CN115807014A

CN115807014A - 桑蚕脂肪酸脱氢酶Bmdesat5的应用

Info

Publication number: CN115807014A
Application number: CN202210767080.8A
Authority: CN
Inventors: 王根洪; 夏庆友; 柏冰川; 温宇婵; 赵萍
Original assignee: Southwest University
Current assignee: Southwest University
Priority date: 2022-07-01
Filing date: 2022-07-01
Publication date: 2023-03-17

Abstract

本发明公开了桑蚕脂肪酸脱氢酶Bmdesat5的应用，通过酿酒酵母真核表达系统对Bmdesat5进行了异源表达，并通过GC/MS鉴定到该基因在酵母阳性重组工程菌株中能合成的酶活产物顺式异油酸。分别向家蚕五龄期幼虫和小鼠中添食Bmdesat5酶促产物顺式异油酸后，家蚕和小鼠均表现出饱腹感升高、摄食量减少、体重降低的现象；同时，家蚕幼虫的生长发育及小鼠的生长状态并不会受到影响，因此用于调控动物进食及体重增长等方面有着重要的应用价值。

Description

桑蚕脂肪酸脱氢酶Bmdesat5的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及桑蚕脂肪酸脱氢酶Bmdesat5的应用。

背景技术

脂肪酸(Fatty acid，FA)是由一条烃链和一个羧基末端组成。在自然界中，脂肪酸大部分主要以甘油三酯的形式存在，仅有少部分以游离脂肪酸形式存在。脂肪酸脱氢酶(Fatty acid desaturase)的主要功能是在脂肪烃链的特定位置除去两个氢原子形成C＝C双键，脂肪酸脱氢酶对所有生物都至关重要，在不饱和脂肪酸合成中起着关键作用，对于底物链长度和双键插入在脂肪酰基链中的位置具有高度特异性。不饱和脂肪酸合成是以饱和脂肪酸为前体，这过程需要脂肪酸脱氢酶、氧分子、NADH以及细胞色素b5的参与。脂肪酸脱氢酶的在生物体内的功能主要有参与脂肪酸代谢，不饱和脂肪酸的形成，在昆虫中参与性信息素的合成，以及其他的一些生物活性物质防御性脂肪酸和功能性碳氢化合物的合成。有研究表明通过向十二指肠中注射长链不饱和脂肪酸能够激活十二指肠中CCK-A受体信号，进而抑制食物的摄入。长链ω-3类不饱和脂肪酸被发现是一种有潜力调节食物摄入的营养因子，已证明摄入长链ω-3类不饱和脂肪酸能够调节超重和肥胖志愿者在减肥过程中的餐后饱腹感。Dolores Parra在人类饱腹感的研究中证明ω-3类PUFAs的摄入可以增加超重和肥胖志愿者餐后的饱腹感。

因此，研究家蚕中对桑蚕的饱腹感和取食有一定的抑制作用的基因及成分，对建立哺乳动物肥胖等疾病模型用于相关研究具有重要意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种桑蚕脂肪酸脱氢酶Bmdesat5在酶促催化生成顺式异油酸中的应用；本发明的目的之二在于提供利用桑蚕脂肪酸脱氢酶Bmdesat5制备顺式异油酸的方法；本发明的目的之三在于提供桑蚕脂肪酸脱氢酶Bmdesat5在酶促生成顺式异油酸降低动物摄食量中的应用；本发明的目的之四在于提供桑蚕脂肪酸脱氢酶Bmdesat5在酶促生成顺式异油酸控制动物体重增长速度中的应用；本发明的目的之五在于提供顺式异油酸在制备降低动物体重变化和/或降低摄食量中的饲料中应用。

