CN1230540C - 果蝇重组相关蛋白质及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涵盖由黑腹果蝇分离的果蝇重组相关蛋白质(DRAP)和编码DRAP的核酸序列。果蝇重组相关蛋白质、来自其它生物体的同源物或由其衍生的活性肽、以及编码这些蛋白质的DNA,可用于依赖同源性的DNA三链配对。DRAP相关的链转移与拓扑异构酶活性的联合能够在DNA内定向配对和切割确定位点,继而有可能分离和/或除去确定的DNA区段。DRAP还可用于克隆、基因组克隆、和基因作图,用于促进基因破坏或“敲除”突变,用于进行特定基因的靶向诱变,和用于生成转基因动物。本发明还涵盖遗传病有关基因的DRAP所驱动敲除或其它修饰的实验性和治疗性使用方法,以及DRAP所驱动的基因操作在基因疗法中的使用。

Description

果蝇重组相关蛋白质及其使用方法
                     发明领域
本发明涵盖果蝇重组相关蛋白质(Drosophila RecombinationAssociated Protein,DRAP)、编码DRAP的核酸序列、和DRAP的使用方法。
                      背景
用于将外源基因引入真核细胞和生物体的一种常用方法是直接转染。转染比较有效,但是基因组整合趋向随机,而且基因表达难以调控。已经发展了多种策略来增强对转基因表达的控制,将表达限制于特定组织,或使表达与转基因动物发育过程中的特定时间相联。直接转基因方法主要苦于不能直接修饰特定基因座。
用于将外源基因引入真核细胞的另一种方法利用指向特化胚胎干细胞特定基因座的同源重组。已经在病毒、原核细胞、和真核细胞中鉴定了参与一般性重组和位点特异性重组的许多基因和基因产物(R.D.Camerini-Otero等人,遗传学年鉴(Ann.Rev.Genetics)29:509-522,1995)。由这些基因编码的这些基因产物和/或蛋白质已经证明可用于DNA的体外和体内分子基因操作,应用于克隆、基因作图、和活的生物体中的基因组操作(N.D.Grindley等人,细胞(Cell)83:1063-1066,1995;和J.C.Wang等人,细胞(Cell)62:403-406,1990)。这些蛋白质在这些应用中的使用依赖它们在同源重组中的活性。
同源重组常规用于在突变型动物的生成中产生“敲除”突变(T.Nomura,实验动物科学(Lab.Anim.Sci.)47:113-117,1997;和M.Torres,发育生物学现行主题(Cur.Top.Dev.Biol.)36:99-114,1998)。这种方法引起基因(即序列)定向插入,即“敲除”基因功能以产生这种突变。虽然这种方法效率通常很低,但是选择和筛选方法能够促进携带特定基因组修饰的细胞的鉴定。在特化胚胎干细胞中完成这种低效过程的酶促机制尚不清楚。因而,鉴定该过程所涉及的一种或一些基因或基因产物将是有益的,从而可以更高效的进行同源重组。可证明这种位点特异性同源重组可用于治疗性目的。这些特定基因和/或基因产物的应用可改进敲除过程的效率,并扩展可实现同源重组的细胞类型的范围。
因而,非常期望开发用于有效、同源性定向的基因组修饰的方法,从而能够进行由敲除至细微修饰的范围内的基因修饰。这些方法依赖于有效的依赖同源性的DNA配对蛋白质的应用,它能够将诱变寡核苷酸指向复杂基因组中的相关基因。这种方法的目的是促进DNA链交换并推动基因转变事件,这种基因转变可在分子水平上鉴定且是可遗传的。有几种体外已用于相关目的的常见的依赖同源性的链转移酶,可能也适用于这种目的(如RARE技术)(L.J.Ferrin等人,自然遗传学(NatureGenetics)6:379-383,1994;和L.J.Ferrin,遗传工程(Genet.Eng.)17:21-30,1995)。
目前在促进DNA链转移和基因转变中常用的重组酶包括来自T4噬菌体的UV敏感X(“UVSX”)、来自大肠杆菌的重组蛋白A(“RecA”)或由其衍生的肽、或者来自酵母的辐射诱导突变体51(“RAD51”)或来自果蝇、小鼠、和人的RAD51同源物。这些蛋白质各自都是重组相关蛋白质大型超家族的成员。这些重组酶通常需要辅助蛋白,诸如单链结合蛋白(“SSB”)、复制蛋白A(“RPA”)、和辐射诱导突变体52(“RAD52”),以实现最高效率。还有许多可为此目的而修饰的定点重组酶(属于整合酶和解离酶超家族)。
果蝇胚胎提供了涉及同源重组的酶的丰富来源(A.Eisen等人,美国国家科学院进展(PNAS)85:7481-7485,1988)。据显示,纯化的蛋白质组分具有与RecA相似的有效的不依赖ATP而依赖同源性的链转移酶活性。活性组分似乎以催化方式而非化学计量方式起作用(A.Eisen等人,1988)。果蝇胚胎细胞快速分裂,因而可提供大量涉及有丝分裂重组和DNA加工的酶。相似有效的依赖同源性的链转移酶活性证明存在于来自果蝇的核提取物中(A.Eisen等人,1988)。这种果蝇蛋白质活性的明显催化本性使之与以RecA/Rad51超家族蛋白质为代表的最常见重组酶区分开,RecA/Rad51超家族的基因产物是以化学计量方式起作用的(R.D.Camerini-Otero等人,1995;J.E.Yancey-Wrona等人,当前生物学(Current Biol.)5:1149-1158,1995;P.Baumann等人,细胞(Cell)87:757-766,1996;F.E.Benson等人,自然(Nature)391:401-404,1998;A.Shinohara等人,自然(Nature)391:404-407,1998;J.H.New等人,自然(Nature)391:407-410,1998;R.H.A.Plasterk等人,细胞(Cell)74:781-786,1993;和O.N.Voloshin等人,科学(Science)272:868-872,1996)。果蝇中独特的依赖同源性的链转移酶活性为进行高效基因打靶提供了某些理论优势。因而,在促进同源重组和同源性指导的基因转变中利用这种果蝇活性将是有利的。
                   发明概述
本发明提供了包含果蝇重组相关蛋白质(DRAP)编码区的分离cDNA克隆[SEQ ID NO:1]、编码DRAP并对应于该分离cDNA克隆第134-610位核苷酸的DNA[SEQ ID NO:2]、和包含于该分离cDNA克隆序列内并对应于分离cDNA克隆第104-610位核苷酸的最长开放读码框(ORF)[SEQID NO:3](见图1)。本发明还提供了[SEQ ID NO:4]描述的分离DRAP多肽,以及由[SEQ ID NO:5]、[SEQ ID NO:6]、和[SEQ ID NO:7]例示的抗原肽(见图2和图4B)。本发明还提供了适用于重组表达DRAP的DNA载体和转化细胞。
果蝇重组相关蛋白质、来自其它生物体的同源物或由其衍生的活性肽、以及编码这些蛋白质的DNA,可用于依赖同源性的DNA三链配对。DRAP相关的链转移与拓扑异构酶活性的联合能够在DNA内定向配对并切割确定位点,继而有可能分离和/或除去确定的DNA片段。DRAP还可用于克隆、基因组克隆、和基因作图。
DRAP还可用于促进基因破坏或“敲除”突变,进行特定基因的靶向诱变,和生成转基因动物。
因而,在一个方面,本发明提供了用于DNA克隆、基因分离、和基因作图的方法。
在另一个方面,本发明提供了用于靶向诱变的方法。
在还有一个方面,本发明提供了遗传病有关基因的DRAP驱动敲除或其它修饰的实验性和治疗性使用方法,以及DRAP驱动基因操作在基因疗法中的使用方法。
根据本说明书、权利要求书、和附图,本发明普通技术人员将领会本发明的这些方面和其它方面。
                    图的简述
图1描述了包含DRAP编码区的分离cDNA克隆的核苷酸序列[SEQ IDNO:1]、编码DRAP并对应于该cDNA克隆第134-610位核苷酸的DNA[SEQID NO:2]、和包含于cDNA克隆序列内并对应于cDNA克隆第104-610位核苷酸的最长开放读码框(ORF)[SEQ ID NO:3]。
图2描述了DRAP的核苷酸序列[SEQ ID NO:2]、核苷酸序列的限制性图谱、和DRAP蛋白质的对应氨基酸序列[SEQ ID NO:4]。
图3A描述了用于由果蝇核提取物纯化链转移酶活性的纯化方案示意图。
图3B描述了来自单链(SS)DNA琼脂糖柱的洗脱收集液的纯化示意图。
图3C是0.8% 1xTAE(Tris-醋酸盐-EDTA)琼脂糖凝胶照片,证明通过图3B所示每个纯化步骤保留的蛋白质级分由双链(DS)和单链环状(SSC)DNA形成DNA聚集物(AG)、缺刻环(NC)接合分子。
图3D是最初核提取物(NE)以及由Sepharose(S)、SS DNA(D)、和Sephacryl HR-200凝胶过滤(GF)柱洗脱的活性收集液的银染SDS-PAGE蛋白质凝胶照片。
图3E描述了来自图3D所述Sephacryl HR-200凝胶过滤柱的纯化收集液分别与兔多克隆抗体(PAb)和中和性小鼠单克隆IgM(MAb)反应的Western印迹。
图3F描述了果蝇核提取物加样后由IgM免疫亲和柱洗脱的收集液的银染10%聚丙烯酰胺凝胶照片。
图4A描述了DRAP蛋白质的cDNA。
图4B描述了成热DRAP蛋白质[SEQ ID NO:4],可能的起始位点对应于cDNAORF第11位密码子处的Met(设为氨基酸#1),成熟蛋白质是159个氨基酸、大约20kDa的蛋白质。编号阴影区描述了预测的3个最亲水的抗原肽。编号1、2、和3的这3种肽分别确定为KDESSP[SEQ ID NO:5]、TRRPVD[SEQ ID NO:6]、和RAMARK[SEQ ID NO:7]。
