CN108753837A

CN108753837A - 一种高血脂或动脉粥样硬化兔模型的构建方法及sgRNA

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Publication number: CN108753837A
Application number: CN201810618328.8A
Authority: CN
Inventors: 成勇; 梁景岩; 吴岱津; 袁婷婷; 张婷; 周敏雅; 陆睿
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2018-06-15
Filing date: 2018-06-15
Publication date: 2018-11-06
Anticipated expiration: 2038-06-15
Also published as: CN108753837B

Abstract

本发明公开了一种高血脂或动脉粥样硬化兔模型的构建方法及sgRNA。构建方法包括：以兔LDLR基因第2外显子或/和第7外显子为靶向，删除LDLR基因部分序列，使得兔子呈现高血脂和动脉粥样硬化的表型。设计的sgRNA引导序列如SEQ ID NO.1～4所示，本发明对兔特定基因的特定位点进行编辑，可成功获得自发性的高血脂和动脉粥样硬化兔，提供了高血脂和动脉粥样硬化兔模型的建立方法，可用于降血脂功效研究，如类似药物的筛选与评价，和对AS病因病机的探讨、治疗对策的探索和防治药物的研发。

Description

一种高血脂或动脉粥样硬化兔模型的构建方法及sgRNA

技术领域

本发明属于生命科学和生物技术领域，特别涉及一种基于基因敲除兔子高血脂和动脉粥样硬化模型的构建方法，主要是LDLR突变位点的选择，用于模拟人体高血脂和动脉粥样硬化，同时出现总胆固醇和甘油三酯异常增高的兔模型的建立方法。

背景技术

脂质代谢紊乱引起高血脂症，主要表现为血浆总胆固醇(TC)，甘油三酯(TG)，低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)升高，现有报道表明，高血脂症与动脉粥样硬化、冠心病、高血压、糖尿病等疾病的发生有关。原发性高血脂症的因素很多，如遗传因素、饮食结构、生活习惯、神经因素等。越来越多的报道显示家族性高血脂与LDLR遗传突变有连锁关系。

LDLR主要参与VLDL、IDL和LDL的分解代谢，近年来研究表明低密度脂蛋白受体(LDLR)基因突变导致LDLR缺陷是高胆固醇血症的主要发病原因之一，LDLR基因变异，可导致LDLR数量及生物活性的异常，引起血清TC浓度大幅度升高，在组织过度沉积，最终导致动脉粥样硬化(As)。世界各地陆续发现LDLR基因突变的种类已超过1500多种。

动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是以高血脂症为病理基础所导致的心脑血管疾病，尤其是斑块脱落后发生的急性心肌梗死和脑卒中已经成为重要的致死和致残性疾病。因此，高血脂和动脉粥样硬化的研究日益广泛与深入，尤其是对这类疾病的病因、病理、基因调控机制、治疗试验和相关的药物试验等成为心脑血管病的研究主题，由此而衍生对该类疾病的高品质动物模型的需求已经迫在眉睫，尤其是对自发性高血脂动脉粥样硬化模型的需求更加迫切。

目前用于研究高血脂和动脉粥样硬化的动物模型绝大部分是通过高脂肪和高胆固醇日粮喂养法，虽然这种方法比较简单，但此法单纯以提高LDL-C水平来实现动物造模(动物实验显示如LDL-C＜80mg/mL则引起动脉粥样硬化)，实验动物体内的LDLR和PCSK9等处于正常表达状态，因此，单一性高脂肪和高胆固醇日粮制备的高血脂动脉粥样硬化模型与人类疾病有一定差异，这种差异将一定程度影响发病机制的探讨，治疗和药理试验的效果判断。

大样本、长时间的观察不同药物治疗破裂斑块是当前研究的特点，迫切需要我们建立操作简单、成本低、成活率高、耗时短、斑块破裂及血栓形成发生率高，且与人类破裂斑块相似的动物模型。因此，研制自发性高血脂动脉粥样硬化及斑块破裂和血栓形成动物模型是当前心脑血管疾病研究的当务之急。

LDLR是脂代谢相关蛋白，LDLR属于一种内吞性受体，系低密度脂蛋白受体基因家族中的一员。由于其能够与多种结构及功能各异的配体相互作用,不仅可以对血脂的动态平衡及纤溶功能进行稳定调节，而且能参与多种生长因子、细胞激酶生物学效应的发挥。近来有研究表明:LDLR与动脉粥样硬化发生发展的多个环节密切相关，研究LDLR与血脂代谢的关系有临床意义。

兔LDLR基因结构研究较少，从基因序列分析来看，与人同源性为75％以上。LDLR前体含847个氨基酸，同样含有18个外显子和17个内含子，基因组全长13kb以上，cDNA全长3.16kb。

动脉粥样硬化(Atherosclerosis，As)作为心血管疾病发病的病理基础，是对人类健康的直接杀手。在人类的心血管疾病的研究显示，机体血清总胆固醇(Total Cholest-erol，TC)或低密度脂蛋白胆固醇(Low density lipoprotein cholesterin，LDL-C)浓度升高是动脉粥样硬化性心血管疾病的独立危险因素之一。

研究在高血脂和动脉粥样硬化病理基础上的斑块脱落和血栓形成的触发过程对心肌梗死和脑卒中的预防和治疗具有指导意义,对评估动脉粥样硬化斑块稳定性，从而确定缺血性脑卒中的治疗及预防方案也具有重要的意义。因此，建立高血脂家兔模型，研究动脉粥样硬化的发生机制及制备动脉粥样硬化斑块脱落模型将为人类血脂异常疾病提供新的治疗靶点，并为新一代药物筛选提供新思路。因此，本专利对临床心脑血管病研究和治疗预防具有重要意义，对降血脂和血管斑块形成的药物研究开发也具有显著的社会经济效益。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的问题，本发明是提供一种自发性的高血脂或动脉粥样硬化兔模型的构建方法，本发明的目的之二是提供相关sgRNA、载体、PAM序列、试剂盒。

