JP7300060B2 - ヒトコラーゲンｘｖｉｉ型ポリペプチド、その製造方法および使用 - Google Patents

ヒトコラーゲンｘｖｉｉ型ポリペプチド、その製造方法および使用 Download PDF

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Description

（関連出願への相互参照）
本願は、２０１９年１０月３１日に出願された出願番号がＣＮ２０１９１１０５１１０６．３である中国特許出願の優先権を主張するものであり、その全体を参照により本出願の一部をなすものそして引用する。
本発明は、遺伝子工学の技術分野に属し、ポリペプチド、その製造方法および使用に関する。
コラーゲン
コラーゲンは一般的に白く、透明で、枝分かれしていないフィブリルであり、皮膚および骨の基本的な支持物であり、タンパク質の総量の２５％～３５％を占める。人体において、コラーゲンは、主に皮膚、血管、骨、腱、歯および軟骨などに分布し、これらの組織の主要な基質や足場であり、さまざまな組織を保護・接続し、重要な生理機能を果たす。したがって、コラーゲンは医療や化粧品などの業界で広く利用されている。
現在、市販されているコラーゲン製品はすべて、ブタ、ウシ、魚などの動物の組織から取られたものである。一部の動物のコラーゲンはヒトのコラーゲンと非常に類似しているが、ウイルス感染や感作のリスクを回避することは依然として困難である。現在、少量の動物由来コラーゲンが化粧品に使用されているが、医療機器や高度な組織工学製品に広く使用することは困難であり、コラーゲン本来の生物学的機能を発揮することはできない。さらに、従来の方法で調製されたコラーゲンは、一般に強力な血液凝固機能を有し、特定の組織工学製品に適用すると、血栓症のリスクが高くなるため、その応用の広さと深さが大きく制限される。
コラーゲンを生成する従来の方法は、酸、塩基、および酵素加水分解を利用して動物由来の組織を処理して、コラーゲン誘導体を抽出するものである。これらの方法で抽出されたコラーゲンは、本来の生物学的活性を失ってしまい、生物医学の分野でその本来の機能を果たすために使用することはできない。中国や海外の研究機関は、従来の組換え発現法を利用して、ヒト由来コラーゲンをｉｎ ｖｉｔｒｏで発現させたが、通常、製造コストが高すぎ、製造期間が長すぎて大量生産に適しない。このため、優れた生体材料特性、人体との高度なアミノ酸配列相同性を有し、且つ工業化システムで大量に製造できるコラーゲン材料は切望されている。
ＸＶＩＩ型ヒトコラーゲン
構造の観点から、天然のヒトコラーゲンの構造は非常に複雑であるため、従来の方法でヒト由来コラーゲンを大量に発現、製造することは極めて困難である。コラーゲンの最も一般的な構造的特徴は、３つのペプチド鎖によって形成される三重らせん構造であり、即ち、３つのＡペプチド鎖が右巻きのスーパーコイル状にタンパク質を形成する。なお、このような三重らせん領域は、コラーゲン領域と呼ばれる。分子構造において、各Ａペプチド鎖は、反復Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ（Ｘ、ＹはＧｌｙ以外の任意のアミノ酸残基を表し、Ｘは一般的にＰｒｏであり、Ｙは一般的にＨｙｐである）ペプチドフラグメントで左巻きらせんを構成し、３つのペプチド鎖が、アミノ酸残基の相互作用下で、同じ軸を中心とし、右巻きのスーパーコイル状に安定した三重らせん構造を形成する。このため、コラーゲンの配列が自発的に結合して安定した三重らせん構造を形成して生物学的機能を発揮することは、一般的に困難であり、このような困難はヒトコラーゲンの開発および製造を深刻に妨げる。
人体には２８種類の異なるタイプのコラーゲンが存在し、よく見られる線維性コラーゲンとよく見られない非線維性コラーゲンに分けられる。ヒトの皮膚におけるＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型は、線維性コラーゲンに属する。非線維性コラーゲンにおいて、ＸＶＩＩ型コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ ＸＶＩＩ、人体のＣＯＬ１７Ａ１遺伝子によってコードされている）は、コラーゲンの非常に重要なサブタイプである。ＸＶＩＩ型コラーゲンは、１本の鎖の分子量が１８０ｋＤａであるＣＯＬ１７Ａ１鎖が３つ会合したホモ三量体であり、７０ｋＤａの球状細胞内ドメイン、膜貫通ドメイン、および１２０ｋＤａの細胞外コラーゲンドメインを含み、非常に高い熱安定性を有する。最近の研究により、ＸＶＩＩ型コラーゲンは、ヒトの表皮幹細胞のヘミデスモソームの重要な成分であり、細胞の老化および皮膚の分化の両方で重要な役割を果たすことが実証された。しかし、これまで、非線維性コラーゲン、特にＸＶＩＩ型コラーゲンの構造、機能に対する認識が非常に限られている。
本発明者は、コラーゲンの構造と機能を長年にわたって深く研究してきた。特に、世界で初めて、ヒトコラーゲンの複数のセグメントの新しい原子構造を解析し、国際タンパク質構造データベースに投稿して公開し、豊富な研究経験を積み重ねた。本発明者は鋭意検討した結果、ＸＶＩＩ型コラーゲンのいくつかの細胞外機能領域の組換え発現を実現することに成功し、このＸＶＩＩ型コラーゲンは優れた生体材料特性を有し、製造方法が簡単で、生産の拡大が容易で、医薬品や化粧品などの産業で広く応用できることを見出した。
本発明は、以下の知見に部分的に基づいて完成したものである。
本発明のポリペプチドＣ１７Ａ３、Ｃ１７Ｂ３およびＣ１７Ｃ１は、既知のヒトコラーゲンと比較して同等以上の細胞接着能を有し、また、ポリペプチドＣ１７Ａ３、Ｃ１７Ｂ３およびＣ１７Ｃ１は、宿主細胞で発現された後、水溶性の形態で存在し、製造方法が簡単で、生産の拡大が容易である。
背景技術に示された従来技術の欠点に対して、本発明は以下のものを提供する。
項目１．
細胞接着活性を有するポリペプチドであって、
配列番号９における６３～１４９６個の連続したアミノ酸残基を含む、ポリペプチド。
項目２．
（Ａ）ｍに示す配列を含む、または（Ａ）ｍに示す配列からなるポリペプチドであって、
各Ａは、配列番号１、配列番号２および配列番号３のいずれか１つに示すアミノ酸配列から選択され、或いは配列番号１、配列番号２および配列番号３のいずれか１つにおいて１個または複数、例えば２、３、４または５個のアミノ酸残基が置換、付加または欠失されたアミノ酸配列であり、或いは配列番号１、配列番号２および配列番号３のいずれか１つに示すアミノ酸配列に対して８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％または９７％の配列同一性を有する配列であり；ｍは１～１０の整数であり；各Ａは同じでも異なっていてもよく、隣接する２つのＡはペプチド結合によって直接結合されるか、または１個以上のアミノ酸残基によって結合される、細胞接着活性を有する、ポリペプチド。なお、本明細書に記載される区間は端点を含み、例えば、１～１０の間は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０を含み、すなわち、ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０であってもよい。
項目３．
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号６に示すアミノ酸配列を含む、またはそれらからなる、項目１または２に記載のポリペプチド。
項目４．
項目１～３のいずれか１つに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、
好ましくは、配列番号５、配列番号７または配列番号８に示すヌクレオチド配列を含む、または配列番号５、配列番号７または配列番号８に示すヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチド。
項目５．
項目４に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
項目６．
項目５に記載の発現ベクターを含む、または項目１～３のいずれか１つに記載のポリペプチドを発現する宿主細胞であって、
好ましくは大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）細胞である、宿主細胞。
項目７．
項目１～３のいずれか１つに記載のポリペプチドを製造する方法であって、
（１）生産培地で項目６に記載の宿主細胞を培養すること；
（２）宿主細胞から項目１～３のいずれか１つに記載のポリペプチドを分離すること
