CN109207387A - 用于产生胶原的酵母菌株和方法 - Google Patents
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Abstract
本文描述了遗传改造以产生增加量的非羟基化胶原或羟基化胶原的酵母菌株。还描述了包括产生胶原所必需的DNA、启动子和羟基化酶的全合一载体。还提供了产生非羟基化或羟基化胶原的方法。
Description
相关申请案
本申请涉及2017年6月29日提交的美国专利申请案号62/526,912，其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及遗传改造的酵母菌株及产生胶原的方法。改造菌株以增加所产生胶原的量并提高所产生胶原的稳定性。胶原可用于产生生物制作的皮革材料等。
发明背景
皮革.皮革用于广泛的应用，包括家具室内装饰、服装、鞋子、行李、手提包和配饰以及汽车应用。皮革的全球贸易估计值每年约为1000亿美元(Future Trends in theWorld Leather Products Industry and Trade,United Nations IndustrialDevelopment Organization,Vienna,2010)，并且对皮革产品的需求持续增长。鉴于生产皮革的经济、环境和社会成本，需要满足这种需求的新方法。为跟上技术和美学趋势，皮革产品的生产者和使用者寻求展现出优越的强度、均匀性、加工性以及纳入天然组分的时尚和吸引人的美学性质的新材料。
考虑到人口增长和全球环境，将需要具有皮革般美学和改进功能的替代材料。皮革是动物皮，并且几乎完全由胶原组成。需要一种可以转化为生物制作的皮革材料的胶原来源。
胶原.胶原是皮革的主要组分。皮肤或动物皮含有大量的胶原，即一种纤维蛋白。胶原是至少28种不同胶原类型的家族的通称；动物皮肤通常是I型胶原，但其他类型的胶原可用于形成包括III型胶原的皮革。
胶原由氨基酸的重复三联体-(Gly-X-Y)n-表征，并且胶原中大约三分之一的氨基酸残基为甘氨酸。X通常是脯氨酸，并且Y通常是羟基脯氨酸，但可能有多达400个可能的Gly-X-Y三联体。不同的动物可能会产生不同的胶原氨基酸组成，这可能导致不同的性质和所产生皮革的差异。
胶原的结构可以由三条不同长度的交织的肽链组成。胶原三螺旋(或单体)可能由约1,050个氨基酸长的α链产生，因此三螺旋呈约300nm长、直径大约为1.5nm的棒形式。
根据动物皮的类型，胶原纤维可能具有一系列的直径。除了I型胶原之外，皮肤(皮)可能还包括其他类型的胶原，包括III型胶原(网硬蛋白)、IV型胶原和VII型胶原。
哺乳动物体内存在各种类型的胶原。举例来说，除了皮肤和动物皮的主要组分之外，I型胶原还存在于软骨、腱、血管结扎、器官、肌肉和骨骼的有机部分中。还成功地将胶原从除了动物皮肤或皮之外的哺乳动物身体的各个区域分离出来。数十年前，研究人员发现，在中性pH条件下，酸性增溶胶原自组装成原纤维，其由在天然组织中观察到的相同横纹纹理组成；Schmitt F.O.J.Cell.Comp Physiol.1942；20:11)。这导致胶原用于组织改造和各种生物医学应用中。最近几年，已使用重组技术从细菌和酵母中收获胶原。
无论胶原的类型如何，其都是通过物理和化学相互作用的组合形成和稳定的，包括静电相互作用，包括盐桥、氢键结、范德华相互作用、偶极-偶极力、极化力、疏水相互作用和通常由酶促反应催化的共价键结。对于I型胶原原纤维、纤维和纤维束，在研发过程中实现了活体内其复杂组装，并且在为组织提供机械支撑、同时允许细胞运动和营养输送方面至关重要。已在脊椎动物中鉴别出了各种不同的胶原类型。这些胶原包括牛、绵羊、猪、鸡和人类胶原。
通常，胶原类型用罗马数字编号，并且每种胶原类型中发现的链由阿拉伯数字鉴别。本领域中可获得各种不同类型的天然胶原的结构和生物功能的详细描述；参见(例如)Ayad等(1998)The Extracellular Matrix Facts Book,Academic Press,San Diego,CA；Burgeson,R E.和Nimmi(1992)"Collagen types:Molecular Structure and TissueDistribution"in Clin.Orthop.282:250-272；Kielty,C.M.等(1993)"The CollagenFamily:Structure,Assembly And Organization In The Extracellular Matrix,"Connective Tissue And Its Heritable Disorders,Molecular Genetics,And MedicalAspects,Royce,P.M.和B.Steinmann编辑，Wiley-Liss，NY，第103-147页；以及Prockop,D.J-和K.I.Kivirikko(1995)"Collagens:Molecular Biology,Diseases,and Potentialsfor Therapy,"Annu.Rev.Biochem.,64:403-434。)
I型胶原是骨和皮肤的主要原纤维胶原，占生物体总胶原的大约80-90％。I型胶原是多细胞性生物体细胞外基质中存在的主要结构性大分子，并且占总蛋白质量的大约20％。I型胶原是包含两条α1(I)链和一条α2(I)链(其分别由COL1A1和COL1A2基因编码)的异源三聚体分子。其他胶原类型不如I型胶原丰富，并展现不同的分布型式。举例来说，II型胶原是软骨和玻璃体液中的主要胶原，而发现III型胶原在血管中含量较高，在皮肤中含量较低。
II型胶原是包含三条由COL2A1基因编码的相同al(II)链的同源三聚体胶原。纯化II型胶原可以通过本领域已知的方法、例如通过Miller和Rhodes(1982)Methods InEnzymology 82:33-64中描述的程序从组织制备。
III型胶原是在皮肤和血管组织中发现的主要原纤维胶原。III型胶原是包含由三条由COL3A1基因编码的相同α1(III)链的同源三聚体胶原。从组织中纯化III型胶原的方法可见于例如Byers等，(1974)Biochemistry 13:5243-5248；以及Miller和Rhodes，上文文献。
IV型胶原以片而非原纤维形式存在于基膜中。最通常地，IV型胶原含有两条α1(IV)链和一条α2(IV)链。包含特定链的IV型胶原具有组织特异性。IV型胶原可以使用(例如)以下中描述的程序来纯化：Furuto和Miller(1987)Methods in Enzymology,144:41-61,Academic Press。
V型胶原是主要发现于骨骼、腱、角膜、皮肤和血管中的原纤维胶原。V型胶原以同源三聚体和异源三聚体形式存在。V胶原的一种形式是两条α1(V)链和一条α2(V)链的异源三聚体。V型原型的另一形式是α1(V)、α2(V)和α3(V)链的异源三聚体。V胶原的另一形式是α1(V)的同源三聚体。从天然来源分离V型胶原的方法可见于(例如)Elstow和Weiss(1983)Collagen Rel.Res.3:181-193，以及Abedin等(1982)Biosci.Rep.2:493-502。
VI型胶原具有小的三螺旋区域和两个大的非胶原剩余部分。VI型胶原是包含α1(VI)、α2(VI)和α3(VI)链的异源三聚体。VI型胶原可在许多结缔组织中发现。关于如何从天然来源纯化VI胶原的描述可见于(例如)Wu等(1987)Biochem.J.248:373-381，以及Kielty等(1991)J.Cell Sci.99:797-807。
VII型胶原是在特定上皮组织中发现的原纤维胶原。VII型胶原是三条α1(VII)链的同源三聚体分子。关于如何从组织中纯化VII型胶原的描述可见于(例如)Lunstrum等(1986)J.Biol.Chem.261:9042-9048，以及Bentz等(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:3168-3172。VIII型胶原可在角膜中的德斯密氏膜(Descemet’s membrane)中发现。VIII型胶原是包含两条α1(VIII)链和一条α2(VIII)链的异源三聚体，但已经报道了其他链组成。从自然界纯化VIII型胶原的方法可见于(例如)Benya和Padilla(1986)J.Biol.Chem.261:4160-4169，以及Kapoor等(1986)Biochemistry 25:3930-3937。
IX型胶原是在软骨和玻璃体液中发现的原纤维相关胶原。IX型胶原是包含α1(IX)、α2(IX)和α3(IX)链的异源三聚体分子。IX型胶原已被归类为FACIT(具有中断三螺旋的原纤维相关胶原)胶原，其拥有几个由非三螺旋结构域分开的三螺旋结构域。纯化IX型胶原的程序可见于(例如)Duance等(1984)Biochem.J.221:885-889；Ayad等(1989)Biochem.J.262:753-761；以及Grant等(1988)The Control of Tissue Damage,Glauert,A.M.编辑，Elsevier Science Publishers,Amsterdam，第3-28页。
X型胶原是α1(X)链的同源三聚体化合物。X型胶原已从(例如)在生长板中发现的肥大软骨中分离出来；参见(例如)Apte等(1992)Eur J Biochem 206(1):217-24。
XI型胶原可在与II型和IX型胶原相关的软骨组织以及身体其他位置中发现。XI型胶原是包含α1(XI)、α2(XI)和α3(XI)链的异源三聚体分子。纯化XI型胶原的方法可见于(例如)Grant等，上文文献。
XII型胶原是发现主要与I型胶原结合的FACIT胶原。XII型胶原是包含三条α1(XII)链的同源三聚体分子。纯化XII型胶原和其变体的方法可见于(例如)Dublet等(1989)J.Biol.Chem.264:13150-13156；Lunstrum等(1992)J.Biol.Chem.267:20087-20092；以及Watt等(1992)J.Biol.Chem.267:20093-20099。
XIII型是在(例如)皮肤、肠、骨、软骨和横纹肌中发现的非原纤维胶原。XIII型胶原的详细描述可见于(例如)Juvonen等(1992)J.Biol.Chem.267:24700-24707。
XIV型是特征为包含α1(XIV)链的同源三聚体分子的FACIT胶原。分离XIV型胶原的方法可见于(例如)Aubert-Foucher等(1992)J.Biol.Chem.267:15759-15764，以及Watt等，上文文献。
XV型胶原在结构上与XVIII型胶原同源。关于天然型XV胶原的结构和分离的信息可见于(例如)Myers等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10144-10148；Huebner等(1992)Genomics 14:220-224；Kivirikko等(1994)J.Biol.Chem.269:4773-4779；以及Muragaki,J.(1994)Biol.Chem.264:4042-4046。
XVI型胶原是在(例如)皮肤、肺纤维母细胞和角质细胞中发现的原纤维相关胶原。关于XVI型胶原的结构以及编码XVI型胶原的基因的信息可见于(例如)Pan等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:6565-6569；以及Yamaguchi等(1992)J.Biochem.112:856-863。
XVII型胶原是半桥粒跨膜胶原，也称为大疱性类天疱疮抗原。关于XVII型胶原的结构和编码XVII型胶原的基因的信息可见于(例如)Li等(1993)J.Biol.Chem.268(12):8825-8834；以及McGrath等(1995)Nat.Genet.11(1):83-86。
XVIII型胶原在结构上与XV型胶原类似，并且可以从肝中分离出来。XVIII型胶原的结构以及从天然来源分离的描述可见于(例如)Rehn和Pihlajaniemi(1994)Proc.Natl.Acad.Sci USA 91:4234-4238；Oh等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci USA 91:4229-4233；Rehn等(1994)J.Biol.Chem.269:13924-13935；以及Oh等(1994)Genomics 19:494-499。
XIX型胶原被认为是FACIT胶原家族的另一成员，并且已在从横纹肌肉瘤细胞分离的mRNA中发现。XIX型胶原的结构和分离的描述可见于(例如)Inoguchi等(1995)J.Biochem.117:137-146；Yoshioka等(1992)Genomics 13:884-886；以及Myers等，J.Biol.Chem.289:18549-18557(1994)。
XX型胶原是FACIT胶原家族新近发现的成员，并已在小鸡角膜中鉴别出来。(例如，参见Gordon等(1999)FASEB Journal 13:A1119；以及Gordon等(1998),IOVS 39:S1128。)
可使用任何类型的胶原，截短的胶原，未改性的或转译后改性的或氨基酸序列修改的胶原，来产生生物制作的材料或生物制作的皮革，所述胶原可通过本文所述的方法原纤维化和交联。生物制作的皮革可以含有基本均匀的胶原，例如仅I型或III型胶原，或可含有2、3、4或更多种不同种胶原的混合物。
重组胶原.
