ES2967088T3 - Cepas de levadura y métodos para controlar la hidroxilación de colágeno recombinante - Google Patents

Cepas de levadura y métodos para controlar la hidroxilación de colágeno recombinante Download PDF

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Abstract

Se describen cepas de levadura genéticamente modificadas para producir mayores cantidades de colágeno no hidroxilado o colágeno hidroxilado. Una secuencia de ADN de colágeno quimérico, que comprende del 10 al 40 por ciento o del 60 al 90 por ciento de ADN optimizado en función de la longitud total del DN de colágeno quimérico. También se describe un vector todo en uno que incluye el ADN necesario para producir colágeno, promotores y enzimas hidroxilantes. También se proporcionan métodos para producir colágeno hidroxilado o no hidroxilado. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Cepas de levadura y métodos para controlar la hidroxilación de colágeno recombinante
Antecedentes de la invención
Campo de la invención
Esta invención se refiere a una secuencia quimérica de ADN de colágeno bovino que comprende una combinación de una sección de SEQ ID NO: 1 que se ha optimizado para su expresión enPichia pastorisy una sección de SEQ ID NO: 1 que no está optimizada, en la que la sección de SEQ ID NO: 1 NO: 1 que se ha optimizado para su expresión enPichia pastoriscomprende del 60 al 90 % de la longitud total de la secuencia quimérica de ADN de colágeno bovino, y la sección de SEQ ID NO: 1 que no está optimizada comprende del 10 al 40 % de la longitud total de la secuencia quimérica de ADN de colágeno, y en la que la sección de SEQ ID NO: 1 que se ha optimizado para su expresión enPichia pastoriscodifica para la secuencia de aminoácidos en el extremo N-terminal de una molécula de colágeno bovino y la sección de SEQ ID NO: 1 que no está optimizada codifica para la secuencia de aminoácidos en el extremo C-terminal de una molécula de colágeno bovino.
La presente invención se refiere además a una cepa de levadura productora de colágeno que comprende un vector, en la que el vector comprende la secuencia quimérica de ADN de colágeno bovino mencionada anteriormente.
La presente invención también se refiere a un método para producir colágeno hidroxilado que comprende hacer crecer la cepa mencionada anteriormente de levadura productora de colágeno en un medio durante de 24 horas a 72 horas.
Descripción de la técnica relacionada
El cuero se usa en una amplia variedad de aplicaciones, incluyendo tapicería de muebles, ropa, zapatos, equipaje, carteras y accesorios, y aplicaciones automotrices. El valor estimado del comercio mundial de cuero es de aproximadamente 100 mil millones de dólares al año. (Future Trends in the World Leather Products Industry and Trade, Organización de las Naciones Unidas para el Desarrollo Industrial, Viena, 2010) y existe una demanda continua y creciente de productos de cuero. Se requieren nuevas formas de satisfacer esta demanda en vista de los costes económicos, ambientales y sociales de la producción de cuero. Para mantenerse al día con las tendencias tecnológicas y estéticas, los productores y usuarios de productos de cuero buscan nuevos materiales que exhiban resistencia, uniformidad y procesabilidad superiores, y propiedades estéticas atractivas y de moda que incorporen componentes naturales.
Dado el crecimiento de la población y el medio ambiente global, habrá una necesidad de materiales alternativos que tengan una estética similar al cuero y funcionalidades mejoradas. El cuero es el pellejo de animal y se compone casi exclusivamente de colágeno. Existe la necesidad de nuevas fuentes de colágeno que puedan incorporarse a materiales de cuero biofabricado.
La producción de cuero biofabricado usando colágeno expresado de manera recombinante enfrenta una serie de desafíos, incluyendo la necesidad de un método para producir colágeno de manera eficiente en las formas y cantidades necesarias para diversas aplicaciones comerciales. Para algunas aplicaciones se desea un componente de colágeno más suave y permeable; en otros, se necesita un componente de colágeno más duro, resistente y duradero.
Se conoce la expresión recombinante de algunos colágenos y proteínas similares al colágeno; véase Bell, documento EP 1232182B1, Bovine collagen and method for producing recombinant gelatin; Olsen, et al., patente estadounidense n.° 6.428.978, Methods for the production of Gelatin and full-length triple helical collagen in recombinant cells; VanHeerde, et al., patente estadounidense n.° 8.188.230, Method for recombinant microorganism expression and isolation of collagen-like polypeptides. Tales colágenos recombinantes no se han usado para producir productos de cuero ni de cuero biofabricado.
Se conocen vectores útiles para expresar proteínas en levaduras; véase Ausubelet al.,En: Current Protocols in Molecular Biology, vol. 2, capítulo 13 Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience, 1988; Grantet al.(1987), Expression and Secretion Vectors for Yeast, en Methods in Enzymology, Ed. Wu y Grossman, Acad. Press, N. Y.
153:516-544; Glover (1986) DNA Cloning, vol. II, IRL Press, Washington, D.C., cap. 3; Bitter (1987), Heterologous Gene Expression in Yeast, en Methods in Enzymology, Eds. Berger y Kimmel, Acad. Press, N. Y.
152:673-684; y The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Eds. Strathernet al.,Cold Spring Harbor Press, vols. I y II (1982). Los vectores de expresión de levaduras están disponibles comercialmente, por ejemplo, tal como se describe en los catálogos de ThermoFisher Scientific (www._thermofisher.com); ATUM (https://www._atum.bio/products/expression-vectors/yeast); o IBA (https://www.Jba-lifesciences.com/cloningyeast-vectors.html) (consultados por última vez el 16 de julio de 2018).
Pichia pastorises una especie de levadura que se ha usado para expresar de manera recombinante proteínas bioterapéuticas, tales como interferón gamma humano, véase Razaghi,et al.,Biologicals 45: 52-60 (2017). Se ha usado para expresar colágeno tipo III y prolil-4-hidroxilasa, véase Vuorela,et al.,EMBO J. 16:6702-6712 (1997). El colágeno y la prolil-4-hidroxilasa también se han expresado enEscherichia colipara producir un material colagenoso, véase Pinkaset al.,ACS Chem. Biol. 6(4):320-324 (2011).
El documento US 2008/081353 da a conocer métodos, reactivos (por ejemplo, vectores) y células huésped para la producción recombinante de colágeno, relacionados con la expresión recombinante de una subunidad de un colágeno o procolágeno y una enzima postraduccional de colágeno o una subunidad de la misma.
El documento CN 102 020 712 da a conocer un colágeno similar al humano para un agente estabilizante de vacunas y un método de producción del mismo. El colágeno similar al humano se obtiene fermentando bacterias de ingeniería de levadura denominadasPichia pastorisX-33/col CGMCC NO.4187.
El documento JP 2011 190210 da a conocer un transformante que produce una proteína de secuencia de repetición de glicina y un método para obtener una proteína de secuencia de repetición de glicina.
Nokelainen M.: “Recombinant human collagens: characterization of type II collagen expressed in insect cells and production of types I-III collagen in the yeastPichia pastoris";Departamento de Bioquímica Médica, Facultad de Medicina, Universidad de Oulu; Oulu University press, 2000, páginas 1-72, da a conocer una producción de una forma recombinante de colágeno humano tipo II en células de insecto. Además, esta tesis se refiere a la expresión de colágeno humano recombinante en levaduras.
Annamari Vuorelaet al.:“Assembly of human prolyl 4-hydroxylase and type III collagen in the yeastPichia pastoris:formation of a stable enzyme tetramer requires coexpression with collagen and assembly of a stable collagen requires coexpression with prolyl-4-hydroxylase", EMBO (European Molecular Biology Organization) JOURNAL, WILEY, DE, vol. 16, n.° 22, 1 de enero de 1997, páginas 6702-6712, se refiere a la expresión de la prolil 4-hidroxilasa y concluye a partir de los datos que la síntesis de colágeno enPichiay probablemente también en otras células implica un mecanismo de control muy inusual.
El documento CA 2134994 da a conocer un método para expresar un gen heterólogo en células de mamífero y un constructo de ADN recombinante para su uso en este método.
Liang Shuliet al.:“Identification and characterization of P-GCW14: a novel, strong constitutive promoter ofPichia pastoris’’,BIOTECHNOLOGY LETTERS, vol. 35, n.° 11, noviembre de 2013, páginas 1865-1871, da a conocer la identificación de un promotor constitutivo novedoso fuerte enPichia pastoris,P GCW14.
El documento US 2016/097053 da a conocer ácidos nucleicos aislados, métodos de expresión, células huésped, vectores de expresión y constructos de ADN para producir proteínas, y proteínas producidas usando los métodos de expresión. Más particularmente, en el mismo se dan a conocer ácidos nucleicos aislados dePichia pastoris,en los que los ácidos nucleicos tienen actividad promotora. Además, este documento de patente se refiere a métodos de expresión, células huésped, vectores de expresión y constructos de ADN, para usar los promotores dePichia pastorispara producir proteínas, y a las proteínas producidas usando los métodos de expresión.
El documento US 2005/112129 da a conocer composiciones de materia útiles para el diagnóstico y tratamiento de tumores en mamíferos y métodos para usar esas composiciones de materia para los mismos.
El uso de la modificación de codones para proporcionar tropocolágeno con un grado selecto de hidroxilación, proporcionando así una gama de diferentes materiales de colágeno para su uso en la producción de cueros obtenidos mediante bioingeniería, no se ha explorado previamente.
Los inventores intentaron abordar estos desafíos mediante la obtención por ingeniería de levaduras recombinantes que puedan expresar abundantemente colágeno en diferentes formas caracterizadas por un grado selectivo de hidroxilación.
Sumario de la invención
Un aspecto de la invención se refiere a una secuencia quimérica de ADN de colágeno bovino según la reivindicación 1.
Otro aspecto de la invención se refiere a una cepa de levadura productora de colágeno según la reivindicación 4. Aún otro aspecto de la invención se refiere a un método para producir colágeno hidroxilado según la reivindicación 6.
Breve descripción de las figuras
La figura 1 muestra diagrama vectorial de MMV-63 que se diseñó para producir colágeno no hidroxilado. La figura 2 muestra diagrama vectorial de MMV-77 que se diseñó para producir colágeno no hidroxilado. La figura 3 muestra diagrama vectorial de MMV-129 que se diseñó para producir colágeno no hidroxilado. La figura 4 muestra diagrama vectorial de MMV-130 que se diseñó para producir colágeno no hidroxilado. La figura 5 muestra diagrama vectorial de MMV-78 que se diseñó para producir colágeno hidroxilado. La figura 6 muestra diagrama vectorial de MMV-94 que se diseñó para producir colágeno hidroxilado. La figura 7 muestra diagrama vectorial de MMV-156 que se diseñó para producir colágeno hidroxilado. La figura 8 muestra diagrama vectorial de MMV-191 que se diseñó para producir colágeno hidroxilado. La figura 9 muestra un vector todo en uno MMV-208 que se diseñó para producir colágeno hidroxilado o no hidroxilado.
La figura 10 muestra el diagrama vectorial de MMV-84.
La figura 11 muestra el diagrama vectorial de MMV-150.
La figura 12 muestra el diagrama vectorial de MMV-140.
La figura 13 muestra el diagrama vectorial de MMV-132.
La figura 14 muestra el diagrama vectorial de MMV-193.
La figura 15 muestra el diagrama vectorial de MMV-194.
La figura 16 muestra el diagrama vectorial de MMV-195.
La figura 17 muestra el diagrama vectorial de MMV-197.
La figura 18 muestra el diagrama vectorial de MMV-198.
La figura 19 muestra el diagrama vectorial de MMV-199.
La figura 20 muestra el diagrama vectorial de MMV-200.
La figura 21 muestra el diagrama vectorial de MMV-128.
La figura 22 describe moléculas de quimera Col3A1.
Descripción detallada de la invención y de la divulgación
El tema al que se hace referencia a continuación en el presente documento como “divulgación” o “realización de la divulgación” no es según la invención y está presente sólo con fines ilustrativos.
Tal como se ejemplifica en el presente documento, se usóPichia pastorispara expresar colágeno bovino tipo III recombinante con diferentes grados de hidroxilación. La hidroxilación de colágeno recombinante se logró mediante coexpresión de P4HA bovina y P4HB bovina que codifican respectivamente para las subunidades alfa y beta de prolil-4-hidroxilasa bovina. Sin embargo, la divulgación no se limita a los productos y la expresión del colágeno tipo III y puede ponerse en práctica con polinucleótidos que codifican para las subunidades de otros tipos de colágenos, así como con enzimas que hidroxilan residuos de prolina, residuos de lisina o residuos tanto de prolina como de lisina. El tropocolágeno tipo III es un homotrímero. Sin embargo, en algunas realizaciones un colágeno formará un heterotrímero que se compone de diferentes cadenas polipeptídicas, tal como colágeno tipo I que inicialmente se compone de dos cadenas pro-a1(I) y una cadena pro-a2(I).
Colágeno.El colágeno es el componente principal del cuero. La piel, o el pellejo de animal, contiene cantidades importantes de colágeno, una proteína fibrosa. El colágeno es un término genérico para una familia de al menos 28 tipos distintos de colágeno; la piel de animal suele ser colágeno tipo I, aunque pueden usarse otros tipos de colágeno para formar cuero, incluyendo colágeno tipo III. El término “colágeno” abarca productos sin procesar (por ejemplo, procolágenos), así como colágenos proteolizados y modificados postraduccionalmente que tienen una estructura de triple hélice.
Los colágenos se caracterizan por un triplete de repetición de aminoácidos, -(Gly-X-Y)n-, y aproximadamente un tercio de los residuos de aminoácidos del colágeno son glicina. X es a menudo prolina e Y es a menudo hidroxiprolina, aunque puede haber hasta 400 posibles tripletes Gly-X-Y. Diferentes animales pueden producir colágenos que tienen diferentes composiciones de aminoácidos, que pueden impartir diferentes propiedades al colágeno y producir cueros que tienen diferentes propiedades o apariencias.
La estructura del colágeno puede consistir en tres cadenas peptídicas entrelazadas de diferentes longitudes. Las triples hélices (o monómeros) de colágeno pueden producirse a partir de cadenas alfa de aproximadamente 1.050 aminoácidos de longitud, de modo que la triple hélice toma la forma de una varilla de aproximadamente 300 nm de largo, con un diámetro de aproximadamente 1,5 nm.
Las fibras de colágeno pueden tener diversos diámetros según el tipo de pellejo de animal. Además del colágeno tipo I, la piel (pellejo de animal) también puede incluir otros tipos de colágeno, incluyendo el colágeno tipo III (reticulina), el colágeno tipo IV y el colágeno tipo VII.
Existen diversos tipos de colágeno en todo el cuerpo de los mamíferos. Por ejemplo, además de ser el componente principal de la piel y el pellejo de animal, el colágeno tipo I también existe en cartílagos, tendones, ligaduras vasculares, órganos, músculos y la porción orgánica del hueso. Se han realizado esfuerzos exitosos para aislar colágeno de diversas regiones del cuerpo de los mamíferos además del pellejo de animal. Hace décadas, los investigadores descubrieron que, a pH neutro, el colágeno solubilizado en ácido se autoensamblaba en fibrillas que se componen de los mismos patrones estriados observados en el tejido nativo; Schmitt F.O. J. Cell. Comp Physiol. 1942;20:11. Esto llevó al uso del colágeno en la ingeniería de tejidos y en una variedad de aplicaciones biomédicas. En años más recientes, se ha obtenido colágeno de bacterias y levaduras mediante técnicas recombinantes.
