CN107629120B

CN107629120B - 白桦bHLH9蛋白在调控三萜类化合物合成中的应用

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Publication number: CN107629120B
Application number: CN201710728633.8A
Authority: CN
Inventors: 尹静; 詹亚光; 李欣; 肖佳雷; 张梦岩; 李影; 常存
Original assignee: Northeast Forestry University
Current assignee: Northeast Forestry University
Priority date: 2017-08-23
Filing date: 2017-08-23
Publication date: 2021-05-11
Anticipated expiration: 2037-08-23
Also published as: CN107629120A

Abstract

本发明公开了白桦bHLH9蛋白及相关生物材料在调控三萜类化合物合成中的应用。通过实验证明：超量表达BpbHLH9基因可以提高转基因酵母和转基因白桦中三萜类物质及三萜类前体物质的含量，其中，对齐墩果酸含量的提高最为显著。在转基因白桦中的三萜途径关键酶基因的相对表达量也均表现出不同程度的上调。结果表明BpbHLH9基因参与白桦三萜类物质的合成，可以有效提高三萜途径关键基因的表达和三萜类物质齐墩果酸、白桦脂酸及白桦脂醇的含量。

Description

白桦bHLH9蛋白在调控三萜类化合物合成中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及白桦bHLH9蛋白在调控三萜类化合物合成中的应用。

背景技术

白桦树皮中含有多种三萜类活性物质，主要包括白桦脂醇、白桦脂酸和齐墩果酸，具有抗艾滋病毒和抑制肿瘤(神经瘤、黑色素瘤、宫颈瘤、乳腺瘤、白血病和骨髓瘤)的药理活性，且低毒而高效，被誉为最有潜力的新型药物制剂，其进一步开发、利用意义重大。

近年来，随着人口扩增和对天然药物需求的不断增大，更加加剧了天然药物生产和自然资源可持续发展之间的矛盾。细胞工程及代谢基因工程的发展使得人们能够通过对植物细胞代谢进行关键步骤和靶分子遗传修饰而使目标产物积累提高，相关研究已取得显著进展，拓展了有关植物代谢途径及其调控机制的认识。然而，次生代谢途径复杂，且不同途径之间有着繁复的交互作用。目前，除了黄酮途径外，对多数次生代谢途径的合成代谢机制及调控网络的认识仍有限，通过代谢基因工程提高植物天然产物含量的潜力还尚未被充分认识和挖掘。进一步深入研究不但有助于掌握植物次生代谢网络及分子调控规律，而且对生产实践中解决植物及其培养细胞目标次生产物低产问题均具有重要的现实意义。

随着后基因组工作的深入，转录因子(transcription factor，TF)作为改造植物代谢途径的工具，以其独有的“多点调控”优势，弥补了代谢工程操作中单个关键酶基因作用不足和多个关键酶基因可能产生组成性致死表达的缺点。另外，由于代谢途径通常有多个限速酶，而且限速步骤很难确定，通过转录因子基因的表达调控可以激活特定代谢支路中多个基因的协同表达，因此通过调节转录因子的表达量从整体角度调控代谢途径，进而提高目的代谢物的产量具有广阔的应用的前景。

发明内容

本发明的一个目的是提供BpbHLH9蛋白质的新用途。

本发明提供了BpbHLH9蛋白质在调控植物和/或微生物三萜类化合物合成中的应用。

本发明还提供了BpbHLH9蛋白质在调控植物和/或微生物三萜类前体化合物合成中的应用。

本发明还提供了BpbHLH9蛋白质在调控植物和/或微生物三萜类化合物含量中的应用。

本发明还提供了BpbHLH9蛋白质在调控植物和/或微生物三萜类前体化合物含量中的应用。

本发明还提供了BpbHLH9蛋白质在调控植物和/或微生物三萜途径关键基因表达中的应用。

上述应用中，所述BpbHLH9蛋白质是如下a)或b)或c)或d)所示的蛋白质：

a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；

b)在序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

c)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；

d)与序列2所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。

本发明的另一个目的是提供与BpbHLH9蛋白质相关的生物材料。

本发明提供了与BpbHLH9蛋白质相关的生物材料在调控植物和/或微生物三萜类化合物合成中的应用。

本发明还提供了与BpbHLH9蛋白质相关的生物材料在调控植物和/或微生物三萜类前体化合物合成中的应用。

本发明还提供了与BpbHLH9蛋白质相关的生物材料在调控植物和/或微生物三萜类化合物含量中的应用。

本发明还提供了与BpbHLH9蛋白质相关的生物材料在调控植物和/或微生物三萜类前体化合物含量中的应用。

本发明还提供了与BpbHLH9蛋白质相关的生物材料在调控植物和/或微生物三萜途径关键基因表达中的应用。

本发明还提供了与BpbHLH9蛋白质相关的生物材料在培育三萜类化合物含量提高的转基因植物中的应用。

本发明还提供了与BpbHLH9蛋白质相关的生物材料在培育三萜类化合物含量提高和/或三萜类前体化合物含量提高的转基因微生物中的应用。

上述应用中，所述与BpbHLH9蛋白质相关的生物材料为下述A1)至A12)中的任一种：

A1)编码BpbHLH9蛋白质的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；

A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；

A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；

A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；

A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；

A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；

A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系。

上述应用中，B1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：

1)其编码序列是序列1第69-1208位所示的cDNA分子或基因组DNA分子；

2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码BpbHLH9蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码BpbHLH9蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。

本发明还有一个目的是提供一种培育三萜类化合物含量提高的转基因植物的方法。

本发明提供的培育三萜类化合物含量提高的转基因植物的方法包括提高受体植物中BpbHLH9蛋白质的含量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的三萜类化合物含量高于所述受体植物。

