JP2017528169A - 短毛の動物を作製するための物質および方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は毛の長さが短い動物を作製するための物質および方法を提供する。好ましい態様において、これは、プロラクチン受容体(PRLR)タンパク質の切断型が産生されるように、該タンパク質をコードするヌクレオチド配列を動物において変更することにより達成される。有利なことにかつ驚くべきことに、本発明によって産生される切断型タンパク質は、乳腺刺激機能性を保持しているが、該動物に短毛の被毛を有させる。
Description
関連出願の相互参照
本出願は、2014年9月23日に出願された米国特許仮出願第62/054,169号の優先権の恩典を主張し、それはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
本出願は、2014年9月23日に出願された米国特許仮出願第62/054,169号の優先権の恩典を主張し、それはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
本出願についての配列表は、2015年9月18日に作成されたSEQ-LIST-9-18-15-ST25.txtと名前を付けられ、かつ33 KBである。配列表の全内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
発明の背景
様々な状況において、動物が短毛の被毛を有することが望ましい。これは特に、いくつかの動物において熱ストレスを軽減するのに有用である。また、短毛が美容的理由および/またはアレルゲン性の理由で好ましい場合もある。
様々な状況において、動物が短毛の被毛を有することが望ましい。これは特に、いくつかの動物において熱ストレスを軽減するのに有用である。また、短毛が美容的理由および/またはアレルゲン性の理由で好ましい場合もある。
耐暑性は、大型の家畜、特に畜牛において重要な形質である。暑熱によって、米国において年に何千頭もの畜牛が死に、畜牛の生産力が低下し、最高の生産力の品種を暑い気候において使用することが阻止される。畜牛における熱ストレスを減少させるための1つの方法は、毛を短くすることである。畜牛において、短毛の被毛は「スリック(slick)」被毛と称され、関連遺伝子はSLICK遺伝子と呼ばれ、短毛の被毛の表現型は「スリック表現型」と呼ばれる。
いくらかの畜牛生産者は、耐暑性を改善するために、夏に彼らの畜牛の毛を刈るが;しかし、この方法は、極度に労働集約的であり、高価であり、かつ大きな群れにとっては非実用的である。スリック表現型は、セネポル(Senepol)、カロラ(Carora)、およびロモシヌアノ(Romosinuano)を含む西アフリカ系統のいくつかの畜牛品種においては天然に見出されるが;しかし、これらの品種は、他の点ではあまりよくない生産力および屠殺体品質を有し、畜牛産業におけるその有用性が限定されている。
スリック表現型の遺伝的基盤は、単一遺伝子優性と特定された(Olson et al. (2003), J Anim Sci.; 81(1):80-90)。伝統的な連鎖解析により、原因遺伝子が畜牛の20番染色体の500万塩基対の領域に位置づけられた(Mariasegaram et al. (2007), Anim Genet.; 38(1):54-59)。ゲノムワイド関連解析(GWAS)研究を用いて、領域がさらに狭められた(Huson et al. (2014), Front Genet.; Apr 29, Vol.5:101)。しかし、より狭い領域はほとんど遺伝子を含有しておらず、そのいずれも変異を含有していなかった。そのため、狭小化は恐らく誤りであった。
熱ストレス下で恒常性を維持する能力は、亜熱帯および熱帯地域において畜牛にとって特に重要である。品種間での耐暑性のバリエーションは長年にわたって研究されているが、耐暑性に関与する遺伝様式を解明することに対しては比較的少しの努力しか向けられてきていない。熱ストレス下での体温のバリエーションが、オーストラリアにおいて研究されており、低度から中程度の遺伝率を有することが示されている(Turner, 1982;Turner, 1984;Mackinnon et al., 1991;Burrow, 2001)。また、セネポル牛は、耐暑性がブラーマン牛と同等であることが報告されており(Hammond and Olson, 1994;Hammond et al., 1996)、適度の品種とのセネポルF1交雑種は、ブラーマンおよびブラーマン交雑種のものに匹敵する耐暑性を示す(Hammond and Olson, 1994;Hammond et al., 1996;Hammond et al., 1998)。
これまで、何の変異がスリック被毛表現型を担うかは知られていなかった。
本発明は、毛の長さが短い動物を作製するための物質および方法を提供する。好ましい態様において、これは、プロラクチン受容体(PRLR)タンパク質の切断型が産生されるように、このタンパク質をコードするヌクレオチド配列を動物において変更することによって達成される。有利なことにかつ驚くべきことに、本発明によって産生される切断型タンパク質は、乳腺刺激機能性を保持しているが、動物に短毛の被毛を有させる。
1つの態様において、本発明は、切断型PRLRタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を提供する。ポリヌクレオチド配列は、切断型C末端のためにヌクレオチドを欠損していてもよいか、または、ヌクレオチドが存在する場合にはN末端をコードするヌクレオチドと読み枠がずれている。
さらなる態様において、本発明は、切断型PRLRタンパク質を動物において発現させる工程であって、乳腺刺激機能を提供するが、より長い毛の被毛と関連する野生型タンパク質のC末端由来のアミノ酸を含有しない、アミノ酸配列を、該切断型PRLRタンパク質が有する、工程を含む、短毛の動物を作製するための方法を提供する。
具体的な態様において、本発明は、そのゲノム内に、PRLRタンパク質の乳腺刺激性断片をコードするが、長い被毛をもたらすアミノ酸をコードするヌクレオチド(例えばSEQ ID NO: 6)を欠如するかまたは少なくともその一部分を欠如する、ポリヌクレオチド(例えばSEQ ID NO: 3)を有する、遺伝子操作された畜牛を提供する。畜牛が切断型B. タウルス(B. taurus)PRLRタンパク質を発現しかつ短毛の被毛の表現型を示すように、PRLR遺伝子の1コピーまたは両方のコピーが変異導入または切断されている、遺伝子操作された畜牛もまた提供される。
有利なことに、動物において被毛の長さにおよびしたがって熱ストレスに影響を及ぼすとのSLICK遺伝子の同定により、この形質を適度の品種へ操作し、それによって温かい気候における畜牛の生産性を増大することが可能になる。本発明によって、熱ストレスの期間中の胚生存の増大およびより多くのミルクの産生を通して、乳牛の生殖能力を成し遂げることができる。スリック毛の適度のウシ科品種への組み込みにより、以前に可能であったものよりも大きな熱ストレスの条件下で、成功裡に飼育することが可能になる。
特許または出願ファイルは、少なくとも1つのカラーで製作された図面を含有する。カラー図面を有する本特許または特許出願刊行物のコピーは、要請して必要な手数料を支払うと、庁により提供される。
