CN112359103B - 人皮肤衰老的分子标志物和调控靶标及其应用 - Google Patents

人皮肤衰老的分子标志物和调控靶标及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112359103B
CN112359103B CN202011245282.3A CN202011245282A CN112359103B CN 112359103 B CN112359103 B CN 112359103B CN 202011245282 A CN202011245282 A CN 202011245282A CN 112359103 B CN112359103 B CN 112359103B
Authority
CN
China
Prior art keywords
cells
human
detecting
basal cells
basal
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202011245282.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112359103A (zh
Inventor
刘光慧
曲静
张维绮
邹治然
龙笑
赵倩
郑彦东
宋默识
王思
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Zoology of CAS
Original Assignee
Institute of Zoology of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Zoology of CAS filed Critical Institute of Zoology of CAS
Priority to CN202011245282.3A priority Critical patent/CN112359103B/zh
Publication of CN112359103A publication Critical patent/CN112359103A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112359103B publication Critical patent/CN112359103B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/13—Amines
    • A61K31/155—Amidines (), e.g. guanidine (H2N—C(=NH)—NH2), isourea (N=C(OH)—NH2), isothiourea (—N=C(SH)—NH2)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/35—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom
    • A61K31/352—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom condensed with carbocyclic rings, e.g. methantheline 
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/365—Lactones
    • A61K31/375—Ascorbic acid, i.e. vitamin C; Salts thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/18—Antioxidants, e.g. antiradicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了人皮肤衰老的分子标志物和调控靶标及其应用。本发明的发明人通过构建并分析人皮肤测序文库及免疫荧光检测，发现COL17A1、IGFBP3、POSTN、CYP27A1可以作为标志物鉴定或辅助鉴定表皮基底细胞，HES1可以作为标志物区分衰老成纤维细胞和年轻成纤维细胞KLF6可以作为标志物区分衰老表皮基底细胞和年轻表皮基底细胞。利用上述标志物可以评估基底细胞癌、乏脂性湿疹等皮肤衰老相关疾病。本发明具有重要的应用价值。

Description

人皮肤衰老的分子标志物和调控靶标及其应用
技术领域
本发明涉及生物医学领域中，人皮肤衰老的分子标志物和调控靶标及其应用。
背景技术
皮肤是人体最大的器官，也是人体抵抗外界刺激的天然屏障。皮肤的衰老是人体衰老的重要特征。皮肤衰老会导致皮肤相关疾病的发生，例如乏脂性湿疹，黑色素细胞瘤，基底细胞瘤等这些疾病，严重影响给人们的生命健康。虽然已经有很多关于皮肤衰老的研究报道，但是关于人的皮肤衰老的内在机制还有待探究。因此，深入解析皮肤衰老过程的细胞分子机制，可以为延缓皮肤衰老和皮肤衰老相关疾病发生的下降提供重要的可干预的靶向细胞以及关键调控分子，进而为延缓皮肤衰老及相关疾病的干预策略提供重要的理论依据。寻找皮肤细胞标志物，皮肤细胞衰老标志物以及其干预手段，同时也为我们保持健康衰老提供了重要的线索。
发明内容
本发明的目的是提供一组人皮肤衰老的分子标志物与调控靶标及其应用。
本发明首先提供来了用于检测COL17A1(17型胶原蛋白α链，collagen type XVIIalpha 1chain)基因、IGFBP3(胰岛素类似生长因子结合蛋白3，Insulin Like GrowthFactor Binding Protein 3)基因、POSTN(骨膜素，Periostin)基因、CYP27A(细胞色素450家族27号亚家族1号，Cytochrome P450 Family 27Subfamily A Member1)1基因、KLF6(Kruppel类似因子6，Kruppel Like Factor 6)基因和HES1(Hes家族BHLH转录因子1，HesFamily BHLH Transcription Factor 1)基因这六种基因中至少一种物质的下述任一应用：
