CN109576355A

CN109576355A - 一种单细胞测序筛选肿瘤血管内皮细胞标记分子的方法

Info

Publication number: CN109576355A
Application number: CN201810691764.8A
Authority: CN
Inventors: 赵永祥; 薛志刚; 阳诺; 钟莉娉; 黄勇
Original assignee: Guangxi Medical University
Current assignee: Guangxi Medical University
Priority date: 2018-06-28
Filing date: 2018-06-28
Publication date: 2019-04-05

Abstract

本发明公开了一种单细胞测序筛选血管内皮细胞标记分子的方法，包括以下步骤：（1）提取肿瘤血管内皮细胞；（2）分离单细胞并进行裂解；（3）对样品的mRNA进行逆转录得到cDNA；（4）以cDNA为模板进行PCR扩增，产物纯化，进行Tagmentation反应，完成cDNA测序文库构建；（5）对构建的cDNA文库进行高通量测序；（6）测序结果进行生物信息学分析，寻找肿瘤血管内皮细胞特异性的标记分子。

Description

一种单细胞测序筛选肿瘤血管内皮细胞标记分子的方法

技术领域

本发明属于生物医学领域，尤其是涉及一种利用单细胞测序筛选肿瘤血管内皮细胞标记分子的方法。

背景技术

在肿瘤的发生和发展过程中，肿瘤血管在此过程中所扮演的角色至关重要。当瘤体生长到1mm³大小时，就分泌了大量的血管内皮细胞生长因子VEGF，诱使瘤体周围生长出许多自己专属的肿瘤新生血管。这些肿瘤血管呈奇特的螺旋状，连接在正常血管上，在形态、功能、蛋白质表达、对细胞因子的反应性及遗传学水平上，它与正常血管存在明显差异。

肿瘤血管新生分为血管生成（angioenesis）和血管发生（vasculogenesis），前者是宿主成熟血管发展而来，后者则是由骨髓或循环系统中的内皮祖细胞，在肿瘤微环境中各种细胞因子的刺激下，定向诱导分化而来。除此之外，肿瘤血管还存在血管共生（vesselco option）和血管拟态（vasculogenic mimicry）两种形式。血管拟态多见于侵袭性较高的肿瘤组织，其内不含内皮细胞，完全由肿瘤细胞构成，在结构和功能上类似血管，被看作是肿瘤组织的另一套循环系统。

以肿瘤供养血管网为靶点的药物是提高肿瘤治愈率的一种新方法。正是这种固有差异为新药物的设计和治疗策略的高度选择性提供了多种独特的靶点。我们利用单细胞测序技术在肿瘤血管内皮细胞的单细胞水平上对全转录组进行扩增与测序，在整体水平上研究细胞中基因转录的情况及转录调控的规律，最后利用生物信息学分析技术，从mRNA水平上分析寻找肿瘤学管内皮细胞的特异性标记分子，为肿瘤的靶向治疗提供新的靶点。

发明内容

本发明的目的在于针对上述存在的科学问题，提供一种单细胞测序筛选肿瘤血管内皮细胞标记分子的方法。

本发明的技术方案概述如下：

本发明的单细胞测序筛选肿瘤血管内皮细胞标记分子的方法，包括以下步骤：

1）提取肿瘤血管内皮细胞；

2）分离单细胞并进行裂解：分离单细胞，加入裂解缓冲液中进行裂解，得到细胞裂解液；

3）对样品的mRNA进行逆转录得到cDNA：使用美国ThermoFisher公司的SuperScript试剂盒构建逆转录体系，对上述步骤2）获得的细胞裂解液进行逆转录，得到cDNA；

4）以cDNA为模板进行PCR扩增，构建测序文库，进行测序：使用美国Illumina公司的NexteraXT试剂盒，按照说明书对上述步骤3）得到的逆转录产物进行扩增和纯化，构建高通量测序文库；完成后将文库送交测序；