为研究参与不饱和脂肪酸合成的桑蚕脂肪酸脱氢酶(Bmdesat5)，运用现代分子生物学研究平台，从基因克隆、真核酵母细胞异源表达分析和异源酸功能探索对Bmdesat5的酶活功能及酶活产物的功能应用进行了研究。首先通过真核酿酒酵母异源表达，检测到了其酶促合成产物为顺式异油酸。脂肪酸在生物体内具有多种生理功能，多项研究表明脂肪酸对动物饮食具有一定的影响。为了探究顺式异油酸在桑蚕体内是否具有类似功能，进行了脂肪酸的添食实验，结果表明添食顺式异油酸减少了五龄家蚕取食量、体重、全茧重和蛹重，能够增加家蚕幼虫肠道内饱腹感相关基因硫激肽(BmSK)的表达。这表明食物中顺式异油酸含量的增加对桑蚕的饱腹感和取食有一定的抑制作用；顺式异油酸添食小鼠后增加了小鼠饱腹感，减少了摄食量和体重增长，并且在肝脏的脂肪生成和代谢过程中也发挥着一定的作用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、桑蚕脂肪酸脱氢酶Bmdesat5在酶促催化生成顺式异油酸中的应用，所述桑蚕脂肪酸脱氢酶Bmdesat5的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所述核苷酸编码。

2、利用桑蚕脂肪酸脱氢酶Bmdesat5制备顺式异油酸的方法，将桑蚕脂肪酸脱氢酶Bmdesat5在表达系统中对Bmdesat5进行了异源表达，发酵得到含有顺式异油酸的产物，所述桑蚕脂肪酸脱氢酶Bmdesat5的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所述核苷酸编码。

本发明优选的，所述表达系统为真核表达系统，也可以为原核表达系统；更优选的，所述表达系统为酵母表达系统。

进一步优选的，将桑蚕脂肪酸脱氢酶Bmdesat5构建于表达载体pYES2的多克隆酶切位点之间获得重组表达载体，再用重组表达载体转化酿酒酵母，得到工程菌，发酵得到含有顺式异油酸的产物。

3、桑蚕脂肪酸脱氢酶Bmdesat5在酶促生成顺式异油酸降低动物摄食量中的应用，所述桑蚕脂肪酸脱氢酶Bmdesat5的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所述核苷酸编码。

4、桑蚕脂肪酸脱氢酶Bmdesat5在酶促生成顺式异油酸控制动物体重增长速度中的应用，所述桑蚕脂肪酸脱氢酶Bmdesat5的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所述核苷酸编码。

5、顺式异油酸在制备降低动物体重增长速度和/或降低摄食量的产品中应用。

本发明优选的，所述顺式异油酸在制备增加动物饱腹感相关基因表达量的产品中的应用，所述饱腹感相关基因为胆囊收缩素CCK基因或酪酪肽PYY基因。

本发明优选的，所述顺式异油酸在制备降低动物肝脏脂肪生成和代谢相关基因表达量的产品中的应用，所述肝脏脂肪生成相关基因为ACC基因、SCD2基因、SCD1基因、SREBP基因或FAS基因；所述脂肪代谢相关基因为PPARα或CPT。

本发明的有益效果在于：桑蚕脂肪酸脱氢酶Bmdesat5在酶促催化生成顺式异油酸中的应用，研究发现顺式异油酸在增加饱腹感、控制体重增长、减少脂肪积累增加脂肪代谢等方面有明显的效果。本发明也为Bmdesat5基因及其产物顺式异油酸的应用价值提供了一定线索和参考价值。此外，本研究结果也表明鳞翅目昆虫家蚕与哺乳动物在进食及饱腹感调控等方面具有相似的调控机制，家蚕可作为哺乳动物肥胖等疾病模型用于相关研究。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为Bmdesat5组织表达谱(A：qRT-PCR定量检测Bmdesat5转录水平；B：PCR扩增检测Bmdesat5 mRNA含量；Te：精巢；Ov：卵巢；Mt：马氏管；Hc：血细胞；Ep：表皮；Mg：中肠；Fb：脂肪体；He：头部；A/Msg：前中部丝腺；Psg：后部丝腺；Sv：涎腺)；

图2为Bmdesat5融合EGFP与内质网染色红色荧光共定位(绿色荧光代表Bmdesat5融合EGFP；红色荧光代表内质网；DAPI代表细胞核)；

图3为Bmdesat5融合EGFP亚细胞定位；

图4为真核表达载体构建(A：真核表达载体构建示意图；B：真核表达载体酶切验证；泳道1：Bmdesat5 ORF片段；泳道2：pYES2载体骨架；泳道3；重组载体；泳道4：重组载体双酶切)；

