KR20170058985A - 단모를 갖는 동물을 생산하기 위한 물질 및 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 단모의 동물을 생산하기 위한 물질 및 방법에 관한 것이다. 바람직한 양태에서, 이는 동물의 프로락틴 수용체(PRLR) 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 조작하여 단백질의 절단된 버젼을 생산함으로써 성취된다. 유리하게는 및 놀랍게는, 본 발명에 따라 생산된 절단된 단백질은 젖촉진 기능성은 유지하면서, 상기 동물이 단모 코트를 갖도록 한다.

Description

단모를 갖는 동물을 생산하기 위한 물질 및 방법{MATERIALS AND METHODS FOR PRODUCING ANIMALS WITH SHORT HAIR}
관련 출원에 대한 상호참조
본원은 2014년 9월 23일자로 출원된 미국가출원 제62/054,169호를 우선권 주장하고, 이의 전체 내용은 본원에 참조로서 혼입된다.
본원에 대한 서열 목록은 SEQ-LIST-9-18-15-ST25.txt로 표지되고, 이는 2015년 9월 18일자로 생성되었고 33 KB이다. 상기 서열 목록의 전체 내용은 본원에 참조로서 혼입된다.
다양한 상황에서, 동물이 단모의 코트(coat)를 갖는 것은 바람직하다. 이는 특히 일부의 동물에서 열 스트레스를 경감시키는데에 유용하다. 단모가 미용 및/또는 알러지의 이유를 위해 바람직한 예도 있다.
내열성은 큰 가축, 특히 축우(cattle)에 있어서 중요한 특성이다. 열은 미국에서 매년 수천마리의 축우를 죽이고, 축우의 효율을 감소시키며 고효율 품종이 뜨거운 기후에서 사용되는 것을 제한한다. 열 스트레스를 축우에서 감소시키기 위한 하나의 방법은 털을 짧게하는 것이다. 축우에서, 단모 코트는 "미끈한(slick)" 코트로 명명되며, 관련된 유전자는 슬릭(SLICK) 유전자라 명명되고, 단모 코트의 표현형은 "슬릭 표현형"이라 명명된다.
일부의 축우 생산자들은 그들의 가축을 여름에 면도하여 내열성을 증가시키지만, 이 방법은 극도로 노동 집약적, 고비용 및 큰 무리의 가축에 비실용적이다. 상기의 슬릭 표현형은 세네폴(Senepol), 카로라(Carora) 및 로모시누아노(Romosinuano)를 비롯한 서아프리카 혈통의 일부 축우 품종에서 자연스럽게 발견되지만, 이 품종들은, 내열성을 증가시키지 않으면, 축우 산업에서 이들의 유용성을 제한하는 보통의 효율 및 고기 품질을 갖는다.
슬릭 표현형의 유전적 기초는 단일 유전자 우세로서 확인되었다(문헌[Olson et al. (2003), J Anim Sci.; 81(1):80-90]). 종래의 연관 분석은 축우의 20번 염색체의 5백만 염기쌍 영역에서 원인 유전자를 찾아내었다(문헌[Mariasegaram et al. (2007), Anim Genet.; 38(1):54-59]). 상기 영역을 게놈 영역 연관성 연구(Genome Wide Associational Study, GWAS)를 사용하여 더욱 협소화시켰다(문헌[Huson et al. (2014), Front Genet.; Apr 29, Vol.5:101]). 그러나, 보다 협소화된 영역은 유전자를 거의 함유하지 않았고, 이 중 어떠한 영역도 돌연변이를 함유하지 않았다. 따라서, 협소화는 아마도 착오였다.
열 스트레스 하에서 항상성을 유지하기 위한 능력은 아열대 및 열대 지역에서 축우에게 특히 중요하다. 내열성에서의 품종 간의 차이가 다년간 연구되어 왔지만, 상대적으로 아주 적은 노력이 내열성에 관련된 유전 방식의 설명을 지향하였다. 열 스트레스 하에서 체온 차이가 오스트레일리아에서 연구되었고 낮은 내지 보통의 유전력을 갖는 것으로 보였다(문헌[Turner, 1982; 1984; Mackinnon et al., 1991; Burrow, 2001]). 또한, 세네폴 축우는 브라만 축우와 동일한 내열성을 갖는 것으로 보고되었고(문헌[Hammond and Olson, 1994; Hammond et al., 1996]), 온대 품종과의 세네폴 F1 교배종들은 브라만 및 브라만 교배종의 내열성과 비등한 내열성을 보였다(문헌[Hammond and Olson, 1994; Hammond et al., 1996; 1998]).
지금까지, 어떠한 돌연변이가 슬릭 코트 표현형의 원인이 되는지 공지된 바 없었다.
본 발명은 단모의 동물을 생산하기 위한 물질 및 방법을 제공한다. 바람직한 양태에서, 이는 동물의 프로락틴 수용체(PRLR) 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 조작하여 단백질의 절단된 버젼을 생산함으로써 성취된다. 유리하게는 및 놀랍게는, 본 발명에 따라 생산된 절단된 단백질은 젖촉진 기능성(lactogenic functionality)은 유지하면서, 상기 동물이 단모 코트를 갖도록 한다.
하나의 양태에서, 본 발명은 절단된 PRLR 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 제공한다. 상기 폴리뉴클레오타이드 서열은 절단된 C-말단에 대한 뉴클레오타이드가 없을 수 있거나, 상기 뉴클레오타이드가 존재하면 이는 N-말단을 암호하는 뉴클레오타이드와 함께 해독틀(reading frame) 밖에 존재한다.
추가적인 양태에서, 본 발명은 단모를 갖는 동물을 생산하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 젖촉진 기능을 제공하는 아미노산을 갖지만 장모 코트와 관련되는 야생형 단백질의 C-말단으로부터의 아미노산을 함유하지 않는 절단된 PRLR 단백질을 동물에서 발현하는 단계를 포함한다.
특정한 양태에서, 본 발명은 PRLR 단백질의 젖촉진 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(예컨대, 서열번호 3)를 게놈 안에 갖지만 장모 코트를 야기하는 아미노산을 암호화하는 뉴클레오타이드(예컨대, 서열번호 6)는 결여되거나 적어도 이의 부분이 결여된 유전적으로 조작된 축우를 제공한다. PRLR 유전자의 하나 또는 2개의 모든 카피가 돌연변이되거나 절단되어 축우가 절단된 보스 타우러스(Bos taurus) PRLR 단백질을 발현하고 단모 코트 표현형을 나타내는, 유전적으로 조작된 축우가 또한 제공된다.
유리하게는, 동물에서 코트 길이 및 이에 의해 열 스트레스에 영향을 끼치는 슬릭 유전자의 확인은 이 특성을 온대 품종에서 조작하여 온난 기후에서 축우의 생산성을 증가시키는 것을 가능하게 한다. 본 발명에 따라, 열 스트레스의 기간 동안에 증가된 배아 생존력 및 보다 많은 우유 생산을 통해 젖소의 생식력이 성취될 수 있다. 슬릭 모발의 온대 솟과 품종으로의 혼입은 전에 가능했던 것보다 큰 열 스트레스의 조건 하에서 상기 품종이 성공적으로 사육될 수 있도록 한다.
서열의 간단한 설명
서열번호 1은 축우(보스 타우러스) PRLR의 전장(full length) mRNA 서열이다.
서열번호 2는 전장/야생형 보스 타우러스 PRLR을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이다.
서열번호 3은 젖촉진 활성을 유지하고 슬릭 표현형을 생성하는 보스 타우러스 PRLR 단백질의 최소 390개 아미노산 부분을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이다.
서열번호 4는 돌연변이된/절단된 보스 타우러스 PRLR 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드의 예이다. 특히, 이는 A461VfsX1 돌연변이에 대응하는 보스 타우러스 PRLR의 돌연변이 mRNA의 단백질 암호화 부분의 서열이다.
서열번호 5는 절단된 보스 타우러스 PRLR 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 예이다. 특히, 이는 아미노산 1 내지 461을 함유하는 절단된 보스 타우러스 PRLR을 코딩하는 mRNA의 서열이다.
서열번호 6은 최소 돌열변이된/절단된 보스 타우러스 PRLR 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드(의 틀)에 존재하지 않는 폴리뉴클레오타이드 서열을 제공한다. 상기 서열 또는 이의 단편은 돌연변이된/절단된 보스 타우러스 PRLR 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드에 존재할 수 있지만, 상기 서열 또는 이의 단편은 돌연변이된/절단된 보스 타우러스 PRLR 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드를 갖는 단백질 해독틀에 존재하지 않거나 충분히 적은 아미노산을 암호화하여 슬릭 코트 표현형이 나타나도록 한다.
서열번호 7은 전장 보스 타우러스 PRLR의 아미노산 서열이다.
서열번호 8은 우유 생산에 요구되는 보스 타우러스 PRLR 단백질의 390개 아미노산 최소의 부분을 위한 서열이다.
서열번호 9는 돌연변이된/절단된 보스 타우러스 PRLR 단백질의 예의 아미노산 서열이다.
서열번호 10은 절단된 보스 타우러스 PRLR 단백질의 예의 아미노산 서열이다.
서열번호 11은 절단된 보스 타우러스 PRLR 단백질(전장 PRLR 단백질의 아미노산 391 내지 581)에 존재하지 않는 보스 타우러스 PRLR 단백질의 아미노산 서열이다.
서열번호 12는 절단된 보스 타우러스 PRLR 단백질(의 틀)에 존재하지 않는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열이다.
서열번호 13은 보스 타우러스 PRLR의 A461VfsX1 돌연변이의 mRNA 서열이다.
본 특허 또는 본원은 하나 이상의 채색된 도면을 포함한다. 채색된 도면을 갖는 본 특허 또는 특허공개의 사본은 신청서 및 필수적인 요금의 지불 하에 특허청에서 제공할 것이다.
도 1은 축우에서 프로락틴 수용체(PRLR) 단백질의 절단을 야기하는 돌연변이를 도시한다. 야생형 서열로부터 C(서열번호 2의 위치 1382에서 시토신)의 결실은 알라닌 461의 발린으로의 돌연변이를 일으키고, 잇따르는 코돈을 종결 코돈으로 전환함으로써 461 아미노산의 PRLR을 생성한다. 이 돌연변이는 예컨대, A461VfsX1로 표시된다(즉, 알라닌(A)이 처음 바뀌는 아미노산이고, 이는 위치 461이며, 이는 대신 발린(V)을 만들고, 종결 코돈(X)을 비롯한 이동틀(shift frame)의 길이는 1이다.