胶原和胶原样蛋白的重组表达由以下已知：Bell,EP 1232182B1,Bovinecollagen and method for producing recombinant gelatin；Olsen等，美国专利号6,428,978，Methods for the production of gelatin and full-length triple helicalcollagen in recombinant cells；VanHeerde等，美国专利号8,188,230，Method forrecombinant microorganism expression and isolation of collagen-likepolypeptides，其公开案是通过引用并入本文中。这种重组胶原尚未用于生产皮革。
原核表达.在原核系统(例如细菌系统)中，可以根据表达多肽的预期用途有利地选择许多表达载体。举例来说，当待产生大量的本发明动物胶原和明胶(例如生成抗体)时，引导高含量的容易纯化的融合蛋白产品表达的载体是所需的。这种载体包括(但不限于)大肠杆菌(E.coli)表达载体pUR278(Ruther等(1983)EMBO J.2:1791)，其中编码序列可以与lac Z编码区同框地连接到载体中，使得产生杂合AS-lacZ蛋白；pIN载体(Inouye等(1985)Nucleic Acids Res.13:3101-3109以及Van Heeke等(1989)J.Biol.Chem.264:5503-5509)；等，其公开内容通过引用并入本文中。pGEX载体也可用于用谷胱甘肽S-转移酶(GST)将外源多肽表达为融合蛋白。一般来说，这种融合蛋白是可溶的，并且可易于通过吸附到谷胱甘肽-琼脂糖珠粒、然后在游离谷胱甘肽存在下洗脱而从裂解的细胞中纯化。pGEX载体被设计为包括凝血酶或因子Xa蛋白酶裂解位点，以便可以从GST部分释放感兴趣的克隆多肽。重组胶原可包含尚未进行转译后修饰、例如未糖基化或羟基化的胶原分子，或可包括一个或多个转译后修饰，例如促进胶原分子的未成束和随机取向的原纤维的原纤维化和形成的修饰。
重组胶原分子可包含可以形成三聚体胶原原纤维的天然胶原分子或改性的胶原分子或截短的胶原分子的氨基酸序列的片段，所述改性的胶原分子或截短的胶原分子具有与天然胶原氨基酸序列(或与其原纤维形成区或与基本上包含[Gly-X-Y]n)的区段，例如由SEQ ID NO:1、2或3以及由以下登录号描述的Col1A1、Col1A2和Col3A1的氨基酸序列描述的牛胶原的那些：NP_001029211.1(https://_www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/77404252，最后登录2017年2月9日)、NP_776945.1(https://_www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/27806257，最后登录2017年2月9日)和NP_001070299.1(https://_www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/116003881，最后登录2017年2月9日)，其以引用并入)至少70、80、90、95、96、97、98或99％相同的氨基酸序列。(这些链接通过在双斜杠后包括下划线而禁用。)
所述重组或改性的胶原分子通常将包含本文所述的重复-(Gly-X-Y)n-序列。
BLASTN可用于鉴别与参考聚核苷酸具有至少70％、75％、80％、85％、87.5％、90％、92.5％、95％、97.5％、98％或99％序列同一性的聚核苷酸序列，例如编码胶原多肽或编码SEQ ID NO:1、2或3的氨基酸序列的聚核苷酸。优化以发现高度相似序列的代表性BLASTN设置使用10的预期阈值和28的字号，在0的查询范围内的最大匹配，1/-2的匹配/失配评分以及线性间隙成本。低复杂度区域可能被过滤或掩蔽。标准核苷酸BLAST的默认设置通过参考以下描述并并入：https://_blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM＝blastn&PAGE_TYPE＝BlastSearch&LINK_LOC＝blasthome(最后登录2017年1月27日)。
BLASTP可用于使用相似性矩阵(例如BLOSUM45、BLOSUM62或BLOSUM80，其中BLOSUM45可用于密切相关的序列，BLOSUM62用于中间范围序列，并且BLOSUM80用于更远缘的相关序列)鉴别与参考氨基酸(例如胶原氨基酸序列)具有至少70％、75％、80％、85％、87.5％、90％、92.5％、95％、97.5％、98％或99％序列同一性或相似性的氨基酸序列。除非另有说明，否则相似性评分将基于BLOSUM62的使用。当使用BLASTP时，相似性百分比是基于BLASTP正性评分，并且序列同一性百分比是基于BLASTP属性评分。BLASTP“属性”显示相同的高评分序列对中总残基的数量和分数；BLASTP“正分”显示对齐分数具有正值并且彼此相似的残基的数量和分数。本公开期望并涵盖与本文公开的氨基酸序列具有这些同一性或相似性程度或任何中等程度的同一性或相似性的氨基酸序列。代表性BLASTP设置使用10的预期阈值，3的字号，BLOSUM 62作为矩阵，以及11(存在)和1(扩展)的空位罚分以及条件组合评分矩阵调整。BLASTP的其他默认设置通过参考在以下获得的公开内容描述并且并入：https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM＝blastp&PAGE_TYPE＝BlastSearch&LINK_LOC＝blasthome(最后登录2017年1月27日)。
酵母表达.胶原分子可在酵母表达系统中产生。在酵母中，可以使用本领域已知的许多含有组成型或诱导型启动子的载体；Grant等，上文文献，第2卷，第13章；(1987)Expression and Secretion Vectors for Yeast,in Methods in Enzymology，Wu和Grossman编辑，Acad.Press,N.Y.153:516-544；Glover(1986)DNA Cloning，第II卷，IRLPress,Wash.,D.C.，第3章；Bitter(1987)Heterologous Gene Expression in Yeast,inMethods in Enzymology，Berger和Kimmel编辑，Acad.Press,N.Y.152:673-684；以及TheMolecular Biology of the Yeast Saccharomyces，Strathern等编辑，Cold SpringHarbor Press，第I和II卷(1982)，其公开内容通过引用并入本文中。
胶原可使用(例如)来自酵母啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的宿主细胞来表达。这种特定酵母可以与大量表达载体中的任一种一起使用。常用的表达载体是含有用于在酵母中繁殖的2P复制起点和用于大肠杆菌的Col E1起点用于高效转录外源基因的穿梭载体。这种基于2P质粒的载体的典型实例是pWYG4，其具有2P ORI-STB元件、GAL1-10启动子和2P D基因终止子。在这种载体中，使用Ncol克隆位点插入用于表达多肽的基因，并提供ATG起始密码子。另一表达载体是pWYG7L，其具有完整的2αORI、STB、REP1和REP2以及GAL1-10启动子，并使用FLP终止子。在这种载体中，编码聚核苷酸以其5'末端在BamHI或Ncol位点插入多连接体中。含有插入的聚核苷酸的载体在去除细胞壁后转化到啤酒酵母中以产生原生质体，所述原生质体在用钙和聚乙二醇处理时或通过用锂离子处理完整细胞吸收DNA。
或者，可以通过电穿孔引入DNA。可以使用(例如)亮氨酸、色胺酸、尿嘧啶或组氨酸营养缺陷型宿主酵母细胞以及可选标记物基因(例如LEU2、TRP1、URA3、HIS3或LEU2-D)来选择转化体。
在一个实施方案中，将编码胶原的聚核苷酸引入毕赤氏酵母的宿主细胞中。非糖酵母属酵母(例如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris))在放大程序中似乎具有产生高产率重组蛋白的特殊优点。另外，毕赤氏酵母属表达试剂盒可从Invitrogen公司(San Diego,CA)获得。
甲基营养型酵母(例如巴斯德毕赤酵母)中有许多甲醇应答基因，每个基因的表达受甲醇应答调节区域(还称为启动子)控制。所述甲醇应答启动子中的任一种都适用于本发明的实践。特定调节区域的实例包括AOX1启动子、AOX2启动子、二羟基丙酮合酶(DAS)、P40启动子和来自巴斯德毕赤酵母的过氧化氢酶基因的启动子等。
也已使用甲基营养型酵母多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)。甲醇上的生长了诱导甲醇代谢的关键酶，例如MOX(甲醇氧化酶)、DAS(二羟基丙酮合酶)和FMDH(甲酸脱氢酶)。这些酶可占总细胞蛋白的30-40％。编码MOX、DAS和FMDH产生的基因受强启动子控制，所述启动子由甲醇上的生长诱导并由葡萄糖上的生长抑制。这些启动子的任何或全部三个可用于获得多形汉逊酵母中异源基因的高水平表达。因此，在一方面中，在可诱导型多形汉逊酵母启动子的控制下，将编码动物胶原的聚核苷酸或其片段或变体克隆到表达载体中。如果需要分泌产物，则将编码在酵母中分泌的信号序列的聚核苷酸与所述聚核苷酸同框地融合。在又一实施方案中，表达载体优选含有营养缺陷型标记物基因，例如URA3或LEU2，其可用于补充营养缺陷型宿主的缺陷。
然后使用本领域技术人员已知的技术使用表达载体以转化多形汉逊酵母宿主细胞。多形汉逊酵母转化的一个有用特征是将表达载体的最多100个拷贝自发整合到基因组中。在大部分情形下，整合的聚核苷酸形成展现头对尾排列的多聚体。即使在非选择性条件下，整合的外源聚核苷酸在若干重组菌株中也显示有丝分裂稳定。这种高拷贝整合现象进一步增加了系统的高生产力潜力。
真菌表达.丝状真菌也被用于产生现在的多肽。丝状真菌中表达和/或分泌重组蛋白的载体是众所周知的，并且所属领域技术人员可以使用这些载体表达本发明的重组动物胶原。
植物表达.已经在植物或植物细胞中产生动物胶原。在使用植物表达载体的情形下，编码本发明胶原的序列的表达可以由许多启动子中的任一者驱动。举例来说，可以使用病毒启动子，例如CaMV的35S RNA和19S RNA启动子(Brisson等(1984)Nature 310:511-514)或TMV的外壳蛋白启动子(Takamatsu等(1987)EMBO J.6:307-311)；或者，可以使用植物启动子，例如RUBISCO的小的亚单位(Coruzzi等(1984)EMBO J.3:1671-1680；Broglie等(1984)Science 224:838-843)；或热休克启动子，例如大豆hsp17.5-E或hsp17.3-B(Gurley等(1986)Mol.Cell.Biol.6:559-565)。这些构造体可以通过本领域技术人员已知的多种方法、例如通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电穿孔等引入植物细胞中。关于这些技术的综述，参见(例如)Weissbach&Weissbach,Methods for PlantMolecular Biology,Academic Press,NY,Section VIII，第421-463页(1988)；Grierson和Corey,Plant Molecular Biology，第2版，Blackie,London，第7-9章(1988)；TransgenicPlants:A Production System for Industrial and Pharmaceutical Proteins,Owen和Pen编辑，John Wiliey&Sons,1996；Transgenic Plants,Galun和Breiman编辑，ImperialCollege Press,1997；以及Applied Plant Biotechnology,Chopra,Malik和Bhat编辑，Science Publishers公司，1999。
植物细胞不会自然产生足够量的转译后酶以有效产生稳定的胶原。因此，在需要羟基化的情况下，用于表达动物胶原的植物细胞补充有必需的转译后酶以充分产生稳定的胶原。在本发明的优选实施方案中，转译后酶是脯氨酰基4-羟化酶。
通过从植物或植物细胞中提供生质来实现在植物系统中产生动物胶原的方法，其中植物或植物细胞包含至少一个可操作地连接到启动子以实现多肽的表达的编码序列，并且然后从生质中提取多肽。或者，多肽可以是非提取的，例如，表达到胚乳中。
植物表达载体和报道基因在本领域中通常是已知的；参见(例如)Gruber等(1993)，Methods of Plant Molecular Biology and Biotechnology,CRC Press。通常，表达载体包含例如重组或合成生成的核酸构造体，并且包含在植物细胞中起作用的启动子，其中所述启动子可操作连接到编码动物胶原的核酸序列或其片段或变体，或对胶原的生物合成重要的转译后酶。
启动子驱动植物中蛋白质表达的水平。为了在植物中产生期望水平的蛋白质表达，表达可以在植物启动子的指导下进行。适于使用的启动子通常在本领域中可获得；参见(例如)PCT公开号WO 91/19806。可使用的启动子的实例包括非组成型启动子或组成型启动子。这些启动子包括(但不限于)核酮糖-1,5-双磷酸羧化酶的小亚单位的启动子；来自肿瘤诱导的根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的质粒的启动子，例如RUBISCO胆酯碱合酶(NOS)和章鱼碱合酶启动子；细菌T-DNA启动子，例如mas和ocs启动子；以及病毒启动子，例如花椰菜嵌纹病毒(CaMV)19S和35S启动子或玄参嵌纹病毒35S启动子。
聚核苷酸序列可以置于组成型启动子的转录控制下，从而引导植物的大部分组织中胶原或转译后酶的表达。聚核苷酸序列在花椰菜嵌纹病毒(CaMV)35S启动子的控制下。双链花椰菜花叶病毒科为植物中转基因表达提供了最重要的单一启动子表达，特别是35S启动子；参见(例如)Kay等(1987)Science 236:1299。来自这个家族的其他启动子(例如玄参嵌纹病毒启动子等)已经描述于本领域中，并且也可以被使用；参见(例如)Sanger等(1990)Plant Mol.Biol.14:433-443；Medberry等(1992)Plant Cell 4:195-192；以及Yin和Beachy(1995)Plant J.7:969-980。
聚核苷酸构造体中用于表达胶原的启动子，如果需要可以进行改性以影响其控制特征。举例来说，CaMV启动子可以接合到RUBISCO基因的一部分，以生成在叶中有活性而在根中无活性的启动子，所述基因在没有光照的情况下抑制RUBISCO的表达。如本文所述可以使用所得嵌合启动子。
具有本领域已知的一般表达性质的组成型植物启动子可以与本发明的表达载体一起使用。这些启动子在大部分植物组织中大量表达，并且包括(例如)肌动蛋白启动子和泛蛋白启动子；参见(例如)McElroy等(1990)Plant Cell 2:163-171；以及Christensen等(1992)Plant Mol.Biol.18:675-689。
或者，多肽可以在特定组织、细胞类型中或在更精确的环境条件或发育控制下表达。引导在这些情况下表达的启动子称为可诱导型启动子。在使用组织特异性启动子的情形下，蛋白质表达在需要提取蛋白质的组织中特别高。根据所需的组织，表达可以靶向胚乳、糊粉层、胚芽(或其作为盾片和子叶的部分)、果皮、茎、叶块茎、根等。已知组织特异性启动子的实例包括指向块茎的I类马铃薯块茎储藏蛋白(patatin)启动子、与马铃薯块茎ADPGPP基因相关的启动子、驱动指向种子的转录的β-伴大豆球蛋白(7S蛋白)的大豆启动以及来自玉蜀黍胚乳的玉米醇溶蛋白基因的指向种子的启动子；参见(例如)Bevan等(1986)Nucleic Acids Res.14:4625-38；Muller等(1990)Mol.Gen.Genet.224:136-46；Bray(1987)Planta 172:364-370；以及Pedersen等(1982)Cell 29:1015-26。
胶原多肽可以借助基于种子的产生技术在种子(例如芸苔、玉米、大豆、稻谷和大麦种子)中产生。在所述过程中，例如，在种子发芽期间回收产物；参见(例如)PCT公开号WO9940210；WO 9916890；WO 9907206；美国专利号5,866,121；美国专利号5,792,933；以及其中引用的所有参考文献。可用于引导多肽表达的启动子可以是异源的或非异源的。这些启动子也可以用于驱动反义核酸的表达以降低、增加或改变目前动物胶原在所需组织中的浓度和组成。
可增加和/或最大化植物或植物细胞中的转录多肽的其他修饰是标准的并且是本领域技术人员已知的。例如，包含编码重组动物胶原的聚核苷酸序列或其片段或变体并且可操作连接到启动子的载体可进一步包含至少一个改变胶原或相关转译后酶的转录速率的因子，包括但不限于肽输出信号序列、密码子使用、内含子、多聚腺苷酸化和转录终止位点。修饰构造体以增加植物中表达水平的方法在本领域中通常是已知的；参见(例如)Rogers等(1985)J.Biol.Chem.260:3731；以及Cornejo等(1993)Plant Mol Biol 23:567-58。在影响胶原和相关转译后酶的转录速率的对植物系统的工程改造中，本领域已知的各种因子(包括调节序列，例如正或负作用序列；增强子和沉默子，以及染色质结构)可影响植物中的转录速率。当表达重组动物胶原时，可以利用这些因子中的至少一种，包括(但不限于)上述胶原类型。