图4C描述了规范的DDE基元,这是转座酶和逆转录病毒整合酶的特征(潜在基元)。在规范形式的下面指出了与规范形式最接近的DRAP DDE基元,标有氨基酸D1、D2、和E1的位置,并在括号中注明插入的氨基酸的跨度。
图4D描述了DRAP与其它重组相关蛋白质共享的新基元MIVVKDESSP[SEQ IDNO:5],是通过与抗DRAP抗体的交叉反应性和序列比较鉴定的。图中示意了来自各基因的基元序列:小鼠和人RAD 51,LLIVDS[SEQ ID NO:23];酵母RAD 51和DCM 1,LIVVDS[SEQ ID NO:24];大肠杆菌REC A,VIVVDS[SEQ ID NO:25];FLP重组酶,MIALKDETNP[SEQ ID NO:26];T4基因32蛋白,ILVVKDPAAP[SEQ IDNO:27],MIAVDVEMGE[SEQ ID NO:28]和KGFSSE[SEQ ID NO:29];以及人拓扑异构酶I,IKDEP[SEQ ID NO:30],KDGSSE[SEQ ID NO:31]和GFSSP[SEQ IDNO:32]。
图5A描述了使用由DRAP cDNA克隆制备的含洋地黄毒苷的反义DNA单链探针在果蝇胚胎滋养细胞上进行的原位杂交研究。标杆相当于20μm。
图5B描述了使用由DRAP cDNA克隆制备的含洋地黄毒苷的反义DNA单链探针在果蝇胚胎上进行的原位杂交研究。标杆相当于20μm。
图6A描述了用Ni-NTA(Qiagen)、磷酸纤维素(Whatman)、和Sephadex75(Pharmacia)柱连续纯化N端His6标记的重组DRAP随后离心浓缩(Millipore)的示意图。
图6B描述了通过考马斯蓝染色的纯化DRAP以及商品化SSB和RecA蛋白质(调至60ng/μl)的12%聚丙烯酰胺凝胶电泳。
图6C描述了来自标准链转移测定法的DNA物质的0.8% 1xTAE琼脂糖凝胶电泳分离,比较RecA/SSB(Promega)与DRAP由双链线性(DSL)和单链环状(SSC)分子生成接合分子(JM)和缺刻环(NC)的情况。
图6D描述了来自拓扑异构酶测定法的DNA物质的0.8% 1xTAE琼脂糖凝胶电泳,其中将包含超螺旋(SC)和缺刻环状(NC)形式的质粒制剂与DRAP(60ng)或RecA/SSB(240/200ng)于37℃保温30分钟。
图6E描述了0.8% 1xTAE琼脂糖凝胶电泳,证实在链转移酶测定法中重组DRAP将与SSC和DSL底物形成大型蛋白质-DNA聚集物(AG)。
图6F描述了在重组酶反应中由末端标记的DSL底物生成的DNA物质的0.8% 1xTAE琼脂糖凝胶电泳。
图7描述了依赖ATP的三链反应,证实DRAP产生置换链且不具有解旋酶活性。DSL定义为双链线性DNA,SSC定义为单链环状DNA,而SCP定义为超螺旋质粒双链DNA。
图8描述了聚丙烯酰胺凝胶,用末端标记的寡核苷酸检验证实DRAP不具有核酸酶活性。
图9描述了由DRAP驱动的分子DNA反应的模型。
图10描述了由重组酶和寡核苷酸驱动的基因转变模型的示意图.
图11描述了用含5’OH的寡核苷酸进行的初步研究的结果。
图12描述了鼠c-kit外显子17cDNA序列[SEQ ID NO:8]、基因座的潜在诱变寡核苷酸(“寡聚物”)(标有下划线的部分)即tgtattcacagagatttggcagccaggaata[SEQ ID NO:9],用于限制性片段长度多态性(“RFLP”)分析的PCR引物(见双线箭头)即ggacagtgtattcac[SEQ ID NO:10]和ttgcgatttcgggctag[SEQ ID NO:11],W42突变的DNA核苷酸序列[SEQ ID NO:12]、和对应于SEQ ID NO:8和12的蛋白质氨基酸序列(分别为[SEQ ID NO:13]和[SEQ ID NO:14])。该图还提供了DNA序列的限制性图谱。
图13描述了由共注射DRAP与诱变c-kit寡核苷酸生成的白色斑点小鼠的照片以及无斑点对照小鼠的照片。
                     发明详述
本说明书中引用的所有专利申请、专利、和参考文献均完整收入本文作为参考。若发生抵触,则以本说明书(包括定义)为准。
本发明致力于编码在黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)胚胎中发现的重组相关蛋白质即果蝇重组相关蛋白质(DRAP)的分离核酸。本发明还致力于展示重组酶(依赖同源性的链转移酶)和拓扑异构酶二者活性的DRAP蛋白质。这种特性联合提供了可用于许多作用(包括克隆或基因打靶方案)的蛋白质。
定义
当用于本文时,“重组酶活性”指促进同源配对和DNA链交换。重组酶可以是位点特异性的或一般性的,而且可以通过多种生化机制在多种生物学序列中起作用。重组酶活性还可由较小肽促进,这些较小肽衍生自天然重组酶或由其衍生的诱变肽。
当用于本文时,“拓扑异构酶活性”指蛋白质改变DNA链环数的能力。当用于本文时,“链环数”指闭环DNA双链体的两条链相互交叉的次数。
当用于本文时,“核酸”或“多核苷酸”指含嘌呤和嘧啶的任意长度的聚合物,其或是多核糖核苷酸,或是多脱氧核糖核苷酸,或是混合的多核糖-多脱氧核糖核苷酸。这包括单链和双链分子,即DNA-DNA、DNA-RNA、和RNA-RNA杂种分子,以及通过将碱基缀合在氨基酸主链上形成的蛋白质核酸”(PNA)。
“分离的”多肽或核酸定义为至少不含天然状态相关的一些物质。一般而言,分离多肽占给定样品中总蛋白质质量的至少大约1%,优选至少大约10%,更优选至少大约50%。多肽重量中还包含其它形式,诸如不同糖基化或磷酸化或者其它翻译后修饰的形式。“分离的”核酸序列不同于天然产生、天然状态的染色体或转录本,通常至少除去天然染色体上通常与之相关的一些蛋白质。“部分纯的”核苷酸序列占给定组分中总核酸质量的至少大约5%,优选至少大约30%,更优选至少大约90%。
本发明还涵盖与上述DRAP序列可发生杂交或由其衍生的核酸。
由指定序列“衍生”的核酸或多肽序列指核苷酸或氨基酸序列与指定序列的一个区域有关的序列。对于核酸序列,这涵盖与指定序列同源或互补的序列,以及“序列保守变体”和“功能保守变体”。对于多肽序列,这包括“功能保守变体”。序列保守变体指其中给定密码子位置的一处或多处核苷酸改变不导致该位置编码的氨基酸的改变。功能保守变体指多肽中的给定氨基酸残基已改变而不改变天然多肽的整体构象和功能,包括,但不限于,用具有相似物化特性(诸如酸性、碱性、疏水性、等等)的氨基酸进行替代。指定多肽的“功能保守”变体还包括能够引起对指定多肽特异的抗体的任何多肽。
若核酸的至少一条链可与另一条核酸链在确定的严谨条件下退火,则核酸彼此是“可杂交的”。杂交严谨度通过如a)进行杂交和/或清洗的温度,和b)杂交和清洗溶液的离子强度和极性(如甲酰胺浓度),以及其它参数来确定。杂交要求两种核酸包含基本上互补的序列;然而,根据杂交严谨度,可耐受错配。杂交核酸的适当严谨度取决于核酸的长度和互补程度,这是本领域众所周知的变量。
在一个实施方案中,本发明涉及能够与上述DRAP序列或其互补序列在高严谨度杂交条件下发生杂交的分离核酸,下文定义了它的范例。
-预杂交处理支持物(如硝酸纤维素滤膜或尼龙膜),该支持物上结合了能够与黑腹果蝇DRAP核酸发生杂交的核酸,该预杂交是在65℃在含下列成份的溶液中保温6小时进行的:4x SSC(1x SSC含0.15MNaCl和0.015M柠檬酸钠,pH7)和10x Denhardt(1x Denhardt是1%菲可、1%聚乙烯吡咯烷酮、和1%牛血清清蛋白(BSA));
-用含下列成份的缓冲液取代预杂交液来接触支持物:4x SSC、1x Denhardt、25mM NaPO4 pH7、2mM EDTA、0.5% SDS、100μg/ml超声处理鲑鱼精DNA,并且含有由DRAP序列衍生的核酸作为探针,特别是放射性探针,其已事先通过于100℃保温3分钟进行变性;
-于65℃保温12小时;
-用下列溶液连续清洗:a)用2x SSC/1x Denhardt/0.5% SDS于65℃清洗45分钟4次;b)用0.2x SSC/0.1x SSC于65℃清洗45分钟2次;并c)用0.1x SSC/0.1% SDS于65℃清洗45分钟1次。
本发明还涵盖展示如下特性的任何核酸:在上述条件下,但是于大约40℃,连续清洗包括用2x SSC于45℃清洗15分钟,与上述黑腹果蝇DRAP可发生特异性杂交。
可以理解,上文定义的杂交条件构成了杂交的优选条件,但是绝非限制,而且可以更改又不影响上述探针与核酸的识别与杂交特性。
可更改膜的杂交和清洗过程中的盐条件和温度,获得更高或更低的严谨度,而又不影响杂交检测。例如,有可能加入甲酰胺来降低杂交温度。
与本发明DRAP序列发生杂交的核酸可以是任意长度。在一个实施方案中,这种多核苷酸的长度是至少8-25个,优选至少100个,最优选至少200个核苷酸。在另一个实施方案中,与本发明多核苷酸发生杂交的多核苷酸的长度与本发明的多核苷酸相同。
DRAP的“功能同源物”定义为共享DRAP的一种或多种特异生化特性。这些特性的范例包括重组醇和拓扑异构酶活性,以及使用抗DRAP抗体证实的抗原性。
“非均一的”在本文中定义为未纯化至均质的级分。
DRAP编码核酸和多肽