技术方案：本发明所述的高血脂或动脉粥样硬化兔模型的构建方法，包括：以兔LDLR基因第2外显子或/和第7外显子为靶向，破坏或删除LDLR基因部分DNA序列，使得兔子呈现高血脂或动脉粥样硬化的表型。

具体的，以兔LDLR基因第2外显子转录起始位点4265-4341bp序列或/和第7外显子转录起始位点7041-7155bp序列为靶向。本发明通过基于CRISPR/Cas9系统对兔靶向兔低密度脂蛋白受体基因(LDLR，genebank登录号为：NW_003159540.1)上述靶向位点进行基因编辑，发现可引发自发性的兔子胆固醇和甘油三酯异常增高，使得兔子呈现高血脂表型，血管内壁出现粥样斑块并进一步导致动脉粥样硬化。

通过基因编辑的方法构建高血脂或动脉粥样硬化兔模型的方法包括如下步骤：

(1)根据靶向位点设计sgRNA，与CRISPR/Cas9质粒载体相连构建CRISPR/Cas9二合一质粒；

(2)以构建的CRISPR/Cas9二合一质粒为模板，扩增sgRNA和Cas9mRNA的转录模板，根据转录模板体外转录出sgRNA和Cas9mRNA；

(3)将转录出的sgRNA和Cas9mRNA共同导入受精卵，进一步获得高血脂或动脉粥样硬化兔。

基因编辑时，设计sgRNA的模板序列选自如下任意一条或多条(分别对应序列表中的SEQ ID NO.17～22)：

sgRNA-1模板：

5’-CAGGGGACAAGTGTGGCCGGAATGAGTTCCAATGCCGGAAC-3’；

sgRNA-2模板：

5’-ATGCCGGAACGGGAAGTGTATCTCCTACAAGTGGGTGTGTGAC-3’；

sgRNA-3模板：

5’-CGGTGCAGCGACCAATGAGTGCATGCGGGGCAACGGAGGCTGC-3’；

sgRNA-4模板：

5’-GGCCACGAGTGTCATTGTCCCAAAGGCTACCGGCTGGTGGACCA-3’。

根据上述模板设计的sgRNA的引导序列如下，选自任意一条：

sgRNA-1的引导序列：5’-GCCACACTTGTCCCCTGCTGCGG-3’；

sgRNA-2的引导序列：5’-GCCGGAATGAGTTCCAATGCCGG-3’；

sgRNA-3的引导序列：5’-AATGAGTGCATGCGGGGCAACGG-3’；

sgRNA-4的引导序列：5’-GACACTCGTGGCCGATTCTGAGG-3’；上述sgRNA的引导序列分别对应序列表中的SEQ ID NO.1～4。其中sgRNA-1的引导序列靶向第二外显子转录起始位点4265-4284bp，sgRNA-2的引导序列靶向第二外显子转录起始位点4283-4302bp，sgRNA-3的引导序列靶向第七外显子转录起始位点7055-7074bp，sgRNA-4的引导序列靶向第七外显子转录起始位点7102-7121bp。利用该sgRNA可特异性对靶向位点进行编辑，并成功构建高血脂和动脉粥样硬化模型。

CRISPR/Cas9质粒载体可采用常规的用于动物基因组编辑的CRISPR/Cas9质粒载体，例如可采用南京尧顺禹生物科技有限公司(CRISPR/Cas9二合一质粒试剂盒)的YSYCRISPR/Cas9二合一质粒载体。构建CRISPR/Cas9二合一质粒的具体方法为：根据sgRNA设计引物，引物退火后连入CRISPR/Cas质粒载体。根据sgRNA-1～sgRNA-4设计的引物依次分别为(分别对应序列表中的SEQ ID NO.9～16)：

F-rabbit-1：5’-TATAGCCACACTTGTCCCCTGCTG-3’

R-rabbit-1：5’-AAACCAGCAGGGGACAAGTGTGGC-3’；

F-rabbit-2：5’-TATAGCCGGAATGAGTTCCAATGC-3’

R-rabbit-2：5’-AAACGCATTGGAACTCATTCCGGC-3’；

F-rabbit-3：5’-TATAgAATGAGTGCATGCGGGGCAA-3’

R-rabbit-3：5’-AAACTTGCCCCGCATGCACTCATTC-3’；

F-rabbit-4：5’-TATAGACACTCGTGGCCGATTCTG-3’

R-rabbit-4：5’-AAACCAGAATCGGCCACGAGTGTC-3’

体外转录的sgRNA1～4依次分别为(分别对应序列表中的SEQ ID NO.5～8)：

sgRNA1：

GCCACACUUGUCCCCUGCUGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuuu

sgRNA2：

GCCGGAAUGAGUUCCAAUGCguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuuu

sgRNA3：

GAAUGAGUGCAUGCGGGGCAAguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuuu

sgRNA4：

GACACUCGUGGCCGAUUCUGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuuu。

将sgRNA和Cas9mRNA可采用显微注射的方法导入受精卵雄原核，然后进行胚胎移植，在获得的突变仔兔中筛选表型为高血脂或动脉粥样硬化。步骤(3)导入cas9 mRNA和sgRNA混合液，其中cas9 mRNA的终浓度分别为40～50ng/μL，sgRNA的终浓度为10～20ng/μL。