畜牛においてプロラクチン受容体(PRLR)タンパク質の切断をもたらす変異を示す。野生型配列からのC(SEQ ID NO: 2の1382位のシトシン)の欠失により、461位のアラニンのバリンへの変異が引き起こされて、次のコドンが終止コドンに変換され、それによって461個のアミノ酸のPRLRが産生される。この変異はA461VfsX1と表わされ、すなわち、アラニン(A)が変化する最初のアミノ酸であり、これは461位にあり、バリン(V)を代わりとして、シフトフレームの長さは、終止コドン(X)を含めて1である。
配列の簡単な説明
SEQ ID NO: 1は、畜牛(ボース・タウルス(Bos taurus))PRLRの完全長mRNA配列である。
SEQ ID NO: 2は、完全長/野生型B. タウルスPRLRをコードするヌクレオチド配列である。
SEQ ID NO: 3は、乳腺刺激活性を保持し、かつスリック表現型を生じさせるB. タウルスPRLRタンパク質の最小の390アミノ酸部分をコードするヌクレオチド配列である。
SEQ ID NO: 4は、変異体/切断型B. タウルスPRLRタンパク質をコードするヌクレオチド配列の例である。具体的には、これは、A461VfsX1変異体に対応するボース・タウルスPRLRの変異体mRNAのタンパク質コード部分の配列である。
SEQ ID NO: 5は、切断型B. タウルスPRLRタンパク質をコードするヌクレオチド配列の例である。具体的には、これは、アミノ酸1〜461を含有する切断型ボース・タウルスPRLRをコードするmRNAの配列である。
SEQ ID NO: 6は、最小の変異体/切断型B. タウルスPRLRタンパク質をコードするヌクレオチドに(インフレームで)存在しないポリヌクレオチド配列を提供する。この配列またはその断片は、変異体/切断型B. タウルスPRLRタンパク質をコードするヌクレオチドに存在することができるが;しかし、この配列またはその断片は、変異体/切断型B. タウルスLRLRタンパク質をコードするヌクレオチドとタンパク質読み枠に存在しないか、または、スリック被毛表現型が起こるように十分にわずかなアミノ酸しかコードしないかのいずれかである。
SEQ ID NO: 7は、完全長B. タウルスPRLRのアミノ酸配列である。
SEQ ID NO: 8は、ミルク産生に必要とされ、かつスリック表現型を提供する、B. タウルスPRLRタンパク質の390アミノ酸最小部分の配列である。
SEQ ID NO: 9は、変異体/切断型B. タウルスPRLRタンパク質の例のアミノ酸配列である。
SEQ ID NO: 10は、切断型B. タウルスPRLRタンパク質の例のアミノ酸配列である。
SEQ ID NO: 11は、切断型B. タウルスPRLRタンパク質に存在しないB. タウルスPRLRタンパク質の一部分(完全長PRLRタンパク質のアミノ酸391〜581)のアミノ酸配列である。
SEQ ID NO: 12は、切断型B. タウルスPRLRタンパク質に(インフレームで)存在しないヌクレオチド配列によってコードされるアミノ配列である。
SEQ ID NO: 13は、B. タウルスPRLRのA461VfsX1変異体のmRNA配列である。
SEQ ID NO: 1は、畜牛(ボース・タウルス(Bos taurus))PRLRの完全長mRNA配列である。
SEQ ID NO: 2は、完全長/野生型B. タウルスPRLRをコードするヌクレオチド配列である。
SEQ ID NO: 3は、乳腺刺激活性を保持し、かつスリック表現型を生じさせるB. タウルスPRLRタンパク質の最小の390アミノ酸部分をコードするヌクレオチド配列である。
SEQ ID NO: 4は、変異体/切断型B. タウルスPRLRタンパク質をコードするヌクレオチド配列の例である。具体的には、これは、A461VfsX1変異体に対応するボース・タウルスPRLRの変異体mRNAのタンパク質コード部分の配列である。
SEQ ID NO: 5は、切断型B. タウルスPRLRタンパク質をコードするヌクレオチド配列の例である。具体的には、これは、アミノ酸1〜461を含有する切断型ボース・タウルスPRLRをコードするmRNAの配列である。
SEQ ID NO: 6は、最小の変異体/切断型B. タウルスPRLRタンパク質をコードするヌクレオチドに(インフレームで)存在しないポリヌクレオチド配列を提供する。この配列またはその断片は、変異体/切断型B. タウルスPRLRタンパク質をコードするヌクレオチドに存在することができるが;しかし、この配列またはその断片は、変異体/切断型B. タウルスLRLRタンパク質をコードするヌクレオチドとタンパク質読み枠に存在しないか、または、スリック被毛表現型が起こるように十分にわずかなアミノ酸しかコードしないかのいずれかである。
SEQ ID NO: 7は、完全長B. タウルスPRLRのアミノ酸配列である。
SEQ ID NO: 8は、ミルク産生に必要とされ、かつスリック表現型を提供する、B. タウルスPRLRタンパク質の390アミノ酸最小部分の配列である。
SEQ ID NO: 9は、変異体/切断型B. タウルスPRLRタンパク質の例のアミノ酸配列である。
SEQ ID NO: 10は、切断型B. タウルスPRLRタンパク質の例のアミノ酸配列である。
SEQ ID NO: 11は、切断型B. タウルスPRLRタンパク質に存在しないB. タウルスPRLRタンパク質の一部分(完全長PRLRタンパク質のアミノ酸391〜581)のアミノ酸配列である。
SEQ ID NO: 12は、切断型B. タウルスPRLRタンパク質に(インフレームで)存在しないヌクレオチド配列によってコードされるアミノ配列である。
SEQ ID NO: 13は、B. タウルスPRLRのA461VfsX1変異体のmRNA配列である。
発明の詳細な開示
本発明は、毛の長さが短い動物を作製するための物質および方法を提供する。好ましい態様において、これは、プロラクチン受容体(PRLR)タンパク質の切断型が産生されるように、このタンパク質をコードするヌクレオチド配列を動物において変更することによって達成される。有利なことにかつ驚くべきことに、本発明によって産生される切断型タンパク質は、乳腺刺激機能性を保持しているが、動物に短毛の被毛を有させる。
本発明は、毛の長さが短い動物を作製するための物質および方法を提供する。好ましい態様において、これは、プロラクチン受容体(PRLR)タンパク質の切断型が産生されるように、このタンパク質をコードするヌクレオチド配列を動物において変更することによって達成される。有利なことにかつ驚くべきことに、本発明によって産生される切断型タンパク質は、乳腺刺激機能性を保持しているが、動物に短毛の被毛を有させる。
したがって、1つの態様において、本発明は、例えば、動物に短毛の(スリック)被毛を与えることによって動物における耐暑性を改善するための、物質および方法を提供する。本明細書で具体的に例証される好ましい態様において、動物はウシ科動物である。
ミルク産生能力を畜牛に与えるが短毛表現型も引き起こすPRLRタンパク質を発現する畜牛が、本明細書において具体的に例証される。好ましい態様において、PRLRタンパク質は、581アミノ酸の野生型タンパク質のうちN末端の390アミノ酸を含む。発現されるタンパク質が、短毛表現型が得られるように完全長タンパク質と比較して十分に切断されている限り、最小の390アミノ酸の断片に加えてアミノ酸が存在することができる。好ましくは、完全長の581アミノ酸のタンパク質のC末端が、少なくとも1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、もしくは120個のアミノ酸またはそれ以上のアミノ酸分だけ切断されている。