图5为Bmdesat5酶活产物GC/MS分析(A：总离子流色谱图；箭头指向显著峰B：显著峰质谱图；C：顺式异油酸结构式)；

图6为家蚕添食脂肪酸后五龄3天摄食量(A：雄性家蚕添食脂肪酸后五龄3天摄食量；B：雌性家蚕添食脂肪酸后五龄3天摄食量；正偏差表示标准差(SD)；*,P<0.05；**,P<0.01,(t检验))；

图7为家蚕添食3天脂肪酸后体型和体重增长变化(A：家蚕添食脂肪酸后五龄3天体型对比；B,C：五龄家蚕添食脂肪酸体重增长变化；♀：雌性；♂：雄性；正偏差表示标准差(SD)；*,P<0.05；**,P<0.01,***,P<0.001(t检验))；

图8为家蚕添食脂肪酸后肠道内硫激肽(BmSK)表达水平检测(*,P<0.05；**,P<0.01)；

图9为A4-desat5转基因载体的构建流程；

图10为A4-desat5转基因家蚕的荧光筛选；

图11为A4-desat5转基因家蚕基因表达量检测(A：Bmdesat5基因在A4-desat5和非转基因家蚕各个组织中的qRT-PCR分析；B：Bmdesat5基因在A4-desat5和非转基因家蚕涎腺中的Western blot检测；He：头；Ep：表皮；Mg：中肠；Fb：脂肪体；Sg：丝腺；Mt：马氏管；Go：生殖腺；Sv：涎腺；*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001)；

图12为A4-desat5转基因家蚕涎腺脂肪酸检测；

图13为A4-desat5转基因家蚕五龄幼虫体重及摄食量统计(A：体重统计；B：摄食量统计；L5D*：五龄第*天；♀：雌性；♂：雄性；*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001)；

图14为A4-desat5转基因家蚕经济性状统计(A：A4-desat5转基因雌蚕蛹重统计；B：A4-desat5转基因雄蚕蛹重统计；C：A4-desat5转基因雌蚕全茧重统计；D：A4-desat5转基因雄蚕全茧重统计；E：A4-desat5转基因雌蚕茧层率统计；F：A4-desat5转基因雄蚕茧层率统计；♀：雌性；♂：雄性；*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001)；

图15为小鼠添食脂肪酸后体重及摄食量变化(A：小鼠体重统计；B：小鼠摄食量统计；Control：空白对照；9c-C16:1：棕榈油酸添食组；11c-C18:1：顺式异油酸添食组；C18:0：硬脂酸添食组；*,P<0.05；**,P<0.01,***,P<0.001)；

图16为小鼠红外成像(A：小鼠红外成像图片；B：实验组小鼠图片)；

图17为小鼠添食脂肪酸后饱腹感相关基因表达量检测(A：胆囊收缩素(CCK)表达量检测；B：酪酪肽(PYY)表达量检测；Control：空白对照；9c-C16:1：棕榈油酸添食组；11c-C18:1：顺式异油酸添食组；C18:0：硬脂酸添食组；*,P<0.05；**,P<0.01,***,P<0.001)；

图18为小鼠添食脂肪酸后肝脏脂肪生成和代谢相关基因表达量检测(P<0.05)(A：肝脏脂肪生成相关基因表达量检测；B：肝脏脂肪酸β氧化相关基因表达量检测)。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1、桑蚕Bmdesat5基因片段的获得

取家蚕P50品系的涎腺组织cDNA为模板，设计克隆桑蚕Bmdesat5基因的引物，具体引物如下：

Bmdesat5_F：5'-atggaagcgaaacaaaacaatctcg-3'(SEQ ID NO.1)；

Bmdesat5_R：5'-ctataaaggtggagtttgcttaagaatgtc-3'(SEQ ID NO.2)；

然后以设计的引物进行PCR扩增，PCR扩增条件为：98℃预变性5min；98℃变性10s，56℃退火10s，72℃延伸15s，33个循环；72℃延伸5min，12℃保存。反应结束后，取5μL PCR产物，1.2％琼脂糖凝胶电泳检测并对所获片段进行序列测定。

扩增获得Bmdesat5基因片段，具体序列如下所示(SEQ ID NO.3)：

>Bmdesat5(1020bp)

