BR102018013305A2

BR102018013305A2 - Estirpe de levedura, métodos para produzir colágeno não hidroxilado e hidroxilado, e, vetor multifuncional

Info

Publication number: BR102018013305A2
Application number: BR102018013305-5A
Authority: BR
Inventors: Lixin DAI; Julia Borden; Jeffrey Nelson; Kristin Ruebling-Jass
Original assignee: Modern Meadow, Inc.
Priority date: 2017-06-29
Filing date: 2018-06-28
Publication date: 2019-03-12
Also published as: JP2019010096A; JP7208722B2; US20190002893A1; CN109207387A; EP3473647A1; KR20190002363A; US11312968B2; CA3008850A1

Abstract

estirpe de levedura, métodos para produzir colágeno não hidroxilado e hidroxilado, e, vetor multifuncional descreve-se estirpes de levedura geneticamente manipuladas para produzir quantidades de colágeno não hidroxilado ou colágeno hidroxilado aumentadas. descreve-se também um vetor multifuncional, incluindo o dna necessário para produzir colágeno, promotores e enzimas de hidroxilação. fornece-se também métodos para a produção de colágeno não hidroxilado ou hidroxilado.

Description

“ESTIRPE DE LEVEDURA, MÉTODOS PARA PRODUZIR COLÁGENO NÃO HIDROXILADO E HIDROXILADO, E, VETOR MULTIFUNCIONAL”

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS [0001] Este pedido está relacionado ao Pedido de Patente U.S. No. 62/526,912, depositado em 29 de junho de 2017, sendo que todo o seu conteúdo é incorporado por referência.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Campo da invenção [0002] Esta invenção diz respeito a estirpes de levedura manipuladas e métodos para produzir colágeno. Manipulam-se as estirpes para aumentar a quantidade de colágeno produzido e melhorar a estabilidade do colágeno produzido. O colágeno pode ser útil para a produção de materiais de couro biofabricados e semelhantes.

Descrição da Técnica Relacionada [0003] Couro. Utiliza-se couro em uma ampla variedade de aplicações, incluindo estofamento de móveis, roupas, sapatos, malas, bolsas, acessórios e aplicações automotivas. O valor comercial global estimado em couro é de aproximadamente US $ 100 bilhões por ano (Tendências Futuras no Mundo Indústria e Comércio de Produtos de Couro, Organização das Nações Unidas para o Desenvolvimento Industrial, Viena, 2010) e há uma demanda contínua e crescente por produtos de couro. São necessárias novas formas de atender a essa demanda em vista dos custos econômicos, ambientais e sociais da produção de couro. Para acompanhar as tendências tecnológicas e estéticas, os produtores e usuários de produtos de couro buscam novos materiais que exibem resistência superior, uniformidade, processabilidade e propriedades estéticas elegantes e atraentes que incorporam componentes naturais.

[0004] Dado o crescimento populacional e o ambiente global, haverá a necessidade de materiais alternativos que tenham estética semelhante ao

Petição 870180055798, de 28/06/2018, pág. 10/81 / 51 couro e funcionalidades aprimoradas. O couro é pele de animal e consiste quase inteiramente de colágeno. Existe uma necessidade de uma fonte de colágeno que possa ser convertida em materiais de couro biofabricados.

[0005] Colágeno. O colágeno é o principal componente do couro. A pele, ou couro de animais, contém quantidades significativas de colágeno, uma proteína fibrosa. O colágeno é um termo genérico para uma família de pelo menos 28 tipos distintos de colágeno; a pele do animal é, normalmente, colágeno tipo I, embora outros tipos de colágeno possam ser utilizados na formação de couro, incluindo o colágeno tipo III.

[0006] Os colágenos são caracterizados pela repetição de um tripleto de aminoácidos, -(Gly-X-Y)_w- e aproximadamente um terço dos resíduos de aminoácidos nos colágenos são glicina. X, muitas vezes, é prolina e Y, muitas vezes, é hidroxiprolina, embora possa haver até 400 tripletos de Gly-X-Y possíveis. Diferentes animais podem produzir diferentes composições de aminoácidos do colágeno, o que pode resultar em propriedades diferentes e em diferenças no couro resultante.

[0007] A estrutura de colágeno pode consistir em três cadeias peptídicas entrelaçadas de comprimentos diferentes. Hélices triplas de colágenos (ou monômeros) podem ser produzidas a partir de cadeias alfa de cerca de 1.050 aminoácidos de comprimento, de modo que a hélice tripla assuma a forma de uma haste com aproximadamente 300 nm de comprimento, com um diâmetro de aproximadamente 1,5 nm.

[0008] As fibras de colágeno podem ter uma faixa de diâmetros, dependendo do tipo de pele de animal. Além do colágeno tipo I, a pele (couro) também pode incluir outros tipos de colágeno, incluindo colágeno tipo III (reticulina), colágeno tipo IV e colágeno tipo VII.

[0009] Existem vários tipos de colágeno em todo o corpo dos mamíferos. Por exemplo, além de ser o principal componente da pele e do couro animal, o colágeno tipo I também é presente na cartilagem, no tendão,

Petição 870180055798, de 28/06/2018, pág. 11/81 / 51 na ligadura vascular, nos órgãos, nos músculos e na porção orgânica do osso. Esforços bem-sucedidos foram realizados para isolar o colágeno de várias regiões do corpo de mamíferos, além da pele ou couro do animal. Décadas atrás, pesquisadores descobriram que, em pH neutro, o colágeno solubilizado por ácido se auto montava em fibrilas compostas pelos mesmos padrões cruzados que se observavam no tecido nativo; Schmitt FO J. Cell. Comp Physiol. 1942;20:11). Isso levou a utilização de colágeno na engenharia de tecidos e uma variedade de aplicações biomédicas. Em anos mais recentes, o colágeno foi colhido de bactérias e leveduras utilizando técnicas recombinantes.

[00010] Independentemente do tipo de colágeno, todos são formados e estabilizados através de uma combinação de interações físicas e químicas, incluindo interações eletrostáticas incluindo interações de pontes de sal, ligações de hidrogênio, de Van der Waals, forças dipolo-dipolo, forças de polarização, interações hidrofóbicas e ligações covalentes, muitas vezes catalisadas por reações enzimáticas. Para fibrilas de colágeno Tipo I, fibras e feixes de fibras, alcança-se sua montagem complexa in vivo durante o desenvolvimento e é fundamental para fornecer suporte mecânico ao tecido ao passo que permite a mobilidade celular e o transporte de nutrientes. Vários tipos distintos de colágenos foram identificados em vertebrados. Estes incluem colágenos bovino, ovino,_suíno, de frango e humano.

[00011] Em geral, os tipos de colágeno são numerados por algarismos romanos e as cadeias encontradas em cada tipo de colágeno são identificadas por algarismos arábicos. Descrições detalhadas da estrutura e funções biológicas dos vários tipos diferentes de colágenos de ocorrência natural são disponíveis na técnica; vide, por exemplo, Ayad et al. (1998) The Extracellular Matrix Facts Book, Academic Press, San Diego, CA; Burgeson, R E., e Nimmi (1992) Collagen types: Molecular Structure and Tissue Distribution em Clin. Orthop. 282:250-272; Kielty, C. M. et al. (1993) The

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Collagen Family: Structure, Assembly And Organization In The Extracellular Matrix, Connective Tissue And Its Heritable Disorders, Molecular Genetics, And Medical Aspects, Royce, P. M. e B. Steinmann eds., Wiley-Liss, NY, pp. 103-147; e Prockop, D.J- e K. I. Kivirikko (1995) Collagens: Molecular Biology, Diseases, and Potentials for Therapy, Annu. Rev. Biochem., 64:403-434).

[00012] O colágeno tipo I é o principal colágeno fibrilar de osso e pele, compreendendo aproximadamente 80% a 90% do colágeno total de um organismo. O colágeno tipo I é a macromolécula estrutural principal presente na matriz extracelular de organismos multicelulares e compreende aproximadamente 20% da massa total de proteínas. O colágeno tipo I é uma molécula heterotrimérica que compreende duas cadeias α1 (I) e uma cadeia α2 (I), codificadas pelos genes COL1A1 e COL1A2, respectivamente. Outros tipos de colágeno são menos abundantes que o colágeno tipo I e exibem padrões de distribuição diferentes. Por exemplo, o colágeno tipo II é o colágeno predominante em cartilagem e humor vítreo, ao passo que o colágeno tipo III é encontrado em níveis elevados nos vasos sanguíneos e, em menor grau, na pele.

[00013] O colágeno tipo II é um colágeno homotrimérico compreendendo três cadeias idênticas de al(II) codificadas pelo gene COL2A1. O colágeno tipo II purificado pode ser preparado a partir de tecidos por métodos conhecidos na arte, por exemplo, por procedimentos descritos em Miller e Rhodes (1982) Methods In Enzymology 82:33-64.

[00014] O colágeno tipo III é um importante colágeno fibrilar encontrado na pele e nos tecidos vasculares. O colágeno tipo III é um colágeno homotrimérico compreendendo três cadeias a1(III) idênticas codificadas pelo gene COL3A1.Os métodos para purificar o colágeno tipo III dos tecidos podem ser encontrados, por exemplo, em Byers et al. (1974) Biochemistry 13:5243-5248; e Miller e Rhodes, supra.

Petição 870180055798, de 28/06/2018, pág. 13/81 / 51 [00015] Encontra-se colágeno tipo IV em membranas basais na forma de folhas em vez de fibrilas. Mais comumente, o colágeno tipo IV contém duas cadeias α1 (IV) e uma cadeia α2 (IV). As cadeias particulares compreendendo colágeno tipo IV são específicas do tecido. O colágeno tipo IV pode ser purificado utilizando, por exemplo, os procedimentos descritos em Furuto e Miller (1987) Methods in Enzymology, 144:41-61, Academic Press.

[00016] O colágeno tipo V é um colágeno fibrilar encontrado principalmente em ossos, tendões, córnea, pele e vasos sanguíneos. O colágeno tipo V existe tanto em formas homotriméricas como heterotriméricas. Uma forma de colágeno tipo V é um heterotrímero de duas cadeias α1 (V) e uma cadeia α2 (V). Outra forma de colágeno do tipo V é um heterotrímero das cadeias α1 (V), α2 (V) e α3 (V). Uma forma adicional de colágeno tipo V é um homotrímero de a1(V). Métodos para isolar o colágeno tipo V de fontes naturais podem ser encontrados, por exemplo, em Elstow e Weiss (1983) Collagen Rel. Res. 3:181-193, e Abedin et al. (1982) Biosci. Rep. 2:493-502.

[00017] O colágeno tipo VI possui uma região helicoidal tripla pequena e duas porções remanescentes não colagenosas grandes. O colágeno tipo VI é um heterotrímero que compreende as cadeias a1(VI), a2(VI) e a3(VI). Encontra-se colágeno tipo VI em muitos tecidos conjuntivos. Descrições de como purificar o colágeno tipo VI de fontes naturais podem ser encontradas, por exemplo, em Wu et al. (1987) Biochem.J.248:373-381, e Kielty et al. (1991) J. Cell Sci. 99:797-807.

[00018] O colágeno tipo VII é um colágeno fibrilar encontrado em determinados tecidos epiteliais. O colágeno tipo VII é uma molécula homotrimérica de três cadeias a1(VII). Descrições de como purificar o colágeno tipo VII do tecido podem ser encontradas, por exemplo, em Lunstrum et al. (1986) J. Biol. Chem. 261:9042-9048 e Bentz et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 80:3168-317. O colágeno tipo VIII pode ser

Petição 870180055798, de 28/06/2018, pág. 14/81 / 51 encontrado na membrana de Descemet na córnea. O colágeno tipo VIII é um heterotrímero que compreende duas cadeias a1(VIII) e uma cadeia a2(VIII), embora outras composições de cadeias tenham sido relatadas. Métodos para a purificação de colágeno tipo VIII da natureza podem ser encontrados, por exemplo, em Benya e Padilla (1986) J. Biol. Chem. 261:4160-4169, e Kapoor et al. (1986) Biochemistry 25:3930-3937.

[00019] O colágeno tipo IX é um colágeno associado à fibrila encontrado em cartilagem e humor vítreo. O colágeno tipo IX é uma molécula heterotrimérica que compreende cadeias a1(IX), a2(IX) e a3(IX). O colágeno tipo IX foi classificado como um colágeno FACIT (Colágenos associados à fibrilação com hélice tripla interrompida), possuindo vários domínios helicoidais triplas separados por domínios helicoidais não triplos. Os procedimentos para purificar o colágeno tipo IX podem ser encontrados, por exemplo, em Duance, et al. (1984) Biochem.J.221:885-889; Ayad et al. (1989) Biochem.J.262:753-761; e Grant et al. (1988) The Control of Tissue Damage, Glauert, A.M., ed., Elsevier Science Publishers, Amsterdam, pp. 328.

[00020] O colágeno tipo X é um composto homotrimérico de cadeias a1(X). O colágeno tipo X foi isolado de, por exemplo, cartilagem hipertrófica encontrada em placas de crescimento; vide, por exemplo, Apte et al. (1992) Eur J Biochem 206 (1):217-24.

[00021] O colágeno tipo XI pode ser encontrado em tecidos cartilaginosos associados a colágenos tipo II, tipo IX e em outros locais do corpo. O colágeno tipo XI é uma molécula heterotrimérica que compreende cadeias a1(XI), a2(XI) e a3(XI). Os métodos de purificação de colágeno tipo XI podem ser encontrados, por exemplo, em Grant et al. supra.