X1、制备检测或辅助检测人表皮基底细胞产品；
X2、检测或辅助检测人表皮基底细胞；
X3、制备筛选或辅助筛选人表皮基底细胞产品；
X4、筛选或辅助筛选人表皮基底细胞；
X5、制备区分或辅助区分人表皮基底细胞亚群产品；
X6、区分或辅助区分人表皮基底细胞亚群；
X7、制备检测或辅助检测人表皮基底细胞衰老情况产品；
X8、检测或辅助检测人表皮基底细胞衰老情况；
X9、制备检测或辅助检测人真皮成纤维细胞衰老情况产品；
X10、检测或辅助检测人真皮成纤维细胞衰老情况。
本发明还提供了用于检测COL17A1、IGFBP3、POSTN、CYP27A1、KLF6和HES1这六种蛋白质至少一种物质的下述任一应用：
X1、制备检测或辅助检测人表皮基底细胞产品；
X2、检测或辅助检测人表皮基底细胞；
X3、制备筛选或辅助筛选人表皮基底细胞产品；
X4、筛选或辅助筛选人表皮基底细胞；
X5、制备区分或辅助区分人表皮基底细胞亚群产品；
X6、区分或辅助区分人表皮基底细胞亚群；
X7、制备检测或辅助检测人表皮基底细胞衰老情况产品；
X8、检测或辅助检测人表皮基底细胞衰老情况；
X9、制备检测或辅助检测人真皮成纤维细胞衰老情况产品；
X10、检测或辅助检测人真皮成纤维细胞衰老情况。
上文中，用于检测COL17A1、IGFBP3、POSTN、CYP27A1、KLF6和HES1这六种蛋白质中至少一种蛋白质含量的物质为能特异识别相应蛋白质的物质，如抗体。
在本发明的一个实施例中，检测COL17A1、CYP27A1表达量的物质分别为COL17A1抗体、CYP27A1抗体。
本发明还提供了以COL17A1基因、IGFBP3基因、POSTN基因和CYP27A1基因中至少一种为人表皮基底细胞标志物的检测标志物表达的物质的下述任一应用：
X1、制备检测或辅助检测人表皮基底细胞产品；
X2、检测或辅助检测人表皮基底细胞；
X3、制备筛选或辅助筛选人表皮基底细胞产品；
X4、筛选或辅助筛选人表皮基底细胞；
X5、制备区分或辅助区分人表皮基底细胞亚群产品；
X6、区分或辅助区分人表皮基底细胞亚群。
本发明还提供了以KLF6基因为人表皮基底细胞衰老标志物的检测标志物表达的物质的下述任一应用：
X7、制备检测或辅助检测人表皮基底细胞衰老情况产品；
X8、检测或辅助检测人表皮基底细胞衰老情况。
本发明还提供了以HES1基因为人真皮成纤维细胞衰老标志物的检测标志物表达的物质的下述任一应用：
X9、制备检测或辅助检测人真皮成纤维细胞衰老情况产品；
X10、检测或辅助检测人真皮成纤维细胞衰老情况。
本发明还提供了槲皮素、二甲双胍和/或维生素C在制备延缓HES1降低导致的真皮成纤维细胞的衰老产品中的应用。
本发明还提供了下述任一物质：
Y1、检测或辅助检测人表皮基底细胞的物质，为检测COL17A1基因、IGFBP3基因、POSTN基因和CYP27A1基因中至少一种基因表达量的物质，或，检测COL17A1、IGFBP3、POSTN和CYP27A1中至少一种蛋白质含量的物质；
Y2、筛选或辅助筛选人表皮基底细胞的物质，为检测COL17A1基因、IGFBP3基因、POSTN基因和CYP27A1基因中至少一种基因表达量的物质，或，检测COL17A1、IGFBP3、POSTN和CYP27A1中至少一种蛋白质含量的物质；
Y3、区分或辅助区分人表皮基底细胞亚群的物质，为检测COL17A1基因、IGFBP3基因、POSTN基因和CYP27A1基因中至少一种基因表达量的物质，或，检测COL17A1、IGFBP3、POSTN和CYP27A1中至少一种蛋白质含量的物质；
Y4、检测或辅助检测人表皮基底细胞衰老情况的物质，为检测KLF6基因表达量的物质，或，检测KLF6蛋白质含量的物质；
Y5、检测或辅助检测人真皮成纤维细胞衰老情况的物质，为检测HES1基因表达量的物质，或，检测HES1蛋白质含量的物质；
Y6、延缓HES1降低导致的真皮成纤维细胞的衰老的物质，为槲皮素、二甲双胍和/或维生素C。
本发明发现，在所有年龄段皮肤组织中，COL17A1在基底细胞1-3中的表达量在两两之间均有显著差异，且在基底细胞3中表达最低；IGFBP3在基底细胞1与2间、1与3间均具有显著差异，在基底细胞2与3间无显著差异，在基底细胞1中表达最高；POSTN在基底细胞1与2间、2与3间均具有显著差异，在基底细胞1与3间无显著差异，在基底细胞2中表达最高；CYP27A1在基底细胞1与3间、2与3间均具有显著差异，在基底细胞1与2间无显著差异，在基底细胞3中表达最高，图1。
在基底细胞，COL17A1在年老组中的表达量均显著高于另外两组，在年轻与中年组中无显著差异，在年老组中表达量最高；IGFBP3在三组中的表达量两两间均有显著差异，在中年组中的表达量最高；POSTN在中年组与年轻组、中年组与老年组中的表达量均有显著差异，在年轻与年老组中无显著差异，在中年组中的表达量最高；CYP27A1在年老组与中年组、年老组与年轻组中的表达量均有显著差异，在年轻与中年组中无显著差异，在年老组中表达量最高，图2。
此外，在所有年龄段个体皮肤中，与非基底细胞相比，CYP27A1在基底细胞中表达量更高，且有显著差异。
KLF6基因无论是在基底细胞1、基底细胞2还是基底细胞3中，KLF6基因在年轻组中的表达量均显著高于中年组，且在中年组中的表达量均显著高于年老祖，且在年轻组中的表达量均显著高于年老组，图3。
对于年轻组，KLF6基因在三种细胞中的表达量两两之间均有显著差异，且在基底细胞3中表达量最高；对于中年组，KLF6基因在三种细胞中的表达量两两之间也均有显著差异，且在基底细胞3中表达量最高；对于年老组，KLF6基因在三种细胞中的表达量两两之间均有显著差异，且在基底细胞3中表达量最高，图3。
HES1基因在年轻与年老以及年轻与中年的人真皮成纤细胞中的表达均具有显著差异，在中年与年老的人真皮成纤细胞中无显著差异,图6。
槲皮素，二甲双胍和维生素C3这3种小分子化合物处理能够显著的延缓HES1敲低的真皮成纤维细胞的衰老。此外，槲皮素处理还能够延缓由于紫外照射导致的真皮成纤维细胞的衰老，图8。
