler)에서 인큐베이션하였다. 생성된 반응을 형광측정 플레이트 판독기 (시너지(Synergy)™ 2, 바이오텍 인스트루먼츠(BioTek Instruments) (버몬트주 위누스키))에서 판독하였다. FAM (λ 485-528 nm) 및 RED (λ 560-620 nm) 채널 양쪽 모두에 대해 판독치를 수집하였다. 이들로부터, 각각의 채널에 대한 제로 (즉, 배경값)에 대한 배수(fold-over-zero)를 샘플의 미처리(raw) 신호를 주형이 없는 경우의 미처리 신호로 나누는 것에 의해 각각의 샘플에 대해 결정하였다. 이러한 데이터로부터, 표준 곡선을 구축하였고, 선형 회귀 분석에 의해 최적 맞춤(best fit)을 결정하였다. 이러한 맞춤으로부터 확인된 파라미터를 사용하여, 겉보기 pat 카피수를 각각의 샘플에 대해 결정하였다.

PCR 분석: 각각의 식물 전사 유닛을 증폭시키는 프라이머를 사용하여 PCR 분석을 완료하였다. 이러한 프라이머들은 프로모터 (파세올린) 및 3' UTR (파세올린 또는 ORF23)에 위치하였다. 이러한 동일한 프라이머 세트들을 캐놀라 및 아라비돕시스 양쪽 모두의 PCR 분석에 사용하였다. pDAB7319 및 pDAB7324 이벤트의 PCR 분석을 위해, 프라이머 MAS414 (서열 18) 및 MAS415 (서열 19)를 사용하여 제1 PTU를 증폭시켰다. 이러한 PTU는 파세올린 프로모터, 아스페르길루스 니둘란스로부터의 아실-CoA 델타-9 디새츄라제 유전자의 기능성 등가물 (AnD9DS v3; 서열 49), 및 파세올린 3'UTR 종결인자로 이루어졌다. 구축물 pDAB7319 내의 제2 PTU의 PCR 증폭을 위해, 프라이머 MAS415 및 MAS413 (서열 20)을 사용하였다. 이러한 PTU는 파세올린 프로모터, 렙토스파에리아 노도룸으로부터의 아실-CoA 델타-9 디새츄라제 유전자의 기능성 등가물 (LnD9DS-2 v2; 서열 17), 및 ORF23 3'UTR로 이루어졌다. MAS415 및 MAS413 프라이머 쌍을 pDAB7324로의 형질전환에 의해 생성된 이벤트의 제2 PTU (파세올린 프로모터, 헬리코베르파 지아 아실-CoA 델타-9 디새츄라제 유전자 v2 (HzD9DS v2; 서열 16), 및 ORF23 3'UTR)를 증폭시키는데 또한 사용하였다. 추가적으로, MAS415 및 MAS413 프라이머 쌍을 pDAB7321 및 pDAB7326 구축물 내의 PTU를 증폭시키는데 사용하였다.

20 ng 게놈 DNA, 5 유닛의 엑스 택(Ex Taq) (다카라), 1× 반응 완충제, 0.2 μM의 각각의 dNTP, 및 0.8 μM의 각각의 프라이머를 사용하여 25 ㎕ 부피로 PCR 반응을 수행하였다. DNA 엔진 테트라드(DNA Engine Tetrad)® 2 열 사이클러 (바이오래드(BioRad), 캘리포니아주 에르쿨레스)에서 증폭 반응을 수행하였다. 프라이머 MAS413 및 MAS415에 대해 하기의 사이클링 조건을 사용하였다: 94℃에서 3분; 이어서 94℃에서 30초, 63℃에서 30초, 및 72℃에서 3분의 사이클 35회; 및 72℃에서 10분의 최종 확장. 프라이머 MAS414 및 MAS415에 대해 사용된 사이클링 조건은 어닐링(annealing) 온도가 63℃에서 60℃로 감소된 것만 다르면서 동일하였다. 반응 생성물을 1％ 아가로스 겔에 러닝시키고, 에티듐 브로마이드로 염색하고, 겔-독(Gel-Doc)™ 상에서 가시화하였다.

서던 블롯 분석: 서던 블롯 분석을 사용하여 캐놀라 이벤트의 통합 패턴을 확립하였다. 이러한 실험에서 캐놀라 게놈 내의 디새츄라제 트랜스진의 통합 및 통합성을 실연하는 데이터가 생성되었다. 선별된 이벤트가 식물 형질전환에 사용된 이원성 벡터로부터의 디새츄라제 트랜스진의 단일 카피를 함유하는 전장 단순 통합 이벤트로서 특성화되었다.

상세한 서던 블롯 분석을 디새츄라제 유전자에 대해 특이적인 프로브, 및 플라스미드 내에 위치하는 부위에서 절단하는 서술적 제한 효소를 사용하여 수행하였다. 이러한 소화로, 플라스미드의 내부에 있는 혼성화 단편, 또는 플라스미드와 캐놀라 게놈 DNA의 접합부에 스패닝(spannin)된 단편 (경계 단편)이 생산되었다. 제한 효소와 프로브의 조합에 대해 서던 혼성화로부터 지시되는 분자 크기가 각각의 이벤트에 대해 독특하였다. 이러한 분석은 플라스미드 단편이 T-가닥 DNA의 재배열 없이 캐놀라 게놈 DNA 내로 삽입되었음을 또한 나타냈다.

서던 블롯 분석을 위해, 100 ㎎의 동결건조된 캐놀라 잎 조직을 플랜트 미니 키트(Plant Mini Kit) (퀴아젠)를 사용하여 추출하였다. 샘플 당 5 마이크로그람 (5 ㎍)의 gDNA를 SpeI 및 PacI 제한 엔도뉴클레아제(endonuclease) (뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs), 매사추세츠주 입시치)로 동시에 소화시켜, 카피수를 결정하기 위해 관심 PTU 및/또는 선별성 마커 (PAT)를 함유하는 단편을 수득하였다. 소화된 DNA를 0.8％ 아가로스 겔 상에서 분리시켰다.

간략하게, DNA 단편의 전기영동 분리 및 가시화 후, 겔을 0.25N HCl로 약 20분 동안 탈퓨린화(depurination)시키고 나서, 변성 용액에 약 30분 동안, 이어서 중화 용액에 30분 이상 동안 노출시켰다. 10× SSC으로의 위킹(wicking) 시스템을 사용하여 하룻밤 동안 나일론 막 (밀리포어(Millipore), 매사추세츠주 빌레리카)으로 서던 전달을 수행하였다. 전달 후, 막을 2× SSC 용액으로 세정하였고, UV 가교에 의해 DNA를 막에 결합시켰다. 이러한 과정으로 혼성화에 대해 준비된 서던 블롯 막이 생산되었다.

프로브를 생성시켰고, PCR 단편을 플라스미드 DNA로부터 증폭시켰으며, 퀴아퀵® 겔 추출(QIAquick® Gel Extraction) 키트 (퀴아젠)을 사용하는 겔 추출을 통해 정제하였다. LnD9DS 프로브를 생성시키는데 사용된 프라이머는 arw008 (서열 21) 및 arw009 (서열 22)였다. HzD9 프로브를 생성시키는데 사용된 프라이머는 arw010 (서열 23) 및 arw011 (서열 24)이었다. 3가지 반응 모두에 대한 PCR 조건은 63℃의 어닐링 온도 및 1분의 확장 시간으로의 사이클 35회로 이루어졌다. PCR 단편을 프라임-잇® RmT 무작위 프라이머 표지(Prime-It® RmT Random Primer Labeling) 키트 (스트라타진(Stratagene), 캘리포니아주 라 호야)를 사용하여 ³²P로 표지하였다.

혼성화 오븐에서 하룻밤 동안 약 65℃에서 혼성화 단계를 수행하였다. 나일론 막 블롯을 헹구고, 블롯을 인광체 영상 스크린에 하룻밤 동안 노출시키고, 스톰™ 860 스캐너(Storm™ 860 Scanner) (몰레큘러 다이나믹스(Molecular Dynamics), 캘리포니아주 서니베일)에서 스캐닝하였다.

실시예 9: 아실- CoA 델타-9 디새츄라제를 함유하는 트랜스제닉 아라비돕시스로부터의 종자의 지방산 조성

아라비돕시스 식물을 LnD9DS-2 v2에 대한 유전자를 함유하는 아그로박테리움 벡터 (pDAB7321; 서열 61), HzD9DS v2에 대한 유전자를 함유하는 아그로박테리움 벡터 (pDAB7326; 서열 63) 또는 MgD9DS v2에 대한 유전자를 함유하는 아그로박테리움 벡터 (pDAB7330; 서열 65)로 형질전환시켰다. 식물을 AnD9DS 유전자를 함유하는 벡터 (pDAB7328; 서열 64)로 또한 형질전환시켰다. 선별성 마커 pat 유전자만 함유하는 빈 벡터 (pDAB7331; 서열 66)를 음성 대조군으로 사용하였다. 스테아로일-선호 디새츄라제 (AnD9DS)와 팔미토일-선호 디새츄라제인 LnD9DS-2 (pDAB7319; 서열 60) 또는 HzD9DS (pDAB7324; 서열 62)가 조합되도록, 2개의 디새츄라제를 조합하여 사용하여 형질전환을 또한 수행하였다. 모든 경우에, 종자-특이적 PvPhas 프로모터 (미국 특허 5,504,200)에 의해 디새츄라제 유전자가 구동되었다. 인베이더® 검정법 분석에 의해 pat 유전자를 함유하는 것으로, 그리고 PCR 분석에 의해 디새츄라제 PTU를 함유하는 것으로 확증된 제초제-저항성 T₁ 식물로부터 대량의 T₂ 종자를 수확하였다.