[00022] O colágeno tipo XII é um colágeno FACIT encontrado principalmente em associação com o colágeno tipo I.O colágeno tipo XII é uma molécula homotrimérica compreendendo três cadeias a1(XII). Métodos

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Ί / 51 para purificar o colágeno tipo XII e suas variantes podem ser encontrados, por exemplo, em Dublet et al. (1989) J. Biol. Chem.264:13150-13156; Lunstrum et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:20087-20092; e Watt et al. (1992) J. Biol. Chem. 26Ί:20093-20099.

[00023] O tipo XIII é um colágeno não fibrilar encontrado, por exemplo, na pele, intestino, osso, cartilagem e músculo estriado. Uma descrição detalhada do colágeno tipo XIII pode ser encontrada, por exemplo, em Juvonen et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:24700-24707.

[00024] O tipo XIV é um colágeno FACIT caracterizado como uma molécula homotrimérica compreendendo cadeias a1(XIV). Métodos para isolar o colágeno tipo XIV podem ser encontrados, por exemplo, em AubertFoucher et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:15759-15764, e Watt et al., supra.

[00025] O colágeno tipo XV é homólogo em estrutura ao colágeno tipo XVIII. Informações sobre a estrutura e isolamento do colágeno tipo XV natural podem ser encontradas, por exemplo, em Myers et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10144-10148; Huebner et al. (1992) Genomics 14:220-224; Kivirikko et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:4773-4779; e Muragaki, J.(1994) Biol. Chem. 264:4042-4046.

[00026] O colágeno tipo XVI é um colágeno associado à fibrila, encontrado, por exemplo, na pele, nos fibroblastos pulmonares e nos queratinócitos. Informações sobre a estrutura do colágeno tipo XVI e o gene que codifica o colágeno tipo XVI podem ser encontradas, por exemplo, em Pan et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6565-6569; e Yamaguchi et al. (1992) J .Biochem.112:856-863.

[00027] O colágeno tipo XVII é um colágeno transmembranar hemidesmosal, também conhecido no antígeno do penfigoide bolhoso. Informações sobre a estrutura do colágeno tipo XVII e o gene que codifica o colágeno tipo XVII podem ser encontradas, por exemplo, em Li et al. (1993)

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J. Biol. Chem. 268(12):8825-8834; e McGrath et al. (1995) Nat. Genet. 11(1):83-86.

[00028] O colágeno tipo XVIII é semelhante em estrutura ao colágeno tipo XV e pode ser isolado do fígado. Descrições das estruturas e isolamento do colágeno tipo XVIII a partir de fontes naturais podem ser encontradas, por exemplo, em Rehn e Pihlajaniemi (1994) Proc. Natl. Acad. Sci USA 91:42344238; Oh et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci USA 91:4229-4233; Rehn et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:13924-13935; e Oh et al. (1994) Genomics 19: 494-499.

[00029] Acredita-se que o colágeno tipo XIX seja outro membro da família de colágeno FACIT e foi encontrado em mRNA isolado de células de rabdomiossarcoma. Descrições das estruturas e isolamento do colágeno tipo XIX podem ser encontradas, por exemplo, em Inoguchi et al. (1995) J .Biochem.117:137-146; Yoshioka et al. (1992) Genomics 13:884-886; e Myers et al.,J. Biol. Chem. 289:18549-18557 (1994).

[00030] O colágeno tipo XX é um membro recém encontrado da família colágena FACIT e foi identificado na córnea de pintinho. (Vide, por exemplo, Gordon et al. (1999) FASEB Journal 13:A1119; e Gordon et al. (1998), IOVS 39:S1128.) [00031] Qualquer tipo de colágeno, colágeno truncado, não modificado ou pós-traducionalmente modificado, ou colágeno modificado por sequência de aminoácido que pode ser fibrilado e reticulado pelos métodos descritos neste documento pode ser utilizado para produzir um material biofabricado ou couro biofabricado. O couro biofabricado pode conter um colágeno substancialmente homogêneo, tal como apenas colágeno Tipo I ou Tipo III ou pode conter misturas de 2, 3, 4 ou mais tipos diferentes de colágeno.

[00032] Colágeno Recombinante.

[00033] A expressão recombinante de colágeno e proteínas semelhantes ao colágeno é conhecida por Bell, EP 1232182B1, Bovine collagen and

Petição 870180055798, de 28/06/2018, pág. 17/81 / 51 method for producing recombinant gelatin; Olsen, et al., Pat. US No. 6,428,978, Methods for the production of gelatin and full-length triple helical collagen in recombinant cells; VanHeerde, et al., Pat. US No. 8,188,230, Method for recombinant microorganism expression and isolation of collagenlike polypeptides, divulgações das quais são incorporadas neste documento por referência. Tais colágenos recombinantes não foram utilizados para produzir couro.

[00034] Expressão procariótica. Em sistemas procarióticos, tais como sistemas bacterianos, diversos vetores de expressão podem ser selecionados vantajosamente dependendo da utilização destinada ao polipeptídeo expresso. Por exemplo, ao se produzir quantidades grandes de colágenos e gelatinas animais da invenção, tal como para geração de anticorpos, podem ser desejáveis vetores que dirigem a expressão de níveis elevados de produtos de proteínas de fusão que são facilmente purificados. Tais vetores incluem, mas não são limitados, do vetor de expressão de E. coli pUR278 (Ruther et al. (1983) EMBO J. 2: 1791), no qual a sequência de codificação pode ser ligada dentro vetor em enquadramento com a região de codificação lac Z, de modo que se produz a proteína AS-lacZ híbrida; vetores pIN (Inouye et al. (1985) Nucleic Acids Res.13: 3101-3109 e Van Heeke et al. (1989) J. Biol. Chem. 264: 5503-5509); e similares, as divulgações das quais são incorporadas neste documento por referência. Vetores pGEX também podem ser utilizados para expressar polipeptídeos estrangeiros como proteínas de fusão com a glutationa S-transferase (GST). Em geral, tais proteínas de fusão são solúveis e podem ser facilmente purificadas a partir de células lisadas por adsorção a grânulos glutationa-agarose, seguida de eluição na presença de glutationa livre. Os vetores pGEX são projetados para incluir trombina ou os locais de clivagem da protease de fator Xa de modo que o polipeptídeo clonado possa ser liberado da fração GST. Um colágeno recombinante pode compreender moléculas de colágeno que não foram modificadas pós-traducionalmente, por

Petição 870180055798, de 28/06/2018, pág. 18/81 / 51 exemplo, não glicosilado ou hidroxilado, ou pode compreender uma ou mais modificações pós-tradução, por exemplo, modificações que facilitam a fibrilação e formação de fibrilas desagregadas e aleatoriamente orientadas de moléculas de colágeno.

[00035] Uma molécula de colágeno recombinante pode compreender um fragmento da sequência de aminoácidos de uma molécula de colágeno nativa que pode formar fibrilas de sequência triméricas ou uma molécula de colágeno modificada ou molécula de colágeno truncada com uma sequência de aminoácidos pelo menos 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica ou semelhante a uma sequência de aminoácidos de colágeno nativo (ou para uma região de formação de fibrila destes ou para um segmento compreendendo, substancialmente, [Gly-X-Y]_w), tal como aquelas de colágeno bovino, descritas por SEQ ID NOS:1, 2 ou 3 e por sequência de aminoácidos de Col1A1, Col1A2 e Col3A1, descritas pelo Número de Acessão. NP_001029211.1 (https://_www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/77404252, último acesso em 9 de fevereiro de 2017), NP_776945.1 (https://_www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/27806257 último acesso em 9 de fevereiro de 2017) e NP_001070299.1 (https://_www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/116003881 último acesso em 9 de fevereiro de 2017) que são incorporados neste documento por referência. (Esses links foram inativados pela inclusão de um sublinhado após a barra dupla.) [00036] Tais moléculas de colágenos recombinantes ou modificadas compreenderão, em geral, compreender as sequência repetidas -(Gly-X-Y)_wdescritas neste documento.

[00037] A BLASTN pode ser utilizado para identificar uma sequência polinucleotídica com uma identidade de sequência de pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97,5%, 98% ou 99% com uma referência polinucleotídica tal como um polinucleotídeo codificando um

Petição 870180055798, de 28/06/2018, pág. 19/81 / 51 polipeptídeo de colágeno ou codificando as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOS:1, 2 ou 3.Uma configuração de BLASTN representativa otimizada para encontrar sequências altamente semelhantes utiliza um Expect Threshold (Limiar Esperado, tradução livre) de 10 e um Wordsize (Tamanho de Palavras) de 28, correspondências máximas na faixa de consulta de 0, pontuações de correspondência/incompatibilidade de 1/-2 e custo de lacuna linear. Regiões de baixa complexidade podem ser filtradas ou mascaradas. As configurações padrão de um BLAST padrão de nucleotídico são descritas e incorporadas por referência a https://_blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE= BlastSearch&LINK_LOC=blasthome (último acesso em 27 de janeiro de 2017).

[00038] O BLASTP pode ser utilizado para identificar uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97,5%, 98% ou 99% de identidade de sequência ou semelhança com um aminoácido de referência, tal como uma sequência de aminoácido de colágeno, utilizando uma matriz de semelhança tal como BLOSUM45, BLOSUM62 ou BLOSUM80, na qual BLOSUM45 pode ser utilizado para sequências aproximadamente relacionadas, BLOSUM62 para sequência de intervalo médio e BLOSUM80 para sequência mais distantemente relacionadas. Exceto quando indicado, uma pontuação de similaridade será baseada no escore de BLOSUM62. Quando o BLASTP é utilizado, a similaridade percentual é baseada no escore positiva de BLASTP e a identidade de sequência percentual é baseada no escore de identidades do BLASTP. As identidades BLASTP mostram o número e a fração de resíduos totais nos pares de sequências de alta pontuação que são idênticos; e Positivos BLASTP mostra o número e a fração de resíduos para os quais os escores de alinhamento têm valores positivos e que são semelhantes entre si. As sequências de aminoácidos com estes graus de identidade ou semelhança

Petição 870180055798, de 28/06/2018, pág. 20/81 / 51 ou qualquer grau intermédio de identidade ou semelhança com as sequências de aminoácidos divulgadas neste documento são contempladas e abrangidas por esta divulgação. Uma configuração de BLASTP representativa que utiliza um Expect Threshold de 10, um Word Size de 3, BLOSUM 62 como uma matriz e Penalidade de Gap de 11 (Existência) e 1 (Extensão) e um ajuste de matriz de escore condicional de composição. Outras configurações padrão para BLASTP são descritas e incorporadas por referência à divulgação disponível em:https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE_TYP E=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome (última acesso em 27 de janeiro de 2017).

[00039] Expressão levedura. Moléculas de colágeno podem ser produzidas em um sistema de expressão de levedura. Na levedura, pode ser utilizado diversos vetores contendo promotores constitutivos ou indutíveis conhecidos na técnica; Ausubel et al., supra, Vol.2, Capítulo 13; Grant et al. (1987) Expression and Secretion Vectors for Yeast, em Methods in Enzymology, Ed. Wu & Grossman, Acad. Press, N.Y.153:516-544; Glover (1986) DNA Cloning, Vol. II, IRL Press, Wash., D.C.,Ch.3; Bitter (1987) Heterologous Gene Expression in Yeast, em Methods in Enzymology, Eds. Berger & Kimmel, Acad. Press, N.Y. 152:673-684; e The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Eds. Strathern et al. Cold Spring Harbor Press, Vols. I e II (1982), as divulgações das quais são incorporadas neste documento por referência.

[00040] O colágeno pode ser expresso utilizando células hospedeiras, por exemplo, da levedura Saccharomyces cerevisiae. Esta levedura, particularmente, pode ser utilizada com qualquer um de um grande número de vetores de expressão. Vetores de expressão utilizados normalmente são vetores de transporte contendo a origem 2P de replicação para propagação em levedura e a origem Col E1 para E. coli, para transcrição eficiente do gene

Petição 870180055798, de 28/06/2018, pág. 21/81 / 51 estrangeiro. Um exemplo típico de tais vetores baseado em plasmídeos 2P é o pWYG4, que tem os elementos 2P ORI-STB, o promotor GAL1-10 e o terminador de gene 2P D. Neste vetor, utiliza-se um local de clonagem Ncol para inserir o gene para o polipeptídeo a ser expresso e para fornecer o códon de iniciação ATG. Outro vetor de expressão é o pWYG7L, que possui 2aORI, STB, REP1 e REP2 intactos e o promotor GAL1-10 e utiliza o terminador FLP. Neste vetor, o polinucleotídeo codificante é inserido no poliligante com as suas extremidades 5' em um local Bam HI ou Ncol. O vetor contendo o polinucleotídeo inserido é transformado em S. cerevisiae ou após a remoção da parede celular para produzir esferoplastos que absorvem DNA no tratamento com cálcio e polietileno glicol ou por tratamento de células intactas com íons de lítio.

[00041] Alternativamente, o DNA pode ser introduzido por eletroporação. Os transformantes podem ser selecionados, por exemplo, utilizando células de levedura hospedeiras que são auxotróficas para leucina, triptofano, uracilo ou histidina em conjunto com genes marcadores selecionáveis tais como LEU2, TRP1, URA3, HIS3 ou LEU2-D.

[00042] Em uma modalidade, os polinucleotídeo que codificam colágeno são introduzidos em células hospedeiras da levedura Pichia. Espécies de levedura não Saccharomyces tais como Pichia pastoris parecem ter vantagens especiais na produção de rendimentos altos de proteína recombinante em procedimentos ampliados. Adicionalmente, um kit de expressão Pichia é disponibilizado da Invitrogen Corporation (San Diego, CA).