实施例2、Bmdesat5表达特征分析

根据得到的Bmdesat5序列，设计引物并通过qRT-PCR手段，对Bmdesat5表达特征进行调查。结果如图1所示。引物序列如下：

Bmdesat5-qPCR_F：5'-acaatctcgcaccgacctta-3'(SEQ ID NO.4)

Bmdesat5-qPCR_R：5'-cctgaccagcaaccatccta-3'(SEQ ID NO.5)；

结果显示，Bmdesat5特异在桑蚕涎腺中高量达。

实施例3、Bmdesat5亚细胞定位

亚细胞定位使用家蚕BmE细胞系。使用生长状态良好的细胞，铺板进行染色。

将Bmdesat5的氨基端或者羧基端融合EGFP蛋白在细胞中表达，通过绿色荧光在细胞内的位置指示目标蛋白的位置。若目标蛋白是位于细胞质中的游离蛋白，当使用适当浓度的去垢剂Digitonin(可以使细胞膜穿孔而不破坏细胞器)处理细胞，游离的荧光蛋白会溢出细胞而荧光消失；若目标蛋白锚定于内质网上，使用去垢剂Digitonin处理细胞后荧光不会消失，当再次向穿孔的细胞中添加Trypsin时，Trypsin则会通过细胞膜上的孔隙进入细胞内，消化EGFP蛋白则荧光消失。

(1)细胞染色观察

1)去除细胞培养基，加入500μL PBS buffer洗涤生长在爬片上细胞两次；

2)加入200μL 4％甲醛室温固定5min，固定后用PBS buffer洗涤3次，每次5min；

3)以下步骤注意避光操作；

4)ER-Tracker Red工作液的配制：取1μL ER-Tracker Red加入到1mL ER-TrackerRed稀释液中，混合均匀，使用前需要37℃温育5min；

5)加入配制好37℃预温育的ER-Tracker Red染色工作液，与细胞37℃共孵育15～30min；

6)去除ER-Tracker Red染色工作液，用500μL PBS buffer洗涤细胞1～2次，每次5min；

7)加100μL DAPI染色液，覆盖住细胞表面，室温静置染色5min；

8)去除DAPI染色液，用PBS buffer洗涤2～3次，每次3～5min；

9)先在载玻片上滴加适当的抗荧光淬灭封片液，将染色完成的爬片有细胞一面朝下安放在抗荧光淬灭封片液上，最后在爬片周围滴加指甲油进行封片；

10)封片后的样品，在避光条件下保存，拍照时，先在普通荧光显微镜下观察找到合适位置，在通过共聚焦显微镜进行拍照保存。

(2)动态细胞定位观察

1)将培养好的细胞去除细胞培养基，加入适量KHM buffer洗涤细胞2次；

2)加入200μL KHM buffer，在荧光显微镜下找到合适的位置，在绿色荧光通道下进行观察拍照；

3)加入去垢剂Digitonin，使其终浓度为180μM，然后间隔40s持续拍照；

4)如果绿色荧光消失则实验结束，如果绿色荧光不消失则进行下一步实验操作；

5)加入适1mg/ml Trypsin溶液，使其终浓度为50mM，然后间隔1min持续拍照，直至绿色荧光消失。

结果如图2和3所示。结果表明，Bmdesat5与ER-Tracker Red(内质网红色荧光探针)染色内质网的红色荧光重合，说明Bmdesat5位于细胞核外的细胞质基质。结合动态细胞定位观察发现，在Bmdesat5氨基端(Bmdesat5+EGFP)和羧基端(EGFP+Bmdesat5)融合EGFP表达的细胞，绿色荧光主要存在于细胞核外的细胞质中；随后进行细胞穿孔处理，当转染细胞中添加总浓度为100μM去垢剂Digitonin后，能使得细胞膜穿孔而不破坏细胞器结构，转染表达EGFP蛋白的细胞，游离的EGFP蛋白会溢出细胞而荧光逐渐消失，Bmdesat5融合EGFP表达的细胞，绿色荧光则不会消失，当再添加Trypsin处理细胞时，Trypsin会进入细胞内消化EGFP蛋白，绿色荧光会逐渐消失。这说明Bmdesat5蛋白是位于细胞质基质中的细胞器膜上，综合结果表明Bmdesat5定位于细胞内质网。