上述方法中，所述提高受体植物中BpbHLH9蛋白质的含量和/或活性的方法为在受体植物中过表达BpbHLH9蛋白质；所述过表达的方法为将BpbHLH9蛋白质的编码基因导入受体植物中；所述BpbHLH9蛋白质的编码基因的核苷酸序列是序列1第69-1208位所示的DNA分子。

在本发明的具体实施例中，所述BpbHLH9蛋白质的编码基因是通过表达载体pCAMBIA1303-BpbHLH9导入受体植物中，所述表达载体pCAMBIA1303-BpbHLH9为将序列1第67-1205位所示的BpbHLH9核苷酸序列插入载体pCAMBIA1303(宝生物，产品目录号为VT1844)的Nco1酶切位点间，且保持pCAMBIA1303载体的其他序列不变得到的载体。

上述方法中，所述植物为含有三萜类化合物合成途径的植物，所述含有三萜类化合物合成途径的植物具体可为白桦Betula platyphylla Suk.。

本发明的最后一个目的是提供一种培育三萜类化合物含量提高和/或三萜类前体化合物含量提高的转基因微生物的方法。

本发明提供的培育三萜类化合物含量提高和/或三萜类前体化合物含量提高的转基因微生物的方法包括在受体微生物中过表达BpbHLH9蛋白质和/或BpSS蛋白质，得到转基因微生物的步骤；所述转基因微生物的三萜类化合物含量和/或三萜类前体化合物含量高于所述受体微生物。

上述方法中，所述过表达的方法为将BpbHLH9蛋白质和/或BpSS蛋白质的编码基因导入受体微生物中；所述BpbHLH9蛋白质的编码基因的核苷酸序列是序列1第69-1208位所示的DNA分子；所述BpSS蛋白质的编码基因的核苷酸序列是序列3第53-1294位所示的DNA分子。

在本发明的实施例中，所述BpbHLH9蛋白质的编码基因和BpSS蛋白质的编码基因是分别通过酵母表达载体pYES3-bHLH9和pYES2-SS导入受体微生物中；所述酵母表达载体pYES3-bHLH9为将序列1第24-1241位所示的BpbHLH9基因序列插入载体pYES3/CT(Invitrogen，产品目录号为V8253-20)的BamHI酶切位点间，且保持载体pYES3/CT的其他序列不变得到的载体；所述酵母表达载体pYES2-SS为序列3所示的DNA序列插入载体pYES2(Invitrogen，产品目录号为V825-20)的HindⅢ酶切位点间，且保持载体pYES2的其他序列不变得到的载体。

上述方法中，所述受体微生物为含有三萜类化合物合成途径的微生物，所述含有三萜类化合物合成途径的微生物为酵母；所述酵母具体可为酵母菌株INVSC1。

上述应用或方法中，所述三萜类化合物为总三萜、白桦脂醇、白桦脂酸或齐墩果酸；

所述三萜类前体化合物为角鲨烯。

所述三萜途径关键基因为HMGR基因和/或FPS基因和/或SS基因和/或SE基因和/或BPY基因和/或BPW基因。

实验证明：超量表达BpbHLH9基因可以提高转基因酵母和转基因白桦中三萜类物质及三萜类前体物质的含量，其中，对齐墩果酸含量的提高最为显著。在转基因白桦中的三萜途径关键酶基因(HMGR、FPS、SS、SE、BPY、BPW)的相对表达量均表现出不同程度的上调。表明BpbHLH9基因参与白桦三萜类化合物的合成，可以有效提高三萜途径关键基因的表达量和齐墩果酸、白桦脂酸及白桦脂醇的含量。

本申请的发明专利受国家自然科学基金(31570589)项目及中央高校基本科研业务费(257-2017DY02)资助。

附图说明

图1为BpbHLH9基因开放阅读框的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列。

图2为BpbHLH9氨基酸序列的保守结构域预测。

图3为BpbHLH9氨基酸序列和其它物种bHLH氨基酸序列同源性比对。

图4为BpbHLH9氨基酸系统进化树。

图5为重组酵母菌中总三萜的含量。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的SC-T诱导培养基配方(1L)：酵母基础氮源(YNB)1.7g(表1)、硫酸铵5g、棉籽糖10g、乳糖20g、L-精氨酸0.1g、L-半胱氨酸0.1g、L-赖氨酸0.1g、L-苏氨酸0.1g、L-天冬氨酸0.05g、L-异亮氨酸0.05g、L-苯丙氨酸0.05g、L-脯氨酸0.05g、L-丝氨酸0.05g、L-酪氨酸0.05g、L-缬氨酸0.05g、L-甲硫氨酸0.05g、L-尿嘧啶0.1g、L-亮氨酸0.1g、L-腺嘌呤0.1g、L-组氨酸0.05g。

下述实施例中的SC-U诱导培养基配方(1L)：酵母基础氮源(YNB)1.7g、硫酸铵5g、棉籽糖10g、乳糖20g、L-精氨酸0.1g、L-半胱氨酸0.1g、L-赖氨酸0.1g、L-苏氨酸0.1g、L-天冬氨酸0.05g、L-异亮氨酸0.05g、L-苯丙氨酸0.05g、L-脯氨酸0.05g、L-丝氨酸0.05g、L-酪氨酸0.05g、L-缬氨酸0.05g、L-甲硫氨酸0.05g、L-色氨酸0.1g、L-组氨酸0.05g、L-亮氨酸0.1g、L-腺嘌呤0.1g。

