CN111304312B - 用于鉴定或辅助鉴定血管细胞和/或血管细胞衰老程度的标志物及其应用 - Google Patents

用于鉴定或辅助鉴定血管细胞和/或血管细胞衰老程度的标志物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了用于鉴定或辅助鉴定血管细胞和/或血管细胞衰老程度的标志物及其应用。本发明首先公开了IL13RA2、WIF1、PTGS1、POSTN、DES、ACTC1、SORBS2和PEBP4在制备鉴定或辅助鉴定血管细胞的产品中的应用。本发明进一步公开了FOXO3在制备鉴别或辅助鉴别不同血管细胞的衰老程度的产品中的应用。本发明标志物在血管细胞的筛选和鉴定上具有重要作用，可以评估血管粥样动脉硬化等血管衰老相关疾病，还可以检测人类血管功能、评价人类血管衰老程度等，为血管衰老相关疾病的研究和干预，特别是在人类心血管功能评估及疾病诊断提供重要的分子指征，具有重要的应用价值。

Description

用于鉴定或辅助鉴定血管细胞和/或血管细胞衰老程度的标 志物及其应用
技术领域
本发明属于生物医学领域，具体涉及用于鉴定或辅助鉴定血管细胞和/或血管细胞衰老程度的标志物及其应用。
背景技术
全世界每年死于心脑血管疾病的人数高达1500万人，其致死率居各类疾病之首。衰老是心血管疾病的主要危险因素，随着年龄的增长动脉特性发生变化，例如血管内皮功能障碍和结构改变，被认为是动脉粥样硬化发生的主要原因。已有的研究表明，与年龄相关的血管老化经常出现在粥样动脉硬化发生之前，并且在粥样动脉硬化的斑块中也分离得到了衰老的血管内皮和血管平滑肌细胞，提示血管衰老是导致粥样动脉硬化等心血管疾病发生的关键原因，其中主动脉和冠状动脉是人类血管系统中最易受机体衰老影响的两个区域。同时，各种血管相关疾病例如动脉粥样硬化、中风和冠心病的发生发展，也促进了机体的衰老。然而目前心血管疾病的治疗却不容乐观，药物治疗和手术治疗都存在一定的风险和副作用，鲜有标本兼治的治疗方法问世。究其原因，很大一方面是人类对血管及其相关疾病认识的不足导致的。因此，深入解析血管衰老过程的细胞分子机制，可以为延缓血管衰老和心血管相关疾病的发生提供重要的可干预的靶向细胞以及关键调控分子，进而为延缓血管衰老及相关疾病的干预策略提供重要的理论依据。
因此，寻找血管细胞标志物及血管细胞衰老的关键因子，将为血管衰老相关疾病的研究和干预，特别是在人类心血管功能评估及疾病诊断提供重要的分子指征。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为如何鉴定血管细胞和/或不同血管细胞的衰老程度。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了IL13RA2、WIF1、PTGS1、POSTN、DES、ACTC1、SORBS2和PEBP4在制备鉴定或辅助鉴定血管细胞的产品中的应用；
或与IL13RA2或其基因特异结合的物质、与WIF1或其基因特异结合的物质、与PTGS1或其基因特异结合的物质、与POSTN或其基因特异结合的物质、与DES或其基因特异结合的物质、与ACTC1或其基因特异结合的物质、与SORBS2或其基因特异结合的物质和与PEBP4或其基因特异结合的物质在制备鉴定或辅助鉴定血管细胞的产品中的应用。
上述应用中，所述鉴定或辅助鉴定血管细胞的产品可含有与IL13RA2或其基因特异结合的物质、与WIF1或其基因特异结合的物质、与PTGS1或其基因特异结合的物质、与POSTN或其基因特异结合的物质、与DES或其基因特异结合的物质、与ACTC1或其基因特异结合的物质、与SORBS2或其基因特异结合的物质和与PEBP4或其基因特异结合的物质的8种蛋白质或其基因特异结合的物质。
本发明中，所述与IL13RA2特异结合的物质可为抗IL13RA2的单克隆抗体或多克隆抗体，与WIF1特异结合的物质可为抗WIF1的单克隆抗体或多克隆抗体，与PTGS1特异结合的物质可为抗PTGS1的单克隆抗体或多克隆抗体，与POSTN特异结合的物质可为抗POSTN的单克隆抗体或多克隆抗体，与DES特异结合的物质可为抗DES的单克隆抗体或多克隆抗体，与ACTC1特异结合的物质可为抗ACTC1的单克隆抗体或多克隆抗体，与SORBS2特异结合的物质可为抗SORBS2的单克隆抗体或多克隆抗体，和与PEBP4特异结合的物质可为抗PEBP4的单克隆抗体或多克隆抗体；所述与IL13RA2基因特异结合的物质可为PCR扩增所述IL13RA2基因的特异引物对，与WIF1基因特异结合的物质可为PCR扩增所述WIF1基因的特异引物对，与PTGS1基因特异结合的物质可为PCR扩增所述PTGS1基因的特异引物对，与POSTN基因特异结合的物质可为PCR扩增所述POSTN基因的特异引物对，与DES基因特异结合的物质可为PCR扩增所述DES基因的特异引物对，与ACTC1基因特异结合的物质可为PCR扩增所述ACTC1基因的特异引物对，与SORBS2基因特异结合的物质可为PCR扩增所述SORBS2基因的特异引物对，与PEBP4基因特异结合的物质可为PCR扩增所述PEBP4基因的特异引物对。