[00043] Há diversos genes responsivos ao metanol em leveduras metilotróficas, tais como Pichia pastoris, sendo que a expressão de cada um controlada por regiões reguladoras responsivas ao metanol, também referenciadas como promotores. Qualquer um de tais promotores responsivos ao metanol é adequado para utilização na prática da presente invenção. Exemplos de regiões reguladoras específicas incluem o promotor AOX1, o

Petição 870180055798, de 28/06/2018, pág. 22/81 / 51 promotor AOX2, a dihidroxiacetona sintase (DAS), o promotor P40 e o promotor para o gene catalase de P. pastoris etc.

[00044] Também foi utilizada levedura metilotrófica Hansenula polymorpha. O crescimento do metanol resulta na indução de enzimas chave do metabolismo do metanol, tais como MOX (metanol oxidase), DAS (dihidroxiacetona sintase) e FMDH (formia desidrogenase). Estas enzimas podem constituir até de 30 a 40% da proteína celular total. Os genes que codificam a produção de MOX, DAS e FMDH são controlados por promotores fortes induzidos por crescimento em metanol e reprimidos por crescimento em glicose. Qualquer um ou todos esses três promotores podem ser utilizados para obter expressão de alto nível de genes heterólogos em H. polymorpha. Portanto, em um aspecto, um polinucleotídeo que codifica o colágeno animal, fragmentos ou variantes deste, é clonado em um vetor de expressão sob o controle de um gene promotor H. polymorpha indutível. Caso seja desejada a secreção do produto, um polinucleotídeo que codifica uma sequência de sinal para secreção em levedura é fundido in-frame com o polinucleotídeo. Em uma modalidade adicional, o vetor de expressão contém, preferencialmente, um gene marcador auxotrófico, tal como URA3 ou LEU2, que pode ser utilizado para complementar a deficiência de um hospedeiro auxotrófico.

[00045] O vetor de expressão é, em seguida, utilizado para transformar células hospedeiras H. polymorpha utilizando técnicas conhecidas àqueles versados na técnica. Um recurso útil de transformação H. polymorpha é a integração espontânea de até 100 cópias do vetor de expressão dentro do genoma. Na maioria dos casos, o polinucleótido integrado forma multímeros exibindo um arranjo cabeça-a-cauda. Demonstrou-se que o polinucleotídeo estrangeiro integrado é mitoticamente estável em várias estirpes recombinantes, mesmo em condições não seletivas. Esse fenômeno de alta

Petição 870180055798, de 28/06/2018, pág. 23/81 / 51 integração de cópias aumenta ainda mais o potencial de produtividade alta do sistema.

[00046] Expressão Fúngica. Também foram utilizados os fungos filamentosos para produzir os presentes polipeptídeos. Os vetores para expressar e/ou segregar proteínas recombinantes em fungos filamentosos são conhecidos e aquele versado na técnica poderia utilizar estes vetores para expressar os colágenos animais recombinantes da presente invenção.

[00047] Expressão Vegetal. Um colágeno animal foi produzido em uma planta ou células de planta. Nos casos em que são utilizados vetores de expressão de plantas, a expressão de sequências que codificam os colágenos da invenção pode ser conduzida por qualquer um de diversos promotores. Por exemplo, promotores virais tais como os promotores de ARN 35S e ARN 19S de CaMV (Brisson et al. (1984) Nature 310:511-514) ou o promotor de proteína de revestimento de TMV (Takamatsu et al. (1987) EMBO J.6:307311) pode ser utilizado; alternativamente, promotores vegetais, tais como a subunidade pequena de RUBISCO (Coruzzi et al. (1984) EMBO J.3:16711680; Broglie et al. (1984) Science 224:838-843) ou promotores de choque térmico, por exemplo, soja hsp17.5-E ou hsp17.3-B (Gurley et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:559-565) podem ser utilizado. Estas construções podem ser introduzidas em células vegetais através de uma variedade de métodos conhecidos por aqueles versados na técnica, tais como utilizando plasmídeos Ti, plasmídeos Ri, vetores virais vegetais, transformação direta de DNA, microinjeção, eletroporação etc. Para revisões de tais técnicas, veja, por exemplo, Weissbach & Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Section VIII, pp.421-463 (1988); Grierson & Corey, Plant Molecular Biology, 2d Ed., Blackie, London, Ch.7-9 (1988); Transgenic Plants: A Production System for Industrial and Pharmaceutical Proteins, Owen e Pen eds., John Wiliey & Sons, 1996; Transgenic Plants, Galun e

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Breiman eds, Imperial College Press, 1997; e Applied Plant Biotechnology, Chopra, Malik, e Bhat eds., Science Publishers, Inc.,1999.

[00048] As células vegetais não produzem naturalmente quantidades suficientes de enzimas pós-traducionais para produzir o colágeno estável eficientemente. Portanto, quando a hidroxilação é desejada, as células vegetais utilizadas para expressar os colágenos animais são suplementadas com as enzimas pós-traducional necessárias para produzir colágenos estáveis suficientes. Em uma modalidade preferencial da presente invenção, a enzima pós-traducional é a prolil-4-hidroxilase.

[00049] Os métodos para produzir os colágenos animais em sistemas vegetais foram alcançados fornecendo uma biomassa a partir de plantas ou células vegetais, em que as plantas ou células vegetais compreendem pelo menos uma sequência codificadora e é operacionalmente ligada a um promotor para efetuar a expressão do polipeptídeo e o polipeptídeo é, em seguida, extraído da biomassa. Alternativamente, o polipeptídeo pode ser não extraído, por exemplo, expresso no endosperma.

[00050] Vetores de expressão vegetais e genes repórter são, em geral, conhecidos na técnica; vide, por exemplo, Gruber et al. (1993) em Methods of Plant Molecular Biology and Biotechnology, CRC Press. Normalmente, o vetor de expressão compreende uma construção de ácido nucleico gerada, por exemplo, recombinante ou sinteticamente, e compreendendo um promotor que funciona em uma célula vegetal, em que esse promotor é ligado operativamente a uma sequência de ácido nucleico que codifica um colágeno animal, fragmentos ou variantes destes, ou uma enzima pós-traducional importante para a biossíntese de colágeno.

[00051 ] Os promotores acionam o nível de expressão proteica em plantas. Para produzir um nível desejado de expressão proteica vegetal, a expressão pode fica sob a direção de um promotor vegetal. Promotores adequados para utilização são, em geral, disponíveis na técnica; vide, por exemplo,

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Publicação PCT No. WO 91/19806.Exemplos de promotores que podem ser utilizados incluem promotores não constitutivos ou promotores constitutivos. Estes promotores incluem, mas não são limitados a, o promotor para a subunidade pequena da ribulose-1,5-bis-fosfato carboxilase; promotores de plasmídeos indutores de tumores Agrobacterium tumefaciens, tais como os promotores da nopalina sintase (NOS) e octopina sintetase de RUBISCO; promotores bacterianos de T-DNA tais como promotores mas e ocs; e promotores virais tais como os promotores 19S e 35S de vírus do mosaico do couve-flor (CaMV) ou o promotor 35S de vírus do mosaico da figueira-dafigueira.

[00052] As sequências polinucleotídicas podem ser colocadas sob o controle transcricional de um promotor constitutivo, dirigindo a expressão do colágeno ou enzima pós-traducional na maioria dos tecidos de uma planta. A sequência polinucleotídica fica sob o controle do promotor 35S de vírus do mosaico do couve-flor (CaMV). A família de caulimorvírus de cadeia dupla forneceu a expressão mais importante do promotor para a expressão para transgene em plantas, particularmente, o promotor 35S; vide, por exemplo, Kay et al. (1987) Science 236:1299.Promotores adicionais dessa família, tais como o promotor de vírus do mosaico da figueira etc., foram descritos na técnica e também podem ser utilizados; vide, por exemplo, Sanger et al. (1990) Plant Mol. Biol. 14:433-443; Medberry et al. (1992) Plant Cell 4:195192; e Yin and Beachy (1995) Plant J.7:969-980.

[00053] Os promotores utilizados em construções polinucleotídicas para expressão de colágenos podem ser modificados, caso desejado, para afetar as suas características de controle. Por exemplo, o promotor CaMV pode ser ligado à porção do gene RUBISCO que reprime a expressão de RUBISCO na ausência de luz, para criar um promotor que é ativo em folhas, mas não em raízes. O promotor quimérico resultante pode ser utilizado conforme descrito neste documento.

Petição 870180055798, de 28/06/2018, pág. 26/81 / 51 [00054] Promotores de plantas constitutivos com propriedades de expressão geral conhecidas na técnica podem ser utilizados com os vetores de expressão da presente invenção. Estes promotores são expressos abundantemente na maioria dos tecidos vegetais e incluem, por exemplo, o promotor de actina e o promotor de ubiquitina; vide, por exemplo, McElroy et al. (1990) Plant Cell 2:163-171; e Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689.

[00055] Alternativamente, o polipeptídeo pode ser expresso em um tecido específico, tipo de célula ou sob condições ambientais mais precisas ou controle do desenvolvimento. Os promotores que dirigem a expressão nestes casos são conhecidos como promotores indutíveis. No caso em que se utiliza um promotor específico de tecido, a expressão de proteína é particularmente elevada no tecido a partir do qual é desejada a extração da proteína. Dependendo do tecido desejado, a expressão pode ser direcionada ao endosperma, camada de aleurona, embrião (ou suas partes como escutelo e cotilédones), pericarpo, caule, folhas de tubérculos, raízes etc. Exemplos de promotores específicos de tecido conhecidos incluem o promotor de patatina classe I direcionado a tubérculo, os promotores associados com genes de ADPGPP de tubérculo de batata, o promotor de soja de β-conglicinina (proteína 7S) que conduz a transcrição dirigida por sementes e promotores dirigidos por sementes dos genes da zeína do endosperma do milho; vide, por exemplo, Bevan et al. (1986) Nucleic Acids Res.14:4625-38; Muller et al. (1990) Mol.Gen.Genet.224:136-46; Bray (1987) Planta 172:364-370; e Pedersen et al. (1982) Cell 29:1015-26.

[00056] Os polipeptídeos de colágeno podem ser produzidos em sementes por meio de técnicas de produção baseadas em sementes utilizando, por exemplo, sementes de canola, milho, soja, arroz e cevada. Em tal processo, por exemplo, o produto é recuperado durante a germinação das sementes; vide, por exemplo, Publicação PCT Nos. WO 9940210; WO

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9916890; WO 9907206;Patente U.S. No. 5,866,121;Patente U.S. No. 5,792,933; e todas as referências citadas nestes. Os promotores que podem ser utilizados para dirigir a expressão dos polipeptídeos podem ser heterólogos ou não heterólogos. Estes promotores podem também ser utilizados para conduzir a expressão de ácidos nucleicos antessentido para reduzir, aumentar ou alterar a concentração e composição dos colágenos animais presentes em um tecido desejado.

[00057] Outras modificações que podem ser feitas para aumentar e/ou maximizar polipeptídeos de transcrição em uma planta ou célula vegetal são padrão e conhecidas por aqueles versados na técnica. Por exemplo, um vetor compreendendo uma sequência polinucleotídica codificando um colágeno animal recombinante, um fragmento ou variante deste, ligado operativamente a um promotor pode compreender, adicionalmente, pelo menos um fator que modifica a taxa de transcrição de colágeno ou enzimas pós-traducionais relacionadas, incluindo, mas não limitando a, sequência de sinal de exportação de peptídeo, utilização de códon, íntrons, poliadenilação e locais de terminação de transcrição. Métodos para modificação de construções para aumentar os níveis de expressão em plantas são, em geral, conhecidos na técnica; vide, por exemplo, Rogers et al. (1985) J. Biol. Chem. 260:3731; e Cornejo et al. (1993) Plant Mol Biol 23:567-58.Ao manipular um sistema vegetal que afeta a taxa de transcrição de colágenos e enzimas póstraducionais relacionadas, vários fatores conhecidos na técnica, incluindo sequência reguladoras tais como sequência de atuação positiva ou negativa, melhoradores e silenciadores, assim como estrutura da cromatina podem afetar taxa de transcrição em plantas. Pelo menos um destes fatores pode ser utilizado quando se expressa um colágeno animal recombinante, incluindo mas não limitado a, os tipos de colágeno descritos acima.

[00058] Os vetores compreendendo polinucleotídeos compreenderão, normalmente, um gene marcador que confere um fenótipo selecionável em

Petição 870180055798, de 28/06/2018, pág. 28/81 / 51 células vegetais. Normalmente, o gene marcador selecionável codificará a resistência a antibióticos com genes adequados incluindo pelo menos um conjunto de genes codificando para resistência ao antibiótico espectinomicina, o gene da estreptomicina-fosfotransferase (SPT) que codifica para resistência à estreptomicina, o gene da neomicina-fosfotransferase (NPTH) que codifica para resistência à canamicina ou à geneticina, a resistência à higromicina, genes que codificam a resistência a herbicidas que atuam para inibir a ação da acetolactato sintase (ALS), particularmente, os herbicidas do tipo sulfonilureia; por exemplo, o gene da acetolactato sintase (ALS) que contém mutações que conduzem para tal resistência, particularmente, as mutações S4 e/ou Hra, genes que codificam para resistência a herbicidas que atuam para inibir a ação da glutamina sintetase, tal como a fofinotricina ou basta; por exemplo o gene bar, ou outros genes semelhantes conhecidos na técnica. O gene bar codifica resistência ao herbicida basta, o gene nptII codifica resistência aos antibióticos kanamicina e geneticina e o gene ALS codifica resistência ao herbicida clorsulfuron.