を含む、方法。
項目８．
項目１～３のいずれか１つに記載のポリペプチド、または項目７に記載の方法に従って製造されたポリペプチドを含む、組成物。
項目９．
項目１～３のいずれか１つに記載のポリペプチド、または項目７に記載の方法に従って製造されたポリペプチド、または項目８に記載の組成物を含む製品であって、
前記製品は医薬組成物、医療機器、組織工学製品、化粧品またはヘルスケア製品であり、
好ましくは、前記医薬組成物は外用剤であり、好ましくは、例えば外用ゲル剤または外用浸潤製剤のような外用塗抹製剤であり；好ましくは、前記外用ゲル剤は、薬学的に許容される担体をさらに含み、前記外用浸潤製剤は、滅菌医療用コットンボールをさらに含む、製品。
項目１０．
製品、好ましくは、医療機器、組織工学製品、化粧品、ヘルスケア製品の製造における、項目１～３のいずれか１つに記載のポリペプチド、または項目７に記載の方法に従って製造されたポリペプチド、項目４に記載のポリヌクレオチド、項目５に記載の発現ベクター、項目６に記載の宿主細胞、または項目８に記載の組成物の使用。
従来技術と比較して、本発明は以下の特徴を有する。
（１）本発明で初めて選択されたＸＶＩＩ型ヒトコラーゲン配列は、長期スクリーニング用に最適化された配列である。
（２）大規模な増幅に適した大腸菌発現系を採用しており、２０時間で１回の発酵が完了することは可能であり、製造コストは非常に低いである。遺伝子配列の大腸菌に対するコドン最適化および２×ＹＴ培地の選択により、生産量は非常に多くになる。
（３）製造された組換えヒト由来コラーゲンは、非常に優れた親水性と安定性を示し、そのアミノ酸組成が天然コラーゲンのアミノ酸配列の対応する部分と１００％同一であり、人体に適用しても免疫拒絶反応やアレルギー反応を引き起こさず、生物医学や化粧品業界で広く使用することができる。
（４）本発明の製品は、活性検出を行った結果、天然のヒトタンパク質の生物活性に到達または上回ることができる生物活性を有し、ヒトにおいて天然タンパク質の機能を発揮することができ、理想的な製品適用の目的を達成する。
（５）本発明の技術のデザインは、コラーゲンの高い細胞接着活性を維持しながら、ヒトにおいてコラーゲンが使用される場合の血液凝固のリスクを効果的に低減することができ、組織工学への幅広い応用の見通しを有する。
図１は、本発明のベクターｐＥＴ３２ａ－Ｃ１７Ａ３、ｐＥＴ３２ａ－Ｃ１７Ｂ３、ＰＥＴ３２ａ－Ｃ１７Ｃ１によって構築されたプラスミドを示す図である。 図２は、本発明のＴｒｘ－Ｃ１７Ａ３タンパク質の発現および精製後に得られたタンパク質の電気泳動図であり；電気泳動で測定されたＴｒｘ－Ｃ１７Ａ３タンパク質の分子量は約４２ｋＤａである。 図３は、本発明のＴｒｘ－Ｃ１７Ｂ３タンパク質の発現および精製後に得られたタンパク質の電気泳動図であり；電気泳動で測定されたＴｒｘ－Ｃ１７Ｂ３タンパク質の分子量は約４０ｋＤａである。 図４は、本発明のＴｒｘ－Ｃ１７Ｃ１タンパク質の発現および精製後に得られたタンパク質の電気泳動図であり；電気泳動で測定されたＴｒｘ－Ｃ１７Ｃ１タンパク質の分子量は約３２ｋＤａである。 図５は、本発明のＴｒｘ－Ｃ１７Ａ３タンパク質の発現後に、制限酵素消化によるＴｒｘタグの除去およびイオン交換による精製で得られた目的タンパク質であるＣ１７Ａ３タンパク質の電気泳動図であり；電気泳動で測定されたＣ１７Ａ３タンパク質の分子量は約２５ｋＤａであり、配列番号４のアミノ酸配列を持つタンパク質に対応する。 図６は、本発明のＴｒｘ－Ｃ１７Ｂ３タンパク質の発現後に、制限酵素消化によるＴｒｘタグの除去およびイオン交換による精製で得られた目的タンパク質であるＣ１７Ｂ３タンパク質の電気泳動図であり；電気泳動で測定されたＣ１７Ｂ３タンパク質の分子量は約２３ｋＤａであり、配列番号６のアミノ酸配列を持つタンパク質に対応する。 図７は、本発明のＴｒｘ－Ｃ１７Ｃ１タンパク質の発現後に、制限酵素消化によるＴｒｘタグの除去およびイオン交換による精製で得られた目的タンパク質であるＣ１７Ｃ１タンパク質の電気泳動図であり；電気泳動で測定されたＣ１７Ｃ１タンパク質の分子量は約１６ｋＤａであり、配列番号３のアミノ酸配列を持つタンパク質に対応する。 図８は、本発明のＣ１７Ａ３タンパク質とＣ１７Ａ１タンパク質（配列番号１）、ヒトコラーゲンとを比較した生物活性検出結果を示す図である。 図９は、本発明のＣ１７Ｂ３タンパク質とＣ１７Ｂ１タンパク質（配列番号２）、ヒトコラーゲンとを比較した生物活性検出結果を示す図である。 図１０は、本発明のＣ１７Ｃ１タンパク質とヒトコラーゲンとを比較した生物活性検出結果を示す図である。
本発明の理解のために、以下にさらなる説明を提供する。
本明細書で使用される「医療機器」とは、ヒトに直接または間接的に使用される機器、設備、器具、ｉｎ ｖｉｔｒｏ診断試薬およびキャリブレータ、材料、および他の同様のまたは関連する物品を指す。
本明細書で使用される「組織工学製品」とは、組織工学に使用される製品を指す。組織工学は、細胞生物学と材料科学を組み合わせて、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで組織または器官を構築する新しい分野である。
本明細書で使用される「分離」とは、培養された宿主細胞から目的ポリペプチドを単離することを指し、例えば、宿主細胞を破壊し、目的ポリペプチドを精製する。精製された目的ポリペプチドがＴｒｘまたはＨｉｓタグなどの精製タグを有する場合、「分離」とは、制限酵素消化によるＴｒｘまたはＨｉｓタグの除去も含む。
「薬学的に許容されるベクター」は、当業者に周知であり、当業者は、本発明の組成物または製品に適用される薬学的に許容されるベクターを選択することができる。例えば、薬学的に許容されるベクターとしては、リン酸、クエン酸および他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブタノールまたはベンジルアルコール；メチルパラベンまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；およびｍ－クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジンなどのアミノ酸；単糖、二糖、およびグルコース、マンノース、またはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；ショ糖、マンニトール、トレハロース、またはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩を形成するカウンターイオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質複合体）；および／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明において、ヒトＸＶＩＩ型コラーゲンＣＯＬ１７Ａ１の配列を選択して、スクリーニングおよび最適化を行う。前記のヒトコラーゲンＸＶＩＩ型の配列は、ＮＣＢＩ参照配列Ｑ９ＵＭＤ９．３（配列番号９）であり、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｅｉｎ／Ｑ９ＵＭＤ９．３を参照する。
Figure 0007300060000001
上記の配列の太字の下線部分は、本発明で選択されたアミノ酸配列である。出願人は、研究を重ねた結果、上記の選択された配列は、水溶性が良く、組換え発現量が高く、精製プロセスが簡単で、市販のヒトコラーゲンまたは配列番号９における他の配列よりも優れた細胞接着効果を達成し、多くの優れた生物材料の特性を有することを発見した。本発明において、ポリペプチドは、配列番号９の完全長配列ではない。
本発明は、以下の知見に部分的に基づいて完成したものである。即ち、実施例に示されるように、配列番号９における少なくとも６３個の連続したアミノ酸残基を含むポリペプチドは、市販のヒトコラーゲンよりも優れた生物材料の特性を有することができる。当業者は、組換えコラーゲンを構成する連続したアミノ酸残基を適切に選択することができる。連続したアミノ酸残基の長さは、例えば、４８～１００、５０～７２、５４～５７、４８～７２であってもよい。
本発明において、一部の具体的なアミノ酸領域の配列を試験した。
(1)C17A:GSPGPKGDMGSPGPKGDRGFPGTPGIPGPLGHPGPQGPKGQKGSVGDPGMEGPMGQRGREGPMGPRGEA （配列番号１）；
(2)C17B:GLQGLRGEVGLPGVKGDKGPMGPPGPKGDQGEKGPRGLTGEPGMRGLPGAVGEPGAKGAMGPA （配列番号２）；