上述应用中，所述血管细胞为主动脉内皮细胞、冠状动脉内皮细胞、主动脉平滑肌细胞、动脉平滑肌细胞和血管外膜成纤维细胞中至少一种。
如下任一所述的应用也在本发明的保护范围之内。
IL13RA2和/或WIF1作为标志物在制备从血管细胞中鉴定或辅助鉴定主动脉内皮细胞的产品中的应用；
与IL13RA2或其基因特异结合的物质和/或与WIF1特异结合的物质在制备从血管细胞中鉴定或辅助鉴定主动脉内皮细胞的产品中的应用；
PTGS1作为标志物在制备从血管细胞中鉴定或辅助鉴定冠状动脉内皮细胞的产品中的应用；
与PTGS1或其基因特异结合的物质在制备从血管细胞中鉴定或辅助鉴定冠状动脉内皮细胞的产品中的应用；
POSTN作为标志物在制备从血管细胞中鉴定或辅助鉴定主动脉血平滑肌细胞的产品中的应用；
与POSTN或其基因特异结合的物质在制备从血管细胞中鉴定或辅助鉴定主动脉血平滑肌细胞的产品中的应用；
DES、ACTC1和/或SORBS2作为标志物在制备从血管细胞中鉴定或辅助鉴定冠状动脉平滑肌细胞的产品中的应用；
与DES或其基因特异结合的物质、与ACTC1或其基因特异结合的物质和/或与SORBS2或其基因特异结合的物质在制备从血管细胞中鉴定或辅助鉴定冠状动脉平滑肌细胞的产品中的应用；
PEBP4作为标志物在制备从血管细胞中鉴定或辅助鉴定血管外膜成纤维细胞的产品中的应用；
与PEBP4或其基因特异结合的物质在制备从血管细胞中鉴定或辅助鉴定血管外膜成纤维细胞的产品中的应用。
在实际应用中，可以检测待测组织和/或器官中是否含有所述血管细胞，如果待测组织和/或器官表达IL13RA2和/或WIF1，则待测组织和/或器官含有或候选含有主动脉内皮细胞；如果待测组织和/或器官表达PTGS1，则待测组织和/或器官含有或候选含有冠状动脉内皮细胞；如果待测组织和/或器官表达PTGS1，则待测组织和/或器官含有或候选含有冠状动脉内皮细胞；如果待测组织和/或器官表达POSTN，则待测组织和/或器官含有或候选含有主动脉血平滑肌细胞；如果待测组织和/或器官表达DES、ACTC1和/或SORBS2，则待测组织和/或器官含有或候选含有冠状动脉平滑肌细胞；如果待测组织和/或器官表达PEBP4，则待测组织和/或器官含有或候选含有血管外膜成纤维细胞。
具体的，如果待测血管细胞表达IL13RA2和/或WIF1，则待测血管细胞为主动脉内皮细胞；如果待测血管细胞表达PTGS1，则待测血管细胞为冠状动脉内皮细胞；如果待测血管细胞表达POSTN1，则待测血管细胞为主动脉平滑肌细胞；如果待测血管细胞表达DES、ACTC1和/或SORBS2，则待测血管细胞为冠状动脉平滑肌细胞；如果待测血管细胞表达PEBP4，则待测血管细胞为血管外膜成纤维细胞。
上述应用中，所述血管细胞为主动脉内皮细胞、冠状动脉内皮细胞、主动脉平滑肌细胞、动脉平滑肌细胞和血管外膜成纤维细胞中至少一种。
为解决上述技术问题，本发明提供了用于鉴定或辅助鉴定血管细胞的标志物。
本发明用于鉴定或辅助鉴定血管细胞的标志物，由IL13RA2、WIF1、PTGS1、POSTN、DES、ACTC1、SORBS2和/或PEBP4组成。
本发明进一步提供了一种用于鉴定或辅助鉴定血管细胞的试剂盒。
本发明所提供的试剂盒包括检测IL13RA2、WIF1、PTGS1、POSTN、DES、ACTC1、SORBS2和/或PEBP4的表达的物质。
上述试剂盒中，所述血管细胞为主动脉内皮细胞、冠状动脉内皮细胞、主动脉平滑肌细胞、动脉平滑肌细胞和血管外膜成纤维细胞中至少一种。
为解决上述技术问题，本发明还提供了FOXO3的应用。
本发明所提供的应用为如下任一所述的应用：
FOXO3在制备鉴别或辅助鉴别不同血管细胞的衰老程度的产品中的应用；
与FOXO3或其基因特异结合的物质在制备鉴别或辅助鉴别不同血管细胞的衰老程度产品中的应用；
FOXO3作为标志物在制备鉴别或辅助鉴别不同血管细胞的衰老程度的产品中的应用。
上述应用中，所述血管细胞为主动脉内皮细胞、冠状动脉内皮细胞、主动脉平滑肌细胞、动脉平滑肌细胞和血管外膜成纤维细胞中至少一种。
本发明中，所述鉴别或辅助鉴别不同血管细胞的衰老程度的产品可含有与FOXO3或其基因特异结合的物质，如所述与FOXO3特异结合的物质可为抗FOXO3的单克隆抗体或多克隆抗体；所述与FOXO3基因特异结合的物质可为PCR扩增所述FOXO3基因的特异引物对。
本发明中在进行鉴别或辅助鉴别不同血管细胞的衰老程度时，FOXO3的表达量低的待测血管细胞的衰老程度高于FOXO3的表达量高的待测血管细胞。
本发明进一步还提供了FOXO3在制备调控血管细胞增长能力和/或体外成管能力的产品中的应用或与FOXO3或其基因特异结合的物质在制备调控血管细胞增长能力和/或体外成管能力的产品中的应用。
上述应用中，所述血管细胞为主动脉内皮细胞、冠状动脉内皮细胞、主动脉平滑肌细胞、动脉平滑肌细胞和血管外膜成纤维细胞中至少一种。