5）对测序结果进行生物信息学分析，从mRNA水平上分析寻找肿瘤血管内皮细胞的特异性标记分子。

以上所述步骤1）中，将从肿瘤组织中提取的血管内皮细胞进行单细胞测序，利用生物信息学分析从mRNA水平上寻找其特异的标记分子。

本发明突出的实质性特点和显著的进步是：

通过利用单细胞测序技术，为肿瘤靶向治疗寻找新的靶点提供更为全面、客观、准确的方法，为肿瘤靶向治疗寻找新的靶点提供一种新的思路和方法。

附图说明

图1为肿瘤组织。

图2为剪碎的肿瘤组织。

图3为 A.震荡器 B.水浴锅。

图4为肿瘤血管内皮细胞。

图5 为流式细胞仪检测肿瘤血管内皮细胞的纯度。

图6为肿瘤血管内皮细胞成管实验。

图7为肿瘤血管内皮细胞吞噬实验。

具体实施方式

下面对本发明的实施操作做详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施案例。

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

1.应用自创的提取方法获得高质量的肿瘤学管内皮细胞。

2.准备肿瘤学管内皮细胞单细胞样品。分离单细胞并进行裂解：分离单细胞，加入裂解缓冲液中进行裂解，得到细胞裂解液。

3.对样品的mRNA进行逆转录得到cDNA：使用美国Thermo Fisher公司的SuperScript试剂盒构建逆转录体系，对步骤3）获得的细胞裂解液进行逆转录，得到cDNA。

4.以cDNA为模板进行扩增，构建测序文库，进行测序，使用美国Illumina公司的Nextera XT试剂盒，按照说明书对步骤4）得到的逆转录产物进行扩增和纯化，构建高通量测序文库；完成后将文库送交测序。

5.通过生物信息学分析寻找肿瘤学管内皮细胞特异性的标记分子。

实施例1

本实施例选择小鼠（Mus musculus）Hep G2移植瘤模型为实验材料，对其肿瘤血管内皮细胞进行了单细胞转录组的测序。

1.获取肿瘤组织中的血管内皮细胞：

1）肿瘤血管内皮细胞的提取方法：

S1）用眼科剪剪碎肿瘤组织得到肿瘤单细胞；

S2）分选所述肿瘤单细胞得到所述肿瘤血管内皮细胞。

实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：

2）单细胞的制备

取3只4-5周龄SCID小鼠，每只于右侧腋下皮下接种HepG2细胞，待肿瘤平均体积长至约1.5×1×1cm³时，得到荷瘤小鼠。将荷瘤小鼠颈椎脱臼处死后浸泡于75%（体积百分比浓度）的乙醇水溶液中3-5 min，得到消毒后的小鼠；在超净工作台内，用无菌剪刀和无菌镊子从消毒后的小鼠胸口剪开小鼠皮肤，小心剥离得到肿瘤组织（参看附图1所示），做到小鼠不出血。

用眼科剪稍微剪碎肿瘤组织并在0.01M PBS中浸泡2min后将其取出，得到浸泡后的肿瘤组织。用眼科剪在无菌平皿上充分剪碎浸泡后的肿瘤组织，在剪碎浸泡后的肿瘤组织的过程中适时滴加0.01M PBS，保持该肿瘤组织处于湿润状态，得到剪碎的肿瘤组织（参看附图2所示）。向上述盛有剪碎的肿瘤组织的无菌平皿中胶原酶Ⅰ溶液，用剪过头的1 ml枪头吹散肿瘤组织，得到胶原酶Ⅰ-肿瘤组织混合物。