종자 샘플을 강철 볼(ball) 및 볼 밀(ball mill)을 사용하여 대용물로서의 헵탄-함유 트리헵타데카노인 (누-첵 프렙(Nu-Chek prep), 미네소타주 일리시안)에서 균질화시켰다. 균질화 전에, MeOH 내의 0.25 M의 신선하게 제조된 MeONa (시그마(Sigma))의 용액을 샘플에 첨가하였다. 가벼운 가열 (40℃) 및 일정한 진탕 하에 반응을 수행하였다. 메틸화된 대용물의 회수에 의해 반응이 증명되었다. FAME의 추출을 3회 반복하였고, 모든 헵탄 층을 풀링(pooling)한 후 분석하였다. 네 번째 추출/유도체화에서 FAME의 존재에 대해 점검하는 것에 의해 완전한 추출을 증명하였다. 생성된 FAME를 SGE로부터의 모세관 칼럼 BPX 70 (15 m × 0.25 ㎜ × 0.25 ㎛)을 사용하여 GC-FID에 의해 분석하였다. 각각의 FAME를 체류 시간에 의해 확인하였고, 보정 표준물로서의 매트레야 엘엘씨 (펜실베이니아주 플레즌트 갭)로부터의 평지씨 오일 기준물 믹스의 주입에 의해 정량하였다.

트랜스제닉 이벤트로부터의 T₂ 종자의 FAME 분석은 각각의 디새츄라제의 발현이, 각각의 이벤트 세트의 평균 포화 지방산 함량으로부터 결정된 바와 같이, 종자의 총 포화 지방산 함량을 감소시키는 것에 대한 유의한 효과가 있었음을 나타냈다. 표 10 및 도 19. 이러한 표 및 하기의 표에서, JMP® 통계 소프트웨어 패키지 (에스에이에스 인스티튜트 인크, 노스캐놀라이나주 캐리)에서 수행된 튜키-크래머 HSD 테스트를 사용하여 결정된 바와 같이, 동일한 문자로 연결되지 않은 값들은 유의하게 상이하다. AnD9DS와 LnD9DS-2 또는 HzD9DS의 조합에서 가장 낮은 평균 총 포화 지방산 함량이 산출되었다.

모든 디새츄라제가 아라비돕시스 종자에서 총 포화 지방산 함량을 저하시켰지만, 효모 실험에서 예측된 바와 같이, 팔미트산 및 스테아르산 지방산 함량에 대한 효과가 상이하였다. 표 11 및 도 20는 각각의 이벤트 세트에 대한 평균 팔미트산 함량을 나타낸다. 표 12 및 도 21은 각각의 이벤트 세트에 대한 T₂ 종자의 평균 스테아르산 함량을 나타낸다.

AnD9DS 및 MgD9DS가 LnD9DS-2 및 HzD9DS보다 스테아르산 함량에 대한 효과가 더 컸다. 반대로, LnD9DS-2 및 HzD9DS는 AnD9DS 및 MgD9DS보다 팔미트산 함량에 대한 효과가 더 컸다. 디새츄라제들의 조합이 양쪽 지방산에 대한 효과가 가장 컸다. 이러한 결과들은 팔미트산의 델타-9 탈포화의 주요 생성물인 팔미톨레산의 종자 함량을 증가시키는 것에 대한 디새츄라제의 효과에서 또한 관찰되었다. 표 13 및 도 22.

위치 및 카피수 효과로 인한, 분석된 이벤트들에 걸친 포화 지방산 함량에 대한 디새츄라제의 효과에서의 변동이 예상되었다. 총 포화 지방산 함량이 가장 낮은 이벤트들의 완전한 지방산 프로파일 (가장 낮은 5개의 이벤트의 평균)의 비교가 야생형 및 대조군으로 형질전환된 식물로부터의 종자의 프로파일과 함께 표 14에서 제시된다.

포화 팔미트 및 스테아르 지방산의 함량을 감소시키는 것, 및 단일 불포화 지방산 함량 (팔미톨레산 및 올레산)을 증가시키는 것에 더하여, 디새츄라제의 존재는 종자 내의 아라키드산 (C20:0)의 양을 또한 저하시켰다. 이는 아마도 이러한 지방산이 스테아르산 및 팔미트산의 신장으로부터 유래되기 때문일 것이다. C20:1Δ9와 같은 에이코센산 (C20:1)의 부수적인 증가가 없기 때문에, 도입된 디새츄라제에 의한 C20:0의 직접적인 탈포화는 없는 것으로 보였다.

실시예 10: 델타-9 디새츄라제 항체 제조

항체와 같은 진단 도구가 식물에서의 트랜스제닉 델타-9 디새츄라제 단백질 발현을 특성화하는데 바람직하다. 아실-CoA 델타-9 디새츄라제는 막-결합 단백질이기 때문에, 에쉐리키아 콜라이(Escherichia coli)에서의 일상적인 과발현이 어렵다. 그러나, 각각의 델타-9 디새츄라제 단백질의 이러한 단백질의 어떠한 막횡단 도메인도 포함하지 않는 C-말단 단편의 과발현에 의해 항체가 성공적으로 생성되었다.

폴리머라제 연쇄 반응: 각각의 디새츄라제에 대한 등가의 C-말단 단편을 증폭시키기 위해 PCR 프라이머들을 디자인하였다. C-말단 6× His 태그가 있는 단백질 단편을 코딩하도록 3' 프라이머를 디자인하였다. 클로닝을 용이하게 하도록, NdeI 및 BamHI 제한 부위를 5' 및 3' 프라이머 내로 각각 혼입하였다. 프라이머 서열들이 하기 표 15에서 제공된다. 예상되는 증폭 생성물은 LnD9DS-2에 대해 659 bp, MgD9DS에 대해 683 bp, HzD9DS에 대해 335 bp였다. PCR 반응을 다카라 엑스 택™ PCR 키트 (클론테크(Clontech), 캘리포니아주 마운틴 뷰)를 사용하여 공급사의 조건을 사용하여 수행하였다. 총 PCR 반응 부피는 50 ㎕였다. 각각의 반응은 200 ng의 플라스미드 DNA 및 50 pmol의 각각의 프라이머를 함유하였다. DNA가 94℃에서 1분 동안 변성된 후, 30초 동안 94℃, 1분 동안 60℃ 및 30초 동안 72℃의 사이클 30회가 이어졌다. 최종 확장은 72℃에서 10분 동안 수행하였다. 각각의 PCR 생성물을 무균성 0.75％ 아가로스 겔 상에서 2개의 웰에 걸쳐 러닝시키고, DNA를 몽타주 스핀 칼럼을 사용하여 겔 정제하고, 15 ㎕ TE 완충제 내에 용출시켰다.

TOPO 클로닝: 정제된 C-말단 단편을 TOPO® pCR®2.1 벡터 (인비트로젠, 캘리포니아주 칼스배드) 내로 TA 클로닝하고, 제조사의 프로토콜 (인비트로젠)에 따라 탑 10 이. 콜라이 세포 내로 형질전환시켰다. 형질전환을 선별하고, 플라스미드 DNA를 뉴클레오스핀® 칼럼 (마헤라이-나겔 게엠베하 & 코(Macherey-Nagel GmbH & Co), 독일 뒤렌)을 사용하여 정제하였다. 3 마이크로리터 (3 ㎕)의 DNA를 NdeI 및 BamHI로 20 ㎕의 총 부피로 90분 동안 37℃에서 소화시키고, 0.8％ 아가로스 겔 상에 러닝시켰다. 각각의 경우에, 유전자-특이적 단편 (+ 3.9 kb TOPO® 벡터 밴드)이 가시적이었다. 3개의 양성 클론을 각각의 클로닝된 유전자에 대해 선택하고, 증폭된 PCR 단편에 오류가 없었음을 확증하기 위해 서열분석하였다. 각각의 MgD9DS 클론은 염기쌍 45에 침묵성 점 돌연변이를 함유하였고, 이는 공개된 서열과 PCR 주형 사이의 단일 뉴클레오티드 다형성 또는 침묵성 PCR 오류를 가리킨다. 이러한 돌연변이가 침묵성이었기 때문에, 수정이 필요하지 않았고, 1개의 클론을 서브클로닝용으로 선택하였다.

델타-9 디새츄라제 C-말단 단편 발현 플라스미드의 제조: PCR로 증폭된 델타-9 디새츄라제 단편을 NdeI 및 BamHI 제한 효소로 소화시키고, pET30b(+) 발현 벡터 내의 상응하는 제한 부위 내로 결찰시켰다. 이러한 클로닝 단계는 15개의 C-말단 아미노산의 부가를 초래하여, 전장 단백질 정제를 용이하게 하는 C-말단 6× His 태그가 구성되었다. 이러한 추가적인 아미노산들은 단백질 발현에 영향을 미칠 것으로 예상되지 않았다. 양성 클론을 수득하였고, 제한 효소 소화 및 서열분석 반응을 통해 확증하였다.