在本发明中，所述调控血管细胞增长能力和/或体外成管能力的产品可含有与FOXO3或其基因特异结合的物质，如所述与FOXO3特异结合的物质可为抗FOXO3的单克隆抗体或多克隆抗体；所述与FOXO3基因特异结合的物质可为PCR扩增所述FOXO3基因的特异引物对。
抑制FOXO3表达的物质在制备抑制血管细胞增长能力和/或体外成管能力的产品中的应用也在本发明的保护范围之内。
本发明中，所述抑制血管细胞增长能力和/或体外成管能力的产品可还有抑制FOXO3表达的物质，如干扰FOXO3表达的小干扰RNA，具体的，干扰FOXO3表达的小干扰RNA的靶序列为SEQ ID NO.1(即CAACCTGTCACTGCATAGT)或SEQ ID NO.2(即GAGCTCTTGGTGGATCATC)。
上述应用中，所述血管细胞为主动脉内皮细胞、冠状动脉内皮细胞、主动脉平滑肌细胞、动脉平滑肌细胞和血管外膜成纤维细胞中至少一种。
本发明进一步提供了一种用于鉴别或辅助鉴别不同血管细胞的衰老程度的试剂盒。
本发明所提供的试剂盒包括检测FOXO3的表达的物质。
上述试剂盒中，所述血管细胞为主动脉内皮细胞、冠状动脉内皮细胞、主动脉平滑肌细胞、动脉平滑肌细胞和血管外膜成纤维细胞中至少一种。
本发明中，所述产品为试剂或试剂盒。
本发明中所述IL13RA2的Gene ID:3598(updated on 13-Mar-2020)，Protein ID:Q14627.1(updated on 16-Oct-2019)；WIF1的Gene ID:11197(updated on13-Mar-2020)，Protein ID:Q9Y5W5.3(updated on 18-Sep-2019)；PTGS1的Gene ID:5742(updated on13-Mar-2020)，Protein ID:P23219.2(updated on 16-Oct-2019)；POSTN的Gene ID:10631(updated on 13-Mar-2020)，Protein ID:Q15063.2(updated on 16-Oct-2019)；DES的Gene ID:1674(updated on 13-Mar-2020)，Protein ID:P17661.3(updated on 16-Oct-2019)；ACTC1的Gene ID:70(updated on 13-Mar-2020)，Protein ID:P68032.1(updatedon13-Nov-2019)；SORBS2的Gene ID:8470(updated on 13-Mar-2020)，Protein ID:O94875.3(updated on 13-Nov-2019)；PEBP4的Gene ID:157310(updated on13-Mar-2020)，Protein ID:Q96S96.3(updated on 16-Oct-2019)；FOXO3的Gene ID:2309(updatedon 13-Mar-2020)，protein ID：O43524.1(updated on 16-Oct-2019)。
本发明标志物在血管细胞的筛选和鉴定上具有重要作用，可以评估血管粥样动脉硬化等血管衰老相关疾病，还可以检测人类血管功能、评价人类血管衰老程度等，为血管衰老相关疾病的研究和干预，特别是在人类心血管功能评估及疾病诊断提供重要的分子指征，具有重要的应用价值。
附图说明
图1为食蟹猴单细胞测序文库构建和分析的示意图。
图2为生物信息学分析对血管细胞分群。
图3为血管细胞分子标志物在不同类型血管细胞中的表达量。
图4为免疫荧光鉴定血管细胞分子标志物在不同类型血管细胞中的表达和定位情况。
图5为生物信息学分析不同类型血管细胞的衰老相关的差异表达基因；其中，A为衰老血管细胞中上调(左侧)和下调(右侧)的差异表达基因；B为FOXO3在年轻组和年老组不同类型血管细胞中的表达情况。
图6为免疫荧光鉴定衰老血管内皮细胞的分子标志物FOXO3在主动脉内皮细胞中的表达和定位情况。
图7为蛋白质印记法鉴定年轻组和年老组主动脉内皮细胞中FOXO3的表达情况。
图8为荧光定量PCR法鉴定小干扰RNA对于人动脉内皮细胞中FOXO3的抑制情况。
图9为结晶紫染色实验鉴定抑制FOXO3表达后的人动脉内皮细胞的增殖能力。
图10为体外成管实验鉴定FOXO3表达后的人动脉内皮细胞的体外成管能力。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的食蟹猴实验是基于《非人类灵长类动物的伦理对待准则》进行的，并已通过中国科学院动物研究所的伦理审批。
下述实施例中各试剂的购买来源：
Krebs-Henseleit溶液购自Leagene Bio，货号为CZ0082；
dNTP购自Fermentas，货号为R0193；
无核酸酶的水购自Ambion，货号为AM9937；