步骤：把胶原酶Ⅰ-肿瘤组织混合物转移到50ml离心管中，然后将该离心管进行如下C1）和C2）的处理，C1）和C2）交替进行15次：

C1）将盛有胶原酶Ⅰ-肿瘤组织混合物的50ml离心管在震荡器（参看附图3中A所示）上进行震荡3 min，得到震荡后的胶原酶-肿瘤组织混合物；

C2）将震荡后的胶原酶-肿瘤组织混合物在37℃水浴锅（参看附图3中B所示）中孵育2min，得到胶原酶消化后的肿瘤组织A。

将步骤C2）的胶原酶消化后的肿瘤组织A进行处理：

c1）将步骤C2）的胶原酶消化后的肿瘤组织于300g下离心6 min，弃上清液；

c2）向步骤c1）的沉淀中加入20 ml 0.01M PBS，混匀后于300g下离心6 min，弃上清液；

c3）向步骤c2）的沉淀中加入20 ml 0.01M PBS，混匀后于300g下离心6 min，弃上清液，得到胶原酶消化后的肿瘤组织；

向胶原酶消化后的肿瘤组织中加入胰酶溶液，得到胰酶-肿瘤组织混合物，将胰酶-肿瘤组织混合物在震荡器上进行震荡10min后，并加入10ml 胎牛血清FBS终止消化，得到胰酶消化后的肿瘤细胞悬浮液。将胰酶消化后的肿瘤细胞悬浮液倒入80目的筛子中进行过滤，得到过滤后的肿瘤细胞悬浮液。

将过滤后的肿瘤细胞悬浮液进行处理：

d1）将过滤后的肿瘤细胞悬浮液于300g下离心6 min，弃上清；

d2）向步骤d1）的沉淀中加入20 ml 0.01M PBS，混匀后于300g下离心6 min，弃上清；

d3）向步骤d2）的沉淀中加入20 ml 0.01M PBS，混匀后于300g下离心6 min，弃上清，得到胰酶消化后的肿瘤细胞。

向胰酶消化后的肿瘤细胞中加入9 ml 4 ℃预冷的溶液A，得到肿瘤细胞悬浮液。

3）磁珠的准备

用1 ml移液枪吹打磁珠分离液(磁珠分离液为MACS产品，货号为130-051-201，含有偶联CD105抗体的免疫磁珠)使其混合均匀，吸取100µl的磁珠分离液加至1ml的溶液A中，得到磁珠混悬液A，将磁珠混悬液A再磁力架上放置一分钟，弃液体，向管中加入1 ml 0.01MPBS，重悬磁珠，得到磁珠混悬液。

4）肿瘤血管内皮细胞的分选

将1 ml步骤1.2的磁珠混悬液加入至步骤1.1的9 ml肿瘤细胞悬浮液中，混合均匀后于4℃层析柜中旋转孵育30 min，得到混合液。

将10 ml混合液转移到插在磁力架上的EP管中，等待两分钟，吸去上层液体，得到磁珠-细胞复合物。将磁珠-细胞复合物按照下述步骤进行处理，共重复五次，得到磁珠-阳性细胞混合物：将盛有磁珠-细胞复合物的EP管拿离磁力架，向盛有磁珠-细胞复合物的EP管中加入1.5 ml溶液A，用移液枪吹匀后，将该EP管放至磁力架上，吸去上层液体。

用release buffer洗去磁珠-阳性细胞混合物的磁珠，得到肿瘤血管内皮细胞，具体操作步骤如下：①加入release buffer 500ul重悬磁珠-阳性细胞混合物；②室温放置15min；③放置于磁力架2min，吸取含阳性细胞的液体，得到不带磁珠的肿瘤血管内皮细胞。将上述肿瘤血管内皮细胞进行培养，培养条件为：ECM内皮细胞培养基（Sciencell公司，货号 1001）。得到贴壁的肿瘤血管内皮细胞（参看附图4所示）。

2.肿瘤血管内皮细胞的鉴定

1）肿瘤血管内皮细胞CD105的表达水平检测

用流式细胞仪测定步骤1的肿瘤血管内皮细胞表达CD105的水平。首先将步骤1的肿瘤血管内皮细胞与PE标记的二抗（PE标记的二抗为北京四正柏生物科技有限公司产品，货号为SPP101-500U）在0.01M PBS中4℃反应30分钟，反应结束后以0.01M PBS洗三次，上机分析，结果如附图5所示。结果显示肿瘤血管内皮细胞纯度很高，高表达CD105，表达率为97.3%（即表达CD105的肿瘤血管内皮细胞占所检测肿瘤血管内皮细胞的百分比为97.3%）。

2）肿瘤血管内皮细胞的成管实验

S1）实验的前一天，将Matrigel放于4℃融化（不能放于室温，凝固之后不可以再用）。灭菌的10μl枪头，μ-Slide Angiogenesis冷藏备用。

S2）开始实验时，从冰箱中取出冷藏的枪头和μ-Slide，在μ-Slide每个孔中加入10μL Matrigel。加入胶时注意保持枪头垂直于孔中间位置，Matrigel一直保持放在冰上。