包含聚核苷酸的载体通常将包含赋予植物细胞可选表型的标记物基因。通常，可选标记物基因将编码抗生素抗性，其中合适的基因包括至少一组编码抗生素大观霉素(spectinomycin)抗性的基因、编码链霉素(streptomycin)抗性的链霉素磷酸转移酶(SPT)基因、编码康霉素(kanamycin)或建那霉素(geneticin)抗性的新霉素(neomycin)磷酸转移酶(NPTH)基因、编码用于抑制乙酰乳酸合酶(ALS)的作用的除草剂(特别是磺酰脲型除草剂)抗性的潮霉素(hygromycin)抗性基因；例如含有导致这种抗性的突变(特别是S4和/或Hra突变)的乙酰乳酸合酶(ALS)基因、编码用于抑制谷氨酰胺合酶的作用的除草剂例如草铵膦或草安宁(basta)抗性的基因；例如bar基因或本领域已知的其他类似基因。bar基因编码对除草剂草安宁的抗性，nptII基因编码对抗生素康霉素和建那霉素的抗性，并且ALS基因编码对除草剂氯磺隆的抗性。
用于在植物中表达外源基因的典型载体在本领域中是众所周知的，包括但不限于来源于肿瘤诱导(Ti)的根癌土壤杆菌的质粒的载体。这些载体是在转化时将一部分DNA整合到宿主植物的基因组中的植物整合载体；参见(例如)Rogers等(1987)Meth InEnzymol.153:253-277；Schardl等(1987)Gene 61:1-11；以及Berger等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86:8402-8406。
包含编码多肽的序列的载体和包含转译后酶或其亚单位的载体可共引入所需的植物中。转化植物细胞的程序可用于本领域中，例如，直接基因转移、活体外原生质体转化、植物病毒介导的转化、脂质体介导的转化、显微注射、电穿孔、土壤杆菌属介导的转化以及粒子轰击；参见(例如)Paszkowski等(1984)EMBO J.3:2717-2722；美国专利号4,684,611；欧洲申请号0 67 553；美国专利号4,407,956；美国专利号4,536,475；Crossway等(1986)Biotechniques 4:320-334；Riggs等(1986)Proc.Natl.Acad.Sci USA 83:5602-5606；Hinchee等(1988)Biotechnology 6:915-921；以及美国专利号4,945,050。)(例如)稻谷、小麦、玉米、高粱和大麦的标准转化方法描述于本领域中；参见(例如)Christou等(1992)Trends in Biotechnology 10:239和Lee等(1991)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 88:6389。小麦可通过与用于转化玉米或稻谷相似的技术进行转化。此外，Casas等(1993)Proc.Nat’lAcad.Sci.USA 90:11212描述转化高粱的方法，而Wan等(1994)Plant Physiol.104:37教导转化大麦的方法。适合于玉米转化的方法由Fromm等(1990)Bio/Technology 8:833以及Gordon-Kamm等(上文文献)提供。
本领域中确立可用于生成产生动物胶原的植物的其他方法；参见(例如)美国专利号5,959,091；美国专利号5,859,347；美国专利号5,763,241；美国专利号5,659,122；美国专利号5,593,874；美国专利号5,495,071；美国专利号5,424,412；美国专利号5,362,865；美国专利号5,229,112；美国专利号5,981,841；美国专利号5,959,179；美国专利号5,932,439；美国专利号5,869,720；美国专利号5,804,425；美国专利号5,763,245；美国专利号5,716,837；美国专利号5,689,052；美国专利号5,633,435；美国专利号5,631,152；美国专利号5,627,061；美国专利号5,602,321；美国专利号5,589,612；美国专利号5,510,253；美国专利号5,503,999；美国专利号5,378,619；美国专利号5,349,124；美国专利号5,304,730；美国专利号5,185,253；美国专利号4,970,168；欧洲公开号EPA 00709462；欧洲公开号EPA00578627；欧洲公开号EPA 00531273；欧洲公开号EPA 00426641；PCT公开号WO 99/31248；PCT公开号WO 98/58069；PCT公开号WO 98/45457；PCT公开号WO 98/31812；PCT公开号WO98/08962；PCT公开号WO 97/48814；PCT公开号WO 97/30582；以及PCT公开号WO 9717459。
昆虫表达.胶原的另一替代表达系统是昆虫系统。杆状病毒是昆虫细胞中大量产生各种重组蛋白的高效表达载体。可采用如Luckow等(1989)Virology 170:31-39以及Gruenwald,S.和Heitz,J.(1993)Baculovirus Expression Vector System:Procedures&Methods Manual,Pharmingen,San Diego,CA中所描述的方法来构造含有用于本发明胶原的胶原编码序列和适当的转录/转译控制信号的表达载体。举例来说，在昆虫细胞中通过感染编码多肽的杆状病毒载体实现蛋白质的重组产生。具有稳定三螺旋的重组胶原、胶原样或胶原多肽的产生可以涉及用三种杆状病毒共感染昆虫细胞，一种编码待表达的动物胶原并且一种各自编码脯氨酰基4-羟基酶的α亚单位和β亚单位。这种昆虫细胞系统允许大量产生重组蛋白。在一个所述系统中，加州苜蓿夜蛾(Autographa californica)核多角体病毒(AcNPV)用作载体以表达外源基因。这种病毒在草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞中生长。可将胶原或胶原样多肽的编码序列克隆到病毒的非必需区域(例如多面体基因)中并置于AcNPV启动子(例如多面体启动子)的控制下。编码序列的成功插入将导致多面体基因失活和产生非封闭型重组病毒；例如，缺乏由多面体基因编码的蛋白质外壳的病毒。然后使用这些重组病毒感染其中表达插入的基因的草地贪夜蛾细胞；参见(例如)Smith等(1983)J.Virol.46:584；以及美国专利号4,215,051。这种表达系统的实例可见于(例如)上述Ausubel等。
动物表达.在动物宿主细胞中，可以利用许多表达系统。在使用腺病毒作为表达载体的情形下，可将编码胶原或胶原样多肽的聚核苷酸序列接合到腺病毒转录/转译控制复合物，例如晚期启动子和三联前导序列。然后可通过活体外或活体内重组将这个嵌合基因插入腺病毒基因组中。插入病毒基因组的非必需区域(例如区域E1或E3)将产生活的并且能够在受感染的宿主中表达编码的多肽的重组病毒；参见(例如)Logan和Shenk，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:3655-3659(1984)。或者，可以使用牛痘7.5K启动子；参见(例如)Mackett等(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:7415-7419；Mackett等(1982)J.Virol.49:857-864；以及Panicali等(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:4927-4931。
哺乳动物宿主细胞中的优选表达系统是塞姆利基森林病毒(Semliki Forestvirus)。哺乳动物宿主细胞(例如，幼小仓鼠肾(BHK)细胞和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)的感染可以产生非常高的重组表达水平。塞姆利基森林病毒是一种优选的表达系统，这是因为所述病毒具有广泛的宿主范围，使得哺乳动物细胞系的感染成为可能。更特定来说，塞姆利基森林病毒可用于多种宿主，这是因为所述系统不基于染色体整合，并且因此在旨在鉴别结构功能关系并测试各种杂合分子的效应的研究中提供了更容易获得重组动物胶原的修饰的方法。用于构造塞姆利基森林病毒载体用于在哺乳动物宿主细胞中表达外源蛋白质的方法描述于(例如)Olkkonen等(1994)Methods Cell Biol 43:43-53中。
非人类转基因动物也可用于表达多肽。所述系统可以通过将本发明的聚核苷酸可操作地连接到启动子以及能够在乳腺中实现表达的其他所需或任选调节序列来构造。同样，所需或任选转译后酶可在采用合适的表达系统在靶细胞中同时产生。使用非人类转基因动物以重组产生蛋白质的方法为本领域已知；参见(例如)美国专利号4,736,866；美国专利号5,824,838；美国专利号5,487,992；以及美国专利号5,614,396。
描述重组胶原产生的以上章节中引用的参考文献均通过引用并入本文。尽管有现有技术的教导，但仍然需要具有增加的胶原产生和增加的胶原稳定性的酵母菌株。
发明概要
在其他实施方案中，本发明涉及遗传改造以产生非羟基化胶原的酵母菌株。在替代实施方案中，本发明提供用以产生羟基化胶原的改造的酵母菌株。在一个实施方案中，本发明提供包括产生胶原、启动子和/或羟基化酶所必需的DNA的全合一载体。还提供产生非羟基化或羟基化胶原的方法。
附图简述
图1显示了设计用于产生非羟基化胶原的MMV 63的矢量图。
图2显示了设计用于产生非羟基化胶原的MMV 77的矢量图。
图3显示了设计用于产生非羟基化胶原的MMV 129的矢量图。
图4显示了设计用于产生非羟基化胶原的MMV 130的矢量图。
图5显示了设计用于产生羟基化胶原的MMV 78的矢量图。
图6显示了设计用于产生羟基化胶原的MMV 94的矢量图。
图7显示了设计用于产生羟基化胶原的MMV 156的矢量图。
图8显示了设计用于产生羟基化胶原的MMV 191的矢量图。
图9显示了设计用于产生非羟基化或羟基化胶原的全合一载体MMV 208。
图10显示了MMV84的矢量图。
图11显示了MMV150的矢量图。
图12显示了MMV140的矢量图。
发明详述
本发明利用酵母来产生胶原。合适的酵母包括(但不限于)阿叙拉属(Arxula)、假丝酵母属(Candida)、驹形氏酵母属(Komagataella)、毕赤氏酵母属(Pichia)、汉逊酵母属(Hansenula)、欧伽铁酵母属(Ogataea)、糖酵母属(Saccharomyces)、隐球菌属(Cryptococcus)和其组合。可使酵母改性或杂交。杂交的酵母是相同属的相同种、不同种的不同菌株或不同属的菌株的混合育种。
外源DNA插入到酵母基因组中或维持游离型以产生胶原。通过载体将胶原的DNA序列引入酵母中。本领域已知，对DNA的修饰(例如密码子优化)可以提高酵母转译DNA的能力和效率。外源DNA是任何非酵母宿主DNA，并且包括(例如但不限于)哺乳动物、隐杆线虫和细菌。用于酵母中胶原产生的合适的哺乳动物DNA包括(但不限于)牛、猪、袋鼠、钝吻鳄、鳄鱼、大象、长颈鹿、斑马、骆马、羊驼、羔羊、恐龙和其组合。
DNA插在载体上，合适的载体包括(但不限于)pHTX1-BiDi-P4HA-Pre-P4HB hygro、pHTX1-BiDi-P4HA-PHO1-P4HB hygro、pGCW14-pGAP1-BiDi-P4HA-Prepro-P4HB G418、pGCW14-pGAP1-BiDi-P4HA-PHO1-P4HB Hygro、pDF-Col3A1优化的吉欧霉素(Zeocin)、pCAT-Col3A1优化的吉欧霉素、具有AOX1着陆垫的pDF-Col3A1优化的吉欧霉素、pHTX1-BiDi-P4HA-Pre-Pro-P4HB hygro。载体通常包括至少一个用于DNA线性化的限制位点。
本领域已知启动子可以改善蛋白质的产生。启动子是载体中包括的DNA序列。适用于本发明的启动子包括(但不限于)AOX1甲醇诱导的启动子、PDF脱阻抑启动子、PCAT脱阻抑启动子、Das1-Das2甲醇诱导的双向启动子、PHTX1组成型双向启动子、CHO组织蛋白启动子、PGCW14-PGAP1组成型双向启动子和其组合。
在纳入酵母中的载体中利用的每个开放阅读框的末尾都需要终止子。终止子的DNA序列插入到载体中。
复制起点是起始复制所必需的。复制起点的DNA序列插入载体中。可另外游离型地维持载体。
含有与酵母基因组同源性的DNA序列是必需的，并且纳入载体中。
选择标记物用于选择已成功转化的酵母细胞。标记物有时与抗生素抗性有关。标记物还可能与在具有或不具有某些氨基酸的情况下生长的能力有关(营养缺陷型标记物)。合适的营养缺陷型标记物包括(但不限于)ADE、HIS、URA、LEU、LYS、TRP和其组合。选择标记物的DNA序列纳入载体中。
在转化后修饰之前，胶原是非羟基化的并在高胃蛋白酶浓度存在下降解，例如1:200胃蛋白酶可用于使胶原的N-末端和C-末端前肽裂解以能够原纤维化，这使胶原转化成生物制作的材料。因此，提供羟基化胶原是有用的。为了能够产生羟基化胶原，可能需要至少一种第二蛋白质。这种第二蛋白质是称为脯氨酰基4-羟基亚单位α-1(下文称为“P4HA1”)和脯氨酰基4-羟基亚单位β(下文称为“P4HB”)的酶。可以将P4HA1和P4HB DNA插入载体上的酵母中以使胶原羟基化。羟基化胶原与非羟基化胶原相比具有更好的热稳定性，并且对高浓度胃蛋白酶消化(例如1:25到1:1的总蛋白与胃蛋白酶比率)具有抗性。
上述改造的酵母需要多个载体，并且将载体加载到细胞中的过程中的每个步骤可能非常耗时。多个载体也携带多个选择标记物，此使得在添加新DNA时难以重复使用标记物。惊奇地发现，“全合一载体”可以利用胶原的DNA和P4HA和P4HB的DNA结合在单一载体上构造而成。启动子和信号序列可以模块化地添加到指定的克隆位点。根据启动子的存在或不存在，可以将DNA插入酵母中用于羟基化或非羟基化胶原。全合一载体包括用于线性化以将DNA插入酵母中的位点，包括随机和定点整合到基因组中。
术语“胶原”是指任何一种已知的胶原类型，包括I至XX型胶原；以及任何其他胶原，无论是天然的、合成的、半合成的还是重组的。其包括本文所述的所有胶原、改性的胶原和胶原样蛋白。本术语还涵盖包含基序(Gly-X-Y)n的前胶原和胶原样蛋白或胶原蛋白质，其中n是整数。其涵盖胶原和胶原样蛋白的分子、胶原分子的三聚物、胶原的原纤维和胶原原纤维的纤维。它也指化学、酶学或重组改性的可原纤维的胶原或胶原样分子，以及能够组装成纳米纤维的胶原、胶原样分子和胶原分子的片段。
在一些实施方案中，胶原或胶原样蛋白中的氨基酸残基(例如赖氨酸和脯胺酸)可能未羟基化或可能具有比相应的天然或未改性的胶原或胶原样蛋白更低或更高程度的羟基化。在其他实施方案中，胶原或胶原样蛋白中的氨基酸残基可能未糖基化或可能具有比相应的天然或未改性的胶原或胶原样蛋白更低或更高程度的糖基化。
胶原组合物中的胶原可以均匀地含有单一类型的胶原分子，例如100％I型牛胶原或100％III型牛胶原，或可以含有不同种类的胶原分子或胶原样分子的混合物，例如牛I型和III型分子的混合物。所述混合物可包括>0％、10、20、30、40、50、60、70、80、90、95、99或<100％的各个胶原或胶原样蛋白组分。这个范围包括所有中间值。举例来说，胶原组合物可含有30％I型胶原和70％III型胶原，或可含有33.3％I型胶原、33.3％II型胶原和33.3％III型胶原，其中胶原的百分比是基于组合物中胶原的总质量或基于胶原分子的分子百分比。
上述改造的酵母细胞可用于产生胶原。为此，将细胞置于发酵室或桶内的培养基中，并供给溶解的氧和碳源，在受控的pH条件下持续12小时至1周范围的时间段。合适的培养基包括(但不限于)缓冲的甘油复合培养基(BMGY)、缓冲的甲醇复合培养基(BMMY)和酵母提取物蛋白胨右旋糖(YPD)。由于胶原在酵母细胞中产生的事实，为了分离胶原，必须使用酵母的分泌菌株或溶解酵母细胞以释放胶原。然后可以通过诸如离心、沉淀等已知技术纯化胶原。
本文公开的胶原使得可产生生物制作的皮革。将胶原转化成生物制作的皮革的方法教导于以下中：共同未决的专利申请案美国申请号15/433566、15/433650、15/433632、15/433693、15/433777、15/433675、15/433676和15/433877，其公开内容通过引用并入本文中。
本发明的实施方案
本发明包括(但不限于)遗传改造的酵母菌株以及产生胶原的方法。
在第一实施方案中，本发明涉及产生非羟基化胶原的酵母菌株，所述酵母菌株包括酵母宿主；靶蛋白的重组DNA；以及启动子。
在第二实施方案中，本发明涉及产生羟基化胶原的酵母菌株，所述酵母菌株包括酵母宿主；靶蛋白的重组DNA；第二靶蛋白的DNA；以及启动子。
在第三实施方案中，本发明涉及全合一载体，其包括靶蛋白的DNA；第二靶蛋白的DNA；以及至少一个启动子的DNA。实例：明胶，胶原I，并引入超过一个基因。
在第四实施方案中，本发明涉及制备胶原的方法。
在第五实施方案中，本发明涉及制备羟基化胶原的方法。
实施方案的详细描述
如本文所用术语DNA意指脱氧核糖核酸。
如本文所用术语效价意指所产生靶蛋白的量。
如本文所用术语生物制作的皮革意指使用生物学、工程学和设计产生具有皮革样性质的材料。
如本文所用术语全合一载体意指包括产生所需重组蛋白所必需的所有DNA的载体。
如本文所用术语稳定的胶原意指在暴露于高浓度胃蛋白酶后至少75％的胶原初始浓度仍存在。
以下非限制性实例用于说明本发明。本发明的范围不限于在这些实施例中描述的细节。
实施例1
打算产生重组胶原的酵母.