Los colágenos se forman y estabilizan mediante una combinación de interacciones físicas y químicas que incluyen interacciones electrostáticas tales como puentes salinos, enlaces de hidrógeno, interacciones de Van der Waals, fuerzas dipolo-dipolo, fuerzas de polarización, interacciones hidrófobas y enlaces covalentes, a menudo catalizados por reacciones enzimáticas. Se han identificado diversos tipos distintos de colágeno en vertebrados, incluyendo colágenos bovinos, ovinos, porcinos, de pollo y humanos.
La divulgación puede ponerse en práctica con polinucleótidos que codifican para uno o más tipos de colágeno. Generalmente, los tipos de colágeno están numerados con números romanos y las cadenas que se encuentran en cada tipo de colágeno se identifican con números arábigos. En la técnica están disponibles descripciones detalladas de la estructura y funciones biológicas de los diferentes tipos de colágenos naturales; véase, por ejemplo, Ayadet al.(1998) The Extracellular Matrix Facts Book, Academic Press, San Diego, CA; Burgeson, R E. y Nimmi (1992) “Collagen types: Molecular Structure and Tissue Distribution” en Clin. Orthop. 282:250-272; Kielty, CMet al.(1993) “The Collagen Family: Structure, Assembly And Organization In The Extracellular Matrix”, Connective Tissue And Its Heritable Disorders, Molecular Genetics, And Medical Aspects, Royce, P. M. y B. Steinmann eds., Wiley-Liss, NY, págs. 103-147; y Prockop, D.J- y K.I. Kivirikko (1995) “Collagens: Molecular Biology, Diseases, and Potentials for Therapy”, Annu. Rev. Biochem., 64:403-434.)
El colágeno tipo I es el principal colágeno fibrilar de huesos y piel que comprende aproximadamente el 80-90 % del colágeno total de un organismo. El colágeno tipo I es la principal macromolécula estructural presente en la matriz extracelular de organismos multicelulares y comprende aproximadamente el 20 % de la masa proteica total. El colágeno tipo I es una molécula heterotrimérica que comprende dos cadenas a1(I) y una cadena a2(I), codificadas por los genes COL1A1 y COL1A2, respectivamente.In vivo,el ensamblaje de fibrillas, fibras y haces de fibras de colágeno tipo I tiene lugar durante el desarrollo y proporciona soporte mecánico al tejido al tiempo que permite la motilidad celular y el transporte de nutrientes. Otros tipos de colágeno son menos abundantes que el colágeno tipo I y exhiben patrones de distribución diferentes. Por ejemplo, el colágeno tipo II es el colágeno predominante en el cartílago y el humor vítreo, mientras que el colágeno tipo III se encuentra en niveles elevados en los vasos sanguíneos y, en menor medida, en la piel.
El colágeno tipo II es un colágeno homotrimérico que comprende tres cadenas al(II) idénticas codificadas por el gen COL2A1. El colágeno tipo II purificado puede prepararse a partir de tejidos mediante métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante procedimientos descritos en Miller y Rhodes (1982) Methods In Enzymology 82:33-64.
El colágeno tipo III es un colágeno fibrilar importante que se encuentra en la piel y los tejidos vasculares. El colágeno tipo III es un colágeno homotrimérico que comprende tres cadenas a1(III) idénticas codificadas por el gen COL3A1. Los métodos para purificar el colágeno tipo III de los tejidos pueden encontrarse, por ejemplo, en Byerset al.(1974) Biochemistry 13:5243-5248; y Miller y Rhodes, citado anteriormente, y pueden usarse junto con colágeno expresado mediante un método de la invención según la reivindicación 6.
El colágeno tipo IV se encuentra en las membranas basales en forma de láminas en lugar de fibrillas. Más comúnmente, el colágeno tipo IV contiene dos cadenas a1(IV) y una cadena a2(IV). Las cadenas particulares que comprenden el colágeno tipo IV son específicas de tejido. El colágeno tipo IV puede purificarse usando, por ejemplo, los procedimientos descritos en Furuto y Miller (1987) Methodos in Enzymology, 144:41-61, Academic Press.
El colágeno tipo V es un colágeno fibrilar que se encuentra principalmente en huesos, tendones, córnea, piel y vasos sanguíneos. El colágeno tipo V existe tanto en forma homotrimérica como heterotrimérica. Una forma de colágeno tipo V es un heterotrímero de dos cadenas a1(V) y una cadena a2(V). Otra forma de colágeno tipo V es un heterotrímero de cadenas a1(V), a2(V) y a3(V). Otra forma de colágeno tipo V es un homotrímero de a1(V). Los métodos para aislar colágeno tipo V de fuentes naturales pueden encontrarse, por ejemplo, en Elstow y Weiss (1983) Collagen Rel. Res. 3:181-193, y Abedinet al.(1982) Biosci. Rep. 2:493-502.
El colágeno tipo VI tiene una pequeña región de triple hélice y dos grandes porciones restantes no colagenosas. El colágeno tipo VI es un heterotrímero que comprende cadenas a1(VI), a2(VI) y a3(VI). El colágeno tipo VI se encuentra en muchos tejidos conjuntivos. Pueden encontrarse descripciones de cómo purificar el colágeno tipo VI de fuentes naturales, por ejemplo, en Wuet al.(1987) Biochem. J. 248:373-381, y Kieltyet al.(1991) J. Cell Sci. 99:797-807.
El colágeno tipo VII es un colágeno fibrilar que se encuentra en tejidos epiteliales particulares. El colágeno tipo VII es una molécula homotrimérica de tres cadenas a1 (VII). Pueden encontrarse descripciones de cómo purificar el colágeno tipo VII del tejido, por ejemplo, en Lunstrumet al.(1986) J. Biol. Chem. 261:9042-9048, y Bentzet al.(1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:3168-3172. El colágeno tipo VIII puede encontrarse en la membrana de Descemet en la córnea. El colágeno tipo VIII es un heterotrímero que comprende dos cadenas a1 (VIII) y una cadena a2(VIII), aunque se han informado otras composiciones de cadenas. Los métodos para la purificación del colágeno tipo VIII de la naturaleza pueden encontrarse, por ejemplo, en Benya y Padilla (1986) J. Biol. Chem.
261:4160-4169, y Kapooret al.(1986) Biochemistry 25:3930-3937.
El colágeno tipo IX es un colágeno asociado a fibrillas que se encuentra en el cartílago y el humor vítreo. El colágeno tipo IX es una molécula heterotrimérica que comprende cadenas a1(IX), a2(IX) y a3(IX). El colágeno tipo IX se ha clasificado como colágeno FACIT (colágenos asociados a fibrillas con triples hélices interrumpidas), que posee varios dominios de triple hélice separados por dominios que no son de triple hélice. Los procedimientos para purificar el colágeno tipo IX pueden encontrarse, por ejemplo, en Duance,et al.(1984) Biochem. J.221:885-889; Ayadet al.(1989) Biochem. J.262:753-761; y Grantet al.(1988) The Control of Tissue Damage, Glauert, A. M., ed., Elsevier Science Publishers, Amsterdam, págs. 3-28.
El colágeno tipo X es un compuesto homotrimérico de cadenas a1(X). El colágeno tipo X se ha aislado, por ejemplo, de cartílago hipertrófico que se encuentra en las placas de crecimiento; véase, por ejemplo, Apteet al.(1992) Eur J Biochem 206 (1): 217-24.
El colágeno tipo XI puede encontrarse en los tejidos cartilaginosos asociados con los colágenos tipo II y tipo IX, y en otras ubicaciones del cuerpo. El colágeno tipo XI es una molécula heterotrimérica que comprende cadenas a1(XI), a2(XI) y a3(XI). Pueden encontrarse métodos para purificar colágeno tipo XI, por ejemplo, en Grantet al.,citado anteriormente.
El colágeno tipo XII es un colágeno FACIT que se encuentra principalmente asociado con el colágeno tipo I. El colágeno tipo XII es una molécula homotrimérica que comprende tres cadenas a1(XII). Los métodos para purificar colágeno tipo XII y variantes del mismo pueden encontrarse, por ejemplo, en Dubletet al.(1989) J. Biol. Chem. 264:13150-13156; Lunstrumet al.(1992) J. Biol. Chem. 267:20087-20092; y Wattet al.(1992) J. Biol. Chem. 267:20093-20099.
El tipo XIII es un colágeno no fibrilar que se encuentra, por ejemplo, en la piel, el intestino, los huesos, los cartílagos y los músculos estriados. Una descripción detallada del colágeno tipo XIII puede encontrarse, por ejemplo, en Juvonenet al.(1992) J. Biol. Chem. 267: 24700-24707.
El tipo XIV es un colágeno FACIT caracterizado como una molécula homotrimérica que comprende cadenas a1(XIV). Pueden encontrarse métodos para aislar colágeno tipo XIV, por ejemplo, en Aubert-Foucheret al.(1992) J. Biol. Chem. 267:15759-15764 y Wattet al.,citado anteriormente.
El colágeno tipo XV tiene una estructura homóloga al colágeno tipo XVIII. Puede encontrarse información sobre la estructura y el aislamiento del colágeno natural tipo XV, por ejemplo, en Myerset al.(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10144-10148; Huebneret al.(1992) Genomics 14:220-224; Kivirikkoet al.(1994) J. Biol. Chem.
269:4773-4779; y Muragaki, J. (1994) Biol. Chem. 264:4042-4046.
El colágeno tipo XVI es un colágeno asociado a fibrillas que se encuentra, por ejemplo, en la piel, los fibroblastos pulmonares y los queratinocitos. La información sobre la estructura del colágeno tipo XVI y el gen que codifica para el colágeno tipo XVI puede encontrarse, por ejemplo, en Panet al.(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6565-6569; y Yamaguchiet al.(1992) J. Biochem. 112:856-863.
El colágeno tipo XVII es un colágeno transmembrana hemidesmosal, también conocido como antígeno del penfigoide ampolloso. La información sobre la estructura del colágeno tipo XVII y el gen que codifica para el colágeno tipo XVII puede encontrarse, por ejemplo, en Liet al.(1993) J. Biol. Chem. 268(12):8825-8834; y McGrathet al.(1995) Nat. Genet. 11(1):83-86.
El colágeno tipo XVIII tiene una estructura similar al colágeno tipo XV y puede aislarse del hígado. Las descripciones de las estructuras y el aislamiento del colágeno tipo XVIII de fuentes naturales pueden encontrarse, por ejemplo, en Rehn y Pihlajaniemi (1994) Proc. Natl. Acad. Sci USA 91:4234-4238; Ohet al.(1994) Proc. Natl. Acad. Sci USA 91:4229-4233; Rehnet al.(1994) J. Biol. Chem. 269:13924-13935; y Ohet al.(1994) Genomics 19:494-499.
Se cree que el colágeno tipo XIX es otro miembro de la familia de colágenos FACIT y se ha encontrado en el ARNm aislado de células de rabdomiosarcoma. Las descripciones de las estructuras y el aislamiento del colágeno tipo XIX pueden encontrarse, por ejemplo, en Inoguchiet al.(1995) J. Biochem. 117:137-146; Yoshiokaet al.(1992) Genomics 13:884-886; y Myerset al.,J. Biol. Chem. 289:18549-18557 (1994).
El colágeno tipo XX es un miembro recién descubierto de la familia de colágenos FACIT y se ha identificado en la córnea de los pollitos; véase, por ejemplo, Gordonet al.(1999) FASEB Journal 13:A1119; y Gordonet al.(1998), IOVS 39:S1128.
Pueden expresarse uno o más tipos de colágeno usando un método de la divulgación y el colágeno expresado puede procesarse o purificarse adicionalmente tal como se describe en las referencias citadas anteriormente. El término “colágeno” se refiere a uno cualquiera de los tipos de colágeno conocidos, incluyendo colágenos tipos de I a XX descritos anteriormente, así como a cualquier otro colágeno, ya sea natural, sintético, semisintético o recombinante. Incluye todos los colágenos, colágenos modificados y proteínas similares al colágeno descritos en el presente documento. El término también abarca procolágenos y proteínas similares al colágeno o proteínas colágenas que comprenden el motivo (Gly-X-Y)n donde n es un número entero. Abarca moléculas de colágeno y proteínas similares al colágeno, trímeros de moléculas de colágeno, fibrillas de colágeno y fibras de fibrillas de colágeno. También se refiere a colágenos o moléculas similares al colágeno modificados químicamente, enzimáticamente o recombinantemente que pueden fibrilarse, así como a fragmentos de colágeno, moléculas similares al colágeno y moléculas de colágeno que pueden ensamblarse en una nanofibra. Las moléculas de colágeno recombinantes, ya sean nativas u obtenidas mediante ingeniería, comprenderán generalmente la secuencia -(Gly-X-Y)n- de repetición descrita en el presente documento.
Hidroxilación de residuos de prolina y lisina en colágeno.Las principales modificaciones postraduccionales de los polipéptidos de colágeno son la hidroxilación de residuos de prolina y/o lisina para producir 4-hidroxiprolina, 3-hidroxiprolina (Hyp) y/o hidroxilisina (Hyl), y la glicosilación de los residuos de hidroxilisilo. Estas modificaciones están catalizadas por tres hidroxilasas (prolil 4-hidroxilasa, prolil 3-hidroxilasa y lisil hidroxilasa) y dos glicosiltransferasas.In vivoestas reacciones se producen hasta que los polipéptidos forman la estructura de colágeno de triple hélice, que inhibe modificaciones adicionales.
Prolil-4-hidroxilasa.Esta enzima cataliza la hidroxilación de residuos de prolina a (2S,4R)-4-hidroxiprolina (Hyp). Gorres,et al.,Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology 45 (2): (2010). Los ejemplos a continuación emplean prolil-4-hidroxilasa bovina tetramérica (2 cadenas alfa y 2 cadenas beta) codificada por P4HA (SEQ ID NO: 54) y P4HB (SEQ ID NO: 52), sin embargo, también pueden usarse isoformas, ortólogos, variantes, fragmentos y prolil-4-hidroxilasa de fuentes no bovinas siempre que conserven la actividad hidroxilasa en una célula huésped de levadura. P4HA1 se describe adicionalmente en http://_www.omim.org/entry/176710 y P4HB1 y P4HB1 en http://www.omim.org/entry/176790.
Prolil 3-hidroxilasa.Esta enzima cataliza la hidroxilación de residuos de prolina. Precursor de prolil 3-hidroxilasa 1[Bos tourus]se describe por la Secuencia de Referencia NCBI: NP_001096761.1 o por NM_001103291.1 (SEQ ID NO: 48). Para una descripción adicional véase Vrankaet al.,J. Biol. Chem. 279: 23615-23621 (2004) o hhttp://_www.omim.org/entry/610339 (consultado por última vez el 14 de julio de 2017). Esta enzima puede usarse en su forma nativa. Sin embargo, también pueden usarse isoformas, ortólogos, variantes, fragmentos y prolil-3-hidroxilasa de fuentes no bovinas siempre que conserven la actividad hidroxilasa en una célula huésped de levadura.