具体的な態様において、ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO: 8に示すPRLRタンパク質の390アミノ酸部分をコードするヌクレオチドを含み、該ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO: 11(アミノ酸391〜581)をコードするヌクレオチドを含まない。あるいは、SEQ ID NO: 11をコードするヌクレオチドのすべてまたは一部分が存在する場合には、SEQ ID NO: 3と同じタンパク質読み枠にないか、または、存在し、かつSEQ ID NO: 3と同じ読み枠にある一部分が、正常な(非スリックまたは短くない)被毛をもたらすのに十分な数のアミノ酸をコードしないかのいずれかである。
「スリック被毛」の存在は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Evidence of a Major Gene Influencing Hair Length and Heat Tolerance in Bos Taurus Cattle, J. Anim. Sci. (2003) 81:80-90においてOlsonらにより示されている試験を用いて、当業者が容易に判定することができる。好ましい態様において、短い被毛の動物の毛は、スリック毛表現型を示さない動物(本明細書において「正常」または「長毛」と称される)の毛の長さの50%、40%、30%、20%、またはさらには10%未満である。
本発明の意図に関して、「畜牛」という用語は、B. タウルス、ヤク(B. mutus)、およびウシ(Bos)属の他のメンバーに属する動物を指す。本発明は、畜牛に関して本明細書において例証されるが;しかし、当業者は、耐暑性、美しさ、アレルゲン性、および/または清潔さを改善するために短毛の被毛から恩恵を受けることができる他の動物で、本発明を実施することができる。好ましくは、動物は非ヒト動物である。これらの他の動物は、他のウシ科動物(特にウシ)、ブタ、ウマ、ヤギ、ネコ、マウス、ラット、イヌ、類人猿、チンパンジー、およびオランウータンを含むが、それらに限定されない。当業者が認識するように、乳腺刺激機能を保存するために必要とされるPRLR部分の切断の正確な点は、種によって変動する可能性があり、短毛の被毛を成し遂げるために必要とされるC末端切断の程度も同様である。しかし、所定の動物のために存在すべきPRLRタンパク質の適切な一部分は、本開示の恩恵を受ける当業者が容易に決定することができる。
本発明によって、スリック表現型を担う変異が特定された。変異は、B. タウルスPRLR遺伝子中のA461VfsX1変異である。変異は、PRLRタンパク質のカルボキシ末端部分のアミノ酸120個の欠失をもたらした。
PRLRタンパク質のC末端から欠失している120個のアミノ酸は、本質的にすべての哺乳動物の種にわたって保存されている。これらのアミノ酸は、ミルク産生のために不可欠ではなく、すなわち、これらのC末端アミノ酸を欠損するPRLRは、ミルク産生のプロセスにおいてその役割を果たすことができる。
SEQ ID NO: 2は、完全長B. タウルスPRLRタンパク質をコードするヌクレオチド配列である。SEQ ID NO: 4および13は、B. タウルスPRLRタンパク質の変異体/切断型形態をコードするヌクレオチド配列である。この特定の切断型タンパク質は、A461VfsX1変異を保有する変異体PRLR遺伝子によってコードされる。この変異を保有する畜牛は、スリック表現型を示す。
したがって、本発明は、SEQ ID NO: 3の配列を含み切断型B. タウルスPRLRタンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供し、該ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO: 3を含むポリヌクレオチドと同じタンパク質読み枠にSEQ ID NO: 6(または長毛の被毛を引き起こすのに十分大きなその一部分)のヌクレオチド配列を含有しない。本発明の意図に関して、そのようなポリヌクレオチドは、「切断型B. タウルスPRLRポリヌクレオチド」と呼ばれる。
本発明の意図に関して、2種のポリヌクレオチドが連結(融合)された場合、融合されたポリヌクレオチドが、第1および第2のポリヌクレオチドによって独立してコードされるポリペプチドを含有するタンパク質をコードする場合には、第1のポリヌクレオチドは、第2のポリヌクレオチドと同じタンパク質読み枠にある。そのため、2種のポリヌクレオチドを、介在ヌクレオチドなしで互いに付着させる場合、2種のポリヌクレオチドのタンパク質読み枠は維持される。3の整数倍ではない数のヌクレオチド(例えば、1、2、4、5、7、8、9、11個など)が第1と第2のポリヌクレオチドの間に挿入される、および/または第1のポリヌクレオチドのタンパク質読み枠中に終止コドンが存在する場合には、2種のポリヌクレオチドの間で読み枠が維持されない。
そのため、ある特定の具体的な態様において、本発明の切断型B. タウルスPRLRポリヌクレオチドは、SEQ ID NO: 6のすべてまたは一部を含むポリヌクレオチドと接続されているSEQ ID NO: 3、4、または5の配列を含むポリヌクレオチドを包含し、ここで、SEQ ID NO: 3、4、または5のポリヌクレオチドとSEQ ID NO: 6のポリヌクレオチドとの間に挿入されたヌクレオチドの数は、3の整数倍ではなく、かつ/またはSEQ ID NO: 3、4、または5の配列でのタンパク質読み枠における終止コドンが、2種のポリヌクレオチドの間に導入されている。そのようなポリヌクレオチドの例は、B. タウルスPRLRタンパク質のA461VfsX1変異体のヌクレオチド配列であり、SEQ ID NO: 4の配列とSEQ ID NO: 6の配列の一部との間に1個のヌクレオチドを含有する、SEQ ID NO; 13を含むポリヌクレオチドである。あるいは、SEQ ID NO: 6のすべてまたは一部は、配列の一部が存在する場合には長毛の被毛を引き起こすのに十分でない限り、全く存在しなくてもよい。
したがって、切断型B. タウルスPRLRポリヌクレオチドは、SEQ ID NO: 6の配列またはその断片を含有することができるが;しかし、SEQ ID NO: 6の配列またはその断片は、長毛の被毛を引き起こすのに十分な数のアミノ酸を、切断型B. タウルスPRLRポリヌクレオチド(例えば、SEQ ID NO: 3)の配列でのタンパク質読み枠においてコードすることができない。
本発明の1つの切断型B. タウルスPRLRポリヌクレオチドは、切断型B. タウルスPRLRタンパク質をコードし、該切断型タンパク質はSEQ ID NO: 8の配列を含み、該切断型B. タウルスPRLRタンパク質は、SEQ ID NO: 11の配列、または長毛の被毛を引き起こすのに十分なその断片を含有しない。
したがって、本発明による有用な切断型B. タウルスPRLRタンパク質の例は、SEQ ID NO: 7に示す完全長PRLRタンパク質の断片を含み、該切断型タンパク質は、SEQ ID NO: 7の1〜390から1〜461アミノ酸のアミノ酸配列を含み、該断片は、SEQ ID NO: 11の配列またはその断片を有さない。