本发明涵盖来自黑腹果蝇、编码DRAP的核酸序列(如图1所述),如包含DRAP编码区的分离cDNA克隆的核苷酸序列[SEQ ID NO:1]、编码DRAP并对应于cDNA克隆第134-610位核苷酸的DNA[SEQ ID NO:2]、和包含于cDNA克隆序列内并对应于cDNA克隆第104-610位核苷酸的最长开放读码框(ORF)[SEQ ID NO:3]。下文实施例1描述了用于确定相关核酸序列的方法,图2和4B显示了推导的DRAP氨基酸序列,即编码来自黑腹果蝇、大约20kDa的DRAP多肽的基因[SEQ ID NO:4]。
本发明涵盖DNA和RNA序列,有义和反义序列。可通过转换、颠换、删除、插入、或其它变更(诸如其它方式剪接)来修饰本发明的DRAP编码序列。本发明还涵盖基因组DRAP序列和DRAP基因侧翼序列,包括DRAP调控序列。编码DRAP多肽的核酸序列还可与异源序列相连,包括启动子、增强子、应答元件、信号序列、多腺苷酸化序列、内含子、5’和3’非编码区、等等。本领域技术人员知道其它有用的异源序列。此外,可修饰核酸以改变稳定性、溶解度、结合亲和力、和特异性。例如,可选择性甲基化DRAP编码序列。还可用能够直接或间接提供可检测信号的标记修饰本发明的核酸序列。例示性标记包括放射性同位素、荧光分子、生物素、等等。
一般而言,本发明的核酸操作使用本领域众所周知的方法,如公开于《分子克隆,实验室手册》(Molecular Cloning,A LaboratoryManual),第2版,Sambrook、Fritsch、和Maniatis编,冷泉港;或《分子生物学现行方案》(Current Protocols in MolecularBiology),Aufubel、Brent、Kingston、More、Freidman、Smith、和Stuhl编,Greene出版协会,Wiley-Interscience,NY,NY,1992及定期更新版本。
本发明还涵盖展示如下特性的任何可杂交核酸:在上述杂交条件下,但是于大约40℃进行,连续清洗包括用2x SSC于45℃清洗15分钟,与上述DRAP编码DNA可发生特异性杂交。
可以理解,上文定义的高严谨度杂交条件构成了杂交的优选条件,但是绝非限制,而且可以本领域知道的方式进行更改又不影响上述探针与核酸的识别与杂交整体特性。
本发明还涵盖包含DRAP编码核苷酸序列的载体、包含该载体的细胞、和用于生成DRAP的方法(包括培养所述细胞)。
已经描述了很多载体(包括质粒和真菌载体)可用于在多种真核和原核宿主中进行表达。这些载体通常包含一种或多种用于克隆或表达的复制系统、一种或多种用于在宿主中进行选择的标记(如抗生素抗性)、和一种或多种表达盒。插入的DRAP编码序列可以人工合成、由天然来源分离、作为杂种分子制备、等等。可以通过已知的方法实现编码序列与转录调控序列的连接。可以通过任何合适的方法转化/转染/感染合适的宿主细胞,包括电穿孔、由CaCl2介导的DNA摄取、真菌感染、显微注射、微粒法、或本领域已知的其它已建立方法。
多种宿主/表达载体组合可用于表达编码DRAP的DNA序列。例如,有用的表达载体可包含染色体、非染色体、和合成DNA序列的片段。合适的载体包括SV40衍生物和已知的细菌质粒,如大肠杆菌质粒col E1、pCR1、pBR322、pMal-C2、pET、pGEX(Smith等人,基因(Gene)67:31-40,1988)、pMB9及其衍生物(诸如RP4质粒);噬菌体DNA,如噬菌体1的许多衍生物,如NM989,和其它噬菌体DNA,如M13和丝状单链噬菌体DNA;酵母质粒,诸如2μ质粒或其衍生物;可用于真核细胞的载体,诸如可用于昆虫或哺乳动物细胞的载体;由质粒和噬菌体DNA联合衍生的载体,诸如经修饰采用噬菌体DNA或其它表达控制序列的质粒;等等。
适用于表达蛋白质的宿主细胞包括细菌、古细菌(Archaebacteria)、真菌(尤其是酵母),以及植物和动物细胞(尤其是哺乳动物细胞)。特别感兴趣的是大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、啤酒酵母、Sf9细胞、C129细胞、293细胞、脉孢菌、CHO细胞、COS细胞、HeLa细胞、以及永生化哺乳动物骨髓和淋巴细胞系。优选的复制系统包括M13、ColE1、SV40、杆状病毒、λ、腺病毒、等等。已经分离了许多转录起始和终止调控区,并显示在多种宿主中在异源蛋白质的转录和翻译中有效。本领域知道这些区域、分离方法、操作方式、等等的范例。在适当表达条件下,宿主细胞可作为重组生成DRAP的来源。
有利的是,裁体还可包含可操作连接DRAP编码部分的启动子序列。可通过使用任何合适的载体和宿主细胞,使用本文公开或引用的方法或者相关领域熟练技术人员知道的其它方法,来表达编码的DRAP。载体/宿主的具体选择对本发明不是至关紧要的。
“启动子序列”是能够结合细胞中的RNA聚合酶并起始下游(3’方向)编码序列转录的DNA调控区。为了说明本发明,启动子序列以3’末端结合转录起始位点,并向上游(5’方向)延伸以包含起始超过背景的可检测水平的转录所必需的最小数目的碱基或元件。在启动子序列内存在转录起始位点(例如可方便的通过核酸酶S1作图来确定),以及负责结合RNA聚合酶的蛋白质结合结构域(共有序列)。
可通过本领域知道的任何启动子/增强子元件来控制DRAP或DRAP片段的表达,但是这些调控元件在选择用于表达的宿主中必需是有功能的。可用于控制DRAP基因表达的启动子包括,但不限于,巨细胞病毒(“CMV”)立即早期启动子(CMV启动子;美国专利号5,385,839和5,168,062)、SV40早期启动子区(Benoist和Chambon,自然(Nature)290:304-310,1981)、劳氏肉瘤病毒3’长末端重复片段中所含的启动子(Yamamoto等人,细胞(Cell)22:787-797,1980)、疱疹病毒胸苷激酶启动子(Wagner等人,美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)78:1441-1445,1981)、金属硫蛋白基因的调控序列(Brinster等人,自然(Nature)296:39-42,1982);原核表达载体,诸如β-内酰胺酶启动子(Villa-Kamaroff等人,美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)75:3727-3731,1978)或tac启动子(DeBoer等人,美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)80:21-25,1983);还可参阅“来自重组细菌的有用蛋白质”(科技美国人(Scientific American)242:74-94,1980);来自酵母或其它真菌的启动子元件,诸如Ga14启动子、ADC(乙醇脱氢酶)启动子、PGK(磷酸甘油激酶)启动子、碱性磷酸酶启动子;和展示组织特异性并已用于转基因动物的动物转录控制区:在胰腺腺泡细胞中有活性的弹性蛋白酶I基因控制区(Swift等人,细胞(Ce1l)38:639-646,1984;Ornitz等人,冷泉港生物学季度讨论会(Cold SpringHarbor Symp.Quant.Biol.)50:399-409,1986;MacDonald,肝脏病学(Hepatology)7:425-515,1987);在胰腺β-细胞内有活性的胰岛素基因控制区(Hanahan,自然(Nature)315:115-122,1985)、在淋巴细胞内有活性的免疫球蛋白基因控制区(Grosschedl等人,细胞(Cell)38:647-658,1984;Adames等人,自然(Nature)318:533-538,1985;Alexander等人,分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)7:1436-1444,1987)、在睾丸、乳房、淋巴、和肥大细胞中有活性的小鼠乳腺肿瘤病毒控制区(Leder等人,细胞(Cell)45:485-495,1986)、在肝中有活性的清蛋白基因控制区(Pinkert等人,基因和发育(Gene and Devel.)1:268-276,1987)、在肝中有活性的甲胎蛋白基因控制区(Krumlauf等人,分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)5:1639-1648,1985;Hammer等人,科学(Science)235:53-58,1987)、在肝中有活性的α1-抗胰蛋白酶基因控制区(Kelsey等人,基因和发育(Gene and Devel.)1:161-171,1987)、在骨髓细胞中有活性的β珠蛋白基因控制区(Mogram等人,自然(Nature)315:338-340,1985;Kollias等人,细胞(Cell)46:89-94,1986)、在脑的少突胶质细胞中有活性的髓鞘碱性蛋白基因控制区(Readhead等人,细胞(Cell)48:703-712,1987)、在骨骼肌中有活性的肌球蛋白轻链2基因控制区(Sani,自然(Nature)314:283-286,1985)、和在下丘脑中有活性的促性腺释放激素基因控制区(Mason等人,科学(Science)234:1372-1378,1986)。
还可通过重组事件将编码野生型或突变型DRAP多肽的核酸引入细胞。例如,可将这种序列引入细胞,由此在内源基因或与该基因基本上相同的序列处实现同源重组。还可使用其它基于重组的方法,诸如非同源重组或通过同源重组删除内源基因.