下述实施例中的SC-T-U诱导培养基配方(1L)：酵母基础氮源(YNB)1.7g、硫酸铵5g、棉籽糖10g、乳糖20g、L-精氨酸0.1g、L-半胱氨酸0.1g、L-赖氨酸0.1g、L-苏氨酸0.1g、L-天冬氨酸0.05g、L-异亮氨酸0.05g、L-苯丙氨酸0.05g、L-脯氨酸0.05g、L-丝氨酸0.05g、L-酪氨酸0.05g、L-缬氨酸0.05g、L-甲硫氨酸0.05g、L-组氨酸0.05g、L-亮氨酸0.1g、L-腺嘌呤0.1g。

表1、酵母基础氮源(单位：mg)

实施例1、BpbHLH9 cDNA全长克隆及生物信息学分析

1、BpbHLH9基因全长的获得

根据白桦转录组数据库中bHLH9基因已知序列两端设计特异引物，以白桦总RNA的反转录产物为模板，用bHLH9-F/R为引物进行PCR扩增，得到PCR产物。引物序列如下：

bHLH9-F：GGTGCCTCTCTTCTCGTGTT；

bHLH9-R：GCGGTAGATATGTCTCCTTCTG。

所得PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，检测到一条大小约为1300bp的特异性条带并对其进行测序。

测序结果显示，PCR扩增得到大小为1243bp的条带，其核苷酸序列如序列1所示，将序列1第69-1208位所示的基因命名为BpbHLH9。BpbHLH9基因编码蛋白的氨基酸序列如序列2所示，并将序列2所示的氨基酸序列命名为BpbHLH9蛋白(图1)。

2、BpbHLH9全长序列生物信息学分析

(1)BpbHLH9基因分子特征分析

以白桦组培苗RNA反转录的cDNA为模板，通过RT-PCR方法获得转录因子bHLH9基因cDNA全长序列，其长度为1243bp，利用NCBI的ORF finder功能预测该全长基因的开放阅读框(opening reading frame，ORF)，结果显示其有完整的ORF，核酸序列长为1140bp，编码379个氨基酸，利用BLASTn工具将此预测的cDNA全长序列进行序列比对，发现该核酸序列与胡桃(Juglans regia)转录因子bHLH67基因(LOC108982135)相似度为85％。

利用TMPred对bHLH9基因编码的BpbHLH9蛋白的跨膜结构进行预测分析。结果显示：BpbHLH9蛋白质存在3个跨膜螺旋，并预测在第64-84个和256-274个氨基酸链是由内向外跨膜；第255-271个氨基酸链是由外向内跨膜(图2)。

(2)BpbHLH9氨基酸序列同源性分析

利用NCBI网站上BLASTp功能对所得BpbHLH9基因所编码的氨基酸序列进行比对，得到与其具有同源性的其他物种的bHLH氨基酸序列，再利用Bioedit中的ClusterW方法进行多序列比对分析。并将BpbHLH9基因编码的氨基酸序列分别与可可树(XP_007051418.1)、大豆(KHN06372.1)、菜豆(XP_007135328.1)、木豆(KYP38825.1)、绿豆(XP_014521636.1)、苹果(XP_008376237.1)、白梨(XP_0 09366590.1)、蒺藜苜蓿(XP_013444538.1)、向日葵(XP_012490186.1)、木棉(KHF97772.1)、赤豆(KOM57214.)、木薯(OAY48927.1)、毛果杨(XP_006 375391.1)和鹰嘴豆(XP_004514916.2)等物种的bHLH氨基酸序列进行了Clustal W法同源性比对。

结果显示，BpbHLH9所编码的氨基酸序列与各物种bHLH编码的氨基酸序列具有较高的相似性，且大部分序列具有保守性。利用BLASTp进行序列比对，结果显示该氨基酸序列与野生大豆(Glycine soja)bHLH70转录因子(KHN06372.1)的相似度为61％(图3)。据此，推断BpbHLH9可能为bHLH转录因子家族的新成员。

(3)BpbHLH9氨基酸序列的系统进化树分析

将BpbHLH9基因编码的氨基酸序列与上述BLAST所得到的bHLH转录因子氨基酸序列进行比对后，再利用MEGA5.0软件中Neighbour-Joining(NJ)方法构建系统进化树。

结果显示：白桦的bHLH9转录因子单独在一个分支上，与白梨、苹果的bHLH57转录因子亲缘性较其他物种高。进一步表明本发明获得的白桦bHLH9基因(BpbHLH9基因)是bHLH家族中的新成员，为编码bHLH转录因子蛋白的新基因。

实施例2、转BpbHLH9酵母的获得及BpbHLH9对角鲨烯和总三萜含量的影响

一、转BpbHLH9酵母的获得

1、酵母表达载体的构建

将序列1第24-1241位所示的BpbHLH9基因序列插入载体pYES3/CT(Invitrogen，产品目录号为V8253-20)的BamHI酶切位点间，且保持载体pYES3/CT的其他序列不变，得到酵母表达载体pYES3-bHLH9。酵母表达载体pYES3-bHLH9表达BpbHLH9蛋白。

将序列3所示的DNA序列插入载体pYES2(Invitrogen，产品目录号为V825-20)的HindⅢ酶切位点间，且保持载体pYES2的其他序列不变，得到酵母表达载体pYES2-SS。其中，序列3第53-1294位为BpSS基因序列，其编码的BpSS蛋白为鲨烯合成酶。

2、转BpbHLH9酵母的获得

将酵母表达载体pYES3-bHLH9以PEG/LiAc方法转化酵母菌株INVSC1(Invitrogen，产品目录号为C810-00)，得到重组酵母INVSC1-pYES3-bHLH9。