表1は、切断型B. タウルスPRLRポリヌクレオチドのある特定の例、およびそれらのポリヌクレオチドによってコードされる切断型B. タウルスPRLRタンパク質を提供する。表1に示す切断型B. タウルスPRLRポリヌクレオチドのすべての配列は、SEQ ID NO: 4または5の1位で始まっており、表1に示す切断型B. タウルスPRLRタンパク質の配列は、SEQ ID NO: 7の1位で始まっている。ポリヌクレオチドの種々の末端位置は、SEQ ID NO: 4または5に対応し、アミノ酸の種々の末端位置は、SEQ ID NO: 7に対応する。
アミノ酸461個より大きい断片もまた、それらが非スリック表現型をもたらすのに十分大きくない限り、本発明の範囲内である。
本発明はまた、切断型B. タウルスPRLRポリヌクレオチドおよび切断型B. タウルスPRLRタンパク質の相同体も提供する。
本発明の意図に関して、「相同体」という用語は、少なくとも70%から約99%(包括的)の間の参照配列との同一性パーセンテージを有する配列を指す。前述の同一性パーセントの範囲は、70%から99%までの、1%の間隔での任意の部分パーセンテージについて記載された説明支持を含み、かつ提供するように解釈されるべきである。例えば、相同な配列は、参照配列と70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、または99パーセントの同一性パーセントを示すことができる。
典型的に、同一性パーセントは、参照配列の全体にわたって算出される。2種またはそれ以上の配列の文脈における「同一」または「同一性」パーセントという用語は、配列比較アルゴリズムを用いて、または手動のアラインメントおよび目視検査により測定されるような、比較ウィンドウにわたる最大の対応について比較およびアラインメントした場合に、同じであるか、または特定されたパーセンテージの同じである残基を有する、2つまたはそれ以上の配列または部分配列を指す。
本発明はまた、切断型B. タウルスPRLRポリヌクレオチドおよびタンパク質と少なくとも70%から約99%(包括的)までの配列同一性を有する、切断型B. タウルスPRLRポリヌクレオチドおよび切断型B. タウルスPRLRタンパク質の相同体も提供する。
切断型B. タウルスPRLRポリヌクレオチドの相同体のある特定の例は、SEQ ID NO: 3、4、または5の配列と約70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、または99パーセントの配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。切断型B. タウルスPRLRポリヌクレオチドの相同体はまた、相同体のタンパク質読み取り領域とインフレームで、SEQ ID NO: 6の配列、または長い被毛をもたらすのに十分なその断片を含有しない。
切断型B. タウルスPRLRタンパク質の相同体のある特定の例は、SEQ ID NO: 8、9、または10の配列と約70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、または99パーセントの配列同一性を有するタンパク質を含む。切断型B. タウルスPRLRタンパク質の相同体はまた、SEQ ID NO: 11の配列、または長い被毛をもたらすのに十分なその断片を含有しない。
本発明による有用な核酸配列は、例証されるヌクレオチド配列のバリアントを含み、該バリアントは、例証されるポリヌクレオチド配列によってコードされる配列と同一であるアミノ酸配列をコードする。遺伝コードの縮重のために、複数の核酸配列が、任意の所定のタンパク質をコードする。例として、コドンGCA、GCC、GCG、およびGCUはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンによって特定されるあらゆる位置で、コドンを、コードされるポリペプチドを変更することなく記載される対応するコドンのいずれかに変更することができる。そのような核酸バリエーションは、サイレント変異と呼ばれる。核酸における各コドン(通常メチオニンに対する唯一のコドンである、AUG以外)は、改変されても依然として同じアミノ酸配列をコードし得ることを、当業者は認識しているであろう。本発明のポリペプチドをコードする、サイレント変異体を有するそのようなバリアント配列は、特許請求される発明の範囲内である。
核酸配列の相同性は、当技術分野において公知の様々な配列比較アルゴリズムおよびプログラムのいずれかを用いて特定することができる。そのようなアルゴリズムおよびプログラムは、TBLASTN、BLASTP、FASTA、TFASTA、およびCLUSTALWを含むが、それらに限定されない(Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(8):2444-2448;Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215(3):403-410;Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Res. 22(2):4673-4680;Higgins et al., 1996, Methods Enzymol. 266:383-402;Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215(3):403-410;Altschul et al., 1993, Nature Genetics 3:266-272)。配列比較は、典型的に、供給業者によって提供されるデフォルトのパラメータを用いて、または、その全体が参照により本明細書に組み入れられる上記で特定された参照文献に示されているパラメータを用いて、実施される。
「約」という用語は、本発明のいくつかの定量的局面、例えば、誘導物質の濃度またはヌクレオチド配列間の同一性パーセントを記載するために、本特許出願において使用される。本発明が作動する局面に関して絶対的な精度は必要とされないことが、理解されるべきである。「約」という用語が本発明の定量的局面を記載するために使用される場合には、関連する局面は±10%変動し得る。
本明細書において使用される「相補的」ポリヌクレオチド配列とは、概して、二本鎖核酸分子(DNA-DNA、DNA-RNA、またはRNA-RNA)において特定のプリンと特定のピリミジンとの間の水素結合から生じる配列を指す。主な特異的対合は、グアニンとシトシン、およびアデニンとチミンまたはウラシルである。「相補的」ポリヌクレオチド配列はまた、「アンチセンス」ポリヌクレオチド配列または「アンチセンス配列」とも称することができる。本発明の種々の局面において、配列は、参照配列に対して「完全に相補的」であり、これは、その塩基対合においてミスマッチを含有しない配列を指す。
本明細書において使用される際、「ベクター」とは、ヌクレオチド構築物、例えばDNA構築物を宿主細胞中に導入するための、プラスミド、コスミド、またはバクテリオファージなどのDNA分子を指す。クローニングベクターは、典型的に、ベクターの本質的な生物学的機能を喪失することなく、異質DNA配列を決定可能な様式でそこで挿入することができる、1つまたは少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位、ならびに、クローニングベクターで形質転換された細胞の同定および選択における使用に適しているマーカー遺伝子を含有する。マーカー遺伝子は、典型的に、抗生物質耐性を提供する遺伝子を含む。本発明を実施する際に使用することができる選択抗生物質の非限定的な例は、Geneticin(G-418)、ミコフェノール酸、およびzeocinを含む。本発明における使用に適している抗生物質の追加の例は、当業者に公知であり、そのような態様は本発明の範囲内である。