上文中，用于检测COL17A1基因、IGFBP3基因、POSTN基因、CYP27A1基因、KLF6基因和HES1基因这六种基因中至少一种基因表达量的物质为能特异识别相应基因序列或转录本序列的物质。
其中，基底细胞1是指人基底细胞中高表达表皮干细胞标记物(COL17A1和IGFBP3)的细胞亚群，此处的高表达是指与基底细胞2和基底细胞3相比，表达差异达到显著水平；
基底细胞2是指人基底细胞中高表达一系列转录因子以及炎症因子(POSTN和JUN)的细胞亚群，此处的高表达是指与基底细胞1和基底细胞3相比相比，表达差异达到显著水平；
基底细胞3是指人基底细胞中高表达炎症应激因子(CYP27A1和S100A9)的细胞亚群，此处的高表达是指与基底细胞1和基底细胞2相比，表达差异达到显著水平；
基底细胞4是指人基底细胞中高表达与基底细胞1高表达分子标记物相同的分子标记物且处于增殖状态的细胞亚群，此处的高表达是指与基底细胞5和基底细胞6相比，表达差异达到显著水平；
基底细胞5是指人基底细胞中处于增殖状态且高表达分化相关的分子标记物(KRT10和KRT1)的细胞亚群，此处的高表达是指与基底细胞4和基底细胞6相比，表达差异达到显著水平；
基底细胞6是指人基底细胞中高表达与基底细胞3高表达炎症应激因子相同的分子标记物，且处于增殖状态的细胞亚群，此处的高表达是指与基底细胞4和基底细胞5相比，表达差异达到显著水平。
在本发明的一个实施例中，年轻组为18-23岁，中年组为44-48岁，年老组为70-76岁。
所述人表皮基底细胞可为人眼表皮基底细胞。所述人表皮基底细胞可为人上眼睑表皮基底细胞。
所述人真皮成纤维细胞可为人眼真皮成纤维细胞。所述人真皮成纤维细胞具体可为人上眼睑真皮成纤维细胞。
本发明中所检测的样本可为从人体中分离的皮肤组织样本、其石蜡切片或其冰冻切片。所检测的细胞可为从人体中分离的皮肤组织样本、其石蜡切片或其冰冻切片中的细胞。
本发明还提供了抑制HES1基因表达的物质在制备促进真皮成纤维细胞的衰老产品中的应用。
本发明还提供了促进HES1基因表达或增加HES1基因表达量的物质在制备抑制真皮成纤维细胞的衰老产品中的应用。
本发明的发明人通过构建并分析人皮肤测序文库及免疫荧光检测，发现COL17A1、IGFBP3、POSTN、CYP27A1可以作为标志物鉴定或辅助鉴定表皮基底细胞，HES1可以作为标志物区分衰老成纤维细胞和年轻成纤维细胞KLF6可以作为标志物区分衰老表皮基底细胞和年轻表皮基底细胞。利用上述标志物可以评估基底细胞癌、乏脂性湿疹等皮肤衰老相关疾病。本发明具有重要的应用价值。
附图说明
图1为人表皮基底细胞的分子标记的表达量情况。
图2为人表皮基底细胞的分子标记在年轻，中年，年老组中的表达情况。
图3为免疫荧光鉴定基底细胞亚群3分子标记COL17A1与CYP27A1。A图为COL17A1的检测结果，B图为CYP27A1的检测结果。Bar值＝50微米。
图4左为KLF6在不同基底细胞中年轻，中年，年老的表达情况；右为KLF6在不同年龄段基底细胞1，基底细胞2，基底细胞3的表达的情况。
图5为在人原代表皮角质化细胞中敲低KLF6后进行的一系列实验。A图为用qRT-PCR检测敲低KLF6以后，人原代表皮角化维细胞KLF6 mRNA水平的变化。B图为用衰老相关β半乳糖苷酶实验检测敲低KLF6以后人原代角化细胞中衰老细胞比例的变化。C图为用免疫荧光染色实验检测敲低KLF6以后人原代角化细胞中增殖细胞比例的变化。
图6为衰老人真皮成纤维细胞中衰老过程中下调的核心转录因子，横坐标由左至右依次为年轻、中年和年老。
图7A为Western blot检测在人原代真皮成纤维细胞中敲低HES1，HES1蛋白水平的变化。B用衰老相关β半乳糖苷酶实验检测在人原代真皮成纤维细胞中敲低HES1衰老细胞比例的变化。C为用免疫荧光染色实验检测敲低HES1以后人原代角化细胞中增殖细胞比例的变化。D为Western blot检测在人原代真皮成纤维细胞中过表达HES1，HES1蛋白水平的变化。E用衰老相关β半乳糖苷酶实验检测在人原代真皮成纤维细胞中过表达HES1衰老细胞比例的变化。F为用免疫荧光染色实验检测过表达HES1以后人原代角化细胞中增殖细胞比例的变化。
图8A图为用槲皮素,二甲双胍，维生素C处理HES1敲低的人原代真皮成纤维细胞，用Ki67染色实验揭示成纤维细胞增殖细胞比例的变化。B图为用槲皮素,二甲双胍，维生素C处理HES1敲低的人原代真皮成纤维细胞，用衰老相关β半乳糖苷酶实验检测成纤维细胞增殖衰老比例的变化。C图为用qRT-PCR检测槲皮素处理或者紫外照射以后，人原代真皮成纤维细胞HES1 mRNA水平的变化。D图为用衰老相关β半乳糖苷酶实验检测用槲皮素处理紫外照射的人原代真皮成纤维细胞后衰老细胞比例的变化。E图为用免疫荧光染色实验检测用槲皮素处理紫外照射的人原代真皮成纤维细胞后增殖细胞比例的变化。
*、**、***、****均为显著性分析结果，*表示p<0.05；**表示p<0.01；***表示p<0.001；****表示p<0.0001；ns表示无显著差异。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。
下述实施例中的人皮肤实验是基于《人类的伦理对待准则》进行的，并已通过中国科学院动物研究所的伦理审批。
实施例1、人皮肤基底细胞分子标志物的获得
一、人皮肤单细胞测序
一)、人皮肤细胞悬浮液的获得
根据人皮肤年龄的分布，由3例18-23岁的志愿者皮肤样本组成年轻组，3例44-48岁的志愿者样本组成中年组，3例70-76岁的志愿者样本组成年老组。所有人均无皮肤相关的疾病发生，均属于健康个体，即排除了皮肤癌，皮屑病等皮肤相关疾病的个体。本实验经过了各组人的知情同意。
获得每个人皮肤的细胞悬浮液。具体步骤如下：
1、通过手术从人上眼睑部位取下皮肤组织，放于生理盐水中，随后用PBS冲洗3遍。
2、步骤1完成后，在冰上，把皮肤样本剪碎成1mm×1mm的大小，然后放于装有裂解液(将如下三种试剂混合得到：胶原酶I(GIBCO，Cat#17100-017)：胶原酶IV(GIBCO，Cat#17104-019):0.25％Trypsin-EDTA(GIBCO，Cat#25200-072)＝1:1:2(体积比))的1.5ml EP管中进行裂解，得到裂解混合物。