导入受精卵的sgRNA可以是sgRNA-1～sgRNA-4中的任意一条或几条。

本发明还提供了一种特异性靶向兔LDLR基因的sgRNA，所述的sgRNA靶向LDLR基因第2外显子转录起始位点4265-4341bp序列或者LDLR基因第7外显子转录起始位点7041-7155bp序列。

进一步的，sgRNA的引导序列如SEQ ID NO.1～4任意一条所示。

本发明还提供了所述特异性编辑动物LDLR基因的sgRNA的转录本，如SEQ ID NO.5～8任意一条所示。

本发明还提供了所述特异性编辑动物LDLR基因的sgRNA的载体、细胞。

本发明还提供了所述特异性编辑动物LDLR基因的sgRNA的PAM序列，序列如下：

sgRNA-1的PAM序列：5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCGG-3’；

sgRNA-2的PAM序列：5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCGG-3’；

sgRNA-3的PAM序列：5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCGG-3’；

sgRNA-4的PAM序列：5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAGG-3’。

本发明还提供了构建高血脂或动脉粥样硬化兔模型的试剂盒，含有下述成分中的至少一种：

(1)如上所述的sgRNA或其转录模板；

(2)cas9mRNA或其转录模板。

有益效果：理想的动物模型是实验研究的必备条件，动脉粥样模型有先天性、转基因、化学诱导等，基因编辑时位点选择至关重要，其不仅仅影响编辑效率，更重要的是不同的位点选择可能会导致不同的表型变化，甚至可能发生基因突变未导致表型变化的情况。本发明对兔特定基因的特定位点进行编辑，可成功获得自发性的高血脂或动脉粥样硬化兔，提供了高血脂或动脉粥样硬化兔模型的建立方法，可用于降血脂功效研究，如类似药物的筛选与评价，和对AS病因病机的探讨、治疗对策的探索和防治药物的研发。

附图说明

图1为含sgRNA的CRISPR/Cas9二合一质粒的测序结果。

图2为LDLR-/-突变兔和正常兔血清的琼脂糖电泳；

图3为LDLR-/-突变兔和正常兔血清载脂蛋白westernblot结果；

图4为LDLR-/-模型组兔主动脉苏丹红IV染色结果；

图5为正常兔主动脉苏丹红IV染色结果；

图6为LDLR-/-模型组兔HE染色(x40)结果；

图7为正常兔HE染色(x40)结果；

图8为LDLR-/-模型组兔颈动脉SMC免疫组化结果；

图9为正常兔颈动脉SMC免疫组化结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1基于CRISPR/Cas9的LDLR基因突变兔模型的构建

1.基因敲除位点设计

针对兔LDLR基因的第二外显子转录超始位点4265-4341bp靶序列和第7外显子转录起始位点基因组序列7041-7155bp靶序列设计sgRNA的引导序列。

如表1，共设计四条sgRNA的引导序列，其中sgRNA-1的引导序列靶向第二外显子转录起始位点4265-4284bp，sgRNA-2的引导序列靶向第二外显子转录起始位点4283-4302bp，sgRNA-3的引导序列靶向第七外显子转录起始位点7055-7074bp，sgRNA-4的引导序列靶向第七外显子转录起始位点7102-7121bp。

表1LDLR基因敲除靶位点

引导序列如下：

sgRNA-1的引导序列：5’-GCCACACTTGTCCCCTGCTGCGG-3’；

sgRNA-2的引导序列：5’-GCCGGAATGAGTTCCAATGCCGG-3’；

sgRNA-3的引导序列：5’-AATGAGTGCATGCGGGGCAACGG-3’；

sgRNA-4的引导序列：5’-GACACTCGTGGCCGATTCTGAGG-3’。

根据确定sgRNA引导序列，设计对应的4对退火引物。按照表2，送至引物合成公司进行合成。

表2兔sgRNA引物设计

2.sgRNA和CRISPR/Cas9二合一质粒构建及体外转录

质粒构建采用CRISPR/Cas9二合一质粒试剂盒，产品编号：k-020；产品名称：CRISPR/cas9二合一质粒构建试剂盒；产品特征：第三代基因组编辑工具。出品厂家：尧顺禹生物(YSY Biotech)南京尧顺禹生物科技有限公司，http://www.njfish.cn/。

合成4条sgRNA引导序列的正反向单链退火引物后，分别退火：56℃，20sec；退火产物与YSYCRISPR/Cas9二合一质粒载体连接：16℃，过夜，构建成四种CRISPR/Cas9二合一质粒，连接产物转化E.coil Trans5α感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司)，涂布氨苄琼脂板，隔夜生长后挑取单克隆菌落做菌体PCR，鉴定阳性克隆。为进一步确定CRISPR/Cas9二合一质粒的正确性，将扩增出阳性条带的菌液测序，进行序列比对，鉴定正确连接的CRISPR/Cas9二合一质粒，测序结果见图1。

构建的四种CRISPR/Cas9二合一质粒分别命名pYSY-T7-Cas9-T7-sgRNA1、pYSY-T7-Cas9-T7-sgRNA2、pYSY-T7-Cas9-T7-sgRNA3和pYSY-T7-Cas9-T7-sgRNA4。

以构建的CRISPR/Cas9二合一质粒为模板，分别做为PCR扩增sgRNA-1、sgRNA-2、sgRNA-3、sgRNA-4和Cas9mRNA的转录模板，根据转录模板体外转录出sgRNA-1、sgRNA-2、sgRNA-3、sgRNA-4和Cas9mRNA。