Lisil hidroxilasa.La lisil hidroxilasa (EC 1.14.11.4) cataliza la formación de hidroxilisina en colágenos y otras proteínas con secuencias de aminoácidos similares al colágeno, mediante la hidroxilación de residuos de lisina en secuencias X-lys-gly. La enzima es un homodímero que consiste en subunidades con una masa molecular de aproximadamente 85 kD. No se ha encontrado ninguna homología significativa entre las estructuras primarias de la lisil hidroxilasa y los 2 tipos de subunidades de la prolil-4-hidroxilasa (176710, 176790) a pesar de las marcadas similitudes en las propiedades cinéticas entre estas 2 colágeno hidroxilasas. Los residuos de hidroxilisina formados en la reacción de lisil hidroxilasa tienen dos funciones importantes: en primer lugar, sus grupos hidroxilo sirven como sitios de unión para unidades de hidratos de carbono, o bien el monosacárido galactosa o bien el disacárido glucosilgalactosa; y segundo lugar, estabilizan las reticulaciones de colágeno intermoleculares.
Procolágeno-lisina, 2-oxoglutarato 5-dioxigenasa 1 [Sostaurus(ganado)], PLOD1, se describe mediante Gene ID: 281409, actualizado el 25 de mayo de 2017 en https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/281409 (consultado por última vez el 14 de julio de 2017). Otro ejemplo se describe en SEQ ID NO: 50 que describe lisil oxidasa deSos taurus(LOX). Esta enzima puede usarse en su forma nativa. Sin embargo, también pueden usarse isoformas, ortólogos, variantes, fragmentos y lisil hidroxilasa de fuentes no bovinas siempre que conserven la actividad hidroxilasa en una célula huésped de levadura.
Ensayo del grado de hidroxilación de residuos de prolina en colágeno recombinante.El grado de hidroxilación de residuos de prolina en colágeno recombinante puede ensayarse mediante métodos conocidos, incluyendo cromatografía de líquidos-espectrometría de masas tal como se describe por Chan,et al.,BMC Biotechnology 12:51 (2012).
Ensayo del grado de hidroxilación de residuos de lisina en colágeno recombinante.La hidroxilación de lisina y la reticulación del colágeno se describen por Yamauchi,et al.,Methods in Molecular Biology, vol. 446, páginas 95 108.; Humana Press (2008). El grado de hidroxilación de residuos de lisina en colágeno recombinante puede ensayarse mediante métodos conocidos, incluyendo el método descrito por Hausmann, Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Protein Structure 133(3): 591-593 (1967).
Punto de fusión del colágeno.El grado de hidroxilación de residuos de prolina, lisina o de prolina y lisina en el colágeno puede estimarse mediante la temperatura de fusión de un colágeno hidratado, tal como un hidrogel, en comparación con un colágeno de control que tiene un contenido conocido de residuos de aminoácidos hidroxilados. Las temperaturas de fusión del colágeno pueden oscilar entre 25 y 40 °C, teniendo generalmente colágenos más altamente hidroxilados temperaturas de fusión más altas. Este intervalo incluye todos los subintervalos y valores intermedios, incluyendo 25, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 y 40.
Modificación de codones.Este proceso incluye la alteración de una secuencia de polinucleótidos que codifica para colágeno, tal como la secuencia de ADN de colágeno que se encuentra en la naturaleza, para modificar la cantidad de colágeno recombinante expresado por una levadura, tal comoPichia pastoris,para modificar la cantidad de colágeno recombinante secretada por la levadura recombinante, para modificar la velocidad de expresión del colágeno recombinante en la levadura recombinante, o para modificar el grado de hidroxilación de los residuos de lisina o prolina en el colágeno recombinante. La modificación de codones también puede aplicarse a otras proteínas tales como hidroxilasas para fines similares o para dirigir hidroxilasas a compartimentos intracelulares o extracelulares particulares, por ejemplo, para dirigir una prolina hidroxilasa al mismo compartimento, tal como el retículo endoplásmico, como molécula de colágeno recombinante.
Las selecciones de codones pueden realizarse basándose en el efecto sobre la estructura secundaria del ARN, el efecto sobre la transcripción y la expresión génica, el efecto sobre la velocidad de alargamiento de la traducción y/o el efecto sobre el plegamiento de proteínas.
Los codones que codifican para colágeno o una hidroxilasa pueden modificarse para reducir o aumentar la estructura secundaria en el ARNm que codifica para el colágeno recombinante o la hidroxilasa o pueden modificarse para reemplazar un codón redundante con un codón que, en promedio, se usa con mayor frecuencia por una célula huésped de levadura basada en todas las secuencias codificantes de proteínas en la levadura (por ejemplo, muestreo de codones), se usa con menos frecuencia por una célula huésped de levadura basada en todas las secuencias codificantes de proteínas en la levadura (por ejemplo, muestreo de codones), o codones redundantes que aparecen en proteínas que se expresan abundantemente en las células huésped de la levadura o que aparecen en proteínas secretadas por las células huésped de la levadura (por ejemplo, una selección de codones basada en un alto índice de adaptación de codones que hace que el gen “parezca” un gen altamente expresado o un gen que codifica para una proteína secretable del huésped de expresión).
La modificación de codones puede aplicarse a toda o parte de una secuencia codificante de proteína, por ejemplo, a al menos uno del primer, segundo, tercero, cuarto, quinto, sexto, séptimo, octavo, noveno o décimo 10 % de una secuencia codificante o combinaciones de las mismas. También puede aplicarse selectivamente a un codón que codifica para un aminoácido particular o a codones que codifican para algunos, pero no todos, aminoácidos que están codificados por codones redundantes. Por ejemplo, sólo los codones para leucina y fenilalanina pueden someterse a modificación de codones tal como se describió anteriormente. Los aminoácidos codificados por más de un codón se describen mediante la tabla de codones bien conocida en la técnica en https://en.wikipedia.org/wiki/DNA_codon_table (consultado por última vez el 13 de julio de 2017).
La modificación de codones incluye los denominados métodos de optimización de codones descritos en https://www.atum.bio/services/genegps (consultado por última vez el 13 de julio de 2017), en https://www.idtdna.com/CodonOpt; por https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1523223/, o por https://en.wikipedia.org/wiki/DNA2.0Algorithm.
La modificación de codones también incluye la selección de codones para permitir la formación de una estructura secundaria de ARNm o para minimizar o eliminar la estructura secundaria. Un ejemplo de esto es realizar selecciones de codones para eliminar, reducir o debilitar la estructura secundaria fuerte en o alrededor de un sitio de unión a ribosoma o codón de iniciación.
Fragmentos de colágeno.Una molécula de colágeno recombinante puede comprender un fragmento de la secuencia de aminoácidos de una molécula de colágeno nativa que puede formar tropocolágeno (colágeno trimérico) o una molécula de colágeno modificada o molécula de colágeno truncada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos el 70, el 80, el 90, el 95, el 96, el 97, el 98 o el 99 % idéntica o similar a una secuencia de aminoácidos de colágeno nativo (o a una región formadora de fibrillas de la misma o a un segmento que comprende sustancialmente [Gly-X-Y]n), tal como aquellas de secuencias de aminoácidos de Col1A1, Col1A2 y Col3A1, descritas por los números de registro NP_001029211.1 (https://_www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/774042S2, consultado por última vez el 9 de febrero de 2017), NP_776945.1 (https://_www .ncbi.nlm.nih.gov/protein/278062S7 consultado por última vez el 9 de febrero de 2017) y NP_001070299.1 (https://_www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/116003881 consultado por última vez el 9 de febrero de 2017).
Un gen que codifica para colágeno o una hidroxilasa puede truncarse o modificarse de otro modo para añadir o eliminar secuencias. Tales modificaciones pueden realizarse para personalizar el tamaño de un polinucleótido o vector, para dirigir la proteína expresada al retículo endoplásmico u otro compartimento celular o extracelular, o para controlar la longitud de una proteína codificada. Por ejemplo, los inventores descubrieron que los constructos que contienen sólo la secuencia Pre a menudo funcionan mejor que aquellos que contienen la secuencia Pre-pro completa. La secuencia Pre se fusionó con P4HB para localizar P4HB en el RE, donde también se localiza el colágeno.
Secuencias codificantes modificadas para colágenos e hidroxilasas. Una secuencia codificante de polinucleótidos para colágeno o una hidroxilasa, u otras proteínas, puede modificarse para codificar para una proteína que es al menos el 70, el 80, el 90, el 95, el 96, el 97, el 98 o el 100 % idéntica o similar a una secuencia de aminoácidos conocida y que conserva las propiedades esenciales de la molécula no modificada, por ejemplo, la capacidad de formar tropocolágeno o la capacidad de hidroxilasar residuos de prolina o lisina en el colágeno. Pueden eliminarse o añadirse sitios de glicosilación en una molécula de colágeno. Pueden realizarse modificaciones para facilitar la producción de colágeno o su secreción por una célula huésped de levadura o para cambiar sus propiedades estructurales, funcionales o estéticas. Una secuencia codificante de colágeno o hidroxilasa modificada también puede someterse a modificación de codones tal como se describe en el presente documento.
Los términos “colágeno nativo”, “polipéptido nativo” o “polinucleótido nativo” se refieren a polipéptidos o a secuencias de polinucleótidos tal como se encuentran en la naturaleza, por ejemplo, sin deleción, adición o sustitución de residuos de aminoácidos o polinucleótidos, sin alteración de la secuencia nativa, por ejemplo, mediante deleción, inserción o sustitución de un nucleótido, tal como alteración mediante modificación de codones. Los tipos de colágenos y enzimas descritos en el presente documento incluyen sus formas nativas, así como formas modificadas que conservan una actividad biológica del colágeno o enzima nativa. Las formas modificadas de polinucleótidos y polipéptidos pueden identificarse mediante aquellas que tienen un grado particular de identidad de secuencia o similitud con una secuencia nativa correspondiente. Las secuencias de polinucleótidos modificadas también incluyen aquellas que tienen el 70, el 80, el 90, el 95, el 96, el 97, el 98, el 99 o el 100 % de identidad de secuencia o similitud con cualquiera de los vectores descritos en el presente documento o con cualquiera de los elementos polinucleotídicos que forman estos vectores tal como se representa, por ejemplo, en las figuras 1-20.
BLASTN puede usarse para identificar una secuencia de polinucleótidos que tiene al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 87,5 %, el 90 %, el 92,5 %, el 95 %, el 97,5 %, el 98 %, el 99 % o <100 % de identidad de secuencia con un polinucleótido de referencia tal como un polinucleótido que codifica para un colágeno, una o más hidroxilasas descritas en el presente documento, o péptidos señal, líder o de secreción o cualquier otra proteína dada a conocer en el presente documento. Una configuración de BLASTN representativa modificada para encontrar secuencias muy similares usa un umbral esperado de 10 y un tamaño de palabra de 28, coincidencias máximas en el intervalo de consulta de 0, puntuaciones de coincidencia/no coincidencia de 1/-2 y un coste de hueco lineal. Las regiones de baja complejidad pueden filtrarse o enmascararse. La configuración predeterminada de un BLAST de nucleótido convencional se describe en https://_blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE TYPE=BIastSearch&LINK _LOC=blasthome (consultado por última vez el 13 de julio de 2017).
BLASTP puede usarse para identificar una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 87,5 %, el 90 %, el 92,5 %, el 95 %, el 97,5 %, el 98 %, el 99 % o <100 % de identidad de secuencia o similitud con un aminoácido de referencia, tal como una secuencia de aminoácidos de colágeno, usando una matriz de similitud tal como BLOSUM45, BLOSUM62 o BLOSUM80 donde BLOSUM45 puede usarse para secuencias estrechamente relacionadas, BLOSUM62 para secuencias de intervalo medio y BLOSUM80 para secuencias más distantes. A menos que se indique lo contrario, la puntuación de similitud se basará en el uso de BLOSUM62. Cuando se usa BLASTP, el porcentaje de similitud se basa en la puntuación de positivos de BLASTP y el porcentaje de identidad de secuencia se basa en la puntuación de identidades de BLASTP. Las “identidades” de BLASTP muestran el número y la fracción de residuos totales en los pares de secuencias de alta puntuación que son idénticos; y los “positivos” de BLASTP muestran el número y la fracción de residuos para los cuales las puntuaciones de alineación tienen valores positivos y que son similares entre sí. Las secuencias de aminoácidos que tienen estos grados de identidad o similitud o cualquier grado intermedio de identidad o similitud con las secuencias de aminoácidos descritas en el presente documento se contemplan y abarcan en esta divulgación. Una configuración de BLASTP representativa usa un umbral esperado de 10, un tamaño de palabra de 3, BLOSUM 62 como matriz y una penalización de hueco de 11 (existencia) y 1 (extensión) y un ajuste de matriz de puntuación de composición condicional. Otras configuraciones predeterminadas para BLASTP se describen en: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome (consultado por última vez el 13 de julio de 2017).
El término “derivado del mismo”, “secuencia modificada” o “análogo” tal como se aplica a los polipéptidos dados a conocer en el presente documento, se refiere a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos el 70, el 80, el 90, el 95 o el 99 % idéntica o similar a la secuencia de aminoácidos de una molécula biológicamente activa. En algunas realizaciones, el derivado comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de una secuencia nativa o previamente obtenida por ingeniería. El derivado puede comprender adiciones, deleciones, sustituciones o una combinación de las mismas a la secuencia de aminoácidos de una molécula nativa o previamente obtenida por ingeniería. Por ejemplo, un derivado puede incorporar o delecionar 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más residuos de prolina o lisina en comparación con una secuencia de colágeno nativo. Pueden hacerse tales selecciones para modificar la holgura o firmeza de un tropocolágeno recombinante o colágeno fibrilado.
Un derivado puede incluir un polipéptido mutante con 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11-15, 16-20, 21-25 ó 26-30 adiciones, sustituciones o deleciones de residuos de aminoácidos. Las adiciones o sustituciones también incluyen el uso de aminoácidos no naturales o aminoácidos modificados. Un derivado también puede incluir modificaciones químicas a un polipéptido, tales como reticulaciones entre residuos de cisteína o residuos hidroxilados o glicosilados. Los derivados incluyen los de todos los polipéptidos, incluyendo colágenos y enzimas, dados a conocer en el presente documento. Generalmente, un derivado tendrá al menos una actividad biológica de la molécula original no modificada, por tanto, un derivado enzimático generalmente tendrá la actividad enzimática de la enzima original y un derivado de colágeno al menos una propiedad estructural, química o biológica del colágeno original.
Cuero biofabricado.Cualquier tipo de colágeno, colágeno truncado, no modificado o modificado postraduccionalmente, o colágeno modificado con una secuencia de aminoácidos que pueda fibrilarse y reticularse mediante los métodos descritos en el presente documento puede usarse para producir un material biofabricado o cuero biofabricado. El cuero biofabricado puede contener un colágeno sustancialmente homogéneo, tal como sólo colágeno tipo I o tipo III, o puede contener mezclas de 2, 3, 4 o más tipos diferentes de colágenos. En algunas realizaciones, un colágeno recombinante, por ejemplo, un componente de un cuero biofabricado, no tendrá ninguno de sus residuos de lisina, prolina o lisina y prolina hidroxilados. En otros al menos el 1, el 2, el 3, el 4, el 5, el 10, el 15, el 20, el 30, el 40, el 50, el 60, el 70, el 80, el 90, el 95 % o el 100 % (o cualquier valor intermedio de subintervalo) de los residuos de lisina, prolina o de lisina y prolina en un colágeno recombinante estarán hidroxilados.
