CN104726408A - 血管内皮细胞的快速提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了血管内皮细胞的快速提取方法。本发明所提供的血管内皮细胞的快速提取方法，包括S1)和S2)：S1)用眼科剪剪碎离体的肿瘤组织得到破碎肿瘤组织，用胶原酶和/或胰酶消化所述破碎肿瘤组织得到肿瘤单细胞；S2)利用免疫磁珠法分选所述肿瘤单细胞得到所述肿瘤血管内皮细胞。实验证明，利用本发明的肿瘤血管内皮细胞的提取方法得到的肿瘤血管内皮细胞纯度非常高，肿瘤血管内皮细胞高表达CD105，表达率为97.3％。实验证明，可利用本发明的肿瘤血管内皮细胞的提取方法提取肿瘤血管内皮细胞。

Description

血管内皮细胞的快速提取方法

技术领域

本发明涉及生物医学领域中血管内皮细胞的快速提取方法。

背景技术

在肿瘤的发生和发展过程中，肿瘤血管在此过程中所扮演的角色至关重要。当瘤体生长到1mm³大小时，就分泌了大量的血管内皮细胞生长因子VEGF，诱使瘤体周围生长出许多自己专属的肿瘤新生血管。这些肿瘤血管呈奇特的螺旋状，连接在正常血管上，在形态、功能、蛋白质表达、对细胞因子的反应性及遗传学水平上，它与正常血管存在明显差异。

肿瘤血管新生分为血管生成(angioenesis)和血管发生(vasculogenesis)，前者是宿主成熟血管发展而来，后者则是由骨髓或循环系统中的内皮祖细胞，在肿瘤微环境中各种细胞因子的刺激下，定向诱导分化而来。除此之外，肿瘤血管还存在血管共生(vesselco option)和血管拟态(vasculogenic mimicry)两种形式。血管拟态多见于侵袭性较高的肿瘤组织，其内不含内皮细胞，完全由肿瘤细胞构成，在结构和功能上类似血管，被看作是肿瘤组织的另一套循环系统。

以肿瘤供养血管网为靶点的药物是提高肿瘤治愈率的一种新方法。正是这种固有差异为新药物的设计和治疗策略的高度选择性提供了多种独特的靶点。但是在现有的肿瘤血管内皮细胞提取方法上，不能获得大量的肿瘤血管内皮细胞，为研究其机制及作用带来很大的影响。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何提高提取肿瘤血管内皮细胞的提取量及质量。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了肿瘤血管内皮细胞的提取方法。

本发明所提供的肿瘤血管内皮细胞的提取方法，包括S1)和S2)：

S1)用眼科剪剪碎离体的肿瘤组织得到肿瘤单细胞；

S2)分选所述肿瘤单细胞得到所述肿瘤血管内皮细胞。

上述方法中，所述眼科剪又称眼科手术剪、眼用手术剪，是剪切眼部软组织用的器械。所述眼科剪可为头端宽0.4毫米,尖而不锐的眼科剪；所述眼科剪也可为头端宽1.6毫米的眼科剪。