(3)C17C:GADFAGDLDYNELAVRVSESMQRQGLLQGMAYTVQGPPGQPGPQGPPGISKVFSAYSNVTADLMDFFQTYGAIQGPPGQKGEMGTPGPKGDRGPAGPPGHPGPPGPRGHKGEKGDKGDQ （配列番号３）。
本明細書において、ポリペプチドは、２０７個のアミノ酸を含むＣ１７Ａを３回繰り返した配列である組換えヒト由来コラーゲンＣ１７Ａ３であってもよく、その基本的な繰り返し単位はGSPGPKGDMGSPGPKGDRGFPGTPGIPGPLGHPGPQGPKGQKGSVGDPGMEGPMGQRGREGPMGPRGEA（配列番号１）であり、ヒトコラーゲンＸＶＩＩ型のペプチドフラグメントである。
Ｃ１７Ａ３のアミノ酸配列は、以下の通りである。
GSPGPKGDMGSPGPKGDRGFPGTPGIPGPLGHPGPQGPKGQKGSVGDPGMEGPMGQRGREGPMGPRGEAGSPGPKGDMGSPGPKGDRGFPGTPGIPGPLGHPGPQGPKGQKGSVGDPGMEGPMGQRGREGPMGPRGEAGSPGPKGDMGSPGPKGDRGFPGTPGIPGPLGHPGPQGPKGQKGSVGDPGMEGPMGQRGREGPMGPRGEA （配列番号４）。
Ｃ１７Ａ３のＤＮＡ配列は、以下の通りである。
GGTAGCCCAGGTCCAAAAGGTGATATGGGAAGCCCAGGTCCGAAAGGTGATCGTGGTTTTCCGGGTACACCAGGTATTCCGGGTCCACTGGGTCATCCAGGTCCGCAAGGTCCGAAAGGCCAGAAAGGTAGCGTGGGTGATCCGGGTATGGAAGGGCCTATGGGGCAGCGTGGGCGTGAAGGGCCGATGGGTCCGCGTGGTGAAGCAGGTAGCCCGGGGCCTAAAGGGGATATGGGGAGTCCGGGTCCGAAAGGGGATCGTGGATTTCCGGGTACGCCGGGTATCCCGGGTCCGCTGGGTCATCCGGGTCCGCAAGGGCCTAAAGGTCAGAAAGGTAGTGTGGGTGATCCTGGTATGGAAGGTCCGATGGGTCAGCGTGGTCGTGAGGGTCCGATGGGACCGCGTGGTGAGGCTGGTAGCCCTGGTCCGAAAGGAGATATGGGTAGCCCGGGTCCGAAAGGTGACCGTGGTTTTCCTGGTACACCGGGTATTCCAGGGCCTCTGGGTCATCCTGGTCCTCAGGGTCCGAAAGGTCAGAAAGGGAGTGTGGGAGATCCGGGTATGGAGGGTCCGATGGGGCAGCGCGGTCGTGAAGGTCCGATGGGCCCGCGTGGTGAAGCC （配列番号５）。
本明細書において、ポリペプチドは、１８９個のアミノ酸を含むＣ１７Ｂを３回繰り返した配列であるヒト由来コラーゲンＣ１７Ｂ３であってもよく、その基本的な繰り返し単位はGLQGLRGEVGLPGVKGDKGPMGPPGPKGDQGEKGPRGLTGEPGMRGLPGAVGEPGAKGAMGPA（配列番号２）であり、ヒトコラーゲンＸＶＩＩ型のペプチドフラグメントである。
Ｃ１７Ｂ３のアミノ酸配列は、以下の通りである。
GLQGLRGEVGLPGVKGDKGPMGPPGPKGDQGEKGPRGLTGEPGMRGLPGAVGEPGAKGAMGPAGLQGLRGEVGLPGVKGDKGPMGPPGPKGDQGEKGPRGLTGEPGMRGLPGAVGEPGAKGAMGPAGLQGLRGEVGLPGVKGDKGPMGPPGPKGDQGEKGPRGLTGEPGMRGLPGAVGEPGAKGAMGPA （配列番号６）。
Ｃ１７Ｂ３のＤＮＡ配列は、以下の通りである。
GGTCTGCAGGGTCTGCGTGGTGAAGTAGGACTGCCGGGTGTGAAAGGAGATAAAGGACCAATGGGTCCACCAGGACCAAAAGGAGATCAAGGAGAAAAAGGACCACGTGGTCTGACAGGTGAACCGGGTATGCGTGGGCTGCCGGGAGCAGTTGGAGAACCGGGAGCAAAAGGAGCAATGGGTCCAGCAGGACTGCAGGGTCTGCGCGGTGAAGTGGGACTGCCTGGTGTTAAAGGGGATAAAGGGCCGATGGGTCCGCCGGGTCCGAAAGGAGATCAGGGAGAAAAAGGGCCGCGTGGTCTGACCGGTGAACCGGGAATGCGTGGTCTGCCGGGGGCTGTGGGTGAGCCAGGTGCAAAAGGTGCAATGGGTCCTGCAGGTCTGCAAGGACTGCGTGGAGAAGTGGGTCTGCCTGGTGTGAAAGGTGATAAAGGTCCGATGGGTCCTCCGGGTCCGAAAGGTGATCAGGGTGAAAAAGGTCCGCGTGGTCTGACGGGTGAACCGGGCATGCGTGGTCTGCCTGGGGCAGTTGGTGAACCGGGGGCAAAAGGTGCTATGGGGCCGGCA （配列番号７）。
本明細書において、ポリペプチドは、１１９個のアミノ酸を含むＣ１７Ｃを１回繰り返した配列であるヒト由来コラーゲンＣ１７Ｃ１であってもよく、その基本的な繰り返し単位はGADFAGDLDYNELAVRVSESMQRQGLLQGMAYTVQGPPGQPGPQGPPGISKVFSAYSNVTADLMDFFQTYGAIQGPPGQKGEMGTPGPKGDRGPAGPPGHPGPPGPRGHKGEKGDKGDQ（配列番号３）であり、ヒトコラーゲンＸＶＩＩ型のペプチドフラグメントである。
Ｃ１７Ｃ１のアミノ酸配列は、以下の通りである。
GADFAGDLDYNELAVRVSESMQRQGLLQGMAYTVQGPPGQPGPQGPPGISKVFSAYSNVTADLMDFFQTYGAIQGPPGQKGEMGTPGPKGDRGPAGPPGHPGPPGPRGHKGEKGDKGDQ （配列番号３）。
Ｃ１７Ｃ１のＤＮＡ配列は、以下の通りである。
GGTGCAGATTTTGCAGGTGATCTGGATTATAATGAACTGGCAGTTCGTGTTAGCGAAAGCATGCAGCGTCAGGGACTGCTGCAGGGAATGGCATATACCGTTCAGGGTCCGCCGGGTCAGCCGGGTCCTCAAGGTCCTCCTGGTATTAGCAAAGTTTTTAGTGCATATTCAAACGTGACGGCAGATCTGATGGATTTTTTTCAGACGTATGGTGCAATTCAGGGTCCTCCTGGGCAAAAAGGTGAAATGGGTACACCTGGTCCGAAAGGCGATCGTGGTCCGGCCGGTCCGCCGGGCCACCCTGGTCCTCCTGGCCCTCGTGGTCATAAAGGTGAGAAAGGTGATAAAGGTGATCAA （配列番号８）。
本明細書において、ポリペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６および配列番号９のいずれか１つに示すアミノ酸配列において、１個または複数、好ましくは２、３、４または５個のアミノ酸残基が置換、付加、欠失または挿入されたアミノ酸配列であり、或いは配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６および配列番号９のいずれか１つに示すアミノ酸配列に対して８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％または９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでも良い。参照ポリペプチド配列に対する「アミノ酸配列同一性の百分率」は、候補配列が参照ポリペプチド配列にアラインメントする時に、必要に応じて、配列同一性の最大百分率が得られるようにギャップを導入した配列同一性であって、保存的置換を配列同一性の一部として考慮しない後、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の百分率として定義される。アミノ酸配列同一性の百分率を決定するためのアラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの一般的に入手可能なコンピューターソフトウェアを使用して、当業者に知られている様々な方法で達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを実現するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列をアラインメントするための適切なパラメータを決定することができる。