Cepas de levadura.La presente divulgación utiliza levadura para producir colágeno. Las levaduras adecuadas incluyen, pero no se limitan a, las del géneroPichia, Candida, Komatagaella, Hansenula, Saccharomyces, Cryptococcus, Arxula, Ogataeay combinaciones de los mismos. La levadura puede modificarse o hibridarse. Las levaduras hibridadas se producen mediante la cría mixta de diferentes cepas de la misma especie, diferentes especies del mismo género o cepas de diferentes géneros. Algunas cepas de levadura que pueden usarse según la divulgación incluyenPichia pastoris, Pichia membranifaciens, Pichia deserticola, Pichia cephalocereana, Pichia eremophila, Pichia myanmarensis, Pichia anomala, Pichia nakasei, Pichia siamensis, Pichia heedii, Pichia barkeri, Pichia norvegensis, Pichia thermometanolica, Pichia stipites, Pichia subpelliculosa, Pichia exigua, Pichia occidentalyPichia cactophila.
En una realización, la invención se refiere a cepas dePichia pastorissegún la reivindicación 4 que se han obtenido por ingeniería para expresar polinucleótidos con codones modificados que codifican para colágeno bovino y opcionalmente hidroxilasa(s). Las cepas huésped dePichia pastorisútiles incluyen, pero no se limitan a, BG10 (tipo natural) (cepa PPS-9010); BG 11, aoxIA (MutS) (cepa PPS-9011), que es un derivado de utilización lenta de metanol de PPS-9010; y BG16, pep4A, prb4A (cepa PPS-9016) que es deficiente en proteasa. Estas cepas están disponibles públicamente y pueden obtenerse de ATUM en https://www_atum.bio/products/cellstrains.
Secuencias de secreción de polipéptidos para levaduras.En algunas realizaciones, un polipéptido codificado por una célula huésped de levadura se fusionará a una secuencia polipeptídica que facilita su secreción de la levadura, por ejemplo, un vector puede codificar para un gen quimérico que comprende una secuencia codificante para colágeno fusionada a una secuencia que codifica para un péptido de secreción. Las secuencias de secreción que pueden usarse para este propósito incluyen secuencia Prepro de factor de apareamiento alfa deSaccharomyces,secuencia Pre de factor de apareamiento alfa deSaccharomyces,señal de secreción de PHO1, secuencia señal de a-amilasa deAspergillus niger,secuencia señal de glucoamilasa deAspergillus awamori,secuencia señal de albúmina sérica deHomo sapiens,secuencia señal de inulinasa deKluyveromcyes maxianus,secuencia señal de invertasa deSaccharomyces cerevisiae,secuencia señal de la proteína asesina deSaccharomyces cerevisiaey secuencia señal de lisozima deGallus gallus.También pueden usarse otras secuencias de secreción conocidas en la técnica.
Promotores y terminadores de levaduras.En algunas realizaciones, uno o más de los siguientes promotores de levadura pueden incorporarse en un vector para promover la transcripción de ARNm que codifica para colágeno o una hidroxilasa. Los promotores se conocen en la técnica e incluyen pAOXI, pDasl, pDas2, pPMP20, pCAT, pDF, pGAP, pFDHI, pFLDI, pTALI, pFBA2, pAOX2, pRKII, pRPE2, pPEXS, pDAKI, pFGHI, pADH2, pTPI1, pFBPI, pTALI, pPFKI, pGPMI y pGCW14.
En algunas realizaciones, se incorpora una secuencia terminadora de levadura en un vector para terminar la transcripción de ARNm que codifica para colágeno o una hidroxilasa. Los terminadores incluyen, pero no se limitan a, AOX1 TT, Das1 TT, Das2 TT, AOD TT, PMP TT, Cat1 TT, TPI TT, FDH1 TT, TEF1 TT, FLD1 TT, GCW14 TT, FBA2 TT, ADH2 TT, FBP1 TT y GAP TT.
Peptidasas distintas de pepsina.La pepsina puede usarse para procesar colágeno y convertirlo en tropolágeno eliminando las secuencias N-terminal y C-terminal. También pueden usarse para este fin otras proteasas, incluyendo, pero sin limitarse a, colagenasa, tripsina, quimotripsina, papaína, ficaína y bromelina. Tal como se usa en el presente documento, “colágeno estable” significa que al menos el 20, el 30, el 40, el 50, el 60, el 75, el 80, el 85, el 90, el 95 o el 100 % (o cualquier valor intermedio o subintervalo) de la concentración inicial de colágeno todavía está presente después de exponerse a una concentración particular de pepsina u otra proteasa. Preferiblemente, al menos el 75 % de un colágeno estable permanecerá después del tratamiento con pepsina u otra proteasa en comparación con un colágeno inestable tratado en las mismas condiciones durante la misma cantidad de tiempo. Antes de la modificación postraduccional, el colágeno no está hidroxilado y se degrada en presencia de una alta concentración de pepsina (por ejemplo, una razón pepsina:proteína de 1:200 o más).
Una vez modificado postraduccionalmente, un colágeno puede ponerse en contacto con pepsina u otra proteasa para escindir los propéptidos N-terminal y C-terminal del colágeno, permitiendo así la fibrilación del colágeno. El colágeno hidroxilado tiene una mejor termoestabilidad en comparación con el colágeno no hidroxilado y es resistente a la digestión con pepsina a altas concentraciones, por ejemplo, en una razón pepsina:proteína total de 1:25, 1:20, 1:15, 1:10, 1:5 a 1:1 (o cualquier valor intermedio). Por tanto, para evitar la proteólisis prematura del colágeno recombinante es útil proporcionar colágeno hidroxilado.
Sistemas de expresión alternativos.Además dePichia pastoris,el colágeno puede expresarse en otros tipos de células de levadura, por ejemplo, puede expresarse en otra levadura, levadura metilotrófica u otro organismo.Saccharomyces cerevisiaepuede usarse con cualquiera de una gran cantidad de vectores de expresión. Los vectores de expresión habitualmente empleados son vectores lanzadera que contienen el origen de replicación 2P para la propagación en levadura y el origen Col E1 paraE. coli,para la transcripción eficiente del gen extraño. Un ejemplo típico de tales vectores basados en plásmidos 2P es pWYG4, que tiene los elementos 2P ORI-STB, el promotor GAL1-10 y el terminador del gen 2P D. En este vector, se usa un sitio de clonación Ncol para insertar el gen del polipéptido que va a expresarse y para proporcionar un codón de inicio ATG.
Otro vector de expresión es pWYG7L, que tiene 2aORI, STB, REP1 y REP2 intactos y el promotor GAL1-10, y usa el terminador FLP. En este vector, el polinucleótido codificante se inserta en el poliligador con sus extremos 5' en un sitio BamHI o Ncol. El vector que contiene el polinucleótido insertado se transforma en S.cerevisiaeo bien después de la eliminación de la pared celular para producir esferoplastos que captan el ADN tras tratamiento con calcio y polietilenglicol o bien mediante tratamiento de células intactas con iones de litio.
Alternativamente, el ADN puede introducirse mediante electroporación. Los transformantes pueden seleccionarse, por ejemplo, usando células huésped de levadura que son auxótrofas para leucina, triptófano, uracilo o histidina junto con genes marcadores seleccionables tales como LEU2, TRP1, URA3, HIS3 o LEU2-D.
Hay varios genes que responden al metanol en levaduras metilotróficas, tales comoPichia pastoris,la expresión de cada uno está controlada por regiones reguladoras sensibles al metanol, también denominadas promotores. Cualquiera de dichos promotores sensibles al metanol es adecuado para su uso en la práctica de la presente invención. Los ejemplos de regiones reguladoras específicas incluyen el promotor AOX1, el promotor AOX2, la dihidroxiacetona sintasa (DAS), el promotor P40 y el promotor del gen de la catalasa deP. pastoris,etc.
La levadura metilotróficaHansenula polymorphatambién puede emplearse. El crecimiento en metanol da como resultado la inducción de enzimas clave del metabolismo del metanol, tal como MOX (metanol oxidasa), DAS (dihidroxiacetona sintasa) y FMHD (formiato deshidrogenasa). Estas enzimas pueden constituir hasta el 30-40 % de la proteína celular total. Los genes que codifican para la producción de MOX, DAS y FMDH están controlados por fuertes promotores inducidos por el crecimiento en metanol y reprimidos por el crecimiento en glucosa. Cualquiera o los tres promotores pueden usarse para obtener expresión de alto nivel de genes heterólogos enH. polymorpha.Por tanto, en un aspecto, un polinucleótido que codifica para colágeno de animal o fragmentos o variantes del mismo se clona en un vector de expresión bajo el control de un promotor deH. polymorphainducible. Si se desea la secreción del producto, se fusiona en marco con el polinucleótido un polinucleótido que codifica una secuencia señal para la secreción en levadura. En una realización adicional, el vector de expresión contiene preferiblemente un gen marcador auxotrófico, tal como URA3 o LEU2, que puede usarse para complementar la deficiencia de un huésped auxotrófico.
El vector de expresión se usa luego para transformar células huésped deH. polymorphausando técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Una característica útil de la transformación deH. polymorphaes la integración espontánea de hasta 100 copias del vector de expresión en el genoma. En la mayoría de los casos, el polinucleótido integrado forma multímeros que exhiben una disposición de cabeza a cola. Se ha demostrado que el polinucleótido extraño integrado es mitóticamente estable en varias cepas recombinantes, incluso en condiciones no selectivas. Este fenómeno de alta integración de copias aumenta adicionalmente el alto potencial de productividad del sistema.
El ADN foráneo se inserta en el genoma de la levadura o se mantiene episomalmente para producir colágeno. La secuencia de ADN del colágeno se introduce en la levadura mediante un vector. Los ADN foráneos son cualquier ADN del huésped que no sea una levadura e incluyen, por ejemplo, pero no se limitan a, los de mamíferos,Caenorhabditis elegansy bacterias. El ADN de mamífero adecuado para la producción de colágeno en levadura incluye, pero no se limita a, bovino, equino, porcino, canguro, elefante, rinoceronte, hipopótamo, ballena, delfín, jirafa, cebra, llama, alpaca, cabra y oveja (cordero). Otros ADN para la producción de colágeno incluyen los de reptiles (tales como caimanes, cocodrilos, tortugas, iguanas, lagartos, serpientes), aves (por ejemplo, avestruz, emú, moa), dinosaurios, anfibios y peces (por ejemplo, tilapia, lubina, salmón, trucha, tiburón, colágeno de anguila) y combinaciones de los mismos.
El ADN se inserta en un vector, los vectores adecuados incluyen, pero no se limitan a, pHTX1-BiDi-P4HA-Pre-P4HB hygro, pHTX1-BiDi-P4HA-PHO1-P4HB hygro, pGCW14-pGAP1-BiDi-P4HA-Prepro-P4HB G418, pGCW14-pGAP1-BiDi-P4HA-PHO1-P4HB Hygro, zeocina modificada con pDF-Col3A1, zeocina modificada con pCAT-Col3A1, zeocina modificada con pDF-Col3A1 con sitio de posicionamiento(landing pad)de AOX1, pHTX1-BiDi-P4HA-Pre-Pro-P4HB hygro. Los vectores normalmente incluían al menos un sitio de restricción para la linealización del ADN.
Un promotor seleccionado puede mejorar la producción de una proteína recombinante y puede incluirse en un vector que comprende secuencias que codifican para colágeno o hidroxilatos. Los promotores adecuados para su uso en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, el promotor inducido por metanol AOX1, el promotor desreprimido pDF, el promotor desreprimido pCAT, el promotor bidireccional inducido por metanol Das1-Das2, el promotor bidireccional constitutivo pHTX1, el promotor bidireccional constitutivo pGCW14-pGAP1 y combinaciones de los mismos. Los promotores inducidos por metanol adecuados incluyen, pero no se limitan a, AOX2, Das 1, Das 2, pDF, pCAT, pPMP20, pFDH1, pFLD1, pTAL2, pFBA2, pPEXS, pDAK1, pFGH1, pRKI1, pREP2 y combinaciones de los mismos.
En los vectores que comprenden la secuencia quimérica de ADN de colágeno bovino según la reivindicación 1 de la invención, incluyendo el vector todo en uno, puede colocarse un terminador al final de cada marco de lectura abierto usado en los vectores incorporados en la levadura. La secuencia de ADN del terminador se inserta en el vector. Para los vectores de replicación, es necesario un origen de replicación para iniciar la replicación. La secuencia de ADN para el origen de la replicación se inserta en el vector. Pueden incorporarse al vector una o más secuencias de ADN que contienen homología con el genoma de la levadura para facilitar la recombinación y la incorporación al genoma de la levadura o para estabilizar el vector una vez transformado en la célula de levadura.
Un vector que comprende la secuencia quimérica de ADN de colágeno bovino según la reivindicación 1 de la invención también incluirá generalmente al menos un marcador selectivo que se usa para seleccionar células de levadura que se han transformado con éxito. Los marcadores a veces están relacionados con la resistencia a los antibióticos y los marcadores también pueden estar relacionados con la capacidad de crecer con o sin ciertos aminoácidos (marcadores auxotróficos). Los marcadores auxotróficos adecuados incluyen, pero no se limitan a, ADE, HIS, URA, LEU, LYS, TRP y combinaciones de los mismos. Para permitir la selección de células de levadura que contienen un vector recombinante, se incorpora al vector al menos una secuencia de ADN para un marcador de selección.
En algunas realizaciones de la divulgación, los residuos de aminoácidos, tales como lisina y prolina, en un colágeno recombinante expresado en levadura o una proteína similar al colágeno pueden carecer de hidroxilación o pueden tener un grado de hidroxilación menor o mayor que un colágeno o colágeno natural o no modificado o proteína similar al colágeno correspondiente. En otras realizaciones, los residuos de aminoácidos en un colágeno o proteína similar al colágeno pueden carecer de glicosilación o pueden tener un grado mayor o menor de glicosilación que un colágeno o proteína similar al colágeno natural o no modificado correspondiente. El colágeno hidroxilado tiene una temperatura de fusión más alta (>37 °C) que el colágeno no hidroxilado o poco hidroxilado (<32 °C) y también fibrila mejor que el colágeno no hidroxilado o poco hidroxilado y forma estructuras más fuertes y duraderas para su uso como materiales. La temperatura de fusión de una preparación de colágeno puede usarse para estimar su grado de hidroxilación y puede variar, por ejemplo, de desde 30 hasta 40 °C, así como todos los valores intermedios tales como 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 y 40 °C. El colágeno subhidroxilado sólo puede formar un material gelatinoso o de tipo gelatina que no es adecuado para artículos duraderos tales como zapatos o bolsos, pero que puede formularse en productos más suaves o más absorbentes.
El colágeno en una composición de colágeno puede ser homogéneo y contener un único tipo de molécula de colágeno, tal como 100 % colágeno bovino tipo I o 100 % colágeno bovino tipo III, o puede contener una mezcla de diferentes tipos de moléculas de colágeno o moléculas similares al colágeno, tal como una mezcla de moléculas bovinas tipo I y tipo III. Tales mezclas pueden incluir >0 %, el 10, el 20, el 30, el 40, el 50, el 60, el 70, el 80, el 90, el 95, el 99 o <100 % (o cualquier valor intermedio o subintervalo) del colágeno individual o componentes de proteína similar al colágeno. Este intervalo incluye todos los valores intermedios. Por ejemplo, una composición de colágeno puede contener el 30 % de colágeno tipo I y el 70 % de colágeno tipo III, o puede contener el 33,3% de colágeno tipo I, el 33,3% de colágeno tipo II y el 33,3% de colágeno tipo III, donde el porcentaje de colágeno se basa en la masa total de colágeno en la composición o en los porcentajes moleculares de moléculas de colágeno.