体外转录采用的试剂盒为：Script MAX Thermo T7Transcription Kit(TSK-101)(东洋纺生物科技有限公司)。

体外转录时在T7RNA聚合酶作用于T7启动子下预计的sgRNA转录本序列分别为：

pYSY-T7-Cas9-T7-sgRNA1：

pYSY-T7-Cas9-T7-sgRNA2：

pYSY-T7-Cas9-T7-sgRNA3：

pYSY-T7-Cas9-T7-sgRNA4：

GACACUCGUGGCCGAUUCUGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuuu

Cas9mRNA为本领域公知序列。

3.LDLR基因突变兔的制备

实验动物：

普通级新西兰兔购于江苏扬州。雌兔6-10月龄，雄兔10-12月龄，体重在2.5-4.5kg/只。饲养条件：室温18-25℃、湿度40％-50％、通风良好、按12/24h控制光照的普通环境中，每次添加75g颗粒饲料，一天两次，并辅助饲喂胡萝卜、青草等青绿饲料，自由饮水。

3.1供体兔超数排卵与供受体同期发情

实验挑选成年母兔作为超数排卵的供体，供体母兔需未发情，挑选时翻看母兔外阴部，若颜色泛白、无肿胀，可作为超速排卵的对象。采用递减法对每只供体母兔进行腿部肌肉注射FSH(卵泡刺激素)，每只供体注射的FSH总量为60IU。在最后一次注射FSH 12h后，每只供体兔耳缘静脉注射100IU hCG(人绒毛膜促性腺激素)。

表3FSH注射方案

在供体母兔注射完hCG的同时，挑选正常、体况良好的雌兔作为受体母体，并同时给受体母体耳缘静脉注射hCG 100IU，受体母体的具体数量视供体雌兔发情状况而定，一般供体比受体为1:2。将注射完hCG的供体母兔与正常健康成年雄兔在人工辅助下进行配种后合笼并做禁食饥饿处理。

配种后18h左右，进行手术取受精卵。

3.2mRNA显微注射兔受精卵

分装好的cas9 mRNA和sgRNA等体积混合，cas9 mRNA和sgRNA终浓度分别为40ng/μL和10ng/μL，通过显微操作系统将转基因片段注射至受精卵。注射完成后将重构胚移入含M16培养液(M7292-100ML，Sigma公司)的方杯中，置于培养箱中培养待用。

注射方案如下：cas9 mRNA分别与sgRNA-1、sgRNA-2、sgRNA-3、sgRNA-4等体积混合注射；cas9 mRNA与(等体积的sgRNA-1+sgRNA-2)等体积混合注射；cas9 mRNA与(等体积的sgRNA-3+sgRNA-4)等体积混合注射；cas9 mRNA与sgRNA(等体积的sgRNA-1+sgRNA-2+sgRNA-3+sgRNA-4)等体积混合注射。

3.3胚胎移植

重构胚在培养箱中培养半小时后，选取质量好的胚胎进行胚胎移植。肌肉注射速眠新II配合耳缘静脉注射Zoletil(舒泰)受体母兔进行麻醉，将其仰卧保定，剃毛消毒。按常规方法将显微注射后胚胎注入到输卵管中。移植完成后，生理盐水清洗后缝合。一般情况下，母兔怀孕30天左右会自然分娩，常规母兔产后护理及仔兔哺乳。

4.技术效果判定和基因突变检测

4.1LDLR基因突变兔检测

4.1.1兔子基因组DNA提取

采用常规方法提取实验仔兔基因组DNA。

4.1.2仔兔LDLR基因测序

提取实验兔基因组作为模板进行PCR检测，通过Primer5.0软件针对兔子基因突变位点设计引物，引物信息见表4。PCR反应体系见表5。

表4突变检测PCR引物

利用PCR分析法对仔兔基因组DNA进行整合检测分析，PCR反应体系如表5：

表5突变检测PCR反应体系

按照上述组份的量加样，LDLR(1-2)引物组加好后放入PCR仪，设定PCR仪进行下列循环：94℃预变性5min；94℃变性40s，60.8℃退火40s，72℃延伸25s，共33个循环；最后72℃延伸10min；4℃保存。

按照上述组份的量加样，LDLR(3-4)引物组加好后放入PCR仪，设定PCR仪进行下列循环：94℃预变性5min；94℃变性45s，60℃退火45s，72℃延伸45s，共31个循环；最后72℃延伸10min；4℃保存。

将PCR产物于1％凝胶中电泳，电泳结束后用溴化乙锭染色约3-5min，脱色后放入凝胶成像仪中拍照，初步判定仔兔LDLR基因突变情况。将条带正确的PCR产物送至测序公司进行序列测定并使用DNAStar序列分析软件与扩增模板标准序列作比对，并用Chromas软件观察测序峰图套峰情况以进一步验证是否发生突变。

4.1.3仔兔LDLR基因PCR扩增产物TA克隆

为鉴定LDLR基因突变阳性兔的突变类型，进一步将PCR产物测序结果显示为LDLR基因突变PCR产物与pGEM-T克隆载体连接。连接pGEM-T克隆载体前用北京金式金公司的PCR纯化试剂盒纯化PCR产物。纯化获得的PCR产物与pGEM-T克隆载体按如下公式进行量的计算：