本発明はまた、標的配列または標的配列から生成した単位複製配列とのハイブリダイゼーションのための検出プローブ(例えば、B. タウルスPRLRポリヌクレオチドの断片)も提供する。そのような検出プローブは、B. タウルスPRLRポリヌクレオチド(例えば、表1、SEQ ID NO: 3、4、および5に記載したポリヌクレオチド)のいずれかの少なくとも8、9、10、11、12、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、もしくは100個、またはそれ以上のヌクレオチドの隣接する/連続するスパンを含むことになる。
標識されたプローブまたはプライマーは、放射性化合物で、または別のタイプの標識、例えば、(1)放射性標識、(2)酵素標識、(3)化学発光標識、(4)蛍光標識、または(5)磁気標識で標識される。あるいは、非標識ヌクレオチド配列を、プローブまたはプライマーとして直接使用することができるが;しかし、配列は、概して、多数の適用において使用することができるプローブを提供するために、放射性元素(32P、35S、3H、125I)で、またはビオチン、アセチルアミノフルオレン、ジゴキシゲニン、5-ブロモ-デオキシウリジン、もしくはフルオレセインなどの分子で標識される。
本明細書において開示されるB. タウルスPRLRポリヌクレオチドは、細胞において、または動物、例えば畜牛および他のウシ科動物において、切断型B. タウルスPRLRタンパク質を発現させる方法に有用である。これは、関心対象の細胞を、B. タウルスPRLRポリヌクレオチドを含むDNA構築物(トランスジェニック遺伝子構築物)で形質転換すること、および切断型B. タウルスPRLRタンパク質を発現する形質転換細胞を生成することによって達成することができる。
追加の態様において、本発明は、切断型PRLRタンパク質をコードする切断型B. タウルスPRLRポリヌクレオチドを含む、トランスフェクションベクター、発現ベクター、宿主細胞、およびトランスジェニック動物に関する。
別の態様において、本発明は、単離された切断型B. タウルスPRLRタンパク質、および、そのような単離された切断型B. タウルスPRLRタンパク質を含む融合ポリペプチドに関する。
本明細書において開示される種々の方法は、ヌクレオチド(DNA)構築物を細胞中に導入する工程を含む。「導入する」という用語は、構築物が細胞の内部へのアクセスを得るような様式で、細胞にヌクレオチド構築物を提示することを意味するように、本明細書において使用される。これらの方法は、ヌクレオチド構築物が細胞の内部へのアクセスを得ることだけで、ヌクレオチド構築物を細胞に導入するための特定の方法には依存しない。ヌクレオチド構築物を細胞中に導入するための方法は、当技術分野において公知であり、安定な形質転換法、一過性の形質転換法、およびウイルス媒介の方法を含むが、それらに限定されない。
本発明はまた、天然にはスリック表現型を示さない動物を遺伝子改変して、スリック表現型を示す動物を作製するために、切断型PRLRポリヌクレオチドを使用する方法も提供する。任意の品種にスリック表現型を付加するために、切断型PRLRタンパク質の発現を引き起こす任意の変異を使用することができる。
したがって、1つの態様において、本発明は、短毛の表現型を有する非ヒト哺乳動物を作製する方法であって、該哺乳動物が、SEQ ID NO: 7に示す配列の少なくとも1〜390個のアミノ酸を含む切断型PRLRタンパク質を発現し、かつSEQ ID NO: 7に示す配列のアミノ酸391〜581のすべてを含有しない、方法を提供する。本発明の方法は、
(a)非ヒト哺乳動物へと発達する能力を有する細胞を取得する工程、および
(b)切断型PRLRタンパク質をコードするポリヌクレオチドを該細胞中に導入するか、または、切断型PRLRタンパク質をコードするポリヌクレオチドをゲノムDNAが含むように該細胞のゲノムDNAを操作する工程、および
(c)該細胞から該非ヒト哺乳動物を作製する工程
を含む。
(a)非ヒト哺乳動物へと発達する能力を有する細胞を取得する工程、および
(b)切断型PRLRタンパク質をコードするポリヌクレオチドを該細胞中に導入するか、または、切断型PRLRタンパク質をコードするポリヌクレオチドをゲノムDNAが含むように該細胞のゲノムDNAを操作する工程、および
(c)該細胞から該非ヒト哺乳動物を作製する工程
を含む。
切断型PRLRタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、SEQ ID NO: 3の配列、またはSEQ ID NO: 3の配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有するその相同体を含むことができ、該ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO: 6の完全なヌクレオチド配列を含有しないか、またはSEQ ID NO: 3のポリヌクレオチドのタンパク質読み枠においてSEQ ID NO: 6の完全なヌクレオチド配列を含有しない。本発明の方法において使用することができるポリヌクレオチドの例は、SEQ ID NO: 3、4、5、または13の配列を含むポリヌクレオチドである。非ヒト哺乳動物に対して短毛表現型を提供する切断型PRLRタンパク質の例は、SEQ ID NO: 8の配列を有するタンパク質である。
1つの態様において、非ヒト哺乳動物へと発達する能力を有する細胞は、全能細胞である。全能細胞は、完全な器官へと発達する能力、またはその細胞もしくは組織のいずれかに分化する能力を有する。本発明の方法において使用することができる全能細胞の非限定的な例は、幹細胞、胚性幹細胞、受精卵母細胞、および接合子である。本発明によって使用することができる全能細胞の追加の例は、当業者に周知であり、そのような態様は本発明の範囲内である。
ある特定の態様において、非ヒト哺乳動物は、ウシ科動物、畜牛、ブタ、ウマ、ヤギ、ネコ、マウス、ヒツジ、ラット、イヌ、類人猿、チンパンジー、またはオランウータンである。本発明によって使用することができるPRLRタンパク質の非限定的な例は、UniProtアクセッション番号Q28172、Q08501、P14787、O46561、P05710、Q58DZ7、Q6JTA8、C7T4Z0、Q3HNA7、D0VFV2、C7T4V8、C7T4W1、C7T4W4、C7T4X8、Q2PBP0、B3GDH0、C7T4X9、E7BKJ5、G3UVW6、Q58DZ7、E7CHC7、E5KXH8、D3ZV73、D0VFV3、F2XX66、I7FI71、E9MW50、Q28172、F1N4H8、Q2PBN9、C7F8W7、G1DE70、S5TFK4、Q28235、O46561、Q08501、Q99JZ1、U6CXL9、P05710、F1M137、P14787、F7HIV1、Q865V4、Q6JTA8、D9IWB8、Q9XS92、およびK7GKV2を有するタンパク質である。