본 발명은 단모의 동물을 생산하기 위한 물질 및 방법을 제공한다. 바람직한 양태에서, 이는 프로락틴 수용체(PRLR) 단백질을 암호화하는 뉴클라오타이드 서열을 동물에서 조작하여 단백질의 절단된 버젼을 생산함으로써 성취될 수 있다. 유리하게는 및 놀랍게는, 본 발명에 따라 생산된 절단된 단백질은 젖촉진 기능성을 유지하면서, 상기 동물이 단모 코트를 갖게 한다.
그러므로, 하나의 양태에서, 본 발명은 예를 들어, 단모 (슬릭) 코트를 동물에게 부여함으로써 동물의 내열성을 향상시키는 물질 및 방법을 제공한다. 본원에서 특정하게 예시된 양태에서, 상기 동물은 솟과 동물이다.
축우에 우유 생산 능력을 부여하면서 단모 표현형 또한 야기하는 PRLR 단백질을 발현하는 축우가 본원에서 특히 예시된다. 바람직한 양태에서, PRLR 단백질은 581개 아미노산 야생형 단백질의 390개 N-말단 아미노산을 포함한다. 발현되는 단백질이 전장 단백질에 비해 충분히 절단되어 단모 표현형이 획득되는 한, 최소 390개 아미노산 단편 외에 추가적인 아미노산이 존재할 수 있다. 바람직하게는, 전장 581개 아미노산 단백질의 C-말단은 적어도 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120개 또는 이 이상의 아미노산만큼 절단된다.
특정한 양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 8에서 제시되는 PRLR 단백질의 390개 아미노산 부분을 암호화하는 뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 11(아미노산 391 내지 581)을 암호화하는 뉴클레오타이드를 포함하지 않는다. 다른 양태에서, 서열번호 11을 암호화하는 뉴클레오타이드의 전부 또는 부분이 존재하면, 이는 서열번호 3과 동일한 단백질 해독틀 안에 존재하지 않거나, 서열번호 3과 동일한 단백질 해독틀 안에 존재하는 부분은 보통(슬릭이 아니거나 단모가 아닌) 코트를 야기하는 충분한 수의 아미노산을 암호화하지 않는다.
"슬릭 코트"의 존재는 예를 들어, 올슨(Olson) 등에 의해 제시된 시험(문헌["Evidence of a Major Gene Influencing Hair Length and Heat Tolerance in Bos Taurus Cattle," J. Anim. Sci. (2003) 81:80-90])을 사용하여 당해 분야의 기술자에 의해 손쉽게 확인될 수 있고, 상기 문헌은 본원에 참조로서 혼입된다. 바람직한 양태에서, 단모 코트 동물의 모발은 슬릭 모발 표현형을 나타내지 않는 동물의 모발(본원에 "보통" 또는 "장모"로 언급됨)의 50%, 40%, 30%, 20% 또는 심지어 10%의 길이이다.
본 발명의 목적을 위해, 용어 "축우"는 보스 타우러스, 보스 무투스(Bos mutus) 및 보스(Bos) 속의 다른 구성원에 속하는 동물을 나타낸다. 본 발명은 축우에 대하여 본원에서 예시되지만, 당해 분야의 기술자는 내열성, 심미성, 알러지성 및/또는 청결성을 향상시키기 위해 단모 코트에 의해 이익을 얻을 수 있는 다른 동물로도 본 발명을 실시할 수 있다. 바람직하게는, 상기 동물은 비인간 동물이다. 상기 다른 동물은 비제한적으로, 다른 솟과 동물(특히 소)), 돼지, 말, 염소, 고양이, 마우스, 랫, 개, 유인원, 침벤지 및 우랑우탄이다. 당해 분야의 기술자에 의해 이해된 바와 같이, 젖촉진 기능을 보존하기 위해 요구되는 PRLR 부분의 절단의 정확한 위치는 단모 코트를 얻는 데 필요한 C-말단 절단의 정도와 같이 종에 따라 다를 수 있다. 그러나, 소정 동물에게 존재하기에 적절한 PRLR 단백질의 부분은 본원의 혜택을 갖는 기술자에 의해 손쉽게 결정될 수 있다.
본 발명에 따라, 슬릭 표현형의 원인이 되는 돌연변이가 확인되었다. 상기 돌연변이는 보스 타우러스 PRLR 유전자에서의 A461VfsX1 돌연변이이다. 상기 돌연변이는 PRLR 단백질의 카복시-말단 부분의 120개 아미노산 결실을 야기한다.
PRLR 단백질의 C-말단으로부터 결실된 상기 120개 아미노산은 필수적으로 모든 포유류 종에 걸쳐 보존된다. 상기 아미노산은 우유 생산에 필수적이지 않다. 즉, 상기 C-말단 아미노산이 결실된 PRLR 단백질은 우유 생산 과정에서의 이의 역할을 충족할 수 있다.
서열번호 2는 전장 보스 타우러스 PRLR 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이다. 서열번호 4 및 13은 보스 타우러스 PRLR 단백질의 돌연변이되고 절단된 형태를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이다. 상기 특정한 절단된 단백질은 A461VfsX1 돌연변이를 갖는 돌연변이 PRLR 유전자에 의해 암호화된다. 상기 돌연변이를 갖는 축우는 슬릭 표현형을 나타낸다.
따라서, 본 발명은 서열번호 3의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 제공하고, 상기 폴리뉴클레오타이드는 절단된 보스 타우러스 PRLR 단백질을 암호화하며, 서열번호 3을 포함하는 폴리뉴클레오타이드와 동일한 단백질 해독틀에서 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 6의 뉴클레오타이드 서열(또는 장모 코트를 야기하는 이의 충분히 큰 부분)을 포함하지 않는다. 본 발명의 목적을 위해, 상기 폴리뉴클레오타이드는 "절단된 보스 타우러스 PRLR 폴리뉴클레오타이드"로 명명된다.
본 발명의 목적을 위해서, 2개의 폴리뉴클레오타이드가 연결될(융합될) 때, 융합된 폴리뉴클레오타이드가 제1 및 제2 폴리뉴클레오타이드에 의해 독립적으로 암호화되는 폴리펩타이드를 함유하는 단백질을 암호화하면, 제1 폴리뉴클레오타이드는 제2 폴리뉴클레오타이드와 같은 단백질 해독틀에 존재한다. 따라서, 2개의 폴리뉴클레오타이드가 간섭하는 뉴클레오타이드 없이 서로 부착되면, 상기 2개의 폴리뉴클레오타이드의 단백질 해독틀은 유지된다. 3의 정수배가 아닌 수(예컨대, 1, 2, 4, 5, 7, 8, 9, 11 등)의 뉴클레오타이드가 제1과 제2 폴리뉴클레오타이드 사이에 삽입되고/되거나 제1 폴리뉴클레오타이드의 단백질 해독틀에 종결 코돈이 존재하면, 상기 해독틀은 유지되지 않는다.
따라서, 어떠한 특정한 양태에서, 본 발명의 절단된 보스 타우러스 PRLR 폴리뉴클레오타이드는, 서열번호 6의 전체 또는 부분을 포함하는 폴리뉴클레오타이드에 연결되는 서열번호 3, 4 또는 5의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 상기의 서열번호 3, 4 또는 5의 폴리뉴클레오타이드와 서열번호 6 사이에 삽입된 뉴클레오타이드의 수는 3의 정수배가 아니고/거나 서열번호 3, 4 또는 5의 서열을 갖는 단백질 해독틀의 종결 코돈은 상기 2개의 폴리펩타이드 사이에 도입된다. 상기 폴리뉴클레오타이드의 예는 서열번호 13을 포함하는 폴리뉴클레오타이드이고, 이는 보스 타우러스 PRLR 단백질의 A461VfsX1 돌연변이의 뉴클레오타이드 서열이고 서열번호 4의 서열과 서열번호 6의 서열의 부분 사이의 하나의 뉴클레오타이드를 함유한다. 다른 양태에서, 서열번호 6의 전체 또는 부분은 전혀 존재하지 않을 수 있고, 존재한다면 장모 코트를 야기하기에 충분하지 않은 경우에 한한다.
따라서, 절단된 보스 타우러스 PRLR 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 6의 서열 또는 이의 단편을 포함할 수 있지만, 서열번호 6 또는 이의 단편의 서열은 장모 코트를 야기하기에 충분한 수의 아미소산을, 절단된 보스 타우러스 PRLR 폴리뉴클레오타이드(예컨대, 서열번호 3)의 서열을 갖는 단백질 해독틀에서 암호화할 수 없다.
본 발명의 하나의 절단된 보스 타우러스 PRLR 폴리뉴클레오타이드는 절단된 보스 타우러스 PRLR 단백질을 암호화하고, 이때 상기 절단된 단백질은 서열번호 8의 서열을 포함하고, 상기 절단된 보스 타우러스 PRLR 단백질은 장모 코트를 야기하기에 충분한 서열번호 11의 서열 또는 이의 단편을 함유하지 않는다.
따라서, 본 발명에 따른 유용한 절단된 보스 타우러스 PRLR 단백질의 예는 서열번호 7에서 제시된 전장 PRLR 단백질의 단편을 포함하고, 이때 절단된 단백질은 서열번호 7의 아미노산 1 내지 390 내지 아미노산 1 내지 461의 아미노산 서열을 포함하고, 단편은 서열번호 11의 서열 또는 그의 단편을 갖지 않는다.
표 1은 절단된 보스 타우러스 PRLR 폴리뉴클레오타이드, 및 상기 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 절단된 보스 타우러스 PRLR 단백질의 특정한 예를 제공한다. 표 1에 제시된 모든 절단된 보스 타우러스 PRLR 폴리뉴클레오타이드의 서열은 서열번호 4 또는 5의 위치 1에서 시작하고, 표 1에 제시된 절단된 보스 타우러스 PRLR 단백질의 서열은 서열번호 7의 위치 1에서 시작한다. 폴리뉴클레오타이드의 다양한 종결 위치는 서열번호 4 또는 5에 상응하고, 아미노산의 다양한 종결 위치는 서열번호 7에 상응한다.