按照连接酶体系说明，制备反应体系，反应体系见表6：

表6DNA连接体系

反应条件：4℃连接过夜。

5.脱靶预测及检测

输入网址http://crispr.dbcls.jp/，选择相同或相似种属的动物进行脱靶预测。输入https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi，在种属Oryctolagus中输入sgRNA序列进行同源对比，并根据兔子基因组内查找碱基序列与sgRNA靶位点错配数不大于5。以PAM为NAG或NGG为条件筛选、近PAM的8个碱基保守gRNA的脱靶位点。设计引物，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，筛选出条带大小正确、明亮、单一送公司测序。测序结果DNASTAR软件进行比对，色谱图用chromas软件查看有无套峰。

6结果

此处对如下注射方案的结果具体分析：

cas9 mRNA+sgRNA-1+sgRNA-2(兔LDLR第二外显子基因编辑)；

cas9 mRNA+sgRNA-3(兔LDLR第七外显子基因编辑)；

cas9 mRNA+sgRNA-4(兔LDLR第七外显子基因编辑)；

cas9 mRNA+sgRNA-3+sgRNA-4(兔LDLR第七外显子基因编辑)；

cas9 mRNA+sgRNA-1+sgRNA-2+sgRNA-3+sgRNA-4(兔LDLR第二和七外显子基因编辑)；

6.1超数排卵及受体兔子妊娠分娩情况

本发明一共超数排卵34只供体兔子，获得804枚受精卵。其中注射LDLR靶位点Cas9mRNA和sgRNA第二外显子(E2)的胚胎数目为116枚，移植胚胎110枚，胚胎存活率94.83％；新西兰兔受体移植6只，兔怀孕顺利分娩2只，怀孕率33.33％；共出生4只仔兔，全部死亡，成活率为0％。注射Cas9mRNA和sgRNA第七外显子(E7)的胚胎数目为209枚，移植胚胎202枚，胚胎存活率96.65％；新西兰兔受体移植12只，兔怀孕顺利分娩6只，怀孕率50％；共出生14只仔兔，成活仔兔11只，成活率为78.57％。最后注射Cas9mRNA和sgRNA第二和第七外显子(E2和E7)的胚胎数目为442枚，移植胚胎373枚，胚胎存活率84.39％；新西兰兔受体移植19只，兔怀孕顺利分娩11只，怀孕率33.33％；共出生19只仔兔，成活仔兔8，成活率为42.11％。在饲养过程中因为温度、疾病等因素，活到成年并继续血脂检测实验转基因兔16只。

表7胚胎显微注射情况

6.2仔兔基因组PCR检测

通过软件Primer 5.0设计引物对正常兔子LDLR基因进行PCR扩增，检测结果显示了实验仔兔LDLR基因位点出现不同程度的突变，将测序PCR产物纯化后连接T载体并测序鉴定基因突变类型。

检测结果表明第二外显子(E2)和第七外显子(E7)2个靶位点共同突变的活基因突变兔8只，1只未突变，突变率为87.50％，剩余7只LDLR基因突变兔均为双等位基因突变，编号为L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L14。其中L2基因突变兔为纯合子，两条染色体突变序列完全一样，两条染色体均缺失了18个bp。

检测结果表明第七外显子(E7)打靶共获得的8只仔兔中，8只仔兔全部突变，突变率为100％。这8只LDLR基因突变兔均为双等位基因突变，双等位基因突变率为100％，编号为L9、L10、L11、L12、L13、L15、L16、L17。其中3只LDLR基因突变兔为纯合子，两条染色体状况完全一样，纯合子率为37.5％。L13测序结果表明两条染色体均增加了2个bp，L15测序结果表明两条染色体均缺失了9个bp，L17测序结果表明两条染色体均增加了10个bp，替换2个bp，其余的5只为复合型杂合子，它们的两条染色体上的等位基因突变情况不同。

6.3仔兔LDLR基因组PCR产物TA克隆及测序结果

将仔兔LDLR基因组PCR产物插入TA载体，通过TA克隆测序鉴定每个LDLR基因突变兔的两条等位基因的突变类型。结果显示，16只LDLR基因突变兔的突变类型有基因缺失、基因插入、碱基替换，主要以基因缺失为主。L1兔基因组经PCR产物结果显示，两条染色体均未发生突变。L2兔两条LDLR基因共同缺失18bp，造成了L2兔的LDLR两条等位基因编码的第27-32位均缺失6个氨基酸：天冬酰胺、谷氨酸、苯丙氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸和精氨酸。L3兔缺失第2外显子149bp核苷酸，导致47个氨基酸缺失和移码突变。L4兔在第七外显子上两条LDLR基因共同缺失8bp，造成了L4兔的LDLR两条等位基因编码的第330-333位均缺失4个氨基酸：精氨酸、异亮氨酸、甘氨酸和组氨酸。L5兔一条LDLR基因缺失5bp，使得一条染色体的LDLR基因编码的第31位氨基酸半胱氨酸缺失，发生移码突变，另一条基因组缺失208bp，编码区缺失117bp替换7个bp，使得染色体的LDLR基因编码的氨基酸序列发生替换，39个氨基酸缺失。L6兔两条LDLR基因共同缺失3bp，造成了L6兔的LDLR两条等位基因编码的氨基酸缺失，基因组上缺失3bp，编码区缺失2bp，造成L6兔的LDLR第328位后氨基酸均发生移码变化，并在第335位翻译终止。L7双等位突变，E2-E7大片段缺失。L9兔一条LDLR基因缺失13bp，造成L9兔的LDLR编码的337-339位3个氨基酸缺失半胱氨酸、脯氨酸和赖氨酸，另一条缺失1bp，替换4个bp，插入4bp造成第330-334位替换3个氨基酸，其中第331位插入缬氨酸。L10兔两条LDLR基因均缺失较多，一条缺失58bp，另一条缺失13bp，使得两条LDLR编码的前者缺失19个氨基酸，后者缺失4个氨基酸。L11兔的一条LDLR基因缺失12bp，第319-331缺失4个氨基酸：天冬氨酸、亮氨酸、精氨酸和异亮氨酸，另一条缺失4bp，第331位缺失1位异亮氨酸，发生移码突变。L12兔的一条LDLR基因缺失12bp，另一条基因上缺失518bp，编码区缺失194bp，使得两条LDLR基因编码的后者缺失63个氨基酸。L13兔两条LDLR基因共同插入2bp，造成了L13兔的LDLR两条等位基因编码的第331位开始产生移码突变。L14兔两条LDLR基因共同缺失3bp，没有造成了L14兔的LDLR两条等位基因编码的氨基酸缺失，基因组上4267-4269缺失3bp，编码区146-147缺失2bp，造成L14兔的LDLR第20位后氨基酸均发生移码变化，并在第27和44位翻译终止。L15兔两条LDLR基因共同缺失9bp，造成了L15兔的LDLR两条等位基因编码的第316-318位均缺失3个氨基酸：甲硫氨酸、精氨酸、甘氨酸。L16兔的一条LDLR基因缺失9bp，另一条基因上缺失32bp，替换3bp，前者第319-321位缺失3个氨基酸：1个冬酰胺和2个甘氨酸。L17兔两条LDLR基因共同插入10bp，替换2bp，使得在第318-320位插入3个氨基酸：2个甘氨酸1个赖氨酸。表7-1至表7-3列出了部分高血脂LDLR突变兔基因组PCR产物TA克隆测序结果。