获得来自DNA 2.0的野生型巴斯德毕赤酵母。将包括胶原序列的MMV 63(序列9)DNA序列插入野生型巴斯德毕赤酵母中，其生成菌株PP28。将MMV63用Pme I消化并转化到PP1(野生型巴斯德毕赤酵母菌株)中以生成PP28。载体MMV63显示于图1中。
对天然牛胶原进行测序(序列1)并使用以下聚合酶链式反应“PCR”方案使所述序列扩增以生成线性DNA序列：
PfuUltra II融合HS DNA聚合酶方案
对于50ul反应：
*所属领域技术人员了解，可基于待扩增的DNA使用多种引物。
对<10kb DNA进行温度循环器方案：
95C达2min，30个循环的95C达20秒、[引物熔融温度-5C]达20秒
如果<1kb，则72C达15秒，否则15sec/kB，72C达3min，以及永远4C。
按照Gibson程序克隆线性DNA，如下：
对于2-3个片段，使用0.02-0.5pmol DNA。对于4-6个片段，使用0.2-1.0pmol DNA。
Pmol＝(以ng表示的重量)×1000/(碱基对×650道尔顿)
或使用NEBioCalculator
优化效率是50-100ng载体，具有2-3倍过量插入物(如果<200bp，则使用5倍过量)。PCR片段的总体积不应超过20％。
1.设置以下反应：
2.于50C下在温度循环器中孵育15min(2-3个片段)或60min(4-6个片段)。转化前存储在冰上或-20C下
3.用2ul组装反应物转化NEB 5-α细胞。
按照以下程序将克隆转化到大肠杆菌中：
-使50ul感受态细胞(通常5α)在冰上解冻
-添加2ul体积的10-100ng DNA
-在冰上静置5min
-于42C下热冲击10秒
-在冰上静置5min
-同时，准备管或板具有1ml超级最佳肉汤，所述肉汤具有分解代谢阻抑(“SOC”)液体培养基
-将感受态细胞转移到适当的管或孔板中
-在37C下振荡1小时以过度生长
-同时，标记板并放在37C孵育器中进行预热。
-以10,000g旋转30s以使细胞浓缩在底部
-去除并弃去800ul SOC。应具有约200ul剩余
-将全部200ul添加到室温琼脂板中。或者，将10％(20ul)添加到板1，并将90％(180ul)添加到板2。
-使用无菌玻璃珠铺在板上。
-在37C下孵育过夜
使转化的细胞生长到群落中，并根据以下程序进行大肠杆菌群落PCR：
GoTaq格林混合母液方案(Taq聚合酶)
对于20ul反应：
| 组分 | 体积 | 最终浓度 |
| GoTaq格林混合母液2x | 10ul | 1倍 |
| 引物1，5uM | 1ul | 0.1uM |
| 引物2，5uM | 1ul | 0.1uM |
| 群落 | 一牙签 | |
| 水 | 8ul |
温度循环器方案：
95C达2min
28个循环的
----------------
95C达30秒
[引物熔融温度-5C]达30秒
72C达1分钟/kB
----------------
72C达5min
永远4C
为了筛选群落用于转化的有效性，按照如下所述进行琼脂糖DNA凝胶程序：
为了准备x％琼脂糖凝胶(通常8-12％)：
1.测量Xg琼脂糖以达到所需的百分比。1g＝1ml。举例来说，为了制备1％凝胶，测量1g琼脂糖加入100ml Tris碱、乙酸和乙二胺四乙酸缓冲液(“TAE”)中
2.将琼脂糖添加到250ml烧瓶中
3.达到100ml TAE缓冲液，或所需的体积
4.微波处理直至液体澄清。对于100ml的1％，这需要约1分30秒。
5.将SYBR Safe DNA染料添加到1倍(其是10,000倍，所以添加总琼脂糖的体积(以ml表示)/10以得到总的ul添加量。举例来说，如果具有100ml琼脂糖，则添加10ul)
6.倒入模具中。请记住添加孔槽。
7.等待45min到1hr使凝胶干燥。
为了运行凝胶：
1.从干燥的凝胶上移除孔模具
2.移除凝胶+塑料支架(不要从塑料支架上取下凝胶)并转移到凝胶盒中
3.将TAE倒在凝胶上以使其完全浸没
4.加载10-20ul梯。100ng应足以可视化。
5.加载DNA样品(在与凝胶加载染料混合后)。凝胶加载染料为6倍，并且应稀释到1倍以加载样品(如：混合4ul染料+20ul DNA并加样全部24ul)。利用格林混合母液进行PCR的DNA已经将染料纳入混合物中，并且不需要添加染料。100ng应足以可视化。一些样品可能需要稀释。
6.将有线顶部放在凝胶盒上。负极(黑色)应在具有孔的一侧。
7.将凝胶盒插入电源中。在100-120的电压下运行10-30min。
*染料与DNA相反(朝着(-)电荷)迁移。这就是为什么长时间/多次运行凝胶是不明智的，并且你将无法看到任何东西。不要重复使用凝胶。相反倒入新的。也可以将染料放入缓冲液本身中，这可能有助于可视化。
为了从大肠杆菌纯化载体，按照制造商的方案，如Zymo Researh微型制剂试剂盒中所述利用DNA制剂试剂盒。
根据供应商的方案，由Genewiz或Eurofins进行Sanger测序。结果证实，在获得转化的克隆后，DNA序列是正确的。
如制造商的方案中所述，使用Midi制剂试剂盒进行大规模DNA制备。从ZymoResearch获得试剂盒。结果显示产生了大量的环状DNA或质粒。
使用Restriction Digestion Guide(来自Addgene)如下所述将质粒转化为线性DNA：
选择限制酶来消化质粒。
注意：为了确定哪种限制酶会剪切您的DNA序列(以及它们将切割的位置)，请使用序列分析程序，例如Addgene的序列分析仪。
通过阅读酶的说明来确定适当的反应缓冲液。
注意：如果正在执行双酶消化(同时消化两种酶)，则需要确定适于酶的最佳缓冲液。大多数公司将具有相容性图表，例如来自NEB的双酶消化查找工具。如果找不到适于两种酶的缓冲液，则需要首先在酶1的缓冲液中消化一种酶，重新纯化切割的质粒，并且然后在酶2的缓冲液中执行第二次消化。
在1.5mL管中合并以下物质：
DNA
限制酶
缓冲液(1倍)
BSA(如果制造商建议)
dH2O补足到总体积
注意：切割的DNA量取决于应用。诊断消化物通常涉及约500ng的DNA，而分子克隆通常需要1-3μg的DNA。总反应体积通常在10-50μL之间变化，这取决于应用，并且主要由待切割的DNA的体积决定。
注意：请参阅下面的提示和常见问题解答部分，了解确定所使用的限制酶体积的注意事项。
注意：典型的限制消化反应可似如下：
1μg DNA
1μL每种限制酶
3μL 10倍缓冲液
3μL 10倍BSA(如果建议)
xμL dH2O(使总体积达到30μL)
通过移液轻轻混合。
在适当的温度(通常37℃)下将管孵育1小时。始终遵守制造商的说明书。
注意：根据应用和反应中DNA的量，孵育时间可在45min到过夜的范围内。
如下所述使用苯酚-氯仿DNA提取和纯化程序纯化DNA：
材料
1. 3M NaOAc(乙酸钠)
2. 100％乙醇，冷
3. 70％乙醇，冷
4.苯酚-氯仿-异戊醇，比率为25:24:1
程序
1.将10％体积的NaOAc添加到DNA(如：50ul到500ul)
2.添加等体积的苯酚-氯仿-异丙醇，小心从底部/较重相取出；涡旋
3.以12,000g离心5min
4.将顶部相转移到新的管中
5.添加2.5体积的冷的100％乙醇，涡旋。如果有很多DNA，液体应该看起来浑浊。
6.在-80C下放置10分钟，或放在干冰上
7.如果可能，在4C下以最大速度离心10分钟。移出大部分上清液(留下约50ul)
8.用1ml冷的70％乙醇洗涤，添加洗涤而不需要额外的机械作用(不要主动干扰颗粒)。
9.以最大速度离心5min
10.移出大部分70％乙醇；风干10-30min
11.重新悬浮于20-30ul水或TE缓冲液中
注意：
微量离心管的优化体积：
○400ul DNA
○40ul NaOAc
○440ul苯酚-氯仿-异戊醇
○顶部相回收约400ul
○添加1ml 100％ETOH
根据以下程序将DNA转变到酵母细胞中：
毕赤氏酵母属电穿孔方案(Bio-Rad Gene Pulser XcellTM总系统号1652660)
将毕赤氏酵母属菌株–来自的DNA2.0野生型毕赤氏酵母属用P4HA/B共表达质粒转化并在Hygro板上进行选择(200ug/ml)。4号克隆
1.将单个群落接种到100ml YPD培养基中并在30度下在振荡(215rpm)下过夜生长。
2.次日，培养物达到OD600约3.5(约3-5×107个细胞/OD600)。将培养物用新鲜的YPD稀释到OD600约1.7，并在30度下在振荡(215rpm)下再生长一小时。
3.将细胞以3,500g离心5min；用水洗涤一次并重新悬浮于10mM Tris-HCl(pH7.5)、100mM LiAc、10mM DTT(新鲜添加)、0.6M山梨醇中
4.对于每次转化，将8×108个细胞等分到8ml 10mM Tris-HCl(pH 7.5)、100mMLiAc、10mM DTT、0.6M山梨醇中，并在室温下孵育30min。
5.将细胞以5000g离心5min，并用冰冷的1.5ml 1M山梨醇洗涤3次，并重新悬浮于80ul冰冷的1M山梨醇中
6.向细胞中添加各种量(约5ug)的线性化DNA并通过移液进行混合。
7.将细胞和DNA混合物(80-100ul)添加到0.2cm比色管中并使用毕赤氏酵母属方案(1500v，25uF，200Ω)脉冲。
8.立即将细胞转移到1ml YPD和1M山梨醇的混合物(1:1)中并在30度下孵育>2小时
9.以不同密度平铺细胞。
将单个群落接种到24深孔板中的2mL BMGY培养基中，并在30摄氏度下在900rpm振荡下生长至少48小时。按照以下程序使用细胞裂解、SDS-page和胃蛋白酶测定测试所得细胞的胶原。
使用以下程序裂解细胞：
制备1倍裂解缓冲液。以下配方适用于制备50个样品的组合。
2.5ml 1M HEPES；最终浓度为50mM。
438.3mg NaCl；最终浓度为150mM。
5ml甘油；最终浓度为10％。
0.5ml Triton X-100；最终浓度为1％。
42ml Millipure水。
将缓冲液于4℃下存储1个月。
使用Qiagen TissueLyser，使巴斯德毕赤酵母细胞裂解。
速度：30hz
时间：15min(连续)
在桌面型离心机上使裂解物以2500rpm离心15min。将约600ul上清液收集于新鲜管或96孔深板中。弃去颗粒。
使用以下程序进行SDS-Page：
缓冲液和溶液的制备
将50ml PierceTM20X Tris-乙酸盐SDS缓冲液与950ml Millipure水混合以制备1倍Tris-乙酸盐SDS缓冲液。
向Mini或Midi凝胶罐的每个室中添加1500ml 1倍Tris-乙酸盐SDS缓冲液。
SDS-PAGE-每个凝胶将包含以下：分子量标记物、阴性对照、阳性对照、样品。
凝胶制备
打开凝胶周围的塑料外壳。
从凝胶移除孔电泳梳。
从凝胶移除白色胶带。
根据制造商说明书将凝胶放入Midi凝胶罐中。
用5ml 1倍Tris-乙酸盐SDS缓冲液冲洗凝胶孔，一次1ml。
吸出气泡并确保所有孔都浸没在1倍Tris-乙酸盐SDS缓冲液中。
用于加载SDS-PAGE凝胶的样品制备。
使样品和对照在冰上解冻。
将LDS缓冲液稀释到2倍，并添加10％2-巯基乙醇最终体积，用水补足体积。
将每个样品和LDS+2-ME以1:1的比率混合
简要地涡旋并离心样品。
将所有样品在70℃下孵育7分钟
使样品冷却到室温并简要地离心。
样品加载
向每个孔中添加20μL对照和样品以及10ul分子量标准品
对1到4个Midi凝胶罐进行电泳
利用300W创建一步程序。
步骤一是150V达一小时10分钟。
根据制造商的说明书将Midi凝胶罐的盖子连接到底座上。
将电源线连接到300W上的正确插座，确保红色电缆连接到红色插座，并且黑色电缆连接到黑色插座。
根据需要对最多4个Midi凝胶罐重复。
运行一步程序。
准备凝胶进行转移。
关闭300W。
拔下300W的Midi凝胶罐电缆。
从Midi凝胶罐移除盖子。
从Midi凝胶罐中移除凝胶。
使用Midi凝胶罐所包括的凝胶刀，通过将刀片插入塑料裂缝并转动刀来打开凝胶的塑料外壳。沿着裂缝重复这个动作，直到塑料外壳分成两部分。
将装有凝胶的塑料外壳保持凝胶面朝下放在含有水的NalgeneTM染色盒上，并轻轻地将凝胶刀压入阳极槽中以将凝胶释放到染色盒中。
重复以下程序3次，以在Millipore水中洗涤凝胶。
孵育30秒
倾析出水
考马斯(Coomassie)染色：
在室温下添加10-20ml的PageBlue蛋白染色溶液，并在室温下孵育60分钟，同时在振荡器上轻轻搅动。凝胶可过夜染色而不影响背景。
弃去染色溶液，并用MilliporeMillipure水冲洗凝胶两次。将染色溶液和水丢弃于指定的生物危害废物容器中，而非流入排水管。
添加20ml水使其脱色。对于完全脱色，将耗费10-12小时。对于更快脱色，向水中添加一些甲醇。频繁地更换水会增强脱色。
利用以下程序进行胃蛋白酶测定：
1.在胃蛋白酶处理前根据Thermo Scientific方案进行BCA测定以获得每个样品的总蛋白。将总蛋白正规化到所有样品的最低浓度。(注意：如果最低总蛋白浓度低于0.5mg/mL，则不要使用这个浓度进行正规化)
2.将100uL裂解物放于微量离心管中。
3.产生含有以下的混合母液：
a.37％HCl(0.6mL酸/100mL)以及
b.胃蛋白酶原液为1mg/mL，于去离子水中，并且胃蛋白酶的最后添加应为1:25比率的胃蛋白酶:总蛋白(重量:重量)。
c.基于步骤1总蛋白的正规化，胃蛋白酶的量将根据最终添加而变化，使用所创建的试算表进行调整。
4.添加胃蛋白酶后，用移液管混合3倍，并使样品在室温下孵育1小时以发生胃蛋白酶反应。
5.一小时后，向每个样品中添加1:1体积的含有巯基乙醇的LDS加载缓冲液，并允许在70℃下孵育7分钟。(在这种情况下，应添加100uL的LDS)。
6.然后以14,000rpm旋转1分钟以去除浊度。
7.从样品顶部添加18uL到3-8％TAE上(使用TAE缓冲液)并在150V下运行凝胶1小时10分钟。或者在沸腾后，可以立即将样品置于-80℃直到需要运行凝胶。
结果显示于下表1中。
实施例2-
产生重组胶原的酵母
按照相同的程序和方案重复实施例1，并进行以下改变：将DNA MMV77(序列10)序列(包括针对毕赤氏酵母属表达优化的牛胶原序列(优化的牛col3A1，序列2))插入酵母中。使用pAOX1启动子(序列3)驱动胶原序列的表达。使用含有500ug/ml的吉欧霉素的YPD板来选择成功的转化体。所得菌株是PP8。载体MMV77显示于图2中。
使用Pme I完成限制性消化。
使菌株在BMMY培养基中生长并测试胶原。结果显示于下表1中。
实施例3
产生增加量的重组胶原的酵母
按照相同的程序和方案重复实施例1，并进行以下改变：将DNA MMV-129(序列11)序列(包括针对毕赤氏酵母属表达优化的牛胶原序列)插入酵母中。使用pCAT启动子(序列7)驱动胶原序列的表达。使用含有500ug/ml的吉欧霉素的YPD板来选择成功的转化体。所得菌株是PP123。用Swa I消化MMV129并将其转化到PP1中以产生PP123。载体MMV129显示于图3中。
使菌株在BMGY培养基中生长并测试胶原。结果显示于下表1中。
实施例4
产生最佳量的重组胶原的酵母
按照相同的程序和方案重复实施例1，并进行以下改变：
将DNA MMV-130(序列12)序列(包括针对毕赤氏酵母属表达优化的牛胶原序列(序列2))插入酵母中。使用pDF启动子(序列6)驱动胶原序列的表达。AOX1着陆垫(由Pme I切割，序列8)用于帮助载体位点特异性整合到毕赤氏酵母属基因体中。使用含有500ug/ml的吉欧霉素的YPD板来选择成功的转化体。所得菌株是PP153。用Pme I消化MMV130并使其转化到PP1中以产生PP153。(牛col3A1优化的，序列2)。
未使用酚提取，并且使用PureLink PCR纯化试剂盒回收线性化DNA。
使菌株在BMGY培养基中生长并测试胶原。结果显示于下表1中。
实施例5
打算产生重组羟基化胶原的酵母
按照相同的程序和方案重复实施例2，并进行以下改变：将含有牛P4HA(序列4)和牛P4HB(序列5)序列的一个DNA载体MMV-78(序列13)插入酵母中。用Pme I消化MMV78并将其转化到PP1中以产生PP8。P4HA和P4HB都含有其内源信号肽并且由Das1-Das2双向启动子(序列25)驱动。用Kpn I消化DNA并将其转化到PP8中以产生PP3序列2。载体MMV78显示于图5中。
使菌株在BMMY培养基中生长并测试胶原和羟基化。结果显示于下表1中。
实施例6
产生重组羟基化胶原的酵母
按照相同的程序和方案重复实施例2，并进行以下改变：将含有牛P4HA和牛P4HB序列的一个DNA载体MMV-78插入酵母中。P4HA和P4HB都含有其内源信号肽并且由Das1-Das2双向启动子驱动。用Kpn I消化DNA并将其转化到PP8中以产生PP3序列2。
使用含有由pAOX1启动子驱动的P4HB的另一载体MMV-94(序列14)，并且也将其插入酵母中。用PHO1信号肽替代P4HB的内源信号肽。所得菌株是PP38。用Avr II消化MMV94并将其转化到PP3中以产生PP38。载体MMV94显示于图6中。
使菌株在BMMY培养基中生长并测试胶原和羟基化。结果显示于下表1中。
实施例7
产生增加量的重组羟基化胶原的酵母
按照相同的程序和方案重复实施例4，并进行以下改变：将含有牛P4HA和牛P4HB序列的一个DNA载体MMV-156(序列15)插入酵母中。P4HA含有其内源信号肽并用α-因子Pre(序列21)序列替代P4HB信号序列。两种基因都由pHTX1双向启动子(序列25)驱动。用Bam HI消化MMV156并将其转化到PP153中以产生PP154。序列2。载体MMV156显示于图7中。使菌株在BMGY培养基中生长并测试胶原和羟基化。结果显示于下表1中。
实施例8
产生最佳量的重组羟基化胶原的酵母
按照相同的程序和方案重复实施例4，并进行以下改变：将含有牛P4HA和牛P4HB序列的一个DNA载体MMV-156插入酵母中。P4HA含有其内源信号肽并用α-因子Pre序列替代P4HB信号序列。两种基因都由pHTX1双向启动子驱动。用Swa I消化DNA并将其转化到PP153中以产生PP154。序列2。
也将含有P4HA和P4HB的另一载体MMV-191(序列16)插入酵母中。P4HA的额外拷贝含有其内源信号肽，并且用α因子Pre-Pro(序列22)序列替代P4HB的额外拷贝的信号序列。P4HA和P4HB的额外拷贝由pGCW14-GAP1双向启动子(序列23)驱动。用Bam HI消化MMV191并将其转化到PP154中以产生PP268。载体MMV191显示于图8中。使菌株在BMGY培养基中生长并测试胶原和羟基化。结果显示于下表1中。
实施例9
全合一载体
利用实施例1的方法和程序来生成全合一载体。全合一载体含有胶原和相关启动子和终止子的DNA、羟基胶原和相关启动子和终止子的酶的DNA、标记物表达和相关启动子和终止子的DNA、用于细菌和酵母复制起点的DNA以及与酵母基因组同源用于整合的DNA。全合一载体含有战略上放置的独特的限制位点5’、3’或在上述组分内。当需要对胶原表达或其他载体组分进行任何修饰时，选择组分的DNA可以很容易地用限制性酶切除，并用使用者选择的克隆方法替代。全合一载体(MMV208，序列17)的最简单型式包括除了羟基酶的启动子之外的所有上述组分。载体MMV208是使用以下组分制备：来自MMV84(序列18)的AOX同源物、来自MMV150(序列19)的核糖体同源物、来自MMV140(序列20)的细菌和酵母复制起点、来自MMV140的吉欧霉素标记物和来自MMV129的Col3A1。从消除以下限制位点的Genscript合成P4HA和B和相关终止子的改性型式：AvrII、NotI、PvuI、PmeI、BamHI、SacII、SwaI、XbaI、SpeI。将载体转化到菌株PP1中。
使菌株在BMGY培养基中生长并测试胶原和羟基化。结果显示于下表1中。
表1
| 实施例 | 胶原(g/L) | 羟基化胶原(％) |
| 1* | 0.05 | 0 |
| 2 | 0.1 | 0 |
| 3 | 0.5 | 0 |
| 4 | 1-1.5 | 0 |
| 5* | 0.1 | 15 |
| 6 | 0.1 | 35 |
| 7 | 1–1.5 | 15 |
| 8 | 1–1.5 | 40-50 |
| 9 | 0.5-1 | 15-20 |
*比较实例；为了量化胶原，使用考马斯染色的凝胶。使用胶原标准曲线来测定样品中的胶原浓度。在1:25胃蛋白酶处理后，通过比较样品带与标准带估计羟基化胶原的量。
如上所讨论，羟基化胶原在高浓度的胃蛋白酶中是稳定的，因此其有用之处在于自发酵不仅具有增加量的胶原，而且还具有羟基化胶原。
描述的解释