本发明还涵盖分离的和纯化的DRAP多肽,包括如具有图2和4B所述氨基酸序列的多肽[SEQ ID NO:4],以及该多肽的功能保守变体,包括保留了上述重组酶和/或拓扑异构酶活性的片段,和抗原性DRAP肽,其范例具有图4B所述氨基酸序列[SEQ ID NO:5]、[SEQ ID NO:6]、和[SEQID NO:7]。
可以由野生型或突变型黑腹果蝇细胞,或者由引入并表达DRAP衍生蛋白质编码序列的异源生物体或细胞(包括,但不限于,细菌、真菌、昆虫、植物、和哺乳动物细胞),分离本发明的DRAP衍生多肽(包括功能保守变体)。此外,多肽可以是重组融和蛋白的一部分。或者,可以通过商品化自动流程化学合成多肽,包括,但不限于,专性固相合成法、部分固相合成法、片段缩合、或经典的溶液合成法。
根据Prosite分析软件程序(ExpasY)的测定,DRAP氨基酸序列[SEQ ID NO:4]具有许多翻译后修饰的潜在位点。这些翻译后修饰位点对于重组酶的生物学功能可能是重要的,包括:a)N-糖基化位点,起始于第4位氨基酸,由氨基酸序列NNSS确定;b)依赖cAMP和cGMP的蛋白激酶磷酸化位点,起始于第137位氨基酸,由氨基酸序列RKLT确定;c)蛋白激酶C磷酸化位点,起始于第23、43、和81位氨基酸,分别由氨基酸序列TFK、TRR、和SPK确定;d)酪蛋白激酶II磷酸化位点,起始于第7位氨基酸,由氨基酸序列STTD确定;e)N-十四烷基化位点,起始于第30、39、52、和149位氨基酸,分别由氨基酸序列GSEVAR[SEQID NO:16]、GIKYTR[SEQ ID NO:17]、GVAKNL[SEQ ID NO:18]、和GLLATG[SEQ ID NO:19]确定。
DRAP没有接近的同源物,但是共享鉴定为MIVVKDESSP[SEQ IDNO:15]并显示于图4D的短基元,它与在几种常见重组酶和其它重组相关蛋白质中发现的基元有关(R.D.Camerini-Otero等人,1995;和W.D.Heyer,Experientia 50:223-233,1994)。DRAP还包含几个DDE基元(见图4B和4C)。DDE基元发现存在于许多转座酶和逆转录病毒整合酶中(F.D.Bushman等人,美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90:3428-3432,1993;C.Cheng等人,细胞(Cell)92:841-850,1998;S.Gangloff等人,Experientia 50:261-269,1994;P.Rice等人,细胞(Cell)82:209-220,1995;和D.J.Sherratt等人,细胞(Cell)93:149-152,1998)。已显示三个氨基酸(即D、D、和E)涉及催化作用,并在其它无关蛋白质中发现。如图4B所示,基元中的氨基酸D、D、和E由可变数目的氨基酸分开。
DRAP的“纯化”指以能够测量其重组酶/拓扑异构酶活性而不受表达该多肽的细胞中其它成份影响的形式分离多肽。本领域众所周知用于多肽纯化的方法,包括,但不限于,制备性圆盘凝胶电泳、等电聚焦、HPLC、反相HPLC、凝胶过滤、离子交换和分配层析、以及逆流分布。对于有些目的,优选在重组系统中生成多肽,其中蛋白质包含便于纯化的额外序列标签,诸如,但不限于,多组氨酸(“His6”)序列。然后可以通过在适当固相基质上进行的层析由宿主细胞的粗制裂解物纯化多肽。或者,可使用针对DRAP或由其衍生的肽产生的抗体作为纯化剂。有可能使用本领域知道的其它纯化方法。
与DRAP强烈反应的蛋白质可用于多种方法,以(亲和)纯化DRAP、增强或抑制DRAP活性、或者在DRAP或其类似物的检测中替代免疫亲和剂(抗体)。可通过多种技术鉴定与DRAP相互作用的蛋白质,诸如免疫共沉淀、共纯化、或遗传技术,诸如酵母双杂交法(B.L.Drees,化学生物学现行观点(Curr Opinions Chem Biol)3:64-70,1999)、用DRAP功能筛选表达文库、及其变异形式。
例如,可通过磷酸化、硫酸化、酰化、或其它蛋白质修饰来修饰分离多肽。还可用能够直接或间接提供可检测信号的标记进行修饰,包括,但不限于,放射性同位素和荧光化合物。
在标准的链转移测定中(见图3C、6C、和7;下文实施例1和6),将同源M13噬菌体双链线形DNA和单链环状DNA一起保温不同时间,用SDS去蛋白质,随后琼脂糖凝胶电泳。高度纯化但非均一的天然蛋白质组分具有有效的链转移酶活性(Eisen等人,1988),并产生与接合分子和/或缺刻环有关的条带。
在非均质组分中,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳时与中和性IgM单克隆抗体发生免疫反应的20kDa物质得到富集(图3D组分28)。当通过溴化乙啶染色琼脂糖凝胶检验接合分子或缺刻环的出现时,由细菌表达的重组DRAP蛋白质的大多数形式展示微弱链转移酶活性。
最初不清楚重组蛋白质展示显然微弱的链转移酶活性的原因。测定得知,不存在接合分子和缺刻环是由于存在由重组DRAP蛋白质展示的另一种重组相关活性,即拓扑异构酶活性。
拓扑异构酶活性是一般性同源重组中用于解离由链转移酶活性形成的接合分子的重要特色(S.Gangloff等人,1994;H.J.Dunderdale等人,自然(Nature)354:506-510,1991;和A.K.Eggleston等人,细胞(Cell)89:607-617,1997)。该活性不是已知的RecA/Rad51家族一般性重组酶或其活性肽的特色。然而,如上所述,拓扑异构酶活性已显示是共享DDE基元的原核位点特异性重组酶、转座酶、与病毒整合酶的整合特性。由于DRAP包含几个潜在的DDE基元,因此检验了其拓扑异构酶活性。
由[SEQ ID NO:4]定义的DRAP重组蛋白质展示有效的、不依赖ATP的拓扑异构酶样活性。将该蛋白质与混合的超螺旋/缺刻环底物一起保温,导致底物的松弛及随后线性化(见实施例6和图6D)。由于缺刻环是使用M13DNA的测定法中完整链转移反应的终产物,因此假定这些产物由DRAP蛋白质拓扑异构酶活性进一步转变成新的双链线性分子。因而,在使用M13病毒DNA底物的标准链转移测定法中,DRAP蛋白质展示了链转移酶和拓扑异构酶两种活性。形成的缺刻环状产物变成线性,而且,在这种情况中,所置换的线性单链的泳动速率与单链环相似,并使之显得溴化乙啶染色的琼脂糖凝胶上只有少许或没有链转移酶活性。然而,可通过双链体底物的末端标记显示链转移(见图6E和6F)。
在末端标记实验中,当用32P标记双链体的两个末端时,可观察双链体两条链的命运。在需要单链和双链DNA二者以及ATP和镁的反应中,入侵的单链环状底物取代了双链体底物中的一条链。所形成的缺刻环被转变成长度与起始底物相同的线性双链体。被取代的线性单链DNA的泳动略慢于单链环状底物。发生了完全的链转移,而缺刻环状中间产物被线性化(图9)。此处讨论和下文提供的范例证实DRAP执行链转移和拓扑异构酶两种活性。
抗DRAP抗体
本发明还涵盖对上述DRAP或其片段特异的抗体,包括,但不限于,针对由[SEQ ID NO:5]、[SEQ ID NO:6]、和[SEQ ID NO:7]定义的肽产生的抗体。当用于本文时,对DRAP特异”的抗体包括,但不限于:结合DRAP但不结合其它核蛋白质,以低于DRAP的亲和力结合来自非果蝇物种、具有DDE基元的RecA样蛋白质的抗体;鉴定DRAP中存在而其它物质中不存在的相关或其它功能结构域的抗体;等等。抗体可以是多克隆的或单克隆的。可以通过免疫接种DRAP或由其衍生的片段在动物宿主中引发抗体,或者可通过免疫细胞的体外免疫形成抗体。用于引起所述抗体的免疫原可以由黑腹果蝇细胞分离,或者在重组系统中生成。
还可在引入了适当抗体编码DNA的重组系统中生成抗体。或者,可通过纯化重链与轻链的生化重建来构建抗体。抗体包括杂种抗体(即包含两套重链/轻链组合,各自识别不同抗原)、嵌合抗体(即其中的重链、轻链、或二者是融合蛋白)、和单价抗体(即包含结合第二种重链恒定区的重链/轻链复合物)。还包括Fab片段,包括抗体的Fab1和F(ab)2片段。
用于生成所有上述类型的抗体及其衍生物的方法在本领域是众所周知的,下文将更详细的讨论。例如,Mayer和Walker在《细胞和分子生物学中的免疫化学方法》(Immunochemical Methods in Cell andMolecular Biology,Academic出版社,伦敦,1987)中公开了用于生成和加工多克隆抗血清的技术。使用Harlow和Lane在《抗体,实验室手册》(Antibodies,A Laboratory Manual,冷泉港实验室,1988)中公开的方法和组合物,以及本领域普通技术人员知道的免疫学和杂交瘤技术,可方便的生成这些抗体。当将天然的或合成的DRAP衍生肽用于诱导对DRAP特异的免疫应答时,可方便的将肽偶联合适载体(诸如KLH),并在合适的佐剂(诸如弗氏佐剂)中施用。优选的是,基本上参照Tam的方法(美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)85:5409,1988),将选择的肽偶联赖氨酸核心载体。
在一个实施方案中,使用本领域标准技术,施用纯化的重组DRAP以免疫小鼠,然后切下脾脏,并将脾细胞用于与骨髓瘤细胞形成杂交细胞,获得分泌抗体的细胞克隆。使用体外测定法,诸如上述用于结合DRAP的测定法,可筛选获得的单克隆抗体。
使用免疫测定法,诸如,但不限于,ELISA,可将抗DRAP抗体用于DRAP的定量。抗DRAP抗体还可用于鉴定、分离、和纯化不同来源的DRAP或相关蛋白质,以及用于进行亚细胞和组织化学定位研究。
