CN117025646A - 一种脯氨酰4-羟化酶与重组人源ⅲ型胶原蛋白共表达体系与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种脯氨酰4‑羟化酶与重组人源Ⅲ型胶原蛋白共表达体系与应用。其表达体系构建方法为将重组人源Ⅲ型胶原蛋白和小球藻病毒(PBCV‑1)脯氨酰4‑羟化酶A085R的基因片段分别插入表达宿主的表达质粒中，共同转化表达宿主，筛选得到高表达的重组工程菌。Flag‑A085Rpro的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，编码基因A085R‑DNAsequence的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明还提供了包含该表达体系产生的重组人源Ⅲ型胶原蛋白的生物医学材料或美容化妆品或护肤品。

Description

一种脯氨酰4-羟化酶与重组人源Ⅲ型胶原蛋白共表达体系与 应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种脯氨酰4-羟化酶与重组人源Ⅲ型胶原蛋白共表达体系与应用。

背景技术

胶原蛋白是生物高分子，动物结缔组织中的主要成分，也是哺乳动物体内含量最多、分布最广的功能性蛋白，占蛋白质总量的25％～30％，某些生物体甚至高达80％以上。因具有良好的生物相容性、可生物降解性以及生物活性，因此在食品、医药、组织工程、化妆品等领域获得广泛的应用。在众多胶原蛋白亚型中，Ⅲ型胶原蛋白是人体皮肤、筋膜、肌腱中主要的胶原蛋白，存在于表皮层和真皮层之间。其结构细小且具有良好的修复性能，对皮肤的弹性、疤痕愈合有重要作用，其减少会导致皮肤衰老。Ⅲ型胶原于出生后即呈下降趋势，正常婴儿皮肤Ⅲ型胶原占80％，随着生长发育，Ⅲ型胶原不断减少，所以Ⅲ型胶原也被称为“婴儿胶原”，是撑起表皮的关键，其在熟龄皮肤中的缺乏也是肌肤塌陷的重要诱因。III型胶原蛋白由三条单链组成，三条单链之间通过氢键形成胶原蛋白特有的三螺旋结构。单链全长1466个氨基酸，其中1-23为信号肽，24-153为N端前肽，154-1221为成熟肽链，1222-1466为C端前肽。成熟肽链由N端结构域、三螺旋区域和C端结构域组成，其中发挥功能的三螺旋结构域由“G-X-Y”氨基酸三联体连接而成，G代表甘氨酸，X代表其他任意氨基酸，Y通常为脯氨酸，根据胶原蛋白的类型，特定的脯氨酸残基会被翻译后的脯氨酸羟化酶(一般为脯氨酰4-羟化酶，又称脯氨酸4-羟化酶、4-脯氨酸羟化酶等)催化，生成4-羟脯氨酸(Hyp)，从而通过三条单链之间脯氨酸形成氢键而构成三螺旋结构。4-羟基脯氨酸的含量是分子内氢键形成所必需的，并对胶原三螺旋的构象稳定以及体温下的热稳定性至关重要。

III型胶原蛋白的化学组成、结构赋予了它在皮肤相关生物医学材料和化妆美容品开发方面的独特地位。Ⅲ型胶原蛋白的三螺旋区域是该类型胶原蛋白生物学功能的主要承载区域，如细胞黏附性、水溶性、稳定性等等。与此同时，胶原蛋白本身发挥作用时分子量比一般多肽更大，而人体用于自我保护的皮肤屏障使得大分子胶原蛋白难以进入，使得外源补充胶原蛋白的分子量选择成为关键问题。这种情况下，相较于对分子量有较为严格限制的胶原蛋白肽全化学合成，基于三螺旋功能区重组表达更接近人体真实情况且具有更高的生物利用度。以大肠杆菌为宿主的原核表达系统是实验室和工业生产最常用的重组蛋白表达系统，具有培养密度高、投料成本较低的优点，但是原核表达系统的表达模式单一，无法对胶原蛋白进行翻译后修饰，使得蛋白的脯氨酸羟化水平受限，不利于形成胶原蛋白特征的三螺旋结构。虽然有研究者选择向原核表达宿主中导入人源脯氨酸羟化酶进行人源胶原蛋白序列的羟化，提升了脯氨酸羟化效率，但以人源脯氨酸羟化酶为代表的真核生物来源酶类在原核系统中面临着自身表达效率低、蛋白折叠效果差的问题，限制了其大量应用。同时，原核表达宿主细胞同时表达两种真核生物来源的蛋白，对其代谢负担较大，也对蛋白表达必要的宿主细胞繁殖速度和其他正常生命活动造成不良影响。因此，设计开发一种原核表达系统适用的较大分子重组人源III型胶原蛋白片段与脯氨酸羟化酶共表达系统，以得到具备正常胶原蛋白结构的活性胶原蛋白，有着一定的研究价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种脯氨酰4-羟化酶与重组人源Ⅲ型胶原蛋白共表达体系与应用。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明提供的原核脯氨酰4-羟化酶与重组人源Ⅲ型胶原蛋白共表达体系，所述Flag-A085R的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