本文使用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，而不打算限制本发明。举例来说，除非上下文另有明确指示，否则如本文所用的单数形式“一(a、an)”和“所述”打算也包括复数形式。应进一步理解，当在本说明书中使用时，术语“包含(comprises)”和/或“包含(comprising)”指明所述特征、步骤、操作、要素和/或组分的存在，但不排除一个或多个其他特征、步骤、操作、要素、组分和/或其群组的存在或添加。
尽管术语“第一”和“第二”在本文中可用于描述各种特征/要素(包括步骤)，但是这些特征/元素不应该被这些术语限制，除非上下文另外指示。这些术语可用于区分一个特征/要素与另一特征/要素。因此，下面讨论的第一特征/要素可以称为第二特征/要素，并且类似地，下面讨论的第二特征/要素可以称为第一特征/要素，此并不背离本发明的教导。
在整个说明书和随后的权利要求中，除非上下文另有要求，否则词语“包含(comprise)”以及诸如“包含(comprises)”和“包含(comprising)”的变化形式意味着各种组分可以共同用于方法和制品(例如，包括装置和方法的组合物和设备)。举例来说，术语“包含(comprising)”应理解为暗示包括任何陈述的要素或步骤，但不排除任何其他要素或步骤。
尽管上文描述了各种说明性实施方案，但是在不背离如权利要求所描述的本发明的范围的情况下，可以对各种实施方案进行多种改变中的任一种。举例来说，在替代实施方案中，通常可以改变进行各种所描述的方法步骤的顺序，并且在其他替代实施方案中，可以总共跳过一个或多个方法步骤。各种装置和系统实施方案的任选特征可包括于一些实施方案中，而非其他实施方案中。因此，前面的描述主要是为了实例性目的而提供的，并且不应解释为限制权利要求中所阐述的本发明的范围。
本文包括的实施例和说明借助说明而非限制方式显示了其中可以实践主题的具体实施方案。如上所提及，可以利用其他实施方案并从中衍生出来，使得可进行结构和逻辑取代和变化，此并不背离本公开的范围。本发明主题的所述实施方案在本文中可以单独地或共同地由术语“发明”来提及，此仅仅是为了方便，并且如果实际上公开超过一个，则不打算自动地将本申请的范围限制到任何单个发明或发明概念。因此，尽管本文已经说明和描述了具体实施方案，但是为了实现相同目的而计算的任何布置可以取代所示的具体实施方案。本公开打算涵盖各种实施方案的任何和所有修改或变化。在阅读了上述描述之后，本领域技术人员将明了上述实施方案和本文中未具体描述的其他实施方案的组合。
通过引用并入
本说明书中提及的所有出版物和专利申请案的整个内容通过引用并入本文中，其并入程度如同每个单独的出版物或专利申请案被具体且单独地指出通过引用并入一般，特别提及出现在通过引用并入的说明书的相同句子、段落、页面或部分中的公开案。
序列表
<110> Modern Meadow公司
<120> 用于产生胶原的酵母菌株和方法
<130> 514257US
<150> US 62/526,912
<151> 2017-06-29
<160> 25
<170> 专利版本3.5
<210> 1
<211> 4401
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 胶原序列1：cDNA序列- 来自母牛的未优化的天然DNA序列
<400> 1
atgatgagct ttgtgcaaaa ggggacctgg ttacttttcg ctctgcttca tcccactgtt 60
attttggcac aacaggaagc tgttgacgga ggatgctccc atctcggtca gtcttatgca 120
gatagagatg tatggaaacc agaaccgtgc caaatatgcg tctgtgactc aggatccgtt 180
ctctgtgatg acataatatg tgacgaccaa gaattagact gccccaaccc tgaaatcccg 240
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ggagacccag gaccacgtgg ggaacgcgga gaagctggtt ctccaggtat cgcaggacct 1380
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ggagaaaagg gtcctcctgg ggaccgtggt ggcccaggcc ctgcagggcc cagaggtgtt 1560
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ggtcctggcc ctcagggtcc tgctggaaag aatggtgaga ccggacctca gggtcctcca 1860
ggacctactg gcccttctgg tgacaaagga gacacaggac cccctggtcc acaaggacta 1920
caaggcttgc ctggaacgag tggtccccca ggagaaaacg gaaaacctgg tgaacctggt 1980
ccaaagggtg aggctggtgc acctggaatt ccaggaggca agggtgattc tggtgctccc 2040
ggtgaacgcg gacctcctgg agcaggaggg ccccctggac ctagaggtgg agctggcccc 2100
cctggtcccg aaggaggaaa gggtgctgct ggtccccctg ggccacctgg ttctgctggt 2160
acacctggtc tgcaaggaat gcctggagaa agagggggtc ctggaggccc tggtccaaag 2220
ggtgataagg gtgagcctgg cagctcaggt gtcgatggtg ctccagggaa agatggtcca 2280
cggggtccca ctggtcccat tggtcctcct ggcccagctg gtcagcctgg agataagggt 2340
gaaagtggtg cccctggagt tccgggtata gctggtcctc gcggtggccc tggtgagaga 2400
ggcgaacagg ggcccccagg acctgctggc ttccctggtg ctcctggcca gaatggtgag 2460
cctggtgcta aaggagaaag aggcgctcct ggtgagaaag gtgaaggagg ccctcccgga 2520
gccgcaggac ccgccggagg ttctgggcct gccggtcccc caggccccca aggtgtcaaa 2580
ggcgaacgtg gcagtcctgg tggtcctggt gctgctggct tccccggtgg tcgtggtcct 2640
cctggccctc ctggcagtaa tggtaaccca ggccccccag gctccagtgg tgctccaggc 2700
aaagatggtc ccccaggtcc acctggcagt aatggtgctc ctggcagccc cgggatctct 2760
ggaccaaagg gtgattctgg tccaccaggt gagaggggag cacctggccc ccagggccct 2820
ccgggagctc caggcccact aggaattgca ggacttactg gagcacgagg tcttgcaggc 2880
ccaccaggca tgccaggtgc taggggcagc cccggcccac agggcatcaa gggtgaaaat 2940
ggtaaaccag gacctagtgg tcagaatgga gaacgtggtc ctcctggccc ccagggtctt 3000
cctggtctgg ctggtacagc tggtgagcct ggaagagatg gaaaccctgg atcagatggt 3060
ctgccaggcc gagatggagc tccaggtgcc aagggtgacc gtggtgaaaa tggctctcct 3120
ggtgcccctg gagctcctgg tcacccaggc cctcctggtc ctgtcggtcc agctggaaag 3180
agcggtgaca gaggagaaac tggccctgct ggtccttctg gggcccccgg tcctgccgga 3240
tcaagaggtc ctcctggtcc ccaaggccca cgcggtgaca aaggggaaac cggtgagcgt 3300
ggtgctatgg gcatcaaagg acatcgcgga ttccctggca acccaggggc ccccggatct 3360
ccgggtcccg ctggtcatca aggtgcagtt ggcagtccag gccctgcagg ccccagagga 3420
cctgttggac ctagcgggcc ccctggaaag gacggagcaa gtggacaccc tggtcccatt 3480
ggaccaccgg ggccccgagg taacagaggt gaaagaggat ctgagggctc cccaggccac 3540
ccaggacaac caggccctcc tggacctcct ggtgcccctg gtccatgttg tggtgctggc 3600
ggggttgctg ccattgctgg tgttggagcc gaaaaagctg gtggttttgc cccatattat 3660
ggagatgaac cgatagattt caaaatcaac accgatgaga ttatgacctc actcaaatca 3720
gtcaatggac aaatagaaag cctcattagt cctgatggtt cccgtaaaaa ccctgcacgg 3780
aactgcaggg acctgaaatt ctgccatcct gaactccaga gtggagaata ttgggttgat 3840
cctaaccaag gttgcaaatt ggatgctatt aaagtctact gtaacatgga aactggggaa 3900
acgtgcataa gtgccagtcc tttgactatc ccacagaaga actggtggac agattctggt 3960
gctgagaaga aacatgtttg gtttggagaa tccatggagg gtggttttca gtttagctat 4020
ggcaatcctg aacttcccga agacgtcctc gatgtccagc tggcattcct ccgacttctc 4080
tccagccggg cctctcagaa catcacatat cactgcaaga atagcattgc atacatggat 4140
catgccagtg ggaatgtaaa gaaagccttg aagctgatgg ggtcaaatga aggtgaattc 4200
aaggctgaag gaaatagcaa attcacatac acagttctgg aggatggttg cacaaaacac 4260
actggggaat ggggcaaaac agtcttccag tatcaaacac gcaaggccgt cagactacct 4320
attgtagata ttgcacccta tgatatcggt ggtcctgatc aagaatttgg tgcggacatt 4380
ggccctgttt gctttttata a 4401
<210> 2
<211> 4404
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Col3A1 cDNA序列
<400> 2
atgatgtctt ttgtccaaaa gggtacttgg ttactttttg ctctgttgca cccaactgtt 60
attctcgcac aacaggaagc agtagatggt ggttgctcac atttaggtca atcttacgca 120
gatagagatg tatggaaacc tgaaccatgt caaatttgcg tgtgtgactc aggttcagtg 180
ctctgcgacg atatcatatg tgacgaccag gaattggact gtccaaaccc agagatacca 240
ttcggtgaat gttgtgctgt ttgtccacag ccaccaactg ctcctacaag acctccaaac 300
ggtcaaggtc cacaaggtcc taaaggtgat ccgggtccac ctggtattcc tggtagaaat 360
ggtgaccctg gacctcccgg ttccccaggt agcccaggat cacctgggcc tcctggaata 420
tgtgaatcct gcccaactgg tggtcagaac tatagcccac aatacgaggc ctacgacgtc 480
aaatctggtg ttgctggagg aggtattgca ggctaccctg gtcccgcagg gcccccaggt 540
ccgccgggtc cgcccggaac atcaggtcat cccggagccc ctggtgcacc aggttatcag 600
ggaccgcccg gagagcctgg acaagctggt cccgctggac cccctggtcc accaggtgct 660
attggaccaa gtggtcctgc cggaaaagac ggtgaatccg gtagacctgg tagacccggc 720
gaaaggggtt tcccaggtcc tcccggaatg aagggtccag ccggtatgcc cggttttcct 780
gggatgaagg gtcacagagg atttgatggt agaaacggag agaaaggcga aaccggtgct 840
cccggactga agggtgaaaa cggtgtccct ggtgagaacg gcgctcctgg acctatgggt 900
ccacgtggtg ctccaggaga aagaggcaga ccaggattgc ctggtgcagc tggtgctaga 960
ggtaacgatg gtgcccgtgg ttccgatgga caacccgggc cacccggccc tccaggtacc 1020
gctggatttc ctggaagccc tggtgctaag ggggaggttg gtccggctgg tagtcccgga 1080
agtagcggtg ccccaggtca aagaggcgaa ccaggccctc agggtcacgc aggagcacct 1140
ggaccgcctg gtcctcctgg ttcgaatggt tcgcctggag gaaaaggtga aatggggccc 1200
gcaggaatcc ccggtgcgcc tggtcttatt ggtgccaggg gtcctccagg cccgccaggt 1260
acaaatggtg tacccggaca gcgaggagca gctggtgaac ctggtaaaaa cggtgccaaa 1320
ggagatccag gtcctcgtgg agagcgtggt gaagctggct ctcccggtat cgccggtcca 1380
aaaggtgagg acggtaagga cggttcccct ggtgagccag gtgcgaacgg actgccaggt 1440
gcagccggag agcgaggagt cccaggattc aggggaccag ccggtgctaa cggcttgcct 1500
ggtgaaaaag ggccccctgg tgatagggga ggacccggtc cagcaggccc tcgtggagtt 1560
gctggtgagc ctggacgtga cggtttacca ggagggccag gtttgagggg tattcccggg 1620
tcccctggcg gtcctggatc ggatggaaaa ccagggccac caggttcgca gggtgaaaca 1680
ggacgtccag gcccacccgg ctcacctggt ccaaggggtc agcctggtgt catgggtttc 1740
cccggtccaa agggtaatga cggagcaccg ggtaaaaatg gtgaacgtgg tggcccaggt 1800
ggtccaggac cccaaggtcc agctggaaaa aacggtgaga caggtcctca aggacctcca 1860
ggacctaccg gtcctagcgg agataaggga gatacgggac cgccaggacc tcaaggattg 1920
caaggtttgc ctggtacatc tggccctccc ggagaaaatg gtaagcctgg agagccagga 1980
ccaaaaggcg aagctggagc cccaggtatc cccggaggta agggagactc aggtgctccg 2040
ggtgagcgtg gtcctccggg tgccggtggt ccacctggac ctagaggtgg tgccgggccg 2100
ccaggtcctg aaggtggtaa aggtgctgct ggtccaccgg gaccgcctgg ctctgctggt 2160
actcctggct tgcagggaat gccaggagag agaggtggac ctggaggtcc cggtccgaag 2220
ggtgataaag gggagccagg atcatccggt gttgacggcg cacctggtaa agacggacca 2280
aggggaccaa cgggtccaat cggaccacca ggacccgctg gccagccagg agataaaggc 2340
gagtccggag cacccggtgt tcctggtata gctggaccca ggggtggtcc cggtgaaaga 2400
ggtgaacagg gcccaccggg tcccgccggt ttccctggcg cccctggtca aaatggagaa 2460
ccaggtgcaa agggcgagag aggagcccca ggagaaaagg gtgagggagg accacccggt 2520
gctgccggtc cagctggggg ttcaggtcct gctggaccac caggtccaca gggcgttaaa 2580
ggtgagagag gaagtccagg tggtcctgga gctgctggat tcccaggtgg ccgtggacct 2640
cctggtcccc ctggatcgaa tggtaatcct ggtccgccag gtagttcggg tgctcctggg 2700
aaggacggtc cacctggccc cccaggtagt aacggtgcac ctggtagtcc aggtatatcc 2760
ggacctaaag gagattccgg tccaccaggc gaaagagggg ccccaggccc acagggtcca 2820
ccaggagccc ccggtcctct gggtattgct ggtcttactg gtgcacgtgg actggccggt 2880
ccacccggaa tgcctggagc aagaggttca cctggaccac aaggtattaa aggagagaac 2940
ggtaaacctg gaccttccgg tcaaaacgga gagcggggac ccccaggccc ccaaggtctg 3000
ccaggactag ctggtaccgc aggggaacca ggaagagatg gaaatccagg ttcagacgga 3060
ctacccggta gagatggtgc accgggggcc aagggcgaca ggggtgagaa tggatctcct 3120
ggtgcgccag gggcaccagg ccacccaggt cccccaggtc ctgtgggccc tgctggaaag 3180
tcaggtgaca ggggagagac aggcccggct ggtccatctg gcgcacccgg accagctggt 3240