절단된 보스 타우러스 PRLR 폴리뉴클레오타이드의 종결 뉴클레오타이드 위치 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 절단된 보스 타우러스 PRLR 단백질의 크기
(아미노산의 수)		 절단된 보스 타우러스 PRLR 단백질의 아미노산 서열
1170 390 1-390
1173 391 1-391
1176 392 1-392
1179 393 1-393
1182 394 1-394
1185 395 1-395
1188 396 1-396
1191 397 1-397
1194 398 1-398
1197 399 1-399
1200 400 1-400
1203 401 1-401
1206 402 1-402
1209 403 1-403
1212 404 1-404
1215 405 1-405
1218 406 1-406
1221 407 1-407
1224 408 1-408
1227 409 1-409
1230 410 1-410
1233 411 1-411
1236 412 1-412
1239 413 1-413
1242 414 1-414
1245 415 1-415
1248 416 1-416
1251 417 1-417
1254 418 1-418
1257 419 1-419
1260 420 1-420
1263 421 1-421
1266 422 1-422
1269 423 1-423
1272 424 1-424
1275 425 1-425
1278 426 1-426
1281 427 1-427
1284 428 1-428
1287 429 1-429
1290 430 1-430
1293 431 1-431
1296 432 1-432
1299 433 1-433
1302 434 1-434
1305 435 1-435
1308 436 1-436
1311 437 1-437
1314 438 1-438
1317 439 1-439
1320 440 1-440
1323 441 1-441
1326 442 1-442
1329 443 1-443
1332 444 1-444
1335 445 1-445
1338 446 1-446
1341 447 1-447
1344 448 1-448
1347 449 1-449
1350 450 1-450
1353 451 1-451
1356 452 1-452
1359 453 1-453
1362 454 1-454
1365 455 1-455
1368 456 1-456
1371 457 1-457
1374 458 1-458
1377 459 1-459
1380 460 1-460
1383 461 1-461
461개 아미노산보다 큰 단편은 또한 슬릭이 아닌 표현형을 야기하기에 충분하지 않는 한, 본 발명의 범주에 속한다.
본 발명은 또한 절단된 보스 타우러스 PRLR 폴리뉴클레오타이드 및 절단된 보스 타우러스 PRLR 단백질의 동족체를 제공한다.
본 발명의 목적을 위해서, 용어 "동족체"는 70% 이상 내지 약 99%(포함적)의 참조 서열과 백분율 동일성을 갖는 서열을 나타낸다. 상기의 백분율 동일성의 범위는 1% 간격으로 70%로부터 99%까지의 임의의 일부 백분율을 포함하고, 발명의 설명에 의해 이를 뒷받침한다. 예를 들어, 동족 서열은 참조 서열에 대해 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99%의 백분율 동일성을 보인다.
전형적으로, 백분율 동일성은 참조 서열의 전체를 기준으로 계산된다. 2개 이상의 서열의 맥락에서, 용어 "동일한" 또는 백분율 "동일성"은, 비교 윈도우에 걸쳐 최대한 대응되도록 비교되고 정렬될 때, 서열 비교 알고리즘을 사용하거나 수동 정렬 및 육안 검사에 의해 측정된 바와 동일하거나 특정 백분율의 동일한 부분을 갖는 2개 이상의 서열 또는 부분서열을 나타낸다.
본 발명은 또한 절단된 보스 타우러스 PRLR 폴리뉴클레오타이드 및 단백질과 70% 이상 내지 약 99%(포함적)의 서열 동일성을 갖는 절단된 보스 타우러스 PRLR 폴리뉴클레오타이드 및 절단된 보스 타우러스 PRLR 단백질을 갖는 절단된 보스 타우러스 PRLR 폴리뉴클레오타이드의 동족체를 제공한다.
절단된 보스 타우러스 PRLR 폴리뉴클레오타이드의 동족체의 특정한 예는 서열번호 3, 4 또는 5의 서열과 약 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 절단된 보스 타우러스 PRLR 폴리뉴클레오타이드의 동족체는 또한 장모 코트를 야기하기에 충분한 서열번호 6의 서열 또는 이의 단편을, 동족체의 단백질 해독 영역을 갖는 틀에서 함유하지 않는다.
절단된 보스 타우러스 PRLR 단백질의 동족체의 특정한 예는 서열번호 8, 9 또는 10의 서열과 약 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 단백질을 포함한다. 절단된 보스 타우러스 PRLR 폴리뉴클레오타이드의 동족체는 또한 장모 코트를 야기하기에 충분한 서열번호 11의 서열 또는 이의 단편을 함유하지 않는다.
본 발명에 따라 유용한 핵산 서열은 예시된 뉴클레오타이드 서열의 변이체를 포함하고, 이때 상기 변이체는 상기 예시된 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암화화되는 서열과 동일한 아미노산 서열을 암호화한다. 유전자 암호의 축퇴(degeneracy) 때문에, 다수의 핵산 서열이 임의의 소정 단백질을 암호화할 수 있다. 예를 들어, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU 모두는 아미노산 알라닌을 암호화한다. 따라서, 알라닌이 코돈에 의해 특정되는 모든 위치에서, 코돈은 암호화된 폴리펩타이드를 바꾸지 않고 임의의 상응하는 코돈으로 바뀔 수 있다. 상기 핵산 변형은 잠재성 돌연변이로 명명된다. 하나의 통상의 기술은 핵산(AUG는 제외, 이는 일반적으로 메티오닌을 위한 유일한 코돈임)에서 각각의 코돈이 변형되어도 여전히 같은 아미노산 서열을 암호화할 수 있음을 인식할 수 있다. 잠재성 돌연변이를 갖는 상기 변이체 서열은 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하고, 본 발명의 범주에 포함된다.
핵산 서열 상동성은 당해 분야에 공지된 임의의 다양한 서열 비교 알고리즘 및 프로그램을 사용하여 확인될 수 있다. 상기 알고리즘 및 프로그램은 비제한적으로, TBLASTN, BLASTP, FASTA, TFASTA 및 CLUSTALW를 포함한다(문헌[Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(8):2444-2448], 문헌[Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215(3):403-410], 문헌[Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Res. 22(2):4673-4680], 문헌[Higgins et al., 1996, Methods Enzymol. 266:383-402], 문헌[Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215(3):403-410] 및 문헌[Altschul et al., 1993, Nature Genetics 3:266-272]). 전형적으로, 서열 비교는 판매자에 의해 제공되는 내정된 변수를 사용하거나, 전체 내용이 본원에 참조로서 혼입된 확인된 문헌에 제시된 변수를 사용하여 수행될 수 있다.
용어 "약"은 본 발명의 일부 정량적인 양상, 예를 들어, 유도 인자(inducer)의 농도 또는 뉴클레오타이드 서열 간의 백분율 동일성을 기술하기 위하여 본원에 사용된다. 절대적인 정확도가 본 발명을 시행하는 양상에 필요하진 않다. 용어 "약"이 본 발명의 정량적인 양상을 기술하는데 사용되는 경우, 관련 양상은 ±10%만큼 변할 수 있다.
본원에 사용된 "상보적인" 폴리뉴클레오타이드 서열은 일반적으로 이중나선 핵산 분자(DNA-DNA, DNA-RNA 또는 RNA-RNA)에서 특정한 퓨린과 특정한 피리미딘 사이의 수소 결합으로부터 발생하는 서열을 나타낸다. 주요한 특정 쌍은 구아닌과 시토신, 및 아데닌과 티민 또는 우라실이다. "상보적인" 폴리뉴클레오타이드 서열은 또한 "안티센스"의 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 "안티센스 서열"로 지칭된다. 본 발명의 다양한 양상에서, 서열은 참조 서열에 "완전히 상보적"이고, 이는 염기쌍에서 잘못 짝지어진 것이 없는 서열을 나타낸다.
본원에 사용된 "벡터"는 뉴클레오타이드 구조(예컨대, DNA 구조)를 숙주 세포에 도입하기 위한 DNA 분자 예컨대, 플라스미드, 코스미드 또는 박테리아 파지를 나타낸다. 클로닝 벡터는 전형적으로 하나 또는 적은 수의 제한 엔도뉴클라아제 인식 부위를 포함하고, 이에서 클로닝 벡터로 형질전환된 세포의 확인 및 선택에서 사용하기에 적합한 마커 유전자뿐만 아니라, 외래 DNA 서열이 확실한 방식으로 벡터의 본질적인 생물학적 기능의 손실없이 삽입될 수 있다. 마커 유전자는 항생제 내성을 제공하는 유전자를 전형적으로 포함한다. 본 발명의 실시에서 사용될 수 있는 선택 항생제의 비제한적인 예는 게네티신(Geneticin, G-418), 마이코페놀산 및 제오신을 포함한다. 본 발명에서 사용되기에 적합한 항생제의 추가적인 예는 당업자에게 공지되어 있고, 상기 양태는 본 발명의 범주에 속한다.
본 발명은 표적 서열 또는 표적 서열로부터 생성된 앰플리콘과의 혼성화를 위한 검출 탐지자(예컨대, 보스 타우러스 PRLR 폴리뉴클레오타이드의 단편)를 또한 제공한다. 상기 검출 탐지자는 8, 9, 10, 11, 12, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 또는 이 이상에 걸친 인접/연속하는 임의의 보스 타우러스 PRLR 폴리뉴클레오타이드(예컨대, 표 1에 서술된 폴리뉴클레오타이드, 서열번호 3, 4 및 5)를 포함한다.
표지된 탐지자 또는 프라이머는 방사성 화합물 또는 다른 유형의 표지(예컨대, 1) 방사성 표지, 2) 효소 표지, 3) 화학 발광 표지, 4) 형광 표지 또는 5) 자성 표지)로 표지된다. 다른 양태에서, 비표지된 뉴클레오타이드 서열은 탐지자 또는 프라이머로서 직접 사용될 수 있지만, 상기 서열은 방사성 원소(32P, 35S, 3H 또는 125I), 또는 바이오틴, 아세틸아미노플루오렌, 다이곡시제닌, 5-브로모-데옥시유리딘 또는 플루오레세인으로 일반적으로 표지되어 다수의 적용례에 사용될 수 있는 탐지자를 제공한다.
본원에 개시된 보스 타우러스 PRLR 폴리뉴클레오타이드는 절단된 보스 타우러스 PRLR 단백질을 셀 또는 동물, 예컨대, 축우 및 다른 솟과 동물에서 발현하는 방법에 유용하다. 이는 관심 세포를 보스 타우러스 PRLR 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 DNA 구조(유전자이식 유전자 구조)로 형질전환하고, 절단된 보스 타우러스 PRLR 단백질을 발현하는 형질전환된 세포를 생성함으로써 성취될 수 있다.
추가적인 양태에서, 본 발명은 절단된 PRLR 단백질을 암호화하는 절단된 보스 타우러스 PRLR 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 형질감염 벡터, 발현 벡터, 숙주 세포 및 유전자이식 동물에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 단리되고 절단된 보스 타우러스 PRLR 단백질, 및 단리되고 절단된 보스 타우러스 PRLR 단백질을 포함하는 융합 폴리펩타이드에 관한 것이다.