表7-1：sgRNA1突变兔LDLR序列缺失列表

表7-2：sgRNA2突变兔LDLR序列缺失列表(部分兔号码与sgRNA1共同缺失)

表7-3：sgRNA4突变兔LDLR序列缺失列表(部分兔与sgRNA1、sgRNA2共同缺失)

6.4off-target检测结果

CRISPR基因编辑技术的目前最大副作用就是关于脱靶效应的争议，本发明通过在线检测预测脱靶软件将以上设计的4条sgRNA，分别查找sgRNA靶位点错配数不大于5的兔子基因组上的5个脱靶最高的碱基序列，软件计算出的最高有可能出现脱靶的概率为千分之二，通过Primer5.0设计脱靶位点相对应的引物。PCR产物测序结果表明，sgRNA1选取的5个位点进行实际验证中，POST3这条23bp的长碱基序列位于兔子基因组chrUN0+31323位置上16份送检结果中，有2份检测到明显双峰，怀疑产生脱靶。通过查找，出现在基因内含子部位。sgRNA2、sgRNA3和sgRNA4结果显示未检测到明显双峰，用序列软件DNAman软件进行对比，未发现突变。即sgRNA2、sgRNA3和sgRNA4这3条sgRNA对应的15个位点未产生脱靶。预测脱靶位点测序分析后的脱靶结果见表8-1～表8-4。

表8-1sgRNA1预测脱靶位点测序分析后的脱靶结果

表8-2sgRNA2预测脱靶位点测序分析后的脱靶结果

表8-3sgRNA3预测脱靶位点测序分析后的脱靶结果

表8-4sgRNA4预测脱靶位点测序分析后的脱靶结果

实施例2LDLR突变兔模型用于评价动脉粥样硬化研究

1方法和步骤

1.1血清生化指标方法

分别于实验前第5周、第10周、第15周时将突变组兔和正常组兔禁食不禁水12h，耳缘静脉采血，取血置于EDTA抗凝的采血管中，采血后于2小时内处理。剩余各组兔血置于促凝采血管中，于室温静置化1h后高速冷冻离也机离心，3000r/min，离心15min，吸取上层血清，待测，实验过程中将取血后发生凝血的样本剔除。血脂检测项目包括血清总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)，采用全自动生化分析仪获得结果，并通过spss软件分析实验数据。

1.2突变兔血清的电泳(电泳结果对所有突变兔都适用)

采用常规方法对突变体兔血清进行琼脂糖电泳研究。

1.3突变体兔血清的WesternBlot

采用常规实验方法对突变体兔血清进行WesternBlot实验。用IPP软件对目的条带进行灰度分析。

1.4苏丹IV红观察LDLR-/-兔脂质蓄积

麻醉LDLR-/-兔后，剥离兔胸主动脉及腹主动脉血管外膜组织，剔除干净主动脉血管外的多余脂肪组织后，不损伤血管的情况下将主动脉树纵向剪开。主动脉标本采用4％多聚甲酸固定，将主动脉分离后肝脏置于4％的多聚甲酸溶液中，常温下固定3h，用包埋剂包埋并制备冰冻切片，以厚度4um进行连续切片用自来水冲洗主动脉1h，将主动脉过夜浸泡在苏丹IV缓冲液中，第二天早晨将主动脉放在70％的酒精中浸泡3min，主动脉放在70％酒精中浸泡30min，流水冲洗主动脉，此时可见斑块被染为红色，重新放回福尔马林固定，以备后期切片再用；随即将染色后的标本平铺与载玻片上，数码相机拍照后，以图像分析软件分析。拍照并对染色后的脂质进行定量。

1.5主动脉石蜡切片的制作

采用常规方法制作突变体兔主动脉石蜡切片。

1.6巨噬细胞免疫组化

分别于第16周、第24周用3％戊巴比妥钠(60mg/kg)致死模型兔和正常兔，解剖颈动脉血管。常规固定、脱水、浸蜡、包埋、切片。免疫组织化学染色ABC法(试剂盒购自美国vector公司)，鼠抗兔MMP-2单克隆抗体(ab-2462)、CD31单克隆抗体购自美国Abcam公司。