实施例4、Bmdesat5真核表达载体的构建

根据真核表达载体的序列信息，选择Kpn I和Not I酶切位点。在扩增出的Bmdesat5基因片段通过PCR扩增引入相应的酶切位点。通过酶切、连接的方法将Bmdesat5克隆到酿酒酵母表达载体pYES2的Kpn I和Not I酶切位点处，重组载体命名为pYES2[Bmdesat5]，重组载体构建过程如图4所示。

引物序列如下：

Bmdesat5Kpn I_F：5'-ggggtaccaaaaaaatgtctgaagcgaaacaaaacaatct-3'(SEQ IDNO.6)；

Bmdesat5Not I_R：5'-ttgcggccgctcataaaggtggagtttgctta-3'(SEQ ID NO.7)；

将验证正确的pYES2[Bmdesat5]载体，转化大肠杆菌扩大培养后提取超纯质粒，通过PEG/LiAc介导转化INVSc1酿酒酵母化学感受态细胞。通过尿嘧啶缺陷型SD-U平板进行筛选，挑取单菌落培养后，通过NaOH消化酿酒酵母细胞壁获取粗制的酿酒酵母基因组，进行PCR扩增筛选阳性重组子，获得的重组工程菌株命名为INVSc1-pYES2[Bmdesat5]。

实施例5、Bmdesat5真核表达及脂肪酸提取后衍生化处理

蛋白诱导表达与检测，具体步骤如下：

1)接种阳性重组工程菌株菌液200μL于15mL包含有2％葡萄糖的SD-U培养基中，29℃，220rpm振荡过夜，培养至OD600＝3；

在50mL(250mL锥形瓶)诱导培养基中起始浓度OD600＝0.4所需要的过夜培养物的量为

2)吸取过夜培养物6.67mL于10mL无菌离心管中，4℃，1,500×g离心5min，使用灭菌ddH₂O洗涤细胞沉淀两次；

3)加入SD-U诱导培养基重悬细胞沉淀，接种于50mL含有2％半乳糖和1％棉子糖的SD-U诱导培养基中，使其初始OD600＝0.4；

4)于20℃，220rpm震荡培养72h；

5)3,500rpm离心5min收集酵母细胞，并用PBS洗涤细胞沉淀2次，-80℃保存备用；

6)将诱导蛋白表达的酵母细胞用液氮研磨破碎，加入裂解buffer溶解酵母蛋白，取40μL蛋白溶液加入10μL 5×SDS Loading Buffer，沸水浴10min制备蛋白样品；

7)使用制备的anti-Bmdesat5抗体进行Western Bloting检测。

脂肪酸提取与衍生化：

(1)脂肪酸提取

1)收集诱导表达后的酵母菌通过冷冻干燥完全去除培养基后，使用液氮进行充分研磨后转入15mL刻度试管并加入4mL BufferI(4:5(v/v)氯仿:甲醇，包含50mg/L雷公藤甲素作为外标内参)；