Las células de levadura obtenidas por ingeniería descritas anteriormente pueden utilizarse para producir colágeno. Para ello, las células se colocan en un medio dentro de una cámara de fermentación y se alimentan con oxígeno disuelto y una fuente de carbono, en condiciones de pH controlado durante un periodo de tiempo que oscila entre doce horas y una semana. Los medios adecuados incluyen, pero no se limitan a, medios complejos de glicerol tamponados (BMGY), medios complejos de metanol tamponados (BMMY) y peptonadextrosa de extracto de levadura (YPD). Debido al hecho de que el colágeno se produce en la célula de levadura, para aislar el colágeno, se debe usar una cepa secretora de levadura o lisar las células de levadura para liberar el colágeno. Luego, el colágeno puede purificarse mediante técnicas convencionales tales como centrifugación, precipitación, filtración, cromatografía y similares.
En otra realización, la invención proporciona secuencias quiméricas de ADN según la reivindicación 1 en levaduras huésped que son útiles para producir colágeno hidroxilado y no hidroxilado. Las secuencias quiméricas de ADN se producen combinando secuencias de ADN modificadas y no modificadas. La secuencia de ADN no modificada puede cortarse en diversas ubicaciones de pares de bases. La secuencia de ADN modificada también puede cortarse en ubicaciones de pares de bases correspondientes. Los cortes modificados y no modificados pueden combinarse de adelante hacia atrás y de atrás hacia adelante. Las secuencias quiméricas de ADN pueden combinarse con promotores, vectores, terminadores y marcadores de selección anteriores e insertarse en un huésped para generar levadura que pueda producir colágeno hidroxilado y no hidroxilado. El porcentaje de ADN optimizado y no optimizado puede calcularse basándose en la longitud total de la secuencia. La cepa quimera es una combinación de ADN optimizado que codifica para la secuencia de aminoácidos en el extremo N-terminal y ADN no optimizado que codifica para la secuencia de aminoácidos en el extremo C-terminal de una molécula de colágeno bovino, tal como se describe en la reivindicación 1. El porcentaje de ADN optimizado oscila entre el 60 y el 90 %. El porcentaje de ADN no optimizado oscila entre el 10 y el 40 %. Por ejemplo, una secuencia de ADN con 1486 pares de bases cortadas en 1331 proporcionará ADN optimizado 0-1331 y ADN no optimizado 1332-1486 y la quimera estará optimizada en un 90 %. Una secuencia de polinucleótidos optimizada codifica para un segmento de colágeno en el extremo N-terminal.
Según la divulgación, la cepa quimérica puede estar formada por dos, tres o cuatro o más secciones de ADN optimizado y no optimizado fusionadas entre sí. Por ejemplo, una secuencia de ADN con 1500 pares de bases puede tener una sección de ADN optimizado de desde 0 hasta 500, una sección de ADN no optimizado de desde 501 hasta 1000 y una sección de ADN optimizado de desde 1001 hasta 1500.
El colágeno dado a conocer en el presente documento permite producir un cuero biofabricado. Los métodos para convertir colágeno en cuero biofabricado se enseñan en solicitudes de patente en tramitación junto la presente, las solicitudes estadounidenses n.os 15/433566, 15/433650, 15/433632, 15/433693, 15/433777, 15/433675, 15/433676 y 15/433877.
REALIZACIONES DE LA INVENCIÓN Y LA DIVULGACIÓN
Las realizaciones no limitativas de la invención y la divulgación incluyen, pero no se limitan a:
Un polinucleótido de la divulgación, que codifica para colágeno bovino, tal como colágeno tipo I o tipo III, o una variante o derivado de colágeno y al menos una enzima que hidroxila residuos de prolina, lisina o de lisina y prolina en el colágeno codificado. En algunas realizaciones, el polinucleótido tendrá modificados los codones de toda o parte del colágeno o las secuencias de polinucleótidos de hidroxilasa nativos o incorporará elementos de control de la expresión tales como secuencias promotoras de levadura para facilitar la expresión del colágeno o la hidroxilasa en una célula huésped de levadura. El polinucleótido modificado cuando se expresa en levadura puede aumentar la expresión de colágeno en comparación con un polipéptido no modificado expresado en condiciones idénticas que codifica para la misma secuencia de colágeno en el 10, el 20, el 25, el 30, el 35, el 40, el 45, el 50, el 60, el 70, el 80, el 90, el 100 o >100 % en peso.
En algunas realizaciones de la divulgación, puede lograrse 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o más veces la expresión de proteínas de colágeno o hidroxilasa. En algunas realizaciones se expresará un colágeno tipo III o una variante de colágeno, donde la variante tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos el 70, el 75, el 80, el 85, el 90, el 95, el 96, el 97, el 98, el 99 o el 100 % idéntica a la de SEQ ID NO: 2. En otras realizaciones, el colágeno bovino es un colágeno bovino tipo I o una variante de colágeno que codifica tanto para cadenas a1(I) como para una cadena a2(I) o que codifica para una o más cadenas de colágeno que es al menos 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % idénticas a las cadenas de colágeno nativo tipo I.
El polinucleótido que codifica para colágeno bovino de la divulgación descrita anteriormente puede incluir una secuencia o segmento de polinucleótido que codifica para las subunidades P4HA y P4HB de la prolil 4-hidroxilasa o una secuencia de polinucleótido que codifica para una enzima que es al menos el 70, el 75, el 80, el 85, el 90, el 95, el 96, el 97, el 98, el 99 o el 100 % idénticos a los mismos. En otras realizaciones, el polinucleótido puede contener una secuencia o segmento de polinucleótido que codifica para prolil-3-hidroxilasa, lisil hidroxilasa y/o lisil oxidasa o una secuencia de polinucleótido que codifica para una enzima que es al menos el 70, el 75, el 80, el 85, el 90, el 95, el 96, el 97, el 98, el 99 o el 100 % idéntico a los mismos. Por ejemplo, un polinucleótido de la divulgación puede codificar para un polipéptido que es al menos el 75-99 % idéntico a la secuencia de aminoácidos de colágeno bovino tipo III de SEQ ID NO: 2 y un segmento que codifica para una hidroxilasa que comprende subunidades P4HA y P4HB que son al menos el 75-99% idénticas a SEQ ID NOS: 54 y 52, respectivamente.
Una secuencia de polinucleótidos de la invención puede codificar además para una secuencia de secreción de polipéptido operativa en levadura que generalmente se coloca adyacente a una secuencia de polinucleótidos que es la secuencia quimérica de ADN de colágeno bovino según la reivindicación 1.
Una secuencia de polinucleótidos de la invención puede contener además un promotor u otra secuencia que facilite o controle la expresión de colágeno o enzimas, tales como hidroxilasas, por ejemplo, puede contener al menos uno de un promotor inducido por metanol AOX1, un promotor desreprimido DN pDF, promotor desreprimido pCAT, promotor bidireccional inducido por metanol Das1-Das2, promotor bidireccional constitutivo pHTX1, promotor bidireccional constitutivo pGCW14-pGAP1, o combinaciones de los mismos.
Un polinucleótido de la invención también puede contener otros elementos tales como una secuencia pre de factor alfa o prepro de factor alfa tales como las codificadas respectivamente por las SEQ ID NO: 23 y 24. En algunas realizaciones, una secuencia de este tipo puede estar unida operativamente a una secuencia de polinucleótidos que expresa una enzima, tal como una hidroxilasa u otras enzimas descritas en el presente documento tales como P4HA (SEQ ID NO: 54) o P4HB (SEQ ID NO: 52), o a una variante de enzima que es al menos el 75, el 80, el 90 o el 95-100 % idéntica a la misma.
Los vectores que contienen las secuencias de polinucleótidos según la reivindicación 1 y opcionalmente las realizaciones adicionales descritas anteriormente representan realizaciones adicionales de la invención a las que se hace referencia en la reivindicación 4. Estos corresponden a un vector que contiene la secuencia quimérica de ADN de colágeno bovino según la reivindicación 1. En algunas realizaciones, la secuencia que codifica para el colágeno bovino según la reivindicación 1 y la secuencia que codifica para una hidroxilasa u otra enzima estarán en el mismo vector; en otros pueden estar en vectores diferentes.
La invención también contempla células huésped de levadura que contienen los vectores descritos en el presente documento, concretamente la cepa según la reivindicación 4. En algunas realizaciones, estos vectores pueden producirse en células que no son de levadura, tal como en células huésped bacterianas y luego transformarse en células huésped de levadura, tales como células huésped dePichia pastoris,que expresan colágeno o colágeno hidroxilado.
Otro aspecto de la divulgación se refiere a un método para producir colágeno recombinante que tiene menos del 1, el 2, el 3, el 4, el 5, el 6, el 7, el 8, el 9 o el 10 % de sus residuos de prolina hidroxilados. Este método implica cultivar unaPichia pastorisu otra célula huésped de levadura adecuada (o célula huésped eucariota) durante un tiempo y en condiciones adecuadas para producir colágeno y recuperar el colágeno; en el que dicho vector está configurado para expresar una cantidad o forma de prolil-4-hidroxilasa que hidroxila no más del 1, el 2, el 3, el 4, el 5, el 6, el 7, el 8, el 9, el 10 % de los residuos de prolina. Otra realización de la divulgación es un método para producir colágeno tipo III recombinante que tiene menos del 1, el 2, el 3, el 4, el 5, el 6, el 7, el 8, el 9, el 10 % de sus residuos de prolina hidroxilados que implica cultivar unPichia pastorisu otra célula huésped de levadura adecuada durante un tiempo y en condiciones adecuadas para producir colágeno tipo III y recuperar el colágeno; en el que dicho vector está configurado para expresar una cantidad de prolil-4-hidroxilasa que hidroxila no más del 1, el 2, el 3, el 4, el 5, el 6, el 7, el 8, el 9, el 10 % de los residuos de prolina. Un vector todo en uno que codifica tanto para colágeno como para una hidroxilasa puede configurarse de modo que se exprese poca o ninguna hidroxilasa funcional, por ejemplo, mediante el uso de un promotor inducible o sensible a la temperatura para la hidroxilasa.
Una realización adicional de la divulgación es un método para producir colágeno recombinante que tiene >10, el 15, el 20, el 25, el 30, el 40, el 50, el 60, el 70, el 80, el 90, el 95 o >95 % de sus residuos de prolina hidroxilados mediante cultivo.Pichia pastorisu otra célula huésped de levadura adecuada que contenga un vector tal como se describe en el presente documento durante un tiempo y en condiciones adecuadas para producir colágeno y recuperar el colágeno; en el que el vector está configurado para expresar una cantidad o forma de prolil-4-hidroxilasa que hidroxila >10, el 15, el 20, el 25, el 30, el 40, el 50, el 60, el 70, el 80, el 90 o >90 % o más de los residuos de prolina en el colágeno. El tiempo y las condiciones de cultivo y la cantidad o actividad de la hidroxilasa pueden usarse para controlar la cantidad de hidroxilación. Otra realización de la divulgación es un método para producir colágeno tipo III recombinante que tiene el 50, el 60, el 70, el 80, el 90, el 95 o >95 % de sus residuos de prolina hidroxilados que comprende cultivar una célula huésped dePichia pastorisque contiene un vector según lo descrito durante un tiempo y en condiciones adecuadas para producir colágeno tipo III y recuperar el colágeno tipo III; en el que el vector está configurado para expresar una cantidad o forma de prolil-4-hidroxilasa que hidroxila el 50, el 60, el 70, el 80, el 90 o >90 % o más de los residuos de prolina. El tiempo y las condiciones de cultivo y la cantidad o actividad de la hidroxilasa pueden usarse para controlar la cantidad de hidroxilación.
Otra realización de la divulgación se refiere a un método para producir colágeno recombinante que tiene el 50, el 60, el 70, el 80, el 90, el 95 o >95 % o más de sus residuos de prolina hidroxilados que comprende cultivarPichia pastorisu otra célula huésped de levadura adecuada que contenga un vector de la divulgación durante un tiempo y en condiciones adecuadas para producir colágeno y recuperar el colágeno; en el que el vector está configurado para expresar una cantidad de prolil-4-hidroxilasa que hidroxila el 50, el 60, el 70, el 80, el 90, el 95 o >95 % o más de los residuos de prolina. El tiempo y las condiciones de cultivo y la cantidad o actividad de la hidroxilasa pueden usarse para controlar la cantidad de hidroxilación.
Otra realización de la divulgación se refiere a un método para producir colágeno tipo III recombinante que tiene el 50, el 60, el 70, el 80, el 90, el 95 o >95 % de sus residuos de prolina hidroxilados que comprende cultivar unaPichia pastorisu otra célula huésped de levadura que contenga un vector de la divulgación durante un tiempo y en condiciones adecuadas para producir colágeno y recuperar el colágeno; en el que dicho vector está configurado para expresar una cantidad de prolil-4-hidroxilasa que hidroxila el 50, el 60, el 70, el 80, el 90, el 95 o >95 % de los residuos de prolina. El tiempo y las condiciones de cultivo y la cantidad o actividad de la hidroxilasa pueden usarse para controlar la cantidad de hidroxilación.
Otra realización de la divulgación se refiere a un método para producir colágeno recombinante que tiene el 75, el 80, el 90, el 95 o >95 % de sus residuos de prolina hidroxilados, incluyendo el cultivo dePichia pastorisu otra célula huésped de levadura que contenga un vector de la divulgación durante un tiempo y en condiciones adecuadas para producir colágeno y recuperar el colágeno; en el que dicho vector está configurado para expresar una cantidad de prolil-4-hidroxilasa que hidroxila el 75, el 80, el 90, el 95 o >95 % de los residuos de prolina.
Una realización adicional de la divulgación es un método para producir colágeno tipo III recombinante que tiene el 75, el 80, el 90, el 95 o >95 % de sus residuos de prolina hidroxilados que comprende cultivarPichia pastorisu otra célula huésped de levadura que contenga un vector de la divulgación durante un tiempo y en condiciones adecuadas para producir colágeno y recuperar el colágeno; en el que dicho vector está configurado para expresar una cantidad de prolil-4-hidroxilasa que hidroxila el 75, el 80, el 90, el 95 o >95 % o más de los residuos de prolina.
Otra realización de la divulgación es un colágeno recombinante elaborado mediante uno cualquiera de los métodos descritos en el presente documento. Un colágeno recombinante de este tipo puede no tener ninguno de sus residuos de prolina o lisina hidroxilados o puede tener >0, el 10, el 20, el 30, el 40, el 50, el 60, el 70, el 80, el 90, el 95 o el 100%de residuos de prolina, lisina o prolina hidroxilados.
Una realización adicional de la divulgación es un cuero biofabricado u otro material que comprende el colágeno recombinante tal como se describe en el presente documento o que se elabora mediante un método descrito en el presente documento.
En otra realización, la invención proporciona secuencias quiméricas de ADN según la reivindicación 1 en células huésped de levadura que son útiles para producir colágeno hidroxilado y no hidroxilado. Las secuencias quiméricas de ADN se producen combinando secuencias de ADN modificadas y no modificadas tal como se establece en la reivindicación 1. La secuencia de ADN no modificada puede cortarse en varias ubicaciones de pares de bases. La secuencia de ADN modificada también puede cortarse en ubicaciones de pares de bases correspondientes. Los cortes modificados y no modificados pueden combinarse de adelante hacia atrás y de atrás hacia adelante. Las secuencias quiméricas de ADN pueden combinarse con promotores, vectores, terminadores y marcadores de selección anteriores e insertarse en un huésped para generar levadura que pueda producir colágeno hidroxilado y no hidroxilado.