3、步骤2完成后，把裂解混合液转移到15ml离心管中，随后加入8ml步骤2的裂解液，充分混匀组织裂解混合物。随后放于37℃消化1小时，得到消化裂解物。
4、步骤3完成后，取出消化裂解物，向其中加入15ml含有10％FBS的DMEM培养基中止消化，得到混合液。
5、步骤4完成后，把混合液依次用70μm和40μm细胞筛过滤，随后收集过滤后的含有细胞的液体。随后将所得含有细胞的液体在4℃1200rpm离心5min，收集细胞沉淀，用含10％FBS水溶液(请核实是否为水溶液)重悬细胞。
6、步骤5完成后，用移液枪吸移混合液50-100次，得到细胞悬浮液。所得细胞包括人基底细胞(即基底细胞1-6)和非基底细胞。非基底细胞包括人真皮成纤维细胞，此外还包括巨噬细胞，T细胞，Langerhans细胞，黑色素细胞，有棘细胞，颗粒细胞等细胞。
其中，基底细胞1是指人基底细胞中高表达表皮干细胞标记物(COL17A1和IGFBP3)的细胞亚群，此处的高表达是指与基底细胞2和基底细胞3相比，表达差异达到显著水平；
基底细胞2是指人基底细胞中高表达一系列转录因子以及炎症因子(POSTN和JUN)的细胞亚群，此处的高表达是指与基底细胞1和基底细胞3相比相比，表达差异达到显著水平；
基底细胞3是指人基底细胞中高表达炎症应激因子(CYP27A1和S100A9)的细胞亚群，此处的高表达是指与基底细胞1和基底细胞2相比，表达差异达到显著水平；
基底细胞4是指人基底细胞中高表达与基底细胞1高表达分子标记物相同的分子标记物且处于增殖状态的细胞亚群，此处的高表达是指与基底细胞5和基底细胞6相比，表达差异达到显著水平；
基底细胞5是指人基底细胞中处于增殖状态且高表达分化相关的分子标记物(KRT10和KRT1)的细胞亚群，此处的高表达是指与基底细胞4和基底细胞6相比，表达差异达到显著水平；
基底细胞6是指人基底细胞中高表达与基底细胞3高表达炎症应激因子相同的分子标记物，且处于增殖状态的细胞亚群，此处的高表达是指与基底细胞4和基底细胞5相比，表达差异达到显著水平。
二)、文库的构建与测序
文库构建和测序依照10x genomics公司Single Cell 3’Reagent Kits v2产品实验指导进行，步骤如下：
1.将样品制备成单细胞悬液后，测定细胞活力，使其高于90％，且使细胞浓度保持再700-1200每个样本上样10000个细胞。
2.油珠包裹的琼脂糖凝珠的制备：取细胞悬浮液，Master Mix(75μL)的含有barcode信息的凝胶珠(40μL)和油滴(280μL)分别加入到Chromium Chip B的不同小室，经由微流体“双十字”交叉系统形成油滴包裹的凝胶珠(Gel Bead-In-EMulsions，GEMs)。
3.充分混匀，凝胶珠在每个油滴内自动溶解释放大量Barcode引物序列，细胞裂解释放mRNA，mRNA与逆转录酶、凝胶珠上的poly dT反转录引物以及dNTP底物相接触，在逆转录酶的作用下发生逆转录反应，产生用于测序的带有Barcode和UMI信息的cDNA一链，再以SMART扩增方法完成第二链合成。
4.cNDA片段化油滴破碎，磁珠纯化cDNA一链，然后以cDNA为模板进行PCR扩增。
5.cDNA扩增完成后，首先利用化学方法将cDNA打断成200-300bp左右的片段，通过末端修复、加A进行cDNA片段筛选，P7 adaptor接头连接Read2测序引物，并通过PCR扩增引入样品Index，最后进行片段筛选，从而构建含有P5和P7接头的cDNA文库。
6.文库完成以后，进行库检，cDNA文库库检合格后，直接在Illumina的测序仪上进行测序。测序完成之后，进行数据分析。
二、获得人表皮基底细胞分子标志物COL17A1和CYP27A1
一)、生物信息分析
基于步骤一的测序结果，以人基因组为参考，比对质量控制后的测序数据，统计唯一比对读长，并拆分得到不同的亚细胞群数据。通过Seurat软件包寻找高变异度基因，基于该基因群对所测细胞中的这些基因进行UMAP分析，通过Seurat软件包Find Clusters功能进行聚类以及Seurat软件包find_all_markers功能，获得COL17A1(17型胶原蛋白α链，collagen type XVII alpha 1chain)、IGFBP3(胰岛素类似生长因子结合蛋白3，InsulinLike Growth Factor Binding Protein 3)、POSTN(骨膜素，Periostin)和CYP27A1(细胞色素450家族27号亚家族1号，Cytochrome P450 Family 27Subfamily A Member 1)在部分细胞中的表达情况。
COL17A1在基底细胞1-3中的表达量在两两之间均有显著差异，且在所有年龄段基底细胞3中表达最低；IGFBP3在基底细胞1与2间、1与3间均具有显著差异，在基底细胞2与3间无显著差异，在所有年龄段基底细胞1中表达最高；POSTN在基底细胞1与2间、2与3间均具有显著差异，在基底细胞1与3间无显著差异，在所有年龄段基底细胞2中表达最高；CYP27A1在基底细胞1与3间、2与3间均具有显著差异，在基底细胞1与2间无显著差异，在所有年龄段基底细胞3中表达最高，图1。
COL17A1在基底细胞1中年老组中的表达量均显著高于另外两组，在年轻与中年组中无显著差异，在年老组中表达量最高；IGFBP3在三组中的表达量两两间均有显著差异，在基底细胞2中中年组中的表达量最高；POSTN在中年组与年轻组、中年组与老年组中的表达量均有显著差异，在年轻与年老组中无显著差异，在基底细胞中中年组中的表达量最高；CYP27A1在年老组与中年组、年老组与年轻组中的表达量均有显著差异，在年轻与中年组中无显著差异，在年老组中表达量最高，图2。
此外，与非基底细胞相比，在所有年龄段，CYP27A1在基底细胞中表达量更高，且有显著差异。
二)、免疫荧光检测
1、取18-23岁年龄段的部分皮肤样本，先用4％PFA 4℃固定过夜。随后进行石蜡包埋，切片。
2、步骤1完成后，石蜡切片(约5μm)，置于带正电的载玻片上，先用二甲苯脱蜡(5分钟*3次)。随后用梯度乙醇水溶液进行复水。
3、步骤2完成后，先用PBS缓冲液清洗，再置于pH6.0、10mM的柠檬酸钠缓冲液中，98℃微波加热切片3次(每次5min)，目的为进行抗原修复。