DRAP的潜在应用
概述
果蝇重组相关蛋白质、来自其它生物体的同源物、或由其衍生的活性肽,可用于期望依赖同源性的DNA三链配对的任何情形。DRAP可用于具有天然或突变序列的单链探针或核酸(RNA、DNA、PNA、或其它DNA相容性化学衍生嘌呤/嘧啶碱基配对寡核苷酸)与任何双链DNA(诸如基因组DNA、分离的线性DNA、或克隆的DNA)中同源区的体内或体外配对。除了用于单链核酸,DRAP还可用于在5’或3’端具有单链延伸的任何双链DNA和/或双链RNA。用于进行这种依赖同源性的配对的基本方法如下:将DRAP与特异性单链探针(或具有单链末端的双链探针)一起预保温(复合),随后(a)在体内或在体外,将复合物质加到双链DNA中,并(b)保温。保温后,探针-DRAP混合物将酶促修饰双链DNA。图10描述了由重组酶和寡核苷酸驱动的基因转变事件。
引入体内是参照本领域认可的任何方法进行的,包括,但不限于,常用的转化、转染、电穿孔、显微注射、或弹击的任一种方法,即使用化学、物理、或生物学手段将DNA和蛋白质引入分离细胞或者特定组织或器官的细胞和/或含DNA和RNA的区室和细胞器(诸如线粒体和细胞核)(参阅《分子生物学现行方案》(Current Protocols in MolecularBiology),1992及定期更新版本)。
链转移与拓扑异构酶(切割)DRAP活性的联合能够在DNA内定向配对和切割确定位点,继而能够分离和/或除去确定的DNA片段。DRAP可单独使用,或者与其它DNA修饰酶和/或蛋白质联合使用,以实现对双链DNA靶的随后操作。
DRAP还可用于在多种现行方法(如RARE法)中取代RecA(+/-SSB)、RAD51(+/-RAD52)、或其同源物和生化活性肽(L.J.Ferrin等人,1994;和L.J.Ferrin,1995)。这将导致所涉及反应效率的改进,因为DRAP以催化方式而非化学计量方式起作用。换言之,反应只包括单一步骤,因为DRAP具有链转移酶和拓扑异构酶二重活性(见下文实施例6)。
还可在不降低其生化活性(通过链转移或拓扑异构酶测定法)的位点修饰DRAP,以包含可指导和/或增强将该蛋白质投递至特定器官或细胞区室和细胞器的肽序列。可用于这种定向投递的系统的一个非限制性范例包括表面掺入器官特异性摄取配体而内部包被DRAP和诱变DNA的脂质体。同样,可通过随机或定向诱变来修饰天然序列,导致可筛选或选择用于提高突变型蛋白质的期望生化活性的氨基酸替代。
下文记录了DRAP的一些具体应用。
克隆
DRAP可作为“通用”限制酶。将确定的一条或一对寡核苷酸用于在双链DNA模板中产生确定的一步切割。当用于本文时,“通用”指DRAP能够指导对任何用户指定序列的切割,待切割序列是由选择用于在存在DRAP时与待切割双链DNA配对的单链(或具有单链末端的双链)探针的同源性确定的。当用于本文时,“双链DNA模板”定义为基因组、质粒、线性片段、等等中的任何双链DNA。一对这种一步切割将导致由双链DNA模板删除确定片段。由确定寡核苷酸序列和DRAP蛋白质起始的配对将确定用户指定的切割位点。这种双链DNA的范例是基因组DNA、分离的线性片段、或任何/多种克隆载体中包含的DNA,克隆载体诸如HAC(人类人工染色体)、YAC(酵母人工染色体)、BAC(细菌人工染色体)、和PAC(噬菌体人工染色体)、粘粒、质粒、噬菌粒、病毒、或其它载体。
用于进行这种一步切割反应的一种方法,包括,但不限于,将确定的寡核苷酸、DRAP、与双链DNA在含NaCl、Mg2+、和其它成份(为配对和切割而优化)的缓冲液中在适用于双链DNA靶的温度和pH一起保温,正如本领域众所周知的和下文实施例关于链转移酶或拓扑异构酶活性测定法的描述。如下所示,由DRAP起始的反应导致基因的同源重组。这种重组导致天然DNA的切除。与目的基因同源的小寡核苷酸将导致天然基因组DNA其它片段的切除。然后,可分离切除的DNA片段并进行本领域认可的进一步操作,以克隆期望的DNA片段。
基因组克隆和作图
当只知道完整或部分cDNA序列时,通过由序列指导的切割来分离确定的双链DNA片段,将能够由基因组DNA克隆大型基因或基因片段。来自已知cDNA序列5’和3’端的寡核苷酸与DRAP一起可用于由基因组DNA切下大型基因片段。可通过脉冲电场凝胶电泳或其它方法由较大的高分子量基因组DNA分离基因片段。然后,该大型基因组片段可作为高质量探针用于基因组文库筛选或原位作图技术。在双链DNA中,甚至在复杂的完整基因组中,生成确定切割和删除的能力是用DRAP遗传修饰活的细胞和生物体的基础。
DRAP促进的基因破坏或“敲除”和靶向诱变
可以进行DRAP促进的基因破坏以生成敲除突变并在生成的细胞和/或动物上评价这种敲除的影响。还有可能评价化合物或疾病相关基因在“敲除”动物或细胞中的影响,从而例如鉴定可补偿被破坏基因活性缺陷的化合物,或测定特定敲除对疾病发生和/或发展的影响。这种技术能够在细胞基因组的天然位置操作单个单位的遗传信息,和在最终分化的生物体背景中检验该操作的结果。
“敲除”哺乳动物是基因组中包含通过基因打靶方法灭活的特定基因的哺乳动物(如小鼠、猫、狗、牛、绵羊、山羊、等)(参阅如美国专利号5,777,195和5,616,491)。敲除哺乳动物包括杂合子敲除体(即一个缺陷型等位基因和一个野生型等位基因)和纯合子突变体(即两个缺陷型等位基因)。敲除哺乳动物的制备要求首先将用于抑制或破坏特定基因表达的核酸构建物引入称为胚胎干细胞的未分化细胞类型。然后将该细胞注射进入哺乳动物胚胎。然后将包含整合细胞的哺乳动物胚胎移植到妊娠期待孕母亲中。Zhou等人(基因和发育(Genes and Development)9:2623-2634,1995)描述了PPCA敲除小鼠。
术语“敲除”指细胞内由内源DNA序列编码的至少部分蛋白质的表达受到部分或完全抑制。术语“敲除构建物”指设计用于在细胞内降低或抑制由内源DNA序列编码的蛋白质的表达的核酸序列。作为敲除构建物的核酸序列通常包含(a)来自待抑制基因某些部分(外显子序列、内含子序列、和/或启动子序列)的DNA和(b)用于检测细胞中是否存在敲除构建物的标记序列。当给定基因的抑制或敲除将导致已知和可见表型时,不需要标记基因。
通常,将敲除构建物引入细胞并在可防止或中断天然DNA序列转录的整合位点处整合到细胞基因组DNA中。这种插入通常是通过同源重组发生的,即在将敲除构建物引入细胞后,敲除构建物中与内源DNA序列中的同源区域彼此杂交并重组,由此敲除构建物掺入内源DNA的对应位置。敲除构建物核酸序列可包含(a)待抑制基因的一个或多个外显子和/或内含子的完整或部分,(b)待抑制基因的完整或部分启动子序列,或(c)及其联合。通常,将敲除构建物插入胚胎干细胞(ES细胞),并通常通过同源重组过程整合到ES细胞基因组DNA中。然后,将该ES细胞注射并整合到发育胚胎中。
术语“破坏基因”和“基因破坏”指将核酸序列插入基因中天然DNA序列的一个区域(通常是一个或多个外显子)和/或启动子区,从而与该基因野生型或天然存在的序列相比,降低或防止该基因在细胞中的表达。然后在将该核酸构建物转染到细胞中后,构建物将整合到基因组DNA中。如此,由于现在已由DNA构建物破坏了DNA,因此细胞的许多后代将不再表达基因(至少是在有些细胞中如此)或将以降低的水平表达。另外,还可使用包含突变并将导致基因编码或非编码部分改变而产生非功能性基因产物的构建物。这种构建物的范例包括,但不限于,包含删除、倒位、转换、颠换、和剪接供体/受体位点改变的构建物。
以前,在生成敲除突变时进行的同源重组要求DNA敲除构建物的长度为至少大约1kb,优选3-4kb,由此为将敲除构建物引入细胞基因组DNA的重组提供足够互补序列。DRAP可用大型构建物促进这种由同源重组驱动的操作。然而,与当前通过复杂冗长流程建立和生成敲除小鼠的实践方法不同,DRAP能够通过较简易的转染方法直接在体外用“寡核苷酸”(即少于约100bp)插入或修饰基因组DNA。DRAP如此提高了生成转基因动物的效率。
将基因以上述方式发生了同源重组的哺乳动物定义为转基因哺乳动物。
本发明的DRAP蛋白质如此可将特异诱变寡核苷酸靶向复杂基因组中一种或多种同源基因。当用于本文时,“诱变寡核苷酸”指在对应于内源基因序列处包含突变的DNA序列。待用寡核苷酸的非限制性范例包括那些在这种同源基因、内含子、外显子、或调控元件内包含一处或多处碱基替代、删除、或插入的寡核苷酸。
DRAP蛋白质,与本领域熟练技术人员知道的内源DNA修复和重组蛋白质一起,可实现靶基因座的直接修饰。蛋白质与诱变寡核苷酸直接共注射进入小鼠受精卵原核将产生有活力的转基因哺乳动物。
如下文实施例7和8所示,重组DRAP与几种诱变寡核苷酸共注射,以在转基因小鼠中诱导基因转变事件,从而在这种小鼠的基因组中产生靶向突变。显微注射的DRAP和诱变寡核苷酸靶向小鼠合子基因组中的特定基因并修饰该基因座,从而消除(敲除)该基因的功能。该方案可使用一种寡核苷酸来起始一步切割。然后由细胞的双链DNA断裂修复酶修复/修饰该切割。当所编码基因的功能受到这种切割/修复过程的破坏时,基因敲除的频率高达大约30%。与当前的实践方法相比,认为这种直接敲除方法较容易且花费较少。
通过使用两种来自目的基因的诱变寡核苷酸可进一步增强这种方法,正如上文关于在克隆和基因作图应用中产生删除的建议。这将在基因中产生比单一双链断裂更难由细胞修复的间隙删除,且将进一步提高消除基因功能的可能性。
这些方法通常可用于所有细胞类型,且不限于生成转基因动物。通过任何上述已知方法和本领域熟练技术人员知道的方法,还可将一种或多种天然或突变寡核苷酸和DRAP引入特定细胞或器官。这种插入在特定细胞或器官类型中导致敲除,并可用于在代谢紊乱或癌状态治疗中消除引起疾病的基因和/或融合基因的功能.