tccagaggcc cacctggtcc gcaaggccct agaggtgaca agggagagac tggagaacga 3300
ggtgctatgg gtatcaaggg tcatagaggt tttccgggta atcccggcgc cccaggttct 3360
cctggtccag ctggccatca aggtgcagtc ggatcgcccg gcccagccgg tcccaggggc 3420
cctgttggtc catccggtcc tccaggaaag gatggtgctt ctggacaccc aggacctatc 3480
ggacctccgg gtcctagagg taatagagga gaacgtggat ccgagggtag tcctggtcac 3540
cctggtcaac ctggcccacc agggcctcca ggtgcacccg gtccatgttg tggtgcaggc 3600
ggtgtggctg caattgctgg tgtgggtgct gaaaaggccg gcggtttcgc tccatattat 3660
ggtgatgaac cgattgattt taagatcaat actgacgaaa tcatgacttc cttaaagtcc 3720
gttaatggtc aaattgagtc tctaatctcc ccagatggtt cacgtaaaaa tcctgctaga 3780
aattgtagag atttgaagtt ttgtcacccc gagttgcagt ccggtgagta ctgggtggac 3840
cccaatcaag gttgtaagtt agacgctatt aaagtttact gcaatatgga gacaggagaa 3900
acttgcatca gcgcttctcc attgactatc ccacaaaaaa attggtggac tgactctgga 3960
gctgagaaaa agcatgtatg gttcggggaa tcgatggaag gtggtttcca attcagctac 4020
ggtaaccctg aacttcctga agatgttctt gacgttcaat tggcatttct gagattgttg 4080
tccagtcgtg caagccaaaa cattacatac cattgcaaaa attccatcgc atatatggat 4140
catgctagcg gaaatgtgaa aaaggcattg aagctgatgg gatcaaatga aggtgaattt 4200
aaagcagagg gtaattctaa gtttacttac actgtattgg aggatggttg tacgaagcat 4260
acaggtgaat ggggtaaaac agtgtttcaa tatcaaaccc gcaaagcagt tagattgcca 4320
atcgtcgata tcgcaccata cgacattgga ggaccagatc aagagttcgg agctgacatc 4380
ggtccggtgt gtttcctttg ataa 4404
<210> 3
<211> 940
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pAOX1
<400> 3
agatctaaca tccaaagacg aaaggttgaa tgaaaccttt ttgccatccg acatccacag 60
gtccattctc acacataagt gccaaacgca acaggagggg atacactagc agcagaccgt 120
tgcaaacgca ggacctccac tcctcttctc ctcaacaccc acttttgcca tcgaaaaacc 180
agcccagtta ttgggcttga ttggagctcg ctcattccaa ttccttctat taggctacta 240
acaccatgac tttattagcc tgtctatcct ggcccccctg gcgaggttca tgtttgttta 300
tttccgaatg caacaagctc cgcattacac ccgaacatca ctccagatga gggctttctg 360
agtgtggggt caaatagttt catgttcccc aaatggccca aaactgacag tttaaacgct 420
gtcttggaac ctaatatgac aaaagcgtga tctcatccaa gatgaactaa gtttggttcg 480
ttgaaatgct aacggccagt tggtcaaaaa gaaacttcca aaagtcggca taccgtttgt 540
cttgtttggt attgattgac gaatgctcaa aaataatctc attaatgctt agcgcagtct 600
ctctatcgct tctgaacccc ggtgcacctg tgccgaaacg caaatgggga aacacccgct 660
ttttggatga ttatgcattg tctccacatt gtatgcttcc aagattctgg tgggaatact 720
gctgatagcc taacgttcat gatcaaaatt taactgttct aacccctact tgacagcaat 780
atataaacag aaggaagctg ccctgtctta aacctttttt tttatcatca ttattagctt 840
actttcataa ttgcgactgg ttccaattga caagcttttg attttaacga cttttaacga 900
caacttgaga agatcaaaaa acaactaatt attcgaaacg 940
<210> 4
<211> 1612
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 优化的牛P4HA cDNA
<400> 4
atgatttggt atatcctagt cgttggtatt ttgttgccac agtcactggc tcacccaggc 60
ttcttcactt ctataggaca gatgactgat ttgattcaca cagaaaaaga cctagttaca 120
agccttaaag actatatcaa agctgaagag gataagttgg agcaaatcaa aaagtgggca 180
gagaaactcg atagattgac tagtactgca acaaaagatc ctgagggttt tgtgggtcac 240
ccagtgaatg ctttcaagct gatgaagaga cttaatacag agtggtcaga attggaaaac 300
ttggtactta aagatatgag tgatggattc atttctaact taacaattca aagacaatac 360
tttccaaacg atgaggacca agtaggagca gcaaaagctt tgttgcgatt gcaggacaca 420
tacaatttgg acaccgacac gatatcgaag ggtgatttac ctggtgtgaa gcataagtcc 480
ttcctcactg tggaagattg ttttgaattg ggaaaagtcg catatacaga agccgactac 540
tatcacacag aattatggat ggagcaagct ctgcgtcagt tggacgaagg tgaagtttct 600
accgttgata aggtttcagt tttggattac ttatcatacg ctgtttacca gcaaggtgat 660
ctggacaaag ctctactttt aactaaaaag ttgttggagc tggacccgga gcatcaaaga 720
gctaacggta atctgaaata ctttgaatac atcatggcta aggaaaagga cgcaaataag 780
tcctcgtccg atgaccaatc cgatcaaaag accactctga aaaaaaaagg tgcagctgtt 840
gactacctcc cagagagaca aaagtatgaa atgctgtgta gaggagaggg tatcaagatg 900
actccaagga gacagaaaaa gctgttctgt agatatcatg atgggaaccg taacccaaaa 960
ttcattcttg ctccagcgaa acaggaagat gaatgggaca agcctagaat cattcgtttt 1020
catgacatca tctccgatgc agaaatagag gttgtgaaag acttggccaa accaagattg 1080
agtagggcta ccgtccatga ccctgagact ggaaaattga ctaccgcaca atatcgtgtc 1140
tctaaatcag catggttgtc cggttacgag aatcccgtgg tcagccgtat caatatgcgt 1200
attcaagatt tgactggtct tgacgtaagc actgctgagg aactacaagt tgccaactat 1260
ggtgtgggcg gtcagtatga accccacttt gatttcgcca gaaaggacga gcctgatgct 1320
tttaaggagc taggtactgg aaatagaatc gcaacgtggt tgttctatat gtccgatgtg 1380
cttgctggag gagccacagt tttccctgag gtaggtgctt ctgtttggcc taaaaagggc 1440
acggccgtat tttggtacaa tctgtttgca tctggagaag gtgattacag cactagacat 1500
gctgcttgtc ccgtcttagt cggtaataag tgggtttcca ataagtggct gcatgagaga 1560
ggtcaagagt ttaggaggcc atgcacattg tcagaattag aatgataatt tt 1612
<210> 5
<211> 1750
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 牛P4HB (PDI)序列，具有α pre-pro信号序列
<400> 5
aaaatgagat tcccatctat tttcaccgct gtcttgttcg ctgcctcctc tgcattggct 60
gcccctgtta acactaccac tgaagacgag actgctcaaa ttccagctga agcagttatc 120
ggttactctg accttgaggg tgatttcgac gtcgctgttt tgcctttctc taactccact 180
aacaacggtt tgttgttcat taacaccact atcgcttcca ttgctgctaa ggaagagggt 240
gtctctctcg agaaaagaga ggccgaagct gcacccgatg aggaagatca tgttttagta 300
ttgcataaag gaaatttcga tgaagctttg gccgctcaca aatatctgct cgtcgagttt 360
tacgctccct ggtgcggtca ttgtaaggcc cttgcaccag agtacgccaa ggcagctggt 420
aagttaaagg ccgaaggttc agagatcaga ttagcaaaag ttgatgctac agaagagtcc 480
gatcttgctc aacaatacgg ggttcgagga tacccaacaa ttaagttttt caaaaatggt 540
gatactgctt ccccaaagga atatactgct ggtagagagg cagacgacat agtcaactgg 600
ctcaaaaaga gaacgggccc agctgcgtct acattaagcg acggagcagc agccgaagct 660
cttgtggaat ctagtgaagt tgctgtaatc ggtttcttta aggacatgga atctgattca 720
gctaaacagt tccttttagc agctgaagca atcgatgaca tccctttcgg aatcacctca 780
aatagtgacg tgttcagcaa gtaccaactt gacaaagatg gagtggtctt gttcaaaaag 840
tttgacgaag gcagaaacaa tttcgagggt gaggttacaa aggagaaact gcttgatttc 900
attaaacata accaactacc cttagttatc gaattcactg aacaaactgc tcctaagatt 960
ttcggtggag aaatcaaaac acatatcttg ttgtttttgc caaagtccgt atcggattat 1020
gaaggtaaac tctccaattt caaaaaggcc gctgagagct ttaagggcaa gattttgttc 1080
atctttattg actcagacca cacagacaat cagaggattt tggagttttt cggtttgaaa 1140
aaggaggaat gtccagcagt ccgtttgatc accttggagg aggagatgac caaatacaaa 1200
ccagagtcgg atgagttgac tgccgagaag ataacagaat tttgtcacag atttctggaa 1260
ggtaagatca agcctcatct tatgtctcaa gagttgcctg atgactggga taagcaacca 1320
gttaaagtat tggtgggtaa aaactttgag gaagtggcct tcgacgagaa aaaaaatgtc 1380
tttgttgaat tctatgctcc gtggtgtggt cactgtaagc agctggcacc aatttgggat 1440
aaactgggtg aaacttacaa agatcacgaa aacattgtta ttgcaaagat ggacagtact 1500
gctaacgaag tggaggctgt gaaagttcac tccttcccta cgctgaagtt ctttcctgca 1560
tctgctgaca gaactgttat cgactataat ggagagagga cattggatgg ttttaaaaag 1620
tttcttgaat ccggaggtca agacggagct ggtgacgacg atgatttgga agatctggag 1680
gaggctgagg aacctgatct tgaggaggat gacgaccaga aggcagtcaa agatgaactg 1740
tgataagggg 1750
<210> 6
<211> 7479
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 胶原表达载体 - pDF-Col3A1
<400> 6
ggatccttca gtaatgtctt gtttcttttg ttgcagtggt gagccatttt gacttcgtga 60
aagtttcttt agaatagttg tttccagagg ccaaacattc cacccgtagt aaagtgcaag 120
cgtaggaaga ccaagactgg cataaatcag gtataagtgt cgagcactgg caggtgatct 180
tctgaaagtt tctactagca gataagatcc agtagtcatg catatggcaa caatgtaccg 240
tgtggatcta agaacgcgtc ctactaacct tcgcattcgt tggtccagtt tgttgttatc 300
gatcaacgtg acaaggttgt cgattccgcg taagcatgca tacccaagga cgcctgttgc 360
aattccaagt gagccagttc caacaatctt tgtaatatta gagcacttca ttgtgttgcg 420
cttgaaagta aaatgcgaac aaattaagag ataatctcga aaccgcgact tcaaacgcca 480
atatgatgtg cggcacacaa taagcgttca tatccgctgg gtgactttct cgctttaaaa 540
aattatccga aaaaattttc tagagtgttg ttactttata cttccggctc gtataatacg 600
acaaggtgta aggaggacta aaccatggct aaactcacct ctgctgttcc agtcctgact 660
gctcgtgatg ttgctggtgc tgttgagttc tggactgata ggctcggttt ctcccgtgac 720
ttcgtagagg acgactttgc cggtgttgta cgtgacgacg ttaccctgtt catctccgca 780
gttcaggacc aggttgtgcc agacaacact ctggcatggg tatgggttcg tggtctggac 840
gaactgtacg ctgagtggtc tgaggtcgtg tctaccaact tccgtgatgc atctggtcca 900
gctatgaccg agatcggtga acagccctgg ggtcgtgagt ttgcactgcg tgatccagct 960
ggtaactgcg tgcatttcgt cgcagaagag caggactaac aattgacacc ttacgattat 1020
ttagagagta tttattagtt ttattgtatg tatacggatg ttttattatc tatttatgcc 1080
cttatattct gtaactatcc aaaagtccta tcttatcaag ccagcaatct atgtccgcga 1140
acgtcaacta aaaataagct ttttatgctc ttctctcttt ttttcccttc ggtataatta 1200
taccttgcat ccacagattc tcctgccaaa ttttgcataa tcctttacaa catggctata 1260
tgggagcact tagcgccctc caaaacccat attgcctacg catgtatagg tgttttttcc 1320
acaatatttt ctctgtgctc tctttttatt aaagagaagc tctatatcgg agaagcttct 1380
gtggccgtta tattcggcct tatcgtggga ccacattgcc tgaattggtt tgccccggaa 1440
gattggggaa acttggatct gattacctta gctgcagaaa agggtaccac tgagcgtcag 1500
accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct 1560
gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat caagagctac 1620
caactctttt tccgaaggta actggcttca gcagagcgca gataccaaat actgttcttc 1680
tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca agaactctgt agcaccgcct acatacctcg 1740
ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt 1800