4、完成步骤3后，冷却，然后先将载玻片用PBS缓冲液洗涤3次，再用PBS缓冲液稀释的含有0.4％(v/v)Triton X-100的溶液通透25min，之后室温下用PBS缓冲液稀释的含有10％(v/v)驴血清的封闭缓冲液封闭1h，然后在4℃下用一抗染色过夜。一抗包括鼠抗KRT14(Invitrogen,Cat#MA5-11599)、兔抗COL17A1(Abcam,Cat#ab184996)、兔抗CYP27A1(Abcam,Cat#ab126785)。KRT14用于指示所有基底细胞。
5、完成步骤4后，取所述切片，先用PBS缓冲液充分洗涤，再与相应的二抗在室温下孵育1h。所用二抗为anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488(Invitrogen,Cat#A21206),anti-mouse IgG Alexa Fluor 568(Invitrogen,Cat#A10037)。
6、完成步骤5后，取所述切片，先进行Hoechst 33342染色，再用PBS缓冲液洗涤3次，之后用
Figure BDA0002769776010000091
抗褪色固定介质固定，使用共聚焦激光扫描显微镜(Leica TCSSP5Ⅱ)获得图像。
对年轻个体(18-23岁)的细胞亚群3的免疫荧光检测结果见图3。结果表明，COL17A1和CYP27A1在不同基底细胞亚群中特异表达，COL17A1在基底细胞1和基底细胞4中高表达，在基底细胞3和6中低表达，CYP27A1在基底细胞3和6中高表达，在其他基底细胞中低表达。
上述结果表明，COL17A1和CYP27A1均为不同基底细胞亚群的细胞分子标志物。
三、衰老人表皮角化细胞的分子标志物的获得和检测
一)、生物信息分析获得衰老人表皮基底细胞分子标志物
基于年轻和年老的人表皮基底细胞测序文库，通过Seurat软件包find_all_markers功能获得衰老人表皮基底细胞分子标志物(|log2(fold change)|≥0.5，P<0.05，FDR<0.05)。
具体的，KLF6在年轻与年老以及年轻与中年，中年与年老的人表皮基底细胞1，2和3中的表达均具有显著差异。(图4)
上述结果表明，KLF6为衰老人表皮基底细胞的分子标志物。
二)、实验验证衰老人表皮基底细胞分子标志物缺失对表皮基底细胞的影响
基于以上实验结果，在人原代表皮基底细胞中敲低KLF6，衰老相关β半乳糖苷酶的阳性细胞比例显著上调，Ki67标记的增殖细胞的比例显著降低。说明了KLF6的缺失会加速表皮基底细胞的衰老。(图5)
具体步骤如下：
敲低实验：将包装质粒pMD2.G(Addgene plasmid，#12260)和psPAX2(Addgeneplasmid，#12259)以及重组载体PLVTHM-GL2-KLF6 shRNA转染HEK293T细胞(ATCC,Cat#CRL-1573)，培养48小时后收集培养上清液液，而后用超高速离心机离心收集病毒颗粒得到用于敲低KLF6基因的病毒，测定病毒滴度后在培养人原代真皮成纤维细胞过程中加入用于敲低KLF6基因的病毒继续培养48小时，培养结束后取一部分细胞利用定量PCR检测KLF6表达量，取另一部分细胞采用SA-β-gal染色实验检测衰老相关β半乳糖苷酶的阳性细胞比例，利用未添加病毒培养的人原代角化细胞作为对照。结果显示添加病毒培养的人原代角化细胞(Lonza,Cat#192627)中KLF6的表达量显著下降。
重组载体PLVTHM-GL2-KLF6 shRNA为将利用引物对KLF6#1与引物对KLF6#2分别把靶向作用于KLF6 mRNA片段的siRNA片段整合至PLVTHM载体(Addgene plasmid，#12247)得到的重组载体，该重组载体能用于抑制KLF6的表达。
KLF6#1：
正向引物：CGCGTGCCGTATGATGAGGCCAACTTTTTCAAGAGAAAAGTTGGCCTCATCATACGGCTTTTTTGGAAAT；
反向引物：CGATTTCCAAAAAAGGCAAATCCACTTCACGCTCTCTCTTGAAGAGCGTGAAGTGGATTTGCCA；
KLF6#2：
正向引物：CGCGTGGCTCCCACTGTGACAGGTGTTTTCAAGAGAAACACCTGTCACAGTGGGAGCCTTTTTTGGAAAT；
反向引物：CGATTTCCAAAAAAGGCTCCCACTGTGACAGGTGTTTCTCTTGAAAACACCTGTCACAGTGGGAGCCA。
检测KLF6的表达量所用引物如下：
正向引物：GGCAACAGACCTGCCTAGAG；反向引物：CTCCCGAGCCAGAATGATTTT。
四、衰老人真皮成纤维细胞的分子标志物的获得和检测
一)、生物信息分析获得衰老人真皮成纤维细胞分子标志物
基于年轻和年老的人真皮成纤细胞测序文库，通过Seurat软件包find_all_markers功能获得衰老人真皮成纤细胞分子标志物(|log2(fold change)|≥0.5，P<0.05，FDR<0.05)。
具体的，HES1在年轻与年老以及年轻与中年的人真皮成纤细胞中的表达均具有显著差异，在中年与年老的人真皮成纤细胞中无显著差异。
上述结果表明，HES1为衰老人真皮成纤维细胞的分子标志物。
二)、实验验证衰老人真皮成纤维细胞分子标志物缺失对真皮细胞的影响
基于以上实验结果，在人原代真皮成纤维细胞中敲低HES1，衰老相关β半乳糖苷酶的阳性细胞比例显著上调，说明了HES1的缺失会加速真皮成纤维细胞的衰老。此外，在衰老的人真皮成纤维细胞中过表达HES1,发现过表达HES1能够减低衰老相关β半乳糖苷酶的阳性细胞比例，说明了HES1的回复会延缓真皮成纤维细胞的衰老。(图7)
具体步骤如下：
1敲低实验：将包装质粒pMD2.G(Addgene plasmid，#12260)和psPAX2(Addgeneplasmid，#12259)以及重组载体PLVTHM-GL2-HES1 shRNA转染HEK293T细胞，培养48小时后收集培养上清液液，而后用超高速离心机离心收集病毒颗粒得到用于敲低HES1基因的病毒，测定病毒滴度后在培养人原代真皮成纤维细胞过程中加入用于敲低HES1基因的病毒继续培养48小时，培养结束后取一部分细胞利用定量PCR检测HES1表达量，取另一部分细胞采用SA-β-gal染色实验检测衰老相关β半乳糖苷酶的阳性细胞比例，利用未添加病毒培养的人原代真皮成纤维细胞作为对照。结果显示添加病毒培养的人原代真皮成纤维细胞中HES1的表达量显著下降。