还可在该特异性寡核苷酸之前或之后引入DRAP cDNA,作为游离型遗传元件或作为转基因,受到适当设计的表达体系的控制,从而能够进行组织特异性和/或诱导剂控制的表达。使用组织特异性启动子或可诱导启动子,经DRAP的受控表达,可实现这种组织特异性。这种方法还能够靶向修饰下述有机体的基因组DNA中的特异DNA序列:整合型病毒(诸如,但不限于,HIV);酵母;原核细胞;培养物中的真核细胞;和离体或体内器官中的细胞。还可用超过一种的上述寡核苷酸进行这些方法中的每一种。
利用HIV DNA的这种方法的范例将包括引入DRAP蛋白质或含DRAPcDNA的游离型构建物与经修饰HIV病毒寡核苷酸或cDNA。外源或表达的DRAP将通过突变型HIV寡核苷酸或cDNA的指导在基因组整合位点处切割整合到基因组中的HIV病毒,产生无活性的HIV病毒。这种方法可用于用已知序列灭活任何整合基因。
本发明的范围包括敲除了两种或更多基因的哺乳动物细胞或器官。通常通过重复本文用于产生单一敲除的流程,通过引入额外的寡核苷酸构建物,或通过将各自包含单一基因敲除的哺乳动物育种并筛选包含双重敲除基因型的后代,产生这种哺乳动物细胞或器官。
RNA干涉
通过经RNA干涉现象有效削弱、敲除、和/或降低靶基因的mRNA表达水平,DRAP相关的依赖同源性的链配对和链切割活性可促进基因表达中的可遗传或非遗传(瞬时)变化。文献中已提到了RNA干涉(RNAi)(参阅J.M.Bosher等人,自然细胞生物学(Nat Cell Biol)2(2):E31-36,2000;和C.P.Hunter,Curt Biol 9(12):R440-442,1999,17),也称为基因沉默。RNAi可用于动物、植物、和酵母细胞。已知它涉及多种基因和基因产物,但是尚未知道所涉及的所有基因和基因产物。DRAP具有单独和/或与内源细胞蛋白质联合促进这种作用必不可少的活性。
治疗性用途
将DRAP和寡核苷酸探针引入特定细胞类型并靶向待破坏的特定基因的能力暗示这种方法学具有某些治疗性用途。已知某些病理学状况是由突变型内源基因(p53、BRCA1、雌激素受体“ER”、等等)的表达引起的,或者是由整合的病毒基因(HIV-1、HIV-2、等等)的表达引起的。同样,正常基因(如药物转运蛋白)的上调可限制传统疗法的效力。当通过任何本文所述方法将DRAP和靶向探针引入受影响细胞后,可破坏/消除引起或促进疾病的基因的表达。这种破坏/消除可导致疾病的治愈、减轻、或更易受传统疗法影响。
DRAP和单链(或具有单链末端的双链)探针可用于在内源基因内指导切割(随后由细胞修复)的用途,暗示本文所述方法可用于基因疗法。将中部插入正常(野生型)或突变型序列而侧翼为特定单链尾的双链DNA片段引入含与该单链侧翼序列同源的序列的基因组内特定基因座。片段各端由DRAP指导的切割使细胞能够通过用外源区段取代内源区段来修复对内源基因座的损伤。如此,可实现简单盒交换并改变细胞基因型。
                      实施例
实施例1:黑腹果蝇重组相关蛋白质(DRAP)基因的分离和初步鉴定
通过硫酸铵沉淀,然后在S-Sepharose柱、SS-DNA琼脂糖柱、和凝胶过滤柱上进行层析分离果蝇胚胎核提取物,以分离具有有效链转移酶活性的蛋白质级分。图3A提供了所用纯化方法的示意图。图3B显示了由单链(SS)DNA琼脂糖柱洗脱的组分的纯化。用含500mM NaCl的缓冲液由SS DNA琼脂糖柱洗脱组分。在配备了标称分子量截留值(nominal MW cutoff,NMWCO)100、30、和10kDa滤膜的Centricon离心装置上连续浓缩蛋白质组分。用M13mp18线性双链DNA(DS)和M13mp18单链环状DNA(SSC),对每一装置的滞留物(图3B和3C中的R)和滤过物(图3B和3C中的F)测定链转移酶活性(图3C)。图3C证实了所测组分中存在活性,因为除了接合分子和缺刻环,还形成了高分子量蛋白质-DNA聚集物(AG)。在高盐(500mM NaCl)组分中,活性物质表现>30kDa。高盐洗脱形成了多聚DRAP复合物。
图3D提供了起始核提取物(NE)和由Sepharose(S)、SS DNA(D)、和Sephacryl HR-200凝胶过滤(GF)柱洗脱的活性组分的银染蛋白质凝胶。活性在凝胶过滤过程中于生理盐水(1x PBS)与20kDa物质共富集。
抗DRAP抗体的生成及应用
将保留了DRAP特异活性(即形成接合分子和高分子量蛋白质-DNA聚集物的能力)的高度纯化组分用于在兔中生成多克隆抗血清,并通过体外方法生成单克隆抗体(IgM)(C.L.Reading,酶学方法(MethodsEnzymol.)121:18-27,1986)。通过凝胶过滤由细胞培养物上清液分离IgM单克隆抗体,并选择其抑制链转移酶活性的能力。这些抗体制剂被证明可用于几种目的。
虽然IgM单克隆抗体制剂的亲和力比IgG制剂低因而更难以应用,但是却被用于在Western印迹上鉴定推定的重组酶蛋白质条带(图3E和3F)和用于鉴定免疫反应性重组酶表达克隆(如下文概述)。IgM抗体的亲和力通常比IgG抗体低,但是由于其单克隆本性和其较低亲和力,能够在天然条件下免疫纯化蛋白质,因而在此处更加有益。
一是,将抗体用于在Western印迹上鉴定活性成份(图3E)。图3E显示了能够与兔多克隆抗体(PAb)和中和性小鼠单克隆IgM(Mab)二者反应的来自Sephacryl HR-200凝胶过滤柱纯化提取物的Western印迹。资料显示20kDa物质能够与所述抗体反应。
二是,将抗体用于由果蝇核提取物直接免疫亲和纯化活性成份(图3F)。图3F描述的Western印迹证实在IgM免疫亲和柱上直接由核提取物分离20kDa物质,伴随少量的其它一些交叉反应和/或相互作用物质。
三是,将抗体用于筛选果蝇cDNA表达文库以鉴定表达免疫反应性肽的克隆。
四是,将抗体用于寻找与大量已知重组相关蛋白质的免疫交叉反应性。
表达克隆和cDNA的分离
将与两种独立抗体制剂免疫反应的克隆噬斑纯化。通过PCR扩增克隆插入片段,并与由得自PVDF膜上假定的免疫反应性重组酶蛋白质条带的氨基酸序列构建的测试寡核苷酸一起用于Southern印迹。
将一个强烈免疫反应性克隆测序,并将编码的蛋白质表示为果蝇重组相关蛋白质(DRAP)。该cDNA克隆的长度为1378bp[SEQ ID NO:1],并将最长ORF鉴定为[SEQ ID NO:3],编码169个氨基酸[SEQ ID NO:5],尽管起始密码子很可能是第11位密码子Met。由第11-169位密码子定义的DRAP氨基酸序列鉴定为[SEQ ID NO:4],它由鉴定为[SEQ ID NO:2]的DNA核苷酸序列编码。
实施例2:DRAP与其它蛋白质的同源性
通过BLAST数据库搜索确定,分离的DRAP cDNA或编码序列没有显著同源物。然而,以全长果蝇cDNA作为探针,在使用人DNA的基因组Southern印迹上有交叉杂交。而且,尽管BLAST搜索没有发现氨基酸序列密切同源性,因而也没有蛋白质密切同源物,但是与抗DRAP抗体的反应指出,与大肠杆菌RecA有微弱关系,而与T4基因32蛋白质(解旋酶)和(牛)拓扑异构酶1有稍微更强的关系。
鉴定了DRAP蛋白质中预测最亲水部分的氨基酸序列。将这些假定的抗原性位点用于鉴定免疫学交叉反应性蛋白质中的相似氨基酸序列,和用于搜索数据库。以这种方式鉴定了在Flp位点特异性重组酶中最保守的10个氨基酸的基元[SEQ ID NO:15](图4D)。
实施例3:DRAP基因和转录本的定位
以洋地黄毒苷标记的DRAP cDNA作为探针的多线染色体原位杂交研究显示,该蛋白质的基因定位于果蝇染色体条带63C/D。该基因座是重组缺陷突变(meiS282)的遗传定位所在。
图5A描述了使用由DRAP cDNA克隆制备的含洋地黄毒苷的反义DNA单链探针在果蝇胚胎滋养细胞上进行的原位杂交研究。探针的检测(紫色染色)指出,在卵巢滋养细胞中转录由母体编码的DRAP基因。
图5B描述了使用相同的含洋地黄毒苷的反义DNA单链DRAP探针在果蝇胚胎上进行的原位杂交研究。资料显示,在母体表达DRAP后,转录本随后均一分布于胚胎中。这说明基因产物可能涉及有丝分裂重组、DNA修复过程、和/或种系发育。
实施例4:DRAP的表达
由cDNA的ORF中第11位或第60位密码子Met起始,与N端或C端(His6)纯化表位一起,在体内表达重组形式的DRAP蛋白质。纯化在细菌中表达的重组蛋白,并检验DNA链转移酶活性。由经修饰pRSET(B)载体在大肠杆菌菌株HSM174(DE3)中表达重组型果蝇重组相关蛋白质(DRAP),其包含在由第1个Met(第11位密码子)起始的cDNA克隆开放读码框N端的11个额外氨基酸(掺入His6纯化表位)。表达产生大约21kDa的蛋白质。
重组蛋白在昆虫细胞/杆状病毒系统中的表达很差,且难以纯化。
实施例5:蛋白质的纯化
DRAP
图6A提供了重组蛋白的纯化示意图。在500ml Terrific培养基“TB”[每升含10g细菌用胰蛋白胨、5g细菌用酵母提取物、和10gNaCl,调pH7.0]中培养大肠杆菌至OD6000.7,然后加入IPTG至1mM,以诱导蛋白质表达3小时。将沉淀的细菌冻存于-80℃。随后将沉淀重悬于添加0.1%吐温20的碱性缓冲液“BB”[300mM NaCl和50mM NaPi,pH8.0],并在弗氏压碎器中进行裂解。通过离心沉淀裂解物中的不溶物。将上清液过滤(0.2μm)并流经5ml Ni-NTA柱(Qiagen)。用添加0、5、和10mM咪唑的BB缓冲液各10倍柱床体积清洗柱子,并用3倍柱床体积添加250mM咪唑的BB洗脱重组蛋白。使用Ultrafree 10kDa装置(Millipore)浓缩洗脱液,使用10DG柱(Bio Rad)脱盐成含50mMNaCl的缓冲液[xmM NaCl、15mM Tris-HCl、3mM醋酸镁、lmM EDTA、0.4mM PMSF、10%甘油,pH7.5],并流经5ml磷酸纤维素柱。用含高达500mM NaCl的柱缓冲液洗去弱粘附蛋白质,并用含1M NaCl的柱缓冲液洗脱重组蛋白。合并含重组蛋白的收集液,如上浓缩,并加样至用转基因缓冲液“TG”[10mM NaCl、10mM Tris-HCl、lmM MgCl2、和0.1mMEDTA,pH7.5]平衡的250ml Sephadex G75凝胶过滤柱。将含重组蛋白的各个收集液浓缩并通过SDS-PAGE进行检验(见图6B)。合并均一收集液并过滤(0.2μm)。通过Bradford法(Bio-Rad)测定蛋白质浓度,以BSA作为标准。合并的均一物质的终浓度是60ng/μl。