鼠抗PECAM-1、鼠抗WIF、鼠抗ACKR1、羊抗IL13RA2和羊抗LUM均购自R&D systems，货号分别为BBA7、MAB134-SP、MAB4139、AF146和AF2846；
兔抗CLDN5、鼠抗PTGS1和兔抗ACTC1均购自Invitrogen，货号分别为34-1600、35-8100和PA5-21396；
兔抗TAGLN、鼠抗SORBS2、兔抗POSTN、兔抗PCOLCE和兔抗COL1A1均购自Abcam，货号分别为Ab14106、Ab73444、Ab14041、Ab39204和Ab34710；
鼠抗SMA购自Zsbio，货号为ZM0003；
兔抗DES和FOXO3购自Cell signaling technology，货号分别为5332和2497；
兔抗PEBP4购自Sigma，货号HPA025064；
鼠抗ACTIN购自Santa Cruz，货号sc-69879；
ERCC RNA Spike-In Mix购自Life Technologies，货号为4456740；
AMPure XP磁珠购自Beckman，货号为A63881；
Figure BDA0002414022920000061
OCTTM化合物购自Sakura Finetek，货号为4583；
Figure BDA0002414022920000062
抗褪色固定介质购自Vector Laboratories，货号为H-1000；
I型胶原酶、细胞团块裂解液(Accumax)、II型中性蛋白酶和DPBS均购自Gibco，货号依次为17100017、00466656、17105041和21600069；
弹性蛋白酶购自Sigma，货号为E7885，
I型DNA酶购自Worthington，货号为LS006333；
弹性蛋白酶牛血清白蛋白(BSA)购自MP，货号为0219989991；
蛋白上样缓冲液购自鼎国，货号为WB-0091；
RNase抑制剂、SuperScript II逆转录酶、5×SuperScript II一链合成缓冲液、二硫苏糖醇(DTT)、Dynabeads MyOne链霉亲和素C1、Alexa
Figure BDA0002414022920000072
488驴抗小鼠IgG(H+L)二抗、Alexa
Figure BDA0002414022920000074
488驴抗兔IgG(H+L)二抗、Alexa
Figure BDA0002414022920000073
568驴抗绵羊IgG(H+L)二抗和Alexa
Figure BDA0002414022920000075
568驴抗小鼠IgG(H+L)二抗均购自Invitrogen，货号分别为AM2684、18064-071、18064-071、18064-071、65001、A21202、A21206、A21099和A10037；兔抗和鼠抗蛋白二抗，均购自中杉金桥，货号分别为ZB-2301和ZB-2307.
Triton X-100购自Sigma-Aldrich，货号为T9284；；
2×KAPA HiFi HotStart ReadyMix和KAPA Hyper Prep建库试剂盒均购自KAPA公司，货号分别为kk2602和KK8054。
下述实施例中，构建食蟹猴单细胞测序文库的引物名称及核苷酸序列如下表。
Figure BDA0002414022920000071
注：条形码引物中，“XXXXXXXX”为8bp的条形码序列(即barcode)，“NNNNNNNN”为8bp随机唯一分子标识符(UMI)序列，“T25”表示25个T；TSO引物中，“rG”为核糖鸟苷，“+G”为经锁定核酸(LNA)修饰的鸟苷；生物素引物中，“/biotin/”为引物5’端进行生物素修饰，“/index/”为6bp的文库条形码序列。
实施例1、食蟹猴血管单细胞测序文库的获得
根据食蟹猴的平均寿命及其与人类年龄的对应关系，选取4只4-5岁的雌性食蟹猴和4只4-5岁的雄性食蟹猴组成年轻组，4只18-20岁的雌性食蟹猴和4只18-20岁的雄性食蟹猴组成年老组。所有食蟹猴均进行体检，包括基本参数的测量(如身体质量指数(Body MassIndex，BMI))、生化指标(如血常规、尿常规)的检测、脑部核磁和心脏等重要内脏器官的超声检测，确定年轻组和年老组中的所有的食蟹猴均无重大疾病。
食蟹猴单细胞测序文库构建和分析的示意图见图1，具体步骤依次如下：
一、食蟹猴细胞悬浮液的获得
获得每只食蟹猴的细胞悬浮液。具体步骤依次如下：
1、麻醉食蟹猴并用生理盐水灌注，然后分离带有主动脉和管状动脉的心脏组织并立即浸入预冷的Krebs-Henseleit溶液。
2、小心去除血管周围的心外膜和其它粘附组织，获得无其他黏附组织的主动脉和冠状动脉血管。
3、分别将主动脉和冠状动脉血管切碎；然后先使用I型胶原酶，37℃、孵育10min；接着使用I型胶原酶、II型中性蛋白酶、弹性蛋白酶和DNA酶I的混合溶液，混匀，37℃、孵育45min，获得细胞团块；