将酵母表达载体pYES2-SS以PEG/LiAc方法转化酵母菌株INVSC1，得到重组酵母INVSC1-pYES2-SS。

将酵母表达载体pYES2-SS和pYES3-bHLH9以PEG/LiAc方法共同转化酵母菌株INVSC1，得到重组酵母INVSC1-pYES-SS-bHLH9。

将载体pYES2以PEG/LiAc方法转化酵母菌株INVSC1，得到对照酵母INVScl1-pYES2。

二、重组酵母的诱导培养

将重组酵母INVScl1-pYES2-SS、INVScl1-pYES3-bHLH9、INVScl 1-pYES-SS-bHLH9和对照酵母INVScl1-pYES2分别在SC-U、SC-T、SC-T-U和SC-U缺陷培养基中诱导培养(诱导剂为质量分数为2％的半乳糖)12h，得到培养物。

三、重组酵母细胞中角鲨烯含量的检测

1、三萜前体物质角鲨烯的提取

分别提取步骤二获得的培养物中的三萜前体物质角鲨烯。具体步骤如下：

(1)将烘干的培养物(酵母细胞)研磨成粉末，称取50mg，浸泡在5mL 10％的KOH-75％乙醇溶液中，50℃水浴15min，得到皂化液；

(2)将上述皂化液移入分液漏斗中，加入5mL正己烷，充分振荡，静置分层，取正己烷相，萃取分离3次。合并提取液，60℃水浴蒸干；

(3)用乙腈溶解蒸发皿上的残留物溶解，最后定容至2.5mL；

(4)每组3个平行实验。

2、角鲨烯含量检测

利用高效液相色谱法(HPLC)检测提取得到的待测样品中的角鲨烯含量。具体步骤如下：配制如下不同浓度的角鲨烯标准品溶液：6.96×10^-3mg/mL、6.42×10^-3mg/mL、5.35×10^-3mg/mL、4.28×10^-3mg/mL、3.21×10^-3mg/mL、2.14×10^-3mg/mL和1.61×10^-3mg/mL，采用高效液相色谱法对不同浓度的标准品溶液进行HPLC定量检测，并以角鲨烯标准品浓度作横坐标，以保留时间前后28.508min处的峰面积作纵坐标，根据浓度与峰面积的关系进行线性回归，并绘制标准曲线。其中，高效液相色谱法条件：色谱柱：HiQ sil C18V 4.6mm×250mm；流动相：乙腈溶液；荧光检测器：Waters公司600-717-2487色谱系统；检测波长：210nm；流速：1.0mL/min；柱温：25℃；进样量：20μL。根据标准曲线得到的标准曲线方程为：y＝10000000x-12009，R²＝0.9994(y为峰面积，x为角鲨烯含量)。结果表明：标准品在1.61-6.96mg/L浓度范围内呈良好线性关系。收集与角鲨烯标准品保留时间(保留时间约28.508min)一致的峰的洗脱液，得到各个酵母细胞中的角鲨烯含量。

检测结果表明：半乳糖诱导12h后，重组酵母INVScl1-pYES-SS-bHLH9细胞中的角鲨烯含量为0.328mg/g；对照酵母INVScl1-pYES2细胞中的角鲨烯含量为0.082mg/g；重组酵母INVScl1-pYES2-SS细胞中的角鲨烯含量为0.134mg/g；重组酵母INVScl1-pYES3-bHLH9细胞中的角鲨烯含量为0.165mg/g。重组酵母INVScl1-pYES-SS-bHLH9细胞中的角鲨烯含量分别为对照酵母INVScl1-pYES2、重组酵母INVScl1-pYES2-SS和重组酵母INVScl1-pYES3-bHLH9中的3.99、2.65和1.98倍。

四、重组酵母细胞中总三萜含量的检测

1、总三萜的提取

分别提取步骤二获得的培养物中的总三萜。具体步骤如下：

(1)将烘干的培养物(酵母细胞)研磨成粉末，称取0.050g样品，用4mL的95％乙醇浸泡24h，得到提取液；

(2)将提取液超声(超声频率为10kHz)40min，70℃水浴萃取1h；

(3)取上层溶液，即为总三萜提取液。

2、总三萜含量检测

利用紫外分光光度计检测提取得到的待测样品中的总三萜含量。具体步骤如下：

(1)精密称取0.0200g齐墩果酸，用95％的乙醇定容至100mL，使其浓度为0.2mg/mL，作为标准储备液；

(2)取上述标准储备液0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL和0.6mL分别置于5mL试管中，加热蒸干；

(3)再加入200μL 5％香草醛-冰醋酸和800μL高氯酸，70℃水浴15min，用流水冷却至室温；

(4)用乙酸乙酯定容至5mL，摇匀，在551nm处测吸光值，以标准品齐墩果酸浓度(X)为横坐标，吸光值(Y)为纵坐标，绘制标准曲线。标准曲线方程为y＝43.044x-0.6438，R²＝0.997。标准品齐墩果酸在4-32mg/L浓度范围内呈良好线性关系。

(5)精密移取100μL总三萜提取液，70℃水浴蒸干；

(6)加入200μL新配的5％香草醛-冰醋酸溶液和800μL高氯酸，摇匀，70℃水浴15min；

(7)流水冷却至室温，加乙酸乙酯定容至4mL，在551nm处测量吸光值；将吸光值代入标准曲线方程，计算得到待测样品中的总三萜含量。

(8)每组3个平行实验。

检测结果表明：重组酵母INVScl-pYES-SS-bHLH9细胞中总三萜含量为54.23mg/g，对照酵母INVScl1-pYES2细胞中的总三萜含量为49.13mg/g，比对照酵母INVScl-pYES2提高了10.39％；重组酵母INVScl-pYES-SS细胞和重组酵母INVScl-pYES-bHLH9细胞中的总三萜含量分别为51.33mg/g和52.07mg/g，分别比对照酵母INVScl-pYES2提高了4.49％和6.00％(图5)。酵母中转入BpbHLH9或BpSS基因均可以显著提高总三萜的含量，并且BpbHLH9和BpSS两个基因共同转化酵母细胞时，总三萜的含量的提高效果最佳。