이. 콜라이에서의 델타-9 디새츄라제 C-말단 펩티드 단편의 발현: 델타-9 디새츄라제/pET30b(+) 발현 플라스미드를 제조사의 권장 프로토콜 (노바젠(Novagen), 위스콘신주 매디슨)에 따라 BL21(DE3) 이. 콜라이 세포 내로 형질전환시켰다. 세포를 카나마이신 (50 ㎍/㎖) 및 글루코스 (1.25 M)를 함유하는 LA 플레이트 상에 플레이팅하였다. 플레이트를 하룻밤 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 전체적인 루프의 세포를 플레이트로부터 긁어내고, 250 ㎖ LB 및 카나마이신 (50 ㎍/㎖) + 이소프로필-P-D-티오갈락토시드 (0.75 mM) 유도제를 함유하는 500 ㎖ 플라스크 내로 접종하였다. 3가지 유도 조건을 테스트하였다. 배양물을 하기와 같이 상이한 온도들에서 유도하였고 상이한 시점에 수확하였다: 28℃에서 하룻밤 (약 18시간); 16℃에서 하룻밤; 또는 37℃에서 4시간. 세포를 15분 동안 6,000 rpm에서 250 ㎖ 병에서의 원심분리에 의해 수확한 후, -20℃에서 동결시켰다.

델타-9 디새츄라제 C-말단 펩티드 단편의 단백질 정제: 250 ㎖ 배양물로부터의 세포 펠릿을 해동시키고, 소형(hand-held) 균질화기를 사용하여 10％ 글리세롤 및 0.5 ㎖의 프로테아제(Protease) 억제제 칵테일 (시그마, 미주리주 세인트 루이스)을 함유하는 저온 포스페이트 완충 염수 (PBS) 50 ㎖에 재현탁시켰다. 브랜슨(Branson)의 450 모델 소니파이어(Sonifier) (코네티컷주 단베리)를 사용하여 얼음 상에서 약 10분 동안 세포를 파괴하였다. 15분 동안 10,000×g에서 원심분리함으로써 봉입체를 펠릿화하고, 브래드포드(Bradford) 단백질 검정법에 의해 측정 시 상층액의 단백질 농도가 기준선에 도달할 때까지 0.5％ 트리톤(Triton) X-100을 함유하는 PBS로 2-3회 추출하였다. 회수된 봉입체를 약 1시간 동안 교반하면서 실온에서 6 M 요소 및 5 mM DTT를 함유하는 PBS 용액에 용해시켰다. 용해된 단백질을 불용성 물질로부터 15분 동안 30,000×g에서의 원심분리에 의해 분리하고, 유지된 상층액을 5 ㎖ Ni-친화성 칼럼 (지이 헬스케어(GE Healthcare), 하이트랩 킬레이팅(HiTrap Chelating), 뉴저지주 피스카타웨이) 상에 적용하였다. C-말단 델타-9 디새츄라제 펩티드의 히스티딘 태그가 금속 수지에 결합하였고, 각각의 단편을 악타® 익스플로러(Akta® Explorer) 100 (지이 헬스케어, 뉴저지주 피스카타웨이)을 사용하여 50-200 mM 이미다졸 구배로 용출시켰다. 분획들 (각각 3 ㎖)을 수집하고, 용출된 피크들을 SDS-PAGE로 분석하였다. C-말단 델타-9 디새츄라제 펩티드를 함유하는 분획들을 풀링하고, 아미콘® 울트라 10,000 MWCO 필터 장치 (밀리포어, 매사추세츠주 빌레리카)를 사용하여 5 ㎖ 미만의 부피로 농축하였다. 그 후, 단백질 샘플을 하이 로드(Hi Load)™ XK16/60 수퍼덱스(Superdex)™ 200 크기 배제 칼럼 (지이 헬스케어, 뉴저지주 피스카타웨이) 상에 주입하고, 20 mM 트리스-HCl, 150 mM NaCl 및 1 mM DTT 내의 6 M 요소로 평형화시켰다. 순수한 C-말단 델타-9 디새츄라제 펩티드를 함유하는 피크 분획들 (각각 4 ㎖)을 저장하였고 (SDS-PAGE 분석 및 기타 생화학적 특정화에 의한 확인 후), 항체 생산에 사용하였다. LnD9DS-2 펩티드에 대한 27 kDa, HzD9DS 펩티드에 대한 15 kDa, 및 MgD9DS 펩티드에 대한 28 kDa의 예상 크기의 펩티드들이 생산되었다. 이러한 유도 조건들에서 SDS-PAGE 겔의 쿠마시 블루(Coomassie blue) 염색에 의한 가시화를 위한 충분한 단백질이 생산되었다.

폴리클로날 항체 생산: 계약 서비스 (스트러티직 바이오솔루션즈(Strategic BioSolutions), 델라웨어주 뉴어크)로 3개의 C-말단 델타-9 디새츄라제 펩티드 각각에 대한 토끼 항체가 생산되었다. 이들의 표준 절차에 따라, 3개의 단백질 단편 각각에 대한 높은 역가 (ELISA를 사용함으로써 확인됨)의 항혈청이 수득되었다. 각각의 정제된 C-말단 델타-9 디새츄라제 펩티드를 20 mM 트리스-HC1, 150 mM NaC1, 1 mM DTT 완충제, 최종 농도 2-3 M의 요소로 희석하여, 단백질을 용액 내에서 유지시켰다. 약 10 ㎎의 단백질을 폴리클로날 항체의 생성을 위해 스트러티직 바이오솔루션즈로 보냈다. 각각의 면역원에 대해 2마리의 토끼를 선택하였고, 표준 프로토콜 (70일 면역화)를 사용하였다. 타이터맥스® 골드(TiterMax® Gold)로 칭해지는 신규 애주번트(adjuvant)를 에멀션 제조를 위해 구입하였다. 면역화 동안 및 프로토콜 말기의 ELISA 적정을 또한 수행하여, 항체 생산의 성공을 확실히 하였다. 2회의 분리된 시점에 항혈청이 전달되었다; 표준 2개월 절차로부터의 1회, 및 사혈로부터의 1회.

토끼 혈청으로부터 총 IgG를 단리하기 위해, 약 20-30 ㎖의 고-역가 항혈청을 5 ㎖ 알칼리-내성 단백질 A 칼럼 (지이 헬스케어, 하이트랩™ 맵 셀렉트 슈어™(HiTrap™ MabSelect SuRe™), 카탈로그#11-0034-94)에 적용하였다. PBS 완충제로의 표준 세정 후, 결합된 IgG를 0.1 M 시트르산나트륨, 0.3 M NaC1, pH 3.3에 대한 짧은 노출에 의해 수지로부터 용출시키고, 1/10 부피의 2 M 트리스-HCl, pH 9 완충제를 각각의 분획에 첨가함으로써 이를 즉각적으로 중화시켰다. 표준 정치 세정 (CIP: cleaning-in-place) 절차를 따라 0.5 N NaOH로 처리함으로써 친화성 칼럼을 청소하여, IgG의 교차 오염을 방지하였다. 각각의 샘플로부터의 회수된 최종 IgG를 하룻밤 동안 4℃에서 50 부피의 PBS에 대해 투석하고, 단백질 농도를 BSA 표준물 (피어스(Pierce), 제품# 23208)을 사용하여 브래드포드 검정법에 의해 결정하였다. 1 ㎖ 분취량을 개별적인 튜브로 옮기고, -80℃에서 보관하였다.

이러한 항체들은 트랜스제닉 식물 물질에서의 디새츄라제 단백질 발현을 측정하는데 사용된 진단 도구이다. 낮은 포화 지방산 오일 표현형 변화와 델타-9 디새츄라제 단백질의 발현 수준 사이의 상관관계를 밝히는데 항체가 사용되었다.

실시예 11: T ₂ 아라비돕시스 종자 내의 아실- CoA 델타-9 디새츄라제 단백질의 수준

웨스턴 블롯에 의해 성숙형 트랜스제닉 종자 샘플 내에서 델타-9 디새츄라제 폴리펩티드를 검출하였다. 마른 종자를 클레코™ 비드 비터(Kleco™ Bead Beater) (가르시아 머신(Garcia Machine), 캘리포니아주 비살리아)에서 스테인레스 스틸 비드로 깨뜨려서 종자를 분석용으로 준비하였다. 추출 완충제를 첨가하였고 (50 mM 트리스, 10 mM EDTA, 2％ SDS), 샘플 튜브를 부드럽게 30분 동안 진동시켰다. 샘플을 15분 동안 3,000 rcf에서 원심분리하였다. 그 후, 상층액을 수집하여, 분석에 사용하였다. 종자 추출물 내의 총 가용성 단백질의 양을 로우리(Lowry) 검정법 (바이오래드, 캘리포니아주 에르쿨레스)으로 결정하였다. 레인 당 20 ㎍의 총 가용성 단백질의 표준화된 로드를 위해, 샘플을 1.55 mg/㎖ 총 가용성 단백질로 표준화하고, LDS 샘플 완충제 (인비트로젠, 캘리포니아주 칼스배드) + 40 mM DTT에서 제조하였다. 샘플을 4-12％ 비스-트리스(Bis-Tris) 겔 (인비트로젠)에서 전기영동하고, 니트로셀룰로스 막으로 옮겼다. 블롯을 차단 완충제로 차단하고, 4가지 상이한 델타-9 디새츄라제 폴리펩티드 (AnD9DS, LnD9DS-2, HzD9DS, 및 MgD9DS)에 대한 항체 (실시예 10 참조)를 프로빙(probing)하였다.

모든 경우에, 상기 기술된 바와 같이 개별적인 디새츄라제의 His-태그로 정제된 C-말단 펩티드 단편에 대해 토끼에서 폴리클로날 항체가 발달되었다. 정제된 C-말단 단편을 웨스턴 블롯의 정량을 위한 기준 항원으로서 사용하였다. 항-토끼 형광 표지 2차 항체 (염소 항-토끼 AF 633; 인비트로젠)를 검출에 사용하였다. 타이푼™ 트리오 플러스(Typhoon™ Trio Plus) 형광 영상화기 (지이 헬스케어) 상에서 블롯이 가시화되었다. 2차 곡선 맞춤으로 표준 곡선이 생성되었고, 선형 회귀를 사용하여 발현을 정량하였다.