본원에 개시된 다양한 방법은 뉴클레오타이드(DNA) 구조를 세포에 도입하는 것을 포함한다. 용어 "도입"은 뉴클레오타이드 구조가 세포의 내부에 접근하는 방식으로 뉴클레오타이드 구조를 세포에 전달함을 의미하도록 본원에 사용된다. 상기 방법은 단지 뉴클레오타이드 구조가 세포의 내부에 접근하는 것, 즉 뉴클레오타이드 구조를 세포에 도입하는 특정한 방법에 의존하지 않는다. 뉴클레오타이드 구조를 세포에 도입하는 방법, 예컨대 비제한적으로, 안정한 형질전환 방법, 일시적인 형질전환 방법 및 바이러스-매개된 방법은 당해 분야에서 공지되어 있다.
본 발명은 또한 절단된 PRLR 폴리뉴클레오타이드를 사용하여 슬릭 표현형을 자연적으로 나타내지 않는 동물을 유전적으로 변형시켜 슬릭 표현형을 나타내는 동물을 생산하는 방법을 제공한다. 임의의 품종에 슬릭 표현형을 추가하기 위해서, 절단된 PRLR 단백질의 발현을 야기하는 임의의 돌연변이가 사용될 수 있다.
따라서, 하나의 양태에서, 본 발명은 단모 표현형을 갖는 비인간 포유류를 생산하는 방법을 제공하고, 이때 상기 포유류는 서열번호 7에서 제시되는 서열 중 적어도 아미노산 1 내지 390을 포함하는 절단된 PRLR 단백질을 발현하고, 서열번호 7에서 제시되는 서열 중 391 내지 581 아미노산을 모두 함유하지 않는다. 본 발명의 방법은 a) 비인간 포유류로 성장할 수 있는 세포를 획득하는 단계; b) 절단된 프로락틴 수용체(PRLR) 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 상기 세포에 도입하거나, 상기 세포의 게놈 DNA를 조작하여 상기 게놈 DNA가 절단된 PRLR 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하도록 하는 단계; 및 c) 상기 세포로부터 상기 비인간 포유류를 생산하는 단계를 포함한다.
절단된 PRLR 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 3의 서열, 또는 서열번호 3의 서열에 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 이의 동족체를 포함할 수 있고, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 6의 전체 뉴클레오타이드 서열을 함유하지 않거나, 서열번호 3의 폴리뉴클레오타이드의 단백질 해독틀에서 서열번호 6의 전체 뉴클레오타이드 서열을 함유하지 않는다. 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 폴리뉴클레오타이드의 예는 서열번호 3, 4, 5 또는 13의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드이다. 단모 표현형을 비인간 포유류에게 제공하는 절단된 PRLR 단백질의 예는 서열번호 8의 서열을 갖는 단백질이다.
하나의 양태에서, 비인간 포유류로 성장할 수 있는 세포는 전분화(totipotent) 세포이다. 전분화 세포는 완전한 기관으로 성장하거나 이의 임의의 세포 또는 조직으로 분화되는 능력을 갖는다. 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 전분화 세포의 비제한적인 예는 줄기세포, 배아줄기세포, 수정된 난모세포 및 접합체이다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 전분화 세포의 추가적인 예는 당해 분야의 기술자에게 널리 공지되어 있고 상기 양태는 본 발명의 범주에 속한다.
특정한 양태에서, 비인간 포유류는 솟과 동물, 축우, 돼지, 말, 염소, 고양이, 마우스, 양, 랫, 개, 유인원, 침팬지 또는 오랑우탄이다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 PRLR 단백질의 비제한적인 예는, 유니프롯(UniProt) 수탁번호 Q28172, Q08501, P14787, O46561, P05710, Q58DZ7, Q6JTA8, C7T4Z0, Q3HNA7, D0VFV2, C7T4V8, C7T4W1, C7T4W4, C7T4X8, Q2PBP0, B3GDH0, C7T4X9, E7BKJ5, G3UVW6, Q58DZ7, E7CHC7, E5KXH8, D3ZV73, D0VFV3, F2XX66, I7FI71, E9MW50, Q28172, F1N4H8, Q2PBN9, C7F8W7, G1DE70, S5TFK4, Q28235, O46561, Q08501, Q99JZ1, U6CXL9, P05710, F1M137, P14787, F7HIV1, Q865V4, Q6JTA8, D9IWB8, Q9XS92 및 K7GKV2를 갖는 단백질이다.
유전적으로 조작된 동물은 유전적으로 조작된 동물, 특히 포유류를 생산하는 분야에 공지된 방법론에 의해 생산될 수 있다. 상기 기술의 비제한적인 예는 절단된 보스 타우러스 PRLR 단백질을 발현하는 유전자이식 축우의 생산, 축우 균주 내의 야생형 단백질을 절단된 단백질로 대체하기 위한 상동 재조합, 절단된 단백질의 제조를 야기할 수 있는, 축우 균주의 게놈에서의 관련 염기의 결실, 또는 게놈 수정을 위한 임의의 다른 방법론을 포함한다. 추가적인 예는 재조합 레트로바이러스, 전핵 주입, 정자-매개된 DNA 전달, 생식 세포 이식 및 핵 전달 클로닝을 비롯한 방법을 포함한다. 본 발명의 제조 방법에 따른 유전적으로 조작된 포유류를 생산하는 더 추가적인 방법은 당해 분야의 기술자에게 널리 공지되고, 상기 방법은 본 발명의 범주에 속한다.
본원에 사용된 용어 "유전적으로 조작된 축우"는 유전자이식 축우, 및 PRLR 유전자의 1 또는 2개 모두의 카피에서 절단된 PRLR 단백질의 발현을 야기하는 돌연변이를 갖는 축우를 포함한다.
유전자이식 축우는 축우의 게놈으로 혼입된 절단된 PRLR 폴리뉴클레오타이드의 하나 이상의 카피를 통해 절단된 PRLR 단백질을 발현하는 축우를 나타낸다. PRLR 유전자의 하나 카피에서 절단된 PRLR 단백질의 발현을 야기하는 돌연변이 또는 절단을 갖는 축우는 동형접합 축우로 명명되지만, PRLR 유전자 2개 모두의 카피에서 절단된 PRLR 단백질의 발현을 야기하는 돌연변이 또는 절단을 갖는 축우는 이형접합 축우라 명명된다.
절단된 PRLR 단백질을 발현하는 유전자이식, 동형접합 또는 이형접합 축우는 슬릭 표현형을 나타낼 수 있다.
하나의 양태에서, 전자 활성체-유사 효과기 뉴클레아제(transcription activator-like effector nuclease)(TALEN)-매개된 상동 재조합이 슬릭 표현형을 나타내는 동형접합 또는 이형접합 축우를 생산하는 데에 사용된다. TALEN-매개된 유전적으로 조작된 유기체를 생산하는 예는 문헌[Zu et al. (2013), TALEN-mediated precise genome modification by homologous recombination in zebrafish, Nature Methods, 10:329-331], 문헌[Katsuyama et al. (2013), An efficient strategy for TALEN-mediated genome engineering in Drosophila, Nucleic Acids Research, Vol. 41, No. 17, e163] 및 문헌[Liu et al. (2014), TALEN-Mediated Gene Mutagenesis in Rhesus and Cynomolgus Monkeys, Cell Stem Cell, Vol. 14, Issue 3, pp. 323-328]에 의해 제공된다.
일정 간격으로 모여있는 짧은 회문 반복체(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)(CRISPR) 및 CRISPR-연관 유전자(CAS) 시스템(CRISPR/CAS 시스템)이 또한 슬릭 표현형을 나타내는 동형접합 또는 이형접합 축우를 생산하는 데 사용될 수 있다. 유전적으로 조작된 유기체, 특히 포유류를 생산하기 위한 CRISPR/CAS 시스템의 용도의 예는 문헌[Cong et al. (2013), Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems, Science, Vol. 339 no. 6121 pp. 819-823] 및 미국특허 제8,795,965호에 의해 제공된다.
동형접합 또는 이형접합 솟과 동물 및 다른 동물을 생산하는 추가적인 기술은 당해 분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있고, 상기 양태는 본 발명의 범주에 속한다.
유전자이식 동물의 생산 방법은 당해 분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 유전자이식 유전자 구조는 축우의 생식세포로 도입되어 유전자이식 축우를 생산할 수 있다. 예를 들어, 상기 구조의 하나 또는 몇몇 카피는 표준 유전자이식 기술에 의해 포유류 배아의 게놈에 혼입될 수 있다.
유전자이식 축우는 절단된 보스 타우러스 PRLR 단백질을 암호화하는 이식유전자를 축우의 생식세포에 도입함으로써 생산될 수 있다. 다양한 성장 단계에서의 배아성 표적 세포가 이식유전자를 도입하는 데 사용될 수 있다. 상이한 방법이 배아 표적 세포의 성장 단계에 따라 사용된다. 사용되는 임의의 동물의 특정한 계열은 전반적으로 좋은 건강, 좋은 배아 수득률, 배아에서의 좋은 전핵체 가시성 및 좋은 생식 건강에 따라 선택된다.
이식유전자의 배아로의 도입은 당해 분야에 공지된 임의의 수단, 예컨대, 미세주사, 전기 천공 또는 리포펙션(lipofection)에 의해 성취될 수 있다. 예를 들어, 비제한적으로, 절단된 PLRLR 단백질 이식유전자는 축우 수정란의 전핵으로의 상기 구조의 미세주사에 의해 동물에 도입될 수 있고, 이는 상기 구조의 하나 이상의 카피가 성장하는 축우의 세포에서 유지되도록 한다. 상기 수정란으로의 이식유전자 구조의 도입 후에, 상기 수정란은 시험관 내에서 다양한 시간 동안 항온처리되거나, 대리 숙주에 재착상되거나, 이 2개의 과정을 모두 거친다. 성체까지의 시험관 내 항온처리가 포함된다. 통상적인 방법은 배아를 시험관 내에서 약 1 내지 7일 동안 항온처리하고, 이를 대리 숙주에 재착상시키는 것이다.
유전자이식에 의해 조작된 배아의 자손은 절단된 PRLR 폴리뉴클레오타이드의 존재를 확인하기 위해 설계된 다양한 방법으로 상기 구조의 존재에 대해 시험될 수 있다. 클로닝된 외인성 구조의 하나 이상의 카피가 상기 유전자이식 배아의 게놈에 안정적으로 통합되어 유지되면, 유전자이식에 의해 첨가된 구조를 갖는 영구적인 유전자이식 계열을 수립할 수 있다.
유전자이식에 의해 변경된 동물의 한배 자식들은 상기 구조의 자손의 게놈으로의 혼입을 확인하기 위해 출생 후에 분석될 수 있다. 바람직하게는, 상기 분석은 바람직한 절단된 PRLR 단백질을 암호화하는 DNA 서열에 상응하는 탐지자를 자손으로부터의 염색체 물질에 혼성화함으로써 성취될 수 있다. 게놈에 상기 구조의 하나 이상의 카피를 함유하는 것으로 밝혀진 자손은 성체로 성장한다.