[00059] Os vetores típicos úteis para a expressão de genes estranhos em plantas são conhecidos na técnica, incluindo, mas não limitados a, vetores derivados do plasmídeo indutor de tumores (Ti) de Agrobacterium tumefaciens. Esses vetores são vetores de integração de plantas que, após a transformação, integram uma porção do DNA dentro do genoma da planta hospedeira; vide por exemplo, Rogers et al. (1987) Meth In Enzymol. 153:253-277; Schardl et al. (1987) Gene 61:1-11; e Berger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:8402-8406.

[00060] Podem ser cointroduzidos, na planta desejada, vetores compreendendo sequências que codificam os polipeptídeos e vetores compreendendo enzimas pós-traducionais ou subunidades destes. Procedimentos para transformar células vegetais são disponíveis na técnica, por exemplo, transferência direta de genes, in vitro transformação de

Petição 870180055798, de 28/06/2018, pág. 29/81 / 51 protoplastos, transformação mediada por vírus de plantas, transformação mediada por lipossomas, microinjeção, eletroporação, transformação mediada por Agrobacterium e bombardeamento de partículas; vide por exemplo, Paszkowski et al. (1984) EMBO J.3:2717-2722; U.S. No. 4,684,611; Aplicação Europeia No. 0 67 553; Patente US No. 4,407,956; Patente US No. 4,536,475; Crossway et al. (1986) Biotechniques 4:320-334; Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci USA 83:5602-5606; Hinchee et al. (1988) Biotechnology 6:915-921; e U.S. No. 4,945,050). Métodos padrão para a transformação de, por exemplo, arroz, trigo, milho, sorgo e cevada são descritos na técnica; vide, por exemplo, Christou et al. (1992) Trends in Biotechnology 10:239 e Lee et al. (1991) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 88:6389.O trigo pode ser transformado por técnicas semelhantes àquelas empregadas para transformar milho ou arroz. Adicionalmente, Casas et al. (1993) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90: 11212, descrevem um método para transformar o sorgo, ao passo que Wan et al. (1994) Plant Physiol.104:37, ensina um método para transformar a cevada. Métodos adequados para transformação de milho são fornecidos por Fromm et al. (1990) Bio/Technology 8:833 e por Gordon-Kamm et al., supra.

[00061] Métodos adicionais que podem ser utilizados para gerar plantas que produzem colágenos animais são estabelecidos na técnica; vide, por exemplo, Patente US No. 5,959,091; Patente US No. 5,859,347; Patente No. 5763,241; Patente US No. 5,659,122; Patente US No. 5,593,874; Patente US No. 5,495,071; Patente US No. 5424412; Patente US No. 5,362,865; Patente US No. 5,229,112; Patente US No. 5,981,841; Patente US No. 5,959,179; Patente US No. 5,932,439; Patente US No. 5.869.720; Patente US No. 5.804.425; Patente US No. 5,763,245; Patente US No. 5,716,837; Patente US No. 5,689,052; Patente US No. 5,633,435; Patente US No. 5,631,152; Patente US No. 5,627,061; Patente US No. 5.602.321; Patente US No. 5,589,612; Patente US No. 5,510,253; Patente US No. 5,503,999; Patente US No.

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5.378.619; Patente US No. 5,349,124; Patente US No. 5,304,730; Patente US No. 5,185,253; Patente US No. 4.970.168; Publicação Europeia No. EPA 00709462; Publicação Europeia No. EPA 00578627; Publicação Europeia No. EPA 00531273; Publicação Europeia No. EPA 00426641; Publicação PCT No. WO 99/31248; Publicação PCT No. WO 98/58069; Publicação PCT No. WO 98/45457; Publicação PCT No. WO 98/31812; Publicação PCT No. WO 98/08962; Publicação PCT No. WO 97/48814; Publicação PCT No. WO 97/30582; e Publicação PCT No. WO 9717459.

[00062] Expressão de Inseto. Outro sistema de expressão alternativa para o colágeno é um sistema de insetos. Os Baculovírus são vetores de expressão muito eficazes para a produção em larga escala de várias proteínas recombinantes em células de incestos. Os métodos descritos em Luckow et al. (1989) Virology 170:31-39 e Gruenwald, S. e Heitz, J.(1993) Baculovirus Expression Vector System: Procedures & Methods Manual, Pharmingen, San Diego, CA, podem ser empregados para construir vetores de expressão contendo uma sequência de codificação de colágeno para os colágenos da invenção e os sinais de controle de transcrição/translação apropriados. Por exemplo, a produção recombinante de proteínas pode ser alcançadas em células de inseto, por infeção de vetores de baculovírus que codificam o polipeptídeo. A produção de colágeno recombinantes, semelhante a colágeno ou peptídeos colagenoso com hélices triplas estáveis pode envolver a coinfecção de células de inseto com três baculovírus, um codificando o colágeno animal a ser expresso e os outros, cada um, codificando a subunidade α e subunidade β do prolil 4-hidroxilase.Este sistema celular de insetos permite a produção de proteínas recombinantes em grandes quantidades. Em um desses sistemas, vírus da polididrose nuclear Autographa californica (AcNPV) é utilizado como um vetor para expressar genes estrangeiros. O vírus cresce nas células de Spodoptera frugiperda. As sequências de codificação para colágenos ou polipeptídeos semelhante a

Petição 870180055798, de 28/06/2018, pág. 31/81 / 51 colágenos podem ser clonadas em regiões não essenciais (por exemplo, o gene poliedrina) do vírus e colocadas sob controle de um promotor de AcNPV (por exemplo, o promotor de poliedrina). A inserção bem-sucedida de uma sequência de codificação resultará na inativação do gene do poliedro e produção de vírus recombinantes não obstruídos; isto é, vírus, falta o casaco proteicos codificado para pelo gene poliedro. Estes vírus recombinantes são, em seguida, utilizados para infectar células de Spodoptera frugiperda nas quais o gene inserido é expresso; vide, por exemplo, Smith et al. (1983) J.Virol.46:584; e Patente US No. 4,215,051.Exemplos adicionais deste sistema de expressão podem ser encontrados, por exemplo, em Ausubel et al. acima.

[00063] Expressão de Animal. Em células hospedeiras de animais, diversos sistemas de expressão podem ser utilizados. Nos casos nos quais um adenovírus é utilizado como um vetor de expressão, sequências polinucleotídicas que codificam colágeno ou polipeptídeos do semelhante colágeno podem ser ligadas a um complexo de controle de transcrição/translação de adenovírus, por exemplo, o promotor tardio e sequência principal tripartida. Este gene quimérico pode, em seguida, ser inserido no genoma de adenovírus pela recombinação in vitro ou in vivo. Inserção em uma região não essenciais do genoma viral (por exemplo, região E1 ou E3) resultará em um vírus recombinante que é viável e capaz de expressar o peptídeo em hospedeiros infectados; vide, por exemplo, Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655-3659 (1984). Alternativamente, o promotor vaccinia 7,5 K pode ser utilizado; vide, por exemplo, Mackett et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:7415-7419; Mackett et al. (1982) J.Virol.49:857-864; e Panicali et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:4927-4931.

[00064] Um sistema de expressão preferencial em células hospedeiras de mamíferos é o vírus da Floresta de Semliki. A infeção de células hospedeiras

Petição 870180055798, de 28/06/2018, pág. 32/81 / 51 de mamífero, por exemplo, células de rim de hamster bebê (BHK) e células de ovário de hamster chinês (CHO), pode render níveis de expressão recombinantes muito elevados. O vírus da Floresta de Semliki é um sistema de expressão preferencial, visto que o vírus tem uma ampla gama de hospedeiros, de tal modo que a infecção de linhas celulares de mamífero será possível. Mais especificamente, o vírus Semliki Forest pode ser utilizado em uma ampla gama de hospedeiros, visto que o sistema não é baseado em integração cromossômica e, assim, fornece uma maneira mais fácil de obter modificações dos colágenos animais recombinantes em estudos que visam identificar relações de função de estrutura e testar os efeitos de várias moléculas híbridas. Os métodos para construir vetores de vírus da Floresta de Semliki para expressão de proteínas exógenas em células hospedeiras de mamíferos são descritos, por exemplo, em Olkkonen et al. (1994) Methods Cell Biol 43:43-53.

[00065] Os animais transgênicos não humanos também podem ser utilizados para expressar os polipeptídeos. Tais sistemas podem ser construídos ligando operativamente o polinucleotídeo da invenção a um promotor, juntamente com outras sequências reguladoras necessárias ou opcionais capazes de efetuar expressão em glândulas mamárias. Do mesmo modo, as enzimas pós-traducionais necessárias ou opcionais podem ser produzidas simultaneamente em células alvo utilizando sistemas de expressão adequados. Os métodos para utilização de animais transgênicos não humanos para produzir proteínas de maneira recombinante são conhecidos na técnica; vide, por exemplo, Patente US No. 4,736,866; Patente US No. 5,824,838; Patente US No. 5,487,992; e Patente US No. 5,614,396.

[00066] As referências citadas nas seções acima que descrevem a produção de colágenos recombinantes são todas incorporadas por referência. Apesar do ensinamento da técnica anterior, há uma necessidade contínua de

Petição 870180055798, de 28/06/2018, pág. 33/81 / 51 estirpes de levedura com produção de colágeno aumentada e estabilidade de colágeno aumentada.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO [00067] Entre as outras modalidades, a invenção é dirigida a estirpes de levedura geneticamente manipuladas para produzir colágeno não hidroxilado. Em uma modalidade alternativa, a presente invenção fornece estirpes de levedura modificada para produzir colágeno hidroxilado. Em uma modalidade, a presente invenção fornece um vetor multifuncional incluindo o DNA necessário para produzir colágeno, o promotor e/ou as enzimas de hidroxilação. Fornecem-se também métodos para a produção de colágeno não hidroxilado ou hidroxilado.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A Fig.1 mostra o diagrama vetorial de MMV 63 que foi projetado para produzir colágeno não hidroxilado.

A Fig.2 mostra o diagrama vetorial de MMV77 que foi projetado para produzir colágeno não hidroxilado.

A Fig.3 mostra o diagrama vetorial de MMV 129 que foi projetado para produzir colágeno não hidroxilado.

A Fig. 4 mostra o diagrama vetorial de MMV 130 que foi projetado para produzir colágeno não hidroxilado.

A Fig. 5 mostra o diagrama vetorial de MMV 78 que foi projetado para produzir colágeno hidroxilado.

A Fig. 6 mostra o diagrama vetorial de MMV 94 que foi projetado para produzir colágeno hidroxilado.

A Fig. 7 mostra o diagrama vetorial de MMV 156 que foi projetado para produzir colágeno hidroxilado.

A Fig. 8 mostra o diagrama vetorial de MMV 191 que foi projetado para produzir colágeno hidroxilado.

A Fig. 9 mostra um vetor MMV 208 multifuncional que foi projetado para

Petição 870180055798, de 28/06/2018, pág. 34/81 / 51 produzir colágeno não hidroxilado ou hidroxilado. A Fig. 10 mostra o diagrama vetorial de MMV84. A Fig. 11 mostra o diagrama vetorial de MMV150. A Fig. 12 mostra o diagrama vetorial de MMV140. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [00068] A presente invenção utiliza levedura para produzir colágeno. Leveduras adequadas incluem, mas não são limitadas a, aquelas do gênero Arxula, Candida, Komagataella, Pichia, Hansenula, Ogataea,

Saccharomyces, Cryptococcus e combinações destes. A levedura pode ser modificada ou hibridizada. As leveduras hibridizadas são criações mistas de diferentes estirpes da mesma espécie, espécies diferentes do mesmo gênero ou estirpes de diferentes gêneros.

[00069] O DNA estrangeiro é inserido dentro do genoma de levedura ou se mantém epissomal para produzir colágeno. A sequência de DNA para o colágeno é introduzida dentro da levedura através de um vetor. Sabe-se na técnica que a modificação do DNA, tal como a otimização de códon, pode melhorar a capacidade e eficiência da levedura para traduzir o DNA. Os DNA estrangeiros são qualquer DNA hospedeiro não de levedura e incluem, por exemplo, mas não limitando a, mamíferos, Caenorhabditis elegans e bactérias. DNA de mamífero adequado para produção de colágeno em levedura inclui, mas não se limita a, bovino, porcino, de canguru, de crocodilo, de elefante, de girafa, de zebra, de lhama, de alpaca, de cordeiro, de dinossauro e combinações destes.

[00070] O DNA é inserido em um vetor, vetores adequados incluem, mas não estão limitados a, pHTX1- BiDi-P4HA-Pre-P4HB hygro, pHTX1- BiDiP4HA-PHO1-P4HB hygro, pGCW14-pGAP1- BiDi-P4HA-Prepro-P4HB G418, pGCW14-pGAP1- BiDi-P4HA-PHO1-P4HB Hygro, Zeoci otimizado por pDF-Col3A1, Zeocin otimizado por pCAT-Col3A1, Zeoci otimizado por pDF-Col3A1 com plataforma de integração AOX1, pHTX1- BiDi-P4HA-Pre

Petição 870180055798, de 28/06/2018, pág. 35/81 / 51

Pro-P4HB hygro. Os vetores incluem, normalmente, pelo menos um local de restrição para a linearização do DNA.

[00071] Sabe-se na técnica que os promotores podem melhorar a produção de proteínas. Os Promotores são sequências de DNA incluídas nos vetores. Promotores adequados para utilização na presente invenção incluem, mas não são limitados a, promotor induzido por metanol AOX1, promotor desreprimido por PDF, promotor desreprimido por PCAT, promotor bidirecional induzido por metanol Das1-Das2, promotor constitutivo bidirecional PHTX1, promotor de histona CHO, promotor constitutivo bidirecional PGCW14-PGAP1 e combinações destes.