2)涡旋混匀5s后，超声浴中超声30min；

3)加入2.5mL Buffer II(Tris-HCl(pH 7.0)50mM,NaCl 1M)，会出现相分离；

4)涡旋5s，然后超声浴超声30min；

5)1,200×g离心5min；

6)使用玻璃巴斯德吸管转移氯仿相(下层相)到新的刻度试管中，注意不要吸取到中间层和上层相；

7)再次加入1mL Buffer I到之前的玻璃管中再次提取样品；

8)涡旋5s，然后超声浴超声15min；

9)1,200×g离心5min；

10)使用玻璃巴斯德吸管转移氯仿相(下层相)到步骤6刻度试管中，注意不要吸取到中间相和上层相；

11)在氮气流中蒸发氯仿；

12)氮吹结束后，可以-20℃冻存。

(2)脂肪酸甲酯化衍生反应

1)在提取的刻度试管中，加入3mL Buffer III(甲醇95％，硫酸5％)，盖紧聚四氟乙烯盖子；

2)涡旋5s；

3)70℃干预或者水浴孵育3h，每30min检查密闭性，样品不可沸腾，并涡旋5s；

4)室温冷却后，加入3mL Mili-Q超纯水和3mL正己烷；

5)涡旋5s，然后在试管旋转器上旋转混匀15min；

6)1,200×g离心5min；

7)收集2mL正己烷相(上层相)，使用玻璃巴斯德吸管转移到新的刻度试管中；

8)加入2mL Mili-Q超纯水到收集的正己烷相中洗涤；

9)涡旋5s，然后1,200×g离心5min；

10)充入氮气后可保存于-20℃，可以不用相分离。

实施例6、GC/MS上机检测

1)使用玻璃巴斯德吸管吸取正己烷相(上层相)到GC样品瓶；

2)盖紧盖子，确保盖子完全密封，不可翻转，以避免蒸发；

3)重新加注GC洗涤剂(甲醇和正庚烷)，清空费瓶，放置样品瓶于自动进样器。先使用GC运行2次溶剂正己烷，再开始检测实验组样品；

4)色谱柱Agilent J&W CP-Sil 88FAME(100m×0.25mm,0.20μm)；使用氦气作为载气，入口温度260℃，压力81.7kPa，分流比0.1:1，总流速20mL/min。FID探测器温度270℃，氢气流速为40mL/min；空气流速为400mL/min；氦气流速为9.3mL/min；

5)样品上样量为1μL，上样之前和之后用甲醇和正庚烷洗涤上样针；

6)程序如下：

结果如图5所示。结果显示，表达Bmdesat5基因株检测到了其酶促合成产物为顺式异油酸，表明Bmdesat5基因能够催化合成顺式异油酸。

实施例7、脂肪酸添食家蚕幼虫

家蚕品系为D9L，幼虫饲养条件为环境温度25℃，相对湿度75％，使用采摘的新鲜桑叶饲喂。选择添食PBS、棕榈油酸(ω7类)和油酸(ω9类)作为对照组，顺式异油酸(ω7类)作为实验组。

蚕体重记录：选取正常的家蚕D9L饲喂至五龄起蚕，雌雄分开，各30头为一组，并称量单头体重，记为L5D0。起蚕饲喂1次后进行添食，将添食的脂肪酸或PBS滴在家蚕正在咬食的桑叶缺口处，家蚕继续咬食会顺带食下缺口处的液滴，按照每克体重添食0.5μg脂肪酸进行。正常饲喂新鲜桑叶，添食后24h，记录一次体重及摄食量。

茧、蛹相关重量记录：家蚕正常饲喂到上蔟结茧，在蛹5天时，对全茧重，蛹重，茧层重单个称重，并记录用于后续分析；

茧层率＝(茧层重/全茧重)×100％；数据分析使用GraphPad Prism 7.0软件进行，显著性差异用双尾T检验进行计算。

结果如图6所示。结果显示，五龄3天添食顺式异油酸、棕榈油酸和油酸的雌性家蚕和雄性家蚕组摄食量均较对照组低，其中添食顺式异油酸的家蚕摄食量最低，表明顺式异油酸能够降低家蚕的摄食量，体重称重结果如图7所示。结果显示，添食顺式异油酸组家蚕体重增重小，表明顺式异油酸能够抑制家蚕体重的增加。图8为家蚕幼虫肠道内硫激肽(BmSK)表达水平检测结果。结果显示，添食顺式异油酸后硫激肽(BmSK)在中部中肠和后部中肠表达量上升，结果表明顺式异油酸能够增加家蚕的饱腹感。

实施例8、家蚕中转基因过表达Bmdesat5

首先将Bmdesat5克隆到pSLfa1180[A4-EGFP]载体，获得pSLfa1180[A4-desat5]重组载体。接着将pSLfa1180[A4-desat5]载体提取质粒后与piggyBac[3×P3-EGFP]载体经Asc I单酶切后使用T4连接酶相连接，构建piggyBac[3×P-EGFP,A4-desat5]的最终载体。如图9所示。转基因载体构建成功后提取超纯质粒用于转基因显微注射。

(1)转基因家蚕的获得：

1)取piggyBac[3×P3-EGFP,A4-desat5]超纯质粒(浓度大于500ng/μL)和piggyBac转座酶的辅助载体pHA3PIG的超纯质粒等摩尔比均匀混合；