아라비돕시스 이벤트로부터의 성숙형 T₂ 종자로부터의 추출물의 SDS-PAGE 웨스턴 블롯은 특이적 항혈청으로 프로빙했을 때 적합한 크기에서 밴드를 나타냈다. 이러한 밴드들을 특이적 기준 항혈청에 대해 정량하였다. 적합한 항혈청으로의 아라비돕시스 T₂ 종자 추출물의 정량적 웨스턴 블롯팅은 총 단백질 (tp) 1 ㎎ 당 평균 63 ng의 LnD9DS-2 (최대 228 ng/mg tp)가 성숙형 종자에서 검출되었고, HzD9DS에 대해서는 평균 34 ng/mg tp (최대 100 ng/mg tp)가 검출되었음을 가리켰다. MgD9DS에 대해서는, 평균 58 ng/mg tp (최대 1179 ng/mg tp)가 T₂ 종자에서 검출되었다. AnD9DS 이벤트에 대해서는, 평균 625 ng/mg tp (최대 1.5 ㎍/mg tp)가 성숙형 T₂ 종자에서 검출되었다. 따라서, 트랜스제닉 종자에서 팔미토일-선호 디새츄라제인 LnD9DS-2 및 HzD9DS가 AnD9DS에 비해 10-18배 덜 발현되었다. 따라서, 이러한 디새츄라제들의 더 높은 수준의 발현은 포화물, 특히 팔미트산이 추가적으로 감소되게 할 것이다.

실시예 12: 캐놀라에서의 델타-9 디새츄라제 유전자의 발현

pDAB7321 (서열 61) 및 pDAB7326 (서열 63) (종자-특이적 PvPhas 프로모터에 의해 구동되는 LnD9DS-2 및 HzD9DS 유전자를 각각 함유함)으로 수행된 형질전환으로부터 일련의 트랜스제닉 캐놀라 이벤트를 수득하였다. LnD9DS-2 유전자를 함유하는 pDAB7321 이벤트 39개를 게놈 DNA의 PCR 분석에 의해 확인하였고, T₁ 종자를 생산하도록 온실에서 성장시켰다. 유사하게, HzD9DS 유전자를 함유한 pDAB7326 이벤트 80개를 확인하였고, T₁ 종자를 생산하였다. 캐놀라를 LnD9DS-2 또는 HzD9DS 유전자와 커플링된 AnD9DS 유전자 (모두 PvPhas 프로모터에 의해 구동됨)를 함유하는 pDAB7319 (서열 60) 또는 pDAB7324 (서열 62)로 또한 형질전환시켰다. 각각 44개 및 76개의 이벤트를 회수하였고, PCR 분석에 의해 양쪽 모두의 디새츄라제 유전자를 함유하는 것으로 확증하였으며, T₁ 종자를 생산하도록 온실에서 성장시켰다.

pDAB7321 (LnD9DS-2 v2) 또는 pDAB7326 (HzD9DS v2)으로 형질전환된 이벤트로부터의 T₁ 종자 샘플의 FAME 분석은 형질전환되지 않은 캐놀라 식물 또는 빈 벡터 대조군으로 형질전환된 식물과 비교하여 포화 지방산 수준의 유의한 감소를 나타내지 않았다. T₁ 종자의 웨스턴 블롯에서, 검출가능한 수준의 델타-9 디새츄라제 단백질이 나타나지 않았다. 또한, LnD9DS-2 또는 HzD9DS에 대한 검출가능한 단백질이 pDAB7319 (AnD9DS v3 및 LnD9DS-2 v2) 또는 pDAB7324 (AnD9DS v3 및 HzD9DS v2)로 형질전환된 식물로부터의 T₁ 종자에서 검출되지 않은 반면, AnD9DS 단백질은 쉽게 검출할 수 있었다. 이러한 이벤트들에서, 대조군 식물과 비교하여 포화 지방산의 감소가 관찰되었지만, 이는 AnD9DS의 발현에 기인하였다.

델타-9 디새츄라제 유전자들의 상대적인 mRNA 수준을 평가하기 위해, 총 RNA를 이중 디새츄라제 구축물 (pDAB7319 및 pDAB7324)로 형질전환된 이벤트로부터의 발달 중인 캐놀라 종자로부터 추출하였고, 정량적 실시간 PCR로 분석하였다. 수분시키고 나서 20일 후, 25일 후, 29일 후, 32일 후, 39일 후, 또는 41일 후에 여러 캐놀라 식물로부터 드라이 아이스 상에서 종자를 수확하고, -80℃에서 보관하였다. 제조사의 권장 프로토콜에 따라 식물 RNeasy® RNA 추출 키트 (퀴아젠)를 사용하여 50 ㎎의 풀링된 동결 종자로부터 총 RNA를 제조하였다. 추출된 RNA를 qRT-PCR용 수퍼스크립트® III 퍼스트 스트랜드 신쎄시스 수퍼믹스(SuperScript® III First Strand Synthesis Supermix) (인비트로젠)를 제조사의 권장 프로토콜에 따라 사용하는 cDNA 합성을 위한 주형으로서 사용하였다.

RT-PCR 검정법을 로슈 어세이 디자인 센터(Roche Assay Design Center) (로슈 디아그노스틱스(Roche Diagnostics), 인디애나주 인디애나폴리스)를 사용하여 디새츄라제 표적에 대해 디자인하였다. 이러한 검정법에서 사용된 프라이머가 표 16에서 기술된다. 표적 검정법에서 FAM-표지 UPL 프로브 (로슈 디아그노스틱스)를 사용하였다. 이러한 검정법을 인테그레이티드 디엔에이 테크놀러지즈(Integrated DNA Technologies)에 의해 합성된 텍사스-레드(Texas-Red)-표지 캐놀라 액틴 기준물 검정법과 함께 이중 반응으로 실행하였다.

라이트사이클러(LightCycler)® 480II 실시간 PCR 열 사이클러 (로슈)에서 RT-PCR 반응을 실행하였다. 533 nm 방출 필터 및 483 nm 여기 신호를 사용하여 표적 UPL 검정법에 대한 데이터를 수집하였다. 액틴 기준물 검정법에 대한 데이터는 610 nm 필터 및 558 nm 여기 신호에서 수집하였다. LC480II 소프트웨어의 "고급형 상대적 정량(Advanced Relative Quantification)" 분석 워크플로(workflow)를 사용하여 사이클 시간 값 및 표적 대 기준물 비가 자동으로 계산되었다. 각각의 샘플 내에서의 디새츄라제 전사물 수준의 상대적인 축적을 표준 ΔΔCt 방법 (로슈)을 사용하여 계산하였다.

pDAB7319 (AnD9DS v3 및 LnD9DS-2 v2) 및 pDAB7324 (AnD9DS v3 및 HzD9DS v2)로부터의 각각의 캐놀라 종자 샘플에 대해, HzD9DS 또는 LnD9DS-2 트랜스진의 전사물 축적이 동일한 이벤트 내의 AnD9DS 전사물보다 유의하게 더 낮았다. 전사물 축적에서의 관찰된 차이는 3배 덜한 것 내지 20배 덜한 것으로 상이하였다. 도 23. 따라서, HzD9DS 및 LnD9DS-2의 불충분한 발현이 이러한 폴리펩티드의 검출 결여 및 이러한 유전자들에 기인하는 표현형의 부재를 설명할 수 있다.

실시예 13: 별법적인 프로모터들에 의한 델타-9 디새츄라제 PTU 의 발현

LnD9DS-2, HzD9DS, 및 MgD9DS 단백질을 코딩하는 유전자(들)를 발현하기 위해 추가적인 전사 조절 영역을 사용하는 것이 캐놀라 내의 이러한 델타-9 디새츄라제의 함량을 추가로 증가시킬 수 있다. 더 이른 발달 시기에, 그리고 더 긴 기간 동안 발현시키는 전사 조절 영역의 확인 및 사용이 종자 발달의 더 이른 단계에 이종성 유전자의 강건한 종자-특이적 전사를 촉진하는 것에 의해 캐놀라 종자 내의 이종성 델타-9 디새츄라제의 수준을 증가시킬 수 있다. 이같은 전사 조절 영역의 예로는 LfKCS3 프로모터 (미국 특허 7,253,337) 및 FAE 1 프로모터 (미국 특허 6,784,342)가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 예를 들어, 플라스미드 pDAB7319; pDAB7321; pDAB7324; pDAB7326; pDAB7328; 및 pDAB7330 내의 앞서 기술된 것들과 같은 유전자와의 작동가능한 연결을 통해, LnD9DS-2, HzD9DS, 및 MgD9DS 발현 카세트의 발현을 구동시키도록, 이러한 프로모터들이 단독으로 또는 조합하여 사용되었다. 플라스미드 내의 전사 조절 영역을 교체하는 방법이 당업계에 주지되어 있다. 따라서, PvPhas 프로모터를 함유하는 폴리뉴클레오티드 단편을 pDAB7319, pDAB7321, pDAB7324, pDAB7326, pDAB7328, 또는 pDAB7330 (또는 pDAB7319, pDAB7321, pDAB7324, pDAB7326, pDAB7328, 또는 pDAB7330을 만들기 위해 사용된 선행 플라스미드)으로부터 제거하고, LfKCS3 또는 FAE 1 프로모터 영역으로 교체하였다. 새롭게 구축된 플라스미드를 사용하여 이전의 실시예에 기재된 절차에 따라 캐놀라 식물을 안정적으로 형질전환시켰다. 트랜스제닉 캐놀라 식물을 단리하고, 분자 면에서 특성화하였다. 초래된 델타-9 디새츄라제 축적을 결정하였고, 델타-9 디새츄라제를 강건하게 발현하는 캐놀라 식물을 확인하였다.