2模型结果与分析

2.1血清生化指标

血脂测定结果示，各组兔子血清总胆固醇CHOL、甘油三脂TG、高密度脂蛋白HDL-C和低密度脂蛋白LDL-C均P<0.05差异有统计学意义。

表9LDLR-/-兔和正常兔5周后血清学指标

注：突变组和正常组比较“*”表示差异显著P<0.05，“**”符号表示差异极显著P<0.01

表10LDLR-/-兔和正常兔10周后血清学指标

表11LDLR-/-兔和正常兔15周后血清学指标

注：突变组和正常组比较“*”表示差异显著P<0.05，“**”表示差异极显著

2.2突变体兔血清的电泳

血清脂蛋白以琼脂糖凝胶(helen公司)为支持介质，在1*TAE缓冲液中电泳，根据各脂蛋白的组成和大小，形状分离在不同区带。Alpha区的脂蛋白主要是高密度脂蛋白(HDL-C)是迁移速率最快的，电泳结束后几乎靠近正极区，Beta区的脂蛋白主要是低密度脂蛋白(LDL-C)迁移速率较慢，几乎聚集在加样区，而Beta前区主要是乳糜微粒的富集区。结果显示(图2)，与野生型兔相比LDLR-/-兔Beta区染色较深，说明该样本中富集低密度脂蛋白。

2.3血清westernblot

进一步的western blot结果(图3)显示，LDLR^-/-兔apoB(apolipoproteinB，ApoB)的含量远大于野生型，apoA1(apolipoproteinAⅠ，ApoAⅠ)的含量低于野生型。而血清载脂蛋白B、载脂蛋白AⅠ分别是低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)中主要的载脂蛋白，其两者的比值可反映出致动脉粥样硬化和抗动脉粥样硬化脂质颗粒的平衡，因此ApoB和ApoAⅠ含量从侧面也反映了LDL-C和HDL-C的水平。

2.4苏丹红IV脂质蓄积

结果分析中，相机白平衡设置为日光，图4和图5为苏丹红IV染色结果图，对染色后的脂质进行定量，采用Image-ProPlus6.0软件测量正常组兔子整条血管面积24812，斑块外面积之和24399，测量模型组兔子整条血管面积23701，斑块外面积之和8097。模型组血管上脂质沉积明显，形成典型的斑块，且斑块占血管面积比例65.83％，正常组血管上脂质沉积少，没有形成大的斑块，红色面积比较零星，不明显，且斑块占血管面积比例1.66％结果显示模型组LDLR-/-斑块形成明显，病变区脂质沉着，染色血管壁内脂质，可见动脉粥样硬化病变区红染脂滴，而在正常组兔血管内无明显的脂质蓄积。LDLR-/-突变兔成功复制了动脉粥样硬化模型。

斑块面积占血管总面积的百分比：

面积比例＝(血管面积-斑块外面积之和)/血管面积

表12LDLR-/-模型组兔和正常组兔斑块的面积比例

2.5主动脉组织学分析

利用Image-ProPlus软件测量血管内膜沉积物的指标，测量沉积物的厚度和面积与血管内径管腔面积的百分比，先测量血管内腔周长，换算出血管内腔等效园形的面积。然后测量血管内膜面积，最后计算内膜面积比血管内腔面积。即血管梗塞比例＝内膜面积/血管内腔等效园面积，将数据导出，最后取其均值。本实验能过比较两组织突变兔和正常兔血管阻塞情况结果如下：

如图6，图7，HE染色后镜下可见，模型组(LDLR-/-突变兔)新生内膜增厚明显，新生内膜表面形成明显的纤维斑块，则形成典型的斑块，管腔面积缩小，内膜表面粗糙，内膜炎症细胞粘附积聚。正常组血管平整，致密，光滑。

如表13，正常组和模型组内膜中膜面积、血管内腔等效园面积和管腔面积狭窄率(％)与正常对照组和突变相比，均具有统计学差异P<0.05。

表13模型和正常兔管腔面积狭窄率

2.6免疫组化主动脉组织中巨噬细胞的含量

各组兔主动脉组织中巨噬细胞表达情况，尼康80i荧光显微镜下进行观察并采集图像。每组切片测平均光密度，求出平均值，利用SPSS软件做标准差，t检验分析免疫组化染色IOD值，图像采用Image-Pro Plus 6.0软件测量斑块内阳性细胞积分光密度(IOD)值及Area，并计算MOD值(MOD＝IOD/Area)，表达以组织中出现棕黄色颗粒者为阳性表达。

研究结果(图8和图9)显示，正常组未见棕黄色的巨噬细胞，突变组可见有大量的棕黄色的巨噬细胞，主要集中在内膜和中膜，是粥样硬化病变中泡沫细胞的主要成分。从每例模型兔和正常兔斑块的的连续切片中随机选取2个不同位置斑块结构清楚的切片进行免疫组化染色，并对其MOD值进行统计分析采用Image-Pro Plus 6.0软件测量模型突变兔斑块内阳性细胞积分光密度(IOD)值28498.0098及Area面积242558，计算得出MOD值0.1174894。测量正常变兔斑块内阳性细胞积分光密度(IOD)值6824.50049及Area面积217538，计算得出MOD值0.0314。