2)使用Eppendorf显微注射仪将已混合好的质粒注射进家蚕早期胚胎中(3-5nL/颗)，使用无毒的胶水封闭注射口；

3)将注射后的蚕卵置于28℃，相对湿度85％的环境下催青。待蚕卵孵化后，即得到转基因G0代家，使用新鲜桑叶饲喂至成虫，自交后获得G1代转基因家蚕；

4)在G1代家蚕蚕卵发育5-6天后，将卵置于荧光显微镜下筛选出眼睛处特异发绿色荧光的蚕卵，即为转基因阳性家蚕。饲养至成虫期，再次确认荧光信号，并传代，以获得稳定遗传的转基因家蚕。

结果如图10所示，在G1代蚕卵发育5-6天时使用荧光显微镜成功筛选到阳性个体，将其命名为A4-Bmdesat5。

(2)转基因家蚕饲养：

将非转基因家蚕和G4代转基因家蚕饲养在温度25℃，相对湿度70％的环境下至五龄起时，区分雌雄个体，同时雌、雄幼虫各分为3组，每组30头蚕，使用新鲜桑叶饲养直至上簇结茧。

(3)转基因家蚕基因表达量检测

取五龄三天的A4-desat5转基因家蚕和非转基因家蚕的各个组织，提取RNA后合成cDNA，以组织cDNA为模板通过qRT-PCR检测Bmdesat5的表达水平。结果如图11所示。结果显示，在A4-desat5转基因家蚕的各个组织中Bmdesat5均被上调表达，并且在涎腺中上调比例更高。Western blot检测结果显示，能够在A4-desat5转基因家蚕涎腺组织中检测到相应的蛋白表达，表明成功获得过表达Bmdesat5的家蚕品系。

(4)转基因家蚕涎腺脂肪酸检测

取五龄三天的A4-desat5转基因家蚕和非转基因家蚕涎腺组织，每20对涎腺作为一个样本，设置3个重复，进行脂肪酸的提取和甲酯化衍生反应，通过GC/MS检测A4-desat5转基因家蚕涎腺中的脂肪酸，结果如图12所示，在保留时间约43.8min时，成功检测到Bmdesat5的产物顺式异油酸的峰，表明在家蚕中成功过表达Bmdesat5，并且具有一定活性。

(4)转基因家蚕幼虫体重及摄食量统计

将非转基因家蚕和G4代转基因家蚕饲养在相同的环境条件下至五龄起时，区分雌雄个体，同时雌、雄幼虫各分为3组，每组30头蚕，记录每天饲喂的桑叶量，确保给食充分，每天记录体重变化以及摄食量的变化直至上簇结茧。结果如图13所示。结果显示，A4-desat5转基因家蚕雌、雄个体的幼虫体重和摄食量均要低于非转基因家蚕，这也表明过表达Bmdesat5，能够减少家蚕幼虫摄食量和体重。

(4)转基因家蚕经济形状统计

在蛹期第五天时，雌、雄分开统计转基因家蚕和野生型的全茧重、茧层重和蛹重并计算茧层率。茧层率＝(茧层重/全茧重)×100％。结果如图14所示。结果显示，转基因雌蚕的蛹重比非转基因家蚕减小了10.04％，转基因雄蚕的蛹重比非转基因家蚕减小了13.01％。在全茧重方面，A4-desat5转基因家蚕低于非转基因家蚕，但茧层率两者无差别。

实施例9、脂肪酸添食小鼠

小鼠选择KM小鼠，饲养环境在室温24±1℃，光照/黑暗周期12h/12h，空气交换率15次/h的SPF级动物实验室。将36只3周大的雄性KM小鼠随机分为4组，每组9只，3只共用一个通风笼，在笼子底部放入SPF级玉米芯垫料，每周进行更换并消毒通风笼。小鼠经过一周的适应期后开始实验，设置空白对照组、添食顺式异油酸组、添食棕榈油酸组(阳性对照)和添食硬脂酸组(阴性对照)。脂肪酸灌胃浓度为500mg/kg，灌胃剂量为0.1-0.2mL/10g(10g指小鼠体重)。在添食实验开始前1天对小鼠进行禁食，可以随意饮水。添食实验连续8天，每天在固定时间内对小鼠进行灌胃，并统计体重及摄食量。