所述原核脯氨酸羟化酶的编码基因A085R-DNAsequence，其核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示。

具体地，本发明提供的原核脯氨酰4-羟化酶与重组人源Ⅲ型胶原蛋白共表达体系的构建方法为将重组人源Ⅲ型胶原蛋白和小球藻病毒(PBCV-1)脯氨酰4-羟化酶A085R的基因片段分别插入表达宿主的两种不同表达质粒中，共同转化表达宿主，筛选得到高表达的重组工程菌。

具体地，表达宿主为大肠杆菌BL21(DE3)的。

具体地，所述表达质粒为A085R-pACYCduet，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，表达质粒A085R-pACYCduet的编码基因是Flag-A085R通过5'NdeI and 3'XhoI双酶切至pACYCduet连接而成。

进一步地，本发明提供了一种重组人源Ⅲ型胶原蛋白，由上述表达体系表达得到。

更进一步地，本发明还要求保护包含所述重组人源Ⅲ型胶原蛋白的生物医学材料或美容化妆品或护肤品。

本发明将已知序列的小球藻病毒(Paramecium bursaria Chlorella virus 1，PBCV-1)脯氨酰4-羟化酶A085R的242个氨基酸进行反向翻译并按表达宿主偏好进行序列优化，构建宿主表达质粒，并与表达人源III型胶原蛋白亚基α1-III成熟肽链中第155-377个氨基酸的质粒N3A-TEV-8HIS-pET-28A(+)进行宿主共转化，帮助胶原肽亚基单体进行关键脯氨酸位点羟化，增强了胶原肽整体的螺旋结构程度和亲水性质。需要说明的是，本发明胶原蛋白氨基酸序列和核苷酸序列选自申请号：2023100278463，申请名称：一种重组人源Ⅲ型胶原蛋白及其表达体系与应用。共表达过程中，由于胶原肽在后端增加8-His组氨酸标签，脯氨酰4-羟化酶不含该标签，可通过组氨酸标签亲和层析等纯化手段得到高纯度要求的目标胶原蛋白样品。两种质粒以一定比例体系转化大肠杆菌，通过两种抗生素抗性筛选得到高表达的重组大肠杆菌工程菌，经过初步发酵及纯化步骤，得到高纯度的重组人源胶原蛋白。

本发明与现有技术相比具有以下有益效果或者优点：

本发明提供的重组人源III型胶原蛋白具有良好的亲水性、稳定性和胶原蛋白结构特征，且具有高序列同源性，其基因序列与人源III型胶原蛋白基因序列相应部分100％相同，在生物医学材料、美容化妆品及护肤品领域等有应用潜力。

附图说明

图1为PBCV-1脯氨酰4-羟化酶Flag-A085R表达质粒的构建示意图和重组人源III型胶原蛋白N3A-TEV-8HIS-pET-28A表达质粒的构建示意图。上图为PBCV-1脯氨酰4-羟化酶Flag-A085R表达质粒的构建示意图，下图为重组人源III型胶原蛋白N3A-TEV-8HIS-pET-28A表达质粒的构建示意图。

图2为两种质粒转化后的大肠杆菌DE3平板图。

图3为两种质粒共转化后的重组人源III型胶原蛋白的凝胶电泳鉴定结果图，右图为免疫印迹结果图；其中，M：蛋白标准品；1：诱导后全菌；2：破碎后全菌；3：破碎后上清；B：亲和层析上样后柱料；E：亲和层析洗脱液；S：洗脱液冻干粉。