S3）加入胶后，将μ-Slide放入合适大小的培养皿中，培养皿中加入吸满水的吸水纸，以防止μ-Slide中水分蒸发。将整个培养皿放入培养箱中，放置30分钟使胶凝固。

S4）. 在胶凝固的过程中，可以开始准备细胞悬液，细胞消化后将细胞悬液浓度调整到2×105 cell/mL。

S5）. 从培养箱中取出μ-Slide，每孔加入50μL细胞悬液。

S6） μ-Slide盖上盖子后放入培养箱培养。

S7）每隔4-6小时记录实验结果。

实验结果显示细胞抱团形成管腔（参看附图6所示）。

3）肿瘤血管内皮细胞的Dil-acLDL吞噬实验

S1）将肿瘤内皮细胞铺板于6孔板中，培养24小时。

S2）更换含Dil-acLDL（配成浓度为10ug/ml)的内皮细胞培养基，37℃培养箱中孵育3小时。

S3）0.01M PBS洗涤2遍，4%多聚甲醛固定，荧光显微镜下观察。

实验结果显示内皮细胞吞噬Dil-acLDL后发出红色荧光。（参看附图7所示）

3.分离单细胞并进行裂解：

1）以RNaseZap和无DNA的溶液清理工作台及移液枪头；

2）混合以下试剂作为裂解缓冲液：

A）0.2%Triton-X100溶液19μl；

B）40U/μl的RNase抑制剂1μl。

3）向0.2ml的薄壁PCR管中加入1.19μl裂解缓冲液；

4）以最小体积从步骤（2）所得的细胞中分离单细胞，体积一般为0.3μl，加入含裂解缓冲液的PCR管中。

4.对样品的mRNA进行逆转录得到cDNA：

1）混合以下试剂作为引物-dNTP预混液：

A）dNTP（10mM）10μl；

B）Oligo-dT₃₀VN引物（10μM）10μl。

2）混合以下试剂作为逆转录预混液：

A）美国ThermoFisher公司的SuperScript III first-strand缓冲液2μl；

B）美国ThermoFisher公司的SuperScript III reverse transcriptase溶液0.5μl；

C）RNAse抑制剂（40U/μl）0.25μl；

D）DTT溶液（100mM）0.5μl；

E）甜菜碱溶液（5M）2μl；

F）氯化镁溶液（1M）0.06μl；

G）TSO溶液（100μM）0.2μl；

H）ERCC外源RNA标准样溶液0.5μl。

3）在步骤（3）所得的含有细胞和裂解缓冲液的PCR管中加入2μl引物-dNTP预混液；

4）快速涡旋震荡PCR管使溶液充分混合，在室温下以700g离心10s后立即置于冰上；

5）以72℃孵育样品3min，立即放回冰上；

6）在室温下以700g离心10s，收集PCR管底部的液体，将其置于冰上；

7）将逆转录预混液加入单细胞裂解产物中，使用移液器轻轻吹吸几次混匀样品，混匀过程中避免产生气泡；

8）在室温下以700g离心10s，收集PCR管底部的液体；

9）将含样品的PCR管置于PCR仪中，设定程序进行细胞mRNA的逆转录，得到cDNA第一链反应产物，逆转录程序的热循环条件表示在表1中。

表1：逆转录程序的热循环条件

5.以cDNA为模板进行扩增，构建测序文库，进行测序：

1）混合以下溶液作为PCR混合液：

A）步骤（4）中得到的第一链反应产物10μl；

B）美国Roche Molecular Systems公司的KAPA HiFi HotStart ReadyMix溶液12.5μl；

C）ISPCR引物溶液（10 μM）0.25μl；

D）无核酸酶水2.25μl。

2）取15μl步骤1）中的PCR混合液加入PCR管中，涡旋震荡使样品混合，在室温下以700g离心10s，收集PCR管底部的液体；

3）将含样品的PCR管置于PCR仪中，设定程序进行细胞cDNA的扩增，程序的热循环条件表示在表2中；

表2：cDNA扩增程序的热循环条件

4）在室温下将美国Beckman Coulter 公司的AMPure XP磁珠放置15min，涡旋震荡混匀；