其中，人原代真皮成纤维细胞参考人皮肤单细胞分离的方法。分离的到细胞悬液以后，用相应的培养基换液培养。
重组载体PLVTHM-GL2-HES1 shRNA为将PLVTHM载体(Addgene plasmid，#12247)的MlUI和ClAI间的识别序列替换为包含有GL2和HES1 shRNA片段得到的重组载体。
重组载体PLVTHM-GL2-HES1 shRNA为将利用引物对HES1靶向作用与HES1 mRNA片段的siRNA片段整合至PLVTHM载体(Addgene plasmid，#12247)得到的重组载体，该重组载体能用于抑制HES1的表达。
PCR所用引物：
正向引物：CGCGTGAAAGTCATCAAAGCCTATTTTCAAGAGAAATAGGCTTTGATGACTTTCTTTTTTGGAAAT；
反向引物：CGATTTCCAAAAAAGAAAGTCATCAAAGCCTATTTCTCTTGAAAATAGGCTTTGATGACTTTCA。
检测HES1的表达量所用引物如下：
正向引物：TCAACACGACACCGGATAAAC；反向引物：GCCGCGAGCTATCTTTCTTCA。
2过表达实验：
将包装质粒pMD2.G(Addgene plasmid，#12260)和psPAX2(Addgene plasmid，#12259)以及携带GAL4的重组载体pLE4-GAL4或者携带HES1 cDNA片段的重组载体pLE4-HES1转染HEK293T细胞，培养48小时后收集培养上清液液，而后用超高速离心机离心收集病毒颗粒得到过表达HES1基因的病毒，测定病毒滴度后在培养人原代真皮成纤维细胞过程中加入用于敲低HES1基因的病毒继续培养48小时，培养结束后取一部分细胞利用定量PCR检测HES1表达量，取另一部分细胞采用SA-β-gal染色实验检测衰老相关β半乳糖苷酶的阳性细胞比例，利用未添加病毒培养的人原代真皮成纤维细胞作为对照。结果显示添加病毒培养的人原代真皮成纤维细胞中HES1的表达量显著升高。
其中，重组载体pLE4-GAL4为将pLE4载体(ZKSCAN3 counteracts cellularsenescence by stabilizing heterochromatin，Huifang Hu et al.,Nucleic AcidsResearch,Volume 48,Issue 11,19June 2020,Pages 6001–6018,https://doi.org/10.1093/nar/gkaa425)的BamH I和Mlu I间的识别序列替换为GAL4基因(序列1)得到的重组载体。
重组载体pLE4-HES1为将pLE4载体的BamH I和Mlu I间的识别序列替换为HES1基因(序列2)得到的重组载体。
3其中，qRT-PCR方法如下：
1)收集人原代成纤维细胞或人原代角化细胞；
2)TRIzol(Invitrogen)裂解后，提取总RNA；
3)利用GoScript逆转录系统(Promega)将总RNA中的1-2μg RNA进行反转录为cDNA；
4)进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)并进行分析。
使用CFX384 Real-Time PCR系统(Bio-Rad)，以GAPDH做内参，数据采用ΔΔCq方法进行分析。其中内参GAPDH引物序列为：
正向引物：GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT；反向引物：GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG。
4Western blot检测：对人原代成纤维细胞进行提取，利用western-blot检测细胞表达的蛋白质。
抗体信息：Western blot所用一抗为重组Anti-Hes1抗体[EPR4226](ab108937)(abcam),内参为β-tubulin抗体(Santa Cruz，sc-5274)。
5SA-β-gal染色实验
洗一遍。加入X-gal染色液(Amresco)，在37℃过夜孵育，随后进行拍照观察，用Image J进行统计分析。
三)、槲皮素等小分子化合物处理对衰老人真皮成纤维细胞的影响
为了研究是否有小分子能够延缓真皮的衰老，发明人利用槲皮素，二甲双胍和维生素C等处理HES1敲低的真皮成纤维细胞，结果发现处理以后，真皮成纤维细胞的增殖细胞比例显著上调。说明此类小分子化合物可能能够延缓真成纤维细胞的衰老。此外，还发现，槲皮素处理可以回复紫外照射导致的HES1缺失诱发的真皮成纤维细胞的衰老(图8)。
具体步骤如下：
1)细胞免疫荧光染色
取出细胞样品，用PBS洗一遍，随后用4％PFA固定15分钟。用PBS洗3遍，随后用含0.4％Triton的PBS通透30分钟。紧接着用10％驴血清封闭一小时，一抗(anti-Ki67，Cat#ab15580)4℃孵育过夜，用PBS洗3遍以后，二抗(anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488，Cat#A21206)室温孵育1小时，随后用PBS洗3遍，并进行封片。最后进行拍照分析。
2)小分子药物处理实验
HES1敲低的细胞以5×104个细胞/孔种在6孔板中，24小时后，用含槲皮素(300
μM)，二甲双胍(100μM)和维生素C(560μM)的培养基进行换液。细胞连续用小分子化合物处理一个星期，每两天换一次液。随后用于免疫荧光和SA-β-gal染色实验。紫外照射处理实验，紫外线的照射强度是1mJ/cm2。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 中国科学院动物研究所