图4为重组人源III型胶原蛋白傅里叶变换红外光谱吸收结果图。

图5为重组人源III型胶原蛋白圆二色谱结果图。

图6为重组人源III型胶原蛋白扫描电镜结果图。

具体实施例

下面，结合实施例对本发明的技术方案进行说明，但是，本发明并不限于下述的实施例。

下述各实施例中实验方法和检测方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述药剂和材料，如无特殊说明，均可在市场上购买得到；所述指标数据，如无特殊说明，均为常规测量方法。

实施例1

1.脯氨酸羟化酶序列选择和质粒构建

基于对人源和绿藻来源的脯氨酰4-羟化酶的氨基酸序列和结构区域的分析，本发明的氨基酸序列(SEQ ID No.1)选取了小球藻病毒PBCV-1的脯氨酰4-羟化酶A085R，该酶共242个氨基酸。选取理由如下：(1)该酶来源于小球藻病毒，其宿主为原核生物中繁殖能力强、环境适应性高的小球藻，因此该酶能够在原核细胞中高效表达和作用，避免了真核生物来源的羟化酶在原核表达系统中难以表达、结构正确率不高的问题，减少了宿主细胞因引入外来酶而死亡的风险；(2)该酶序列长度与待表达的重组人源III型胶原蛋白序列长度差异小，分子量大小相似，纯化过程中亲和层析前无需另外为该酶增加纯化步骤，能够有效减少蛋白损失、增加酶与蛋白作用的时间。与重组胶原蛋白C端连接8-His组氨酸标签不同，该酶序列的N端与Flag标签连接，不仅能通过不同标签来有效区分酶与重组胶原蛋白，还能通过多步亲和层析提升蛋白纯度，达到不同产品的要求。

本发明的质粒Flag-A085R-pACYCduet为自行设计，质粒构建示意图如图1所示，质粒的编码基因Flag-A085R-DNAsequence经过Flag-A085R序列(SEQ ID No.1)反向翻译后得到，大肠杆菌密码子优化后合成，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，通过5'NdeI和3'XhoI双酶切至pACYCduet连接而成。质粒序列如SEQ ID No.3所示。

3.质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)

将冻干的质粒干粉用无菌水溶解成100ng/μL。将溶解好的N3A-TEV-8HIS-pET-28A(+)质粒10μL和A085R-pACYCduet质粒10μL分别加入到含有100μL大肠杆菌DE3感受态细胞的1.5mL EP管中，在冰上放置30min，然后42℃水浴热击90s，再放置冰上2-3分钟后，加入800μL的LB液体培养基中，并在37℃震荡培养1h，最后取100μL液体涂布在含有卡那霉素和氯霉素双抗性的固体培养基中，37℃恒温培养过夜。图2为转化后的大肠杆菌DE3平板图。

4.扩大培养

挑取平板上的单菌落，接入1mL含有卡那霉素(50ug/ul)和氯霉素(170ug/ul)的LB液体培养基，220rpm，37℃培养至OD₆₀₀＝0.8时进行保菌，其余菌液接入1L含有卡那霉素(50ug/ul)和氯霉素(170ug/ul)的LB液体培养基中，220rpm，37℃培养至OD₆₀₀＝0.6时加0.5mM IPTG进行诱导，37℃，160rpm继续培养24h。采用离心将菌体与培养基分离，离心条件为6000g，20min。

5.重组人源III型胶原蛋白的纯化制备方法，包括如下步骤：

取具有表达出重组人源III型胶原蛋白能力的重组大肠杆菌溶解在缓冲液(Tris-HCl、EDTA)使用均质机进行破菌，再使用离心机离心取上清液。将离心取得上清液中以10g/L的添加量加入固体NaCl，边搅拌边逐渐加入，使用离心机离心，再取离心上清。将上述含有NaCl的离心上清液的pH值调整在2.0-4.5之间，使得杂质蛋白析出，使用离心机离心，保留离心上清。将上清液进行透析，透析外液使用破菌缓冲液，多次更换透析外液直到内外电导和pH一致。

使用Ni亲和层析对带有组氨酸标签的重组人源III型胶原蛋白进行富集。向清洗后的层析柱中加入含有待亲和蛋白的上清液，上样完成后用裂解缓冲盐溶液进行冲洗除杂，采用咪唑洗脱液对结合在Ni亲和柱料上的蛋白进行竞争性洗脱。纯化后的蛋白通过蛋白凝胶电泳进行检测，并利用蛋白免疫印迹湿转法检测组氨酸标签。蛋白凝胶电泳和免疫印迹结果如图3，重组蛋白在以上条件下表达良好，经纯化后得到的蛋白条带单一，说明纯度较高。