大肠杆菌RecA和单链结合蛋白
用TG缓冲液将均一的大肠杆菌RecA蛋白质(Promega)1∶1稀释,然后使用几个用TG缓冲液平衡的微量Bio-spin P6柱(Bio Rad)脱盐。终浓度是480ng/μl,并用TG缓冲液将物质适当稀释以供应用。图6B是12%微量凝胶SDS-PAGE后的考马斯蓝染色,显示了这两种蛋白质和预先染色的MW标记(Benchmark,BRIL)。在TG缓冲液中相似配制SSB。
实施例6:DRAP的活性
如上所述,用Ni-NTA(Qiagen)、磷酸纤维素(Whatman)、和Sephadex 75(Pharmacia)柱连续纯化N端His6标记的重组DRAP,随后离心浓缩(Millipore)。在多种测定法中比较该物质与商品化大肠杆菌单链结合蛋白(SSB,Promega)和RecA(Promega、Pharmacia、和USB)。
在考马斯蓝染色的12%聚丙烯酰胺凝胶上观察纯化和商品化蛋白质(调至60ng/μl):DRAP蛋白质(5和2.5μl)、SSB(5μl)、和RecA(5μl;Pharmacia和USB)(图6B)。
A.DRAP生成的接合分子比RecA/SSB少
上文实施例1和图3C所述链转移测定法指出,DRAP生成的接合分子比RecA/SSB少。
在第二种标准链转移测定法中,在由双链线性分子(DSL)和单链环状分子(SSC)生成接合分子(JM)和缺刻环(NC)方面,RecA/SSB(Promega)显得比DRAP更有效(图6C)。
重组DRAP在链转移酶测定法中在存在ATP(1mM)和Mg(10mM)时与SSC和DSL底物形成大型蛋白质-DNA聚集物(AG),但在用SDS去蛋白后不形成JM或NC(图6E)。
对这些相同链转移反应中使用的DSL进行末端标记指出,DRAP在含ATP和Mg的反应中确实进行链转移(图6F)。在加入含SDS的加样染料前,发现所有SS DNA和许多DSL DNA存在于凝胶顶部的蛋白质-DNA聚集物(AG)中。去蛋白后,标记与DSL和SSL物质共泳动。SSL产物的形成要求SSC和DSL底物以及ATP。另外,将DSL底物单独与DRAP一起保温不形成SSL产物(图7)。
                 标准链转移活性测定法
                                  DRAP    RecA/SSB
DRAP(60ng/μl)                    1μl
RecA(240ng)                               1μl
SSB(200ng)                                1μl
ss DNA+ds DNA(各50ng/μl)         2μl    2μl
10x Tris(200mM,pH7.35)           1μl    1μl
l0x MgCl2(50-100mM)              1μl    1μl
10x ATP或H2O(10mM)               1μl    1μl
ddH2O                            4μl   3μl
                                  10μl   10μl
于37℃保温30分钟
加样缓冲液(添加SDS)               3μl   3μl
总体积                            13μl   13μl
在0.8% 1xTAE琼脂糖凝胶上于4-6V/cm分离1-2小时,电泳缓冲液(1xTAE)中含有溴化乙啶,或者电泳后染色,随后照相记录。
加样缓冲液:1x TAE、50%甘油、2.5%十二烷基硫酸钠(“SDS”)、和溴酚蓝(“BPB”)。
上述标准链转移测定法实验指出,与使用RecA/SSB(或RAD51/RAD52)时观察到的一样,DRAP并不随着中间产物(JM或NC)的生成而停止。单独使用DRAP的反应进行至完全分解重组产物,与用分解性的内切核酸酶Ruv A、B、和C重建的含RecA/SSB重组系统时观察到的相似。因而,DRAP具备用“寡核苷酸”(即少于约100bp)直接插入或修饰目的基因内小段单链或双链DNA的能力。
B.DRAP具有拓扑异构酶活性
多种重组酶展示拓扑异构酶1样活性。当将该蛋白质与超螺旋质粒一起保温时,将切割DNA的一条链并可重新连接。若另一DNA链经过瞬时缺刻,则质粒松弛。缺刻DNA甚至可线性化。该活性是由DRAP展示的,而RecA(与单链结合蛋白SSB一起)也展示较低程度的该活性。该活性依赖Mg,但不依赖ATP。
在拓扑异构酶测定法(见下文所述测定条件)中,将包含超螺旋(SC)和缺刻环状(NC)DNA形式的M13mp18质粒制剂与DRAP(60ng)或RecA/SSB(240/200ng)于37℃保温30分钟。用含SDS的加样染料终止反应,并通过琼脂糖凝胶电泳分离产物。DRAP在不依赖ATP的反应中以显著高于RecA/SSB的程度生成双链线性(DSL)DNA分子(图6D)。
              拓扑异构酶活性测定法
                              DRAP    RecA/SSB
DRAP(60ng/μl)                1μl
RecA(240ng)                           1μl
SSB(200ng)                            1μl
质粒(50ng/μl)                1μl    1μl
10x Tris(200mM,pH7.35)       1μl    1μl
10x MgCl2(50-100nM)          1μl    1μl
10x ATP或H2O(10mM)           1μl    1μl
ddH2O                        5μl   4μl
                              10μl   10μl
于37℃保温30分钟
加样缓冲液(添加SDS)           3μl   3μl
总体积                        13μl   13μl在0.8% 1xTAE琼脂糖凝胶上于4-6V/cm分离1-2小时,电泳缓冲液(1xTAE)中含有溴化乙啶,或者电泳后染色,随后照相记录。
加样缓冲液:1x TAE、50%甘油、2.5% SDS、和BPB。
图6D所示资料证实,DRAP拓扑异构酶活性的存在引起SC向NC和NC向线性形式DNA的转变,出现新的线性条带。
C.DRAP不具有依赖ATP的解旋酶活性
图7显示了DRAP不具有依赖ATP的解旋酶活性。该图显示,在上文A部分所述使用DRAP的标准三链反应中,生成了置换的单链DNA条带。由经标记双链DNA置换一条链并不是依赖ATP的解旋酶反应的结果。资料显示,双链DNA与DRAP的保温,不管是在单独或者ATP存在与否时进行,都没有发生由于解旋或解旋酶活性引起的链置换。在与同源SSC一起保温时,发生非常有限的DNA置换,而在与同源超螺旋质粒双链DNA(“SCP”)一起在不存在ATP保温时,不发生链置换。只有在存在同源SSC而非SCP且与DRAP和ATP共保温时,才由经标记DSL DNA发生显著链置换。
           **************************
资料证实将DRAP与双链DNA(2条链)或双链超螺旋质粒DNA(4条链)一起保温时不生成产物,而与双链和单链环状DNA(3条链)一起保温时引起同源重组。因而,所有上述资料证实DRAP展示与不依赖ATP的拓扑异构酶I样切割活性偶联的依赖同源性和ATP的三链转移活性。
D.DRAP不具有核酸酶活性
进行实验来测定在重组DRAP样品中是否存在会降解待用诱变寡核苷酸的任何核酸酶活性。测定条件概述如下:
                  核酸酶活性测定法
蛋白质样品             (60ng/μl)           1μl
寡核苷酸               (5ng/μl)            1μl
10x Tris               (200mM,pH7.35)      1μl
10x MgCl2             (100mM)              1μl
10x ATP(Y-S)           (10mM)           1或0μl
ddH2O                                  5或6μl
                                        10μl
于37℃保温30分钟
加样缓冲液(添加SDS)                     3μl
总体积                                  13μl
在8×10cm 6% 1xTAE微型凝胶(MiniProtean,BioRad)上于250V分离14分钟。将凝胶在滤纸上干燥并对胶片曝光。
加样缓冲液:1x TAE、50%甘油、BPB、和二甲苯腈蓝。
任何寡核苷酸都可用于该测定法。对于这个实验,使用T4多核苷酸激酶用32P-ATP在5’末端标记由pUC19多位点接头中央部分衍生的寡核苷酸(33聚体):