アミノ酸の付加とは、前記ポリペプチドがコラーゲンの特性および細胞接着活性を有する限り、アミノ酸配列（例えば配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６および配列番号９のいずれか１つ）のＣ末端またはＮ末端にアミノ酸を付加することを指す。
アミノ酸の置換とは、前記ポリペプチドがコラーゲンの特性および細胞接着活性を有する限り、アミノ酸配列（例えば配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６および配列番号９のいずれか１つの配列）の特定の位置の特定のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されることを指す。
アミノ酸の挿入とは、前記ポリペプチドがコラーゲンの特性および細胞接着活性を有する限り、アミノ酸配列（例えば配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６および配列番号９のいずれか１つの配列）の適切な位置にアミノ酸残基を挿入することを指す。なお、挿入されたアミノ酸残基の全部または一部は、互いに隣接していてもよく、或いは挿入されたアミノ酸同士は、互いに隣接していなくてもよい。
アミノ酸の欠失とは、前記ポリペプチドがコラーゲンの特性および細胞接着活性を有する限り、アミノ酸配列（例えば配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６および配列番号９のいずれか１つの配列）から１、２または３個以上のアミノ酸を除去することを指す。
本発明において、置換とは、保存的アミノ酸置換であってもよく、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６および配列番号９のいずれか１つのアミノ酸配列と比較して、３個、より好ましくは２個のアミノ酸、または１個のアミノ酸が類似または同等の特性を有するアミノ酸で置換されたペプチドを指す。これらの保存的変異ペプチドは、表１に従ってアミノ酸置換を行うことにより生成することができる。
表１：アミノ酸の保存的置換
Figure 0007300060000002
本明細書において、ポリペプチド配列中のすべてのアミノ酸は、Ｌ型アミノ酸であってもよく、その中で、１個または複数（例えば、２～５個、２～４個または２～３個）のアミノ酸は、ポリペプチドのバイオアベイラビリティ、安定性、および／または抗ウイルス活性を改善するために、Ｄ型コンフォメーションを有するアミノ酸、人工的に修飾されたアミノ酸、および自然界に存在する希少アミノ酸などで置換されていてもよい。ここで、Ｄ型アミノ酸とは、タンパク質を構成するＬ型アミノ酸に対応するアミノ酸を指す。人工的に修飾されたアミノ酸とは、メチル化、リン酸化などによって修飾されたタンパク質を構成する一般的なＬ型アミノ酸を指す。自然界に存在する希少アミノ酸は、タンパク質を構成する珍しいアミノ酸と、タンパク質を構成しないアミノ酸を含み、例えば、５－ヒドロキシリジン、メチルヒスチジン、γアミノ酪酸、ホモセリンなどがある。
本発明において、組換えヒト由来コラーゲンの製造は、当技術分野における従来の方法によって実施することができる。例えば、次の手順で生産することができる。（１）大腸菌の遺伝子操作された細菌を構築する。（２）大腸菌の遺伝子操作された細菌を発酵培養する。（３）組換えヒト由来コラーゲンの誘導および発現する。（４）組換えヒト由来コラーゲンを精製し、必要に応じて制限消化する。
工程（１）では、大腸菌の遺伝子操作された細菌の構築を次のように実行することができる。（１）ＰＣＲ法により、ヒト由来ＸＶＩＩ型コラーゲンの遺伝子ヘリックス領域のＤＮＡ断片を、コドン最適化とスプライシング組換えを行い、最終的に目的遺伝子断片を得る。（２）得られた目的遺伝子断片をＰＥＴ－３２ａ発現ベクターに挿入し、組換え発現プラスミドを得る。（３）組換え発現プラスミドを大腸菌コンピテントセルＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、スクリーニングして陽性の大腸菌の遺伝子操作された細菌を得る。
工程（２）と（３）では、大腸菌の遺伝子操作された細菌の発酵培養および組換えヒト由来コラーゲンの誘導と発現を次のように実行することができる。（１）ＬＡＢプレートから、大腸菌の遺伝子操作された細菌の最適化された単一コロニーを選び、それを１０ｍｌのＬＢ培地に入れ、３７℃、２２０ｒｐｍで１２～１６時間培養する。（２）１：１００の比率で細菌液を２×ＹＴ培地に接種して増幅培養し、３７℃で約３時間培養する。ＯＤ６００が０．４～０．６になると、最終濃度０．５ｍＭのＩＰＴＧを添加して誘導を行い、１６℃でさらに２０時間培養し、遠心分離により菌体を回収する。
工程（４）では、組換えヒト由来コラーゲンポリペプチドの精製と制限消化を次のように実行することができる。（１）リン酸緩衝液（４０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ３、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．８）に細菌を再懸濁させ、超音波で破砕し、遠心分離によって上清を収集する。（２）ＮＩ－ＮＴＡアフィニティーカラムを利用して組換えヒト由来コラーゲンを結合し、夾雑タンパク質を１０ｍＭイミダゾールで洗い流した後、Ｔｅｖプロテアーゼ（Ｔｏｂａｃｃｏ Ｅｔｃｈ Ｖｉｒｕｓ ｅｎｚｙｍｅ）を添加し、４℃でカラムによって１６時間制限消化し、最終的に目的のコラーゲンポリペプチドを得る。
宿主細胞は、例えば真菌および酵母のような真核細胞、大腸菌などの腸内細菌科のような原核細胞であってもよい。当業者は、上記の大腸菌株を他の発現株に置き換えて宿主細胞とすることができることを理解すべきである。
実施例
以下、実施例により本発明を説明する。当業者は、実施例が単なる例示であり、限定的ではないことを理解すべきである。本発明は、添付の特許請求の範囲のみによって限定される。
実施例１：組換えヒト由来コラーゲンポリペプチドの構築、発現および精製
Ｃ１７Ａ３遺伝子発現ベクターの構築および発現
１． 実施例１で使用されたヒト由来コラーゲンＣ１７Ａ３の全長遺伝子配列を配列番号５に示す。なお、この配列は、大腸菌のコドンに対してコドン最適化を実施したものである。
２． Ｃ１７Ａ３遺伝子の全長は６２１ｂｐであり、最適化されたＣ１７Ａ３コドン遺伝子配列である配列番号５に基いて、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｓｈｅｎｇｙｕａｎ Ｋｅｍｅｎｇ Ｇｅｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社に依頼して遺伝子断片を合成したものであり、合成されたＣ１７Ａ３遺伝子断片をＴｅｖプロテアーゼ切断部位にリンクした後、ＫｐｎＩおよびＸｈｏＩの酵素切断部位を介してＰＥＴ３２ａ発現ベクター（中国科学院生物物理研究所から提供）に挿入した。この構築された発現プラスミドは、大腸菌コンピテントセルＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｍｅｒｃｋ社）に形質転換された。具体的な手順は次のとおりである。１：このプラスミド１μｌを１００μｌの大腸菌コンピテントセルＢＬ２１（ＤＥ３）に取り、氷上で３０分間放置した。２：この混合物を４２℃の水浴で９０秒間熱ショックを与えた後、速やかに氷の上に２分間放置した。３：この混合物に６００μｌの耐性が生じないＬＢを加え、３７℃、２２０ｒｐｍの条件で１時間培養した。４：この細菌液を２００μｌ取り、アンピシリン耐性が生じるＬＢプレート（１０ｇ／Ｌのペプトン、５ｇ／Ｌの酵母エキス、１０ｇ／Ｌの塩化ナトリウム、１５ｇ／Ｌの寒天、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン抗生物質）に均一にコーティングした。５：はっきりと見えるコロニーが成長するまで、プレートを逆さまにして３７℃のインキュベーターで約２０時間培養した。
３． 形質転換されたＬＢプレートから単一のコロニーを選び、１０ｍｌのＬＢ（１００μｇ／ｍｌアンピシリン抗生物質を含む）培地で１２～１６時間培養した後、１：１００の比率で２×ＹＴ培地（１６ｇ／Ｌのペプトン、１０ｇ／Ｌの酵母エキス、５ｇ／Ｌの塩化ナトリウム）に移し、増幅培養を行い、３７℃、２２０ｒｐｍで、細菌液のＯＤ６００が０．４～０．６になるまで培養した際に、最終濃度０．５ｍＭのＩＰＴＧ（Ｓｉｇｍａ社、カタログ番号：Ｉ５５０２－１Ｇ）を添加し、発現を誘導した。ここで、誘導条件は１８℃、１８０ｒｐｍで２０時間培養した。最後に、遠心分離によって菌体を収集し、－２０℃で保存するか、すぐに次の工程で精製した。