본원에 사용된 용어 "접합체"는 완전한 유기체로 성장할 수 있는 이배체 세포를 나타낸다. 일반적으로, 상기 접합체는 하나 이상의 배우자로부터의 2개의 반수체 핵의 융합을 통해 자연적으로 또는 인공적으로 형성된 핵을 함유하는 난자를 포함한다. 따라서, 배우자 핵은 자연적으로 호환되는 것, 즉, 기능성 유기체로 분화하고 성장할 수 있는 생존 접합체를 야기하는 하는 것이어야 한다. 일반적으로, 정배수체 접합체가 바람직하다. 비정수체 접합체가 수득되면, 염색체의 수는 각각의 배우자가 유래한 유기체의 정수체 수 하나 이하의 차이가 있어야 한다.
접합체에 첨가된 이식유전자 구조의 카피의 수는 첨가된 외인성 유전 물질의 총량에 의존하고, 이는 유전적 형질전환이 발생하게 하는 양이다. 이론적으로는, 오직 하나의 카피가 요구되지만, 일반적으로는 다수의 카피가 사용된다(예컨대, 1,000 내지 20,000 카피의 이식유전자 구조가 생성되어 하나의 카피가 기능적임이 보장됨). 각각의 삽입된 외인성 DNA 서열의 하나 초과의 카피를 갖는 것이 종종 외인성 DNA 서열의 표현형 발현을 증대시키기에 유리할 수 있다.
외인성 유전 물질이 핵 유전 물질에 첨가되는 것을 가능하게 하는 임의의 기술이 세포, 핵막 또는 다른 존재하는 세포 또는 유전 구조를 파괴하지 않는 한 사용될 수 있다. 외인성 유전 물질은 바람직하게는 미세주사에 의해 핵 유전 물질에 삽입된다. 세포 및 세포 구조의 미세주사는 당해 분야에 공지되고 사용된다.
재착상은 표준 방법을 사용하여 성취될 수 있다. 일반적으로, 대리 숙주가 마취되고, 배아는 난관에 삽입된다.
대리 숙주의 유전자이식 자손은 이식유전자의 존재 및/또는 발현에 대해 임의의 적합한 방법에 의해 선별된다. 선별은 이식유전자의 적어도 일부에 상보적인 탐지자를 사용하는 서던 블롯 또는 노던 블롯 분석에 의해 성취될 수 있다. 전형적으로, DNA는 조직으로부터 준비되고 서던 분석 또는 PCR에 의해 이식유전자에 대해 분석된다. 다른 양태에서, 상기 분석에서 임의의 조직 또는 세포 유형이 사용될 수 있음에도, 이식유전자를 높은 수준으로 발현하는 것으로 믿어지는 조직 또는 세포가 절단된 보스 타우러스 PRLR 단백질의 존재 및/또는 발현에 대해 시험된다.
유전자이식 동물의 자손은 유전자이식 동물을 적합한 배우자와 교배시키거나, 유전자이식 동물로부터 수득한 난자 및/또는 정자의 시험관내 수정에 의해 수득될 수 있다. 배우자와의 교배가 시행되는 경우, 상기 배우자는 유전자이식 및/또는 넉아웃이거나 아닐 수도 있다. 유전자이식인 경우, 이는 동일하거나 상이한 또는 2가지 모두의 이식유전자를 함유할 수 있다. 다른 양태에서, 상기 배우자는 부모 계열일 수 있다. 시험관내 수정이 사용되는 경우, 수정된 배아는 대리 숙주에 착상되거나 시험관내 배양되거나 2가지 모두일 수 있다. 상기 방법을 사용함에 있어서, 자손은 이식유전자의 존재에 대해 적절한 방법에 의해 평가될 수 있다.
본원에 따라 생산된 유전자이식 동물은 외인성 유전 물질을 포함할 수 있다. 상기 기술된 바와 같이, 특정한 양태에서, 외인성 유전 물질은 절단된 PRLR 단백질의 생산을 야기하는 DNA 서열일 수 있다. 또한, 상기 양태에서, 상기 서열은 전사 제어 요소, 예컨대, 프로모터에 부착될 수 있고, 바람직하게는 절단된 PRLR 단백질을 조직 특이적인 방식으로 발현하는 유전자이식 동물을 생산하는, 특정 유형의 세포에서 이식유전자 생성물의 발현을 가능하게 한다.
미분화세포는 이식유전자를 축우(또는 다른 동물)에 도입하기 위한 제2 유형의 표적 세포를 제공한다. 유전자이식 축우, 축우 배아가 시험관 내에서 미분화세포 단계로 배양될 때, 이는 레트로바이러스의 감염에 대한 표적이 될 수 있다. 분할세포의 효과적인 감염은 투명대(zona pellucida)를 제거하는 효소 처리에 의해 수득된다(문헌[Manipulating the Mouse Embryo, Hogan eds. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1986]). 이식유전자를 도입하는 데 사용되는 바이러스 벡터 시스템은 전형적으로 이식유전자를 갖는 복제불능 레트로바이러스이다. 형질감염은 분할세포를 바이러스-생성 세포의 단일막 상에서 배양함으로써 손쉽게 및 효과적으로 수득된다.
다른 양태에서, 감염은 후기 단계에서 시행될 수 있다. 바이러스 또는 바이러스-생성 세포는 할강에 주입될 수 있다. 혼입이 유전자이식 축우를 형성하는 세포의 아집단에서만 나타나기 때문에 대부분의 창시자는 이식유전자에 대해 모자이크된다. 추가적으로, 상기 창시자는 이식유전자의 다양한 레트로바이러스 삽입을 자손에서 일반적으로 분리되는 게놈에서의 상이한 위치에서 함유할 수 있다. 추가적으로, 이식유전자를 중기 배아의 자궁내 레트로바이러스 감염을 통해 생식세포에 도입할 수 있다.
이식유전자 도입을 위한 제3 유형의 표적 세포는 배아줄기세포(ES)이다. ES 세포는 시험관 내에서 배양된 전착상 배아로부터 수득되고 배아와 융합된다. 이식유전자는 DNA 형질감염 또는 레트로바이러스-매개된 형질도입을 통해 효과적으로 ES 세포에 도입될 수 있다. 상기 형질전환된 ES 세포는 이후에 축우로부터의 배반포와 조합될 수 있다. 상기 ES 세포는 이후에 배아를 군집화하고, 생성된 키메라 동물의 생식세포에 기여한다.
유전자이식 솟과 동물 및 다른 동물 또한 제공되고, 상기 유전자이식한 동물은 슬릭 표현형에 의해 특징지어진다. 유전자에 대한 변형은 절단된 PRLR 단백질을 생성하는 결실, 돌연변이 또는 절단; 절단된 PRLR 폴리뉴클레오타이드를 갖는 것과 같은 외인성 유전자의 도입; 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
본 발명의 추가적인 양태는 특정한 동물이 절단된 PRLR 단백질을 암호화하는 돌연변이 PRLR 유전자를 갖는지를 확인하는 방법을 제공한다. PRLR 돌연변이의 존재 및 돌연변이 PRLR 유전자의 카피 수를 확인하는 시험은 유전적으로 조작된 축우(또는 다른 동물)를 생산하는 방법에서 전달될 배아의 선택을 또한 개선할 수 있다.
PRLR 절단 돌연변이를 확인하는 데 사용될 수 있는 분자 생물학적 기술의 비제한적인 예는 하기를 포함한다:
(A) DNA 또는 RNA로부터의 돌연변이-특이적 PCR. DNA 또는 RNA(cDNA로 전환됨)는 시험될 동물로부터 단리될 수 있다. 돌연변이 또는 정상적인 대립유전자에 특이적인 프라이머는 PCR이 돌연변이가 존재하는지를 나타내도록 디자인될 수 있다. 본원에 제공된 뉴클레오타이드 서열에 근거하여, 당해 분야의 기술자는 DNA 또는 RNA로부터의 돌연변이-특이적 PCR을 위한 적절한 프라이머를 디자인할 수 있고, 상기 양태는 본 발명의 범주에 속한다.
(B) 제한 부위. 돌연변이 A461VfsX1은 새로운 회문 서열을 게놈 DNA - ACATGT에 생성한다. 상기 회문 서열은 고유 비-돌연변이 게놈에는 존재하지 않는다. 돌연변이 부위를 포괄하는 게놈 DNA의 영역을 증폭하는 프라이머로 생산되는 PCR 생성물은 상기 서열에 특이적인 제한 효소(예컨대, 제한 엔도뉴클레아제 PciI)로 절단될 수 있다. 회문 서열 TGTACA 상에 작용하는 엔도뉴클레아제에 의해 절단되는 능력은 돌연변이의 존재를 나타낸다.
(C) 직접 서열분석. 돌연변이의 영역은 mRNA(이는 선택적으로 cDNA로 전환될 수 있음) 또는 게놈 DNA로부터 PCR 증폭될 수 있다. PCR 생성물이 서열분석되어 PRLR 돌연변이 유전자의 존재를 확인할 수 있다. 본원에 제공된 뉴클레오타이드 서열에 근거하여, 당해 분야의 통상의 기술자는 DNA 또는 RNA를 서열분석하는 적절한 프라이머를 설계할 수 있고, 상기 양태는 본 발명의 범주에 속한다.
(D) 단일가닥 구조 다형성(SSCP) 및 이형 이중가닥 분석 시험은 DNA에서 위치 돌연변이를 확인하기 위해 설계될 수 있다.
(E) PRLR 단백질의 카복시 말단에 특이적인 항체를 사용하는 웨스턴 블롯. 전장 PRLR 단백질에 상응하는 웨스턴 블롯상의 밴드의 부재는 돌연변이의 존재 및 절단된 PRLR 단백질의 발현을 나타낸다.
본 발명은 또한 절단된 보스 타우러스 PRLR 단백질을 발현하는 축우에서 돌연변이의 감지를 위해 사용될 수 있는 항체를 제공한다. 상기 항체는 전장 PRLR 단백질의 C-말단 영역에 위치한 C-말단 아미노 영역 또는 에피토프를 지향한다. 따라서, 본 발명은 서열번호 11의 서열 또는 이의 단편으로 이루어진 폴리펩타이드를 제공한다. 상기 폴리펩타이드는 절단된 보스 타우러스 PRLR 단백질을 발현하는 축우에서 돌연변이를 감지하는 데 사용될 수 있는 항체를 얻는 데 사용될 수 있다.
본원에서 참조되거나 인용된 모든 특허, 특허출원, 가출원 및 공개문헌은, 도면 및 표를 비롯한 전체 내용이 본원의 명확한 교시에 부합하는 한에서 본원에 참조로서 혼입된다.