添食8天检测结果如图15所示。结果显示，棕榈油酸添食组、顺式异油酸添食组和硬脂酸添食组小鼠体重先增加后缓慢降低，其中顺式异油酸添加组体重增加最少，且摄食量最低，表明添食顺式异油酸能够有效抑制小鼠的摄食量，减少体重的增长。

实验结束后对小鼠进行解剖，并对主要器官称重，包括：心脏、肝脏、脾、肺和肾脏。称量前使用生理盐水清洗器官并用灭菌滤纸吸干水分，随后使用分析天平进行称重。脏器指数为某脏器的重量与其体重之比值，结果如表1所示。

表1、小鼠脏器指数(平均值±标准差，n＝9)

结果显示，各添食脂肪酸组小鼠脏器指数与对照组无差异。图16为小鼠红外成像结果，结果显示顺式异油酸添加组小鼠体温与对照组无差异，均处于正常水平。表明添食脂肪酸没有影响小鼠的正常发育和生长。

在实验结束后收集小鼠的十二指肠、回肠和肝脏，经液氮研磨后提取组织RNA，用于检测饱腹感相关基因表达水平和脂肪生成、代谢相关基因表达。

图17为小鼠添食脂肪酸后饱腹感相关基因表达量检测，结果显示，顺式异油酸添食组CCK基因和PYY基因表达量相比其他组显著升高。表明添食顺式异油酸增加了小鼠的饱腹感。

图18为小鼠添食脂肪酸后肝脏脂肪生成和代谢相关基因表达量检测。结果显示，添食脂肪酸后肝脏脂肪生成相关基因表达量下降，而肝脏脂肪酸β氧化相关基因表达量上升。结果表明，顺式异油酸能够减少小鼠肝脏中脂肪的积累，加速脂肪的代谢。

上述结果表明食物中顺式异油酸含量的增加对桑蚕的饱腹感和取食有一定的抑制作用；顺式异油酸添食小鼠后增加了小鼠饱腹感，减少了摄食量和体重增长，并且在肝脏的脂肪生成和代谢过程中也发挥着一定的作用。综上，顺式异油酸在增加饱腹感、控制体重增长、减少脂肪积累增加脂肪代谢等方面有明显的效果。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims

1.桑蚕脂肪酸脱氢酶Bmdesat5在酶促催化生成顺式异油酸中的应用，其特征在于：所述桑蚕脂肪酸脱氢酶Bmdesat5的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所述核苷酸编码。

2.利用桑蚕脂肪酸脱氢酶Bmdesat5制备顺式异油酸的方法，其特征在于：将桑蚕脂肪酸脱氢酶Bmdesat5在表达系统中对Bmdesat5进行了异源表达，发酵得到含有顺式异油酸的产物，所述桑蚕脂肪酸脱氢酶Bmdesat5的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所述核苷酸编码。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述表达系统为真核表达系统。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述表达系统为酵母表达系统。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：将桑蚕脂肪酸脱氢酶Bmdesat5构建于表达载体pYES2的多克隆酶切位点之间获得重组表达载体，再用重组表达载体转化酿酒酵母，得到工程菌，发酵得到含有顺式异油酸的产物。

6.桑蚕脂肪酸脱氢酶Bmdesat5在酶促生成顺式异油酸降低动物摄食量中的应用，其特征在于：所述桑蚕脂肪酸脱氢酶Bmdesat5的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所述核苷酸编码。

7.桑蚕脂肪酸脱氢酶Bmdesat5在酶促生成顺式异油酸控制动物体重增长速度中的应用，其特征在于：所述桑蚕脂肪酸脱氢酶Bmdesat5的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所述核苷酸编码。

8.顺式异油酸在制备降低动物体重增长速度和/或降低摄食量的产品中应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述顺式异油酸在制备增加动物饱腹感相关基因表达量的产品中的应用，所述饱腹感相关基因为胆囊收缩素CCK基因或酪酪肽PYY基因。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述顺式异油酸在制备降低动物肝脏脂肪生成和代谢相关基因表达量的产品中的应用，所述肝脏脂肪生成相关基因为ACC基因、SCD2基因、SCD1基因、SREBP基因或FAS基因；所述脂肪代谢相关基因为PPARα或CPT。