４． 約５０ｍｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．８）（４０ｍＭリン酸二水素ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム）を使用して菌体沈殿物を再懸濁（１Ｌ）させ、高圧細菌破壊装置（ＳＣＩＥＮＴＺ ＢＩＯ社）を使用して細菌を破壊した後、１３０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、封入体から可溶性タンパク質を十分に分離した。
５． カラム容量の５倍の結合バッファー（Ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）（４０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ３、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．８）でＮｉ－ＮＴＡ（Ｑｉａｇｅｎ社、カタログ番号：３０２１０）アフィニティーカラムを平衡化した。次に、タンパク質上清を添加し、４℃で０．５～１時間インキュベートして、目的の組換えタンパク質がカラムに十分に結合させた。さらに、１０ｍＭのイミダゾール（Ｓｉｇｍａ社）を含む洗浄バッファー（ｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）（１０ｍＭのイミダゾール、４０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ３、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．８）２００ｍｌで夾雑タンパク質を洗い流した。ここで、Ｔｒｘタグ付き目的タンパク質が必要な場合は、溶出バッファー（ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）（２５０ｍＭのイミダゾール、４０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ３、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．８）を直接使用して、目的タンパク質Ｔｒｘ－Ｃ１７Ａ３を溶出することができる。また、Ｔｒｘタグを除去した目的タンパク質が必要な場合は、Ｈｉｓタグ付きＴＥＶプロテアーゼを適量で追加し、４℃で１６時間インキュベートした後、フロースルー液として、キャリアタンパク質Ｔｒｘを除去した目的コラーゲンＣ１７Ａ３を収集することができる。
６． 陰イオン交換カラムにより、目的タンパク質を迅速に精製した。目的タンパク質をバッファーＡ（２０ｍＭのＴｒｉｓ、１５ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に透析し、陰イオン交換カラムＨｉｔｒａｐ Ｑ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を通し、バッファーＢ（２０ｍＭのＴｒｉｓ、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０）でグラジエント溶出し、それぞれの溶出画分を収集してタンパク質を検出した。得られた目的タンパク質生成物を一晩透析し、乾燥粉末に凍結乾燥した。
７． 得られたＣ１７Ａ３タンパク質について、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分子量と純度を測定した。具体的な手順は次のとおりである。精製されたタンパク質溶液４０μｌを取り、５×タンパク質ローディングバッファー（２５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ：６．８）、１０％ＳＤＳ、０．５％ブロモフェノールブルー、５０％グリセロール、５％β－メルカプトエタノール）１０μｌを加え、１００℃の沸騰水で１０分間煮沸した後、ウェルあたり１０μｌでＳＤＳ－ＰＡＧＥタンパク質ゲルに加え、電圧８０Ｖで２時間泳動した。その後、タンパク質をクマシーブリリアントブルー染色液（０．１％クマシーブリリアントブルーＲ－２５０、２５％イソプロパノール、１０％氷酢酸）で２０分間染色し、さらにタンパク質脱染色液（１０％酢酸、５％エタノール）を使用して脱染色した。最後に、天然ヒトコラーゲンと比較してタンパク質活性を測定した。
Ｃ１７Ｂ３遺伝子発現ベクターの構築および発現
１．実施例２で使用されたヒト由来コラーゲンＣ１７Ｂ３の全長遺伝子配列を配列番号７に示す。なお、この配列は、大腸菌のコドンに対してコドン最適化を実施したものである。
２． Ｃ１７Ｂ３遺伝子の全長は５６７ｂｐであり、最適化されたＣ１７Ｂ３コドン遺伝子配列である配列番号７に基いて、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｓｈｅｎｇｙｕａｎ Ｋｅｍｅｎｇ Ｇｅｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社に依頼して遺伝子断片を合成したものであり、合成されたＣ１７Ｂ３遺伝子断片をＴｅｖプロテアーゼ切断部位にリンクした後、ＫｐｎＩおよびＸｈｏＩの酵素切断部位を介してＰＥＴ３２ａ発現ベクター（中国科学院生物物理研究所から提供）に挿入した。この構築された発現プラスミドは、大腸菌コンピテントセルＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｍｅｒｃｋ社）に形質転換された。具体的な手順は次のとおりである。１：このプラスミド１μｌを１００μｌの大腸菌コンピテントセルＢＬ２１（ＤＥ３）に取り、氷上で３０分間放置した。２：この混合物を４２℃の水浴で９０秒間熱ショックを与えた後、速やかに氷の上に２分間放置した。３：この混合物に６００μｌの耐性が生じないＬＢを加え、３７℃、２２０ｒｐｍの条件で１時間培養した。４：この細菌液を２００μｌ取り、アンピシリン耐性が生じるＬＢプレート（１０ｇ／Ｌのペプトン、５ｇ／Ｌの酵母エキス、１０ｇ／Ｌの塩化ナトリウム、１５ｇ／Ｌの寒天、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン抗生物質）に均一にコーティングした。５：はっきりと見えるコロニーが成長するまで、プレートを逆さまにして３７℃のインキュベーターで約２０時間培養した。
３． 形質転換されたＬＢプレートから単一のコロニーを選び、１０ｍｌのＬＢ（１００μｇ／ｍｌアンピシリン抗生物質を含む）培地で１２～１６時間培養した後、１：１００の比率で２×ＹＴ培地（１６ｇ／Ｌのペプトン、１０ｇ／Ｌの酵母エキス、５ｇ／Ｌの塩化ナトリウム）に移し、増幅培養を行い、３７℃、２２０ｒｐｍで、細菌液のＯＤ６００が０．４～０．６になるまで培養した際に、最終濃度０．５ｍＭのＩＰＴＧ（Ｓｉｇｍａ社、カタログ番号：Ｉ５５０２－１Ｇ）を添加し、発現を誘導した。最後に、遠心分離によって菌体を収集し、－２０℃で保存するか、すぐに次の工程で精製した。
４． 約５０ｍｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．８）（４０ｍＭリン酸二水素ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム）を使用して菌体沈殿物を再懸濁（１Ｌ）させ、高圧細菌破壊装置（ＳＣＩＥＮＴＺ ＢＩＯ社）を使用して細菌を破壊した後、１３０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、封入体から可溶性タンパク質を十分に分離した。