以上结果表明：BpbHLH9基因参与三萜类前体物质角鲨烯和三萜类化合物的合成，具有调控三萜类前体物质角鲨烯和三萜类化合物的合成的功能。

实施例3、转BpbHLH9白桦的获得及BpbHLH9功能分析

一、转BpbHLH9白桦的获得

1、表达载体的构建

将序列1第67-1205位所示的BpbHLH9核苷酸序列插入载体pCAMBIA1303(优宝生物，产品目录号为VT1844)的Nco1酶切位点间，且保持pCAMBIA1303载体的其他序列不变，得到表达载体pCAMBIA1303-BpbHLH9。

2、重组菌的构建

将表达载体pCAMBIA1303-BpbHLH9转入LBA4404根癌农杆菌(北京鼎国生物技术有限公司，产品目录号为MCC026)中，得到重组菌LBA4404-pCAMBIA1303-BpbHLH9。

3、转BpbHLH9白桦的获得及鉴定

用含有表达载体pCAMBIA1303-BpbHLH9的LBA4404根癌农杆菌侵染白桦组培苗的叶片、叶柄和茎段，经脱菌与抗性筛选及再生系统的诱导成苗，共获得22株BpbHLH9抗性组培苗。为了进一步验证获得的抗性白桦苗是否为阳性转基因植株，对BpbHLH9抗性组培苗进行分子鉴定。具体步骤如下：

以获得的BpbHLH9抗性组培苗DNA为模板，采用GUS-F/R引物(GUS-F：ATTACGGCAAAGTGTGGGTC；GUS-R：TGACGCACAGTTCATAGAGATA)进行PCR鉴定，PCR扩增得到大小为486bp的产物的BpbHLH9抗性组培苗即为阳性转BpbHLH9白桦苗。最终从22株BpbHLH9抗性组培苗中筛选得到8株阳性转BpbHLH9白桦苗，分别将其命名为转BpbHLH9白桦株系bHLH9-1、bHLH9-3、bHLH9-4、bHLH9-7、bHLH9-8、bHLH9-10、bHLH9-11和bHLH9-18。

从上述鉴定的阳性转BpbHLH9白桦株系中，选取5个株系(bHLH9-1、bHLH9-7、bHLH9-8、bHLH9-10和bHLH9-18)作为实验组，选择未检测出目的条带的bHLH9-5株系作为对照组。利用实时荧光定量PCR方法分别对5株阳性转BpbHLH9白桦株系的BPbHLH9基因相对表达量进行检测。

结果表明：阳性转BpbHLH9白桦株系bHLH9-1、bHLH9-7、bHLH9-8、bHLH9-10和bHLH9-18中的BpbHLH9基因表达量显著上调，分别为对照组的5.99、6.85、8.29、4.21和6.48倍。其中BpbHLH9基因在阳性转BpbHLH9白桦株系bHLH9-7和bHLH9-8株系中的超量表达效果最好。选取阳性转BpbHLH9白桦株系bHLH9-7和bHLH9-8用于下述实验。

二、BpbHLH9的功能分析

1、转BpbHLH9白桦株系中三萜合成关键基因的表达

为研究BpbHLH9基因对三萜途径关键酶基因表达的影响，确定在白桦三萜合成中的功能，利用实时荧光定量PCR方法分别对阳性转BpbHLH9白桦株系bHLH9-7和bHLH9-8中的三萜合成途径相关基因HMGR、FPS、SS、SE、BPY、BPW的相对表达量进行检测。并以野生型白桦组培苗为对照。引物序列如表1所示。

表1、三萜合成相关基因的荧光定量PCR引物

基因名称	引物序列(5'-3')
		TU-F	TCAACCGCCTTGTCTCTCAGG
TU-R	TGGCTCGAATGCACTGTTGG
		FPS-F	CCGCGGGATCTCTGTCATTGA
FPS-R	CCAAGGGTGCAGGCAAGAAAT
		BPY-F	CTGCTCAGTTCCTTCAAGTC
BPY-R	TTGCCCATGCAGTATGTACC
		BPW-F	TTGAAGACGTGCAAGAACCTG
BPW-R	CATCAATGAGGGATAACAAGG
		HMGR-F	GTCATCGGCATCTCCGGTAA
HMGR-R	ATGTTACTGGCGTGGGCATT
		SE-F	GCAGACCCTTCACCCATCTTGTTT
SE-R	CCACAGTCATTCCTCCCCCAG
		SS-F	CAGAGGTGTAGTGAAAATGAGGCG
SS-R	GGTCGTTTGGTAGAGAGATAAGCA

结果表明：阳性转BpbHLH9白桦株系bHLH9-7和bHLH9-8中，三萜途径关键酶基因HMGR、FPS、SS、SE、BPY和BPW的相对表达量均表现出不同程度的上调，其中上调效果最为显著的是BPY基因，分别是对照组的26.15倍和41.76.倍。其次分别为HMGR、SS、SE、BPW四个基因，HMGR、SS、SE、BPW四个基因的上调效果相似，最后为FPS基因。