델타-9 디새츄라제의 발현 증가를 위한 전사 조절 영역에 대한 추가적인 변형은 기존의 코작(Kozak) 서열을 표 17에 기재된 서열 중 임의의 것으로 교체하는 것을 포함한다. 델타-9 디새츄라제의 시작 부위의 상류에서의 별법적인 코작 서열의 조작을 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 달성하였다. 당업계에 공지된 기술을 사용하여, 합성 폴리뉴클레오티드 단편을 합성하고 델타-9 디새츄라제 코딩 서열의 상류에 클로닝하였다. 시작 코돈의 내용은 트랜스진의 발현 수준에 대한 효과가 강력하다. 코작 서열을 표 17에 열거된 것으로 변형하는 것은 이종성 델타-9 디새츄라제의 발현 수준을 증가시켰다.

실시예 14: 헬리코베르파 지아 및 렙토스파에리아 노도룸으로부터의 델타-9 디새츄라제 유전자의 디자인 및 합성

식물에서의 이종성 유전자의 더 높은 발현 수준을 수득하기 위해, 실시예 2에 기술된 코돈 최적화 전략을 변형하였고, HzD9DS 및 LnD9DS-2에 대한 이종성 유전자 단백질 코딩 영역을 새로운 디자인 프로토콜을 사용하여 재조작하였다.

예상되는 숙주 식물 (본 경우에는 캐놀라)의 코돈 편향이 계산된 표를 사용하여 코돈을 선택하였다. 델타-9 디새츄라제 유전자의 식물 발현을 위한 코딩 영역을 디자인하는 것에서, 식물이 선호하는 제1 ("첫 번째 선택권") 코돈을 결정하였고, 약 95％의 경우에 사용하였다. "두 번째 선택권" 코돈은 약 5％의 빈도로 드물게 사용하였다. 따라서, 각각의 델타-9 디새츄라제의 아미노산을 코딩하는 새로운 DNA 서열이 디자인되었고, 이때 이러한 새로운 DNA 서열은 아미노산 서열 내의 각각의 위치에서의 적합한 아미노산을 특정하기 위한 식물이 첫 번째로 선호하는 코돈 및 두 번째로 선호하는 코돈의 치환에 의해 천연 델타-9 디새츄라제 유전자와 상이하였다. 그 후, 새로운 서열을 변형에 의해 생성되었을 수 있는 제한 효소 부위에 대해 분석하였다. 그 후, 확인된 제한 효소 부위를 코돈을 첫 번째 또는 두 번째 선택권의 선호되는 코돈으로 교체하는 것에 의해 제거하였다. 관심 유전자의 전사 또는 번역에 영향을 미칠 수 있는 서열 내의 기타 부위, 구체적으로는 고도로 안정적인 줄기-고리(stem loop) 구조를 또한 제거하였다.

캐놀라의 유전자 코드로부터의 선호되는 코돈 선택권 (첫 번째 및 두 번째 선택권)의 선택을 캐놀라에 대한 단백질 코딩 서열로부터 편집된 코돈 편향 표로부터 결정하였다. 표 18 및 19에서, "천연 유전자 ％"로 표지된 열은 브라시카 나푸스 (캐놀라)의 코딩 영역에서 발견된 바와 같은, 각각의 아미노산에 대한 동의성 코돈들의 분포 (이러한 아미노산에 대한 모든 코돈에 대한 사용 ％ 단위)를 나타낸다. 본질적으로 엠. 그리세아, 에이치. 지아 및 엘. 노도룸 델타-9 디새츄라제의 아미노산을 코딩하는 새로운 DNA 서열을 캐놀라 유전자에서 발견된 첫 번째 및 두 번째 선택권 코돈의 선호되는 코돈 분포를 사용하여 캐놀라에서의 최적의 발현을 위해 디자인하였다. 구축된 캐놀라 코돈 편향 표를 사용하여 서열 12 (엠. 그리세아), 서열 13 (에이치. 지아), 및 서열 14 (엘. 노도룸)의 단백질 서열의 역-번역에 의해 식물-최적화 DNA 서열의 디자인을 시작하였다. "식물 최적화 유전자 ％"로 표지된 열은 선호되는 코돈 및 이것이 델타-9 디새츄라제 유전자 디자인 내로 혼입된 빈도를 가리킨다. 서열 44 및 서열 45는 각각 새로운 캐놀라-최적화 LnD9DS-2 및 HzD9DS 디새츄라제의 뉴클레오티드 서열을 기재한다. 이러한 새로운 캐놀라-최적화 서열들을 LnD9DS-2 v3 및 HzD9DS v3으로 표지하였다.

서열 44 및 서열 45를 포함하는 DNA 단편들의 합성을 피코스크립트 및 블루 헤론 바이오테크놀러지에 의해 수행하였다. 그 후, 실질적으로 이전의 실시예에 기술된 바와 같이, 합성 DNA를 발현 벡터 내로 클로닝하고 캐놀라 내로 형질전환시켰다.

실시예 15: 식물 내의 아실- CoA 디새츄라제 폴리펩티드의 축적을 증가시키기 위한 N- 및 C-말단의 변형

소포체 (ER) 내의 막-결합 단백질의 축적 및 안정성은 아미노산 서열 모티프 및 이의 N- 및 C-말단에서의 변형에 영향을 받을 수 있다. 문헌 [Ravid and Hochstrasser (2008) Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 9:679-90]. 특히, N- 및 C-말단 모티프 및 변형이 진균 및 식물, 뿐만 아니라 동물에서의 지질 디새츄라제의 축적 및 안정성을 조정하는 것으로 나타났다. 문헌 [McCartney et al. (2004) Plant J. 37:156-73]; [Mziaut et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97:8883-8].

FAD2 또는 FAD3의 N-말단에 Myc 또는 헤마글루틴 (HA) 에피토프 태그를 부가하는 것은 효모 내에서의 이러한 효소들의 정상 상태 수준을 유의하게 증가시킨다. 문헌 [O'Quin et al. (2009) Appl Microbiol Biotechnol 83:117-25]. 따라서, 이러한 에피토프 또는 유사한 에피토프를 본 발명의 델타-9 디새츄라제의 N-말단에 부가하는 것을 식물에서의 이러한 폴리펩티드의 발현을 증가시키기 위해 사용하였다. Myc 태그 (서열 46) 또는 HA 태그 (서열 47)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 링커를 델타-9 디새츄라제 (예를 들어, HzD9DS, MgD9DS, AnD9DS, LnD9DS-1, 및 LnD9DS-2) 코딩 서열의 5' 끝부분 내에 연속적인 오픈 리딩 프레임(open reading frame)으로서 클로닝하였다. 생성된 코딩 서열을 실시예 3에 기술된 클로닝 전략을 사용하여 식물 발현 플라스미드 내에 클로닝하였다. 새롭게 구축된 플라스미드를 사용하여 아라비돕시스 및/또는 캐놀라 식물 세포, 물질, 또는 조직을 안정적으로 형질전환시켰다. 형질전환된 식물 세포, 물질, 또는 조직으로부터 트랜스제닉 식물을 재생시켰다. 트랜스제닉 식물을 단리하고, 분자 면에서 특성화하였다. 트랜스제닉 식물의 종자에서의 초래된 델타-9 디새츄라제 축적을 결정하였고, 델타-9 디새츄라제 폴리펩티드를 강건하게 발현하는 식물을 확인하였다.

아라비돕시스 및 캐놀라에서의 AnD9DS의 발현 (실시예 11 및 12)으로부터의 증거는 HzD9DS 및 LnD9DS-2에 비하여 이러한 특정한 디새츄라제 효소의 유의하게 더 높은 발현 수준을 가리킨다. 따라서, AnD9DS의 코어(core) 디새츄라제 도메인 (막횡단 절편 및 보존된 촉매성 히스티딘 잔기를 함유함)의 바깥에 있는 N- 및 C-말단 전체 또는 이의 일부분을 더 낮게 발현되는 디새츄라제들 내의 등가의 잔기를 교체하고 이들의 발현을 증가시키는데 사용할 수 있다. 이에 따라, AnD9DS의 N-말단 잔기 1-68 및 C-말단 잔기 281-455 (각각 서열 72 및 서열 73) 전체 또는 이의 일부분을 LnD9DS-2 (서열 14)의 68개의 N-말단 잔기 (1-68) 및 168개의 C-말단 잔기 (281-449) 및/또는 HzD9DS (서열 13)의 76개의 N-말단 잔기 (1-76) 및 60개의 C-말단 잔기 (293-353) 전체 또는 이의 일부분을 교체하는데 사용하였다. 생성된 코딩 서열을 실시예 3에 기술된 클로닝 전략을 사용하여 식물 발현 플라스미드 내에 클로닝하였다. 새롭게 구축된 플라스미드를 사용하여 아라비돕시스 및/또는 캐놀라 식물 세포, 물질, 또는 조직을 안정적으로 형질전환시켰다. 형질전환된 식물 세포, 물질, 또는 조직으로부터 트랜스제닉 식물을 재생시켰다. 트랜스제닉 식물을 단리하고, 분자 면에서 특성화하였다. 트랜스제닉 식물의 종자에서의 초래된 델타-9 디새츄라제 축적을 결정하였고, 변형된 HzD9DS 또는 변형된 LnD9DS-2 폴리펩티드를 강건하게 발현하는 식물을 확인하였다.