본원에 기술된 예시 및 양태는 오직 설명의 목적을 위하고, 이에서의 다양한 변형 또는 변화가 당해 분야의 기술자에게 제안되고, 본원 및 첨부된 청구범위의 사상과 범주에 포함된다는 것이 이해되어야 할 것이다. 추가적으로, 본원에 개시된 임의의 발명 또는 이의 양태의 임의의 요소 또는 제한은 본원에 개시된 임의의 및/또는 모든 다른 요소 및 제한(개별적으로 또는 임의의 조합으로) 또는 이의 임의의 다른 발명 또는 양태와 조합될 수 있고, 상기 모든 조합은 비제한적으로 본 발명의 범주로 고려된다.
SEQUENCE LISTING <110> AgGenetics, Inc. <120> Materials and Methods for Producing Animals With Short Hair <130> MWH.106X <140> PCT/US2015/051717 <141> 2015-09-23 <150> US 62/054,169 <151> 2014-09-23 <160> 13 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2389 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 1 cgggcaaatg ctgaggatac tttccaagtg aaccctgagt gaacctctaa tatatttatt 60 tcctgtggaa agaggaagga gccaacatga aggaaaatgc agcatctaga gtggttttca 120 ttttgctact ttttctcagt gtcagccttc tgaatggaca gtcacctcct gaaaaaccca 180 agctcgttaa atgtcggtct cctggaaagg aaacattcac ctgctggtgg gagcctgggg 240 cagatggagg acttcctacc aattacacgc tgacttacca caaggaagga gaaacactca 300 tccatgaatg tccagactac aaaaccgggg gccccaactc ctgctacttt agcaagaagc 360 acacctccat atggaagatg tacgtcatca cagtaaacgc catcaaccag atgggaatca 420 gttcctcgga tccactttat gtgcacgtga cttacatagt tgaaccagag cctcctgcaa 480 acctgacttt ggaattaaaa catccagaag atagaaaacc atatctatgg ataaaatggt 540 ctccacccac catgactgat gtaaaatctg gttggttcat tatccagtac gaaattcgat 600 taaaacctga 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aactgattgg 540 gagactcatt ttactctgaa gcaaactcag cttaagattt tcaacttata tccaggacaa 600 aaataccttg tgcagattcg ctgcaagcca gaccatggat actggagtga gtggagccca 660 gagagctcca tccagatacc taatgacttc ccagtgaagg acacaagcat gtggatcttt 720 gtggccatcc tttctgctgt catctgtttg attatggtct gggcagtggc tttgaagggc 780 tatagcatgg tgacctgcat cctcccacca gttccagggc caaaaataaa aggatttgat 840 gttcatctgc tggagaaggg caagtccgaa gaacttctgc gagctctgga aagccaagac 900 ttccccccca cttctgactg cgaggacttg ctgatggagt tcatagaggt agatgactgt 960 gaggaccagc agctgatgcc acgcccctcc aaagaacaca cggagcaagg cgtgaagccc 1020 atgcacctgg atcttgacag tgactctggc cggggcagct gcgacagccc ttcgctcttg 1080 tctgaaaagt gtgatgaacc tcaggcccat ccctccaagt tccatactcc cgagggccct 1140 gagaagctgg agaatccgga aacaaacctt acatgtctcc aggcccctca gagcacaagc 1200 gtggaaggca aaatccccta ttttctggcc aatggaccca aatcttccac atggcctttc 1260 ccgcagcccc ccagcctata cagccccaga tattcttacc acaacattgc tgacgtgtgt 1320 gagctggccc tgggcatggc cggcaccaca gccacttcgc tggaccaaac agaccaacat 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Pro Asn Ser Cys Tyr Phe Ser Lys Lys His Thr Ser Ile Trp 85 90 95 Lys Met Tyr Val Ile Thr Val Asn Ala Ile Asn Gln Met Gly Ile Ser 100 105 110 Ser Ser Asp Pro Leu Tyr Val His Val Thr Tyr Ile Val Glu Pro Glu 115 120 125 Pro Pro Ala Asn Leu Thr Leu Glu Leu Lys His Pro Glu Asp Arg Lys 130 135 140 Pro Tyr Leu Trp Ile Lys Trp Ser Pro Pro Thr Met Thr Asp Val Lys 145 150 155 160 Ser Gly Trp Phe Ile Ile Gln Tyr Glu Ile Arg Leu Lys Pro Glu Lys 165 170 175 Ala Thr Asp Trp Glu Thr His Phe Thr Leu Lys Gln Thr Gln Leu Lys 180 185 190 Ile Phe Asn Leu Tyr Pro Gly Gln Lys Tyr Leu Val Gln Ile Arg Cys 195 200 205 Lys Pro Asp His Gly Tyr Trp Ser Glu Trp Ser Pro Glu Ser Ser Ile 210 215 220 Gln Ile Pro Asn Asp Phe Pro Val Lys Asp Thr Ser Met Trp Ile Phe 225 230 235 240 Val Ala Ile Leu Ser Ala Val Ile Cys Leu Ile Met Val Trp Ala Val 245 250 255 Ala Leu Lys Gly Tyr Ser Met Val Thr Cys Ile Leu Pro Pro Val Pro 260 265 270 Gly Pro Lys Ile Lys Gly Phe Asp Val His Leu Leu Glu Lys Gly Lys 275 280 285 Ser Glu Glu Leu Leu Arg Ala Leu Glu Ser Gln Asp Phe Pro Pro Thr 290 295 300 Ser Asp Cys Glu Asp Leu Leu Met Glu Phe Ile Glu Val Asp Asp Cys 305 310 315 320 Glu Asp Gln Gln Leu Met Pro Arg Pro Ser Lys Glu His Thr Glu Gln 325 330 335 Gly Val Lys Pro Met His Leu Asp Leu Asp Ser Asp Ser Gly Arg Gly 340 345 350 Ser Cys Asp Ser Pro Ser Leu Leu Ser Glu Lys Cys Asp Glu Pro Gln 355 360 365 Ala His Pro Ser Lys Phe His Thr Pro Glu Gly Pro Glu Lys Leu Glu 370 375 380 Asn Pro Glu Thr Asn Leu Thr Cys Leu Gln Ala Pro Gln Ser Thr Ser 385 390 395 400 Val Glu Gly Lys Ile Pro Tyr Phe Leu Ala Asn Gly Pro Lys Ser Ser 405 410 415 Thr Trp Pro Phe Pro Gln Pro Pro Ser Leu Tyr Ser Pro Arg Tyr Ser 420 425 430 Tyr His Asn Ile Ala Asp Val Cys Glu Leu Ala Leu Gly Met Ala Gly 435 440 445 Thr Thr Ala Thr Ser Leu Asp Gln Thr Asp Gln His Xaa Leu Lys Ala 450 455 460 Ser Lys Thr Ile Glu Thr Gly Arg Glu Gly Lys Ala Thr Lys Gln Arg 465 470 475 480 Glu Ser Glu Gly Cys Ser Ser Lys Pro Asp Gln Asp Thr Val Trp Pro 485 490 495 Arg Pro Gln Asp Lys Thr Pro Leu Ile Ser Ala Lys Pro Leu Glu Tyr 500 505 510 Val Glu Ile His Lys Val Ser Gln Asp Gly Val Leu Ala Leu Phe Pro 515 520 525 Lys Gln Asn Glu Lys Phe Gly Ala Pro Glu Ala Ser Lys Glu Tyr Ser 530 535 540 Lys Val Ser Arg Val Thr Asp Ser Asn Ile Leu Val Leu Val Pro Asp 545 550 555 560 Pro Gln Ala Gln Asn Leu Thr Leu Leu Glu Glu Pro Ala Lys Lys Ala 565 570 575 Pro Pro Ala Leu Pro 580 <210> 8 <211> 390 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 8 Met Lys Glu Asn Ala Ala Ser Arg Val Val Phe Ile Leu Leu Leu Phe 1 5 10 15 Leu Ser Val Ser Leu Leu Asn Gly Gln Ser Pro Pro Glu Lys Pro Lys 20 25 30 Leu Val Lys Cys Arg Ser Pro Gly Lys Glu Thr Phe Thr Cys Trp Trp 35 40 45 Glu Pro Gly Ala Asp Gly Gly Leu Pro Thr Asn Tyr Thr Leu Thr Tyr 50 55 60 His Lys Glu Gly Glu Thr Leu Ile His Glu Cys Pro Asp Tyr Lys Thr 65 70 75 80 Gly Gly Pro Asn Ser Cys Tyr Phe Ser Lys Lys His Thr Ser Ile Trp 85 90 95 Lys Met Tyr Val Ile Thr Val Asn Ala Ile Asn Gln Met Gly Ile Ser 100 105 110 Ser Ser Asp Pro Leu Tyr Val His Val Thr Tyr Ile Val Glu Pro Glu 115 120 125 Pro Pro Ala Asn Leu Thr Leu Glu Leu Lys His Pro Glu Asp Arg Lys 130 135 140 Pro Tyr Leu Trp Ile Lys Trp Ser Pro Pro Thr Met Thr Asp Val Lys 145 150 155 160 Ser Gly Trp Phe Ile Ile Gln Tyr Glu Ile Arg Leu Lys Pro Glu Lys 165 170 175 Ala Thr Asp Trp Glu Thr His Phe Thr Leu Lys Gln Thr Gln Leu Lys 180 185 190 Ile Phe Asn Leu Tyr Pro Gly Gln Lys Tyr Leu Val Gln Ile Arg Cys 195 200 205 Lys Pro Asp His Gly Tyr Trp Ser Glu Trp Ser Pro Glu Ser Ser Ile 210 215 220 Gln Ile Pro Asn Asp Phe Pro Val Lys Asp Thr Ser Met Trp Ile Phe 225 230 235 240 Val Ala Ile Leu Ser Ala Val Ile Cys Leu Ile Met Val Trp Ala Val 245 250 255 Ala Leu Lys Gly Tyr Ser Met Val Thr Cys Ile Leu Pro Pro Val Pro 260 265 270 Gly Pro Lys Ile Lys Gly Phe Asp Val His Leu Leu Glu Lys Gly Lys 275 280 285 Ser Glu Glu Leu Leu Arg Ala Leu Glu Ser Gln Asp Phe Pro Pro Thr 290 295 300 Ser Asp Cys Glu Asp Leu Leu Met Glu Phe Ile Glu Val Asp Asp Cys 305 310 315 320 Glu Asp Gln Gln Leu Met Pro Arg Pro Ser Lys Glu His Thr Glu Gln 325 330 335 Gly Val Lys Pro Met His Leu Asp Leu Asp Ser Asp Ser Gly Arg Gly 340 345 350 Ser Cys Asp Ser Pro Ser Leu Leu Ser Glu Lys Cys Asp Glu Pro Gln 355 360 365 Ala His Pro Ser Lys Phe His Thr Pro Glu Gly Pro Glu Lys Leu Glu 370 375 380 Asn Pro Glu Thr Asn Leu 385 390 <210> 9 <211> 461 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 9 Met Lys Glu Asn Ala Ala Ser Arg Val Val Phe Ile Leu Leu Leu Phe 1 5 10 15 Leu Ser Val Ser Leu Leu Asn Gly Gln Ser Pro Pro Glu Lys Pro Lys 20 25 30 Leu Val Lys Cys Arg Ser Pro Gly Lys Glu Thr Phe Thr Cys Trp Trp 35 40 45 Glu Pro Gly Ala Asp Gly Gly Leu Pro Thr Asn Tyr Thr Leu Thr Tyr 50 55 60 His Lys Glu Gly Glu Thr Leu Ile His Glu Cys Pro Asp Tyr Lys Thr 65 70 75 80 Gly Gly Pro Asn Ser Cys Tyr Phe Ser Lys Lys His Thr Ser Ile Trp 85 90 95 Lys Met Tyr Val Ile Thr Val Asn Ala Ile Asn Gln Met Gly Ile Ser 100 105 110 Ser Ser Asp Pro Leu Tyr Val His Val Thr Tyr Ile Val Glu Pro Glu 115 120 125 Pro Pro Ala Asn Leu Thr Leu Glu Leu Lys His Pro Glu Asp Arg Lys 130 