2、转BpbHLH9白桦株系中白桦脂酸、齐墩果酸及白桦脂醇的含量检测

为进一步确定BpbHLH9基因在三萜合成中的功能，选取转BpbHLH9白桦株系bHLH9-7和bHLH9-8进行下述实验：

(1)取转BpbHLH9白桦株系的茎段，在含有5mg/L 6-BA的IS培养基中诱导形成愈伤组织；

(2)将烘干的转BpbHLH9白桦愈伤组织研磨成粉末，称取0.30g，浸泡在20mL的盐酸乙醇溶液(体积比2:8)中，90℃加热回流3h，充分振荡，冷却后过滤，收集滤液；然后，取上述过滤液15mL，加入15mL蒸馏水，80℃的水浴蒸发至乙醇全部挥发；再用20mL的乙醚萃取混合物，重复3次，合并萃取液，40℃水浴蒸干；用甲醇溶解蒸发皿上的残留物溶解，得到提取物，最后定容至2.5mL。

(3)利用HPLC分别检测步骤(2)获得的提取物中的白桦脂酸、齐墩果酸及白桦脂醇含量，并以野生型白桦的愈伤组织作为对照。具体步骤如下：

1)白桦脂酸线性关系考察

精密吸取浓度为0.5mg/mL的白桦脂酸标准品溶液0.2mL、0.5mL、1mL、2mL、3mL、4mL和5mL，分别置于5mL容量瓶中，加95％乙醇稀释至刻度，摇匀，采用高效液相色谱法对不同浓度的标准品溶液进行HPLC定量检测。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，根据浓度与峰面积的关系进行线性回归，并绘制标准曲线。白桦脂酸回归方程为：y₁＝9×10⁶x+68020，R²＝0.9994。结果表明：白桦脂酸在0.2-5.0μg范围内具有良好的线性关系。

2)齐墩果酸线性关系考察

精密吸取浓度为0.5mg/mL的齐墩果酸标准品溶液0.2mL、0.5mL、1mL、2mL、3mL、4mL和5mL，分别置于5mL容量瓶中，加95％乙醇稀释至刻度，摇匀，采用高效液相色谱法对不同浓度的标准品溶液进行HPLC定量检测。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，根据浓度与峰面积的关系进行线性回归，并绘制标准曲线。齐壤果酸回归方程为：y₂＝10⁷x+43301，R²＝0.9993。结果表明：齐墩果酸在0.2-5.0μg范围内具有良好的线性关系。

3)白桦脂醇线性关系考察

精密吸取浓度为0.5mg/mL的白桦脂醇标准品溶液0.2mL、0.5mL、1mL、2mL、3mL、4mL和5mL，分别置于5mL容量瓶中，加95％乙醇稀释至刻度，摇匀，采用高效液相色谱法对不同浓度的标准品溶液进行HPLC定量检测。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，根据浓度与峰面积的关系进行线性回归，并绘制标准曲线。白桦脂醇回归方程为：y₃＝10⁷x+63763，R²＝0.9995。结果表明：白桦脂醇在0.2-5.0μg范围内具有良好的线性关系。

上述高效液相色谱法条件：色谱柱：HiQ sil C18V 4.6mm×250mm；流动相：乙腈溶液；荧光检测器：Waters公司600-717-2487色谱系统；检测波长：210nm；流速：1.0mL/min；柱温：25℃；进样量：20μL。

结果表明：转BpbHLH9白桦系BpbHLH9-7愈伤组织中白桦脂酸、齐墩果酸及白桦脂醇的含量分别为0.6355mg/g、0.2348mg/g和0.3495mg/g。转BpbHLH9白桦系BpbHLH9-8愈伤组织中的白桦脂酸、齐墩果酸及白桦脂醇含量分别为0.6463mg/g、0.3042mg/g和0.3925mg/g。野生型白桦愈伤组织中的白桦脂酸、齐墩果酸及白桦脂醇的含量分别为0.5969mg/g、0.1615mg/g和0.3190mg/g。转BpbHLH9白桦株系bHLH9-7和bHLH9-8愈伤组织中白桦脂酸、齐墩果酸及白桦脂醇的含量均高于野生型对照。与野生型对照相比，转BpbHLH9白桦株系bHLH9-7愈伤组织中的白桦脂酸、齐墩果酸及白桦脂醇含量分别提高了9.49％、45.35％和9.56％。与野生型对照相比，转BpbHLH9白桦株系bHLH9-8愈伤组织中的白桦脂酸、齐墩果酸及白桦脂醇含量分别提高了11.35％、88.34％和23.02％。说明超量表达BpbHLH9基因可以提高三萜类化合物齐墩果酸、白桦脂酸及白桦脂醇的含量，其中，对齐墩果酸含量的提高效果最大，其次是白桦脂醇和白桦脂酸。

以上表明，BpbHLH9基因参与白桦三萜类化合物的合成，可以提高三萜途径关键基因的表达和三萜类化合物齐墩果酸、白桦脂酸及白桦脂醇的含量。本发明为白桦三萜类物质代谢工程遗传途径改造和有效成分进一步利用奠定了坚实基础。