실시예 16: 식물에서의 아실- CoA 디새츄라제의 mRNA 발현을 강화하기 위한 변형

mRNA 축적을 안정화하고 증가시키는 유전 요소의 혼입에 의해 mRNA의 발현이 강화될 수 있다는 것이 당업계에 공지되어 있다. 5' 및 3' 비번역 영역 (예를 들어, 담배 오스모틴(Osmotin) 5' 및 3' UTR 서열 (문헌 [Liu et al. (2003) Nat. Biotechnol. 21:1222-8]), 및 담배 모자이크 바이러스 Ω 서열 (문헌 [Gallie et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:8693-711])) 또는 인트론 (문헌 [Koziel et al. (1996) Plant Mol. Biol. 32:393-405])을 HzD9Ds 또는 LnD9DS-2 코딩 서열에 근접하게 혼입하는 것을 사용하여 상기 언급된 유전 요소가 결여된 동일한 코딩 서열의 발현에 비교했을 때 트랜스진의 발현 수준을 증가시켰다. 이러한 유전 요소들 중 하나 이상을 디새츄라제 PTU 내에 부가하는 것을 당업계에 주지된 방법에 따라 수행하였다. 이러한 5' 비번역 영역, 3' 비번역 영역, 및/또는 인트론을 포함하는 폴리뉴클레오티드 단편을 식물 발현 플라스미드 (예를 들어, pDAB7319, pDAB7321, pDAB7324, pDAB7326, pDAB7328, pDAB7330, 또는 pDAB7319, pDAB7321, pDAB7324, pDAB7326, pDAB7328, 또는 pDAB7330을 만드는데 사용된 선행 플라스미드)에 표준 클로닝 방법을 통해 부가하였다. 새롭게 구축된 플라스미드를 사용하여 아라비돕시스 및/또는 캐놀라 식물 세포, 물질, 또는 조직을 안정적으로 형질전환시켰다. 형질전환된 식물 세포, 물질, 또는 조직으로부터 트랜스제닉 식물을 재생시켰다. 트랜스제닉 식물을 단리하고, 분자 면에서 특성화하였다. 트랜스제닉 식물의 종자에서의 초래된 델타-9 디새츄라제 축적을 결정하였고, HzD9DS 또는 LnD9DS-2 폴리펩티드를 강건하게 발현하는 식물을 확인하였다.

또한, OLE1과 같은 효모 디새츄라제 유전자가 고도로 조절된다는 것이 당업계에 공지되어 있다. 막횡단 영역을 코딩하고 사이토크롬 b5 도메인의 일부인 서열들의 결실은 OLE1 전사물의 안정성을 감소시킨다. 문헌 [Vemula et al. (2003) J. Biol. Chem. 278(46):45269-79]. OLE1 내의 이러한 서열들의 존재는 mRNA 안정화 서열로서 작용한다. 따라서, 코딩 서열의 mRNA 전사물의 안정성을 증가시키고, 이에 의해 LnD9DS-2 또는 HzD9DS 폴리펩티드의 더 높은 수준의 발현 및 이어지는 증가를 초래하도록, 막횡단 영역을 코딩하고 사이토크롬 b5 도메인을 코딩하는 OLE1 서열들을 LnD9DS-2 또는 HzD9DS 코딩 서열 내로 혼입하는 것을 사용하였다. OLE1 막횡단 영역 및 사이토크롬 b5 도메인 서열들을 포함하는 키메라 LnD9DS-2 또는 HzD9DS 코딩 서열을 당업계에 공지된 방법을 사용하여 구축하였다. 이에 의해 생산된 코딩 서열을 식물 발현 플라스미드 내로 혼입하고 (예를 들어, 이전의 실시예에 기술된 바와 같이), 아그로박테리움-매개 식물 형질전환을 통해 트랜스제닉 식물을 생성시키는데 사용하였다. 트랜스제닉 식물을 단리하고, 특성화하였다. 초래된 델타-9 디새츄라제 축적을 결정하였고, 델타-9 디새츄라제를 강건하게 발현하는 식물을 확인하였다.

실시예 17

식물에서의 델타-9 디새츄라제의 안정적인 발현을 위한 별법적인 3' 비번역 영역 종결인자의 사용

제한된 개수의 이용가능한 3' UTR-종결인자로 인해, 아그로박테리움 ORF 23 3' UTR-종결인자 (AtuORF23 3' UTR)가 전사를 종결시키는데 전형적으로 사용된다. 다른 3' UTR-종결인자들이 아라비돕시스 탈리아나에서 전사 판독 초과(read-through)를 종결시키는데 더욱 효과적이라는 것이 최근에 제시되었다. 따라서, 상류 유전자의 전사 판독 초과를 감소시키고 이에 의해 전사 방해를 감소시키기 위해 파세올루스 불가리스 파세올린 3'UTR-종결인자 (서열 69)를 파세올루스 불가리스 파세올린 프로모터와 조합하여 사용하였다.

파세올루스 불가리스 파세올린 3'UTR-종결인자 (PvPhas 3'UTR v1)를 플라스미드 pDAB7321 및 pDAB7326에서 앞서 기술된 LnD9DS-2 v2 발현 카세트 및 HzD9DS v2 발현 카세트 내에 혼입하였다. 당업자에게 주지된 방법에 따라, PvPhas 3'UTR v1을 포함하는 폴리뉴클레오티드 단편을 LnD9DS-2 v2 유전자의 하류에 놓아 이원성 플라스미드인 pDAB110110 (도 4a; 서열 74)를 생성시켰다. PvPhas 3'UTR v1을 포함하는 폴리뉴클레오티드 단편을 또한 HzD9DS v2 유전자의 하류에 놓아 이원성 플라스미드인 pDAB110112 (도 4b; 서열 75)를 생성시켰다.

생성된 이원성 플라스미드들을 제한 효소 소화 및 서열분석을 통해 확증하였다. 새롭게 구축된 플라스미드들을 각각 사용하여, 아라비돕시스 및/또는 캐놀라 식물 세포, 물질, 또는 조직을 안정적으로 형질전환시켰다. 형질전환된 식물 세포, 물질, 또는 조직으로부터 트랜스제닉 식물을 재생시켰다. 트랜스제닉 식물을 단리하고, 분자 면에서 특성화하였다. 트랜스제닉 식물의 종자에서의 초래된 델타-9 디새츄라제 축적을 결정하였고, HzD9DS 또는 LnD9DS-2 폴리펩티드를 강건하게 발현하는 식물을 확인하였다.