遺伝子操作された動物は、遺伝子操作された動物、特に哺乳動物を作製するための、当技術分野において公知の方法論によって作製することができる。そのような技術の非限定的な例は、切断型B. タウルスPRLRタンパク質を発現するトランスジェニック畜牛を作製すること、畜牛血統における野生型タンパク質を切断型タンパク質で置き換えるための相同組み換え、切断型タンパク質の産生をもたらすことになる畜牛血統のゲノム中の関連する塩基の欠失、またはゲノム編集のための任意の他の方法論を含む。追加の例は、組み換えレトロウイルスを含む方法、前核注入、精子媒介DNA移入、生殖細胞移植、および核移入クローニングを含む。本発明の方法にしたがう遺伝子改変された哺乳動物を作製するまたさらなる方法は、当業者に周知であり、そのような方法は特許請求される発明の範囲内である。
本明細書において使用される「遺伝子操作された畜牛」という用語は、トランスジェニック畜牛、および、PRLR遺伝子の1コピー中または両方のコピー中に変異を保有し該変異が切断型PRLRタンパク質の発現をもたらす、畜牛を包含する。
トランスジェニック畜牛とは、畜牛のゲノム中に組み込まれた1コピーまたは複数コピーの切断型PRLRポリヌクレオチドを介して切断型PRLRタンパク質を発現する畜牛を指す。PRLR遺伝子の1コピー中に変異または切断を保有し該変異または切断が切断型PRLRタンパク質の発現をもたらす畜牛は、ホモ接合畜牛と呼ばれ;他方、PRLR遺伝子の両方のコピー中に変異または切断を保有し該変異が切断型PRLRタンパク質の発現をもたらす畜牛は、ヘテロ接合畜牛と呼ばれる。
切断型PRLRタンパク質を発現する、トランスジェニック、ホモ接合、またはヘテロ接合の畜牛は、スリック表現型を示すことができる。
1つの態様において、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ媒介(TALEN媒介)相同組み換えが、スリック表現型を示すホモ接合またはヘテロ接合の畜牛を作製するために使用される。TALEN媒介の遺伝子操作された生物を作製する例は、Zu et al. (2013), TALEN-mediated precise genome modification by homologous recombination in zebrafish, Nature Methods, 10:329-331;Katsuyama et al. (2013), An efficient strategy for TALEN-mediated genome engineering in Drosophila, Nucleic Acids Research, Vol. 41, No. 17, e163;およびLiu et al. (2014), TALEN-Mediated Gene Mutagenesis in Rhesus and Cynomolgus Monkeys, Cell Stem Cell, Vol. 14, Issue 3, pp. 323-328によって提供される。
クラスター化され規則的に間隔のあいた短い回文構造リピート(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat)(CRISPR)およびCRIPS関連遺伝子(CAS)システム(CRISPR/CASシステム)もまた、スリック表現型を示すホモ接合またはヘテロ接合の畜牛を作製するために使用することができる。遺伝子操作された生物、特に哺乳動物を作製するためのCRISPR/CASシステムの使用の例は、Cong et al. (2013), Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems, Science, Vol. 339 no. 6121 pp. 819-823によって、および米国特許第8,795,965号において提供される。
ホモ接合またはヘテロ接合のウシ科動物および他の動物を生成する追加の技術は、当業者に周知であり、そのような態様は本発明の範囲内である。
トランスジェニック動物を生成するための方法は、当業者に周知である。トランスジェニック遺伝子構築物を畜牛の生殖系列中に導入して、トランスジェニック畜牛を作製することができる。例えば、1コピーまたは数コピーの構築物を、標準的なトランスジェニック技術によって哺乳動物の胚のゲノム中に組み込んでもよい。
トランスジェニック畜牛は、切断型B. タウルスPRLRタンパク質をコードする導入遺伝子を畜牛の生殖系列中へ導入することによって、作製することができる。種々の発生段階の胚性標的細胞を、導入遺伝子を導入するために使用することができる。胚性標的細胞の発生の段階に応じて、異なる方法が使用される。使用される任意の動物の特定の系列は、全身の良好な健康、良好な胚生産量、胚における良好な前核可視性、および良好な生殖適合性について選択される。
導入遺伝子の胚中への導入は、当技術分野において公知の任意の手段、例えば、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、またはリポフェクションによって達成することができる。例えば、しかし限定としてではなく、切断型PRLRタンパク質の導入遺伝子を、畜牛受精卵の前核中への構築物のマイクロインジェクションによって動物中に導入することができ、1コピーまたは複数コピーの構築物を発達中の畜牛の細胞に保持させる。導入遺伝子構築物の受精卵中への導入後に、卵を、様々な量の時間にわたってインビトロでインキュベートしてもよいか、または代理宿主中に再移植してもよいか、または両方でもよい。成熟までのインビトロインキュベーションが含まれる。一般的な方法は、約1〜7日間インビトロで胚をインキュベートして、それらを代理宿主中に再移植することである。
遺伝子導入により操作した胚の子孫を、切断型PRLRポリヌクレオチドの存在を特定するために設計された種々の方法により、構築物の存在について試験することができる。1コピーまたは複数コピーの外因性クローン化構築物が、そのようなトランスジェニック胚のゲノム中に安定に組み込まれたままである場合には、遺伝子導入により付加された構築物を保有する永久的なトランスジェニック系列を確立することが可能である。
遺伝子導入により変更した動物の同腹子を、子のゲノム中への構築物の組み込みについて誕生後にアッセイすることができる。好ましくは、このアッセイは、所望の切断型PRLRタンパク質をコードするDNA配列に対応するプローブを、子孫由来の染色体材料上にハイブリダイズさせることによって達成される。そのゲノム中に少なくとも1コピーの構築物を含有することが見出された子孫を、成熟まで成長させる。
本明細書において使用される接合子という用語は、完全な生物に発達する能力を有する二倍体細胞を指す。概して、接合子は、天然または人工的のいずれかで、1つまたは複数の配偶子由来の2つの一倍体核の融合によって形成される核を含有する卵から構成されることになる。したがって、配偶子の核は、天然に適合性であるもの、すなわち、分化を経験し、機能する生物に発達する能力を有する生存可能な接合子をもたらすものでなければならない。概して、正倍数性接合子が好ましい。異数性接合子が得られる場合、染色体の数が、いずれかの配偶子が由来する生物の正倍数体の数に対して2つ以上変動しているべきではない。
接合子に付加される導入遺伝子構築物のコピー数は、付加される外因性遺伝物質の総量に依存し、遺伝的形質転換が起きることを可能にする量であることになる。理論的には、1コピーのみが必要とされるが;しかし、概して、多数のコピーが利用され、例えば、1コピーが機能的であることを確実にするために1,000〜20,000コピーの導入遺伝子構築物が生成される。外因性DNA配列の表現型発現を増強するために、挿入された外因性DNA配列の各々の2つ以上の機能性コピーを有することには、利点がある場合が多い。