135 140 Pro Tyr Leu Trp Ile Lys Trp Ser Pro Pro Thr Met Thr Asp Val Lys 145 150 155 160 Ser Gly Trp Phe Ile Ile Gln Tyr Glu Ile Arg Leu Lys Pro Glu Lys 165 170 175 Ala Thr Asp Trp Glu Thr His Phe Thr Leu Lys Gln Thr Gln Leu Lys 180 185 190 Ile Phe Asn Leu Tyr Pro Gly Gln Lys Tyr Leu Val Gln Ile Arg Cys 195 200 205 Lys Pro Asp His Gly Tyr Trp Ser Glu Trp Ser Pro Glu Ser Ser Ile 210 215 220 Gln Ile Pro Asn Asp Phe Pro Val Lys Asp Thr Ser Met Trp Ile Phe 225 230 235 240 Val Ala Ile Leu Ser Ala Val Ile Cys Leu Ile Met Val Trp Ala Val 245 250 255 Ala Leu Lys Gly Tyr Ser Met Val Thr Cys Ile Leu Pro Pro Val Pro 260 265 270 Gly Pro Lys Ile Lys Gly Phe Asp Val His Leu Leu Glu Lys Gly Lys 275 280 285 Ser Glu Glu Leu Leu Arg Ala Leu Glu Ser Gln Asp Phe Pro Pro Thr 290 295 300 Ser Asp Cys Glu Asp Leu Leu Met Glu Phe Ile Glu Val Asp Asp Cys 305 310 315 320 Glu Asp Gln Gln Leu Met Pro Arg Pro Ser Lys Glu His Thr Glu Gln 325 330 335 Gly Val Lys Pro Met His Leu Asp Leu Asp Ser Asp Ser Gly Arg Gly 340 345 350 Ser Cys Asp Ser Pro Ser Leu Leu Ser Glu Lys Cys Asp Glu Pro Gln 355 360 365 Ala His Pro Ser Lys Phe His Thr Pro Glu Gly Pro Glu Lys Leu Glu 370 375 380 Asn Pro Glu Thr Asn Leu Thr Cys Leu Gln Ala Pro Gln Ser Thr Ser 385 390 395 400 Val Glu Gly Lys Ile Pro Tyr Phe Leu Ala Asn Gly Pro Lys Ser Ser 405 410 415 Thr Trp Pro Phe Pro Gln Pro Pro Ser Leu Tyr Ser Pro Arg Tyr Ser 420 425 430 Tyr His Asn Ile Ala Asp Val Cys Glu Leu Ala Leu Gly Met Ala Gly 435 440 445 Thr Thr Ala Thr Ser Leu Asp Gln Thr Asp Gln His Val 450 455 460 <210> 10 <211> 461 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 10 Met Lys Glu Asn Ala Ala Ser Arg Val Val Phe Ile Leu Leu Leu Phe 1 5 10 15 Leu Ser Val Ser Leu Leu Asn Gly Gln Ser Pro Pro Glu Lys Pro Lys 20 25 30 Leu Val Lys Cys Arg Ser Pro Gly Lys Glu Thr Phe Thr Cys Trp Trp 35 40 45 Glu Pro Gly Ala Asp Gly Gly Leu Pro Thr Asn Tyr Thr Leu Thr Tyr 50 55 60 His Lys Glu Gly Glu Thr Leu Ile His Glu Cys Pro Asp Tyr Lys Thr 65 70 75 80 Gly Gly Pro Asn Ser Cys Tyr Phe Ser Lys Lys His Thr Ser Ile Trp 85 90 95 Lys Met Tyr Val Ile Thr Val Asn Ala Ile Asn Gln Met Gly Ile Ser 100 105 110 Ser Ser Asp Pro Leu Tyr Val His Val Thr Tyr Ile Val Glu Pro Glu 115 120 125 Pro Pro Ala Asn Leu Thr Leu Glu Leu Lys His Pro Glu Asp Arg Lys 130 135 140 Pro Tyr Leu Trp Ile Lys Trp Ser Pro Pro Thr Met Thr Asp Val Lys 145 150 155 160 Ser Gly Trp Phe Ile Ile Gln Tyr Glu Ile Arg Leu Lys Pro Glu Lys 165 170 175 Ala Thr Asp Trp Glu Thr His Phe Thr Leu Lys Gln Thr Gln Leu Lys 180 185 190 Ile Phe Asn Leu Tyr Pro Gly Gln Lys Tyr Leu Val Gln Ile Arg Cys 195 200 205 Lys Pro Asp His Gly Tyr Trp Ser Glu Trp Ser Pro Glu Ser Ser Ile 210 215 220 Gln Ile Pro Asn Asp Phe Pro Val Lys Asp Thr Ser Met Trp Ile Phe 225 230 235 240 Val Ala Ile Leu Ser Ala Val Ile Cys Leu Ile Met Val Trp Ala Val 245 250 255 Ala Leu Lys Gly Tyr Ser Met Val Thr Cys Ile Leu Pro Pro Val Pro 260 265 270 Gly Pro Lys Ile Lys Gly Phe Asp Val His Leu Leu Glu Lys Gly Lys 275 280 285 Ser Glu Glu Leu Leu Arg Ala Leu Glu Ser Gln Asp Phe Pro Pro Thr 290 295 300 Ser Asp Cys Glu Asp Leu Leu Met Glu Phe Ile Glu Val Asp Asp Cys 305 310 315 320 Glu Asp Gln Gln Leu Met Pro Arg Pro Ser Lys Glu His Thr Glu Gln 325 330 335 Gly Val Lys Pro Met His Leu Asp Leu Asp Ser Asp Ser Gly Arg Gly 340 345 350 Ser Cys Asp Ser Pro Ser Leu Leu Ser Glu Lys Cys Asp Glu Pro Gln 355 360 365 Ala His Pro Ser Lys Phe His Thr Pro Glu Gly Pro Glu Lys Leu Glu 370 375 380 Asn Pro Glu Thr Asn Leu Thr Cys Leu Gln Ala Pro Gln Ser Thr Ser 385 390 395 400 Val Glu Gly Lys Ile Pro Tyr Phe Leu Ala Asn Gly Pro Lys Ser Ser 405 410 415 Thr Trp Pro Phe Pro Gln Pro Pro Ser Leu Tyr Ser Pro Arg Tyr Ser 420 425 430 Tyr His Asn Ile Ala Asp Val Cys Glu Leu Ala Leu Gly Met Ala Gly 435 440 445 Thr Thr Ala Thr Ser Leu Asp Gln Thr Asp Gln His Ala 450 455 460 <210> 11 <211> 191 <212> PRT <213> Bos taurus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (71)..(71) <223> Xaa can either be alanine or valine <400> 11 Thr Cys Leu Gln Ala Pro Gln Ser Thr Ser Val Glu Gly Lys Ile Pro 1 5 10 15 Tyr Phe Leu Ala Asn Gly Pro Lys Ser Ser Thr Trp Pro Phe Pro Gln 20 25 30 Pro Pro Ser Leu Tyr Ser Pro Arg Tyr Ser Tyr His Asn Ile Ala Asp 35 40 45 Val Cys Glu Leu Ala Leu Gly Met Ala Gly Thr Thr Ala Thr Ser Leu 50 55 60 Asp Gln Thr Asp Gln His Xaa Leu Lys Ala Ser Lys Thr Ile Glu Thr 65 70 75 80 Gly Arg Glu Gly Lys Ala Thr Lys Gln Arg Glu Ser Glu Gly Cys Ser 85 90 95 Ser Lys Pro Asp Gln Asp Thr Val Trp Pro Arg Pro Gln Asp Lys Thr 100 105 110 Pro Leu Ile Ser Ala Lys Pro Leu Glu Tyr Val Glu Ile His Lys Val 115 120 125 Ser Gln Asp Gly Val Leu Ala Leu Phe Pro Lys Gln Asn Glu Lys Phe 130 135 140 Gly Ala Pro Glu Ala Ser Lys Glu Tyr Ser Lys Val Ser Arg Val Thr 145 150 155 160 Asp Ser Asn Ile Leu Val Leu Val Pro Asp Pro Gln Ala Gln Asn Leu 165 170 175 Thr Leu Leu Glu Glu Pro Ala Lys Lys Ala Pro Pro Ala Leu Pro 180 185 190 <210> 12 <211> 119 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 12 Lys Ala Ser Lys Thr Ile Glu Thr Gly Arg Glu Gly Lys Ala Thr Lys 1 5 10 15 Gln Arg Glu Ser Glu Gly Cys Ser Ser Lys Pro Asp Gln Asp Thr Val 20 25 30 Trp Pro Arg Pro Gln Asp Lys Thr Pro Leu Ile Ser Ala Lys Pro Leu 35 40 45 Glu Tyr Val Glu Ile His Lys Val Ser Gln Asp Gly Val Leu Ala Leu 50 55 60 Phe Pro Lys Gln Asn Glu Lys Phe Gly Ala Pro Glu Ala Ser Lys Glu 65 70 75 80 Tyr Ser Lys Val Ser Arg Val Thr Asp Ser Asn Ile Leu Val Leu Val 85 90 95 Pro Asp Pro Gln Ala Gln Asn Leu Thr Leu Leu Glu Glu Pro Ala Lys 100 105 110 Lys Ala Pro Pro Ala Leu Pro 115 <210> 13 <211> 1745 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 13 atgaaggaaa atgcagcatc tagagtggtt ttcattttgc tactttttct cagtgtcagc 60 cttctgaatg gacagtcacc tcctgaaaaa cccaagctcg ttaaatgtcg gtctcctgga 120 aaggaaacat tcacctgctg gtgggagcct ggggcagatg gaggacttcc taccaattac 180 acgctgactt accacaagga aggagaaaca ctcatccatg aatgtccaga ctacaaaacc 240 gggggcccca actcctgcta ctttagcaag aagcacacct ccatatggaa gatgtacgtc 300 atcacagtaa acgccatcaa ccagatggga atcagttcct cggatccact ttatgtgcac 360 gtgacttaca tagttgaacc agagcctcct gcaaacctga ctttggaatt aaaacatcca 420 gaagatagaa 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cagccccaga tattcttacc acaacattgc tgacgtgtgt 1320 gagctggccc tgggcatggc cggcaccaca gccacttcgc tggaccaaac agaccaacat 1380 gtttaaaagc ctcaaaaacc attgaaactg gcagggaagg aaaggcaacc aagcagaggg 1440 agtcagaagg ctgcagttcc aagcctgacc aagacacggt gtggccacga ccccaagaca 1500 aaaccccctt gatctctgct aaacccttgg aatacgtgga gatccacaag gtcagccaag 1560 atggagtgct ggctctgttc ccaaaacaaa acgagaagtt tggcgcccct gaagccagca 1620 aggagtactc aaaggtgtcc cgggtgacag atagcaacat cctggtattg gtgccggatc 1680 cgcaagcgca aaacctgact ctgttagaag aaccagccaa gaaggccccg ccagccctgc 1740 catag 1745

Claims (18)

  1. a) 비인간 포유류로 성장할 수 있는 세포를 획득하는 단계;
    b) 절단된 프로락틴 수용체(PRLR) 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 상기 세포에 도입하거나, 상기 세포의 게놈 DNA를 조작하여 상기 게놈 DNA가 절단된 PRLR 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하도록 하는 단계; 및
    c) 상기 세포로부터 상기 비인간 포유류를 생산하는 단계
    를 포함하는, 단모 표현형을 갖는 비인간 포유류의 생산 방법으로서,
    상기 포유류가 전장(full length) PRLR 단백질의 C-말단 부분이 결여된, 절단된 PRLR 단백질을 발현하고, 상기 절단된 PRLR 단백질이 단모 표현형을 생산하고 상기 비인간 포유류에 젖촉진 기능을 제공하는, 생산 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    비인간 포유류로 성장할 수 있는 세포가 전분화 세포(totipotent cell)인, 생산 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    전분화 세포가 줄기세포, 배아줄기세포, 수정된 난모세포 및 접합체로부터 선택되는, 생산 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    비인간 포유류가 소, 돼지, 말, 염소, 고양이, 마우스, 랫, 개, 유인원, 침팬지 또는 오랑우탄인, 생산 방법.