SEQUENCE LISTING <110> Dow Agrosciences LLC Merlo, Ann O Gachotte, Daniel J Thompson, Mark A Walsh, Terence A <120> Lowering Saturated Fatty Acid Content of Plant Seeds <130> 2971-p10092.1US <150> US 61/358,314 <151> 2010-06-24 <160> 78 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Forward primer Mgdelta9F <400> 1 gaagaattca tggcttcgtc atcttcctcc gtgccggagt tggc 44 <210> 2 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Reverse primer Mg9deltaR <400> 2 ctcgagctag ttagtcacgc ggcctgagca cccggaacag g 41 <210> 3 <211> 1523 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR amplified fragment of MgD9Ds <400> 3 gaattcatgg cttcgtcatc ttcctccgtg ccggagttgg ctgccgcctt ccctgatggc 60 actaccgact tcaagcccat gaggaacacc aagggctacg acgtcagcaa gccgcacatt 120 tccgagacac ctatgacact caagaactgg cataagcacg tcaactggct caacaccacc 180 ttcatcttgt ttgtgcccct ggctggtctc atatccactt actgggtccc tctgcagtgg 240 aagacggctg tatgggctgt cgtctactac ttcaacaccg gcctgggaat tactgccggt 300 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ctgggatgac tttgttgagc agtccaagaa cggaaaggct tggattgcag 1200 ttgccggtgt catccacgat gttggtgact tcatcaagga ccaccctggt ggcagagctc 1260 tcatcaactc ggccattggc aaggacgcaa ccgcaatctt caacggcggt gtttacaacc 1320 actccaacgc cgctcacaac ctgctctcga ctatgcgtgt gggtgttttg cgtggcggct 1380 gcgaggttga gatctggaag cgcgcccagt ccgaaaacaa ggacgtctca accgtcgttg 1440 attcttcggg taaccgcatc gtccgcgcgg gtgggcaagc gaccaaggtc gtccagcctg 1500 ttccgggtgc tcaggccgcg tga 1523 <210> 4 <211> 1428 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Intronless MgD9Ds clone <400> 4 atggcttcgt catcttcctc cgtgccggag ttggctgccg ccttccctga tggcactacc 60 gacttcaagc ccatgaggaa caccaagggc tacgacgtca gcaagccgca catttccgag 120 acacctatga cactcaagaa ctggcataag cacgtcaact ggctcaacac caccttcatc 180 ttgtttgtgc ccctggctgg tctcatatcc acttactggg tccctctgca gtggaagacg 240 gctgtatggg ctgtcgtcta ctacttcaac accggcctgg gaattactgc cggttaccac 300 cgactttggg ctcacagctc gtacaaggcc tcgcttccgc tcaaaatcta ccttgccgcc 360 gttggcgctg gtgccgtcga gggctccatc agatggtggt ccaacggtca ccgcgcacac 420 caccgataca ccgataccga gaaggacccc tactcagtcc gcaagggtct cctgtactca 480 cacatgggat ggatgcttct gaagcagaac cccaagaagc agggccgcac cgacatcacc 540 gacctgaacg aggaccccgt tgtcgtttgg cagcaccgca acttcctcaa gtgtgttatc 600 ttcatggccc tcgtcttccc cacacttgtg gctggccttg gctggggtga ctactgggga 660 ggtttcatct acggaggtat tctgcgtgtc ttcttcgtcc agcaggccac cttctgcgtc 720 aactcgcttg cccactggct cggtgaccag cctttcgacg atcgcaactc gccgcgtgat 780 cacgtcatca cagccctggt cacccttgga gagggatacc acaacttcca ccacgagttc 840 ccttcggact accgcaacgc tattgagtgg taccagtatg accccaccaa gtggtcaatc 900 tggatctgga agcagcttgg tcttgcccac aacctgaagc agttccgcca aaacgagatt 960 gagaagggac gcgtccagca gctgcagaag aagctcgacc agaagcgcgc caagcttgat 1020 tggggtattc ccttggagca gcttcccgtt gttagctggg atgactttgt tgagcagtcc 1080 aagaacggaa aggcttggat tgcagttgcc ggtgtcatcc acgatgttgg tgacttcatc 1140 aaggaccacc ctggtggcag agctctcatc aactcggcca ttggcaagga cgcaaccgca 1200 atcttcaacg gcggtgttta caaccactcc aacgccgctc acaacctgct 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aaaatttaac tccataattt ttttattcga ctgatcttaa agcaacaccc 10380 agtgacacaa ctagccattt ttttctttga ataaaaaaat ccaattatca ttgtattttt 10440 tttatacaat gaaaatttca ccaaacaatg atttgtggta tttctgaagc aagtcatgtt 10500 atgcaaaatt ctataattcc catttgacac tacggaagta actgaagatc tgcttttaca 10560 tgcgagacac atcttctaaa gtaattttaa taatagttac tatattcaag atttcatata 10620 tcaaatactc aatattactt ctaaaaaatt aattagatat aattaaaata ttactttttt 10680 aattttaagt ttaattgttg aatttgtgac tattgattta ttattctact atgtttaaat 10740 tgttttatag atagtttaaa gtaaatataa gtaatgtagt agagtgttag agtgttaccc 10800 taaaccataa actataagat ttatggtgga ctaattttca tatatttctt attgctttta 10860 ccttttcttg gtatgtaagt ccgtaactgg aattactgtg ggttgccatg acactctgtg 10920 gtcttttggt tcatgcatgg atcttgcgca agaaaaagac aaagaacaaa gaaaaaagac 10980 aaaacagaga gacaaaacgc aatcacacaa ccaactcaaa ttagtcactg gctgatcaag 11040 atcgccgcgt ccatgtatgt ctaaatgcca tgcaaagcaa cacgtgctta acatgcactt 11100 taaatggctc acccatctca acccacacac aaacacattg cctttttctt catcatcacc 11160 acaaccacct gtatatattc attctcttcc gccacctcaa tttcttcact tcaacacacg 11220 tcaacctgca tatgcgtgtc atcccatgcc caaatctcca tgcatgttcc aaccaccttc 11280 tctcttatat aatacctata aatacctcta atatcactca cttctttcat catccatcca 11340 tccagagtac tactactcta ctactataat accccaaccc aactcatatt caatactact 11400 ctaggatcca acaatggctc ccaacatttc tgaggatgtc aatggtgttc tttttgagtc 11460 agatgcggca acccctgatt tggctctttc cacaccacct gtgcaaaaag ctgacaacag 11520 acccaagcaa cttgtgtgga ggaacatttt gcttttcgct tacttgcacc tcgcagctct 11580 ctacggaggc tatttgtttc tcttcagtgc aaaatggcag accgacattt tcgcttacat 11640 tctttatgtc atctctggac tggggataac tgctggggca catagactct gggctcacaa 11700 gtcatacaaa gccaagtggc cactcagagt tatactggtc atcttcaaca cggttgcctt 11760 tcaagacgct gctatggatt gggctcgtga ccatagaatg catcacaagt acagcgagac 11820 cgacgcggac ccacacaatg caacgagagg tttcttcttc tctcacattg gctggcttct 11880 tgttaggaaa catcctgatc tgaaagaaaa agggaaggga ctcgacatga gtgatctcct 11940 tgctgatcca atactccgtt ttcagaagaa gtactatctg atcctcatgc ctctggcctg 12000 ttttgtgatg ccaaccgtta tcccggttta cttttgggga gaaacttgga caaatgcttt 12060 cttcgtggca gccatgttcc gttatgcttt catcctgaat gttacctggt tggtgaactc 12120 tgccgcacac aagtggggag acaaacccta tgacaagtcc atcaagcctt ccgaaaacct 12180 ttcagttgcg atgtttgctt tgggagaagg atttcacaat taccatcaca cttttccgtg 12240 ggactacaag acagcagagc ttggaaacaa caagttgaac ttcacaacaa cgttcatcaa 12300 tttctttgcg aaaatcggtt gggcctatga tttgaagact gtgagtgatg acattgtcaa 12360 gaacagggtc aagagaactg gcgatggaag ccatcatctc tggggctggg gtgatgagaa 12420 tcagagcaaa gaagagatag atgcagccat taggatcaac cctaaagacg attgagtagt 12480 tagcttaatc acctagagct cggtcaccag tatgaactaa aatgcatgta ggtgtaagag 12540 ctcatggaga gcatggaata ttgtatccga ccatgtaaca gtataataac tgagctccat 12600 ctcacttctt ctatgaataa acaaaggatg ttatgatata ttaacactct atctatgcac 12660 cttattgttc tatgataaat ttcctcttat tattataaat catctgaatc gtgacggctt 12720 atggaatgct tcaaatagta caaaaacaaa tgtgtactat aagactttct aaacaattct 12780 aactttagca ttgtgaacga gacataagtg ttaagaagac ataacaatta taatggaaga 12840 agtttgtctc catttatata ttatatatta cccacttatg tattatatta ggatgttaag 12900 gagacataac aattataaag agagaagttt gtatccattt atatattata tactacccat 12960 ttatatatta tacttatcca cttatttaat gtctttataa ggtttgatcc atgatatttc 13020 taatatttta gttgatatgt atatgaaaag gtactatttg aactctctta ctctgtataa 13080 aggttggatc atccttaaag tgggtctatt taattttatt gcttcttaca gataaaaaaa 13140 aaattatgag ttggtttgat aaaatattga aggatttaaa ataataataa ataataaata 13200 acatataata tatgtatata aatttattat aatataacat ttatctataa aaaagtaaat 13260 attgtcataa atctatacaa tcgtttagcc ttgctggaac gaatctcaat tatttaaacg 13320 agagtaaaca tatttgactt tttggttatt taacaaatta ttatttaaca ctatatgaaa 13380 tttttttttt ttatcagcaa agaataaaat taaattaaga aggacaatgg tgtcccaatc 13440 cttatacaac caacttccac aagaaagtca agtcagagac aacaaaaaaa caagcaaagg 13500 aaatttttta atttgagttg tcttgtttgc tgcataattt atgcagtaaa acactacaca 13560 taaccctttt agcagtagag caatggttga ccgtgtgctt agcttctttt attttatttt 13620 tttatcagca aagaataaat aaaataaaat gagacacttc agggatgttt caacccttat 13680 acaaaacccc aaaaacaagt ttcctagcac cctaccaacg aattcgcggc cgcttaatta 13740 agatgagtga tactcaggac tcaggactca ctctgctgat cactagtgct agcctcgagg 13800 tcgaccagct tt 13812 <210> 76 <211> 1434 <212> DNA <213> Magnaporthe grisea <400> 76 gaattcatgg cttcgtcatc ttcctccgtg ccggagttgg ctgccgcctt ccctgatggc 60 actaccgact tcaagcccat gaggaacacc aagggctacg acgtcagcaa gccgcacatt 120 tccgagacac ctatgacact caagaactgg cataagcacg tcaactggct caacaccacc 180 ttcatcttgt ttgtgcccct ggctggtctc atatccactt actgggtccc tctgcagtgg 240 aagacggctg tatgggctgt cgtctactac ttcaacaccg gcctgggaat tactgccggt 300 taccaccgac tttgggctca cagctcgtac aaggcctcgc ttccgctcaa aatctacctt 360 gccgccgttg gcgctggtgc cgtcgagggc tccatcagat ggtggtccaa cggtcaccgc 420 gcacaccacc gatacaccga taccgagaag gacccctact cagtccgcaa gggtctcctg 480 tactcacaca tgggatggat gcttctgaag cagaacccca agaagcaggg ccgcaccgac 540 atcaccgacc tgaacgagga ccccgttgtc gtttggcagc accgcaactt cctcaagtgt 600 gttatcttca tggccctcgt cttccccaca cttgtggctg gccttggctg gggtgactac 660 tggggaggtt tcatctacgg aggtattctg cgtgtcttct tcgtccagca ggccaccttc 720 tgcgtcaact cgcttgccca ctggctcggt gaccagcctt tcgacgatcg caactcgccg 780 cgtgatcacg tcatcacagc cctggtcacc cttggagagg gataccacaa cttccaccac 840 gagttccctt cggactaccg caacgctatt gagtggtacc agtatgaccc caccaagtgg 900 tcaatctgga tctggaagca gcttggtctt gcccacaacc tgaagcagtt ccgccaaaac 960 gagattgaga agggacgcgt ccagcagctg cagaagaagc tcgaccagaa gcgcgccaag 1020 cttgattggg gtattccctt ggagcagctt cccgttgtta gctgggatga ctttgttgag 1080 cagtccaaga acggaaaggc ttggattgca gttgccggtg tcatccacga tgttggtgac 1140 ttcatcaagg accaccctgg tggcagagct ctcatcaact cggccattgg caaggacgca 1200 accgcaatct tcaacggcgg tgtttacaac cactccaacg ccgctcacaa cctgctctcg 1260 actatgcgtg tgggtgtttt gcgtggcggc tgcgaggttg agatctggaa gcgcgcccag 1320 tccgaaaaca aggacgtctc aaccgtcgtt gattcttcgg gtaaccgcat cgtccgcgcg 1380 ggtgggcaag cgaccaaggt cgtccagcct gttccgggtg ctcaggccgc gtga 1434 <210> 77 <211> 212 <212> PRT <213> Leptosphaeria nodorum <400> 77 Tyr Tyr Phe Cys Thr Ala Phe Gly Ile Thr Gly Gly Tyr His Arg Leu 1 5 10 15 Trp Ser His Arg Ser Tyr Ser Ala Arg Leu Pro Leu Arg Leu Phe Leu 20 25 30 Ala Phe Thr Gly Ala Gly Ala Ile Gln Gly Ser Ala Arg Trp Trp Ser 35 40 45 Ala Asn His Arg Ala His His Arg Trp Thr Asp Thr Met Lys Asp Pro 50 55 60 Tyr Ser Val Met Arg Gly Leu Leu Phe Ser His Ile Gly Trp Met Val 65 70 75 80 Leu Asn Ser Asp Pro Lys Val Lys Gly Arg Thr Asp Val Ser Asp Leu 85 90 95 Asp Ser Asp Pro Val Val Val Trp Gln His Lys His Tyr Gly Lys Cys 100 105 110 Leu Leu Phe Ala Ala Trp Ile Phe Pro Met Ile Val Ala Gly Leu Gly 115 120 125 Trp Gly Asp Trp Trp Gly Gly Leu Val Tyr Ala Gly Ile Ile Arg Ala 130 135 140 Cys Phe Val Gln Gln Ala Thr Phe Cys Val Asn Ser Leu Ala His Trp 145 150 155 160 Ile Gly Glu Gln Pro Phe Asp Asp Arg Arg Thr Pro Arg Asp His Val 165 170 175 Leu Thr Ala Leu Val Thr Met Gly Glu Gly Tyr His Asn Phe His His 180 185 190 Glu Phe Pro Ser Asp Tyr Arg Asn Ala Ile Ile Trp Tyr Gln Tyr Asp 195 200 205 Pro Thr Lys Trp 210 <210> 78 <211> 216 <212> PRT <213> Helicoverpa zea <400> 78 Leu Tyr Val Ile Ser Gly Leu Gly Ile Thr Ala Gly Ala His Arg Leu 1 5 10 15 Trp Ala His Lys Ser Tyr Lys Ala Lys Trp Pro Leu Arg Val Ile Leu 20 25 30 Val Ile Phe Asn Thr Val Ala Phe Gln Asp Ala Ala Met Asp Trp Ala 35 40 45 Arg Asp His Arg Met His His Lys Tyr Ser Glu Thr Asp Ala Asp Pro 50 55 60 His Asn Ala Thr Arg Gly Phe Phe Phe Ser His Ile Gly Trp Leu Leu 65 70 75 80 Val Arg Lys His Pro Asp Leu Lys Glu Lys Gly Lys Gly Leu Asp Met 85 90 95 Ser Asp Leu Leu Ala Asp Pro Ile Leu Arg Phe Gln Lys Lys Tyr Tyr 100 105 110 Leu Ile Leu Met Pro Leu Ala Cys Phe Val Met Pro Thr Val Ile Pro 115 120 125 Val Tyr Phe Trp Gly Glu Thr Trp Thr Asn Ala Phe Phe Val Ala Ala 130 135 140 Met Phe Arg Tyr Ala Phe Ile Leu Asn Val Thr Trp Leu Val Asn Ser 145 150 155 160 Ala Ala His Lys Trp Gly Asp Lys Pro Tyr Asp Lys Ser Ile Lys Pro 165 170 175 Ser Glu Asn Leu Ser Val Ala Met Phe Ala Leu Gly Glu Gly Phe His 180 185 190 Asn Tyr His His Thr Phe Pro Trp Asp Tyr Lys Thr Ala Glu Leu Gly 195 200 205 Asn Asn Lys Leu Asn Phe Thr Thr 210 215