4、完成步骤4后，使用细胞团块裂解液(Accumax)，处理细胞团块5min，使其分散为单细胞，即得食蟹猴细胞悬浮液。
二、食蟹猴血管细胞测序文库的构建
采用优化的STRT-seq的单细胞转录组建库方法，分别对每只食蟹猴血管细胞进行裂解、反转录和预扩增，构建食蟹猴血管细胞测序文库，在Illumina X Ten平台上进行测序。具体步骤如下：
1、取步骤一得到的细胞悬浮液，在解剖显微镜下通过口吸管分别挑入装有2μL裂解缓冲液的Eppendorf管(规格为200μL)中，72℃裂解3min；其中，裂解缓冲液由0.05μL浓度为40U/μL RNase抑制剂、0.095μL 10％(v/v)Triton X-100、0.5μL浓度为10mM的dNTP水溶液、1.105μL无核酸酶水、0.1μL 1：2000000稀释的ERCC RNA Spike-In Mix和0.15μL浓度为10μM的条形码引物水溶液组成。
2、完成步骤1后，加入2.85μL逆转录混合物，混匀，之后25℃孵育5min，42℃孵育60min，50℃孵育30min，70℃孵育10min；其中，逆转录混合物由0.25μL 200U/μLSuperScript II逆转录酶、1μL 5×SuperScript II一链合成缓冲液、0.125μL RNase抑制剂、0.25μL浓度为0.1M的DTT水溶液、1μL浓度为5M的甜菜碱水溶液、0.03μL浓度为1M的MgCl2水溶液、0.145μL无核酸酶水和0.05μL浓度为100μM的TSO引物水溶液组成。
3、完成步骤2后，加入装有7.5μL PCR混合物的EP管中，进行PCR扩增，合并标记有不同条形码的预扩增cDNA，再使用AMPure XP磁珠将合并的标记有不同条形码的预扩增cDNA纯化两次，得到合并的DNA；
其中，PCR混合物由6.25μL 2×KAPA HiFi HotStart ReadyMix、0.25μL浓度为10μM的预扩增引物水溶液、0.75μL浓度为10μM的3'P2引物水溶液和0.25μL无核酸酶水组成；
PCR扩增的反应程序：95℃3min；98℃20s，65℃30s，72℃5min；98℃20s，67℃15s，72℃5min，13个循环数；72℃5min。
4、制备生物素PCR反应体系，然后进行PCR扩增，之后使用AMPure XP磁珠纯化两次，得到生物素标记的DNA片段；
其中，生物素PCR反应体系为50μL，由25μL 2×KAPA HiFi HotStart ReadyMix、2μL浓度为10μM的锚定引物水溶液、2μL浓度为10μM的生物素引物水溶液、40ng合并的DNA和无核酸酶水组成。
5、完成步骤4后，利用超声破碎仪将生物素标记的DNA片段断裂至300bp左右，使用AMPure XP磁珠纯化1次；之后用Dynabeads MyOne链霉亲和素C1富集生物素标记的3'末端，得到富集的DNA片段。
6、取步骤5富集的DNA片段，按照KAPA Hyper Prep建库试剂盒说明书的步骤，进行末端修复、dA加尾和接头连接，得到连接接头的DNA。
7、完成步骤4后，制备PCR反应体系，然后进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；其中，PCR反应体系为50μL，由25μL 2×KAPA HiFi HotStart ReadyMix、Illumina QP2引物、短通用引物、连接接头的DNA和无核酸酶水组成。Illumina QP2引物和短通用引物在PCR反应体系中的浓度均为0.3μM。
8、使用Illumina HiSeq 4000对步骤7得到的PCR扩增产物进行150bp读长的双端测序，得到食蟹猴血管细胞测序文库。
实施例2、血管细胞分子标志物的获得和检测
一、生物信息分析获得血管细胞分子标志物
以食蟹猴基因组Macaca_fascicularis_5.0(Ensemble)为参考，统计唯一比对读长，并拆分为不同的细胞数据，如图2所示，细胞为主动脉内皮细胞、冠状动脉内皮细胞、主动脉平滑肌细胞、冠状动脉平滑肌细胞、外膜成纤维细胞、免疫细胞和心外膜细胞。以唯一分子序号标记单个分子，矫正扩增偏差，获得食蟹猴血管单细胞表达图谱。通过Seurat软件包寻找高变异度基因，基于该基因群对所测细胞中的这些基因进行非线性降维(t-SNE)，通过Seurat软件包Find