序列表

<110>东北林业大学

<120>白桦bHLH9蛋白在调控三萜类化合物合成中的应用

<160>3

<210>1

<211>1243bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

tgcggtagat atgtctcctt ctgcttcttg ggggttacat ttattgcaat tgttttgtta 60

gtataactat ggaatgttgg tcgccgaggg agaaggagag acaatttaag gctcacttca 120

acaaccgctc agctgaaatg gagggtctcc aaggaccagt tactccctgc ttctttgggg 180

agcattcagg catggcttgt ccagagcaag aatttatcat cgctacagaa aggggagaac 240

agcacttttc agccccgatg ttagagaaca caattccatt tcttcagatg ctacaaagtg 300

tgggatcccc acagtacttt ttgcccttca aggagcccag ctttcagaca ctgttgagat 360

tacagcactt taagaagcca tgggaggatt acactcgcat gcctgaaatg gaaacccaaa 420

ttcaggccat agagcttgag agctgcgtca cccatgacat aacggagctg caatattcac 480

cggtcaaatc cgaaaccatg gaccttcaaa acccacatcc ggcttcacgt ctagcagtca 540

ccggccggga acgaagaaag cgaaagcgga caaggccgac caagaacaag gaagaagtag 600

agagccagcg catgacccac attgccgtgg aacgcaaccg gagacggcaa atgaatgacc 660

atctcaacgt cctcaagtcc ctcatgcccg cctcctatat tcaaaggggt gaccaagcgt 720

ctatcatcgg aggtgcaata gactttgtga aggaactgga gcagctactt cattcccttg 780

aagcgaaaaa gagaatgaca aaaaatcaag aagcggggga cggctccagc tccgtctccg 840

gcgcggtggc tgtttcctcc accggttttt ttatatcgcc gcaatgtaca gttggatcgg 900

aggaaggcaa ctatggggag gaggtgaagg cggagaacaa gtctgaggtg gcagatatag 960

aggttactgt gattcaaacc catgtgaact tgaaaattca atgccgacgg cggccggggc 1020

tgttgctgaa agccattgtt gcactggagg atctccggct aacagttttg cacctcaaca 1080

tcacctcctc agattcctcg gttctttact ctttcaatct caagatagag gacgagtgta 1140

agctaggatc cgctgatgag atagcgtcga ccgttcatca aatattaagc ttcatcaacg 1200

gtagctgatt gttcaaagat tttcaacacg agaagagagg cac 1243

<210>2

<211>379

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

Met Glu Cys Trp Ser Pro Arg Glu Lys Glu Arg Gln Phe Lys Ala His

1 5 10 15

Phe Asn Asn Arg Ser Ala Glu Met Glu Gly Leu Gln Gly Pro Val Thr

20 25 30

Pro Cys Phe Phe Gly Glu His Ser Gly Met Ala Cys Pro Glu Gln Glu

35 40 45

Phe Ile Ile Ala Thr Glu Arg Gly Glu Gln His Phe Ser Ala Pro Met

50 55 60

Leu Glu Asn Thr Ile Pro Phe Leu Gln Met Leu Gln Ser Val Gly Ser

65 70 75 80

Pro Gln Tyr Phe Leu Pro Phe Lys Glu Pro Ser Phe Gln Thr Leu Leu

85 90 95

Arg Leu Gln His Phe Lys Lys Pro Trp Glu Asp Tyr Thr Arg Met Pro

100 105 110

Glu Met Glu Thr Gln Ile Gln Ala Ile Glu Leu Glu Ser Cys Val Thr

115 120 125

His Asp Ile Thr Glu Leu Gln Tyr Ser Pro Val Lys Ser Glu Thr Met

130 135 140

Asp Leu Gln Asn Pro His Pro Ala Ser Arg Leu Ala Val Thr Gly Arg

145 150 155 160

Glu Arg Arg Lys Arg Lys Arg Thr Arg Pro Thr Lys Asn Lys Glu Glu

165 170 175

Val Glu Ser Gln Arg Met Thr His Ile Ala Val Glu Arg Asn Arg Arg

180 185 190

Arg Gln Met Asn Asp His Leu Asn Val Leu Lys Ser Leu Met Pro Ala

195 200 205

Ser Tyr Ile Gln Arg Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ile Gly Gly Ala Ile