[00072] Necessita-se de um terminador na extremidade de cada quadro de leitura aberto utilizado nos vetores incorporados dentro da levedura. A sequência de DNA para o terminador é inserido dentro do vetor.

[00073] Necessita-se de uma origem de replicação para iniciar a replicação. Insere-se o DNA para a origem de replicação dentro do vetor. O vetor pode ser, adicionalmente, mantido de forma epistomal.

[00074] Necessita-se e incorpora-se uma sequência de DNA contendo homologia com o genoma da levedura dentro do vetor.

[00075] Utilizam-se marcadores de seleção para selecionar células de levedura que foram transformadas com sucesso. Os marcadores, por vezes, são relacionados à resistência a antibióticos. Os marcadores também podem ser relacionados à capacidade de crescer com ou sem certos aminoácidos (marcadores auxotróficos). Marcadores auxotróficos adequados incluem, mas não são limitados a, ADE, HIS, URA, LEU, LYS, TRP e combinações destes. Incorpora-se uma sequência de DNA para um marcador de seleção dentro do vetor.

[00076] Antes da modificação pós-traducional, o colágeno é não hidroxilado e degrada na presença de uma concentração alta de pepsina, por exemplo, uma Pepsina 1:200 pode ser utilizada para clivar os propeptídeos N

Petição 870180055798, de 28/06/2018, pág. 36/81 / 51 terminal e C-terminal de colágeno para permitir a fibrilação, o que permite a conversão do colágeno em material biofabricado. Portanto, é útil fornecer colágeno hidroxilado. Para permitir a produção de colágeno hidroxilado, pode ser necessária pelo menos uma segunda proteína. Esta segunda proteína é uma enzima conhecida como prolil 4-hidroxilase de subunidade alfa-1, doravante “P4HA1” e prolil 4-hidroxilase de subunidade beta, doravante “P4HB”. O DNA de P4HA1 e P4HB pode ser inserido dentro da levedura em um vetor para hidroxilar o colágeno. O colágeno hidroxilado tem melhor termoestabilidade em comparação com o colágeno não hidroxilado e é resistente à digestão com concentração alta de pepsina, por exemplo, 1:25 a 1:1, proporção total de proteína para pepsina.

[00077] As leveduras manipuladas acima necessitam de múltiplos vetores e cada etapa no processo de carregar vetores dentro da célula pode consumir muito tempo. Múltiplos vetores também carregam múltiplos marcadores de seleção, dificultando a reutilização de marcadores ao adicionar DNA novo. Descobrimos, interessantemente, que um vetor multifuncional poderia ser construído com o DNA do colágeno e o DNA de P4HA e P4HB combinados em um único vetor. Promotores e sequências de sinal podem ser adicionados de maneira modular em locais de clonagem especificados. O DNA pode ser inserido em levedura para colágeno hidroxilado ou não hidroxilado, dependendo da presença ou ausência dos promotores. O vetor multifuncional inclui locais para linearização para inserir o DNA na levedura, incluindo tanto para integração aleatória como dirigida a local dentro do genoma.

[00078] O termo colágeno se refere a qualquer um dos tipos de colágenos conhecidos, incluindo colágeno tipo de I a XX, assim como a quaisquer outros colágeno, sejam naturais, sintéticos, semissintéticos ou recombinantes. Incluem-se todos os colágenos, colágenos modificados e proteínas semelhantes ao colágeno descritas neste documento. O termo também abrange pró-colágenos e proteínas semelhantes a colágeno ou

Petição 870180055798, de 28/06/2018, pág. 37/81 / 51 proteínas colágenas compreendendo o motivo (Gly-X-Y)n no qual n é um número inteiro. Engloba-se moléculas de colágeno e proteínas semelhantes ao colágeno, trímeros de moléculas de colágeno, fibrilas de colágeno e fibras de fibrilas de colágeno. Refere-se também a colágenos química, enzimática ou recombinantemente modificados ou moléculas semelhantes a colágeno que podem ser fibrilados, assim como fragmentos de colágeno, moléculas semelhantes a colágeno e moléculas colágenas capazes de se montar em uma nanofibra.

[00079] Em algumas modalidades, os resíduos de aminoácidos, tais como lisina e prolina, em um colágeno ou proteína semelhante a colágeno pode carecer hidroxilação ou pode ter um grau menor de hidroxilação que um colágeno ou proteína semelhante a colágeno natural ou não modificada. Em outras modalidades, resíduos de aminoácidos em um colágeno ou proteína semelhante a colágeno pode carecer de glicosilação ou ter um grau de glicosilação menor ou maior que um colágeno ou proteína semelhante a colágeno natural ou não modificado.

[00080] O colágeno em uma composição de colágeno pode conter homogeneamente um único tipo de molécula de colágeno, tal como colágeno tipo I 100% bovino ou colágeno tipo III 100% bovino, ou pode conter uma mistura de diferentes tipos de moléculas de colágeno ou moléculas semelhantes a colágeno, tais como uma mistura de moléculas bovinas de Tipo I e Tipo III. Tais misturas podem incluir > 0%, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99 ou <100% dos componentes individuais de colágeno ou proteína do tipo colágeno. Esse intervalo inclui todos os valores intermediários. Por exemplo, uma composição de colágeno pode conter 30% de colágeno tipo I e 70% de colágeno tipo III, ou pode conter 33,3% de colágeno tipo I, 33,3% de colágeno tipo II e 33,3% de colágeno tipo III, na qual a porcentagem de colágeno tem como base a massa total de colágeno na composição ou nas percentagens moleculares das moléculas de colágeno.

Petição 870180055798, de 28/06/2018, pág. 38/81 / 51 [00081] As células de levedura descritas acima podem ser utilizadas para produzir colágeno. Para tal, as células são colocadas em meios dentro de uma tanque ou câmara de fermentação e alimentado com oxigênio dissolvido e uma fonte de carbono, sob condições controladas de pH, por um período de tempo variando de doze horas a 1 semana. Os meios adequados incluem, mas não são limitados a, meio tamponado complexo contendo gliceral (BMGY), meio tamponado complexo contendo metanol (BMMY) e extrato de levedura peptona dextrose (YPD). Devido ao fato de que o colágeno é produzido na célula de levedura, a fim de isolar o colágeno, deve-se utilizar uma estirpe secretória de levedura ou lisar as células de levedura para liberar o colágeno. O colágeno pode, em seguida, ser purificado através de técnicas conhecidas, tais como centrifugação, precipitação e semelhantes.

[00082] O colágeno divulgado neste documento torna possível produzir um couro biofabricado. Os métodos para conversão de colágeno em couro biofabricado são ensinados nos pedidos de patente copendentes 15/433566, 15/433650, 15/433632, 15/433693, 15/433777, 15/433675, 15/433676 e 15/433877, cujas divulgações são incorporadas neste documento por referência.

MODALIDADES DA INVENÇÃO [00083] A invenção inclui, mas não se limita a, estirpes de levedura geneticamente modificadas e métodos para produzir colágeno.

[00084] Em uma primeira modalidade, a presente invenção é dirigida a uma estirpe de levedura que produz colágeno não hidroxilado incluindo um hospedeiro de levedura; um DNA recombinante de uma proteína alvo; e um promotor.

[00085] Em uma segunda modalidade, a presente invenção é dirigida a uma estirpe de levedura que produz colágeno hidroxilado incluindo um hospedeiro de levedura; um DNA recombinante de uma proteína alvo; um DNA de uma segunda proteína alvo; e pelo menos um promotor.

Petição 870180055798, de 28/06/2018, pág. 39/81 / 51 [00086] Em uma terceira modalidade, a presente invenção é dirigida a um vetor multifuncional incluindo um DNA de uma proteína alvo; um DNA de uma segunda proteína alvo; e um DNA para pelo menos um promotor. Exemplos: Gelatina, Colágeno I e para introduzir mais que um gene.

[00087] Em uma quarta modalidade, a presente invenção é dirigida a um método para produzir colágeno.

[00088] Em uma quinta modalidade, a presente invenção é dirigida a um método para produzir colágeno hidroxilado.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES [00089] Conforme utilizado neste documento, o termo DNA significa ácido desoxirribonucleico.

[00090] Conforme utilizado neste documento, o termo título significa a quantidade de proteína alvo produzida.

[00091] Conforme utilizado neste documento, o termo couro biofabricado significa a utilização de biologia, engenharia e design para criar um material com propriedades semelhantes a couro.

[00092] Conforme utilizado neste documento, o termo vetor multifuncional significa um vetor que inclui todos os DNAs necessários para produzir uma proteína recombinante desejada.

[00093] Conforme utilizado neste documento, o termo colágeno estável significa que, após ser exposto a uma concentração elevada de pepsina, pelo menos 75% da concentração inicial de colágeno ainda está presente.

[00094] Os exemplos não limitantes a seguir são ilustrativos da presente invenção. O escopo da invenção não é limitado aos detalhes descritos nestes Exemplos.

EXEMPLO 1

Levedura destinada a produzir colágeno recombinante.

[00095] Pichia pastoris tipo selvagem do DNA 2.0 foi obtido. Uma sequência de DNA MMV 63 (Sequência 9), incluindo uma sequência de

Petição 870180055798, de 28/06/2018, pág. 40/81 / 51 colágeno, foi inserida dentro da Pichia pastoris tipo selvagem que gerou a estirpe PP28. MMV63 foi digerido por Pme I e transformado em PP1 (estirpe Pichia pastoris tipo selvagem) para gerar PP28. O vetor MMV63 é mostrado na Figura 1.

[00096] O colágeno bovino nativo foi sequenciado (Sequência 1) e a sequência foi amplificada utilizando o seguinte protocolo de reação em cadeia da polimerase PCR para criar uma sequência linear de DNA:

Protocolo de polimerase de DNA PfuUltra 11 Fusion HS

Para uma reação de 50 ul:

Componente	Volume	Concentração final
Polimerase Pfu	1 ul
10 mM dNTP	1 ul	200 uM
Tampão de reação 10x Pfu ultra HF	5 ul	1,0x
Primer 1, 5 uM	1 ul	0,1 uM
Primer 2, 5 uM	1 ul	0,1 uM
DNA	Variável	5-30 ng
água	Volume total feito com água a 50 ul

* Aquele versado na técnica apreciaria que podem ser utilizados múltiplos iniciadores com base no DNA a ser amplificado.

Protocolo termociclador para < 10 kb de DNA:

C por 2 min, 30 ciclos de 95C por 20 segundos, [temperatura de fusão de iniciador-5C] por 20 segundos

72C por 15 segundos caso <1kb, caso contrário 15 seg por kB, 72C por 3 min e 4 C para sempre.

[00097] O DNA linear foi clonado seguindo o Procedimento Gibson, conforme se segue;

Para 2-3 fragmentos, foi utilizado 0,02 a 0,5 pmol de DNA. Para 4 a 6

Petição 870180055798, de 28/06/2018, pág. 41/81 / 51 fragmentos, foi utilizado 0,2 a 1,0 pmol de DNA.

Pmols = (peso em ng) x 1000 / (pares de bases x 650 daltons)

Ou utiliza-se NEBioCalculator

A eficiência otimizada é de 50 a 100 ng vetor com inserção de excesso 2 a 3 vezes (use 5 vezes de excesso caso <200 pb). O volume total de fragmentos de PCR não deve exceder 20%.

1. Configura-se a seguinte reação:

Quantidade Total de Fragmentos	Quantidade de Fragmentos Recomendados Utilizados para Montagem
2-3 Montagens de Fragmentos	4-6 Montagem de Fragmentos	Controle Positivo**
0,02-0,5pmols* X pl	0,2-1 pmols* X pl	10 pl
Mistura Master de Montagem de Gibson (2X)	10 pl	10 pl	10 pl
H2O Desionizado	10-X pl	10-X pl	0
Volume Total	20 pl***	20 pl***	20 pl

2. Incube no termociclador a 50C por 15 min (2 a 3 frag) ou 60 min (4 a 6 frag). Armazene em gelo ou -20C antes da transformação

3. Transforme células NEB 5-alfa com 2 ul de reação de montagem. [00098] Os clones foram transformados em E. Coli seguindo o procedimento abaixo:

- Derreta Cinco 50 ul células competentes (tipicamente 5 alfa) em gelo

- Adicione 10 a 100 ng DNA em 2 ul de volume

Petição 870180055798, de 28/06/2018, pág. 42/81 / 51

- Descanse em gelo por 5 min

- Choque de calor a 42 C por 10 segundos

- Descanse em gelo por 5 min

- No meio tempo, prepare os tubos ou a coloque em placa com 1 ml de caldo Super optimal com meio líquido de repressão catabólica (“SOC”).

- Transfira células competentes dentro do tubo apropriado ou poço na placa

- Deixe agitando por 37C por 1 hora para crescimento

- No meio tempo, rotule as placas e coloque na incubadora 37C para aquecer.

- Empurre a 10,000g por 30s para concentrar as células na parte inferior

- Remova e descartar 800 ul de SOC. Deve-se ter restos de ~ 200 ul

- Adicione 200 ul inteiros às placas de agar à temperatura ambiente. Alternativamente, adicione 10% (20 ul) à placa 1 e 90% (180 ul) à placa 2.

- Espalhe na placa utilizando grânulos de vidro estéreis.