Clusters功能进行聚类以及Seurat软件包find_all_markers功能，获得PECAM1(CD31)、IL13RA2、WIF1、CLDN5、PTGS1、ACKR1、RELN、SM22、SMA、POSTN、DES、ACTC1、SORBS2、LUM、COL1A1、PCOLCE和PEBP4在部分细胞中的表达情况，结果如图3所示，PECAM1(CD31)在主动脉内皮和冠状动脉内皮细胞中表达，而在主动脉和冠状动脉平滑肌细胞、淋巴样内皮细胞、外膜成纤维细胞、心外膜细胞和免疫细胞中不表达；IL13RA2和WIF1在主动脉内皮细胞中表达，而在冠状动脉内皮细胞、淋巴样内皮细胞、主动脉和冠状动脉平滑肌细胞、外膜成纤维细胞、心外膜细胞和免疫细胞中不表达；CLDN5、PTGS1和ACKR1在冠状动脉内皮细胞中表达，而在主动脉内皮细胞、淋巴样内皮细胞、主动脉和冠状动脉平滑肌细胞、外膜成纤维细胞、心外膜细胞和免疫细胞中不表达；RELN在淋巴样内皮细胞中表达，而在主动脉和冠状动脉内皮细胞、主动脉和冠状动脉平滑肌细胞、外膜成纤维细胞、心外膜细胞和免疫细胞中不表达；SM22、SMA和POSTN在主动脉平滑肌细胞中表达，而在主动脉和冠状动脉内皮细胞、淋巴样内皮细胞、冠状动脉平滑肌细胞、外膜成纤维细胞、心外膜细胞和免疫细胞中不表达；DES、ACTC1和SORBS2在冠状动脉平滑肌细胞中表达，而在主动脉和冠状动脉内皮细胞、淋巴样内皮细胞、主动脉平滑肌细胞、外膜成纤维细胞、心外膜细胞和免疫细胞中不表达；LUM、COL1A1、PCOLCE和PEBP4在外膜成纤维细胞中表达，而在主动脉和冠状动脉内皮细胞、淋巴样内皮细胞、主动脉和冠状动脉平滑肌细胞、心外膜细胞和免疫细胞中不表达；其中，PECAM1是经典主动脉和冠状动脉内皮细胞标志物，CLDN5、RELN和ACKR1是经典冠状动脉内皮细胞标志物，SM22和SMA是经典主动脉平滑肌细胞标志物，LUM、COL1A1和PCOLCE是经典外膜成纤维细胞标志物。因此，IL13RA2和WIF1为新型主动脉内皮细胞分子标志物，PTGS1为新型冠状动脉内皮细胞分子标志物，POSTN为新型主动脉平滑肌细胞新型标志物，DES、ACTC1和SORBS2为新型冠状动脉平滑肌细胞分子标志物，PEBP4为新型血管外膜成纤维细胞分子标志物。
二、免疫荧光检测
平均统计来自8个年轻和8个年老的食蟹猴个体的血管切片，每个个体包含三个独立切片，每个切片至少拍摄三张图片，每张图片至少包含200细胞用于定量。
1、分别取实施例1步骤一中2获得的8个年轻和8个年老的食蟹猴的主动脉和冠状动脉血管，先用4％(m/v)多聚甲醛溶液4℃固定过夜，然后用PBS缓冲液充分洗涤，再浸入30％(m/v)蔗糖水溶液，包埋在
Figure BDA0002414022920000101
OCTTM化合物中，然后冷冻。
2、完成步骤1后，进行冷冻切片(约8μm)，置于带正电的载玻片上，-80℃保存。
3、完成步骤2后，取切片，先用PBS缓冲液清洗，再置于pH6.0、10mM的柠檬酸钠缓冲液中，98℃微波加热切片3次(每次5min)，目的为进行抗原修复。
4、完成步骤3后，冷却，先将切片用PBS缓冲液洗涤3次，再用PBS缓冲液稀释的0.4％(v/v)Triton X-100通透25min，之后室温下用PBS缓冲液稀释的10％驴血清封闭缓冲液封闭1h，并在4℃下用一抗染色过夜。一抗包括兔抗CLDN5、TAGLN(SM22)、POSTN、DES、ACTC1、COL1A1、PCOLCE和PEBP4，鼠抗PECAM1、WIF1、PTGS1、ACKR1、SMA和SORBS2，羊抗IL13RA2和LUM。
5、完成步骤4后，取所述切片，先用PBS缓冲液充分洗涤，再与相应的二抗在室温下孵育1h。
6、完成步骤5后，取所述切片，先进行Hoechst 33342染色，再用PBS缓冲液洗涤3次，之后用
Figure BDA0002414022920000111
抗褪色固定介质固定，使用共聚焦激光扫描显微镜(LeicaTCS SP5Ⅱ)获得图像。
部分免疫荧光检测结果如图4所示，PECAM1、IL13RA2和WIF1均在主动脉内皮细胞中特异表达，CLDN5、PTGS1和ACKR1在冠状动脉内皮细胞中特异表达，SM22、SMA和POSTN在主动脉平滑肌细胞中特异表达，DES、ACTC1和SORBS2在冠状动脉平滑肌细胞中特异表达，LUM、COL1A1、PCOLCE和PEBP4在血管外膜成纤维细胞中特异表达。
上述结果进一步表明，IL13RA2和WIF1为新型主动脉内皮细胞分子标志物，PTGS1为新型冠状动脉内皮细胞分子标志物，POSTN为新型主动脉平滑肌细胞新型标志物，DES、ACTC1和SORBS2为新型冠状动脉平滑肌细胞分子标志物，PEBP4为新型血管外膜成纤维细胞分子标志物。
上述分子标志物中，所述IL13RA2的Gene ID:3598(updated on 13-Mar-2020)，Protein ID:Q14627.1(updated on 16-Oct-2019)；WIF1的Gene ID:11197(updated on13-Mar-2020)，Protein ID:Q9Y5W5.3(updated on 18-Sep-2019)；PTGS1的Gene ID:5742(updated on 13-Mar-2020)，Protein ID:P23219.2(updated on 16-Oct-2019)；POSTN的Gene ID:10631(updated on 13-Mar-2020)，Protein ID:Q15063.2(updated