<120> 人皮肤衰老的分子标志物和调控靶标及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 444
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
atgaagctac tgtcttctat cgaacaagca tgcgatattt gccgacttaa aaagctcaag 60
tgctccaaag aaaaaccgaa gtgcgccaag tgtctgaaga acaactggga gtgtcgctac 120
tctcccaaaa ccaaaaggtc tccgctgact agggcacatc tgacagaagt ggaatcaagg 180
ctagaaagac tggaacagct atttctactg atttttcctc gagaagacct tgacatgatt 240
ttgaaaatgg attctttaca ggatataaaa gcattgttaa caggattatt tgtacaagat 300
aatgtgaata aagatgccgt cacagataga ttggcttcag tggagactga tatgcctcta 360
acattgagac agcatagaat aagtgcgaca tcatcatcgg aagagagtag taacaaaggt 420
caaagacagt tgactgtatc gtag 444
<210> 2
<211> 843
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
atgccagctg atataatgga gaaaaattcc tcgtccccgg tggctgctac cccagccagt 60
gtcaacacga caccggataa accaaagaca gcatctgagc acagaaagtc atcaaagcct 120
attatggaga aaagacgaag agcaagaata aatgaaagtc tgagccagct gaaaacactg 180
attttggatg ctctgaagaa agatagctcg cggcattcca agctggagaa ggcggacatt 240
ctggaaatga cagtgaagca cctccggaac ctgcagcggg cgcagatgac ggctgcgctg 300
agcacagacc caagtgtgct ggggaagtac cgagccggct tcagcgagtg catgaacgag 360
gtgacccgct tcctgtccac gtgcgagggc gttaataccg aggtgcgcac tcggctgctc 420
ggccacctgg ccaactgcat gacccagatc aatgccatga cctaccccgg gcagccgcac 480
cccgccttgc aggcgccgcc accgccccca ccgggacccg gcggccccca gcacgcgccg 540
ttcgcgccgc cgccgccact cgtgcccatc cccgggggcg cggcgccccc tcccggcggc 600
gccccctgca agctgggcag ccaggctgga gaggcggcta aggtgtttgg aggcttccag 660
gtggtaccgg ctcccgatgg ccagtttgct ttcctcattc ccaacggggc cttcgcgcac 720
agcggccctg tcatccccgt ctacaccagc aacagcggca cctccgtggg ccccaacgca 780
gtgtcacctt ccagcggccc ctcgcttacg gcggactcca tgtggaggcc gtggcggaac 840
tga 843

Claims (3)

1.用于检测KLF6基因表达量的物质的下述任一应用：
X1、制备检测或辅助检测人表皮基底细胞衰老情况产品；
X2、检测或辅助检测人表皮基底细胞衰老情况。
2.用于检测KLF6蛋白质含量的物质的下述任一应用：
X1、制备检测或辅助检测人表皮基底细胞衰老情况产品；
X2、检测或辅助检测人表皮基底细胞衰老情况。
3.以KLF6基因为人表皮基底细胞衰老标志物的检测标志物表达的物质的下述任一应用：
X1、制备检测或辅助检测人表皮基底细胞衰老情况产品；
X2、检测或辅助检测人表皮基底细胞衰老情况。
CN202011245282.3A 2020-11-10 2020-11-10 人皮肤衰老的分子标志物和调控靶标及其应用 Active CN112359103B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011245282.3A CN112359103B (zh) 2020-11-10 2020-11-10 人皮肤衰老的分子标志物和调控靶标及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011245282.3A CN112359103B (zh) 2020-11-10 2020-11-10 人皮肤衰老的分子标志物和调控靶标及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112359103A CN112359103A (zh) 2021-02-12
CN112359103B true CN112359103B (zh) 2023-03-14

Family

ID=74509199