- Incube a 37C durante a noite [00099] As células transformadas foram cultivadas em colônias e foi realizado E. Coli PCR de acordo com o procedimento abaixo:

Protocolo GoTaq Green Master Mix (polimerase Taq)

Para 20 ul de reação:

Componente	Volume	Concentração final
GoTaq Green MM 2x	10 ul	1x
Primer 1, 5 uM	1 ul	0,1 uM
Primer 2, 5 uM	1 ul	0,1 uM
Colônia	palito de dente
água	8 ul

Protocolo Termociclador:

C por 2 min ciclos de

95C por 30 segundos

Petição 870180055798, de 28/06/2018, pág. 43/81 / 51 [temperatura de desnaturação do iniciador -5C] durante 30 segundos

72C por 1 minuto por kB

72C por 5 min

C para sempre [000100] Para peneirar as colônias para eficácia de transformação, seguiuse o procedimento de DNA em Gel de agarose conforme descrito abaixo:

Para fazer um gel de x% agarose (tipicamente de 8 de 12%):

1. Meça X g de agarose para obter a porcentagem desejada.1g = 1 ml. Por exemplo, para fazer um gel 1%, meça 1 g de agarose em 100 ml de Tris base, ácido acético e tampão de ácido etilenodiamino tetra-acético (“TAE”)

2. Adicione agarose a um frasco de 250 ml

3. Traga para 100 ml de tampão TAE, ou o volume desejado

4. Coloque no micro-ondas até o líquido ficar claro. Para 1% em 100 ml, isto leva ~ 1 min 30 segundos.

5. Adicione SYBR Safe DNA stain a 1x (é de 10,000x, então adicione seu volume total de agarose em ml / 10 para obter ul total para adicionar. Por exemplo, caso tenha-se 100 ml de agarose, adicione 10 ul)

6. Despeje no molde. Lembre-se de adicionar nas fendas de poço.

7. Aguarde de 45 min a 1 h para gel secar.

Para executar um gel:

1. Remova o molde de poço do gel seco

2. Remova o gel + suporte de plástico (não tire o gel do suporte de plástico) e transfira para a caixa de gel

3. Despeje o TAE sobre o gel para que fique completamente submerso

4. Carregue 10 a 20 ul de escada.100 ng deve ser mais do que suficiente para visualizar.

5. Carregue as amostras de DNA (após elas terem sido misturadas com o corante de carregamento de gel). O corante de carregamento de gel é 6x e

Petição 870180055798, de 28/06/2018, pág. 44/81 / 51 deve ser diluído para 1x para carregar amostras (por exemplo: misture 4 ul de corante + 20 ul de DNA e carregue todos os 24 ul). O DNA PCRed com GoTaq® Green Master Mix já tem corante incorporado dentro da mistura e não precisa ter corante adicionado.100 ng deve ser mais do que suficiente para visualizar. Algumas amostras podem precisar ser diluídas.

6. Coloque a parte superior com fio na caixa de gel. O negativo (preto) deve estar na lateral com os poços.

7. Conecte a caixa de gel na fonte de alimentação. Execute a voltagem de 100 a 120 por 10 a 30 min.

* O corante migra em oposição ao DNA (na direção da carga (-)). É por isso que executar um gel mais longo/várias vezes é desaconselhável e a visualização será impossível. Não reutilize os géis. Despeje novos em vez disso. Você também pode colocar corante no próprio tampão, o que pode ajudar na visualização.

[000101] A fim de purificar o vetor de E. Coli, um kit de preparação de DNA foi utilizado conforme descrito no kit de mini-preparação Zymo Researh, seguindo o protocolo do fabricante.

[000102] O sequenciamento Sanger foi realizado pela Genewiz ou pela Eurofins, de acordo com o protocolo do fornecedor. Os resultados confirmaram que, após a obtenção dos clones transformados, a sequência de DNA é correta.

[000103] A preparação de DNA em larga escala foi realizada utilizando o Kit de Preparação Midi, conforme descrito no protocolo do fabricante. Obteve o kit da Zymo Research. Os resultados mostram que geramos uma quantidade significativa de DNA circular ou plasmídeos.

[000104] Os plasmídeos foram convertidos em DNA linear utilizando o Guia de Digestão de Restrição (da Addgene) conforme descrito abaixo: Selecione enzimas de restrição para digerir o plasmídeo.

Observação: Para determinar quais enzimas de restrição irão cortar a

Petição 870180055798, de 28/06/2018, pág. 45/81 / 51 sequência de DNA (e onde elas serão cortadas), utilize um programa de análise de sequência, tal como o Analisador de Sequência da Addgene.

Determine um tampão de reação apropriado lendo as instruções para sua enzima.

Observação: Caso você esteja realizando uma digestão dupla (digerindo com duas enzimas ao mesmo tempo), será necessário determinar o melhor tampão que funciona para ambas as suas enzimas. A maioria das empresas terá um gráfico de compatibilidade, tal como o ferramenta localizadora de digestão dupla da NEB. Caso você não encontre um tampão apropriado para ambas as suas enzimas, será necessário digerir com uma enzima primeiro no tampão para a enzima 1, purificar novamente o plasmídeo cortado e, em seguida, conduzir a segunda digestão no tampão para a enzima 2.

Em um tubo de 1,5 mL, combine o seguinte:

DNA

Enzima(s) de Restrição

Tempão (1x)

BSA (caso recomendado pelo fabricante) dH2O até o volume total

Observação: A quantidade de DNA que você corta depende da sua aplicação. Digestões diagnósticas normalmente envolvem ~500ng de DNA, ao passo que a clonagem molecular geralmente requer 1-3pg de DNA. O volume total da reação geralmente varia de 10 a 50pL dependendo da aplicação, e é, em grande parte, determinado pelo volume de DNA a ser cortado.

Observação: Consulte a seção Dicas e perguntas frequentes (FAQ) abaixo para obter informações sobre a determinação do volume da enzima de restrição a ser utilizada.

Observação: Uma reação de digestão de restrição típica poderia se assemelhar com:

pg de DNA

Petição 870180055798, de 28/06/2018, pág. 46/81 / 51 μΡ de cada Enzima de Restrição gl 10x de tampão

3pL 10x de BSA (caso recomendado) x μΐ dH₂O (para trazer o volume total para 30pL)

Misture suavemente pipetando.

Incubar o tubo a temperatura adequada (normalmente 37°C) por 1 hora.

Sempre siga as instruções do fabricante.

Observação: Dependendo da aplicação e da quantidade de DNA na reação, o tempo de incubação pode variar de 45 min a uma noite.

[000105] O DNA foi purificado utilizando o procedimento de Extração e

Purificação de DNA com Fenoflorofórmio conforme descrito abaixo: Materiais

1. 3M NaOAc (acetato de sódio)

2. 100% Etanol, frio

3. 70% Etanol, frio

4. Álcool fenol-clorofórmio-isoamílico em proporção de 25:24:1 Procedimento

1. Adicionar 10% do volume de NaOAc ao DNA (por exemplo:50 ul a 500 ul)

2. Adicione volume igual de fenol-clorofórmio-isopropanol, com cuidado para tirar da fase inferior/mais pesada; misture em círculo.

3. Centrifugue a 12,000 g por 5 min

4. Transfira a fase superior para um tubo novo

5. Adicione 2,5 volumes de etanol 100% frio, misture em círculo. O líquido deve parecer nublado caso haja muito DNA.

6. Coloque a -80C por 10 minutos ou em gelo seco

7. Centrifugue na velocidade máxima por 10 minutos, a 4C, caso possível. Remova a maioria do sobrenadante (deixe ~ 50 ul)

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8. Lave com 1 ml de etanol 70% frio, adicionando lavagem sem ação mecânica adicional (não perturbe ativamente a pelota).

9. Centrifugar por 5 min a velocidade máxima

10. Remova a maioria do etanol a 70%; deixar secar ao ar por 10 a 30 min

11. Suspenda novamente em 20 a 30 ul de água ou tampão TE Observações:

Volumes otimizados para tubos de microcentrífuga:

400 ul de DNA ul NaOAc z

o 440 ul Álcool fenol-clorofórmio-isoamílico o Fase superior recuperada ~ 400 ul

Adicione 1 ml de ETOH 100% [000106] O DNA foi transformado em células de levedura de acordo com o procedimento abaixo:

Protocolo de Eletroporação de Pichia (Bio-Rad Gene Pulser Xcell™ Total System #1652660)

Estirpe de Pichia - WT Pichia de DNA2.0 transformada com plasmídeo de co-expressão P4HA/B e selecionada em placa Hygro (200/ml). Clone #4

1. Uma colônia única foi inoculada em meio YPD 100 ml e cultivada a 30 graus durante a noite com agitação (215 rpm).

2. No dia seguinte a cultura atinge OD600 ~ 3,5 (~ 3-5 X 10⁷células/OD600). Dilua a cultura com fresco YPD para OD600 ~ 1,7 e deixe-a crescer por mais uma hora a 30 graus com agitação (215 rpm).

3. Gire as células a 3,500g por 5 min; lave uma vez com água e suspenda novamente em 10 ml de Tris-HCl 10 mM (pH 7,5), LiAc 100 mM, 10 mM DTT (adicione fresco), 0,6 M de Sorbitol

4. Para cada transformação, realize alíquota 8 X 10⁸ células em 8 ml de Tris-HCl 10 mM (pH 7,5), LiAc 100 mM, DTT 10 mM, Sorbitol 0,6 M e incube à temperatura ambiente por 30 min.

Petição 870180055798, de 28/06/2018, pág. 48/81 / 51

5. Centrifugue as células a 5000g por 5 minutos e lave com 1,5 ml de Sorbitol 1M gelado 3 vezes e suspensa novamente em 80 ul de Sorbitol 1M gelado

6. Adicione várias quantidades (cerca de 5 pg) de DNA linearizado às células e misture por pipetagem.

7. Adicione as células e mistura de DNA (80 a 100ul) dentro de cuvete de 0,2 cm e pulse utilizando o protocolo de Pichia (1500 v, 25 uF, 200Ω)

8. Transfira imediatamente as células dentro de 1 ml de mistura de YPD e Sorbitol 1M (1:1) e incube a 30 graus por > 2 horas

9. Coloque em placa as células em densidades diferentes.

[000107] Inocule as colônias únicas em 2 mL de meio BMGY em uma placa de 24 poços profundos e deixe crescer por pelo menos 48 horas a 30 graus Celsius com agitação a 900 rpm. As células resultantes foram testadas para colágeno utilizando lise celular, SDS-page e ensaio de pepsina seguindo o procedimento abaixo.

[000108] As células foram lisadas utilizando o seguinte procedimento: Preparação de 1x tampão de lise. A receita a seguir é adequada para preparar uma combinação de 50 amostras.

2,5 ml de HEPES 1 M; concentração final 50 mM.

438,3 mg de NaCl; concentração final 150 mM.

ml de glicerol; concentração final 10%.

0,5 ml de Triton X-100; concentração final 1%.

ml de água Millipure.

Armazenar o tampão em 4^oC por 1 mês.

Utilizando um Qiagen TissueLyser, lise células Pichia pastoris.

Velocidade:30hz

Tempo:15 min (contínuo)

Centrifugue o lisado a 2500rpm por 15 min em centrífuga de mesa. Recolher cerca de 600ul de sobrenadante em um tubo fresco ou placa de 96 poços

Petição 870180055798, de 28/06/2018, pág. 49/81 / 51 profundos. Descarte a pelota.

A SDS-Page foi realizada utilizando o seguinte procedimento:

Preparação de Tampões e Soluções

Misture 50 ml de Tampão 20X Tris-Acetato SDS Pierce ™ com 950 ml de Água Millipure para obter o tampão SDS 1X Tris-Acetato.

Adicione 1500 ml de tampão 1X Tris-Acetate SDS a cada câmara do Mini ou Midi Gel Tank.

SDS-PAGE - Cada gel irá conter o seguinte: Marcadores de Peso Molecular, Controle Negativo, Controle(s) Positivo(s), Amostras.

Preparação de Gel

Abra o invólucro de plástico ao redor do gel.

Retire o pente de poço do gel.

Remova a fita branca do gel.

Coloque o gel no Midi Gel Tank de acordo com as instruções do fabricante.

Enxague os poços de gel com 5 ml de tampão 1X Tris-Acetato SDS, 1 ml de cada vez.

Aspire as bolhas e assegure que todos os poços estão submersos em Tampão 1X Tris-Acetate SDS.

Preparação de amostras para o carregamento de gel SDS-PAGE.

Descongele amostras e controles no gelo.

Dilua o tampão LDS para 2X e adicione 10% de 2-mercaptoetanol no volume final, complete o volume com água.

Misture cada amostra e LDS + 2-ME em uma proporção de 1:1

Misture em círculo brevemente e centrifugue as amostras.

Incube todas as amostras em 70^oC por 7 minutos

Permita que as amostras esfriem até a temperatura ambiente e centrifugue brevemente.

Carregamento de amostra

Adicione 20 pL de controle e amostras e 10 pL de peso molecular padrão a

Petição 870180055798, de 28/06/2018, pág. 50/81 / 51 cada poço

Realize eletroforese para 1 a 4 Midi Gel Tanks

Crie um programa de uma etapa no PowerEase® 300W.

A primeiro etapa é de 150 V por uma hora e 10 minutos.

Anexe a tampa do Midi Gel Tank à base de acordo com as instruções do fabricante.

Conecte os cabos de alimentação às saídas corretas no PowerEase® 300W, certificando-se de que o cabo vermelho esteja conectado à saída vermelha e que o cabo preto esteja conectado à saída preta.

Repita conforme necessário para até 4 Midi Gel Tanks.

Execute o programa de uma etapa.

Prepare o gel para transferência.

Desligue o PowerEase® 300W.

Desconecte os cabos do Midi Gel Tank do PowerEase® 300W.

Remova a tampa do Midi Gel Tank.

Remova o gel do Midi Gel Tank.

Utilizando a faca para gel incluída com o Midi Gel Tank, abra o revestimento de plástico do gel colocando a lâmina da faca na fenda de plástico e torcendo a faca. Repita este movimento ao longo da fenda até que o revestimento de plástico seja separado em dois.

Segure o revestimento de plástico com o gel anexo com o lado do gel para baixo sobre a Caixa de Coloração da Nalgene ™ contendo água e pressione levemente a faca para gel no sulco de ânodo para soltar o gel na Caixa de Coloração.

Repita o procedimento a seguir 3 vezes para lavar o gel na água Millipore. Incube por 30 segundos

Decante a água

Coloração com Coomassie:

Adicione 10-20 ml de Solução de Coloração de Proteína PageBlue e incube à

Petição 870180055798, de 28/06/2018, pág. 51/81 / 51 temperatura ambiente por 60 minutos com agitação suave em um agitador. Os géis podem ser colorizados durante a noite sem afetar o fundo.

Elimine a solução de coloração e lave o gel duas vezes com água MilliporeMillipure. Descarte a solução de coloração e a água em um recipiente de resíduos de risco biológico designado, não ralo abaixo.

Adicione 20ml de água para descolorizar. A descoloração completa levará de 10 a 12 horas. Para acelerar a descoloração, adicione um pouco de metanol à água. Substituir a água com frequência melhorará a descoloração.

[000109] O ensaio de pepsina foi realizado com o seguinte procedimento:

1. Antes do tratamento com pepsina, realize o ensaio de BCA para obter a proteína total de cada amostra de acordo com o protocolo da Thermo Scientific. Normalize a proteína total para a menor concentração para todas as amostras. (Observação: caso a menor concentração de proteína total seja menor que 0,5mg/mL, não use essa concentração para normalização)

2. Coloque 100 uL de lisado em um tubo de microcentrífuga.

3. Crie uma mistura principal contendo o seguinte:

a. 37% de HCl (0,6mL de ácido por 100mL) e

b. Pepsina (estoque é 1mg/mL em água desionizada e a adição final de pepsina deve estar na proporção de 1:25 pepsina: proteína total (peso:peso).

c. Com base na etapa 1 da normalização de proteína total, a quantidade de pepsina variará de acordo com a adição final, ajuste utilizando a planilha criada.

4. Após a adição de pepsina, misture 3X com pipeta e permita que as amostras incubem durante uma hora à temperatura ambiente para que a reação de pepsina ocorra.

5. Após uma hora, adicione volume 1:1 de tampão de carregamento LDS contendo β-mercaptoetanol para cada amostra e permita que a incubação durante 7 minutos a 70^oC. (Nesta situação, deve ser adicionado 100uL de LDS).

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6. Em seguida, gire a 14.000 rpm por 1 minuto para remover a turbidez.

7. Adicione 18μL do topo da amostra dentro de um TAE 3-8% (utilizando tampão TAE) e execute o gel durante 1h 10 minutos a 150V. Ou, depois de ferver, pode-se colocar imediatamente amostras em -80^oC até que um gel precise ser executado.

[000110] Os resultados são mostrados na Tabela 1 abaixo.

EXEMPLO 2

Levedura produzindo colágeno recombinante [000111] Repetiu-se o exemplo 1 seguindo os mesmos procedimentos e protocolos com as seguintes alterações: Inseriu-se uma sequência de DNA MMV77 (Sequência 10), incluindo uma sequência de colágeno bovino otimizada para expressão de Pichia (col3A1 otimizado por bovino, sequência 2), dentro da levedura. Utilizou-se um promotor pAOX1 (Sequência 3) para dirigir a expressão da sequência de colágeno. Utilizou-se uma placa YPD contendo Zeocina a 500ug/ml para selecionar transformantes bem-sucedidos. A estirpe resultante foi PP8.O vetor MMV77 é mostrado na Figura 2.

A digestão por restrição foi feita utilizando Pme I.

[000112] As cepas foram cultivadas em meio BMMY e testadas para colágeno. Os resultados são mostrados na Tabela 1 abaixo.

EXEMPLO 3

Levedura produzindo quantidade maior de colágeno recombinante [000113] Repetiu-se o exemplo 1 seguindo os mesmos procedimentos e protocolos com as seguintes alterações: Inseriu-se uma sequência de DNA MMV-129 (Sequência 11), incluindo uma sequência de colágeno bovino otimizada para expressão de Pichia, dentro da levedura. Utilizou-se um promotor pCAT (Sequência 7) para dirigir a expressão da sequência de colágeno. Utilizou-se uma placa YPD contendo Zeocina a 500ug/ml para selecionar transformantes bem-sucedidos. A estirpe resultante foi PP123.

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MMV129 foi digerido por Swa I e transformado em PP1 para gerar PP123.O vetor MMV129 é mostrado na Figura 3.

[000114] As cepas foram cultivadas em meio BMGY e testadas para colágeno. Os resultados são mostrados na Tabela 1 abaixo.

EXEMPLO 4

Levedura produzindo quantidade ideal de colágeno recombinante [000115] Repetiu-se o exemplo 1 seguindo os mesmos procedimentos e protocolos com as seguintes alterações:

[000116] Inseriu-se uma sequência de DNA MMV-130 (Sequência 12) incluindo uma sequência de colágeno bovino (Sequência 2) otimizada para expressão de Pichia, dentro da levedura. Utilizou-se um promotor pDF (Sequência 6) para dirigir a expressão da sequência de colágeno. Utilizou-se uma plataforma de integração AOX1 (cortada por Pme I, sequência 8) para ajudar na integração de local específico do vetor dentro genoma de Pichia. Utilizou-se uma placa YPD contendo Zeocina a 500ug/ml para selecionar transformantes bem-sucedidos. A estirpe resultante foi PP153.MMV130 foi digerido por Pme I e transformado em PP1 para gerar PP153.(Col3A1 de bovino otimizado, sequência 2).

A extração de fenol não foi utilizada e o kit de purificação PureLink PCR foi utilizada para recuperar o DNA linearizado.

[000117] As cepas foram cultivadas em meio BMGY e testadas para colágeno. Os resultados são mostrados na Tabela 1 abaixo.

EXEMPLO 5

Levedura destinada a produzir colágeno hidroxilado recombinante [000118] Repetiu-se o exemplo 2 seguindo os mesmos procedimentos e protocolos com as seguintes alterações: Inseriu-se um vetor de DNA, MMV78 (Sequência 13), contendo tanto sequências de P4HA bovino (Sequência 4) como P4HB bovino (sequência 5), dentro da levedura.MMV78 foi digerido por Pme I e transformado em PP1 para gerar PP8.Tanto o P4HA como o

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P4HB contêm os seus peptídeos sinal endógenos e são conduzidos pelo promotor bidirecional Das1-Das2 (Sequência 25). O DNA foi digerido por Kpn I e transformado em PP8 para gerar PP3.Sequência 2.O vetor MMV78 é mostrado na Figura 5.

[000119] As estirpes foram cultivadas em meios BMMY e testadas para colágeno e hidroxilação. Os resultados são mostrados na Tabela 1 abaixo.

EXEMPLO 6

Levedura produzindo colágeno hidroxilado recombinante [000120] Repetiu-se o exemplo 2 seguindo os mesmos procedimentos e protocolos com as seguintes alterações: Inseriu-se um vetor de DNA, MMV78, contendo sequências de tanto P4HA bovino como de P4HB bovino, dentro da levedura. Tanto P4HA como P4HB contêm os seus peptídeos sinal endógenos e são dirigidos pelo promotor bidirecional Das1-Das2.O DNA foi digerido por Kpn I e transformado em PP8 para gerar PP3.Sequência 2.

[000121] Utilizou -se e também inseriu-se outro vetor, MMV-94 (Sequência 14), contendo P4HB conduzido pelo promotor pAOX1, dentro da levedura. O peptídeo sinal endógeno de P4HB foi substituído pelo peptídeo sinal de PHO1. A estirpe resultante foi PP38. O MMV94 foi digerido pelo Avr II e transformado em PP3 para gerar PP38. O vetor MMV94 é mostrado na Figura 6.

[000122] As estirpes foram cultivadas em meios BMMY e testadas para colágeno e hidroxilação. Os resultados são mostrados na Tabela 1 abaixo.

EXEMPLO 7 [000123] Levedura produzindo quantidade maior de colágeno hidroxilado recombinante [000124] Repetiu-se o exemplo 4 seguindo os mesmos procedimentos e protocolos com as seguintes alterações: Inseriu-se vetor de DNA, MMV-156 (Sequência 15), contendo tanto sequência de P4HA bovina como de P4HB bovinas, dentro da levedura. O P4HA contém seus peptídeos sinais endógenos

Petição 870180055798, de 28/06/2018, pág. 55/81 / 51 e a sequência de sinal de P4HB foi substituída com uma sequência pré do fator Alfa (Sequência 21). Ambos os genes foram dirigidos pelo promotor bidirecional pHTX1 (Sequência 25). O MMV156 foi digerido por Bam HI e transformado em PP153 para gerar PP154.Sequência 2.O vetor MMV156 é mostrado na Figura 7. As cepas foram cultivadas em meios BMGY e testadas para colágeno e hidroxilação. Os resultados são mostrados na Tabela 1 abaixo.

EXEMPLO 8 [000125] Levedura produzindo quantidade otimizada de colágeno hidroxilado recombinante

Repetiu-se o exemplo 4 seguindo os mesmos procedimentos e protocolos com as seguintes alterações: Inseriu-se um vetor de DNA, MMV-156, contendo sequências tanto de P4HA bovino como de P4HB bovino, dentro da levedura. O P4HA contém os seus peptídeos sinais endógenos e a sequência de sinal de P4HB foi substituída pela sequência pré do fator alfa. Ambos os genes foram conduzidos pelo promotor bidirecional pHTX1. O DNA foi digerido por Swa I e transformado em PP153 para gerar PP154. Sequência 2.

[000126] Inseriu-se também outro vetor, MMV-191 (Sequência 16), contendo P4HA e P4HB, dentro da levedura. A cópia extra de P4HA contém o seu peptídeo sinal endógeno e a cópia extra de sequência de sinal de P4HB foi substituída pela sequência Pré-Pro do Fator Alfa (Sequência 22). As cópias extras de P4HA e P4HB foram conduzidas pelo promotor bidirecional pGCW14-GAP1 (Sequência 23). O MMV191 foi conduzido por Bam HI e transformado em PP154 para gerar PP268.O vetor MMV191 é mostrado na Figura 8. As estirpes foram cultivadas em meios BMGY e testadas para colágeno e hidroxilação. Os resultados são mostrados na Tabela 1 abaixo. EXEMPLO 9

Vetor multifuncional

Petição 870180055798, de 28/06/2018, pág. 56/81 / 51 [000127] Utilizaram-se os métodos e procedimentos do exemplo 1 para criar um vetor multifuncional. O vetor multifuncional contém DNA de colágeno e promotor e terminador associados, o DNA para as enzimas que hidroxilam o colágeno e os promotores e terminadores associados, o DNA para a expressão do marcador e o promotor e terminador associado, o DNA para a(s) origem(ns) de replicação para bactérias e leveduras e o(s) DNA(s) com homologia ao genoma de levedura para integração. O vetor multifuncional contém locais de restrição exclusivos estrategicamente colocados 5',3' ou dentro dos componentes acima. Quando se deseja qualquer modificação na expressão de colágeno ou outros componentes do vetor, o DNA para componentes selecionados pode ser facilmente eliminado com enzimas de restrição e substituído pelo método de clonagem escolhido pelo usuário. A versão mais simples do vetor multifuncional (MMV208, Sequência 17) inclui todos os componentes acima exceto promotor(es) para enzimas hidroxilase. O vetor MMV208 foi feito utilizando os seguintes componentes: Homologia de AOX de MMV84 (Sequência 18), Homologia ribossômica de MMV150 (Sequência 19), Origens de replicação bacteriana e de levedura de MMV140 (Sequência 20), Marcador de Zeocina de MMV140 e Col3A1 de MMV129.Versões modificadas de P4HA e B e terminadores associados foram sintetizadas a partir de Genscript, eliminando os seguintes locais de restrição: AvrII, NotI, PvuI, PmeI, Bam HI, SacII, SwaI, XbaI, SpeI. O vetor foi transformado na estirpe PP1.

[000128] As estirpes foram cultivadas em meio BMGY e testadas para colágeno e hidroxilação. Os resultados são mostrados na Tabela 1 abaixo. Tabela 1

Exemplo	Colágeno (g/L)	Colágeno Hidroxilado
(%)
1*	0,05	0
2	01	0

Petição 870180055798, de 28/06/2018, pág. 57/81 / 51

3	0,5	0
4	1- 1,5	0
5*	0,1	15
6	0,1	35
7	1 - 1,5	15
8	1 - 1,5	40-50
9	0,5 - 1	15 - 20

* Exemplos Comparativos; a fim de quantificar o colágeno, utilizaram-se géis colorizados com coomassie. Uma curva padrão de colágeno foi utilizada para determinar a concentração de colágeno nas amostras. A quantidade de colágeno hidroxilado foi estimada comparando a banda de amostra com uma banda padrão após tratamento 1:25 de pepsina.

[000129] Conforme discutido acima, o colágeno hidroxilado é estável em concentração alta de pepsina, portanto, é útil não apenas ter quantidades aumentadas de colágeno a partir de uma fermentação, mas também ter colágeno hidroxilado.

Interpretação da Descrição [000130] A terminologia utilizada neste documento tem a finalidade de descrever modalidades particulares apenas e não se destina a limitar a invenção. Por exemplo, conforme utilizado neste documento, as formas singulares “um”, “uma” e o/a estão destinadas a incluir também as formas plurais, a menos que o contexto indique claramente de outra forma. Compreender-se-á, adicionalmente, que os termos “compreende” e/ou “compreendendo,” quando usados neste relatório descritivo, especificam a presença de características, etapas, operações, elementos e/ou componentes indicados, mas não impossibilitam a presença ou a adição de uma ou mais outras características, etapas, operações, elementos, componentes e/ou grupos dos mesmos.