on16-Oct-2019)；DES的Gene ID:1674(updated on 13-Mar-2020)，Protein ID:P17661.3(updatedon 16-Oct-2019)；ACTC1的Gene ID:70(updated on 13-Mar-2020)，Protein ID:P68032.1(updated on 13-Nov-2019)；SORBS2的Gene ID:8470(updated on13-Mar-2020)，ProteinID:O94875.3(updated on 13-Nov-2019)；PEBP4的Gene ID:157310(updated on 13-Mar-2020)，Protein ID:Q96S96.3(updated on 16-Oct-2019)；FOXO3的Gene ID:2309(updatedon 13-Mar-2020)，protein ID：O43524.1(updated on16-Oct-2019)。
实施例3、衰老血管细胞分子标志物的获得和检测
一、生物信息分析获得衰老血管细胞分子标志物
基于实施例1的年轻组和年老组的食蟹猴血管细胞测序文库，通过Seurat软件包find_all_markers功能获得衰老血管细胞分子标志物(|log2(fold change)|≥0.5，P<0.05，FDR<0.05)。
FOXO3在年轻组和年老组不同类型的血管细胞中的表达情况结果如图5所示：FOXO3在年轻组和年老组的主动脉内皮细胞的表达量分别为2.02±1.74和1.21±1.44(平均值±标准差)；在年轻组和年老组的冠状动脉内皮细胞1的表达量分别为2.09±1.77和1.23±1.64(平均值±标准差)；在年轻组和年老组的冠状动脉内皮细胞2的表达量分别为1.97±1.71和1.25±1.53(平均值±标准差)；在年轻组和年老组的主动脉平滑肌细胞的表达量分别为2.85±1.42和2.25±1.67(平均值±标准差)；在年轻组和年老组的冠状动脉平滑肌细胞的表达量分别为2.75±1.58和2.25±1.67(平均值±标准差)；在年轻组和年老组的外膜成纤维细胞的表达量分别为3.01±1.56和2.35±1.67(平均值±标准差)；结果表明FOXO3在年轻组和老年组中的主动脉内皮细胞、冠状动脉内皮细胞、主动脉平滑肌细胞、冠状动脉平滑肌细胞和血管外膜成纤维细胞的表达量存在显著性的差异，年轻组的FOXO3的表达量要明显高于年老组的FOXO3的表达量，因此，FOXO3是血管细胞衰老程度的分子标志物，即FOXO3的表达量低的待测血管细胞的衰老程度高于FOXO3的表达量高的待测血管细胞。其中，FOXO3的Gene ID:2309(updated on 13-Mar-2020)，protein ID：O43524.1(updated on16-Oct-2019)。
二、免疫荧光检测
平均统计来自8个年轻和8个年老的食蟹猴个体的血管切片，每个个体包含三个独立切片，每个切片至少拍摄三张图片，每张图片至少包含200细胞用于定量。
按照实施例2中步骤二的方法，将一抗替换为兔抗FOXO3和鼠抗CD31，完成步骤(5)后，取所述切片，先进行Hoechst 33342染色，再用PBS缓冲液洗涤3次，之后用
Figure BDA0002414022920000121
抗褪色固定介质固定，使用共聚焦激光扫描显微镜(Leica TCS SP5Ⅱ)获得图像，使用ImageJ软件测量FOXO3的荧光强度，取平均值。
以年轻组的食蟹猴主动脉内皮细胞的FOXO3平均荧光强度作为1，计算其它食蟹猴主动脉内皮细胞的FOXO3相对荧光强度。
免疫荧光检测的结果和定量结果如图6所示，结果表明与年轻组食蟹猴的主动脉内皮细胞相比，衰老组的内皮细胞中FOXO3的蛋白表达量显著降低。
上述结果表明，FOXO3是新型内皮细胞衰老程度的分子标志物。
三、蛋白质印迹法(Western blot)检测
统计年轻组和年老组的八个食蟹猴的血管组织中FOXO3蛋白表达量。
对上述16个食蟹猴的血管组织置于1％SDS溶液中使用组织研磨仪使其充分裂解，加热至105℃，10min，使蛋白充分变性。然后取等量蛋白分别进行Western blot(以ACTIN表达量为参照)，分别检测年轻组和年老组的食蟹猴的血管组织中FOXO3蛋白含量。
Western blot具体步骤如下：
1、在等量的蛋白样品中加入适量浓缩的蛋白上样缓冲液(鼎国)。
完成步骤1后，将准备好的蛋白样品上样到SDS-PAGE胶孔内，进行蛋白电泳实验。
2、当蛋白上样缓冲液中的溴酚蓝到达胶的底端附近停止电泳。
3、完成步骤2后，使用转膜仪进行蛋白转膜，2小时。
4、完成步骤3后，立即使用脱脂奶粉进行封闭，室温，两小时。
5、完成步骤4后，分别使用FOXO3抗体和内参蛋白抗体ACTIN进行一抗孵育，4℃，过夜。
6、完成步骤5后，使用相应抗性的蛋白二抗进行孵育，室温，1小时。洗净后立即进行显影。