tggacccaag acgatagtta ccggataagg cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt 1860
gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct acaccgaact gagataccta cagcgtgagc 1920
tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca 1980
gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata 2040
gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg 2100
ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg cggccttttt acggttcctg gccttttgct 2160
ggccttttgc tcacatgtat ttaaataatg tatctaaacg caaactccga gctggaaaaa 2220
tgttaccggc gatgcgcgga caatttagag gcggcgatca agaaacacct gctgggcgag 2280
cagtctggag cacagtcttc gatgggcccg agatcccacc gcgttcctgg gtaccgggac 2340
gtgaggcagc gcgacatcca tcaaatatac caggcgccaa ccgagtctct cggaaaacag 2400
cttctggata tcttccgctg gcggcgcaac gacgaataat agtccctgga ggtgacggaa 2460
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ttattgaaag aattcaaaac gatgagcttt gtgcaaaagg ggacctggtt acttttcgct 1140
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<210> 10
<211> 7954
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MMV77
<400> 10
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atgtgcggca cacaataagc gttcatatcc gctgggtgac tttctcgctt taaaaaatta 6600
tccgaaaaaa ttttctagag tgttgttact ttatacttcc ggctcgtata atacgacaag 6660
gtgtaaggag gactaaacca tggctaaact cacctctgct gttccagtcc tgactgctcg 6720
tgatgttgct ggtgctgttg agttctggac tgataggctc ggtttctccc gtgacttcgt 6780
agaggacgac tttgccggtg ttgtacgtga cgacgttacc ctgttcatct ccgcagttca 6840
ggaccaggtt gtgccagaca acactctggc atgggtatgg gttcgtggtc tggacgaact 6900
gtacgctgag tggtctgagg tcgtgtctac caacttccgt gatgcatctg gtccagctat 6960
gaccgagatc ggtgaacagc cctggggtcg tgagtttgca ctgcgtgatc cagctggtaa 7020
ctgcgtgcat ttcgtcgcag aagagcagga ctaacaattg acaccttacg attatttaga 7080
gagtatttat tagttttatt gtatgtatac ggatgtttta ttatctattt atgcccttat 7140
attctgtaac tatccaaaag tcctatctta tcaagccagc aatctatgtc cgcgaacgtc 7200
aact 7204
<210> 20
<211> 6601
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MMV140
<400> 20
gatcaaagga tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa 60
aaaaccaccg ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc 120
gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gttcttctag tgtagccgta 180
gttaggccac cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct 240
gttaccagtg gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg acccaagacg 300
atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag 360
cttggagcga acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc 420
cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg 480
agagcgcacg agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt 540
tcgccacctc tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg 600
gaaaaacgcc agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca 660
catgtattta aataatgtat ctaaacgcaa actccgagct ggaaaaatgt taccggcgat 720
gcgcggacaa tttagaggcg gcgatcaaga aacacctgct gggcgagcag tctggagcac 780
agtcttcgat gggcccgaga tcccaccgcg ttcctgggta ccgggacgtg aggcagcgcg 840
acatccatca aatataccag gcgccaaccg agtgtctcgg aaaacagctt ctggatatct 900
tccgctggcg gcgcaacgac gaataatagt ccctggaggt gacggaatat atatgtgtgg 960
agggtaaatc tgacagggtg tagcaaaggt aatattttcc taaaacatgc aatcggctgc 1020
cccgcaacgg gaaaaagaat gactttggca ctcttcacca gagtggggtg tcccgctcgt 1080
gtgtgcaaat aggctcccac tggtcacccc ggattttgca gaaaaacagc aagttccggg 1140
gtgtctcact ggtgtccgcc aataagagga gccggcaggc acggagttta catcaagctg 1200
tctccgatac actcgactac catccgggtc tctcagagag gggaatggca ctataaatac 1260
cgcctccttg cgctctctgc cttcatcaat caaatcatgc tgaggactcg aattccctag 1320
gatgatgagc tttgtgcaaa aggggacctg gttacttttc gctctgcttc atcccactgt 1380
tattttggca caacagtatc cgtatgatgt gccggattat gcgtctcccc agtacgaagc 1440
atatgatgtc aagtctggag tagcaggagg aggaatcgca ggctatcctg ggccagctgg 1500
tcctcctggc ccacccggac cccctggcac atctggccat cctggtgccc ctggcgctcc 1560
aggataccaa ggtccccccg gtgaacctgg gcaagctggt ccggcaggtc ctccaggacc 1620
tcctggtgct ataggtccat ctggccctgc tggaaaagat ggggaatcag gaagacccgg 1680
acgacctgga gagcgaggat ttcctggccc tcctggtatg aaaggcccag ctggtatgcc 1740
tggattccct ggtatgaaag gacacagagg ctttgatgga cgaaatggag agaaaggcga 1800
aactggtgct cctggattaa agggggaaaa tggcgttcca ggtgaaaatg gagctcctgg 1860
acccatgggt ccaagagggg ctcccggtga gagaggacgg ccaggacttc ctggagccgc 1920
aggggctcga ggtaatgatg gagctcgagg aagtgatgga caaccgggcc cccctggtcc 1980
tcctggaact gcaggattcc ctggttcccc tggtgctaag ggtgaagttg gacctgcagg 2040
atctcctggt tcaagtggcg cccctggaca aagaggagaa cctggacctc agggacatgc 2100
tggtgctcca ggtccccctg ggcctcctgg gagtaatggt agtcctggtg gcaaaggtga 2160
aatgggtcct gctggcattc ctggggctcc tgggctgata ggagctcgtg gtcctccagg 2220
gccacctggc accaatggtg ttcccgggca acgaggtgct gcaggtgaac ccggtaagaa 2280
tggagccaaa ggagacccag gaccacgtgg ggaacgcgga gaagctggtt ctccaggtat 2340
cgcaggacct aagggtgaag atggcaaaga tggttctcct ggagaacctg gtgcaaatgg 2400
acttcctgga gctgcaggag aaaggggtgt gcctggattc cgaggacctg ctggagcaaa 2460
tggccttcca ggagaaaagg gtcctcctgg ggaccgtggt ggcccaggcc ctgcagggcc 2520
cagaggtgtt gctggagagc ccggcagaga tggtctccct ggaggtccag gattgagggg 2580
tattcctggt agccccggag gaccaggcag tgatgggaaa ccagggcctc ctggaagcca 2640
aggagagacg ggtcgacccg gtcctccagg ttcacctggt ccgcgaggcc agcctggtgt 2700
catgggcttc cctggtccca aaggaaacga tggtgctcct ggaaaaaatg gagaacgagg 2760
tggccctgga ggtcctggcc ctcagggtcc tgctggaaag aatggtgaga ccggacctca 2820
gggtcctcca ggacctactg gcccttctgg tgacaaagga gacacaggac cccctggtcc 2880
acaaggacta caaggcttgc ctggaacgag tggtccccca ggagaaaacg gaaaacctgg 2940
tgaacctggt ccaaagggtg aggctggtgc acctggaatt ccaggaggca agggtgattc 3000
tggtgctccc ggtgaacgcg gacctcctgg agcaggaggg ccccctggac ctagaggtgg 3060
agctggcccc cctggtcccg aaggaggaaa gggtgctgct ggtccccctg ggccacctgg 3120
ttctgctggt acacctggtc tgcaaggaat gcctggagaa agagggggtc ctggaggccc 3180
tggtccaaag ggtgataagg gtgagcctgg cagctcaggt gtcgatggtg ctccagggaa 3240
agatggtcca cggggtccca ctggtcccat tggtcctcct ggcccagctg gtcagcctgg 3300
agataagggt gaaagtggtg cccctggagt tccgggtata gctggtcctc gcggtggccc 3360
tggtgagaga ggcgaacagg ggcccccagg acctgctggc ttccctggtg ctcctggcca 3420
gaatggtgag cctggtgcta aaggagaaag aggcgctcct ggtgagaaag gtgaaggagg 3480
ccctcccgga gccgcaggac ccgccggagg ttctgggcct gccggtcccc caggccccca 3540
aggtgtcaaa ggcgaacgtg gcagtcctgg tggtcctggt gctgctggct tccccggtgg 3600
tcgtggtcct cctggccctc ctggcagtaa tggtaaccca ggccccccag gctccagtgg 3660
tgctccaggc aaagatggtc ccccaggtcc acctggcagt aatggtgctc ctggcagccc 3720
cgggatctct ggaccaaagg gtgattctgg tccaccaggt gagaggggag cacctggccc 3780
ccagggccct ccgggagctc caggcccact aggaattgca ggacttactg gagcacgagg 3840
tcttgcaggc ccaccaggca tgccaggtgc taggggcagc cccggcccac agggcatcaa 3900
gggtgaaaat ggtaaaccag gacctagtgg tcagaatgga gaacgtggtc ctcctggccc 3960
ccagggtctt cctggtctgg ctggtacagc tggtgagcct ggaagagatg gaaaccctgg 4020
atcagatggt ctgccaggcc gagatggagc tccaggtgcc aagggtgacc gtggtgaaaa 4080
tggctctcct ggtgcccctg gagctcctgg tcacccaggc cctcctggtc ctgtcggtcc 4140
agctggaaag agcggtgaca gaggagaaac tggccctgct ggtccttctg gggcccccgg 4200
tcctgccgga tcaagaggtc ctcctggtcc ccaaggccca cgcggtgaca aaggggaaac 4260
cggtgagcgt ggtgctatgg gcatcaaagg acatcgcgga ttccctggca acccaggggc 4320
ccccggatct ccgggtcccg ctggtcatca aggtgcagtt ggcagtccag gccctgcagg 4380
ccccagagga cctgttggac ctagcgggcc ccctggaaag gacggagcaa gtggacaccc 4440
tggtcccatt ggaccaccgg ggccccgagg taacagaggt gaaagaggat ctgagggctc 4500
cccaggccac ccaggacaac caggccctcc tggacctcct ggtgcccctg gtccatgttg 4560
tggtgctggc ggggttgctg ccattgctgg tgttggagcc gaaaaagctg gtggttttgc 4620
cccatattat ggagctagcg gttacattcc tgaagctcct agagacggac aagcatacgt 4680
tagaaaggac ggtgagtggg tgttgctgtc caccttctta gctagcgatt acaaggatga 4740
cgacgataag ggatcgtgtt gcccgggctg ctgtcatcac catcatcacc atagatctta 4800
agcggccgcg agtcgtgagt aatcaagagg atgtcagaat gccatttgcc tgagagatgc 4860
aggcttcatt tttgatactt ttttatttgt aacctatata gtataggatt ttttttgtca 4920
ttttgtttct tctcgtacga gcttgctcct gatcagccta tctcgcagct gatgaatatc 4980
ttgtggtagg ggtttgggaa aatcattcga gtttgatgtt tttcttggta tttcccactc 5040
ctcttcagag tacagaagat taagtgagac gttcgtttgt gctccggagg atccttcagt 5100
aatgtcttgt ttcttttgtt gcagtggtga gccattttga cttcgtgaaa gtttctttag 5160
aatagttgtt tccagaggcc aaacattcca cccgtagtaa agtgcaagcg taggaagacc 5220
aagactggca taaatcaggt ataagtgtcg agcactggca ggtgatcttc tgaaagtttc 5280
tactagcaga taagatccag tagtcatgca tatggcaaca atgtaccgtg tggatctaag 5340
aacgcgtcct actaaccttc gcattcgttg gtccagtttg ttgttatcga tcaacgtgac 5400
aaggttgtcg attccgcgta agcatgcata cccaaggacg cctgttgcaa ttccaagtga 5460
gccagttcca acaatctttg taatattaga gcacttcatt gtgttgcgct tgaaagtaaa 5520
atgcgaacaa attaagagat aatctcgaaa ccgcgacttc aaacgccaat atgatgtgcg 5580
gcacacaata agcgttcata tccgctgggt gactttctcg ctttaaaaaa ttatccgaaa 5640
aaattttcta gagtgttgtt actttatact tccggctcgt ataatacgac aaggtgtaag 5700
gaggactaaa ccatggctaa actcacctct gctgttccag tcctgactgc tcgtgatgtt 5760
gctggtgctg ttgagttctg gactgatagg ctcggtttct cccgtgactt cgtagaggac 5820
gactttgccg gtgttgtacg tgacgacgtt accctgttca tctccgcagt tcaggaccag 5880