外因性遺伝物質の核遺伝物質への付加を可能にする任意の技術を、それが細胞、核膜、または他の存在する細胞構造もしくは遺伝構造に対して破壊性でない限り、利用することができる。外因性遺伝物質は、マイクロインジェクションによって核遺伝物質中に優先的に挿入される。細胞および細胞構造のマイクロインジェクションは、当技術分野において公知でありかつ使用される。
再移植は標準的な方法を用いて達成される。通常、代理宿主に麻酔をかけ、胚を卵管中に挿入する。
代理宿主のトランスジェニックの子は、任意の適している方法によって、導入遺伝子の存在および/または発現についてスクリーニングされ得る。スクリーニングは、導入遺伝子の少なくとも一部分に相補的であるプローブを使用し、サザンブロットまたはノーザンブロット解析によって達成することができる。典型的には、DNAを組織から調製し、導入遺伝子についてのサザン解析またはPCRによって解析する。あるいは、任意の組織または細胞タイプが、この解析のために使用され得るが、最高レベルで導入遺伝子を発現することが確信されている組織または細胞を、切断型B. タウルスPRLRタンパク質の存在および/または発現について試験する。
トランスジェニック動物の子孫は、トランスジェニック動物を適しているパートナーと交配することによって、または、トランスジェニック動物から取得した卵および/または精子のインビトロ受精によって取得され得る。パートナーとの交配を行うべき場合には、パートナーは、トランスジェニックおよび/またはノックアウトであってもまたはそうでなくてもよい。トランスジェニックである場合には、同じ導入遺伝子または異なる導入遺伝子、または両方を含有してもよい。あるいは、パートナーは親系列であってもよい。インビトロ受精を使用する場合には、受精胚を、代理宿主中に移植しても、もしくはインビトロでインキュベートしてもよいか、または両方でもよい。これらの方法を使用し、子孫を、適切な方法を用いて導入遺伝子の存在について評定してもよい。
本説明によって作製されるトランスジェニック動物は、外因性遺伝物質を含むことになる。上記に示すように、外因性遺伝物質は、ある特定の態様において、切断型PRLRタンパク質の産生をもたらすDNA配列となる。さらに、そのような態様において、配列は、特異的な細胞のタイプにおける導入遺伝子産物の発現を好ましくは可能にする転写制御エレメント、例えば、プロモーターに付着されることになり、これにより、組織特異的様式で切断型PRLRタンパク質を発現するトランスジェニック動物が作製される。
未分化胚芽細胞は、畜牛(および他の動物)中への導入遺伝子の導入のために第2のタイプの標的細胞を提案する。発達中のトランスジェニック畜牛である畜牛胚をインビトロで胚盤胞段階まで培養する場合には、それをレトロウイルス感染の標的にすることができる。卵割球の効率的な感染は、透明帯を除去するための酵素処理によって得られる(Manipulating the Mouse Embryo, Hogan eds. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1986))。導入遺伝子を導入するために使用されるウイルスベクターシステムは、典型的に、導入遺伝子を保有する複製欠損レトロウイルスである。トランスフェクションは、単層のウイルス産生細胞上で卵割球を培養することによって、容易にかつ効率的に得られる。
あるいは、感染をより遅い段階に行うことができる。ウイルスまたはウイルス産生細胞を、割腔中に注入することができる。組み込みは、トランスジェニック畜牛を形成した細胞のサブセットにおいてのみ起こるため、初代の大部分は、導入遺伝子についてモザイク状となる。さらに、初代は、ゲノム中の様々な位置に、導入遺伝子の種々のレトロウイルス挿入を含有する可能性があり、これは概して、子において分離することになる。加えて、妊娠中期胚の子宮内レトロウイルス感染によって、導入遺伝子を生殖系列中に導入することもまた可能である。
導入遺伝子の導入のための第3のタイプの標的細胞は、胚性幹細胞(ES)である。ES細胞を、インビトロで培養した着床前の胚から取得し、胚と融合させる。導入遺伝子は、DNAトランスフェクションによって、またはレトロウイルス媒介形質導入によって、ES細胞中に効率的に導入することができる。そのように形質転換したES細胞を、その後、畜牛由来の胚盤胞と合わせることができる。ES細胞は、その後、胚にコロニー形成し、結果として生じるキメラ動物の生殖系列に寄与する。
トランスジェニックウシ科動物および他の動物もまた提供され、トランスジェニック動物はスリック表現型を特徴とする。遺伝子に対する変更は、切断型PRLRタンパク質の産生をもたらす欠失、変異、もしくは切断;または、切断型PRLRポリヌクレオチドを有するものなどの外因性遺伝子の導入;または前述の組み合わせを含むことができる。
本発明のさらなる態様は、特定の動物が、切断型PRLRタンパク質をコードする変異体PRLR遺伝子を保有するかどうかを特定する方法を提供する。PRLR変異の存在および変異体PRLR遺伝子のコピー数を特定するための試験はまた、遺伝子操作された畜牛(および他の動物)を作製する方法において移入されるべき胚の選択を改善することもできる。
PRLR切断変異体を特定するために使用することができる非限定的な分子生物学技術の例は、以下を含む。
(A)DNAまたはRNAからの変異特異的PCR。DNAまたはRNA(cDNAに変換)を、試験されるべき動物から単離することができる。変異体対立遺伝子または正常対立遺伝子に特異的なプライマーを、変異が存在するかどうかをPCRが示すように設計することができる。本明細書において提供されるヌクレオチド配列に基づいて、当業者は、DNAまたはRNAからの変異特異的PCRに適切なプライマーを設計することができ、そのような態様は本発明の範囲内である。
(B)制限部位。変異A461VfsX1は、ゲノムDNA中に新たな回文構造配列、すなわちACATGTを創出する。この回文構造配列は、天然の/変異していないゲノム中には存在しない。変異部位にわたるゲノムDNAの領域を増幅するプライマーで産生されたPCR産物は、この配列に特異的な制限酵素(例えば、制限エンドヌクレアーゼPciI)で切ることができる。回文構造配列TGTACAに作用するエンドヌクレアーゼによって切ることができることにより、変異の存在が示される。
(C)直接シーケンシング。変異の領域を、mRNA(任意でcDNAに変換することができる)またはゲノムDNAからPCR増幅することができる。PCR産物をシーケンシングして、PRLR変異体遺伝子の存在を特定することができる。本明細書において提供されるヌクレオチド配列に基づいて、当業者は、DNAまたはRNAをシーケンシングする適切なプライマーを設計することができ、そのような態様は本発明の範囲内である。
(D)一本鎖高次構造多型(SSCP)およびヘテロ二重鎖解析試験を、DNA中の点変異を特定するために設計することができる。
(E)PRLRタンパク質のカルボキシ末端に特異的な抗体を用いたウェスタンブロット。完全長PRLRタンパク質に対応するウェスタンブロット上のバンドがないことにより、変異の存在および切断型PRLRタンパク質の発現が示される。
(A)DNAまたはRNAからの変異特異的PCR。DNAまたはRNA(cDNAに変換)を、試験されるべき動物から単離することができる。変異体対立遺伝子または正常対立遺伝子に特異的なプライマーを、変異が存在するかどうかをPCRが示すように設計することができる。本明細書において提供されるヌクレオチド配列に基づいて、当業者は、DNAまたはRNAからの変異特異的PCRに適切なプライマーを設計することができ、そのような態様は本発明の範囲内である。