表14模型组和正常兔组阳性巨噬细胞表达率

序列表

<110> 扬州大学

<120> 一种高血脂或动脉粥样硬化兔模型的构建方法及sgRNA

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gccacacttg tcccctgctg cgg 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gccggaatga gttccaatgc cgg 23

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aatgagtgca tgcggggcaa cgg 23

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gacactcgtg gccgattctg agg 23

<210> 5

<211> 101

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gccacacuug uccccugcug guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu u 101

<210> 6

<211> 101

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gccggaauga guuccaaugc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu u 101

<210> 7

<211> 102

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gaaugagugc augcggggca aguuuuagag cuagaaauag caaguuaaaa uaaggcuagu 60

ccguuaucaa cuugaaaaag uggcaccgag ucggugcuuu uu 102

<210> 8

<211> 101

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gacacucgug gccgauucug guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu u 101

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tatagccaca cttgtcccct gctg 24

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aaaccagcag gggacaagtg tggc 24

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tatagccgga atgagttcca atgc 24

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

aaacgcattg gaactcattc cggc 24

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tatagaatga gtgcatgcgg ggcaa 25

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

aaacttgccc cgcatgcact cattc 25

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tatagacact cgtggccgat tctg 24

<210> 16

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

aaaccagaat cggccacgag tgtc 24

<210> 17

<211> 41

<212> DNA

<213> 兔(Oryctolagus cuniculus)

<400> 17

caggggacaa gtgtggccgg aatgagttcc aatgccggaa c 41

<210> 18

<211> 43

<212> DNA

<213> 兔(Oryctolagus cuniculus)

<400> 18

atgccggaac gggaagtgta tctcctacaa gtgggtgtgt gac 43

<210> 19

<211> 43

<212> DNA

<213> 兔(Oryctolagus cuniculus)

<400> 19

cggtgcagcg accaatgagt gcatgcgggg caacggaggc tgc 43

<210> 20

<211> 44

<212> DNA

<213> 兔(Oryctolagus cuniculus)

<400> 20

ggccacgagt gtcattgtcc caaaggctac cggctggtgg acca 44

Claims

1.一种高血脂或动脉粥样硬化兔模型的构建方法，其特征在于，包括：以兔LDLR基因第2外显子或/和第7外显子为靶向，删除或改变LDLR基因部分DNA序列，使得兔子呈现高血脂或动脉粥样硬化的表型。

2.根据权利要求1所述的高血脂或动脉粥样硬化兔模型的构建方法，其特征在于，以兔LDLR基因第2外显子4265-4341bp序列或/和第7外显子7041-7155bp序列为靶向。

3.根据权利要求1所述的高血脂或动脉粥样硬化兔模型的构建方法，其特征在于，采用基因编辑的方法删除或改变LDLR部分基因序列，步骤包括：

(2)以构建的CRISPR/Cas9二合一质粒为模板，扩增sgRNA和Cas9 mRNA的转录模板，根据转录模板体外转录出sgRNA和Cas9 mRNA；

(3)将上述质粒转录的sgRNA和Cas9 mRNA共同导入受精卵，获得高血脂或动脉粥样硬化兔。

4.根据权利要求3所述的高血脂或动脉粥样硬化兔模型的构建方法，其特征在于，步骤(3)导入cas9 mRNA和sgRNA混合液，其中cas9 mRNA的终浓度分别为40～50ng/μL，sgRNA的终浓度为10～20ng/μL。

5.根据权利要求3或4所述的高血脂或动脉粥样硬化兔模型的构建方法，其特征在于，基因编辑时，设计sgRNA的模板序列选自如下任意一条或多条：

sgRNA-1模板：

5’-CAGGGGACAAGTGTGGCCGGAATGAGTTCCAATGCCGGAAC-3’；

sgRNA-2模板：

5’-ATGCCGGAACGGGAAGTGTATCTCCTACAAGTGGGTGTGTGAC-3’；

sgRNA-3模板：

5’-CGGTGCAGCGACCAATGAGTGCATGCGGGGCAACGGAGGCTGC-3’；

sgRNA-4模板：

5’-GGCCACGAGTGTCATTGTCCCAAAGGCTACCGGCTGGTGGACCA-3’。

6.一种特异性靶向兔LDLR基因的sgRNA，其特征在于，所述的sgRNA靶向LDLR基因第2外显子转录起始位点4265-4341bp序列或者LDLR基因第7外显子转录起始位点7041-7155bp序列。

7.根据权利要求6所述的特异性靶向兔LDLR基因的sgRNA，其特征在于，sgRNA的引导序列选自如下任意一条：

sgRNA-1的引导序列：5’-GCCACACTTGTCCCCTGCTGCGG-3’；

sgRNA-2的引导序列：5’-GCCGGAATGAGTTCCAATGCCGG-3’；

sgRNA-3的引导序列：5’-AATGAGTGCATGCGGGGCAACGG-3’；

sgRNA-4的引导序列：5’-GACACTCGTGGCCGATTCTGAGG-3’。

8.根据权利要求6或7所述特异性编辑动物LDLR基因的sgRNA的PAM序列，其特征在于，序列如下：

sgRNA-1的PAM序列：5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCGG-3’；

sgRNA-2的PAM序列：5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCGG-3’；

sgRNA-3的PAM序列：5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCGG-3’；

sgRNA-4的PAM序列：5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAGG-3’。

9.含权利要求6或7所述特异性编辑动物LDLR基因的sgRNA的载体、细胞。

10.一种构建高血脂或动脉粥样硬化兔模型的试剂盒，其特征在于，含有下述成分中的至少一种：

权利要求6或7所述的sgRNA或其转录模板；

cas9mRNA或其转录模板。