Western blot实验结果如图7所示。结果表明，与年轻组的食蟹猴的主动脉内皮细胞相比，衰老组的主动脉内皮细胞中FOXO3的蛋白表达量显著降低。
上述结果再一次证实，FOXO3是新型内皮细胞衰老程度分子标志物。
实施例4、血管细胞衰老程度的分子标志物FOXO3的功能验证
将人动脉内皮细胞(LONZA)分为三组，即si-FOXO3 I组、si-FOXO3 II组和si-NC组，通过小干扰RNA(siRNA)检测人动脉内皮细胞中抑制FOXO3的表达情况。
1采用Lipofectamine 3000试剂盒(Invitrogen)向si-FOXO3 I组、si-FOXO3 II组和si-NC组的人动脉内皮细胞中分别转染两个针对FOXO3的小干扰RNA(si-FOXO3 I：CAACCTGTCACTGCATAGT，即SEQ ID NO.1；si-FOXO3 II：即GAGCTCTTGGTGGATCATC，即SEQ IDNO.2)和阴性对照小干扰RNA(si-NC)，培养48小时，收取细胞，即获得了si-FOXO3 I组、si-FOXO3 II组和si-NC组的细胞。
2、然后采用使用荧光定量PCR的方法检测细胞中FOXO3的表达量。
提取步骤1收取细胞的RNA，反转录，得到cDNA。
分别以不同组的cDNA为模板，实时荧光定量PCR检测FOXO3基因的相对表达量(以18s rRNA基因为内参)。
检测18s rRNA基因和FOXO3基因的引物序列见表1。
表1引物序列
Figure BDA0002414022920000141
4、完成步骤3后，拟合线性曲线。
检测结果如图8所示，si-FOXO3 I组、si-FOXO3 II组相对于si-NC组的细胞FOXO3表达量明显降低，结果表明FOXO3基因的表达被成功抑制。
二、通过单克隆形成实验检测抑制FOXO3表达后人动脉内皮细胞的增殖能力
1、将步骤一中1获得的si-FOXO3 I组、si-FOXO3 II组和si-NC组的人动脉内皮细胞，以3000个细胞/孔的密度种于6孔板细胞培养皿中，使用动脉内皮细胞培养基EGM2(LONZA，货号为CC-3156)培养10天。
2、使用4％多聚甲醛固定细胞30分钟，使用1X结晶紫染色液，对培养皿中的细胞进行染色30分钟，最后使用清水洗去浮色。
3、使用扫描仪扫描整个培养皿的照片，然后使用Image J软件对每孔的细胞数量进行统计。
检测结果如图9所示，si-FOXO3 I组、si-FOXO3 II组的相对细胞数量明显低于si-NC组，结果表明在人动脉内皮细胞中抑制FOXO3的表达后，细胞的增殖能力明显减弱。
三、通过体外成管实验检测抑制FOXO3表达后人动脉内皮细胞的成管能力
1、将步骤一中1获得的si-FOXO3 I组、si-FOXO3 II组和si-NC组的人动脉内皮细胞，以70000个细胞/孔的密度种于24孔板细胞培养皿中，使用动脉内皮细胞培养基EGM2(LONZA，货号为CC-3156)培养8小时。
2、使用显微镜随机拍照，每个孔三个视野，然后使用Image J软件对闭合管腔的管腔壁的长度进行统计。
检测结果如图10所示，si-FOXO3 I组、si-FOXO3 II组的相对管腔壁长度明显低于si-NC组，结果表明，在人动脉内皮细胞中抑制FOXO3的表达后，细胞的体外成管能力明显减弱。
以上结果均证明，抑制FOXO3表达会引起人动脉内皮细胞增长能力和体外成管能力减弱，证明FOXO3基因对于人动脉内皮细胞的稳态和功能维持至关重要，而人动脉内皮细胞增长能力和体外成管能力是衰老的表现之一，因此进一步证实了FOXO3基因是新型衰老内皮细胞分子标志物。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院动物研究所
<120> 用于鉴定或辅助鉴定血管细胞和/或血管细胞衰老程度的标志物及其应用
<130> GNCFY200687
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
caacctgtca ctgcatagt 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gagctcttgg tggatcatc 19

Claims (2)

1.检测FOXO3基因表达的物质在制备鉴别或辅助鉴别不同血管细胞的衰老程度的产品中的应用；
所述血管细胞为主动脉内皮细胞、冠状动脉内皮细胞、主动脉平滑肌细胞、冠状动脉平滑肌细胞和血管外膜成纤维细胞中至少一种。
2.抑制FOXO3表达的物质在制备抑制血管细胞增长能力和/或血管细胞体外成管能力的产品中的应用；
所述抑制FOXO3表达的物质为干扰FOXO3表达的小干扰RNA；所述小干扰RNA的序列为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2；
所述血管细胞为动脉内皮细胞。
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