210 215 220

Asp Phe Val Lys Glu Leu Glu Gln Leu Leu His Ser Leu Glu Ala Lys

225 230 235 240

Lys Arg Met Thr Lys Asn Gln Glu Ala Gly Asp Gly Ser Ser Ser Val

245 250 255

Ser Gly Ala Val Ala Val Ser Ser Thr Gly Phe Phe Ile Ser Pro Gln

260 265 270

Cys Thr Val Gly Ser Glu Glu Gly Asn Tyr Gly Glu Glu Val Lys Ala

275 280 285

Glu Asn Lys Ser Glu Val Ala Asp Ile Glu Val Thr Val Ile Gln Thr

290 295 300

His Val Asn Leu Lys Ile Gln Cys Arg Arg Arg Pro Gly Leu Leu Leu

305 310 315 320

Lys Ala Ile Val Ala Leu Glu Asp Leu Arg Leu Thr Val Leu His Leu

325 330 335

Asn Ile Thr Ser Ser Asp Ser Ser Val Leu Tyr Ser Phe Asn Leu Lys

340 345 350

Ile Glu Asp Glu Cys Lys Leu Gly Ser Ala Asp Glu Ile Ala Ser Thr

355 360 365

Val His Gln Ile Leu Ser Phe Ile Asn Gly Ser

370 375

<210>3

<211>1588bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

acatggggtg cgtgtgtttc gtagtttcac taaatcggat ttgagaggag caatggggag 60

tttgggtgcg attctgagaa acccagatga cttttacccg ttgctgaaga tgaagatggc 120

ggcgaggcac gccgagaggc agatccctcc ggagccacac tgggccttct gctacaccat 180

gctcaacaag gtctctcgca gcttcgccat ggttattcag cagctcagtc ccgagcttcg 240

caacgctata tgcatatttt atttggttct tcgagccctg gatactgttg aggatgacac 300

aagcatacct acagatgtta aagtgccaat cctgaaagct tttcatcgtc acatatatga 360

ttgcgagtgg catttttcat gtggtacaaa ggaatacaaa gttcttatgg accaatttca 420

tcatgtatcg actgcttttc tggagcttga aaagagttat caggaggcaa ttgaggaaat 480

taccaaaaga atgggtgcag gaatggcaaa atttatatgc aaggaggtgg agacaattga 540

tgactatgat gaatattgcc actatgtagc aggacttgtt ggactaggtt tgtccaaact 600

tttccatgcc tctgggtcag aagatttggc atcagatcat ctctcaaatt caatgggttt 660

atttcttcag aaaacaaaca taatacgaga ttatttggag gatattaatg agataccaaa 720

gtctcgcatg ttctggcctc gtcagatctg gagtaaatat gttaacaaac ttgaggactt 780

gaaatatgag gaaaactctg aaaaggcagt gcaatgtttg aatgacatgg tcactaatgc 840

tttgatacat gcggaagatt gcttgaaata catgtctgct ttacgagatc cgacaatttt 900

tcgattttgt gctatccccc agatcatggc aattggaaca cttgaattat gctacaacaa 960

cattgaagtc ttcagaggtg tagtgaaaat gaggcgtggt cttactgcca aactcattga 1020

tcgaacaaaa acgatggcag atgtctatgg tgctttcttt gatttctcct gtatgttgaa 1080

gttgaaggtt gacaagaatg accctaatgc aacaaaaacg ttgaacaggc tggaaggaat 1140

acagaaaacc tgccgggatt cgggagtcct taacaagaga aaatcttaca taatcaggag 1200

cgagcctaga ttcaatccgg ctcttattgc tatactgtta attatattgt ccatcatttt 1260

tgcttatctc tctaccaaac gaccaaataa ttaagaactc gaaggtttct tcaaatttcc 1320

ctgagaactt gagttcatgg ctggctggta ccaagtgcat gctttgttcc atgaaacttg 1380

atttatgttt gtattatttt aatggttatg cttggaggtt gtatatctac caatggaggt 1440

tgtttatcta ccaatggagg tgtcaaatac agttcctgaa gtatccatcc tgttgtagaa 1500

aactcttacc tgtttgcaat tctggacttg ttaacacatc aaatgaactc ctgtttagca 1560

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 1588

Claims

1.BpbHLH9蛋白质在调控植物和/或微生物三萜类化合物合成中的应用；

或，BpbHLH9蛋白质在调控植物和/或微生物角鲨烯合成中的应用；

或，BpbHLH9蛋白质在调控植物和/或微生物三萜类化合物含量中的应用；

或，BpbHLH9蛋白质在调控植物和/或微生物角鲨烯含量中的应用；

或，BpbHLH9蛋白质在调控植物三萜途径关键基因表达中的应用；

所述BpbHLH9蛋白质是如下a）或b）所示的蛋白质：

a）氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；

b）在序列表中序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

所述植物为白桦；

所述微生物为酵母。

2.与权利要求1中所述的BpbHLH9蛋白质相关的生物材料在调控植物和/或微生物三萜类化合物合成中的应用；

或，与权利要求1中所述的BpbHLH9蛋白质相关的生物材料在调控植物和/或微生物角鲨烯合成中的应用；

或，与权利要求1中所述的BpbHLH9蛋白质相关的生物材料在调控植物和/或微生物三萜类化合物含量中的应用；

或，与权利要求1中所述的BpbHLH9蛋白质相关的生物材料在调控植物和/或微生物角鲨烯含量中的应用；

或，与权利要求1中所述的BpbHLH9蛋白质相关的生物材料在调控植物三萜途径关键基因表达中的应用；

或，与权利要求1中所述的BpbHLH9蛋白质相关的生物材料在培育三萜类化合物含量提高的转基因植物中的应用；

或，与权利要求1中所述的BpbHLH9蛋白质相关的生物材料在培育三萜类化合物含量提高和/或角鲨烯含量提高的转基因微生物中的应用；

所述与权利要求1中所述的BpbHLH9蛋白质相关的生物材料为下述A1）至A4）中的任一种：

A1）编码BpbHLH9蛋白质的核酸分子；

A2）含有A1）所述核酸分子的表达盒；

A3）含有A1）所述核酸分子的重组载体；

A4）含有A2）所述表达盒的重组载体；

所述植物为白桦；

所述微生物为酵母。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：A1）所述核酸分子为序列表中序列1第69-1208位所示的cDNA分子或基因组DNA分子。

4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述三萜途径关键基因为HMGR基因和/或FPS基因和/或SS基因和/或SE基因和/或BPY基因和/或BPW基因。

5.一种培育三萜类化合物含量提高的转基因植物的方法，包括提高受体植物中权利要求1中所述的BpbHLH9蛋白质的含量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的三萜类化合物含量高于所述受体植物；

所述植物为白桦。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述提高受体植物中权利要求1中所述的BpbHLH9蛋白质的含量和/或活性的方法为在受体植物中过表达权利要求1中所述的BpbHLH9蛋白质；

所述过表达的方法为将权利要求1中所述的BpbHLH9蛋白质的编码基因导入受体植物中；

所述BpbHLH9蛋白质的编码基因的核苷酸序列是序列表中序列1第69-1208位所示的DNA分子。

7.一种培育三萜类化合物含量提高和/或角鲨烯含量提高的转基因微生物的方法，包括在受体微生物中过表达权利要求1中所述的BpbHLH9蛋白质和BpSS蛋白质，得到转基因微生物的步骤；所述转基因微生物的三萜类化合物含量和/或角鲨烯含量高于所述受体微生物；

所述过表达的方法为将权利要求1中所述的BpbHLH9蛋白质的编码基因和BpSS蛋白质的编码基因导入受体微生物中；

所述权利要求1中所述的BpbHLH9蛋白质的编码基因的核苷酸序列是序列表中序列1第69-1208位所示的DNA分子；

所述BpSS蛋白质的编码基因的核苷酸序列是序列表中序列3第53-1294位所示的DNA分子；

所述微生物为酵母。

8.根据权利要求1-3中任一所述的应用或权利要求5-7中任一所述的方法，其特征在于：所述三萜类化合物为白桦脂醇、白桦脂酸或齐墩果酸。