5）将25μl磁珠加入等体积步骤3）所得到的cDNA扩增产物中，用移液器吹吸10次混匀，将溶液转移到96孔板中，在室温下孵育8min；

6）将96孔板在磁力架上放置5min，待溶液澄清，小心移除上清液；加入200μl的80%乙醇清洗磁珠，孵育30s后将小心移除乙醇，重复2次；

7）完全移除乙醇后，在室温下放置5min，待磁珠表面出现一道裂缝后，加入15μl的EB溶液，用移液器吹吸10次混匀；

8）移除磁力架，室温放置2min；将96孔板再放回磁力架上，放置2分钟，待溶液澄清后，吸取13μl的上清液，移到一个新的0.2ml薄壁PCR管中；

9）使用6%的PAGE凝胶检测cDNA扩增产物的片段大小分布，好的文库应该片段大小应该在500~3000bp之间，没有小于500bp的短片段，而且峰应该出现在1500~2000bp之间（图4）；

10）混合以下溶液作为标记预混液：

A）美国Illumina公司的标记DNA缓冲液4μl；

B）美国Illumina公司的标记酶混合液1.67μl；

C）美国Illumina公司的重悬缓冲液1.33μl。

11）取1μl步骤8）中得到的cDNA，加入7μl步骤10）中的标记预混液，在55℃孵育10min，对cDNA进行标记；

12）再加入2μl的美国Illumina公司的NT缓冲液，在室温下孵育5min，完成标记反应；

13）混合以下溶液作为接头连接扩增预混液：

A）美国Roche Molecular Systems公司的KAPA HiFi HotStart ReadyMix溶液15μl；

B）美国Illumina公司的Index 1引物溶液2.5μl；

C）美国Illumina公司的Index 2引物溶液2.5μl。

14）向步骤12）中得到的10μl标记产物中加入20μl步骤13）中的接头连接预混液，置于PCR仪中，设定程序进行接头的连接，程序的热循环条件表示在表3中。

表3：接头连接程序的热循环条件

15）在室温下将美国Beckman Coulter 公司的AMPure XP磁珠放置15min，涡旋震荡混匀；

16）将24μl磁珠按照0.8：1的体积比加入步骤13）得到的30μl产物中，用移液器吹吸10次混匀，将溶液转移到96孔板中，在室温下孵育8min；

17）重复步骤6）至步骤8），纯化扩增产物；

18）使用6%的PAGE凝胶和美国Agilent公司的2100 Bioanalyzer检测步骤17）中获得测序文库的片段大小分布（图5、图6），并用美国ThermoFisher公司的Qubit3.0荧光计测量各文库DNA的浓度；

19）根据步骤18）中测得各文库的浓度及所需测序的数据量，计算最终文库混合液中各文库的摩尔比例，按比例将文库混合，使用Qubit3.0荧光计测量，调整终浓度达到5nM；

20）送测序公司进行高通量测序。

选择小鼠（Musmusculus）的肿瘤血管内皮细胞为实验材料仅是为了举例，证明此方法可以成功应用于哺乳动物血管内皮细胞的单细胞转录组测序，但本发明同样可以应用于人类及其他哺乳动物的血管内皮细胞的单细胞转录组测序。

本发明并不局限于前述的具体实施方式，本发明扩展到任何本说明书中披露的新特征或新的组合，以及披露的任一新方法或过程的步骤或新的组合。

Claims

1.一种单细胞测序筛选肿瘤血管内皮细胞标记分子的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1）提取肿瘤血管内皮细胞；

4）以cDNA为模板进行PCR扩增，构建测序文库，进行测序：使用美国Illumina公司的NexteraXT试剂盒，对上述步骤3）得到的逆转录产物进行扩增和纯化，构建高通量测序文库；完成后将文库送交测序；

5）对测序结果进行生物信息学分析，寻找肿瘤血管内皮细胞特异性的标记分子。

2.根据权利要求1所述单细胞测序筛选肿瘤血管内皮细胞标记分子的方法，其特征在于：所述步骤1）中，将从肿瘤组织中提取的血管内皮细胞进行单细胞测序，从mRNA水平上寻找肿瘤血管内皮细胞特异性的标记分子。