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011245282.3A Active CN112359103B (zh) 2020-11-10 2020-11-10 人皮肤衰老的分子标志物和调控靶标及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112359103B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113838531B (zh) * 2021-09-19 2024-03-29 复旦大学 一种基于转录组数据和机器学习策略评估细胞衰老程度的方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019232320A1 (en) * 2018-05-31 2019-12-05 The Regents Of The University Of California Dna methylation biomarker of aging for human ex vivo and in vivo studies
CN110678751A (zh) * 2017-03-09 2020-01-10 克利拉生物技术有限公司 针对细胞衰老的生物标志物
CN110845603A (zh) * 2019-10-31 2020-02-28 中国科学院生物物理研究所 人胶原蛋白17型多肽、其生产方法和用途

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108753967B (zh) * 2018-06-08 2022-06-17 复旦大学附属中山医院 一种用于肝癌检测的基因集及其panel检测设计方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110678751A (zh) * 2017-03-09 2020-01-10 克利拉生物技术有限公司 针对细胞衰老的生物标志物
WO2019232320A1 (en) * 2018-05-31 2019-12-05 The Regents Of The University Of California Dna methylation biomarker of aging for human ex vivo and in vivo studies
CN110845603A (zh) * 2019-10-31 2020-02-28 中国科学院生物物理研究所 人胶原蛋白17型多肽、其生产方法和用途

Also Published As

Publication number Publication date
CN112359103A (zh) 2021-02-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3093348B1 (en) Method for distinguishing desired cell type using expression of mirna as indicator
KR101618950B1 (ko) 피부 자극 물질 스크리닝용 조성물 및 이를 이용한 피부 자극 물질의 스크리닝 방법
CN112359103B (zh) 人皮肤衰老的分子标志物和调控靶标及其应用
CN105063194A (zh) 一种帕金森的诊断标志物及其应用
CN111304312B (zh) 用于鉴定或辅助鉴定血管细胞和/或血管细胞衰老程度的标志物及其应用
EP2437060A1 (de) Markersequenzen für Multiple Sklerose und deren Verwendung
CN113151455A (zh) 外泌体miR-181b-5p在食管鳞癌诊断和治疗中的应用
EP4293108A1 (en) Method for detecting or quantifying photoaged cells, application of same, and method for preparing photoaged cells
CN105288659A (zh) Tenm1基因及其表达产物在诊治乳头状腺癌的应用
Veeraraghavan et al. Dynamic subtype-and context-specific subcellular RNA regulation in growth cones of developing neurons of the cerebral cortex
CN111471771B (zh) 一种评价或辅助评价胰岛细胞身份及衰老的标志物
CN115044639A (zh) 一种抗衰老药物的筛选方法
CN114657281A (zh) 内源病毒作为衰老程度的标志物及其作为衰老干预靶标的应用
CN107937515A (zh) 一种阿尔茨海默的诊疗基因靶点及其应用
Nascimento et al. Persistent postnatal migration of interneurons into the human entorhinal cortex
CN107881240B (zh) 骨肉瘤的诊治标志物
Szabolcsi et al. Parvalbumin-neurons of the ventrolateral hypothalamic parvafox nucleus receive a glycinergic input: a gene-microarray study
CN104984363A (zh) Zmym1在制备帕金森诊疗试剂中的应用
KR102665392B1 (ko) 무증상 갑상선 저하증 진단용 조성물 및 이를 포함하는 키트
CN115201356B (zh) 一种高通量无偏见的内源性液-液相分离蛋白质筛选方法
CN112063719B (zh) 一种检测或辅助检测视网膜视锥细胞的标志物及其应用
CN113403396B (zh) 针对Sorcin调控环路诊断、预测、逆转卵巢癌紫杉醇耐药
CN111699389B (zh) 使用蛋白质标记物grp78选择高效干细胞的方法
CN110938700B (zh) 一种评价或辅助评价卵巢细胞的方法及其使用的标志物
RU2715643C1 (ru) Плазмида для выявления мезенхимального состояния клетки

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant