CN116375847A - 酵母重组xvii型人源化胶原蛋白及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种酵母重组XVII型人源化胶原蛋白及其制备方法,尤其是表达XVII型胶原蛋白第15螺旋区的重组人源化胶原蛋白、重组工程菌及其制备方法,属于基因工程、合成生物学技术领域。本发明提供了XVII型胶原蛋白的第15螺旋区全长序列,并基于该序列进行氨基酸残基的突变得到突变体;本发明首次将XVII胶原蛋白的第15螺旋区的全长序列在毕赤酵母表达,建立了一整套的发酵工艺和纯化工艺,提高蛋白表达水平并减少降解,并通过实验验证了所得到的蛋白具有达到乃至超过天然人胶原的细胞粘附活性、促细胞迁移活性等生物学活性,能达到真正产品应用的目的,可以广泛应用于医药、医疗器械、生物材料、组织工程、化妆品等领域。
Description
技术领域
本发明涉及酵母重组XVII型人源化胶原蛋白及其制备方法,尤其是表达XVII型胶原蛋白第15螺旋区的重组人源化胶原蛋白、重组工程菌其制备方法,属于基因工程、合成生物学技术领域。
背景技术
人有28种不同的胶原蛋白,其中人XVII胶原蛋白是一种跨膜型非成纤维胶原蛋白,是细胞中半桥粒的一种组成成分,在上皮细胞-基底膜的作用中发挥重要作用;可调控上皮细胞的黏附、分离和发育分化,对角化细胞的分化和再生有重要作用;可维持毛囊干细胞、表皮干细胞的活性,对于细胞衰老和皮肤分化具有重要的作用。人XVII胶原蛋白由三条相同α1(XVII)链构成,分为胞内、跨膜、胞外三大类结构域,又可根据是否具有典型的(Gly-X-Y)n氨基酸重复序列及能否形成三螺旋区域分为16个非三螺旋区和15个三螺旋区。其中第15螺旋区全长242个氨基酸,是XVII胶原蛋白中最长的三螺旋区域,具有典型的(Gly-X-Y)n氨基酸重复序列特征。现有人XVII胶原蛋白的研究主要集中于发育生物学、基因研究和疾病发生机理,对其蛋白质本身结构、功能等面的研究认识极其有限,对第15螺旋区的研究认知是最多的:现有研究表明其可与不常见的整合素α5β1、αVβ1结合,有特殊的整合素结合位点,对多种细胞有良好的细胞黏附活性,在热变性后单链的状态下仍保持其生物学活性。第15螺旋区是人XVII胶原蛋白中最有应用潜力的功能区域。
人XVII胶原蛋白在人体及动物体内中含量极少,提取难度非常大,无法依靠传统的酸、碱、酶解法处理动物组织获得,少量的提取只满足科研需求,无法量产,没有大量应用的可能性,同时不可避免的有免疫原性和潜在的病毒、疫病等生物安全性隐患。现在解决此类问题的主要方式则是通过基因工程等生物技术来获得重组胶原蛋白。现有的几种重组蛋白表达体系中:哺乳动物细胞表达系统、昆虫细胞(杆状病毒)表达系统成本高、产量低,胶原蛋白的大量生产应用一般不采用这两种方式。原核(大肠杆菌)系统表达的重组蛋白无翻译后修饰、胞内表达需菌体裂解,会有大量杂质蛋白,且天然带有作为细菌细胞壁成分的内毒素、肽聚糖等热源物质。毕赤酵母作为一种真核微生物,拥有真核细胞完整的细胞器,能对重组蛋白质进行一定的翻译后修饰,有力支撑蛋白质生物学功能的实现,拥有微生物表达系统高密度、低成本、短周期、高表达等规模化发酵工业生产的优点;重组蛋白可分泌于胞外,无菌体裂解而来的杂质蛋白;细胞壁成分中不含内毒素、肽聚糖。毕赤酵母遗传背景清楚,已有多种基因工程药品、疫苗实现上市,监管审批的难度小,是最为理想的胶原蛋白表达体系。
但毕赤酵母表达系统仍然有其缺点,其中最主要的是分泌表达的外源重组蛋白往往被毕赤酵母中的蛋白酶系统降解,特别是于高密度发酵表达天然序列的重组蛋白质时(比如胶原蛋白),降解的情况会比较严重。针对这种情况,研究者往往采用修改胶原蛋白相应氨基酸序列的方式达到降低降解的目的,但蛋白质的氨基酸序列是其理化性质、生物学功能等一切性质的基石,所以氨基酸序列并不能仅仅以降低降解为目的,还要保证其理化性质,特别生物学功能的稳定,这需要大量研究才能做到。另外,蛋白质氨基酸序列是亿万年来自然进化形成的结果,人们现有对胶原蛋白的认知仍是有限的,保持其氨基酸序列的稳定性是重组人胶原蛋白生产开发中(以现有科学水平不可认知到的)隐患最少的一种策略。
现有研究中,通过原核(大肠杆菌)表达,申请号CN201911051106.3使用PET载体和大肠杆菌表达体系,从人XVII胶原蛋白第15螺旋区的氨基酸序列中分别选取一段69个氨基酸序列(专利中命名为17A)和另一段63个氨基酸序列(专利中命名为17B)及以这两段序列三次重复序列(专利中命名为17A3、17B3)进行了表达,但均未覆盖全部的第15螺旋区序列。重组胶原蛋白的应用前提是能够进行规模化、高密度、高表达的发酵生产和纯化,毕赤酵母是一种理想的表达宿主。但作为真核生物,对异源性的蛋白质大量表达分泌,即细胞内生物资源被大量占用的情况下,毕赤酵母必然会对异源性蛋白质表达进行相应的调控,其突出的表现其实就是所表达重组蛋白的降解。这在未经突变、修饰的天然胶原蛋白氨基酸序列上表现的更为突出。对于具体种类的重组蛋白,确定一整套的降低降解产生的发酵、纯化工艺则是获得完整天然氨基酸序列的重组胶原蛋白的关键技术,尤其是高密度、高表达的发酵生产、纯化的规模化制备生产时,更是不可或缺。
发明内容
本发明的目的在于,克服现有技术中存在的一些技术问题,提供酵母重组XVII型人源化胶原蛋白、重组工程菌及其制备方法,尤其是提供了表达XVII型胶原蛋白第15螺旋区的重组人源化胶原蛋白、重组工程菌及其制备方法。
为实现上述目的,本发明采用了以下技术方案:
本发明首先提供了一种重组XVII型人源化胶原蛋白,所述重组XVII型人源化胶原蛋白包括与SEQ ID NO.1的567-808位具有80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上同一性的氨基酸序列,并维持XVII型胶原蛋白第15螺旋区生物学活性。
在某些实施方式中,所述重组XVII型人源化胶原蛋白包括与SEQ ID NO.2(1703NT)、SEQ ID NO.4(1703)、SEQ ID NO.6(1703MNT)或SEQ ID NO.8(1703M)具有80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上同一性并维持XVII型胶原蛋白第15螺旋区生物学活性的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述重组XVII型人源化胶原蛋白包括SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列。
本发明还提供了分离的多核苷酸,所述多核苷酸编码本发明所述的重组XVII型人源化胶原蛋白。
在某些实施方式中,所述多核苷酸包括SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列、或其简并序列。
本发明还提供了载体,所述载体包含本发明所述的多核苷酸。
在某些实施方式中,所述载体为真核载体或原核载体。
在某些实施方式中,所述载体为pPIC9K。
本发明还提供了宿主细胞或重组工程菌,所述宿主细胞或重组工程菌包括本发明所述的核酸,或本发明所述的载体。
在某些实施方式中,所述宿主细胞或重组工程菌为真核细胞或原核细胞。
在某些实施方式中,所述宿主细胞或重组工程菌为毕赤酵母工程菌。
在某些实施方式中,所述毕赤酵母工程菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC No.21889、CGMCC No.21888、CGMCC No.21890、CGMCCNo.21884。
本发明还提供了组合物,所述组合物包括本发明所述的重组XVII型人源化胶原蛋白,或本发明所述的多核苷酸,或本发明所述的载体,或本发明所述的宿主细胞或重组工程菌。
本发明还提供了制品,所述制品包括包括本发明所述的重组XVII型人源化胶原蛋白,或本发明所述的多核苷酸,或本发明所述的载体,或本发明所述的宿主细胞或重组工程菌,或本发明所述的组合物;优选地,所述制品选自药物、医疗器械、生物材料、组织工程产品、化妆品或保健品。
本发明还提供了本发明所述的重组XVII型人源化胶原蛋白,本发明所述的多核苷酸,本发明所述的载体,发明所述的宿主细胞或重组工程菌,本发明所述的组合物或本发明所述的制品在制备药物、医疗器材、生物材料、组织工程产品、化妆品或保健品中的用途。
本发明还提供了一种提高重组XVII型人源化胶原蛋白生产水平且蛋白低降解的制备方法,包括如下步骤:
(1)将所述重组工程菌接于种子培养基中,过夜培养制备菌种液;
(2)设置发酵温度和pH值,将菌种液接种到发酵培养基中,调节搅拌转速、空气通量、罐压、DO值,培养至碳源耗尽,DO快速回升,开始流加补料培养基,至菌OD600值至一定值,停止流加补料培养基;
(1)等甘油耗尽,DO≥70%后开始流加诱导培养基,进入甲醇诱导阶段,调节转速、通气量、罐压和流加速度使DO≥30%;
(4)诱导发酵结束后,取发酵液上清,检测蛋白;
优选地,所述重组XVII型人源化胶原蛋白为表达XVII型胶原蛋白第15螺旋区的重组人源化胶原蛋白;更优选地,所述重组XVII型人源化胶原蛋白包括权利要求1或2中所述,或者包括SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述步骤(1)中种子培养基为YPG。
在某些实施方式中,所述步骤(2)中发酵温度设置为25℃-35℃,优选温度为30℃,pH值设置为3.5-6,优选pH值为4.0;所述补料培养基为50%W/V甘油,每升加12mL PTM1。
在某些实施方式中,所述步骤(2)中当所述菌OD600值为50-150,优选菌OD600值为50时,停止流加补料培养基。
在某些实施方式中,所述步骤(2)中发酵培养基组分包括:NH4H2PO4 11.9-47.6g/L、KH2PO4 2.515-10.06g/L、CaSO4·2H2O 0.295-1.18g/L、K2SO4 4.55-18.2g/L、MgSO4·7H2O3.725-14.9g/L、甘油20g/L、PTM1 0.45mL/L;优选地,所述发酵培养基组分包括NH4H2PO411.9g/L、KH2PO4 2.515g/L、CaSO4·2H2O 0.295g/L、K2SO4 4.55g/L、MgSO4·7H2O 3.725g/L、甘油20g/L、PTM1 0.45mL/L。
在某些实施方式中,所述步骤(3)中诱导培养基组分包括:纯甲醇、50%甘油、PTM1;其中纯甲醇和50%甘油体积比为10-7:0-3,每升加入12mL PTM1;优选地,所述纯甲醇和50%甘油体积比为8:2。
在某些实施方式中,所述步骤(4)后还包括对发酵产品进行纯化的步骤;优选地,所述纯化包括依次进行的疏水层析和阳离子层析步骤。
在某些实施方式中,所述疏水层析采用缓冲液A平衡,缓冲液B洗杂,缓冲液C洗脱。阳离子层析采用缓冲液D平衡,缓冲液E洗脱;优选地,缓冲液A包括:20mM KH2PO4,2M硫酸铵,pH5.0;缓冲液B包括:20mM KH2PO4,0.6M硫酸铵,pH5.0;缓冲液C包括:20mM KH2PO4,pH5.0;缓冲液D包括:20mM酒石酸,100mM氯化钠,pH4.0;缓冲液E包括:20mM酒石酸,500mM氯化钠,pH4.0。
本发明进一步的还提供了一种重组XVII型人源化胶原蛋白的纯化方法,包括如下步骤:
(1)疏水层析:配制缓冲液A:20mM KH2PO4,2M硫酸铵,pH5.0;缓冲液B:20mMKH2PO4,0.6M硫酸铵,pH5.0;缓冲液C:20mM KH2PO4,pH5.0;收集重组XVII型人源化胶原蛋白的发酵液上清,用缓冲液A平衡疏水层析介质,上样结束后,用缓冲液A进行再平衡;然后缓冲液B进行洗杂,缓冲液C进行洗脱,开始收集洗脱液1;
(2)阳离子层析:配制缓冲液D:20mM酒石酸,100mM氯化钠,pH4.0;缓冲液E:20mM酒石酸,500mM氯化钠,pH4.0;缓冲液D平衡阳离子层析介质,将洗脱液1上样,上样结束后,用缓冲液D进行再平衡,用缓冲液E进行洗脱,收集洗脱液2,将洗脱液2超滤冻干,得到纯化后的蛋白冻干品。
优选地,所述重组XVII型人源化胶原蛋白为表达XVII型胶原蛋白第15螺旋区的重组人源化胶原蛋白;更优选地,所述重组XVII型人源化胶原蛋白如权利要求1或2中所述,或者包括SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
本发明的有益效果:
(1)本发明首次实现了天然XVII型胶原蛋白第15螺旋区(命名1703NT,序列如SEQID NO.2所示)的毕赤酵母重组表达。
本发明针对天然胶原蛋白序列可能存在的易降解性质,对人XVII胶原蛋白的第15螺旋区序列1703NT进行了少数氨基酸残基的突变,命名1703MNT(序列如SEQ ID NO.6所示)。1703MNT明显降低天然蛋白在毕赤酵母表达时降解较多的状况,且经检测验证其基本理化性质未变、生物学活性并未降低(甚至更为优异)。
本发明的人XVII胶原蛋白的第15螺旋区应用于人体不会产生免疫排斥和过敏反应,具有达到乃至超过天然人胶原的细胞粘附活性、促细胞迁移活性等生物学活性,能达到真正产品应用的目的,可以广泛应用于医药、医疗器械、生物材料、组织工程、化妆品等领域。
(2)本发明以1703NT、1703MNT氨基酸序列为基础,进行DNA序列的密码子偏好性及其转录、翻译过程中相关优化参数进行计算、优化,合成更适宜于毕赤酵母中高效表达的DNA序列。本发明对1703NT、1703MNT的DNA序列进行修饰,分别于二者氨基端添加编码Strep-Tag II标签的DNA序列、羧基端添加编码6×His Tag标签的DNA序列,使其含有双特异性亲和纯化标记,这样可进行亲和层析纯化,也便于以两种标签序列为基础进行免疫学抗体检测,分别命名为1703(序列如SEQ ID NO.4所示)、1703M(序列如SEQ ID NO.8所示)。将编码1703、1703M、1703NT、1703MNT的外源DNA克隆入表达载体pPIC9K中,构建重组表达载体pPIC9K-1703、pPIC9K-1703M、pPIC9K-1703NT、pPIC9K-1703MNT。并进一步诱导表达,筛选表达量高的工程菌。
(3)本发明基于高密度规模化发酵生产需求(而非实验室研究阶段)建立了天然全长第15螺旋区于毕赤酵母中低降解的发酵表达、提取纯化的一整套方法和工艺流程,提高表达量的同时,极大降低天然全长第15螺旋区的降解,获得天然全长的第15螺旋区重组胶原蛋白。
本发明优化发酵培养基配方、发酵时最适的发酵pH、诱导初始菌浓度OD600、混合碳源流加使用的诱导培养基配方等条件,建立了一整套的发酵工艺。使表达重组XVII型人源化胶原蛋白1703巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)工程菌株(保藏编号CGMCC No.21888)胶原蛋白表达量从11g/L左右提高到17g/L左右,表达重组XVII型人源化胶原蛋白1703NT的巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)工程菌株(保藏编号CGMCC No.21889)能达到>15g/L。同时发酵过程中蛋白降解明显得到改善,尤其主要占优电泳条带(光密度最大)只有一条,之前分子量比较小、占比比较大(40%左右)的的主降解条带基本消失,说明此时的发酵条件起到了抑制重组胶原蛋白降解的作用,其效果与1703M这样改变氨基酸序列的突变体带来抗降解效果类似。
同时本发明中建立了两步纯化法,使用含酒石酸缓冲体系,方法简便、有效,经疏水层析、阳离子层析即可获得高纯度的重组XVII型人源化胶原蛋白1703、1703NT。纯化后的1703、1703NT冻干品,电泳检测均呈现单条带,经液相分析、测算(面积归一化法),单峰明显,纯度高,1703可达到94%,1703NT可达到95%。
本发明的发酵、纯化工艺适用于高密度生物反应器的发酵、纯化,已具备工业化广大生产的条件。
(3)本发明通过实验验证了重组表达的第15螺旋区的生物学活性,本发明得到的第15螺旋区重组胶原蛋白具有良好的粘附活性、促细胞迁移活性。
本发明中,对1703、1703NT冻干品进行了LC-MS检测,证明其分子量与理论预测值一致。对1703、1703NT高纯度冻干品进行N端、C端的测序验证以及基于LC-MS/MS的蛋白全序列分析,证明其N端、C端完整,1703、1703NT表达的氨基酸序列正确无误。对1703、1703M、1703NT、1703MNT高纯冻干品红外光谱扫描,其酰胺A、酰胺B、酰胺I、酰胺II、酰胺III的波数均符合重组胶原蛋白结构特征。
本发明中使用体外培养的NIH/3T3细胞进行1703、1703NT、1703M的细胞粘附和细胞迁移实验,实验表明1703、1703NT、1703M的细胞粘附活性显著优于商品化的天然人胶原蛋白,且1703、1703NT、1703M的细胞粘附活性无显著差异,说明进行氨基酸序列突变后的1703M并没有显著改变突变前序列的细胞粘附活性;1703、1703NT、1703M纯化冻干品的促细胞迁移活性显著优于天然人胶原蛋白,且1703M的促细胞迁移活性优于1703、1703NT。
附图说明
图1为1703、1703MNT、1703NT、1703MNT诱导表达24h后的菌液上清SDS-PAGE检测结果。
图2为1703、1703M诱导表达24h后的菌液上清的WB图,图中,左图为抗6×His Tag抗体的WB图,右图为抗Strep-Tag II抗体的WB图。
图3为1703诱导表达24h后的菌液上清SDS-PAGE检测结果中目的条带质谱分析结果。
图4为1703M诱导表达24h后的菌液上清SDS-PAGE检测结果中目的条带质谱分析结果。
图5为不同基础盐发酵培养基诱导表达48h后得到的发酵液上清的SDS-PAGE图。
图6为不同pH值条件下诱导表达48h后得到的发酵液上清的SDS-PAGE图。
图7为不同诱导初始OD600值诱导表达48h后得到的发酵液上清SDS-PAGE图。
图8为不同诱导培养基诱导表达48h后得到的发酵液上清SDS-PAGE图。
图9为1703发酵平行实验中诱导表达后得到的发酵液上清SDS-PAGE图。
图10为1703NT诱导表达后得到的发酵液上清SDS-PAGE图。
图11为纯化后1703(图a)、1703NT(图b)冻干品的HPLC图谱。
图12为纯化后1703(图a)、1703NT(图b)冻干品SDS-PAGE电泳图。
图13为纯化后的1703冻干样品的去卷积分子量。
图14为纯化后的1703NT冻干样品的去卷积分子量。
图15为纯化后的1703冻干样品C端肽段的二级质谱图。
图16为纯化后的1703NT冻干样品C端肽段的二级质谱图。
图17为纯化后的1703冻干样品的红外光谱扫描图。
图18为纯化后的1703NT冻干样品的红外光谱扫描图。
图19为纯化后的1703M冻干样品的红外光谱扫描图。
图20为纯化后的1703MNT冻干样品的红外光谱扫描图。
图21为本发明得到的1703、1703NT、1703M和天然人胶原蛋白、BSA的细胞粘附活性检测结果。
图22为本发明得到的1703、1703NT、1703M和天然人胶原蛋白、BSA的细胞迁移状态的实际对比图。
图23为NIH/3T3细胞培养24h、48h后1703、1703NT、1703M和天然人胶原蛋白、BSA的的细胞迁移率。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更好的理解本发明的技术方案,下面对本发明的较佳实施例进行详细的阐述,但是如下实施例并不限制本发明的保护范围。
本发明的实施例中,没有多作说明的都是采用常规实验方法完成,实施例中所涉及过程没有多作说明的都是本领域技术人员根据产品说明书或本领域基础知识可以理解并且容易实现的,因此不再详细描述。
实施例1:重组胶原蛋白氨基酸序列的设计、表达
(1)氨基酸序列的设计、DNA序列优化
选择人XVII胶原蛋白序列优化,具体序列参考:
Uniprot Q9UMD9-1序列(https://www.uniprot.org/uniprot/Q9UMD9),NCBI参照序列Q9UMD9.3(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/Q9UMD9.3),二者序列相同,如SEQ ID NO.1所示:
SEQ ID NO.1:
本发明中表达人XVII型胶原蛋白第15螺旋区,为SEQ ID NO.1中加粗有下划线部分即为选取的序列,将此种重组XVII型人源化胶原蛋白,即表达XVII型胶原蛋白第15螺旋区的重组人源化胶原蛋白命名为1703NT,共242个氨基酸,其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示:
GSPGPKGDMGSPGPKGDRGFPGTPGIPGPLGHPGPQGPKGQKGSVGDPGMEGPMGQRGREGPMGPRGEAGPPGSGEKGERGAAGEPGPHGPPGVPGSVGPKGSSGSPGPQGPPGPVGLQGLRGEVGLPGVKGDKGPMGPPGPKGDQGEKGPRGLTGEPGMRGLPGAVGEPGAKGAMGPAGPDGHQGPRGEQGLTGMPGIRGPPGPSGDPGKPGLTGPQGPQGLPGTPGRPGIKGEPGAPGKI
编码1703NT的DNA序列以毕赤酵母为宿主进行密码子优化,优化后的序列如SEQID NO.3所示:
GGTTCTCCTGGTCCAAAAGGAGATATGGGTTCACCCGGTCCCAAAGGAGATAGAGGATTCCCTGGTACTCCAGGTATCCCCGGTCCCCTGGGTCACCCTGGACCTCAAGGTCCTAAAGGTCAAAAGGGTTCTGTAGGAGATCCAGGTATGGAGGGTCCCATGGGTCAGAGAGGTAGAGAAGGTCCCATGGGACCAAGAGGTGAAGCTGGACCTCCCGGAAGTGGTGAAAAAGGAGAAAGAGGAGCAGCAGGAGAACCTGGACCCCATGGACCTCCAGGAGTTCCTGGATCAGTCGGACCCAAAGGTTCATCCGGTTCTCCTGGACCTCAAGGTCCACCAGGACCCGTCGGATTGCAAGGATTGAGAGGAGAAGTTGGACTTCCCGGAGTTAAGGGTGACAAGGGTCCTATGGGTCCTCCTGGTCCAAAGGGAGATCAGGGTGAAAAGGGTCCTAGAGGTCTGACTGGTGAACCAGGAATGAGAGGACTTCCCGGTGCCGTGGGTGAACCCGGTGCAAAAGGAGCAATGGGTCCTGCCGGTCCTGATGGACACCAGGGACCCAGAGGAGAGCAGGGATTAACAGGAATGCCTGGTATCAGAGGTCCCCCAGGTCCCTCAGGAGACCCAGGAAAGCCAGGACTTACTGGTCCCCAGGGTCCTCAAGGTCTGCCTGGAACTCCCGGAAGACCCGGAATCAAAGGTGAACCAGGAGCCCCAGGAAAAATC
于SEQ ID NO.2氨基端添加Strep-Tag II标签、羧基端添加6×His Tag标签,添加标签后的序列共260个氨基酸,将此种重组XVII型人源化胶原蛋白,即表达XVII型胶原蛋白第15螺旋区的重组人源化胶原蛋白命名为1703,其氨基酸序列(下划线部分为标签序列)如SEQ ID NO.4所示:
YVEFWSHPQFEKGSPGPKGDMGSPGPKGDRGFPGTPGIPGPLGHPGPQGPKGQKGSVGDPGMEGPMGQRGREGPMGPRGEAGPPGSGEKGERGAAGEPGPHGPPGVPGSVGPKGSSGSPGPQGPPGPVGLQGLRGEVGLPGVKGDKGPMGPPGPKGDQGEKGPRGLTGEPGMRGLPGAVGEPGAKGAMGPAGPDGHQGPRGEQGLTGMPGIRGPPGPSGDPGKPGLTGPQGPQGLPGTPGRPGIKGEPGAPGKIHHHHHH
1703对应的DNA序列如SEQ ID NO.5所示(下划线部分为标签对应的序列):
本发明中重组XVII型人源化胶原蛋白1703NT的突变体,将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列上第63位的M、第66位的R、第152位的R、第188位的R,均变为P,命名为1703MNT,突变后的序列共242个氨基酸,如SEQ ID NO.6所示:
GSPGPKGDMGSPGPKGDRGFPGTPGIPGPLGHPGPQGPKGQKGSVGDPGMEGPMGQRGREGPPGPPGEAGPPGSGEKGERGAAGEPGPHGPPGVPGSVGPKGSSGSPGPQGPPGPVGLQGLRGEVGLPGVKGDKGPMGPPGPKGDQGEKGPPGLTGEPGMRGLPGAVGEPGAKGAMGPAGPDGHQGPPGEQGLTGMPGIRGPPGPSGDPGKPGLTGPQGPQGLPGTPGRPGIKGEPGAPGKI
编码1703MNT的DNA序列如SEQ ID NO.7所示:
GGTTCTCCAGGTCCTAAAGGAGATATGGGTTCTCCAGGACCAAAGGGAGATAGAGGTTTTCCAGGTACTCCTGGTATTCCAGGTCCTTTGGGTCATCCAGGTCCTCAAGGTCCAAAGGGTCAAAAAGGTTCTGTTGGAGATCCAGGAATGGAAGGTCCAATGGGTCAAAGAGGTAGAGAAGGTCCACCTGGTCCACCTGGAGAAGCTGGTCCACCTGGTTCTGGTGAAAAGGGAGAGAGAGGTGCTGCTGGAGAGCCAGGTCCTCACGGTCCACCTGGTGTTCCTGGTTCTGTTGGTCCAAAAGGTTCTTCTGGTTCTCCAGGACCACAAGGTCCACCTGGTCCAGTTGGTTTGCAAGGTTTGAGAGGTGAAGTTGGTTTGCCAGGTGTTAAGGGAGATAAAGGTCCTATGGGTCCACCTGGTCCAAAGGGAGATCAAGGTGAAAAAGGTCCACCTGGTTTGACTGGAGAGCCTGGTATGAGAGGTTTGCCAGGTGCTGTTGGTGAACCTGGTGCTAAGGGTGCTATGGGTCCAGCTGGTCCTGATGGTCATCAAGGTCCACCTGGAGAGCAAGGTTTGACTGGTATGCCAGGTATTAGAGGTCCACCTGGACCTTCTGGAGATCCAGGTAAACCTGGTTTGACTGGTCCACAAGGTCCTCAAGGTTTGCCAGGTACTCCTGGTAGACCAGGTATTAAGGGAGAGCCTGGTGCTCCAGGTAAAATT
SEQ ID NO.6氨基端添加Strep-Tag II标签、羧基端添加6×His Tag标签,为1703的变体,命名为1703M,其氨基酸序列共260个氨基酸(下划线部分为标签序列),如SEQ IDNO.8所示:
YVEFWSHPQFEKGSPGPKGDMGSPGPKGDRGFPGTPGIPGPLGHPGPQGPKGQKGSVGDPGMEGPMGQRGREGPPGPPGEAGPPGSGEKGERGAAGEPGPHGPPGVPGSVGPKGSSGSPGPQGPPGPVGLQGLRGEVGLPGVKGDKGPMGPPGPKGDQGEKGPPGLTGEPGMRGLPGAVGEPGAKGAMGPAGPDGHQGPPGEQGLTGMPGIRGPPGPSGDPGKPGLTGPQGPQGLPGTPGRPGIKGEPGAPGKIHHHHHH
1703M对应的DNA序列如SEQ ID NO.9(下划线部分为标签对应的序列)如下:
TACGTAGaattcTGGTCACATCCACAATTTGAGAAGGGTTCTCCAGGTCCTAAAGGAGATATGGGTTCTCCAGGACCAAAGGGAGATAGAGGTTTTCCAGGTACTCCTGGTATTCCAGGTCCTTTGGGTCATCCAGGTCCTCAAGGTCCAAAGGGTCAAAAAGGTTCTGTTGGAGATCCAGGAATGGAAGGTCCAATGGGTCAAAGAGGTAGAGAAGGTCCACCTGGTCCACCTGGAGAAGCTGGTCCACCTGGTTCTGGTGAAAAGGGAGAGAGAGGTGCTGCTGGAGAGCCAGGTCCTCACGGTCCACCTGGTGTTCCTGGTTCTGTTGGTCCAAAAGGTTCTTCTGGTTCTCCAGGACCACAAGGTCCACCTGGTCCAGTTGGTTTGCAAGGTTTGAGAGGTGAAGTTGGTTTGCCAGGTGTTAAGGGAGATAAAGGTCCTATGGGTCCACCTGGTCCAAAGGGAGATCAAGGTGAAAAAGGTCCACCTGGTTTGACTGGAGAGCCTGGTATGAGAGGTTTGCCAGGTGCTGTTGGTGAACCTGGTGCTAAGGGTGCTATGGGTCCAGCTGGTCCTGATGGTCATCAAGGTCCACCTGGAGAGCAAGGTTTGACTGGTATGCCAGGTATTAGAGGTCCACCTGGACCTTCTGGAGATCCAGGTAAACCTGGTTTGACTGGTCCACAAGGTCCTCAAGGTTTGCCAGGTACTCCTGGTAGACCAGGTATTAAGGGAGAGCCTGGTGCTCCAGGTAAAATTCATCATCACCATCATCAC
(2)DNA序列的合成与重组表达载体的构建
以发明人已授权的专利CN113185604B中表达载体pPIC9K-col17a1为模板设计引物P1、P2,扩增XVII型胶原的第15螺旋区序列,PCR产物纯化后以EcoRI和NotI进行双酶切,酶切结束后割胶回收目的条带。质粒pPIC9K经EcoRI和NotI双酶切,柱回收酶切后的质粒。酶切回收的目的片段和质粒以3:1分子量混合,使用Takara公司的DNA Ligation Kit进行连接,连接产物转化DH5α,过夜长出的转化子以通用引物5’AOX、3’AOX为引物进行菌落PCR,阳性克隆随机挑选5个转化子提质粒送样测序,结果符合预期,该质粒命名为pPIC9K-1703。
P1序列如SEQ ID NO.10所示:
(EcoRI)
cgGAATTCTGGAGTCATCCTCAATTCGAAAAAGGTTCTCCTGGTCCAAAAGGAGA
P2序列如SEQ ID NO.11所示:
ATAGTTTAGCGGCCGCTTAGTGATGATGGTGATGGTGGATTTTTCCTGGGGCTCCTGGT(NotI)
5'AOX序列如SEQ ID NO.12所示:5’-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’
3'AOX序列如SEQ ID NO.13所示:5’-GGCAAATGGCATTCTGACAT-3’
委托南京金斯瑞生物科技股分有限公司将SEQ ID NO.9合成后,克隆至pPIC9K的EcoRI和NotI酶切位点,获得表达质粒pPIC9K-1703M。委托南京金斯瑞生物科技股分有限公司构建去除1703和1703M两端标签DNA序列的亚克隆,克隆位点为pPIC9K的EcoRI和NotI,获得表达质粒pPIC9K-1703NT和pPIC9K-1703MNT。
(3)重组工程菌株的构建、菌种筛选
分别将上述重组表达载体质粒(pPIC9K-1703、pPIC9K-1703NT、pPIC9K-1703MNT和pPIC9K-1703M)10μg用SacⅠ(购自大连TaKaRa公司,具体操作按试剂盒说明书进行)37℃酶切消化过夜,使其线性化,再使用PCR产物纯化试剂盒(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)回收线性化质粒,使体积控制在10μL左右。
将线性化质粒电转化入空宿主菌种毕赤酵母GS115(购自中国工业微生物菌种保藏管理中心)感受态细胞中,将电转后的菌液涂布于MD平板上,每100μL~200μL涂布一块平板,室温静置10min,于30℃倒置培养2-5天,直至有单菌落(阳性转化子)出现。
向MD平板表面加入2mL无菌双蒸水,然后用无菌三角涂布器轻轻刮下平板表面的His+转化子,并转移到50mL离心管中。以无菌双蒸水稀释菌悬液,105个细胞涂布于含有0.5mg/mLG418的YPD平板上,倒置,30℃培养3~4d后至单菌落出现。从YPD平板上挑取菌落至无菌96孔板中(200μL YPD/孔),混匀,于30℃培养48h;混匀孔中菌液,各取10μL接入至一块新的无菌96孔板,于30℃培养24h后再重复一次此操作;24h后,从第三块96孔板中取出1μL分别点在含有1.0mg/mL和4mg/mL G418的YPD平板上,于30℃继续培养96h~120h。毕赤酵母转化子若能在含高浓度G418的平板上生长,说明该转化子含有多拷贝的目的基因,即有多个重组片段进入了酵母体内并通过同源重组整合到酵母的染色体上。经过这一步筛选可得到的高拷贝、可高效表达的重组酵母工程菌种。
构建的4种工程菌样本均送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,菌种保藏编号分别对应的是:
表达蛋白1703M的菌株,保藏编号为:CGMCC No.21884;
表达蛋白1703的菌株,保藏编号为:CGMCC No.21888;
表达蛋白1703NT的菌株,保藏编号为:CGMCC No.21889;
表达蛋白1703MNT的菌株,保藏编号为:CGMCC No.21890。
保藏地址均为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号;保藏日期均为:2021年3月11日。分类命名均为:巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris。
(4)诱导表达与重组胶原蛋白的鉴定
分别挑选单菌落,置于装有10mL BMGY培养基的100mL三角瓶中,于28-30℃、220rpm培养至OD600为2~6(16-18h)。室温下1500~3000g离心5min,收集菌体,用BMMY培养基重悬菌体,使OD600为2左右,放置于28-30℃、220rpm的摇床上继续生长3天,每24h向培养基中添加100%甲醇至终浓度为1.0%。按时间点(开始诱导后每24小时取样一次)分别取菌液样品,取样量为1mL,置于1.5mL EP管中,最大转速离心2~3min,收集上清,加入5×上样缓冲液(250mM Tris-HCl、pH6.8,10%SDS,0.5%溴酚蓝,50%甘油,5%β-巯基乙醇),置于100℃金属浴加热10min,进行SDS-PAGE检测。因1703、1703M氨基端有Srtep-TagⅡ标签,羧基端有6×His标签,可以抗Srtep-TagⅡ、抗6×His Tag的抗体(购自南京金斯瑞生物科技股份有限公司)进行Western Blot检测(具体操作参看说明书进行)。
如图1所示,1703、1703M可高效分泌表达于胞外的培养上清中,1703、1703M的理论分子量分别为24968.16Da、24756.88Da;1703NT、1703MNT的理论分子量分别为22566.54Da、22355.26Da,表观分子量约为32kDa。从电泳图可以看到:
(1)1703、1703NT泳道中主要有两条主要的条带(光密度度值最大的),符合表观分子量预期大小的,分子量较大的为全长条带(使用Image Lab软件测算,占比为41.5%),仅次于全长条带、分子量比较小的为主降解条带且占比较大(用Image Lab软件测算,占比为40.2%),二者比例接近;
(2)1703M降解条带明显少于1703、1703MNT降解条带明显少于1703NT,1703、1703NT泳道中占比量约40%的主降解条带基本消失,说明本发明进行的氨基酸突变可以达到减少氨基酸序列降解的目的。
从图2(ECL化学发光显色,全自动化学发光图像分析系统Tanon 5200将蛋白质分子质量标准合成于图像)中可以看到,1703和1703M的氨基端Srtep-TagⅡ标签,羧基端6×His标签均可检测到,最大条带均与SDS-PAGE中表观分子量大小相同,以抗His抗体检测时1703M条带明显少于1703,和SDS-PAGE结果一致。
图1和图2可以看出,修改氨基酸序列后的变体1703M更稳定,蛋白降解得到了缓解。
将1703、1703M在SDS-PAGE上的预期条带切割下来,用胰蛋白酶将其酶解,Nano-HPLC-MS/MS质谱检测重组胶原的胰蛋白酶解后肽段(交由苏州普泰生物技术有限公司完成),并将检测到肽段进行序列比对(Uniprot数据库)。结果如图3和图4所示:1703、1703M被酶解后检测到的肽段均属于氨基酸序列选取设计时选择人XVII胶原蛋白序列的相关区域,说明本发明的胶原蛋白成功表达。
实施例2.提高人源化胶原蛋白生产水平同时低降解发酵工艺
在本发明的具体实施例中,采用的菌株为表达蛋白1703、1703NT的巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris,保藏编号为1703:CGMCC No.21888、1703NT:CGMCC No.21889,保藏日期为2021年03月11日,保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
常规通用的培养基及溶液配方成份如下所示,无如特殊标注,后文中只写简称,不再详述配方;如无特殊标注生产厂家、试剂级别,配方中各组份为国产分析纯或化学纯即可。
YPG培养基:酵母提取物10g/L、蛋白栋20g/L、无水甘油10g/L。
PTM1:CuSO4·5H2O 6g/L、MnSO4·H2O 3g/L、NaCI 0.08g/L、Na2MoO4·2H2O 0.2g/L、H3BO3 0.02g/L、CoCl2·6H2O 0.5g/L、ZnCl2 20g/L、FeSO4·7H2O 65g/L、生物素(USP Grade级)0.2g/L、浓H2SO4 5mL/L,用0.22μm的无菌滤膜过滤除菌,4℃保存。
碱液配方:浓氨水300ml,加入无菌纯化水700ml,混均。
UV法蛋白定量公式:C(mg/mL)=(A215-A225)*0.144。
(1)发酵培养基配方优化
经典的BSM培养基配方(Invitrogen公司)中含有85%H3PO4、KOH,实际生产中不便于操作,本发明针对所表达的蛋白种类进行了基础培养基配方的摸索、优化,确定了专属的基础盐制备的发酵培养基。菌株为表达蛋白1703的巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)工程菌株,保藏编号为CGMCC No.21888。
本部分1#~4#发酵罐使用的通用培养基:(1)种子培养基,YPG;(2)诱导培养基:纯甲醇,每升加入12mL PTM1;(3)补料培养基:50%W/V甘油,高压湿热灭菌,无菌溶液中每升加12mL PTM1。
1#发酵罐:使用发酵培养基A,配方:NH4H2PO4 47.6g/L、KH2PO4 10.06g/L、CaSO4·2H2O 1.18g/L、K2SO4 18.2g/L、MgSO4·7H2O 14.9g/L、甘油20g/L、PTM1 0.45mL/L。除去PTM1以外成份配制后经高温湿热灭菌,待温度降至室温加入PTM1,用氨水调节pH至5.0。
2#发酵罐:使用发酵培养基B,配方:NH4H2PO4 35.7g/L、KH2PO4 7.545g/L、CaSO4·2H2O 0.885g/L、K2SO4 13.65g/L、MgSO4·7H2O 11.175g/L、甘油20g/L、PTM1 0.45mL/L。除去PTM1以外成份配制后经高温湿热灭菌,待温度降至室温加入PTM1,用氨水调节pH至5.0。
3#发酵罐:使用发酵培养基C,配方:NH4H2PO4 23.8g/L、KH2PO4 5.03g/L、CaSO4·2H2O 0.59g/L、K2SO4 9.1g/L、MgSO4·7H2O 7.45g/L、甘油20g/L、PTM1 0.45mL/L。除去PTM1以外成份配制后经高温湿热灭菌,待温度降至室温加入PTM1,用氨水调节pH至5.0。
4#发酵罐:使用发酵培养基D,配方:NH4H2PO4 11.9g/L、KH2PO4 2.515g/L、CaSO4·2H2O 0.295g/L、K2SO4 4.55g/L、MgSO4·7H2O 3.725g/L、甘油20g/L、PTM1 0.45mL/L。除去PTM1以外成份配制后经高温湿热灭菌,待温度降至室温加入PTM1,用氨水调节pH至5.0。
1#~4#发酵罐发酵过程均控制一致:将菌种接于种子培养基YPG中,30℃、220rpm培养过夜制备菌种液。设置发酵温度30℃,pH5.0。将菌种液按10%接种量分别加到含有3L发酵培养基的5L发酵罐(保兴生物)中,调节搅拌转速为300r/min-700r/min,空气通量为2VVM,罐压为0-0.05MPa,DO≥于30%,培养至碳源耗尽,DO快速回升,开始流加补料培养基,至菌OD600=150,湿重200g/L,停止流加补料培养基。等甘油耗尽DO≥70%后开始流加诱导培养基,进入甲醇诱导阶段,调节转速、通气量、罐压和流加速度使DO≥30%。每4h取样,测定OD600,湿重和UV蛋白含量。诱导48h后,结束发酵,放罐收集发酵液7000rpm离心20分钟,取发酵液上清,检测UV蛋白含量、进行SDS-PAGE电泳。
经UV检测,发酵液上清中最终重组胶原蛋白浓度:1#,9.99g/L;2#,10.17g/L;3#,10.75g/L;4#,11.30g/L。发酵液上清的SDS-PAGE电泳图,如图5所示。重组胶原蛋白浓度结合SDS-PAGE电泳图可知,发酵培养基D表达量较高,故选择发酵培养基D作为发酵培养基。但通过SDS-PAGE电泳图可以看到,各泳道中,主要有两条主要的条带(光密度度值最大的),分子量较大的为全长条带(占比40%左右)分子量比较小的为降解条带,且占比较大(40%左右)。单纯培养基的优化可以获得较高的产量,但仍有出现蛋白降解的情况,所以后续工艺优化会在这个基础上继续进行。
(2)发酵pH工艺优化,减少发酵时重组胶原蛋白的降解
本部分1#~4#发酵罐使用的通用培养基:(1)种子培养基,YPG;(2)诱导培养基:纯甲醇,每升加入12mL PTM1;(3)补料培养基:50%W/V甘油,高压湿热灭菌,无菌溶液中每升加12mL PTM1;(4)发酵培养基,发酵培养基D:NH4H2PO4 11.9g/L、KH2PO4 2.515g/L、CaSO4·2H2O 0.295g/L、K2SO4 4.55g/L、MgSO4·7H2O 3.725g/L、甘油20g/L、PTM1 0.45mL/L。菌株为表达重组胶原蛋白1703巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)工程菌株,保藏编号为CGMCCNo.21888。
1#发酵罐:使用发酵培养基D,除去PTM1以外成份配制后经高温湿热灭菌,待温度降至室温加入PTM1,用氨水调节pH至6.0。设置发酵温度30℃,pH6.0。
2#发酵罐:使用发酵培养基D,除去PTM1以外成份配制后经高温湿热灭菌,待温度降至室温加入PTM1,用氨水调节pH至5.0。设置发酵温度30℃,pH 5.0。
3#发酵罐:使用发酵培养基D,除去PTM1以外成份配制后经高温湿热灭菌,待温度降至室温加入PTM1,用氨水调节pH至4.0。设置发酵温度30℃,pH4.0。
4#发酵罐:使用发酵培养基D,除去PTM1以外成份配制后经高温湿热灭菌,待温度降至室温加入PTM1,用氨水调节pH至3.5。设置发酵温度30℃,pH 3.5。
1#~4#发酵罐发酵过程均控制基本一致:将菌种接于种子培养基YPG中,30℃、220rpm培养过夜制备菌种液。设置发酵温度30℃(1#~4#发酵罐设置pH值不同)。将菌种液按10%接种量加到含有3L发酵培养基D(1#~4#发酵罐中培养基pH值不同)的5L发酵罐(保兴生物)中,调节搅拌转速为300r/min-700r/min,空气通量为2VVM,罐压为0-0.05MPa,DO≥于30%,培养至碳源耗尽,DO快速回升,开始流加补料培养基,至菌OD600=150,湿重200g/L,停止流加补料培养基。等甘油耗尽DO≥70%后开始流加诱导培养基,进入甲醇诱导阶段,调节转速、通气量、罐压和流加速度使DO≥30%。每4h取样,测定OD600、湿重和UV蛋白含量。诱导48h后,结束发酵,放罐收集发酵液7000rpm离心20分钟,取发酵液上清,检测UV蛋白含量、进行SDS-PAGE电泳。
经UV检测,发酵液上清中最终重组胶原蛋白浓度:1#,9.70g/L;2#,12.00g/L;3#,12.50g/L;4#,9.50g/L。发酵液上清的SDS-PAGE电泳图,如图6所示。3#发酵罐发酵时保持pH4.0能有效减少目的蛋白降解,同时UV检测蛋白含量最高,说明发酵时pH4.0是最适的发酵pH。同时,可以发现3#发酵罐的电泳图泳道中,主要的电泳条带(光密度最大)只有一条,之前分子量比较小、占比大的的主降解条带基本消失,说明此时的发酵条件优化起到了抑制重组胶原蛋白降解的作用。
(3)诱导起始OD600值工艺优化
诱导起始的菌浓度值OD600直接影响后续蛋白最终表达量。
本部分1#~3#发酵罐使用的通用培养基:(1)种子培养基,YPG;(2)诱导培养基:纯甲醇,每升加入12mL PTM1;(3)补料培养基:50%W/V甘油,高压湿热灭菌,无菌溶液中每升加12mL PTM1;(4)发酵培养基,发酵母培养基D:NH4H2PO4 11.9g/L、KH2PO4 2.515g/L、CaSO4·2H2O 0.295g/L、K2SO4 4.55g/L、MgSO4·7H2O 3.725g/L、甘油20g/L、PTM1 0.45mL/L,除去PTM1以外成份配制后经高温湿热灭菌,待温度降至室温加入PTM1,用氨水调节pH至4.0。设置发酵温度30℃,pH 4.0。菌株为表达蛋白1703巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)工程菌株,保藏编号为CGMCC No.21888。
1#发酵罐:设置发酵温度30℃,pH4.0。将菌种液按10%接种量加到含有3L发酵培养基D的5L发酵罐(保兴生物)中,调节搅拌转速为300r/min-700r/min,空气通量为2VVM,罐压为0-0.05MPa,DO≥于30%,培养至碳源耗尽,DO快速回升,开始流加补料培养基,至菌诱导起始OD600=50(湿重74g/L),停止流加补料培养基。等甘油耗尽DO≥70%后开始流加诱导培养基,进入甲醇诱导阶段,调节转速、通气量、罐压和流加速度使DO≥30%。每4h取样,测定OD600、湿重和UV蛋白含量。诱导48h后,结束发酵,放罐收集发酵液7000rpm离心20分钟,取发酵液上清,检测UV蛋白含量、进行SDS-PAGE电泳。
2#发酵罐:设置发酵温度30℃,pH4.0。将菌种液按10%接种量加到含有3L发酵培养基D的5L发酵罐(保兴生物)中,调节搅拌转速为300r/min-700r/min,空气通量为2VVM罐压为0-0.05MPa,DO≥于30%,培养至碳源耗尽,DO快速回升,开始流加补料培养基,至菌诱导起始OD600=100(湿重121g/L),停止流加补料培养基。等甘油耗尽DO≥70%后开始流加诱导培养基,进入甲醇诱导阶段,调节转速、通气量、罐压和流加速度使DO≥30%。每4h取样,测定OD600、湿重和UV蛋白含量。诱导48h后,结束发酵,放罐收集发酵液7000rpm离心20分钟,取发酵液上清,检测UV蛋白含量、进行SDS-PAGE电泳。
3#发酵罐:设置发酵温度30℃,PH4.0。将菌种液按10%接种量加到含有发酵培养基D的5L发酵罐(保兴生物)中,调节搅拌转速为300r/min-700r/min,空气通量为2VVM,罐压为0-0.05MPa,DO≥于30%,培养至碳源耗尽,DO快速回升,开始流加补料培养基,至菌诱导起始OD600=150(湿重203g/L),停止流加补料培养基。等甘油耗尽DO≥70%后开始流加诱导培养基,进入甲醇诱导阶段,调节转速、通气量、罐压和流加速度使DO≥30%。每4h取样,测定OD600、湿重和UV蛋白含量。诱导48h后,结束发酵,放罐收集发酵液7000rpm离心20分钟,取发酵液上清,检测UV蛋白含量、进行SDS-PAGE电泳。
经UV检测,发酵液上清中最终重组胶原蛋白浓度:1#,14.60g/L;2#,13.00g/L;3#,12.30g/L。发酵液上清的SDS-PAGE电泳图,如图7所示,电泳图泳道中,主要的电泳条带(光密度最大)只有一条,1#发酵罐发酵诱导初始OD600=50蛋白表达量明显高于OD600=100和OD600=150,OD600=50作为诱导初始OD600最优。
(4)混合碳源流加,诱导培养基的优化
诱导培养基中甲醇可有效诱导重组胶原蛋白的表达,但完全使用甲醇作为诱导培养基的主要成份为毕赤酵母提供碳源可能会抑制细胞的生长状态,适量的添加一定量的甘油或其它碳源反而可有效促进发酵时重组胶原蛋白的表达。本部分对诱导培养基成份进行优化,进行混合碳源流加调节。菌株为表达蛋白1703巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)工程菌株,保藏编号为CGMCC No.21888。
本部分1#~4#发酵罐使用的通用培养基:(1)种子培养基,YPG;(2)补料培养基:50%W/V甘油,高压湿热灭菌,无菌溶液中每升加12mL PTM1;(3)发酵培养基,发酵母培养基D:NH4H2PO4 11.9g/L、KH2PO4 2.515g/L、CaSO4·2H2O 0.295g/L、K2SO4 4.55g/L、MgSO4·7H2O3.725g/L、甘油20g/L、PTM1 0.45mL/L,除去PTM1以外成份配制后经高温湿热灭菌,待温度降至室温加入PTM1,用氨水调节PH至4.0。
1#发酵罐,使用诱导培养基A,纯甲醇:50%甘油(无菌)=7:3,每升加入12mLPTM1。
2#发酵罐,使用诱导培养基B,纯甲醇:50%甘油(无菌)=9:1,每升加入12mLPTM1。
3#发酵罐,使用诱导培养基C,纯甲醇:50%甘油(无菌)=8:2,每升加入12mLPTM1。
4#发酵罐,使用诱导培养基D,纯甲醇:50%甘油(无菌)=10:0,每升加入12mLPTM1。
1#~4#发酵罐发酵过程均控制基本一致:将菌种接于种子培养基YPG中,30℃、220rpm培养过夜制备菌种液。设置发酵温度30℃,pH4.0。将菌种液按10%接种量加到含有发酵培养基D的5L发酵罐(保兴生物)中,调节搅拌转速为300r/min-700r/min,空气通量为2VVM,罐压为0-0.05MPa,DO≥于30%,培养至碳源耗尽,DO快速回升,开始流加补料培养基,至菌OD600=50,湿重74g/L,停止流加补料培养基。等甘油耗尽DO≥70%后开始流加诱导培养基(1#~4#发酵罐诱导培养基不同),进入甲醇诱导阶段,调节转速、通气量、罐压和流加速度使DO≥30%。每4h取样,测定OD600、湿重和UV蛋白含量。诱导48h后,结束发酵,放罐收集发酵液7000rpm离心20分钟,取发酵液上清,检测UV蛋白含量、进行SDS-PAGE电泳。
经UV检测,发酵液上清中最终重组胶原蛋白浓度:1#,12.30g/L;2#,15.90g/L;3#,16.70g/L;4#,14.30g/L。发酵液上清的SDS-PAGE电泳图,如图8所示,电泳图泳道中,主要的电泳条带(光密度最大)只有一条。3#发酵罐诱导培养基为纯甲醇:50%甘油=8:2时,蛋白表达量最高。
(5)优化发酵工艺的验证
经过优化稳定后的发酵工艺是一整套的工艺,其中几个关键点:
a.使用的发酵培养基,为发酵培养基D:NH4H2PO4 11.9g/L、KH2PO4 2.515g/L、CaSO4·2H2O 0.295g/L、K2SO4 4.55g/L、MgSO4·7H2O 3.725g/L、甘油20g/L、PTM1 0.45mL/L,除去PTM1以外成份配制后经高温湿热灭菌,待温度降至室温加入PTM1,用氨水调节PH至4.0;
b.发酵时pH4.0是最适的发酵pH;
c.诱导初始菌浓度OD600=50;
d.混合碳源流加使用的诱导培养基,为诱导培养基C:纯甲醇:50%甘油(无菌)=8:2,每升加入12mL PTM1;
其余为通用培养基:种子培养基(YPG)、补料培养基(50%W/V甘油,高压湿热灭菌,无菌溶液中每升加12mL PTM1)。
发酵过程如下:将菌种接于种子培养基YPG中,30℃、220rpm培养过夜制备菌种液。设置发酵温度30℃,pH4.0。将菌种液按10%接种量加到含有发酵培养基的5L发酵罐(保兴生物)中,调节搅拌转速为300r/min-700r/min,空气通量为2VVM,罐压为0-0.05MPa,DO≥于30%,培养至碳源耗尽,DO快速回升,开始流加补料培养基,至菌OD600=50,湿重74g/L,停止流加补料培养基。等甘油耗尽DO≥70%后开始流加诱导培养基,进入甲醇诱导阶段,调节转速、通气量、罐压和流加速度使DO≥30%。每4h取样,测定OD600、湿重和UV蛋白含量。诱导48h后,结束发酵,放罐收集发酵液7000rpm离心20分钟,取发酵液上清,检测UV蛋白含量、进行SDS-PAGE电泳。
按以上发酵条件,使用表达蛋白1703巴斯德毕赤酵母工程菌株(保藏编号CGMCCNo.21888)进行了多批次发酵罐平行实验,发酵结束时,相关参数无明显差别,蛋白表达量稳定于>16g/L,同时达到重组胶原蛋白低降解的目标,可见下表1及图9。
表1.按该部分中发酵条件多批次发酵罐平行实验结果
发酵罐 | 补料总体积(mL) | OD600 | 湿重(g/L) | 胶原蛋白量(g/L) |
1# | 368 | 16 | 212 | 16.3 |
2# | 375 | 192 | 222 | 16.2 |
3# | 381 | 186 | 229 | 17.2 |
4# | 388 | 181 | 227 | 16 |
同时,同样的发酵工艺,也可应用于表达蛋白1703NT巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)工程菌株(菌株保藏编号CGMCC No.21889)的发酵表达中,其降解条带更少,蛋白表达量也稳定于>15g/L,结果如图10所示。
经过一系列发酵工艺优化,表达蛋白1703巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)工程菌株(保藏编号CGMCC No.21888)在5L罐中胶原蛋白表达量从11g/L左右提高到17g/L左右,表达蛋白1703NT的巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)工程菌株(保藏编号CGMCCNo.21889)能达到>15g/L。同时发酵过程中蛋白降解明显得到改善,尤其主要占优电泳条带(光密度最大)只有一条,之前分子量比较小、占比比较大(40%左右)的主降解条带基本消失,说明此时的发酵条件起到了抑制重组胶原蛋白降解的作用,其效果与1703M这样改变氨基酸序列的突变体带来抗降解效果类似。
实施例3.获得高纯度蛋白的纯化工艺建立
蛋白1703、1703NT在氨基酸序列的差别只有N端、C端的标签序列,作为主体部分的重组人源化胶原蛋白氨基酸序列是完全相同的,本发明开发了两步纯化法,不使用亲和层析(标签序列可结合相应的亲和层析介质),即可获得高纯度的蛋白1703、1703NT。
(1)疏水层析
所述各缓冲液用去离子水配制:
缓冲液A包括:20mM KH2PO4,2M硫酸铵,pH5.0;缓冲液B包括:20mM KH2PO4,0.6M硫酸铵,pH5.0;缓冲液C包括:20mM KH2PO4,pH5.0。
收集发酵液,使用离心机(赛默飞科技公司,Lynx 6000)分离菌泥和上清液,上清液中加入20mM的磷酸二氢钾,2M的硫酸铵,充分溶解,将上清液的pH调至5.0后过滤,滤膜(上海兴亚净化材料厂)为0.45μm。设置30mL/min的流速进行缓冲液A(0.45μm滤膜过滤)平衡疏水层析介质(柱管:利穗科技有限公司,XK50/30。疏水填料:思拓凡生物工程科技有限公司,Capto Phenyl,装载于思拓凡生物工程科技有限公司,AKTA pure 150M)至A215吸光值降到30Mau且电导率保持在192ms/cm左右,设置20mL/min的流速上样,上样体积为300mL/次,上样结束后,设置30mL/min的流速,用缓冲液A进行再平衡,直至A215吸光值降至30Mau且电导率保持在192ms/cm左右,在流速不变的情况下,缓冲液B进行洗杂(0.45μm滤膜过滤),直至A215吸光值降至30Mau后,设置缓冲液C进行洗脱,当A215吸收值上升时打开收样伐,开始收集洗脱液1,直至A215吸收值降至50Mau后,停止收集。洗脱液1放置在4摄氏度的冰箱中待用。
(2)阳离子层析
所述各缓冲液用去离子水配制:
缓冲液D包括:20mM酒石酸,100mM氯化钠,pH4.0;缓冲液E包括:20mM酒石酸,500mM氯化钠,pH4.0。
设置30mL/min的流速进行缓冲液D(0.45μm滤膜过滤)平衡阳离子层析介质(柱管:利穗科技有限公司,XK50/30。阳离子填料:思拓凡生物工程科技有限公司,SP SepharoseFast Flow,装载于思拓凡生物工程科技有限公司,AKTA pure 150M)至A215吸光值降到30Mau且电导率保持在11ms/cm左右。取出洗脱液1,并且调节pH至4.0,设置20mL/min的流速将洗脱液1上样,上样结束后,设置30mL/min的流速,用缓冲液D进行再平衡,直至A215吸收值下降至30Mau且电导率保持在11ms/cm左右,在流速不变的情况下,缓冲液E进行洗脱,当A215吸收值上升时,打开收样阀,开始收集洗脱液2,直至A215吸收值下降至100Mau后,停止收集。将洗脱液2超滤冻干(超滤设备:思拓凡生物工程科技有限公司,AKTA Flux),最终收集冻干品。
取1703、1703NT冻干品用超纯水溶解至2mg/mL,均0.22μm滤膜过滤,进样10μL(Sepax Bio-C18色谱柱,高效液相色谱仪为Waters2695或Agilent LC1260),分析纯度。
取1703、1703NT冻干品用超纯水溶解至1mg/mL,均0.22μm滤膜过滤,进样5μL,SDS-PAGE电泳检测。
纯化结果如图11所示,纯化后的1703(图11a)、1703NT(图11b)冻干品,经液相分析、测算(面积归一化法),单峰明显,纯度高,1703可达到94%,1703NT可达到95%。图12中电泳图纯化后的1703(图12a)、1703NT(图12b)冻干品均呈现单条带。
综上,本发明开发了两步纯化法,使用含酒石酸缓冲体系,方法简便、有效,经疏水层析、阳离子层析即可获得高纯度的蛋白1703、1703NT。
实施例4.重组XVII型人源化胶原蛋白1703、1703NT性质表征与生物学活性检测
(1)分子量检测
蛋白1703的理论预测的分子量为24968.16Da、蛋白1703NT的理论预测的分子量22566.54Da。对1703、1703NT高纯度冻干品进行LC-MS分析(毛细管高效液相色谱仪ThermoFisher Scientific Ultimate 3000、电喷雾-四极杆飞行时间质谱仪质谱仪AB SCIEXTripleTOF 5600Mass Spectrometer,色谱柱ACQUITY UPLC Protein BEH C4Column)获取其去卷积分子量,委托北京百泰派克生物科技有限公司完成检测。如图13所示,1703的分子量主要为24967.82Da,和理论分子量(24967.81Da)基本一致;如图14所示,1703NT的分子量主要为22566.12Da,与理论分子量(22566.22Da)基本一致。(2)N端、C端测序、全序列测序验证
委托北京百泰派克生物科技有限公司对1703、1703NT高纯度冻干品进行N端、C端的测序验证以及基于LC-MS/MS的蛋白全序列分析。
N端测序通过岛津全自动蛋白质多肽测序仪(PPSQ-33A)对样品的N端序列进行分析(Edman降解法):取适量1703、1703NT冻干品样品溶解,将样品溶液滴在PVDF膜上,放置到反应器中,组装好反应器后将其放置于仪器固定位置,通过软件PPSQ-30Analysis设置:样品名称、样品号、测试循环数、选择方法文件,设置完成后开始测试,PPSQ-33A产生的原始数据及图谱由PPSQ-30DataProcessing软件识别标峰并导出对应图谱,数据分析后,确定蛋白质N端序列。检测到1703NT冻干品样品的N端序列为:NH2-Tyr-Val-Glu-Phe-Trp-Ser-His-Pro-Glu-Phe-Glu-Lys-Gly-Ser-Pro,即YVEFWSHPQFEKGSP,与理论N-端氨基酸序列(YVEFWSHPQFEKGSP)一致。检测到1703NT冻干品样品的N端序列为:NH2-Gly-Ser-Pro-Gly-Pro-Lys-Gly-Asp-Met-Gly,即:GSPGPKGDMG,与理论N-端氨基酸序列(GSPGPKGDMG)一致。
C端测序:取适量1703、1703NT高纯度冻干品进行胰蛋白酶(Trypsin)、胃蛋白酶(Pepsin)酶解处理,之后将处理好的样品通过液质联用(LC-MS/MS)分析,得到质谱原始结果的raw文件,经过软件Byonic分析,匹配数据,得到鉴定结果。质谱数据经过数据库检索,检测1703冻干品样品C端肽段的二级质谱图如图15所示,其序列为:PGTPGRPGIKGEPGAPGKIHHHHHH,与理论C-端氨基酸序列(PGTPGRPGIKGEPGAPGKIHHHHHH)一致。检测到1703NT冻干品样品C端肽段的二级质谱图如图16所示,其序列为:PGAPGKI,与理论C-端氨基酸序列(PGAPGKI)一致。
基于LC-MS/MS的蛋白全序列分析:进一步的,取1703、1703NT高纯度冻干品样品进行胰蛋白酶(Trypsin)、糜蛋白酶(Chymotrypsin)、胃蛋白酶(Pepsin)、胰蛋白酶(Trypsin)&Glu-C蛋白酶、胰蛋白酶(Trypsin)&Asp-N蛋白酶酶解处理,之后将处理好的样品通过液质联用(LC-MS/MS)分析,得到质谱原始结果的raw文件,经过软件Byonic分析,匹配数据,得到全序列测序验证的的结果。综合检测结果分析,1703、1703NT冻干品样品氨基酸序列及其总覆盖率均为100%,样本蛋白的氨基酸序列与理论氨基酸序列一致。
蛋白质的生物合成起始于N端、结束于C端,N、C端的氨基酸序列是否正确直接说明氨基酸序列是否正确、完整,基于LC-MS/MS的蛋白全序列分析可以验证表达的氨基酸序列是否正确,以上检测结果表明:1703、1703NT表达的氨基酸序列正确无误。
(3)傅里叶变换红外光谱(FT-IR)分析
胶原蛋白基团的特征吸收峰可以被红外光谱分析检测,试验取微量1703、1703NT、1703M、1703MNT高纯度冻干品样品分别KBr研磨成粉后压片,室温下,在4000~400cm-1范围内扫描(Thermo Scientific,NicoletTMiSTM 10FT-IR光谱仪),方法及结果分析参照(Jeong,H.,J.Venkatesan and S.Kim,Isolation and characterization of collagenfrom marine fish(Thunnus obesus).Biotechnology and Bioprocess Engineering,2013.18(6):p.1185-1191.)
从1703、1703NT、1703M、1703MNT高纯度冻干品样品的红外光谱扫描图(依次对应图17、18、19、20)可以看到其其特征吸收均波数均符合重组胶原蛋白结构特征:酰胺A(3299cm-1左右)、酰胺B(3081cm-1左右)、酰胺I(1650cm-1左右)、酰胺II(1530~1550cm-1左右)、酰胺III(1240cm-1左右)(参见文献[1].陈静涛等,重组胶原蛋白与牛源Ⅰ型胶原蛋白红外光谱研究.材料导报,2008(03):第119-121页.[2].Doyle,B.B.,E.G.Bendit andE.R.Blout,Infrared spectroscopy of collagen and collagen-likepolypeptides.Biopolymers,1975.14(5):p.937-957.[3].周爱梅等,重组人源胶原蛋白的分离纯化及其结构表征.食品与发酵工业,2015(03):第46-52页.)。
(4)重组胶原蛋白细胞黏附活性实验
重组胶原蛋白的细胞黏附活检测方法参考文献Juming Yao,SatoshiYanagisawa,Tetsuo Asakura.Design,Expression and Characterization of Collagen-Like Proteins Based on the Cell Adhesive and Crosslinking Sequences Derivedfrom Native Collagens,J Biochem.136,643-649(2004)。委托常州大学药学院功能纳米材料与生物医学检测实验室完成。
具体实施方法:正常培养NIH/3T3细胞(购自中国科学院细胞库,货号GNM6,培养、传代方法参照细胞说明书执行)。取1703、1703NT、1703M纯化冻干品、对照人胶原蛋白(Sigma,货号C7774)及牛血清白蛋白(BSA,购自生工生物(上海)股份有限公司)溶解(超纯水或1M HCl溶液),以UV蛋白定量经验公式:C(mg/mL)=0.144*(A215-A225)测定蛋白浓度,再以PBS(pH 7.4)稀释至0.5mg/mL。向96孔细胞培养板中加入100μL各种蛋白溶液和空白PBS溶液对照,室温静置60min;再向每孔中加入105个培养状态良好的3T3细胞,37℃、5%CO2孵育60min。以PBS清洗4次孔中细胞。使用LDH检测试剂盒(Roche,04744926001)检测OD492nm的吸光度值(具体操作参照说明书执行),分析数据并进行显著性差异分析(SPSS 22软件,Ducan法,P<0.05)。
OD492nm的吸光度相应的表征出胶原蛋白样品的细胞粘附活性:黏附活性越高,说明蛋白粘附的细胞越多,胶原蛋白越能在短时间内帮助细胞贴壁或粘附于细胞外基质之上,更利于构建更佳的细胞外环境。如图21所示,1703、1703NT、1703M的细胞粘附活性显著优于商品化的天然人胶原蛋白,且1703、1703NT、1703M的细胞粘附活性无显著差异,说明进行氨基酸序列突变后的1703M并没有显著改变突变前序列的细胞粘附活性。
(5)划痕法检测重组胶原蛋白细胞迁移活性实验
重组胶原蛋白的细胞迁移活性活检测及分析方法参考文献Bobadilla,A.,etal.,In vitro cell migration quantification method for scratch assays.J R SocInterface,2019.16(151):p.20180709.委托常州大学药学院功能纳米材料与生物医学检测实验室完成。
具体实施方法:取1703、1703NT、1703M纯化冻干品、对照人胶原蛋白(Sigma,货号C7774)及牛血清白蛋白(BSA,购自生工生物(上海)股份有限公司)溶解(超纯水或1M HCl溶液),以UV蛋白定量经验公式:C(mg/mL)=0.144*(A215-A225)测定蛋白浓度,再以DMEM无血清培养(GIBCO,货号12800017,pH 7.4)稀释至0.5mg/mL(稀释后,调节其pH稳定于7.0~7.4)。正常培养、传代NIH/3T3细胞(购自中国科学院细胞库,货号GNM6,培养、传代方法参照细胞说明书执行)。将状态良好的细胞接入6孔板,每孔按照2万细胞/mL密度接种2mL细胞悬液,培养36h。用200μL枪头制备划痕,用PBS清洗细胞3次,去除划下的细胞。于孔中加入DMEM无血清培养基稀释的蛋白溶液,继续放入37℃、5%CO2培养箱培养,0h、24h、48h取样、拍照。使用Image J软件对细胞迁移的图片进行处理,获得初始划痕面积和无细胞空白区域面积数据,计算:迁移率=(1-无细胞空白区域面积/初始划痕面积)*100%,分析数据并进行显著性差异分析(SPSS 22软件,Ducan法,P<0.05)。
体外细胞迁移实验在一定程度上模拟了体内细胞迁移的过程,直接反映了细胞与胞外基质及基质影响下细胞之间的相互作用。细胞迁移活性是更有效表征胶原蛋白生物学活性的指标,迁移率越高,速度越快,胶原蛋白的生物学活性越佳。如图22所示的不同时间下拍摄的细胞迁移实际对比图(两红色线内为初始及细胞迁移后划痕伤口区域,图中每张图的右下角,红色横线部分为标尺,标尺大小均为100μm)及图23所示的计算细胞迁称率(Image J计算无细胞空白区域)的比较可知,1703、1703NT、1703M纯化冻干品的细胞迁移活性显著优于天然人胶原蛋白,且1703M的促细胞迁移活性也优于1703、1703NT。
Claims (18)
1.重组XVII型人源化胶原蛋白,其特征在于,所述重组XVII型人源化胶原蛋白包括与SEQ ID NO.1的567-808位具有80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上同一性的氨基酸序列,并维持XVII型胶原蛋白第15螺旋区生物学活性。
2.根据权利要求1所述的重组XVII型人源化胶原蛋白,其特征在于,所述重组XVII型人源化胶原蛋白包括与SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.8具有80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上同一性并维持XVII型胶原蛋白第15螺旋区生物学活性的氨基酸序列;优选地,所述重组XVII型人源化胶原蛋白包括SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列。
3.多核苷酸,其特征在于,所述多核苷酸编码权利要求1或2所述的重组XVII型人源化胶原蛋白。
4.根据权利要求3所述的多核苷酸,其特征在于,所述多核苷酸包括SEQ ID NO.3、SEQID NO.5、SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列、或其简并序列。
5.载体,其特征在于,所述载体包括权利要求3或4所述多核苷酸;所述载体为真核载体或原核载体;优选地,所述载体为pPIC9K。
6.宿主细胞或重组工程菌,其特征在于,所述宿主细胞或重组工程菌包含权利要求3或4所述的多核苷酸,或权利要求5所述的载体;优选地,所述细胞为真核细胞或原核细胞,更优选地,所述宿主细胞为毕赤酵母工程菌。
7.根据权利要求6所述的宿主细胞或重组工程菌,其特征在于,所述毕赤酵母工程菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为CGMCC No.21889、CGMCCNo.21888、CGMCC No.21890、CGMCC No.21884。
8.组合物,其特征在于,所述组合物包括权利要求1-2所述的重组XVII型人源化胶原蛋白,或权利要求3-4所述的多核苷酸,或权利要求5所述的载体,或权利要求6-7所述的宿主细胞或重组工程菌。
9.制品,其特征在于,所述制品包括权利要求1-2所述的重组XVII型人源化胶原蛋白,或权利要求3-4所述的多核苷酸,或权利要求5所述的载体,或权利要求6-7所述的宿主细胞或重组工程菌,或权利要求8所述的组合物;优选地,所述制品选自药物、医疗器械、生物材料、组织工程产品、化妆品或保健品。
10.根据权利要求1-2所述的重组XVII型人源化胶原蛋白、权利要求3-4所述的多核苷酸、权利要求5所述的载体、权利要求6-7所述的宿主细胞或重组工程菌、权利要求8所述的组合物或权利要求9所述的制品在制备药物、医疗器材、生物材料、组织工程产品、化妆品或保健品中的用途。
11.一种提高重组XVII型人源化胶原蛋白生产水平且蛋白低降解的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)将权利要求6或7中所述重组工程菌接于种子培养基中,过夜培养制备菌种液;
(2)设置发酵温度和pH值,将菌种液接种到发酵培养基中,调节搅拌转速、空气通量、罐压、DO值,培养至碳源耗尽,DO快速回升,开始流加补料培养基,至菌OD600值至一定值,停止流加补料培养基;
(3)等甘油耗尽,DO≥70%后开始流加诱导培养基,进入甲醇诱导阶段,调节转速、通气量、罐压和流加速度使DO≥30%;
(4)诱导发酵结束后,取发酵液上清,检测蛋白;
所述重组XVII型人源化胶原蛋白为表达XVII型胶原蛋白第15螺旋区的重组人源化胶原蛋白;更优选地,所述重组XVII型人源化胶原蛋白包括权利要求1或2中所述,或者包括SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
12.根据权利要求11所述的制备方法,其特征在于,
步骤(2)中所述发酵培养基组分包括:NH4H2PO4 11.9-47.6g/L、KH2PO4 2.515-10.06g/L、CaSO4·2H2O 0.295-1.18g/L、K2SO4 4.55-18.2g/L、MgSO4·7H2O 3.725-14.9g/L、甘油20g/L、PTM1 0.45mL/L;优选地,所述发酵培养基组分包括NH4H2PO4 11.9g/L、KH2PO42.515g/L、CaSO4·2H2O 0.295g/L、K2SO4 4.55g/L、MgSO4·7H2O 3.725g/L、甘油20g/L、PTM10.45mL/L。
13.根据权利要求11所述的制备方法,其特征在于,步骤(2)中所述pH值设置为3.5-6,优选pH值为4.0。
14.根据权利要求11所述的制备方法,其特征在于,所述步骤(2)中当所述菌OD600值为50-150,优选菌OD600值为50时,停止流加补料培养基。
15.根据权利要求11所述的制备方法,其特征在于,所述步骤(3)中诱导培养基组分包括:纯甲醇、50%甘油、PTM1;其中纯甲醇和50%甘油体积比为10-7:0-3,每升加入12mLPTM1;优选地,所述纯甲醇和50%甘油体积比为8:2。
16.根据权利要求11-15任一项所述的制备方法,其特征在于,所述步骤(4)后还包括对发酵产品进行纯化的步骤;优选地,所述纯化包括依次进行的疏水层析和阳离子层析步骤。
17.根据权利要求16所述的制备方法,其特征在于,所述疏水层析采用缓冲液A平衡,缓冲液B洗杂,缓冲液C洗脱;所述阳离子层析采用缓冲液D平衡,缓冲液E洗脱;优选地,缓冲液A包括:20mM KH2PO4,2M硫酸铵,pH5.0;缓冲液B包括:20mM KH2PO4,0.6M硫酸铵,pH5.0;缓冲液C包括:20mM KH2PO4,pH5.0;缓冲液D包括:20mM酒石酸,100mM氯化钠,pH4.0;缓冲液E包括:20mM酒石酸,500mM氯化钠,pH4.0。
18.一种重组XVII型人源化胶原蛋白的纯化方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)疏水层析:配制缓冲液A:20mM KH2PO4,2M硫酸铵,pH5.0;缓冲液B:20mM KH2PO4,0.6M硫酸铵,pH5.0;缓冲液C:20mM KH2PO4,pH5.0;
收集重组XVII型人源化胶原蛋白的发酵液上清,用缓冲液A平衡疏水层析介质,上样结束后,用缓冲液A进行再平衡;然后缓冲液B进行洗杂,缓冲液C进行洗脱,开始收集洗脱液1;
(2)阳离子层析:配制缓冲液D:20mM酒石酸,100mM氯化钠,pH4.0;缓冲液E:20mM酒石酸,500mM氯化钠,pH4.0;
缓冲液D平衡阳离子层析介质,将洗脱液1上样,上样结束后,用缓冲液D进行再平衡,用缓冲液E进行洗脱,收集洗脱液2,将洗脱液2超滤冻干,得到纯化后的蛋白冻干品;
优选地,所述重组XVII型人源化胶原蛋白为表达XVII型胶原蛋白第15螺旋区的重组人源化胶原蛋白;更优选地,所述重组XVII型人源化胶原蛋白包括权利要求1或2中所述,或者包括SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
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