５． カラム容量の５倍の結合バッファー（Ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）（４０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ３、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．８）でＮｉ－ＮＴＡ（Ｑｉａｇｅｎ社、カタログ番号：３０２１０）アフィニティーカラムを平衡化した。次に、タンパク質上清を添加し、４℃で０．５～１時間インキュベートして、目的の組換えタンパク質がカラムに十分に結合させた。さらに、１０ｍＭのイミダゾール（Ｓｉｇｍａ社）を含む洗浄バッファー（ｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）（１０ｍＭのイミダゾール、４０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ３、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．８）２００ｍｌで夾雑タンパク質を洗い流した。ここで、Ｔｒｘタグ付き目的タンパク質が必要な場合は、溶出バッファー（ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）（２５０ｍＭのイミダゾール、４０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ３、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．８）を直接使用して、目的タンパク質Ｔｒｘ－Ｃ１７Ｂ３を溶出することができる。また、Ｔｒｘタグを除去した目的タンパク質が必要な場合は、Ｈｉｓタグ付きＴＥＶプロテアーゼを適量で追加し、４℃で１６時間インキュベートした後、フロースルー液として、キャリアタンパク質Ｔｒｘを除去した目的コラーゲンＣ１７Ｂ３を収集することができる。
６． 陰イオン交換カラムにより、目的タンパク質を迅速に精製した。目的タンパク質をバッファーＡ（２０ｍＭのＴｒｉｓ、１５ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に透析し、陰イオン交換カラムＨｉｔｒａｐ Ｑ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を通し、バッファーＢ（２０ｍＭのＴｒｉｓ、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０）でグラジエント溶出し、それぞれの溶出画分を収集してタンパク質を検出した。得られた目的タンパク質生成物を一晩透析し、乾燥粉末に凍結乾燥した。
７． 得られたＣ１７Ｂ３タンパク質について、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分子量と純度を測定した。精製されたタンパク質溶液４０μｌを取り、５×タンパク質ローディングバッファー（２５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ：６．８）、１０％ＳＤＳ、０．５％ブロモフェノールブルー、５０％グリセロール、５％β－メルカプトエタノール）１０μｌを加え、１００℃の沸騰水で１０分間煮沸した後、ウェルあたり１０μｌでＳＤＳ－ＰＡＧＥタンパク質ゲルに加え、電圧８０Ｖで２時間泳動した。その後、タンパク質をクマシーブリリアントブルー染色液（０．１％クマシーブリリアントブルーＲ－２５０、２５％イソプロパノール、１０％氷酢酸）で２０分間染色し、さらにタンパク質脱染色液（１０％酢酸、５％エタノール）を使用して脱染色した。最後に、天然ヒトコラーゲンと比較してタンパク質活性を測定した。
Ｃ１７Ｃ１遺伝子発現ベクターの構築および発現
１． 実施例２で使用されたヒト由来コラーゲンＣ１７Ｃ１の全長遺伝子配列を配列番号８に示す。なお、この配列は、大腸菌のコドンに対してコドン最適化を実施したものである。
２． Ｃ１７Ｃ１遺伝子の全長は３５７ｂｐであり、最適化されたＣ１７Ｃ１コドン遺伝子配列である配列番号８に基いて、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｓｈｅｎｇｙｕａｎ Ｋｅｍｅｎｇ Ｇｅｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社に依頼して遺伝子断片を合成したものであり、合成されたＣ１７Ｃ１遺伝子断片をＴｅｖプロテアーゼ切断部位にリンクした後、ＫｐｎＩおよびＸｈｏＩの酵素切断部位を介してＰＥＴ３２ａ発現ベクター（中国科学院生物物理研究所から提供）に挿入した。この構築された発現プラスミドは、大腸菌コンピテントセルＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｍｅｒｃｋ社）に形質転換された。具体的な手順は次のとおりである。１：このプラスミド１μｌを１００μｌの大腸菌コンピテントセルＢＬ２１（ＤＥ３）に取り、氷上で３０分間放置した。２：この混合物を４２℃の水浴で９０秒間熱ショックを与えた後、速やかに氷の上に２分間放置した。３：この混合物に６００μｌの耐性が生じないＬＢを加え、３７℃、２２０ｒｐｍの条件で１時間培養した。４：この細菌液を２００μｌ取り、アンピシリン耐性が生じるＬＢプレート（１０ｇ／Ｌのペプトン、５ｇ／Ｌの酵母エキス、１０ｇ／Ｌの塩化ナトリウム、１５ｇ／Ｌの寒天、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン抗生物質）に均一にコーティングした。５：はっきりと見えるコロニーが成長するまで、プレートを逆さまにして３７℃のインキュベーターで約２０時間培養した。
３． 形質転換されたＬＢプレートから単一のコロニーを選び、１０ｍｌのＬＢ（１００μｇ／ｍｌアンピシリン抗生物質を含む）培地で１２～１６時間培養した後、１：１００の比率で２×ＹＴ培地（１６ｇ／Ｌのペプトン、１０ｇ／Ｌの酵母エキス、５ｇ／Ｌの塩化ナトリウム）に移し、増幅培養を行い、３７℃、２２０ｒｐｍで、細菌液のＯＤ６００が０．４～０．６になるまで培養した際に、最終濃度０．５ｍＭのＩＰＴＧ（Ｓｉｇｍａ社、カタログ番号：Ｉ５５０２－１Ｇ）を添加し、発現を誘導した。最後に、遠心分離によって菌体を収集し、－２０℃で保存するか、すぐに次の工程で精製した。
４． 約５０ｍｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．８）（４０ｍＭリン酸二水素ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム）を使用して菌体沈殿物を再懸濁（１Ｌ）させ、高圧細菌破壊装置（ＳＣＩＥＮＴＺ ＢＩＯ社）を使用して細菌を破壊した後、１３０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、封入体から可溶性タンパク質を十分に分離した。
５． カラム容量の５倍の結合バッファー（Ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）（４０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ３、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．８）でＮｉ－ＮＴＡ（Ｑｉａｇｅｎ社、カタログ番号：３０２１０）アフィニティーカラムを平衡化した。次に、タンパク質上清を添加し、４℃で０．５～１時間インキュベートして、目的の組換えタンパク質がカラムに十分に結合させた。さらに、１０ｍＭのイミダゾール（Ｓｉｇｍａ社）を含む洗浄バッファー（ｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）（１０ｍＭのイミダゾール、４０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ３、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．８）２００ｍｌで夾雑タンパク質を洗い流した。ここで、Ｔｒｘタグ付き目的タンパク質が必要な場合は、溶出バッファー（ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）（２５０ｍＭのイミダゾール、４０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ３、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．８）を直接使用して、目的タンパク質Ｔｒｘ－Ｃ１７Ｃ１を溶出することができる。また、Ｔｒｘタグを除去した目的タンパク質が必要な場合は、Ｈｉｓタグ付きＴＥＶプロテアーゼを適量で追加し、４℃で１６時間インキュベートした後、フロースルー液として、キャリアタンパク質Ｔｒｘを除去した目的コラーゲンＣ１７Ｃ１を収集することができる。