6.重组人源III型胶原蛋白的高级结构表征方法：

(1)傅里叶变换红外光谱(FT-IR)

取约1mg的干燥冻干蛋白样品与备好的溴化钾混合后制成透明试样薄片，室温下利用傅里叶变换红外光谱仪扫描，记录4000-5000cm^-1区间的光谱。

重组人源III型胶原蛋白冻干粉的FT-IR结果如图4所示，含有胶原蛋白所有特征峰，即峰值高于2500cm^-1的酰胺A带与酰胺B带，峰值在1200-1700cm^-1的酰胺I、II、III带。

(2)圆二色谱

取适量胶原蛋白样品配制浓度为0.1mg/mL的水溶液，置于光程为1mm的样品池中于室温进行扫描分析，扫描波数为190-250nm。

重组人源III型胶原蛋白的圆二色谱结果如图5所示，实线为应用共表达体系的蛋白圆二色谱结果，虚线为未应用共表达体系的相同浓度的蛋白圆二色谱结果。蛋白在198nm附近出现明显的负吸收峰，在223nm处有一较弱的正吸收峰，在217nm处有一交叉点，呈现胶原蛋白三螺旋结构的典型特征；且应用共表达体系后，两处特征峰值更高，说明其结构特征更加明显。

(3)扫描电镜

取适量胶原蛋白样品用离子溅喷金处理，用扫描电镜在10.0kV的加速电压下，放大100-1000倍观察胶原蛋白微观结构。

重组人源III型胶原蛋白的扫描电镜图像如图6所示，胶原外层可形成由蛋白纤维交织而成的致密网状片层结构(图6，左)，拨开片层结构后内部可看到单独的胶原纤维(图6，右)。

综上，本发明提供的原核脯氨酸羟化酶与重组人源III型胶原蛋白共表达系统及蛋白纯化方法，利用了蛋白质分子量、溶解度、等电点、亲和标签等的差异去除杂蛋白、富集目标蛋白，条件温和，使得纯化得到的重组人源III型胶原蛋白能够成为用于化妆品原料、食品和医疗器械等的潜在原料。

该套方法构建的工程菌表达的重组人源III型胶原蛋白经过蛋白凝胶电泳、免疫印迹，确定了蛋白分子量和纯度；通过圆二色谱和傅里叶变换红外光谱，确定了蛋白具有胶原蛋白特征结构；通过扫描电镜，确定了蛋白具有胶原蛋白的高级立体结构和潜在的支撑、弹性特性，具备应用价值。

如上所述，即可较好地实现本发明，上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种改变和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种脯氨酰4-羟化酶与重组人源Ⅲ型胶原蛋白共表达体系，其特征在于，所述体系中，所述脯氨酰4-羟化酶的氨基酸序列的名称是Flag-A085Rpro，所述Flag-A085Rpro氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.根据权利要求1所述的表达体系，其特征在于，所述原核脯氨酰4-羟化酶的编码基因名称是A085R-DNAsequence。

3.根据权利要求2所述的表达体系，其特征在于，所述基因A085R-DNAsequence的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

4.根据权利要求1所述的表达体系，其特征在于，所述表达体系的构建方法为将重组人源Ⅲ型胶原蛋白和小球藻病毒(PBCV-1)脯氨酰4-羟化酶A085R的基因片段分别插入表达宿主的表达质粒pET-28A(+)和pACYCduet中，共同转化表达宿主，筛选得到高表达的重组工程菌。

5.根据权利要求4所述的表达体系，其特征在于，所述表达宿主为大肠杆菌BL21(DE3)。

6.根据权利要求4所述的表达体系，其特征在于，脯氨酰4-羟化酶A085R的基因片段插入表达宿主的表达质粒pACYCduet中构建的表达质粒为A085R-pACYCduet。

7.根据权利要求6所述的表达体系，其特征在于，所述表达质粒A085R-pACYCduet的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

8.根据权利要求6所述的表达体系，其特征在于，所述表达质粒A085R-pACYCduet的编码基因是Flag-A085Rpro通过5'NdeI and 3'XhoI双酶切至pACYCduet连接而成。

9.一种重组人源Ⅲ型胶原蛋白，其特征在于，由权利要求1-8任一项所述表达体系表达得到。

10.一种生物医学材料或美容化妆品或护肤品，其特征在于，包含权利要求9所述重组人源Ⅲ型胶原蛋白。