Petição 870180055798, de 28/06/2018, pág. 58/81 / 51 [000131] Embora os termos “primeiro” e “segundo” possam ser utilizados neste documento para descrever vários característica/elementos (incluindo etapas), esses característica/elementos não devem ser limitados por esses termos, a menos que o contexto indique o de outra forma. Esses termos podem ser utilizados para distinguir um característica/elemento de outro característica/elemento. Assim, uma primeira característica/elemento discutida abaixo pode ser denominada uma segunda característica/elemento e, de modo semelhante, uma segunda característica/elemento discutido abaixo pode ser denominada uma primeira característica/elemento sem se afastar dos ensinamentos da presente invenção.

[000132] Através desta especificação específica e as reivindicações que se seguem, a menos que o contexto exija de outro modo, a palavra compreender, assim como variações tais como compreende e compreendendo significa que vários componentes podem ser empregados conjuntamente nos métodos e artigos (por exemplo, composições e aparatos incluindo dispositivos e métodos). Por exemplo, o termo “compreendendo” será entendido como implicando a inclusão de quaisquer elementos ou etapas declaradas, mas não a exclusão de quaisquer outros elementos ou etapas.

[000133] Embora várias modalidades ilustrativas sejam descrias acima, diversas mudanças podem ser feitas a várias modalidades sem divergir do escopo da invenção conforme descrito pelas reivindicações. Por exemplo, a ordem na qual as várias etapas dos métodos descritos são executadas pode ser alterada frequentemente em modalidades alternativas e, em outras modalidades alternativas, uma ou mais etapas do método podem ser totalmente ignoradas. Funções opcionais de várias modalidades de dispositivos e sistemas podem ser incluídas em algumas modalidades e não em outras. Portanto, a descrição anterior é fornecida principalmente para fins exemplificativos e não deve ser interpretada como limitando o escopo da invenção conforme estabelecido nas reivindicações.

Petição 870180055798, de 28/06/2018, pág. 59/81 / 51 [000134] Os exemplos e ilustrações incluídos neste documento mostram, a título de ilustração e não de limitação, modalidades específicas nas quais o assunto inventivo pode ser praticado. Conforme mencionado, outras modalidades podem ser utilizadas e derivadas destas, tal que mudanças e substituições estruturais e lógicas possam ser feitas sem divergir do escopo desta divulgação. Tais modalidades do assunto inventivo podem ser referenciadas, individual ou coletivamente, neste documento, pelo termo “invenção”, meramente pela conveniência e sem a intenção de voluntariamente limiar o escopo desta aplicação a qualquer invenção ou conceito inventivo, caso mais de um seja de fato divulgado. Assim, apesar de modalidades específicas terem sido ilustradas e descritas neste documento, qualquer arranjo projetado para alcançar o mesmo propósito pode ser substituído pelas modalidades específicas mostradas. Esta divulgação destinase a abranger quaisquer e todas as adaptações ou variações de várias modalidades. Combinações das modalidades acima e outras modalidades não especificamente descritas neste documento serão evidentes àqueles versados na técnica ao revisar a descrição acima.

INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA [000135] Todas as publicações e pedidos de patente mencionadas neste relatório descritivo são incorporados neste documento por referência em suas totalidades na mesma medida como se cada publicação, patente ou pedido de patente individual fosse indicado especificamente e individualmente para ser incorporado por referência, especialmente referenciada é a divulgação que aparece na mesma sentença, parágrafo, página ou seção do relatório no qual a incorporação por referência aparece.

Claims

1. Estirpe de levedura manipulada geneticamente para produzir colágeno não hidroxilado, caracterizada pelo fato de que compreende:

(i) Uma estirpe de levedura; e (ii) Um vetor compreendendo uma sequência de DNA para colágeno; uma sequência de DNA para um promotor de colágeno; uma sequência de DNA para um terminador de colágeno; uma sequência de DNA para um marcador de sequência, uma sequência de DNA para um promotor para o marcador de seleção; uma sequência de DNA para um terminador para marcador de seleção; uma sequência de DNA para uma origem de replicação selecionada dentre uma bactéria e uma levedura; e uma sequência de DNA contendo homologia com o genoma de levedura, em que o vetor foi inserido dentro da estirpe de levedura ou mantido de maneira epissomal.

2. Estirpe de levedura de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a estirpe de levedura é selecionada do grupo consistindo em aquelas do gênero Arxula, Candida, Komagataella, Pichia, Hansenula, Ogataea, Saccharomyces, Cryptococcus e combinações destes.

3. Estirpe de levedura de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a sequência de DNA para o colágeno é selecionada do grupo consistindo em colágeno bovino, suíno, de canguru, de jacaré, de crocodilo, de elefante, de girafa, de zebra, de lhama, de alpaca, de cordeiro, de dinossauro, marinho, bactérias e combinações destes.

4. Estirpe de levedura de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a sequência de DNA para o colágeno é selecionada dentre um DNA de colágeno nativo, DNA de colágeno manipulado e um DNA de colágeno otimizado por códon.

5. Estirpe de levedura de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a sequência de DNA para o promotor é

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2 / 7 selecionada do grupo consistindo em DNA para o promotor induzido por metanol AOX1, DNA para o promotor desreprimido por PDF, DNA para o promotor desreprimido por PCAT, DNA para o promotor bidirecional induzido por metanol Das1-Das2, DNA para o promotor constitutivo bidirecional PHTX1, DNA para um promotor de histona CHO, DNA para o promotor constitutivo bidirecional PGCW14-PGAP1 e combinações destas.

6. Estirpe de levedura de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a sequência de DNA para o marcador de seleção é selecionada do grupo consistindo em um DNA para resistência a antibióticos e um DNA para marcador auxotrófico.

7. Estirpe de levedura de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o antibiótico é selecionado do grupo que consiste em higromicina, zeocina, geneticina e combinações destes.

8. Estirpe de levedura de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o vetor é inserido dentro da levedura através de um método selecionado do grupo que consiste em eletroporação, transformação química e acoplamento.

9. Método para produzir colágeno não hidroxilado, caracterizado pelo fato de que compreende;

(i) fornecer uma estirpe de levedura como definida na reivindicação 1; e (ii) crescer a estirpe em um meio por um período de tempo suficiente para produzir colágeno.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a estirpe de levedura é selecionada do grupo consistindo em aquelas do gênero Arxula, Candida, Komagataella, Pichia, Hansenula, Ogataea, Saccharomyces, Cryptococcus e combinações destes.

11. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de o meio é selecionado do grupo consistindo em meio tamponado

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3 / 7 complexo contendo gliceral (BMGY), meio tamponado complexo contendo metanol (BMMY) e extrato de dextrose peptona de levedura (YPD).

12. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o período de tempo é de 24 horas a 72 horas.

13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a levedura é selecionada do grupo consistindo em aquelas do gênero Arxula, Candida, Komagataella, Pichia, Hansenula, Ogataea, Saccharomyces, Cryptococcus e combinações destes.

14. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a sequência de DNA para o colágeno é selecionado do grupo consistindo em colágeno bovino, suíno, de canguru, de jacaré, de crocodilo, de elefante, de girafa, de zebra, de lhama, de alpaca, de cordeiro, de dinossauro e combinações destes.

15. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a sequência de DNA para o promotor é selecionada do grupo consistindo em DNA para o promotor constitutivo bidirecional PHTX1 e o DNA para o promotor bidirecional constitutivo PGCW14-PGAP1.

16. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a sequência de DNA para o marcador de seleção é selecionada do grupo consistindo em DNA para resistência antibiótica e um DNA para marcador auxotrófico.

17. Estirpe de levedura manipulada geneticamente para produzir colágeno hidroxilado, caracterizada pelo fato de que compreende:

(i) uma estipe de levedura;

(ii) um vetor compreendendo uma sequência de DNA para colágeno, uma sequência de DNA para um promotor de colágeno, uma sequência de DNA para um terminador, uma sequência de DNA para um marcador de seleção, uma sequência de DNA para um promotor para o marcador de seleção, uma sequência de DNA para um terminador para

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4 / 7 marcador de seleção, uma sequência de DNA para uma origem de replicação para bactéria e/ou levedura, uma sequência de DNA contendo homologia com o genoma de levedura, em que o vetor foi inserido dentro da estirpe de levedura; e (iii) um segundo vetor compreendendo uma sequência de DNA para P4HA1, uma sequência de DNA para P4HB e pelo menos uma sequência de DNA para um promotor, em que os vetores foram inseridos dentro da estirpe de levedura.

18. Estirpe de levedura de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que a estirpe de levedura é selecionada do grupo consistindo em aquelas do gênero Arxula, Candida, Komagataella, Pichia, Hansenula, Ogataea, Saccharomyces, Cryptococcus e combinações destes.

19. Estirpe de levedura de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que a sequência de DNA para o colágeno é selecionada do grupo consistindo em colágeno bovino, suíno, de canguru, de jacaré, de crocodilo, de elefante, de girafa, de zebra, de lhama, de alpaca, de cordeiro, de dinossauro e combinações destes.

20. Estirpe de levedura de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que a sequência de DNA para o colágeno é selecionada dentre um DNA de colágeno nativo, DNA de colágeno manipulado e um DNA de colágeno otimizado.

21. Estirpe de levedura de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que a sequência de DNA para o promotor é selecionada do grupo consistindo em DNA para o promotor induzido por metanol AOX1, DNA para o promotor desreprimido por PDF, DNA para o promotor desreprimido por PCAT, DNA para o promotor bidirecional induzido por metanol Das1-Das2, DNA para o promotor constitutivo bidirecional PHTX1, DNA para um promotor de histona CHO, DNA para o promotor constitutivo bidirecional PGCW14-PGAP1 e combinações destes.

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5 / 7

22. Estirpe de levedura de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que a sequência de DNA para o promotor é selecionada do grupo consistindo em DNA para o promotor constitutivo bidirecional PHTX1 e o DNA para o promotor bidirecional constitutivo PGCW14-PGAP1.

23. Estirpe de levedura de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que a sequência de DNA para o marcador de seleção é selecionada do grupo consistindo em DNA para o DNA de resistência antibiótica e um DNA para marcador auxotrófico.

24. Estirpe de levedura de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que o antibiótico é selecionado do grupo que consiste em higromicina, zeocina, geneticina e combinações destes.

25. Estirpe de levedura de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que o vetor é inserido dentro da levedura através de um método selecionado do grupo que consiste em eletroporação, transformação química e acoplamento.

26. Método para produzir colágeno hidroxilado, caracterizado pelo fato de que compreende;

(iii) fornecer uma estirpe de levedura como definida na reivindicação 17; e (iv) crescer a estirpe em um meio por um período de tempo suficiente para produzir colágeno.

27. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a estirpe de levedura é selecionada do grupo consistindo em aquelas do gênero Arxula, Candida, Komagataella, Pichia, Hansenula, Ogataea, Saccharomyces, Cryptococcus e combinações destes.

28. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o meio é selecionado do grupo consistindo em BMGY, BMMY e YPD.

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6 / 7

29. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o período de tempo é de 24 horas a 72 horas.

30. Método de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que a levedura é selecionada do grupo consistindo em aquelas do gênero Arxula, Candida, Komagataella, Pichia, Hansenula, Ogataea, Saccharomyces, Cryptococcus e combinações destes.

31. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pelo fato de que o DNA para o colágeno é selecionado do grupo consistindo em colágeno bovino, suíno, de canguru, de jacaré, de crocodilo, de elefante, de girafa, de zebra, de lhama, de alpaca, de cordeiro, de dinossauro e combinações destes.

32. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o DNA para o promotor é selecionado do grupo consistindo em DNA para o promotor constitutivo bidirecional PHTX1 e o DNA para o promotor bidirecional constitutivo PGCW14-PGAP1.

33. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o DNA para o marcador de seleção é selecionado do grupo consistindo em um DNA para uma resistência antibiótica e um DNA para um marcador auxotrófico.

34. Vetor multifuncional, caracterizado pelo fato de que compreende:

(i) um DNA necessário para produzir colágeno, incluindo um promotor e um terminador;

(ii) um DNA para enzimas de hidroxilação selecionadas do grupo que consiste em P4HA1 e P4HB, incluindo promotores e terminadores;

(iii) um DNA para um marcador de seleção; incluindo um promotor e um terminador;

(iv) um DNA para origens de replicação para leveduras e bactérias;

Petição 870180055798, de 28/06/2018, pág. 66/81

7 / 7 (v) DNAs com homologia ao genoma de levedura para integração dentro genoma; e (vi) Locais de restrição em uma posição selecionada do grupo que consiste em 5', 3', dentro dos DNAs acima e combinações destes, permitindo a clonagem modular.

35. Vetor multifuncional de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que a sequência de DNA necessária para produzir o colágeno é selecionada do grupo consistindo em bovino, suíno, canguru, jacaré, crocodilo, elefante, girafa, zebra, lhama, alpaca, cordeiro, dinossauro e combinações destes.

36. Vetor multifuncional de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que a sequência de DNA para o promotor é selecionada do grupo consistindo em DNA para o promotor constitutivo bidirecional PHTX1 e o DNA para o promotor bidirecional constitutivo PGCW14-PGAP1.

37. Vetor multifuncional de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que o DNA para o marcador de seleção é selecionado do grupo consistindo em um DNA para uma resistência antibiótica e um DNA para um marcador auxotrófico.

38. Vetor multifuncional de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que o antibiótico é selecionado do grupo que consiste em higromicina, zeocina, geneticina e combinações destes.