gttgtgccag acaacactct ggcatgggta tgggttcgtg gtctggacga actgtacgct 5940
gagtggtctg aggtcgtgtc taccaacttc cgtgatgcat ctggtccagc tatgaccgag 6000
atcggtgaac agccctgggg tcgtgagttt gcactgcgtg atccagctgg taactgcgtg 6060
catttcgtcg cagaagagca ggactaacaa ttgacacctt acgattattt agagagtatt 6120
tattagtttt attgtatgta tacggatgtt ttattatcta tttatgccct tatattctgt 6180
aactatccaa aagtcctatc ttatcaagcc agcaatctat gtccgcgaac gtcaactaaa 6240
aataagcttt ttatgctctt ctctcttttt ttcccttcgg tataattata ccttgcatcc 6300
acagattctc ctgccaaatt ttgcataatc ctttacaaca tggctatatg ggagcactta 6360
gcgccctcca aaacccatat tgcctacgca tgtataggtg ttttttccac aatattttct 6420
ctgtgctctc tttttattaa agagaagctc tatatcggag aagcttctgt ggccgttata 6480
ttcggcctta tcgtgggacc acattgcctg aattggtttg ccccggaaga ttggggaaac 6540
ttggatctga ttaccttagc tgcagaaaag ggtaccactg agcgtcagac cccgtagaaa 6600
a 6601
<210> 21
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> α因子Pre
<400> 21
atgagattcc catctatttt caccgctgtc ttgttcgctg cctcctctgc attggct 57
<210> 22
<211> 267
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> α因子Pre pro
<400> 22
atgagattcc catctatttt caccgctgtc ttgttcgctg cctcctctgc attggctgcc 60
cctgttaaca ctaccactga agacgagact gctcaaattc cagctgaagc agttatcggt 120
tactctgacc ttgagggtga tttcgacgtc gctgttttgc ctttctctaa ctccactaac 180
aacggtttgt tgttcattaa caccactatc gcttccattg ctgctaagga agagggtgtc 240
tctctcgaga aaagagaggc cgaagct 267
<210> 23
<211> 1298
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pGCW14-GAP1双向启动子
<400> 23
ttttgttgtt gagtgaagcg agtgacggaa cggtaaaatg taagtaacaa aagaaaaaga 60
gaaccagggg ggggaggaga gtatgtattt ataccgtacg gcaccaggcg aaaagctata 120
aacaaacctt tttcgcggta tatttgttta tatttcctat tttaaactca aaatctgccc 180
taatctggac ttttcatgca aagttatgca cctgaggcag gaatgaagca ggctcgacga 240
cgaaaaggct ggaatgggta actatggatc gattgatttg tctgttgaaa tcttgatttg 300
gcactcgttt aaattaacat tctgcatcat ggtgaattgc ggtcacaggt actggttttt 360
cctgaagctc taggcggtgt tactgttccc acaacttaaa acctaaaaga ggtgggtgct 420
tctttgcgtg ggtgaccaaa aataaaaccg actgcctagt ggcattgata cctttttttg 480
ggtgttgtcc tggaaaccac tgaacgtatc tgcgagatac aaaagtattt ttagataagt 540
ggcaaatgca aaaaatctga ttggtcagtt aatgattgat gaacgacttt aaggttaaaa 600
agcaaaatag tgactgctgc catgtgcctg tatagcacat gaactgatta ttctgttccc 660
acgctacgat gaaaacgcct tctctgccga aagattaaag ctgcgcggga aaaaaaaatt 720
aactttacgg ggcgagcacg gttccccgaa acaaaagatg gttggctttc acccagcgag 780
ctcactggat cccagttaaa aatagttagg tgggttcacc tgtttttgta gaaatgtctt 840
ggtgtcctcg accaatcagg tagccatccc tgaaatacct ggctccgtgg caacaccgaa 900
cgacctgctg gcaacgttaa attctccggg gtaaaactta aatgtggagt aatagaacca 960
gaaacgtctc ttcccttctc tctccttcca ccgcccgtta ccgtccctag gaaattttac 1020
tctgctggag agcttcttct acggccccct tgcagcaatg ctcttcccag cattacgttg 1080
cgggtaaaac ggaggtcgtg tacccgacct agcagcccag ggatggaaag tcccggccgt 1140
cgctggcaat aactgcgggc ggacgcatgt cttgagatta ttggaaacca ccagaatcga 1200
atataaaagg cgaacacctt tcccaatttt ggtttctcct gacccaaaga ctttaaattt 1260
aatttatttg tccctatttc aatcaattga acaactat 1298
<210> 24
<211> 1251
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Das1-Das2双向启动子
<400> 24
ttttgatgtt tgatagtttg ataagagtga actttagtgt ttagaggggt tataatttgt 60
tgtaactggt tttggtctta agttaaaacg aacttgttat attaaacaca acggtcactc 120
aggatacaag aataggaaag aaaaacttta aactggggac atgttgtctt tatataattt 180
ggcggttaac ccttaatgcc cgtttccgtc tcttcatgat aacaaagctg cccatctatg 240
actgaatgtg gagaagtatc ggaacaaccc ttcactaagg atatctaggc taaactcatt 300
cgcgccttag atttctccaa ggtatcggtt aagtttcctc tttcgtactg gctaacgatg 360
gtgttgctca acaaagggat ggaacggcag ctaaagggag tgcatggaat gactttaatt 420
ggctgagaaa gtgttctatt tgtccgaatt tcttttttct attatctgtt cgtttgggcg 480
gatctctcca gtggggggta aatggaagat ttctgttcat ggggtaagga agctgaaatc 540
cttcgtttct tataggggca agtatactaa atctcggaac attgaatggg gtttactttc 600
attggctaca gaaattatta agtttgttat ggggtgaagt taccagtaat tttcattttt 660
tcacttcaac ttttggggta tttctgtggg gtagcataga gcaatgatat aaacaacaat 720
tgagtgacag gtctactttg ttctcaaaag gccataacca tctgtttgca tctcttatca 780
ccacaccatc ctcctcatct ggccttcaat tgtggggaac aactagcatc ccaacaccag 840
actaactcca cccagatgaa accagttgtc gcttaccagt caatgaatgt tgagctaacg 900
ttccttgaaa ctcgaatgat cccagccttg ctgcgtatca tccctccgct attccgccgc 960
ttgctccaac catgtttccg cctttttcga acaagttcaa atacctatct ttggcaggac 1020
ttttcctcct gcctttttta gcctcagctc tcggttagcc tctaggcaaa ttctggtctt 1080
catacctata tcaacttttc atcagatagc ctttgggttc aaaaaagaac taaagcagga 1140
tgcctgatat ataaatccca gatgatctgc ttttgaaact attttcagta tcttgattcg 1200
tttacttaca aacaactatt gttgatttta tctggagaat aatcgaacaa a 1251
<210> 25
<211> 550
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pHTX1双向启动子
<400> 25
tgttgtagtt ttaatatagt ttgagtatga gatggaactc agaacgaagg aattatcacc 60
agtttatata ttctgaggaa agggtgtgtc ctaaattgga cagtcacgat ggcaataaac 120
gctcagccaa tcagaatgca ggagccataa attgttgtat tattgctgca agatttatgt 180
gggttcacat tccactgaat ggttttcact gtagaattgg tgtcctagtt gttatgtttc 240
gagatgtttt caagaaaaac taaaatgcac aaactgacca ataatgtgcc gtcgcgcttg 300
gtacaaacgt caggattgcc accacttttt tcgcactctg gtacaaaagt tcgcacttcc 360
cactcgtatg taacgaaaaa cagagcagtc tatccagaac gagacaaatt agcgcgtact 420
gtcccattcc ataaggtatc ataggaaacg agagtcctcc ccccatcacg tatatataaa 480
cacactgata tcccacatcc gcttgtcacc aaactaatac atccagttca agttacctaa 540
acaaatcaaa 550
Claims (38)
1.一种遗传改造以产生非羟基化胶原的酵母菌株，其包含：
(i)酵母菌株；和
(ii)载体，所述载体包含胶原的DNA序列；胶原启动子的DNA序列；胶原终止子的DNA序列；选择标记物的DNA序列、用于所述选择标记物的启动子的DNA序列；用于所述选择标记物的终止子的DNA序列；选自细菌和酵母的复制起点的DNA序列；以及含有与酵母基因组的同源性的DNA序列，其中所述载体已插入所述酵母菌株中或游离型维持。
2.如权利要求1所述的酵母菌株，其中所述酵母菌株是选自由来自以下属的那些组成的组：阿叙拉属、假丝酵母属、驹形氏酵母属、毕赤氏酵母属、汉逊酵母属、欧伽铁酵母属、糖酵母属、隐球菌属和其组合。
3.如权利要求1所述的酵母菌株，其中所述胶原的DNA序列是选自由以下各项组成的组：牛、猪、袋鼠、钝吻鳄、鳄鱼、大象、长颈鹿、斑马、骆马、羊驼、羔羊、恐龙胶原、海洋生物、细菌和其组合。
4.如权利要求3所述的酵母菌株，其中所述胶原的DNA序列是选自天然胶原DNA、改造的胶原DNA和密码子优化的胶原DNA。
5.如权利要求1所述的酵母菌株，其中所述启动子的DNA序列是选自由以下各项组成的组：AOX1甲醇诱导的启动子的DNA、PDF脱阻抑启动子的DNA、PCAT脱阻抑启动子的DNA、Das1-Das2甲醇诱导的双向启动子的DNA、PHTX1组成型双向启动子的DNA、CHO组织蛋白启动子的DNA、PGCW14-PGAP1组成型双向启动子的DNA和其组合。
6.如权利要求1所述的酵母菌株，其中所述选择标记物的DNA序列是选自由以下各项组成的组：抗生素抗性的DNA和营养缺陷型标记物的DNA。
7.如权利要求6所述的酵母菌株，其中所述抗生素是选自由以下各项组成的组：潮霉素、吉欧霉素、建那霉素和其组合。
8.如权利要求1所述的酵母菌株，其中所述载体通过选自由电穿孔、化学转化和交配组成的组的方法插入所述酵母中。
9.一种产生非羟基化胶原的方法，其包括：
(i)提供根据权利要求1所述的酵母菌株；以及
(ii)使所述菌株在培养基中生长足以产生胶原的时间段。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述酵母菌株是选自由来自以下属的那些组成的组：阿叙拉属、假丝酵母属、驹形氏酵母属、毕赤氏酵母属、汉逊酵母属、欧伽铁酵母属、糖酵母属、隐球菌属和其组合。
11.如权利要求9所述的方法，其中所述培养基是选自由以下各项组成的组：缓冲的甘油复合培养基(BMGY)、缓冲的甲醇复合培养基(BMMY)和酵母提取物蛋白胨右旋糖(YPD)。
12.如权利要求9所述的方法，其中所述时间段是24小时到72小时。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述酵母是选自由来自以下属的那些组成的组：阿叙拉属、假丝酵母属、驹形氏酵母属、毕赤氏酵母属、汉逊酵母属、欧伽铁酵母属、糖酵母属、隐球菌属和其组合。
14.如权利要求9所述的方法，其中所述胶原的DNA序列是选自由以下各项组成的组：牛、猪、袋鼠、钝吻鳄、鳄鱼、大象、长颈鹿、斑马、骆马、羊驼、羔羊、恐龙胶原和其组合。
15.如权利要求9所述的方法，其中所述启动子的DNA序列是选自由以下各项组成的组：PHTX1组成型双向启动子的DNA和PGCW14-PGAP1组成型双向启动子的DNA。
16.如权利要求9所述的方法，其中所述选择标记物的DNA序列是选自由以下各项组成的组：抗生素抗性DNA的DNA和营养缺陷型标记物的DNA。
17.一种遗传改造以产生羟基化胶原的酵母菌株，其包含：
(i)酵母菌株；
(ii)载体，所述载体包含胶原的DNA序列、胶原启动子的DNA序列、终止子的DNA序列、选择标记物的DNA序列、用于所述选择标记物的启动子的DNA序列、用于所述选择标记物的终止子的DNA序列、用于细菌和/或酵母的复制起点的DNA序列、含有与酵母基因组的同源性的DNA序列，其中所述载体已插入所述酵母菌株中；以及
(iii)第二载体，所述第二载体包含P4HA1的DNA序列、P4HB的DNA序列以及启动子的至少一个DNA序列，其中所述载体已插入所述酵母菌株中。
18.如权利要求17所述的酵母菌株，其中所述酵母菌株是选自由来自以下属的那些组成的组：阿叙拉属、假丝酵母属、驹形氏酵母属、毕赤氏酵母属、汉逊酵母属、欧伽铁酵母属、糖酵母属、隐球菌属和其组合。
19.如权利要求17所述的酵母菌株，其中所述胶原的DNA序列是选自由以下各项组成的组：牛、猪、袋鼠、钝吻鳄、鳄鱼、大象、长颈鹿、斑马、骆马、羊驼、羔羊、恐龙胶原和其组合。
20.如权利要求19所述的酵母菌株，其中所述胶原的DNA序列是选自天然胶原DNA、改造的胶原DNA和优化的胶原DNA。
21.如权利要求17所述的酵母菌株，其中所述启动子的DNA序列是选自由以下各项组成的组：AOX1甲醇诱导的启动子的DNA、PDF脱阻抑启动子的DNA、PCAT脱阻抑启动子的DNA、Das1-Das2甲醇诱导的双向启动子的DNA、PHTX1组成型双向启动子的DNA、CHO组织蛋白启动子的DNA、PGCW14-PGAP1组成型双向启动子的DNA和其组合。
22.如权利要求21所述的酵母菌株，其中所述启动子的DNA序列是选自由以下各项组成的组：PHTX1组成型双向启动子的DNA和PGCW14-PGAP1组成型双向启动子的DNA。
23.如权利要求17所述的酵母菌株，其中所述选择标记物的DNA序列是选自由以下各项组成的组：抗生素抗性DNA的DNA和营养缺陷型标记物的DNA。
24.如权利要求23所述的酵母菌株，其中所述抗生素是选自由以下各项组成的组：潮霉素、吉欧霉素、建那霉素和其组合。
25.如权利要求17所述的酵母菌株，其中所述载体通过选自由电穿孔、化学转化和交配组成的组的方法插入所述酵母中。
26.一种产生羟基化胶原的方法，其包括：
(iii)提供根据权利要求17所述的酵母菌株；以及
(iv)使所述菌株在培养基中生长足以产生胶原的时间段。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述酵母菌株是选自由来自以下属的那些组成的组：阿叙拉属、假丝酵母属、驹形氏酵母属、毕赤氏酵母属、汉逊酵母属、欧伽铁酵母属、糖酵母属、隐球菌属和其组合。
28.如权利要求26所述的方法，其中所述培养基是选自由以下各项组成的组：BMGY、BMMY和YPD。
29.如权利要求26所述的方法，其中所述时间段是24小时到72小时。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述酵母是选自由来自以下属的那些组成的组：阿叙拉属、假丝酵母属、驹形氏酵母属、毕赤氏酵母属、汉逊酵母属、欧伽铁酵母属、糖酵母属、隐球菌属和其组合。
31.如权利要求26所述的方法，其中所述胶原的DNA是选自由以下各项组成的组：牛、猪、袋鼠、钝吻鳄、鳄鱼、大象、长颈鹿、斑马、骆马、羊驼、羔羊、恐龙胶原和其组合。
32.如权利要求26所述的方法，其中所述启动子的DNA是选自由以下各项组成的组：PHTX1组成型双向启动子的DNA和PGCW14-PGAP1组成型双向启动子的DNA。
33.如权利要求26所述的方法，其中所述选择标记物的DNA是选自由以下各项组成的组：抗生素抗性DNA的DNA和营养缺陷型标记物的DNA。
34.一种全合一载体，其包含：
(i)产生胶原所必需的DNA，包括启动子和终止子；
(ii)选自由P4HA1和P4HB组成的组的羟基化酶的DNA，包括启动子和终止子；
(iii)选择标记物的DNA，包括启动子和终止子；
(iv)用于酵母和细菌的复制起点的DNA；
(v)用于整合到基因组中的与酵母基因组具有同源性的DNA；以及
(vi)在选自由5’、3’、上述DNA内和其组合组成的组的位置处的限制位点，其允许模块化克隆。
35.如权利要求34所述的全合一载体，其中产生胶原所必需的DNA序列是选自由以下各项组成的组：牛、猪、袋鼠、钝吻鳄、鳄鱼、大象、长颈鹿、斑马、骆马、羊驼、羔羊、恐龙和其组合。
36.如权利要求34所述的全合一载体，其中所述启动子的DNA序列是选自由以下各项组成的组：PHTX1组成型双向启动子的DNA和PGCW14-PGAP1组成型双向启动子的DNA。
37.如权利要求34所述的全合一载体，其中所述选择标记物的DNA序列是选自由以下各项组成的组：抗生素抗性的DNA和营养缺陷型标记物的DNA。
38.如权利要求37所述的全合一载体，其中所述抗生素是选自由以下各项组成的组：潮霉素、吉欧霉素、建那霉素和其组合。
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