  5. 제6항에 있어서,
    비인간 포유류가 소인, 생산 방법.
  6. a) 비인간 포유류로 성장할 수 있는 세포를 획득하는 단계;
    b) 절단된 프로락틴 수용체(PRLR) 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 상기 세포에 도입하거나, 상기 세포의 게놈 DNA를 조작하여 상기 게놈 DNA가 절단된 PRLR 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하도록 하는 단계; 및
    c) 상기 세포로부터 상기 비인간 포유류를 생산하는 단계
    를 포함하는, 단모 표현형을 갖는 비인간 포유류의 생산 방법으로서,
    상기 포유류가 서열번호 7에 제시된 서열의 아미노산 1 내지 390을 포함하는 절단된 PRLR 단백질 또는 이의 변이체를 발현하고, 서열번호 7에 제시된 서열의 아미노산 391 내지 581을 함유하지 않는, 생산 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    절단된 PRLR 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 서열번호 3의 서열 또는 서열번호 3의 서열에 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 이의 동족체를 포함하고;
    상기 폴리뉴클레오타이드가 서열번호 6의 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 단편을 함유하지 않거나, 서열번호 6의 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 단편을 서열번호 3의 폴리뉴클레오타이드의 단백질 해독틀에서 함유하지 않는,
    생산 방법.
  8. 제6항에 있어서,
    비인간 포유류가 소인, 생산 방법.
  9. 서열번호 3의 서열 또는 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 이의 동족체를 포함하고;
    서열번호 6의 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 단편을 폴리뉴클레오타이드의 단백질 해독틀에서 함유하지 않는
    폴리뉴클레오타이드.
  10. 제9항에 따른 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 단백질.
  11. 제10항에 있어서,
    서열번호 8의 서열을 포함하는 단백질.
  12. 제9항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 형질감염 벡터, 발현 벡터 또는 숙주 세포.
  13. 게놈 DNA에 삽입된 제9항에 따른 폴리뉴클레오타이드의 하나 이상의 카피를 포함하고 단모 코트 표현형을 나타내는 유전적으로 조작된 동물.
  14. 제10항에 따른 단백질 및 단모 코트 표현형의 발현을 야기하는 하나 이상의 돌연변이를 PRLR 유전자의 1 또는 2개 모두의 카피에서 갖는 유전적으로 조작된 동물.
  15. 제13항에 있어서,
    솟과 동물, 돼지, 말, 염소, 고양이, 마우스, 랫, 개, 유인원, 침팬지 및 오랑우탄으로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전적으로 조작된 동물.
  16. 제13항에 있어서,
    축우인 유전적으로 조작된 동물.
  17. 제14항에 있어서,
    솟과 동물, 돼지, 말, 염소, 고양이, 마우스, 랫, 개, 유인원, 침팬지 및 오랑우탄으로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전적으로 조작된 동물.
  18. 제14항에 있어서,
    축우인 유전적으로 조작된 동물.
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Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10920242B2 (en) 2011-02-25 2021-02-16 Recombinetics, Inc. Non-meiotic allele introgression
US9528124B2 (en) 2013-08-27 2016-12-27 Recombinetics, Inc. Efficient non-meiotic allele introgression
US10779518B2 (en) 2013-10-25 2020-09-22 Livestock Improvement Corporation Limited Genetic markers and uses therefor
AU2015320738B2 (en) 2014-09-23 2021-12-02 Acceligen, Inc. Materials and methods for producing animals with short hair
BR112018005412A2 (pt) * 2015-09-21 2018-10-09 Recombinetics Inc animais geneticamente modificados que possuem tolerância térmica aumentada.
US20240090479A1 (en) * 2021-01-27 2024-03-21 Abs Global, Inc. Hyperprolactinemia or lactation without pregnancy
WO2023196818A1 (en) 2022-04-04 2023-10-12 The Regents Of The University Of California Genetic complementation compositions and methods

Family Cites Families (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4873191A (en) 1981-06-12 1989-10-10 Ohio University Genetic transformation of zygotes
FR2737497B1 (fr) 1995-08-02 1997-10-03 Agronomique Inst Nat Rech Utilisation du domaine intra-cytoplasmique du recepteur de la prolactine ou du recepteur de l'hormone de croissance pour obtenir la secretion de proteines
EP0821070A1 (en) 1996-07-22 1998-01-28 Carelli, Claude Marcel Henri Pit-1 gene polymorphism and trait selection in animals
AU6218899A (en) 1998-10-12 2000-05-01 Geron Bio-Med Limited Porcine oocytes with improved developmental competence
CA2372294A1 (en) * 1999-05-13 2000-11-23 The Penn State Research Foundation Genetic marker for meat quality, growth, carcass and reproductive traits in livestock
WO2001030965A2 (en) 1999-10-28 2001-05-03 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods of in vivo gene transfer using a sleeping beauty transposon system
US7645441B2 (en) 2000-12-22 2010-01-12 Sagres Discovery Inc. Compositions and methods in cancer associated with altered expression of PRLR
JP4968498B2 (ja) 2002-01-23 2012-07-04 ユニバーシティ オブ ユタ リサーチ ファウンデーション ジンクフィンガーヌクレアーゼを用いる、標的化された染色体変異誘発
AU2003288686A1 (en) * 2002-11-22 2004-06-18 Institut Clayton De La Recherche Compositions and systems for the regulation of genes
WO2004061125A2 (en) 2002-12-31 2004-07-22 Mmi Genomics, Inc. Compositions, methods and systems for inferring bovine traits
US7985739B2 (en) 2003-06-04 2011-07-26 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Enhanced sleeping beauty transposon system and methods for using the same
CA2543786A1 (en) 2003-10-24 2005-05-06 Mmi Genomics, Inc. Methods and systems for inferring traits to manage non-beef livestock
WO2007002372A2 (en) 2005-06-24 2007-01-04 Regents Of The University Of Minnesota Using cytosine deaminases to diminish retroelement transfer from pigs to humans
GB0524110D0 (en) * 2005-11-28 2006-01-04 Univ Cambridge Tech Biomarkers and methods for identification of agents useful in the treatment of affective disorders
US20110023159A1 (en) 2008-12-04 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Ovine genome editing with zinc finger nucleases
US20110023140A1 (en) 2008-12-04 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Rabbit genome editing with zinc finger nucleases
KR20100080068A (ko) 2008-12-31 2010-07-08 주식회사 툴젠 신규한 징크 핑거 뉴클레아제 및 이의 용도
US20120192298A1 (en) 2009-07-24 2012-07-26 Sigma Aldrich Co. Llc Method for genome editing
EP2462230B1 (en) 2009-08-03 2015-07-15 Recombinetics, Inc. Methods and compositions for targeted gene modification
US20110197290A1 (en) 2010-02-11 2011-08-11 Fahrenkrug Scott C Methods and materials for producing transgenic artiodactyls
BR112013021785A8 (pt) 2011-02-25 2018-07-03 Recombinetics Inc animais geneticamente modificados e métodos para fazer os mesmos
US9528124B2 (en) 2013-08-27 2016-12-27 Recombinetics, Inc. Efficient non-meiotic allele introgression
CN114634950A (zh) 2012-12-12 2022-06-17 布罗德研究所有限公司 用于序列操纵的crispr-cas组分系统、方法以及组合物
US10779518B2 (en) 2013-10-25 2020-09-22 Livestock Improvement Corporation Limited Genetic markers and uses therefor
AR100216A1 (es) 2014-04-28 2016-09-21 Recombinetics Inc Edición de genes multiplexados
AU2015320738B2 (en) 2014-09-23 2021-12-02 Acceligen, Inc. Materials and methods for producing animals with short hair
BR112018005412A2 (pt) 2015-09-21 2018-10-09 Recombinetics Inc animais geneticamente modificados que possuem tolerância térmica aumentada.

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