5’-GGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAG-3′[SEQ ID NO:20]
在Qiaquick柱上用PN缓冲液(Qiagen)纯化寡核苷酸,OD260指示浓度为5ng/μl。任何寡核苷酸序列都可用于该实验。将SEQ ID NO:16的寡核苷酸与60ng DRAP或RecA在多种缓冲液中于37℃保温30分钟。加入加样缓冲液并在6% 1xTAE聚丙烯酰胺微型凝胶上于250V分离14分钟。将凝胶干燥,并使用增感屏于-80℃使胶片曝光大约16小时。没有观察到寡核苷酸的降解(图8)。在存在ATP-γ-5时的RecA凝胶移位与该蛋白质的已知特性一致。该资料显示DRAP不具有核酸酶活性。
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由上述资料能够假定DRAP作用机制的非限制性模型。图9描述了该模型,但并非将本发明限制于这种机制。图9中的示意图指出DRAP是如何偶联其链转移与拓扑异构酶活性的。在不依赖ATP的反应中,DRAP能够使超螺旋(SC)质粒底物松弛和线性化。DRAP还能够由双链线性(DSL)和单链环状(SSC)底物形成接合分子(JM)和缺刻环(NC),这与RecA/SSB的活性相似。RecA/SSB将反应终止于JM/NC阶段,而DRAP由于其拓扑异构酶活性而进一步进行反应。有了重组DRAP,JM完全转变成NC,而NC转变回DSL。尚未确定切割位置,而图9指出了可能的推定产物。
实施例7:转基因小鼠的初步生成
使用DRAP和对应于N-myc:
5′-TTTCCTGAAAAGC TTATTCAGCACCCGAA-3′(有义链)[SEQ ID NO:21];
β-1珠蛋白,5′-ATGGTGCACCTGACTGATG TTGAGAAG-3′(有义链)[SEQ ID NO:22];和Agouti基因的突变寡核苷酸(突变寡核苷酸是标有下划线的粗体)进行最初的转基因实验(见图11)。
寡核苷酸DNA的注射量取决于常规转基因实验中对注射的“基因大小”DNA分子数的估计值。估计在通常的转基因实验中注射每皮升(“pl”)大约500个分子。对于30聚体寡聚物,这换算成浓度是大约7.5ng/ml。在优选实施方案中,所用诱变寡核苷酸的5’末端应当是水解的(“5’OH”)。
对每次共注射检验了3种不同蛋白质:核苷酸比率。“低”比率相当于1个蛋白质分子/1个寡核苷酸。“中”比率与对RecA观察的1个蛋白质分子/3个核苷酸(10个蛋白质分子/30聚体)比率一致。“高”比率是上述RecA观察值的十分之一,即终比率100个蛋白质分子/30聚体。在任何共注射比率对胚胎都没有观测到毒性。
如图11所示,在“高”比率观察到表型改变。N-myc打靶的死产表型与胚胎致死(即传统的“敲除”)一致。β1-珠蛋白打靶的矮小表型与小鼠胚胎和/或新生鼠发育过程中β或高度同源珠蛋白带氧能力的潜在改变一致。因而,该比率的蛋白质:寡核苷酸是所有其它转基因研究的起点。还应当在重新移植被注射合子前,测定增加DNA和/或蛋白质的量对胚胎的毒性。图11提供了这些实验的资料。该资料显示,利用针对N-myc外显子1和β1-珠蛋白基因的含5’OH寡聚物的实验生成了表型上的转基因小鼠,而用Agouti 5′OH寡聚物生成的小鼠没有明显的表型改变。
通过来自多只动物的DNA的限制性分析确定了N-myc和β1-珠蛋白基因座没有发生直接取代。
实施例8:其它转基因实验
其它靶基因的选择
检验小鼠遗传数据库以获取候选基因,从而测试DRAP在转基因小鼠中生成靶向突变的能力。标准如下:
1.该方法应当能够再现已知的点突变。
2.已知突变应当与易于通过分子方法确认的可观察表型相关。
3.突变/表型应当是常染色体显性或半显性的。
4.突变/表型应当不是致死的,甚至在纯合子时也不致死。
根据这些标准,选择了c-Kit酪氨酸激酶受体。该基因中的突变引起白色斑点表型。最佳诱变等位基因是W-42。这种错义突变生成可通过切割PCR产物来评价的限制性片段长度多态性(RFLP)。此外,数据库修饰并中只有少许相关序列与建议的诱变寡核苷酸相似。
图12显示了经测定适合修饰的基因部分以及将产生的新RFLP。由于皮毛颜色变化容易显现,而且能够通过照相记录证实,因此我们试图用诱变寡核苷酸修饰c-kit基因。
DRAP与c-kit寡聚物的注射
以DRAP:寡核苷酸摩尔比10∶1的浓度将DRAP与含5′P的c-kit寡核苷酸[SEQ ID NO:9]共注射到小鼠受精卵的雄原核中。在该实验中,使用如美国专利号4,873,191所述标准转基因方案,对每个胚胎注射大约500,000个分子的DRAP与大约50,000个分子的寡核苷酸。
在两个水平对转基因动物进行突变c-kit分析。
第一个分析水平是评价白色斑点表型的可视证据。图13描述了由共注射DRAP与诱变c-kit寡核苷酸生成的白色斑点小鼠以及无斑点对照小鼠的照片。该资料描述了野生型基因的破坏足以改变胚胎的基因产物,消除基因功能,和生成预期白色斑点表型。
第二个分析水平是进行c-kit基因的分子分析以证明基因转变事件。通过使用鉴定为[SEQ ID NO:9和10]的PCR引物,对外显子17的完整或部分片段的基因组DNA PCR扩增进行分子分析。随后测定在基因转变事件中是否生成新的ApoI或Tsp509I限制性位点。由于外显子较小(124bp)且切割接近片段的一个末端,因此在6%聚丙烯酰胺凝胶上分离限制性消化产物。
对于限制性分析,Tsp509I可能是酶的较佳选择,因为ApoI受制于“星活性”。星活性能够产生假阳性结果。对于最终确认,可将PCR物质克隆到标准载体中,然后测序。需要的所有至关紧要的酶都是商品化的(NEB及其它公司)。
本文特别收入上文确定的所有参考文献,因为它们描述、提出、提供基础、或者授予对实践本发明的一个或多个实施方案可能重要的组合物和/或方法。

Claims (22)

1.包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、和SEQ ID NO:3构成的组的序列的分离核酸。
2.包含编码SEQ ID NO:4所示多肽的核苷酸序列的分离核酸。
3.包含权利要求1或2定义的核酸并可操作连接转录调控元件的核酸载体。
4.包含权利要求3定义的载体的细胞。
5.权利要求4定义的细胞,其中所述细胞选自细菌、真菌、昆虫、和哺乳动物细胞。
6.用于产生多肽的方法,包括:
a)在适于表达DRAP多肽的条件下培养权利要求4定义的细胞;并
b)由所述培养物回收所述多肽。
7.包含由SEQ ID NO:4定义的氨基酸序列的分离多肽。
8.一种分离的多肽,其特征在于具有重组酶和拓扑异构酶活性,并且由可与包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3中的序列的分离核酸可杂交的核酸所编码,其中所述杂交是通过在由4×SSC、1×Denhardt、25mM NaPO4(pH7)、2mM EDTA、0.5%SDS和100μg/ml超声处理过的鲑鱼精DNA组成的缓冲液中于65℃杂交12小时,随后连续用下述溶液洗涤而达到的:(1)用2×SSC、1×Denhardt和0.5%SDS于65℃洗涤45分钟,4次;(2)用0.2×SSC、0.1%SDS于65℃洗涤45分钟,2次;和(3)用0.1×SSC、0.1%SDS于65℃洗涤45分钟。
9.对确定的DNA区段进行靶向诱变的方法,包括将权利要求8所述的分离多肽和与所述DNA区段同源的寡核苷酸引入包含所述区段的细胞。
10.权利要求9的方法,其中所述的分离多肽包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
11.除去确定的DNA区段的方法,包括将权利要求8所述的分离多肽和与所述DNA区段同源的寡核苷酸引入包含所述区段的细胞。
12.权利要求11的方法,其中所述的分离多肽包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
13.促进确定的DNA区段的基因破坏的方法,包括将权利要求8所述的分离多肽和与所述DNA区段同源的寡核苷酸引入包含所述区段的细胞。
14.权利要求13的方法,其中所述的分离多肽包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
15.包含具有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的分离多肽的蛋白质样品,其中所述多肽至少为样品中总蛋白质重量的大约1%。
16.包含具有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的分离多肽的蛋白质样品,其中所述多肽至少为样品中总蛋白质重量的大约10%。
17.一种分离的第一核酸,其在高度严谨杂交条件下可与第二核酸杂交,其中所述第二核酸包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQID NO:3中的序列,并且所述的分离第一核酸编码具有重组酶和拓扑异构酶活性的多肽。
18.权利要求17的分离核酸,其中所述分离核酸至少约100个核苷酸长。
19.权利要求18的分离核酸,其中所述分离核酸至少约200个核苷酸长。
20.一种分离的核酸,其中包含作为脱氧核糖核酸的分离的第一核酸,该第一核酸:
(1)在高度严谨条件下与包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3中的序列的第二核酸可杂交;并且
(2)编码包含重组酶和拓扑异构酶活性的多肽。
21.权利要求20的分离核酸,其中所述分离核酸至少约100个核苷酸长。
22.权利要求21的分离核酸,其中所述分离核酸至少约200个核苷酸长。
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