Otras realizaciones de la invención y la divulgación incluyen, pero no se limitan a:
La divulgación proporciona una cepa de levadura obtenida mediante ingeniería genética para producir colágeno no hidroxilado que incluye (i) una cepa de levadura; y (ii) un vector que comprende una secuencia de ADN para colágeno; una secuencia de ADN para un promotor de colágeno; una secuencia de ADN para un terminador de colágeno; una secuencia de ADN para un marcador de selección, una secuencia de ADN para un promotor del marcador de selección; una secuencia de ADN para un terminador del marcador de selección; una secuencia de ADN para un origen de replicación seleccionado de uno para bacterias y otro para levaduras; y una secuencia de ADN que contiene homología con el genoma de la levadura, en la que el vector se ha insertado en la cepa de levadura. En esta realización, la cepa de levadura puede seleccionarse del grupo que consiste en aquellas del géneroPichia, Candida, Komatagaella, Hansenula, Saccharomyces, Cryptococcus, Arxula, Ogataeay combinaciones de los mismos. En la realización anterior, el vector puede contener una secuencia de ADN para colágeno seleccionado del grupo que consiste en colágeno bovino, porcino, de canguro, caimán, cocodrilo, elefante, jirafa, cebra, llama, alpaca, cordero, dinosaurio y combinaciones de los mismos. En esta realización, la secuencia de ADN para el colágeno puede seleccionarse de ADN de colágeno nativo, ADN de colágeno obtenido mediante ingeniería genética y ADN de colágeno con codones modificados.
En esta realización, la secuencia de ADN para el promotor puede seleccionarse del grupo que consiste en ADN para el promotor inducido por metanol AOX1, ADN para el promotor desreprimido pDF, a Dn para el promotor desreprimido pCAT, ADN para el promotor bidireccional inducido por metanol Das1-Das2, ADN para el promotor bidireccional constitutivo pHTX1, ADN para el promotor bidireccional constitutivo pGCW14-pGAP1 y combinaciones de los mismos. El marcador de selección en esta realización puede seleccionarse del grupo que consiste en un ADN para resistencia a los antibióticos y un ADN para marcador auxotrófico, por ejemplo, la resistencia a los antibióticos puede ser a un antibiótico seleccionado del grupo que consiste en higromicina, zeocina, genetina y combinaciones de las mismas.
La cepa de levadura tal como se describe en la realización anterior puede contener un vector que se insertó en la levadura mediante un método seleccionado del grupo que consiste en electroporación, transformación química y apareamiento.
Otra realización de la divulgación se refiere a un método para producir colágeno no hidroxilado que incluye (i) proporcionar una cepa de levadura tal como se describe en las realizaciones anteriores; y (ii) hacer crecer la cepa en un medio durante un periodo de tiempo suficiente para producir colágeno. En este método, la levadura puede seleccionarse del grupo que consiste en las del géneroPichia, Candida, Komatagaella, Hansenula, Saccharomyces, Cryptococcus, Arxula, Ogataeay combinaciones de los mismos y/o el medio seleccionado del grupo que consiste en medios complejos de glicerol tamponados (BMGY), medios complejos de metanol tamponados (BMMY) y peptona-dextrosa de extracto de levadura (YPD). La cepa de levadura puede cultivarse durante un periodo de tiempo de entre 24, 48 ó 72 horas o cualquier periodo de tiempo intermedio. En particular, este periodo de tiempo es de 24 horas a 72 horas. En este método, la cepa de levadura puede expresar una secuencia de ADN para colágeno seleccionado del grupo que consiste en colágeno bovino, porcino, de canguro, caimán, cocodrilo, elefante, jirafa, cebra, llama, alpaca, cordero, dinosaurio y combinaciones de los mismos. En este método, la secuencia de ADN para el promotor en la cepa de levadura puede seleccionarse del grupo que consiste en el ADN para el promotor bidireccional constitutivo pHTX1 y el ADN para el promotor bidireccional constitutivo pGCW14-pGAP1; y/o el marcador de selección puede seleccionarse del grupo que consiste en el ADN para el ADN de resistencia a los antibióticos y el ADN para el marcador auxotrófico.
Otra realización de la divulgación es una cepa de levadura obtenida mediante ingeniería genética para producir colágeno hidroxilado que incluye (i) una cepa de levadura y (ii) un vector que contiene una secuencia de ADN para colágeno; una secuencia de ADN para un promotor de colágeno; una secuencia de ADN para un terminador; una secuencia de ADN para un marcador de selección; una secuencia de ADN para un promotor del marcador de selección; una secuencia de ADN para un terminador del marcador de selección; una secuencia de ADN para un origen de replicación para bacterias y/o levaduras; una secuencia de ADN que contiene homología con el genoma de la levadura; en el que el vector se ha insertado en la cepa de levadura; y (iii) un segundo vector que comprende una secuencia de ADN para P4HA1; una secuencia de ADN para P4HB; y al menos una secuencia de ADN para un promotor, en el que los vectores se han insertado en la cepa de levadura. En esta realización, la cepa de levadura puede seleccionarse del grupo que consiste en aquellas de los génerosPichia, Candida, Komatagaella, Hansenula, Saccharomyces, Cryptococcus, Arxula, Ogataeay combinaciones de los mismos; y/o la cepa de levadura puede expresar una secuencia de ADN para colágeno seleccionado del grupo que consiste en colágeno bovino, porcino, de canguro, caimán, cocodrilo, elefante, jirafa, cebra, llama, alpaca, cordero, dinosaurio y combinaciones de los mismos. En la cepa de levadura de esta realización, la secuencia de ADN para el colágeno se selecciona de ADN de colágeno nativo, ADN de colágeno obtenido mediante ingeniería y ADN de colágeno modificado; y/o la secuencia de ADN para el promotor se selecciona del grupo que consiste en ADN para el promotor inducido por metanol AOX1, ADN para el promotor desreprimido pDF, ADN para el promotor desreprimido pCAT, ADN para el promotor bidireccional inducido por metanol Das1-Das2, ADN para el promotor bidireccional constitutivo pHTX1, ADN para el promotor bidireccional constitutivo pGCW14-pGAP1 y combinaciones de los mismos. En la cepa de levadura de esta realización, la secuencia de ADN para el promotor puede seleccionarse del grupo que consiste en el ADN para el promotor bidireccional constitutivo pHTX1 y el ADN para el promotor bidireccional constitutivo pGCW14-pGAP1; y/o la secuencia de ADN para el marcador de selección puede seleccionarse del grupo que consiste en el ADN para el ADN de resistencia a los antibióticos y el ADN para el marcador auxotrófico. Algunos ejemplos de genes o ADN de resistencia a los antibióticos incluyen resistencia a un antibiótico seleccionado del grupo que consiste en higromicina, zeocina, genetina y combinaciones de las mismas, aunque también pueden usarse otros genes de resistencia a los antibióticos conocidos. El vector puede insertarse en la cepa de levadura de esta realización mediante un método seleccionado del grupo que consiste en electroporación, transformación química y apareamiento.
Otra realización de la divulgación es un método para producir colágeno hidroxilado que incluye (i) proporcionar una cepa de levadura tal como se describe en el presente documento, es decir, una cepa de levadura obtenida mediante ingeniería genética para producir colágeno hidroxilado, y (ii) hacer crecer la cepa en un medio durante un periodo de tiempo suficiente para producir colágeno. La cepa de levadura puede seleccionarse del grupo que consiste en las del géneroPichia, Candida, Komatagaella, Hansenula, Saccharomyces, Cryptococcus, Arxula, Ogataeay combinaciones de los mismos; el ADN de colágeno expresado por la cepa de levadura puede seleccionarse del grupo que consiste en ADN que codifica para colágeno bovino, porcino, de canguro, caimán, cocodrilo, elefante, jirafa, cebra, llama, alpaca, cordero, dinosaurio o combinaciones de los mismos; y/o el medio puede seleccionarse del grupo que consiste en BMGY, BMMY e YPD. La cepa de levadura puede cultivarse durante un periodo de tiempo de entre aproximadamente 24, 48 ó 72 horas. En particular, este periodo de tiempo es de 24 horas a 72 horas. En el método de esta realización, el ADN para el promotor se selecciona del grupo que consiste en el ADN para el promotor bidireccional constitutivo pTHX1 y el ADN para el promotor bidireccional constitutivo pGCW14-pGAP1; y/o el ADN para el marcador de selección se selecciona del grupo que consiste en el ADN para el ADN de resistencia a los antibióticos y el ADN para el marcador auxotrófico.
Otra realización de la divulgación se refiere a un vector todo en uno que incluye (i) un ADN que, cuando se expresa, produce colágeno, un promotor y un terminador; (ii) al menos un ADN para una o más enzimas de hidroxilación seleccionadas del grupo que consiste en P4HA1 y P4HB, incluyendo promotores y terminadores; (iii) al menos un ADN para un marcador de selección; incluyendo un promotor y un terminador; (iv) al menos un ADN para un origen u orígenes de replicación para levaduras y bacterias; (v) uno o más ADN con homología con el genoma de la levadura para su integración en el genoma; y (iv) uno o más sitios de restricción en una posición seleccionada del grupo que consiste en 5', 3', dentro de los ADN anteriores, y combinaciones de los mismos que permiten la clonación modular. En algunas realizaciones, el vector todo en uno contendrá una o más secuencias de ADN que, cuando se expresan, producen un colágeno seleccionado del grupo que consiste en colágeno bovino, porcino, de canguro, caimán, cocodrilo, elefante, jirafa, cebra, llama, alpaca, cordero, dinosaurio y combinaciones de los mismos.
El vector todo en uno puede incluir un promotor seleccionado del grupo que consiste en el ADN para el promotor bidireccional constitutivo pTHX1 y el ADN para el promotor bidireccional constitutivo pGCW14-pGAP1 y/o puede incluir una o más secuencias de ADN para marcadores de selección, tales como resistencia a los antibióticos y/o marcadores auxotróficos. Los marcadores de resistencia a los antibióticos incluyen resistencia a un antibiótico seleccionado del grupo que consiste en higromicina, zeocina, genetina y combinaciones de las mismas.
Otra realización de la invención se refiere a una secuencia quimérica de ADN de colágeno bovino, que contiene de 60 a 90 por ciento de ADN optimizado en base a la longitud total del ADN de colágeno quimérico como se reivindica en la reivindicación 1. En esta secuencia quimérica de ADN de colágeno, el ADN optimizado se origina en el extremo N, es decir, el ADN optimizado codifica para la secuencia de aminoácidos en el extremo N-terminal de una molécula de colágeno bovino, como se reivindica en la reivindicación 1. En una realización de la divulgación, la secuencia quimérica de ADN de colágeno puede codificar colágeno tipo I y se ha sometido a optimización de codones para la expresión enPichia pastoris.Según la invención, la secuencia quimérica de ADN de colágeno codifica para colágeno bovino, en donde la secuencia de ADN es como se reivindica en la reivindicación 1. La secuencia quimérica de ADN de colágeno de esta realización puede comprender además una secuencia de polinucleótidos que codifica para P4HA1 y/o PAHB.
Otra realización de la invención se refiere a una cepa de levadura productora de colágeno que incluye un vector que comprende una secuencia de ADN para un colágeno quimérico tal como se reivindica en la reivindicación 1 y tal como se describe adicionalmente en el presente documento, en la que la cepa se reivindica en la reivindicación 4; una secuencia de ADN para un promotor de colágeno; una secuencia de ADN para un terminador; una secuencia de ADN para un marcador de selección; una secuencia de ADN para un promotor del marcador de selección; una secuencia de ADN para un terminador del marcador de selección; una secuencia de ADN para un origen de replicación para bacterias y/o levaduras; y una secuencia de ADN que contiene homología con el genoma de la levadura. En esta realización, la cepa de levadura puede contener un ADN para el promotor seleccionado del grupo que consiste en el ADN para el promotor bidireccional constitutivo pTHX1 y el a Dn para el promotor bidireccional constitutivo pGCW14-pGAP1. La cepa de levadura puede contener un marcador de selección seleccionado del grupo que consiste en ADN que codifica para al menos una resistencia a los antibióticos y ADN que codifica para al menos un marcador auxotrófico.
Otra realización de la invención se dirige a un método para producir colágeno hidroxilado tal como se reivindica en la reivindicación 6 que incluye (i) proporcionar una cepa de levadura tal como se describe en el presente documento, es decir, una cepa de levadura productora de colágeno que incluye un vector que comprende una secuencia de ADN para un colágeno quimérico según la reivindicación 1 y tal como se describe adicionalmente en el presente documento; y (ii) hacer crecer la cepa en un medio durante un periodo de tiempo suficiente para producir colágeno, en el que el periodo es de 24 horas a 72 horas. En esta realización, la cepa de levadura puede seleccionarse del grupo que consiste en aquellas del géneroPichia, Candida, Komatagaella, Hansenula, Saccharomyces, Cryptococcus, Arxula, Ogataeay combinaciones de los mismos; el medio puede seleccionarse del grupo que consiste en medios complejos de glicerol tamponados, medios complejos de metanol tamponados y peptona-dextrosa de extracto de levadura; y el tiempo de cultivo es de 24, 48 ó 72 horas y generalmente oscila entre 24 horas y 72 horas. En algunas realizaciones de este método, la cepa de levadura incluye un promotor seleccionado del grupo que consiste en el ADN para el promotor bidireccional constitutivo pTHX1 y el ADN para el promotor bidireccional constitutivo pGCW14-pGAP1. En otras realizaciones de este método, la cepa de levadura comprende al menos un marcador de selección seleccionado del grupo que consiste en ADN que codifica para una resistencia a los antibióticos y ADN que codifica para un marcador auxotrófico.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos no limitantes son ilustrativos de la presente invención. El alcance de la invención no se limita a los detalles descritos en estos ejemplos.
EJEMPLO 1
Se obtuvo la cepa dePichia pastorisBG10 (tipo natural) de ATUM (anteriormente DNA 2.0). Se insertó una secuencia de<a>D<n>de MMV 63 (SEQ ID NO: 11) (“secuencia 9”) que incluía una secuencia de colágeno y vectores enPichia pastorisde tipo natural, lo que generó la cepa PP28. Se digirió MMV63 mediante Pme I y se transformó en PP1 (cepa dePichia pastorisde tipo natural) para generar PP28. El vector MMV63 se muestra en la figura 1.
Se secuenció el ADN que codifica para colágeno bovino nativo tipo III (SEQ ID NO: 1) y se amplificó la secuencia mediante el protocolo “PCR” de reacción en cadena de la polimerasa para crear una secuencia de ADN lineal. Se transformó el ADN en células de levadura dePichiade tipo natural (PP1) de DNA 2.0 usando un protocolo de electroporación dePichia(sistema total Bio-Rad Gene Pulser Xcell™ n.° 1652660). Se transformaron células de levadura con plásmido de coexpresión P4HA/B y se seleccionaron transformantes (por ejemplo, clon n.° 4) en una placa Hygro (200 ug/ml).
Se inoculó una única colonia del clon n.° 4 en 100 ml de medio YPD y se hizo crecer a 30 grados durante la noche con agitación a 215 rpm. Al día siguiente, cuando el cultivo alcanzó una DO600 ~3,5 (~3-5 * 107 células/DO600) se diluyó con YPD recién preparado hasta una DO600 ~1,7 y se hizo crecer durante otra hora a 30 °C con agitación a 215 rpm. ;Luego, las células se centrifugaron a 3500 g durante 5 minutos; se lavaron una vez con agua y se resuspendieron en 10 ml de Tris-HCl 10 mM (pH 7,5), LiAc 100 mM, DTT 10 mM (recién añadido) y sorbitol 0,6 M. ;Para cada transformación, se colocó una alícuota de 8 * 108 células en 8 ml de Tris-HCl 10 mM (pH 7,5), LiAc 100 mM, DTT 10 mM, sorbitol 0,6 M y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos.