Claims

서열 12, 서열 13, 서열 14, 서열 50, 서열 51, 서열 52, 서열 72 및 서열 73으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 80％ 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 델타-9 디새츄라제(desaturase) 효소를 코딩하는 단리된 핵산 분자.
제1항에 있어서, 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 8, 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 15, 서열 16, 서열 17, 서열 44 및 서열 45로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 60％ 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자.
제1항에 있어서, 유전자 조절 요소를 추가로 포함하는 핵산 분자.
제3항에 있어서, 유전자 조절 요소가 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae) 델타-9 디새츄라제 프로모터, 델타-9 디새츄라제 3'UTR/종결인자, ole1 유전자 프로모터, 파세올린 프로모터, 파세올루스 불가리스(Phaseolus vulgaris) 파세올린 5' 비번역 영역, 파세올루스 불가리스 파세올린 3' 비번역 영역, 파세올루스 불가리스 파세올린 매트릭스 부착 영역, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) ORF23 3' 비번역 영역, 카사바 베인 모자이크 바이러스(Cassava vein Mosaic Virus) 프로모터, 아그로박테리움 투메파시엔스 ORF1 3' 비번역 영역, 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum) RB7 매트릭스 부착 영역, 오버드라이브(Overdrive), T-가닥 경계 서열, LfKCS3 프로모터, FAE 1 프로모터, 서열 40, 서열 41, 서열 42, 서열 43, Myc 태그(tag), 및 헤마글루틴 태그로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 분자.
서열 12, 서열 13, 서열 14, 서열 50, 서열 51, 서열 52, 서열 72 및 서열 73으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 80％ 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단리된 델타-9 디새츄라제 효소.
서열 72 및/또는 서열 73을 포함하며, 서열 77 및 서열 78로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 추가로 포함하는 키메라 델타-9 디새츄라제 폴리펩티드.
세포 내의 포화 지방산의 양이 감소되도록 제1항의 핵산 분자로 세포를 형질전환시키는 단계
를 포함하는, 세포 내의 포화 지방산의 양을 감소시키는 방법.
제7항에 있어서, 세포가 효모 세포인 방법.
제7항에 있어서, 세포가 식물 세포인 방법.
제9항에 있어서, 식물 세포를 1개를 초과하는 제1항의 핵산 분자로 형질전환시키는 단계를 포함하는 방법.
제9항에 있어서, 식물 세포의 형질전환이 식물 세포 내의 16:0-ACP의 수준을 감소시키기 위한 수단을 식물 세포 내로 도입하는 방법.
제11항에 있어서, 식물 세포 내의 16:0-ACP의 수준을 감소시키기 위한 수단이 색소체외(extraplastidial) 디새츄라제인 방법.
제12항에 있어서, 색소체외 디새츄라제가 LnD9DS 디새츄라제, AnD9DS 디새츄라제, HzD9DS 디새츄라제, 및 MgD9DS 디새츄라제로 이루어진 군으로부터 선택된 디새츄라제인 방법.
제9항에 있어서, 식물 세포가 아라비돕시스(Arabidopsis), 보라고(Borago), 캐놀라(Canola), 리시누스(Ricinus), 테오브로마(Theobroma), 지아(Zea), 고시피움(Gossypium), 크람베(Crambe), 쿠페아(Cuphea), 리눔(Linum), 레스퀘렐라(Lesquerella), 림난테스(Limnanthes), 리놀라(Linola), 트로파에올룸(Tropaeolum), 오에노테라(Oenothera), 올레아(Olea), 엘라에이스(Elaeis), 아라키스(Arachis), 평지씨, 카르타무스(Carthamus), 글리신(Glycine), 소자(Soja), 헬리안투스(Helianthus), 니코티아나(Nicotiana), 베르노니아(Vernonia), 트리티쿰(Triticum), 호르데움(Hordeum), 오리자(Oryza), 아베나(Avena), 소르굼(Sorghum), 세칼레(Secale), 및 벼과(Gramineae)의 기타 구성원으로 이루어진 군으로부터 선택된 속으로부터 선택된 식물로부터 수득되는 방법.
제1항의 핵산 서열을 포함하는 오일 종자 식물.
서열 12, 서열 13, 서열 14, 서열 50, 서열 51 및 서열 52로 이루어진 군으로부터 선택된 색소체외 디새츄라제를 발현하는 식물 종자.
동계(isogenic) 버전의 트랜스제닉(transgenic) 브라시카 나푸스(Brassica napus) 계통에 비해 종자의 16:0 수준이 감소된, 트랜스제닉 브라시카 나푸스 계통의 종자.
제1항의 핵산 분자로 식물 물질을 형질전환시키는 단계; 및
형질전환된 식물 물질을 배양하여 식물을 수득하는 단계
를 포함하는, 야생형 식물과 비교하여 식물 내에 감소된 양의 포화 지방산을 포함하는 유전자 조작 식물을 생성시키는 방법.
제18항에 있어서, 식물이 아라비돕시스, 보라고, 캐놀라, 리시누스, 테오브로마, 지아, 고시피움, 크람베, 쿠페아, 리눔, 레스퀘렐라, 림난테스, 리놀라, 트로파에올룸, 오에노테라, 올레아, 엘라에이스, 아라키스, 평지씨, 카르타무스, 글리신, 소자, 헬리안투스, 니코티아나, 베르노니아, 트리티쿰, 호르데움, 오리자, 아베나, 소르굼, 세칼레, 및 벼과의 기타 구성원으로 이루어진 군으로부터 선택된 속으로부터 선택되는 방법.
제18항의 방법에 의해 수득된 식물.
제20항의 식물로부터 수득된 식물 물질.
제21항에 있어서, 식물 물질이 종자인 식물 물질.