(B)制限部位。変異A461VfsX1は、ゲノムDNA中に新たな回文構造配列、すなわちACATGTを創出する。この回文構造配列は、天然の/変異していないゲノム中には存在しない。変異部位にわたるゲノムDNAの領域を増幅するプライマーで産生されたPCR産物は、この配列に特異的な制限酵素(例えば、制限エンドヌクレアーゼPciI)で切ることができる。回文構造配列TGTACAに作用するエンドヌクレアーゼによって切ることができることにより、変異の存在が示される。
(C)直接シーケンシング。変異の領域を、mRNA(任意でcDNAに変換することができる)またはゲノムDNAからPCR増幅することができる。PCR産物をシーケンシングして、PRLR変異体遺伝子の存在を特定することができる。本明細書において提供されるヌクレオチド配列に基づいて、当業者は、DNAまたはRNAをシーケンシングする適切なプライマーを設計することができ、そのような態様は本発明の範囲内である。
(D)一本鎖高次構造多型(SSCP)およびヘテロ二重鎖解析試験を、DNA中の点変異を特定するために設計することができる。
(E)PRLRタンパク質のカルボキシ末端に特異的な抗体を用いたウェスタンブロット。完全長PRLRタンパク質に対応するウェスタンブロット上のバンドがないことにより、変異の存在および切断型PRLRタンパク質の発現が示される。
本発明はまた、切断型B. タウルスPRLRタンパク質を発現する畜牛における変異体の検出のために使用することができる抗体も提供する。これらの抗体は、完全PRLRタンパク質のC末端領域に位置するC末端アミノ領域またはエピトープに対するものである。したがって、本発明は、SEQ ID NO: 11の配列からなるポリペプチドまたはその断片を提供する。これらのポリペプチドは、切断型B. タウルスPRLRタンパク質を発現する畜牛において変異体を検出するのに使用され得る抗体を生じさせるために、使用することができる。
本明細書において言及または引用されるすべての特許、特許出願、仮出願、および刊行物は、それらが本明細書の明確な教示と矛盾しない程度まで、すべての図面および表を含み、その全体が参照により組み入れられる。
本明細書に記載される実施例および態様は、例証目的にすぎないこと、および、それらに照らした種々の改変または変更が当業者に示唆されかつ本出願の精神および範囲ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれるべきであることが、理解されるべきである。加えて、本明細書において開示される任意の発明またはその態様の任意の要素または限界を、本明細書に開示される任意のおよび/またはすべての他の要素もしくは限界(個々にまたは任意の組み合わせで)または任意の他の発明もしくはその態様と組み合わせることができ、すべてのそのような組み合わせは、それらに限定されることなく本発明の範囲で企図される。
Claims (18)
- 短毛の表現型を有する非ヒト哺乳動物を作製する方法であって、該哺乳動物が、完全長PRLRタンパク質のC末端部分を欠如する切断型PRLRタンパク質を発現し、該切断型PRLRタンパク質が、短毛の表現型を生じさせかつ該非ヒト哺乳動物に乳腺刺激機能を提供し、該方法が、
(a)非ヒト哺乳動物へと発達する能力を有する細胞を取得する工程、および
(b)該切断型PRLRタンパク質をコードするポリヌクレオチドを該細胞中に導入するか、または、該切断型PRLRタンパク質をコードするポリヌクレオチドをゲノムDNAが含むように該細胞のゲノムDNAを操作する工程、および
(c)該細胞から該非ヒト哺乳動物を作製する工程
を含む、方法。 - 前記非ヒト哺乳動物へと発達する能力を有する前記細胞が全能細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記全能細胞が、幹細胞、胚性幹細胞、受精卵母細胞、接合子から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記非ヒト哺乳動物が、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ネコ、マウス、ラット、イヌ、類人猿、チンパンジー、またはオランウータンである、請求項1に記載の方法。
- 前記非ヒト哺乳動物がウシである、請求項6に記載の方法。
- 短毛の表現型を有する非ヒト哺乳動物を作製する方法であって、該哺乳動物が、SEQ ID NO: 7に示す配列のアミノ酸1〜390を含む切断型PRLRタンパク質またはそのバリアントを発現し、かつSEQ ID NO: 7に示す配列のアミノ酸391〜581のすべてを含有せず、該方法が、
(a)非ヒト哺乳動物へと発達する能力を有する細胞を取得する工程、および
(b)該切断型PRLRタンパク質をコードするポリヌクレオチドを該細胞中に導入するか、または、該切断型PRLRタンパク質をコードするポリヌクレオチドをゲノムDNAが含むように該細胞のゲノムDNAを操作する工程、および
(c)該細胞から該非ヒト哺乳動物を作製する工程
を含む、方法。 - 前記切断型PRLRタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、SEQ ID NO: 3の配列、またはSEQ ID NO: 3の配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有するその相同体を含み、かつ、該ポリヌクレオチドが、SEQ ID NO: 6のヌクレオチド配列もしくは断片を含有しないか、またはSEQ ID NO: 3のポリヌクレオチドのタンパク質読み枠においてSEQ ID NO: 6のヌクレオチド配列もしくは断片を含有しない、請求項6に記載の方法。
- 前記非ヒト哺乳動物がウシである、請求項6に記載の方法。
- SEQ ID NO: 3の配列、または少なくとも90%の配列同一性を有するその相同体を含み、ポリヌクレオチドのタンパク質読み枠においてSEQ ID NO: 6のヌクレオチド配列またはその断片を含有しない、該ポリヌクレオチド。
- 請求項9に記載のポリヌクレオチドによってコードされる、タンパク質。
- SEQ ID NO: 8の配列を含む、請求項10に記載のタンパク質。
- 請求項9に記載のポリヌクレオチドを含む、トランスフェクションベクター、発現ベクター、または宿主細胞。
- ゲノムDNA中に挿入された請求項9に記載のポリヌクレオチドの1コピーまたは複数コピーを含み、短毛の被毛の表現型を示す、遺伝子操作された動物。
- PRLR遺伝子の1コピー中または両方のコピー中に1つまたは複数の変異を保有し、該変異が、請求項10に記載のタンパク質の発現、および短毛の被毛の表現型をもたらす、遺伝子操作された動物。
- ウシ科動物、ブタ、ウマ、ヤギ、ネコ、マウス、ラット、イヌ、類人猿、チンパンジー、およびオランウータンからなる群より選択される、請求項13に記載の遺伝子操作された動物。
- 畜牛である、請求項13に記載の遺伝子操作された動物。
- ウシ科動物、ブタ、ウマ、ヤギ、ネコ、マウス、ラット、イヌ、類人猿、チンパンジー、およびオランウータンからなる群より選択される、請求項14に記載の遺伝子操作された動物。
- 畜牛である、請求項14に記載の遺伝子操作された動物。
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