６． 陰イオン交換カラムにより、目的タンパク質を迅速に精製した。目的タンパク質をバッファーＡ（２０ｍＭのＴｒｉｓ、１５ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に透析し、陰イオン交換カラムＨｉｔｒａｐ Ｑ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を通し、バッファーＢ（２０ｍＭのＴｒｉｓ、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０）でグラジエント溶出し、それぞれの溶出画分を収集してタンパク質を検出した。得られた目的タンパク質生成物を一晩透析し、乾燥粉末に凍結乾燥した。
７． 得られたＣ１７Ｃ１タンパク質について、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分子量と純度を測定した。具体的な手順は次のとおりである。精製されたタンパク質溶液４０μｌを取り、５×タンパク質ローディングバッファー（２５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ：６．８）、１０％ＳＤＳ、０．５％ブロモフェノールブルー、５０％グリセロール、５％β－メルカプトエタノール）１０μｌを加え、１００℃の沸騰水で１０分間煮沸した後、ウェルあたり１０μｌでＳＤＳ－ＰＡＧＥタンパク質ゲルに加え、電圧８０Ｖで２時間泳動した。その後、タンパク質をクマシーブリリアントブルー染色液（０．１％クマシーブリリアントブルーＲ－２５０、２５％イソプロパノール、１０％氷酢酸）で２０分間染色し、さらにタンパク質脱染色液（１０％酢酸、５％エタノール）を使用して脱染色した。最後に、天然ヒトコラーゲンと比較してタンパク質活性を測定した。
結果
図２～４の電気泳動図は、それぞれ、見かけの分子量が４２ｋＤａ、４０ｋＤａおよび３２ｋＤａであるＴｒｘ－Ｃ１７Ａ３、Ｔｒｘ－Ｃ１７Ｂ３およびＴｒｘ－Ｃ１７Ｃ１の融合タンパク質が得られたことを示している。
図５～７の電気泳動図は、それぞれ、見かけの分子量が２５ｋＤａ、２３ｋＤａおよび１６ｋＤａであるＣ１７Ａ３、Ｃ１７Ｂ３およびＣ１７Ｃ１の融合タンパク質が得られたことを示している。
実施例２ Ｃ１７Ａ３、Ｃ１７Ｂ３、Ｃ１７Ｃ１タンパク質の細胞接着活性の検出
コラーゲンの活性の検出方法について、文献Ｊｕｍｉｎｇ Ｙａｏ，Ｓａｔｏｓｈｉ Ｙａｎａｇｉｓａｗａ，Ｔｅｔｓｕｏ Ａｓａｋｕｒａ，Ｄｅｓｉｇｎ，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｌｌａｇｅｎ－Ｌｉｋｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓｉｖｅ ａｎｄ Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ Ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ Ｎａｔｉｖｅ Ｃｏｌｌａｇｅｎｓ，Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３６，６４３－６４９（２００４）を参照する。具体的な実施方法は以下のとおりです。
１． 対照ヒトコラーゲン（Ｓｉｇｍａ、Ｃ７７７４）、Ｃ１７Ａ３、Ｃ１７Ａ１（配列番号１、Ｃ１７Ａ３と同じ方法で調製された）、Ｃ１７Ｂ３、Ｃ１７Ｂ１（配列番号２、Ｃ１７Ｂ３と同じ方法で調製された）、Ｃ１７Ｃ１タンパク質サンプルを含む、検出するタンパク質サンプルの濃度を、紫外線（ＵＶ）吸収法を利用して検出する。具体的には、２１５ｎｍと２２５ｎｍにおけるサンプルのＵＶ吸収をそれぞれ測定し、実験式Ｃ（μｇ／ｍＬ）＝１４４×（Ａ２１５－Ａ２２５）によってタンパク質濃度を算出した。なお、Ａ２１５＜１．５で検出する必要がある。この方法の原理は、遠紫外線光におけるペプチド結合の特徴的な吸収を測定することである。この方法は、発色団の含有量に影響されず、干渉物質が少なく、操作が簡単で、クマシーブリリアントブルーで着色されていないヒトコラーゲンおよびその類似物の検出に適している。（参考文献Ｗａｌｋｅｒ ＪＭ．Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ．４３－４５）。タンパク質濃度を測定した後、検出するすべてのタンパク質の濃度をＰＢＳで０．５ｍｇ／ｍｌに調整した。
２． ９６ウェルプレートに、１００μｌの各タンパク質溶液とブランク対照のＰＢＳ溶液を加え、室温で６０ｍｉｎ放置した。
３． １０５個のよく培養された３Ｔ３細胞（清華大学のＴｏｎｇ Ｐｅｉ先生から提供）を各ウェルに加え、３７℃で６０分間インキュベートした。
４． 各ウェルをＰＢＳで４回洗浄した。
５． ＬＤＨ検出キット（Ｒｏｃｈｅ、０４７４４９２６００１）を使用してＯＤ４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。なお、ＯＤ４９２ｎｍにおける吸光度は、コラーゲンまたはその断片の細胞接着活性を反映することができる。タンパク質の細胞接着活性が高いほど、短時間で高品質の外部環境を細胞に提供し、細胞が壁に接着することに寄与する。
結果を図８～１０に示す。図８～１０は、３回の並行実験のＯＤ４９２ｎｍの平均値および標準誤差に基づいてプロットしたものである。
図８～１０の結果は、３つのヒト組換えコラーゲン（即ち、Ｃ１７Ａ３、Ｃ１７Ｂ３、Ｃ１７Ｃ１）が、いずれも市販のヒトコラーゲンと比較して良好な細胞接着活性を有することを示している。
配列
配列番号１（Ｃ１７Ａ）
GSPGPKGDMGSPGPKGDRGFPGTPGIPGPLGHPGPQGPKGQKGSVGDPGMEGPMGQRGREGPMGPRGEA
配列番号２（Ｃ１７Ｂ）
GLQGLRGEVGLPGVKGDKGPMGPPGPKGDQGEKGPRGLTGEPGMRGLPGAVGEPGAKGAMGPA
配列番号３（Ｃ１７Ｃ１）
GADFAGDLDYNELAVRVSESMQRQGLLQGMAYTVQGPPGQPGPQGPPGISKVFSAYSNVTADLMDFFQTYGAIQGPPGQKGEMGTPGPKGDRGPAGPPGHPGPPGPRGHKGEKGDKGDQ
配列番号４（Ｃ１７Ａ３）
GSPGPKGDMGSPGPKGDRGFPGTPGIPGPLGHPGPQGPKGQKGSVGDPGMEGPMGQRGREGPMGPRGEAGSPGPKGDMGSPGPKGDRGFPGTPGIPGPLGHPGPQGPKGQKGSVGDPGMEGPMGQRGREGPMGPRGEAGSPGPKGDMGSPGPKGDRGFPGTPGIPGPLGHPGPQGPKGQKGSVGDPGMEGPMGQRGREGPMGPRGEA
配列番号５（Ｃ１７Ａ３－ＤＮＡ）
GGTAGCCCAGGTCCAAAAGGTGATATGGGAAGCCCAGGTCCGAAAGGTGATCGTGGTTTTCCGGGTACACCAGGTATTCCGGGTCCACTGGGTCATCCAGGTCCGCAAGGTCCGAAAGGCCAGAAAGGTAGCGTGGGTGATCCGGGTATGGAAGGGCCTATGGGGCAGCGTGGGCGTGAAGGGCCGATGGGTCCGCGTGGTGAAGCAGGTAGCCCGGGGCCTAAAGGGGATATGGGGAGTCCGGGTCCGAAAGGGGATCGTGGATTTCCGGGTACGCCGGGTATCCCGGGTCCGCTGGGTCATCCGGGTCCGCAAGGGCCTAAAGGTCAGAAAGGTAGTGTGGGTGATCCTGGTATGGAAGGTCCGATGGGTCAGCGTGGTCGTGAGGGTCCGATGGGACCGCGTGGTGAGGCTGGTAGCCCTGGTCCGAAAGGAGATATGGGTAGCCCGGGTCCGAAAGGTGACCGTGGTTTTCCTGGTACACCGGGTATTCCAGGGCCTCTGGGTCATCCTGGTCCTCAGGGTCCGAAAGGTCAGAAAGGGAGTGTGGGAGATCCGGGTATGGAGGGTCCGATGGGGCAGCGCGGTCGTGAAGGTCCGATGGGCCCGCGTGGTGAAGCC
配列番号６（Ｃ１７Ｂ３）
GLQGLRGEVGLPGVKGDKGPMGPPGPKGDQGEKGPRGLTGEPGMRGLPGAVGEPGAKGAMGPAGLQGLRGEVGLPGVKGDKGPMGPPGPKGDQGEKGPRGLTGEPGMRGLPGAVGEPGAKGAMGPAGLQGLRGEVGLPGVKGDKGPMGPPGPKGDQGEKGPRGLTGEPGMRGLPGAVGEPGAKGAMGPA
配列番号７（Ｃ１７Ｂ３－ＤＮＡ）