Las células se centrifugaron a 5000 g durante 5 minutos y se lavaron con 1,5 ml de sorbitol 1 M enfriado con hielo 3 veces y se resuspendieron en 80 |il de sorbitol 1 M enfriado con hielo.
Se añadieron a las células diversas cantidades (aproximadamente 5 |ig) de ADN linealizado y se mezclaron mediante pipeteo.
La mezcla de células y ADN (80-100 |il) se añadió a una cubeta de 0,2 cm y se sometió a pulsado según un protocolo paraPichiaa 1500 v, 25 |iF y 200 Q.
Luego se les transfirió inmediatamente una mezcla de 1 ml de YPD y sorbitol 1 M (1:1) y se incubaron a 30 °C durante > 2 horas.
Las células se sembraron en placas a diferentes densidades.
Se inocularon colonias individuales en 2 ml de medio BMGY en una placa de 24 pocillos profundos y se dejaron crecer durante al menos 48 horas a 30 °C con agitación a 900 rpm. Las células resultantes se sometieron a prueba para determinar el colágeno usando lisis celular, SDS-page y ensayo de pepsina siguiendo el procedimiento a continuación.
Se lisaron células de levadura en tampón de lisis 1x usando un equipo Qiagen TissueLyser a una velocidad de 30 Hz de forma continua durante 1 minuto. El tampón de lisis se preparó a partir de 2,5 ml de HEPES 1 M (concentración final 50 mM); 438,3 mg de NaCl; concentración final 150 mM; 5 ml de glicerol; concentración final 10 %; 0,5 ml de Tritón X-100; concentración final 1%; y 42 ml de agua Millipure.
Las células lisadas se centrifugaron a 2500 rpm durante 15 minutos en una centrífuga de mesa. Se retuvo el sobrenadante y se descartó el sedimento.
SDS-PAGE.Se realizó SDS-PAGE en presencia de 2-mercaptoetanol en el sobrenadante, los marcadores de peso molecular, el control negativo y un control positivo. Después de la electroforesis, el gel se retiró y se tiñó con azul de Coomassie y luego se descoloró en agua.
Ensayo de pepsina.Se realizó un ensayo de pepsina con el siguiente procedimiento:
Antes del tratamiento con pepsina se realizó un ensayo BCA para obtener la proteína total de cada muestra según el protocolo Thermo Scientific. La cantidad de proteína total se normalizó a la concentración más baja igual o superior a 0,5 mg/ml para todas las muestras.
Se colocó una muestra de 100 |il de lisado en un tubo de microcentrífuga. Se preparó una mezcla maestra que contenía lo siguiente: HCl al 37 % (0,6 |il de ácido por 100 |il) y disolución madre de pepsina a 1 mg/ml en agua desionizada. La cantidad de pepsina añadida fue en una razón pepsina:proteína total de 1:25 (peso:peso).
Después de la adición de pepsina, las muestras se mezclaron tres veces con una pipeta y se incubaron durante una hora a temperatura ambiente para que tuviera lugar la reacción de pepsina. Después de una hora, se añadió a cada muestra un volumen 1:1 de tampón de carga LDS que contenía p-mercaptoetanol y se dejó incubar durante 7 minutos a 70 °C. Después de la incubación, las muestras se centrifugaron a 14.000 rpm durante 1 minuto para eliminar la turbidez.
Luego, se añadieron 18 |il de la parte superior de las muestras a TAE al 3-8 % usando tampón TAE y se ejecutaron en un gel durante 1 hora y 10 minutos a 150 V. La tabla 1 a continuación informa los resultados. EJEMPLO 2
Se repitió el ejemplo 1 siguiendo los mismos procedimientos y protocolos con los siguientes cambios: se insertó en la levadura una secuencia de ADN de MMV77 (SEQ ID NO: 12) (“secuencia 10”) que incluía una secuencia de colágeno bovino modificada para aumentar la expresión enPichia(SEQ ID NO: 3) (“secuencia 2”). Se usó un promotor pAOX1 (SEQ ID NO: 5) (“secuencia 3”) para impulsar la expresión de la secuencia de colágeno. Se usó una placa YPD que contenía zeocina a 500 ug/ml para seleccionar transformantes exitosos. La cepa resultante fue PP8. El vector MMV77 se muestra en la figura 2. La digestión de restricción se realizó usando Pme I. Las cepas se hicieron crecer en medio BMMY y se sometieron a prueba para determinar el colágeno. Los resultados se muestran en la tabla 1 a continuación.
EJEMPLO 3
Se repitió el ejemplo 1 siguiendo los mismos procedimientos y protocolos con los siguientes cambios: se insertó en la levadura una secuencia de ADN de MMV-129 (SEQ ID NO: 13) (“secuencia 11”) que incluía una secuencia de colágeno bovino modificada para aumentar la expresión enPichia.Se usó un promotor pCAT (SEQ ID NO: 9) (“secuencia 7”) para impulsar la expresión de la secuencia de colágeno. Se usó una placa YPD que contenía zeocina a 500 |ig/ml para seleccionar transformantes exitosos. La cepa resultante fue PP123. Se digirió MMV129 mediante Swal y se transformó en PP1 para generar PP123. El vector MMV129 se muestra en la figura 3. Las cepas se hicieron crecer en medio BMGY y se sometieron a prueba para determinar el colágeno. Los resultados se muestran en la tabla 1 a continuación.
EJEMPLO 4
Se repitió el ejemplo 1 siguiendo los mismos procedimientos y protocolos con los siguientes cambios:
Se insertó en la levadura una secuencia de ADN de MMV-130 (SEQ ID NO: 14) (“secuencia 12”) que incluía una secuencia de colágeno bovino Col3A1 (tipo III) (SEQ ID NO: 3) (“secuencia 2”) modificada para aumentar la expresión enPichia.Se usó un promotor pDF mostrado en SEQ ID NO: 8 (“secuencia 6”) para impulsar la expresión de la secuencia de colágeno. Se usó un sitio de posicionamiento AOX1 (SEQ ID NO: 10) (“secuencia 8”), que está cortado por Pmel, para facilitar la integración específica del sitio del vector en el genoma dePichia.Se usó una placa YPD que contenía zeocina a 500 |ig/ml para seleccionar transformantes exitosos. La cepa resultante se denominó PP153. MMV130 se digirió mediante Pmel y se transformó en PP1 para generar PP153. La secuencia bovina col3A1 modificada viene dada por SEQ ID NO: 3 (“secuencia 2”).
Se usó un kit de purificación por PCR PureLink en lugar de extracción con fenol para recuperar el ADN linealizado. Las cepas se hicieron crecer en medio BMGY y se sometieron a prueba para determinar el colágeno. Los resultados se muestran en la tabla 1 a continuación.
EJEMPLO 5
Se repitió el ejemplo 2 siguiendo los mismos procedimientos y protocolos con los siguientes cambios:
Se insertó en la levadura un vector de ADN, MMV-78 (SEQ ID NO: 15) (“secuencia 13”), que contenía secuencias tanto de P4HA bovina optimizada (SEQ ID NO: 6) (“secuencia 4”) como de P4HB bovina (SEQ ID NO: 7) (“secuencias 5”). Se digirió MMV78 mediante Pmel y se transformó en PP1 para generar PP8. Tanto P4HA como P4HB contenían sus péptidos señal endógenos y están impulsados por el promotor bidireccional Das1-Das2 (SEQ ID NO: 27) (“secuencia 24”). Se digirió el ADN mediante Kpn I y se transformó en PP8 para generar PP3. El vector MMV78 se muestra en la figura 5. Las cepas se cultivaron en medio BMMY y se sometieron a prueba para determinar el colágeno e la hidroxilación. Los resultados se muestran en la tabla 1 a continuación.
EJEMPLO 6
Se repitió el ejemplo 2 siguiendo los mismos procedimientos y protocolos con los siguientes cambios:
Se insertó en la levadura un vector de ADN, MMV-78, que contenía secuencias tanto de P4HA bovina como de P4HB bovina. Tanto P4HA como P4HB contenían sus péptidos señal endógenos y estaban impulsados por el promotor bidireccional Das1-Das2. Se digirió el ADN mediante Kpnl y se transformó en PP8 para generar<p>P3. Se usó otro vector, MMV-94 (SEQ ID NO: 16) (“secuencia 14”), que contenía P4HB impulsado por el promotor pAOX1 y también se insertó en la levadura. El péptido señal endógeno de P4HB fue reemplazado por el péptido señal PHO1. La cepa resultante fue PP38. MMV94 fue digerido por Avr II y se transformó en PP3 para generar PP38. El vector m MV94 se muestra en la figura 6. Las cepas se cultivaron en medio BMMY y se sometieron a prueba para determinar el colágeno e la hidroxilación. Los resultados se muestran en la tabla 1 a continuación. EJEMPLO 7
Se repitió el ejemplo 4 siguiendo los mismos procedimientos y protocolos con los siguientes cambios:
Se insertó en la levadura un vector de ADN, MMV-156 (SEQ ID NO: 17) (“secuencia 15”), que contenía secuencias tanto de P4HA bovina como de P4HB bovina. El P4HA contenía sus péptidos señal endógenos y la secuencia señal de P4HB se reemplazó con la secuencia pre de factor alfa (SEQ ID NO: 23) (“secuencia 21”). Ambos genes fueron impulsados por el promotor bidireccional pHTX1 (SEQ ID NO: 26) (“secuencia 25”). El MMV156 se digirió mediante Barn HI y se transformó en PP153 para generar PP154. El vector MMV156 se muestra en la figura 7. Las cepas se cultivaron en medio BMGY y se sometieron a prueba para determinar el colágeno e la hidroxilación. Los resultados se muestran en la tabla 1 a continuación.
EJEMPLO 8
Se repitió el ejemplo 4 siguiendo los mismos procedimientos y protocolos con los siguientes cambios: se insertó en la levadura un vector de ADN, MMV-156, que contenía secuencias tanto de P4HA bovina como de P4HB bovina. P4HA contiene sus péptidos señal endógenos y la secuencia señal P4HB se reemplazó con la secuencia pre de factor alfa. Ambos genes fueron impulsados por el promotor bidireccional pHTX1. Se digirió el ADN mediante Swal y se transformó en PP153 para generar PP154.
También se insertó en la levadura otro vector, MMV-191 (SEQ ID NO: 18) (“secuencia 16”), que contenía tanto P4HA como P4HB. La copia adicional de P4HA contiene su péptido señal endógeno y la secuencia señal de la copia adicional de P4HB se reemplazó con la secuencia prepro de factor Alfa (SEQ ID NO: 24) (“secuencia 22”). Las copias adicionales de P4HA y P4HB fueron impulsadas por el promotor bidireccional pGCW14-GAP1 (SEQ ID NO: 25) (“secuencia 23”). MMV191 se digirió mediante Bam HI y se transformó en PP154 para generar PP268. El vector MMV191 se muestra en la figura 8. Las cepas se hicieron crecer en medio BMGY y se sometieron a prueba para determinar el colágeno y la hidroxilación. Los resultados se muestran en la tabla 1 a continuación.
EJEMPLO 9
Los métodos y procedimientos del ejemplo 1 se utilizaron para crear un vector todo en uno. El vector todo en uno contiene ADN de colágeno y el promotor y terminador asociados, el ADN para las enzimas que hidroxilan el colágeno y los promotores y terminadores asociados, el ADN para la expresión del marcador y el promotor y terminador asociados, el ADN para el/los origen/orígenes de replicación para bacterias y levaduras, y el/los ADN con homología con el genoma de la levadura para su integración. El vector todo en uno contiene sitios de restricción únicos estratégicamente ubicados en 5', 3' o dentro de los componentes anteriores. Cuando se desea realizar alguna modificación en la expresión del colágeno u otros componentes del vector, el ADN de componentes seleccionados puede escindirse fácilmente con enzimas de restricción y reemplazarse con el método de clonación elegido por el usuario. La versión más simple del vector todo en uno MMV208 (SEQ ID NO: 19) (“secuencia 17”) incluye todos los componentes anteriores excepto el/los promotor(es) para las enzimas hidroxilasas. El vector MMV208 se preparó usando los siguientes componentes: homología AOX de MMV84 (SEQ ID NO: 20) (“secuencia 18”), homología ribosómica de MMV150 (SEQ ID NO: 21) (“secuencia 19”), orígenes bacteriano y de levadura de replicación de MMV140 (SEQ ID NO: 22) (“secuencia 20”), marcador de zeocina de MMV140 y Col3A1 de MMV129. Se sintetizaron versiones modificadas de P4HA y B y terminadores asociados a partir de Genscript eliminando los siguientes sitios de restricción: AvrII, Notl, Pvul, Pmel, BamHI, Sacll, Swal, Xbal, Spel. El vector se transformó en la cepa PP1.
Las cepas se cultivaron en medio BMGY y se sometieron a prueba para determinar el colágeno y la hidroxilación. Los resultados se muestran en la tabla 1 a continuación.
La tabla 1 describe la cantidad de colágeno producido en g/l, así como el porcentaje de colágeno hidroxilado. La cantidad de colágeno expresada se cuantificó tiñendo geles con tinte azul de Coomassie y comparando el resultado con una curva de calibración para el contenido de colágeno. La cantidad de colágeno hidroxilado se determinó comparando bandas de muestra con una banda convencional después de un tratamiento con pepsina 1:25. La expresión de colágeno hidroxilado porPichiaes ventajosa porque el colágeno hidroxilado es estable en una alta concentración de pepsina necesaria para procesar adicionalmente los polipéptidos de colágeno.
Tabla 1
Los datos de los ejemplos 1 y 2 muestran que la modificación de codones de la secuencia de colágeno bovino tipo III duplicó la cantidad de colágeno expresado porPichia.La comparación de los datos de los ejemplos 2 y 3 muestra que la expresión del colágeno bovino tipo III aumenta adicionalmente en un factor de 5 impulsando la transcripción de la secuencia codificante del colágeno tipo III con el promotor pCAT. La comparación de los datos de los ejemplos 2 y 4 muestra que la expresión del colágeno bovino tipo III aumenta de diez a quince veces impulsando la transcripción de la secuencia codificante del colágeno tipo III con el promotor pDF y proporcionando un sitio de posicionamiento AOX1 para facilitar la integración del vector en ADN genómico dePichia.La comparación de los datos de los ejemplos 2, 5 y 6 muestra que la transformación dePichiacon secuencias codificantes para la prolina hidroxilasa (P4HA P4HB) produjeron colágeno hidroxilado y que la cantidad de colágeno hidroxilado podría aumentarse regulando adicionalmente la expresión de la prolina hidroxilasa. Los ejemplos 7-9 muestran que la expresión de colágeno puede aumentarse de cinco a quince veces y que la cantidad de colágeno hidroxilato aumentó mediante la introducción de dos vectores o mediante un enfoque de vector todo en uno en el que tanto las secuencias de colágeno como las de hidroxilasa están codificadas por el mismo vector.