GGTCTGCAGGGTCTGCGTGGTGAAGTAGGACTGCCGGGTGTGAAAGGAGATAAAGGACCAATGGGTCCACCAGGACCAAAAGGAGATCAAGGAGAAAAAGGACCACGTGGTCTGACAGGTGAACCGGGTATGCGTGGGCTGCCGGGAGCAGTTGGAGAACCGGGAGCAAAAGGAGCAATGGGTCCAGCAGGACTGCAGGGTCTGCGCGGTGAAGTGGGACTGCCTGGTGTTAAAGGGGATAAAGGGCCGATGGGTCCGCCGGGTCCGAAAGGAGATCAGGGAGAAAAAGGGCCGCGTGGTCTGACCGGTGAACCGGGAATGCGTGGTCTGCCGGGGGCTGTGGGTGAGCCAGGTGCAAAAGGTGCAATGGGTCCTGCAGGTCTGCAAGGACTGCGTGGAGAAGTGGGTCTGCCTGGTGTGAAAGGTGATAAAGGTCCGATGGGTCCTCCGGGTCCGAAAGGTGATCAGGGTGAAAAAGGTCCGCGTGGTCTGACGGGTGAACCGGGCATGCGTGGTCTGCCTGGGGCAGTTGGTGAACCGGGGGCAAAAGGTGCTATGGGGCCGGCA
配列番号８（Ｃ１７Ｃ１－ＤＮＡ）
GGTGCAGATTTTGCAGGTGATCTGGATTATAATGAACTGGCAGTTCGTGTTAGCGAAAGCATGCAGCGTCAGGGACTGCTGCAGGGAATGGCATATACCGTTCAGGGTCCGCCGGGTCAGCCGGGTCCTCAAGGTCCTCCTGGTATTAGCAAAGTTTTTAGTGCATATTCAAACGTGACGGCAGATCTGATGGATTTTTTTCAGACGTATGGTGCAATTCAGGGTCCTCCTGGGCAAAAAGGTGAAATGGGTACACCTGGTCCGAAAGGCGATCGTGGTCCGGCCGGTCCGCCGGGCCACCCTGGTCCTCCTGGCCCTCGTGGTCATAAAGGTGAGAAAGGTGATAAAGGTGATCAA
配列番号９（ＣＯＬ１７Ａ１）
MDVTKKNKRDGTEVTERIVTETVTTRLTSLPPKGGTSNGYAKTASLGGGSRLEKQSLTHGSSGYINSTGSTRGHASTSSYRRAHSPASTLPNSPGSTFERKTHVTRHAYEGSSSGNSSPEYPRKEFASSSTRGRSQTRESEIRVRLQSASPSTRWTELDDVKRLLKGSRSASVSPTRNSSNTLPIPKKGTVETKIVTASSQSVSGTYDATILDANLPSHVWSSTLPAGSSMGTYHNNMTTQSSSLLNTNAYSAGSVFGVPNNMASCSPTLHPGLSTSSSVFGMQNNLAPSLTTLSHGTTTTSTAYGVKKNMPQSPAAVNTGVSTSAACTTSVQSDDLLHKDCKFLILEKDNTPAKKEMELLIMTKDSGKVFTASPASIAATSFSEDTLKKEKQAAYNADSGLKAEANGDLKTVSTKGKTTTADIHSYGSSGGGGSGGGGGVGGAGGGPWGPAPAWCPCGSCCSWWKWLLGLLLTWLLLLGLLFGLIALAEEVRKLKARVDELERIRRSILPYGDSMDRIEKDRLQGMAPAAGADLDKIGLHSDSQEELWMFVRKKLMMEQENGNLRGSPGPKGDMGSPGPKGDRGFPGTPGIPGPLGHPGPQGPKGQKGSVGDPGMEGPMGQRGREGPMGPRGEAGPPGSGEKGERGAAGEPGPHGPPGVPGSVGPKGSSGSPGPQGPPGPVGLQGLRGEVGLPGVKGDKGPMGPPGPKGDQGEKGPRGLTGEPGMRGLPGAVGEPGAKGAMGPAGPDGHQGPRGEQGLTGMPGIRGPPGPSGDPGKPGLTGPQGPQGLPGTPGRPGIKGEPGAPGKIVTSEGSSMLTVPGPPGPPGAMGPPGPPGAPGPAGPAGLPGHQEVLNLQGPPGPPGPRGPPGPSIPGPPGPRGPPGEGLPGPPGPPGSFLSNSETFLSGPPGPPGPPGPKGDQGPPGPRGHQGEQGLPGFSTSGSSSFGLNLQGPPGPPGPQGPKGDKGDPGVPGALGIPSGPSEGGSSSTMYVSGPPGPPGPPGPPGSISSSGQEIQQYISEYMQSDSIRSYLSGVQGPPGPPGPPGPVTTITGETFDYSELASHVVSYLRTSGYGVSLFSSSISSEDILAVLQRDDVRQYLRQYLMGPRGPPGPPGASGDGSLLSLDYAELSSRILSYMSSSGISIGLPGPPGPPGLPGTSYEELLSLLRGSEFRGIVGPPGPPGPPGIPGNVWSSISVEDLSSYLHTAGLSFIPGPPGPPGPPGPRGPPGVSGALATYAAENSDSFRSELISYLTSPDVRSFIVGPPGPPGPQGPPGDSRLLSTDASHSRGSSSSSHSSSVRRGSSYSSSMSTGGGGAGSLGAGGAFGEAAGDRGPYGTDIGPGGGYGAAAEGGMYAGNGGLLGADFAGDLDYNELAVRVSESMQRQGLLQGMAYTVQGPPGQPGPQGPPGISKVFSAYSNVTADLMDFFQTYGAIQGPPGQKGEMGTPGPKGDRGPAGPPGHPGPPGPRGHKGEKGDKGDQVYAGRRRRRSIAVKP

Claims (9)

  1. （Ａ） ｍ に示す配列からなるポリペプチドであって、
    各Ａは、配列番号１、配列番号２および配列番号３のいずれか１つに示すアミノ酸配列から選択され、或いは配列番号１、配列番号２および配列番号３のいずれか１つにおいて１個～５個のアミノ酸残基が置換、付加または欠失されたアミノ酸配列であり、或いは配列番号１、配列番号２および配列番号３のいずれか１つに示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％または９７％の配列同一性を有する配列であり；ｍは１～１０の整数であり；各Ａは同じでも異なっていてもよく、隣接する２つのＡはペプチド結合によって直接結合されるか、または１個以上のアミノ酸残基によって結合され；細胞接着活性を有するポリペプチド。
  2. 配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号６に示すアミノ酸配列からなる、
    請求項１に記載のポリペプチド。
  3. 請求項１～２のいずれか１つに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、
    好ましくは、配列番号５、配列番号７または配列番号８に示すヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチド。
  4. 請求項３に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
  5. 請求項４に記載の発現ベクターを含む、または請求項１～２のいずれか１つに記載のポリペプチドを発現する宿主細胞であって、
    好ましくは大腸菌細胞である、宿主細胞。
  6. 請求項１～２のいずれか１つに記載のポリペプチドを製造する方法であって、
    （１）生産培地で請求項５に記載の宿主細胞を培養すること；
    （２）宿主細胞から請求項１～２のいずれか１つに記載のポリペプチドを分離すること
    を含む、方法。
  7. 請求項１～２のいずれか１つに記載のポリペプチド、または請求項６の方法に従って製造されたポリペプチドを含む、組成物。
  8. 請求項１～２のいずれか１つに記載のポリペプチド、または請求項６に記載の方法に従って製造されたポリペプチド、または請求項７に記載の組成物を含む製品であって、
    前記製品は医薬組成物、医療機器、組織工学製品、化粧品またはヘルスケア製品であり、
    好ましくは、前記医薬組成物は外用剤であり、好ましくは、例えば外用ゲル剤または外用浸潤製剤のような外用塗抹製剤であり；好ましくは、前記外用ゲル剤は、薬学的に許容される担体をさらに含み、前記外用浸潤製剤は、滅菌医療用コットンボールをさらに含む、製品。
  9. 製品、好ましくは、医療機器、組織工学製品、化粧品、ヘルスケア製品の製造における、請求項１～２のいずれか１つに記載のポリペプチド、または請求項６の方法に従って製造されたポリペプチド、請求項３に記載のポリヌクレオチド、請求項４に記載の発現ベクター、請求項５に記載の宿主細胞、または請求項７に記載の組成物の使用。
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