EJEMPLO 10
Los métodos y procedimientos del ejemplo 1 se usaron para crear vectores quiméricos Col3A1. El vector MMV132 se modificó para incluir el ADN de colágeno quimérico y el promotor asociado PDF y el terminador AOX1TT, el ADN para la expresión del marcador y el promotor y terminador asociados, el ADN para el/los origen/orígenes de replicación para bacterias y levaduras, y el/los ADN(s) con homología con el genoma de la levadura para su integración. El vector MMV63 fue el ADN fuente para los dominios de Col3A1 no modificados. El vector MMV128 (figura 21) fue el ADN fuente para los dominios de Col3A1 modificados. La longitud total del polipéptido de Col3A1 es de 1465 aminoácidos (aa). Los plásmidos se diseñaron para incorporar secuencias de ADN bovino nativo (sin modificar) y secuencias de ADN con codones modificados dePichia pastoris.Los plásmidos se diseñaron de manera que las transiciones entre secuencias modificadas y no modificadas de Col3A1 estuvieran en aa 710, 1.200 y 1.331. Estos métodos se usaron para crear los plásmidos MMV193, MMV194, MMV195, MMV197, MMV198 y MMV199. Los vectores plasmídicos resultantes se muestran en la tabla 2 a continuación con el plásmido MMV130 completamente optimizado y el plásmido MMV200 completamente no optimizado (figura 20) para comparación.
Tabla 2
EJEMPLO 11
Se repitió el ejemplo 2 siguiendo los mismos procedimientos y protocolos con los siguientes cambios:
Se obtuvieron PP1 y PP97. PP97 era una cepa en la que se inactivaron dos genes de proteasa (PEP4 y PRB1) de la cepa huésped. Se insertaron en la levadura las secuencias de ADN de MMV194, MMV195,<m>M<v>130 y MMV200 que incluían diferentes combinaciones de ADN de secuencia de colágeno bovino modificado y no modificado para la expresión enPichia.Se usó un promotor pDF para impulsar la expresión de la secuencia de colágeno. Se usó una placa YPD que contenía zeocina a 500 ug/ml para seleccionar transformantes exitosos. La digestión de restricción se realizó usando SwaI para linealizar el ADN para la integración, se transformaron 3 5 ug de ADN cortado para vectores excepto MMV130 que se digirió con Pme1 y se transformaron 200 ng de ADN. Las cepas resultantes se muestran en la tabla 3 a continuación.
Tabla 3
EJEMPLO 12
Se repitió el ejemplo 7 siguiendo los mismos procedimientos y protocolos con los siguientes cambios:
Se insertó en la levadura un vector de ADN, MMV-156, que contenía secuencias tanto de P4HA bovina como de P4HB bovina. P4HA contiene sus péptidos señal endógenos y la secuencia señal P4HB se reemplazó con la secuencia pre de factor alfa. Ambos genes fueron impulsados por el promotor bidireccional pHTX1. Se digirió el ADN mediante BamH1 y se transformó. Véase la tabla 4 para obtener información sobre las cepas y transformaciones.
Tabla 4
Cepa original Punto de división Primera mitad Segunda mitad Plásmidos Cepa
EJEMPLO 13
Se repitió el ejemplo 8 siguiendo los mismos procedimientos y protocolos con los siguientes cambios:
El tampón de lisis se elabora con Na2PO450 mM, EDTA 1 mM, glicerol al 5 % y el pH se ajustó a 7,4 con ácido acético. También se insertó en la levadura otro vector, MMV-191, que contenía tanto P4HA como P4HB. La copia adicional de P4HA contiene su péptido señal endógeno y la secuencia señal de la copia adicional de P4HB se reemplazó con la secuencia prepro de facto alfa. Las copias adicionales de P4HA y P4HB fueron impulsadas por el promotor bidireccional pGCW14-GAP1. Se digirió el ADN mediante Barn HI y se transformó. Véase la tabla 5 para obtener información sobre transformaciones y nuevas cepas. Las cepas se cultivaron en medio BMGY y se sometieron a prueba para determinar el colágeno.
Tabla 5
EJEMPLO 14
Se repitió el ejemplo 2 siguiendo los mismos procedimientos y protocolos con los siguientes cambios:
Se insertó en la levadura un vector de ADN, MMV-78, que contenía secuencias tanto de P4HA bovina como de P4HB bovina. P4HA y P4HB son impulsadas por el promotor bidireccional Das1-Das2. Se digirió el ADN mediante Kpn I y se transformó en PP8 para generar PP3 que contiene la secuencia de colágeno de SEQ ID NO: 3 (“secuencia 2”). Se usó otro vector, MMV-94 (SEQ ID NO: 16) (“secuencia 14”), que contenía P4HB impulsada por el promotor pAOX1 y también se insertó en la levadura. El péptido señal endógeno de P4HB fue reemplazado por el péptido señal PHO1. La cepa resultante fue PP38.
Se llenó una placa de 24 pocillos profundos con 2 ml de YPD en cada pocillo y se inocularon colonias individuales de la cepa PP38. Las colonias se cultivaron en YPD durante 24 horas con agitación a 900 rpm. Las células se centrifugaron a 3.000 rpm durante 5 minutos y se eliminó el sobrenadante. Para la inducción sin metanol, el sobrenadante se reemplazó con 2 ml de BMGY (1 %) y se cultivó durante otras 48 horas. Para la inducción con metanol, se añadió metanol hasta una concentración final del 0,5 % y las células se cultivaron durante 24 horas. Se añadió nuevamente metanol y las células crecieron durante otras 24 horas. Al final de la inducción, se extrajo 1 ml de muestra para su análisis.
Se sometieron a prueba las muestras para determinar el colágeno usando SDS-PAGE y tinción de Coomassie descrita en el ejemplo 1. La banda para la muestra de inducción libre de metanol era más oscura que la banda para la muestra inducida con metanol, lo que muestra que la muestra de inducción libre de metanol tenía una mayor concentración de colágeno expresado.
Términos tales como “optimizado” u “optimizar” tal como se usan en el presente documento incluyen valores o características obtenidos mediante una selección cuidadosa de características de constructos de ADN quimérico u otras variables críticas del proceso y no implican el uso de una variable conocida que produzca resultados efectivos.
La terminología usada en el presente documento tiene el propósito de describir realizaciones particulares únicamente y no pretende que sea limitativa de la invención.
Los títulos (tales como “Antecedentes” y “Sumario”) y los subtítulos usados en el presente documento están destinados únicamente a la organización general de los temas dentro de la presente invención, y no se pretende que limiten la divulgación de la presente invención o cualquier aspecto de la misma. En particular, el objeto dado a conocer en los “Antecedentes” puede incluir tecnología novedosa y puede no constituir una enumeración de la técnica anterior. El objeto dado a conocer en el “Sumario” no es una divulgación exhaustiva o completa del alcance total de la tecnología o cualquiera de sus realizaciones. La clasificación o discusión de un material dentro de una sección de esta memoria descriptiva como si tuviera una utilidad particular se hace por conveniencia, y no debe inferirse que el material debe funcionar necesaria o únicamente según su clasificación en el presente documento cuando se usa en cualquier composición determinada.
Tal como se usan en el presente documento, se pretende que las formas singulares “un”, “una” y “el/la” incluyan también las formas plurales, a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
Tal como se usa en el presente documento, el término “y/o” incluye todas y cada una de las combinaciones de uno o más de los elementos enumerados asociados y puede abreviarse como “/”.
Los enlaces se deshabilitan mediante la inserción de un espacio o un espacio subrayado antes de “www” y pueden reactivarse eliminando el espacio.
Tal como se usa en el presente documento en la memoria descriptiva y las reivindicaciones, incluido el uso en los ejemplos y a menos que se especifique expresamente lo contrario, todos los números pueden leerse como si estuvieran precedidos por la palabra “sustancialmente”, “alrededor de” o “aproximadamente”, incluso si el término no aparece expresamente. La frase “alrededor de” o “aproximadamente” puede usarse al describir la magnitud y/o la posición para indicar que el valor y/o la posición descritos están dentro de un intervalo esperado razonable de valores y/o posiciones. Por ejemplo, un valor numérico puede tener un valor que sea /- 0,1 % del valor indicado (o intervalo de valores), /- 1 % del valor indicado (o intervalo de valores), /- 2 % del valor declarado (o intervalo de valores), /- 5 % del valor declarado (o intervalo de valores), /- 10 % del valor declarado (o intervalo de valores), /- 15 % del valor declarado (o intervalo de valores), /- 20 % del valor indicado (o intervalo de valores), etc. Cualquier intervalo numérico mencionado en el presente documento pretende incluir todos los subintervalos incluidos en el mismo.
Tal como se usan en el presente documento, las palabras “preferido” y “preferiblemente” se refieren a realizaciones de la tecnología que brindan determinados beneficios, bajo determinadas circunstancias. Sin embargo, también pueden preferirse otras realizaciones, en las mismas u otras circunstancias. Además, la enumeración de una o más realizaciones preferidas no implica que otras realizaciones no sean útiles y no se pretende que excluya otras realizaciones del alcance de la tecnología.
Tal como se menciona en el presente documento, todos los porcentajes de composición son en peso de la composición total, a menos que se especifique lo contrario. Tal como se usa en el presente documento, se pretende que la palabra “incluir” y sus variantes no sean limitativas, de modo que la enumeración de elementos en una lista no excluye otros elementos similares que también pueden ser útiles en los materiales, composiciones, dispositivos y métodos de esta tecnología. De manera similar, se pretende que los términos “puede” y “podría” y sus variantes no sean limitativos, de modo que la mención de que una realización puede o podría comprender determinados elementos o características no excluye otras realizaciones de la presente invención que no contienen esos elementos o características.
Aunque los términos “primero” y “segundo” pueden usarse en el presente documento para describir diversas características/elementos (incluyendo las etapas), estas características/elementos no deben estar limitados por estos términos, a menos que el contexto indique lo contrario. Estos términos pueden usarse para distinguir una característica/elemento de otra característica/elemento. Por tanto, una primera característica/elemento analizado a continuación podría denominarse segunda característica/elemento y, de manera similar, una segunda característica/elemento analizado a continuación podría denominarse primera característica/elemento sin apartarse de las enseñanzas de la presente invención.
En el presente documento pueden usarse términos espacialmente relativos, tales como “debajo”, “abajo”, “inferior”, “sobre”, “superior” y similares, para facilitar la descripción para describir la relación de un elemento o característica con otro(s) elemento(s) o característica(s) tal como se ilustra en las figuras. Se entenderá que, se pretende que los términos espacialmente relativos abarquen diferentes orientaciones del dispositivo en uso u operación además de la orientación representada en las figuras. Por ejemplo, si un dispositivo en las figuras está invertido, los elementos descritos como “debajo” o “por debajo” de otros elementos o características se orientarían entonces “sobre” los otros elementos o características. Por tanto, el término a modo de ejemplo “debajo” puede abarcar tanto una orientación de arriba como de abajo. El dispositivo puede orientarse de otra manera (girado 90 grados o en otras orientaciones) y los descriptores espacialmente relativos usados en el presente documento pueden interpretarse en consecuencia. De manera similar, los términos “hacia arriba”, “hacia abajo”, “vertical”, “horizontal” y similares se usan en el presente documento únicamente con fines explicativos, a menos que se indique específicamente lo contrario.
Cuando en el presente documento se hace referencia a que una característica o elemento está “sobre” otra característica o elemento, puede estar directamente sobre la otra característica o elemento o también pueden estar presentes características y/o elementos intermedios. Por el contrario, cuando se dice que una característica o elemento está “directamente sobre” otra característica o elemento, no hay características o elementos intermedios presentes. También se entenderá que, cuando se hace referencia a una característica o elemento como “conectado”, “unido” o “acoplado” a otra característica o elemento, puede estar directamente conectado, unido o acoplado a la otra característica o elemento o pueden estar presentes características o elementos intermedios. Por el contrario, cuando se hace referencia a una característica o elemento como “directamente conectado”, “directamente unido” o “directamente acoplado” a otra característica o elemento, no hay características o elementos intermedios presentes. Aunque se describen o muestran con respecto a una realización, las características y elementos así descritos o mostrados pueden aplicarse a otras realizaciones. Los expertos en la técnica también apreciarán que las referencias a una estructura o característica que está dispuesta “adyacente” a otra característica pueden tener porciones que se superponen o subyacen a la característica adyacente.
La cita de referencias en el presente documento no constituye una admisión de que dichas referencias sean técnica anterior o tengan alguna relevancia para la patentabilidad de la tecnología dada a conocer en el presente documento. Cualquier discusión sobre el contenido de las referencias citadas tiene como objetivo simplemente proporcionar un resumen general de las afirmaciones hechas por los autores de las referencias y no constituye una admisión en cuanto a la exactitud del contenido de tales referencias.

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Secuencia quimérica de ADN de colágeno bovino que comprende una combinación de una sección de SEQ ID NO: 1 que se ha optimizado para su expresión enPichia pastorisy una sección de SEQ ID NO: 1 que no está optimizada, en la que la sección de SEQ ID NO: 1 que se ha optimizado para su expresión enPichia pastoriscomprende del 60 al 90 % de la longitud total de la secuencia quimérica de ADN de colágeno bovino, y la sección de SEQ ID NO: 1 que no está optimizada comprende del 10 al 40 % de la longitud total de la secuencia quimérica de ADN de colágeno bovino, y en la que la sección de SEQ ID NO: 1 que se ha optimizado para su expresión enPichia pastoriscodifica para la secuencia de aminoácidos en el extremo N-terminal de una molécula de colágeno bovino y la sección de SEQ ID NO: 1 que no está optimizada codifica para la secuencia de aminoácidos en el extremo C-terminal de una molécula de colágeno bovino.
2. Secuencia quimérica de ADN de colágeno bovino según la reivindicación 1, en la que la secuencia quimérica de ADN de colágeno bovino está unida a una secuencia de polinucleótidos que codifica para P4HA1, P4HB o ambos.
3. Secuencia quimérica de ADN de colágeno bovino según la reivindicación 1, en la que la sección de SEQ ID NO: 1 que se ha optimizado para su expresión enPichia pastoriscomprende del 60 al 80 % de la longitud total de la secuencia quimérica de ADN de colágeno bovino.
4. Cepa de levadura productora de colágeno que comprende un vector, en la que el vector comprende la secuencia quimérica de ADN de colágeno bovino según la reivindicación 1.
5. Cepa de levadura productora de colágeno según la reivindicación 4, que comprende además una secuencia de polinucleótidos que codifica para P4HA1, P4HB o ambos.
6. Método para producir colágeno hidroxilado que comprende hacer crecer la cepa de levadura productora de colágeno según la reivindicación 5 en un medio durante de 24 horas a 72 horas.
7. Cepa de levadura productora de colágeno según la reivindicación 4, en la que la cepa de levadura productora de colágeno es una cepa dePichia.
8. Método según la reivindicación 6, en el que el medio se selecciona del grupo que consiste en medios complejos de glicerol tamponados, medios complejos de metanol tamponados y peptona-dextrosa de extracto de levadura.
9. Método según la reivindicación 6, en el que el periodo de tiempo es de 24 horas, 48 horas o 72 horas.
10. Método según la reivindicación 6, en el que el vector comprende además un promotor seleccionado del grupo que consiste en un promotor bidireccional constitutivo pTHX1 y un promotor bidireccional constitutivo pGCW14-pGAP1.
11. Método según la reivindicación 6, en el que el vector comprende además al menos un marcador de selección seleccionado del grupo que consiste en ADN que codifica para una resistencia a antibióticos y ADN que codifica para un marcador auxotrófico.
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