所述眼科剪具体可为张家港市大都医疗器械有限公司的型号为YYJ-PT＞10cm的弯剪。

所述离体的肿瘤组织可在PBS中浸泡1-3分钟后用所述眼科剪剪碎得到所述肿瘤单细胞。

上述方法中，所述S1)可包括A1)和A2)：

A1)用所述眼科剪剪碎所述离体的肿瘤组织得到破碎肿瘤组织；

A2)向所述破碎肿瘤组织中加入酶进行消化得到所述肿瘤单细胞。

所述破碎肿瘤组织的大小可为0.027-0.125mm³，具体可为(0.3-0.5)mm×(0.3-0.5)mm×(0.3-0.5)mm。

上述方法中，所述用所述眼科剪剪碎所述离体的肿瘤组织得到破碎肿瘤组织还可包括向所述离体的肿瘤组织和/或所述破碎肿瘤组织上添加PBS的步骤。

上述方法中，所述酶可为胶原酶和/或胰酶。

上述方法中，所述A2)可包括B1)和B2)：

B1)向所述破碎肿瘤组织中加入胶原酶进行消化得到胶原酶消化后的肿瘤组织；

B2)向所述胶原酶消化后的肿瘤组织中加入胰酶进行消化得到所述肿瘤单细胞。

上述方法中，所述B1)可包括C1)、C2)和C3)：

C1)向所述破碎肿瘤组织中加入胶原酶溶液得到胶原酶-肿瘤组织混合物；

C2)将所述胶原酶-肿瘤组织混合物在震荡器上进行震荡，得到震荡后的胶原酶-肿瘤组织混合物；

C3)将所述震荡后的胶原酶-肿瘤组织混合物在37℃孵育，得到所述胶原酶消化后的肿瘤组织。

上述方法中，C2)所述震荡的时间可为3-5分钟。C2)所述震荡的频率可为1500-2000rpm，具体可为1700rpm。C3)所述孵育可在37℃水浴锅中进行；所述孵育的时间可为1-3分钟。

上述方法中，所述C2)和所述C3)可交替进行10-15次。

上述方法中，所述胶原酶可为胶原酶Ⅰ。

上述方法中，所述胶原酶溶液可为胶原酶Ⅰ溶液。所述胶原酶Ⅰ溶液可为向DMEM完全培养基中加入胎牛血清(FBS)和P/S得到的溶液，其中所述胎牛血清的体积百分比浓度为10％，所述P/S的体积百分比浓度为1％。所述P/S为向超纯水(DDH₂O)中加入胶原酶Ⅰ、青霉素和链霉素得到溶液。所述P/S中胶原酶Ⅰ的浓度可为10mg/ml，所述青霉素的浓度可为100u/ml，所述链霉素的浓度可为100u/ml。所述胶原酶Ⅰ溶液中胶原酶Ⅰ的浓度可为1000mg/ml。

所述DMEM完全培养基具体可为Gibco公司产品，货号为11995-065。所述胎牛血清具体可为Gibco公司产品，货号为10099-141。所述胶原酶Ⅰ具体可为北京索莱宝科技有限公司产品，货号为C8140-100。

上述方法中，所述方法还包括将所述胶原酶消化后的肿瘤组织进行洗涤的步骤。所述洗涤可用PBS进行。

上述方法中，所述B2)可包括D1)和D2)：

D1)向所述胶原酶消化后的肿瘤组织中加入胰酶得到胰酶-肿瘤组织混合物；

D2)将所述胰酶-肿瘤组织混合物在震荡器上进行震荡，得到所述肿瘤单细胞。

上述方法中，D2)所述震荡的时间可为8-12分钟。所述震荡的频率可为1500-2000rpm，具体可为1700rpm。

上述方法中，所述胰酶可为胰酶溶液。所述胰酶溶液可为向DDH₂O中加入NaCl、NaHCO₃、葡萄糖、EDTA和胰酶得到的溶液，其中，所述NaCl的浓度可为0.8g/ml，所述NaHCO₃的浓度可为0.05g/ml，所述葡萄糖的浓度可为0.1g/ml，所述EDTA的浓度可为0.03g/ml，所述胰酶的浓度可为0.25g/ml。

上述方法中，所述方法还包括将所述肿瘤单细胞进行洗涤的步骤。所述洗涤可用PBS进行。

上述方法中，所述提取方法中可利用免疫磁珠法分选所述肿瘤单细胞得到所述肿瘤血管内皮细胞。所述利用免疫磁珠法分选所述肿瘤单细胞所用免疫磁珠偶联CD105抗体。

上述方法中，所述利用免疫磁珠法分选所述肿瘤单细胞的具体方法可包括H1)、H2)和H3)：

H1)用溶液A重悬所述肿瘤单细胞得到肿瘤单细胞悬浮液；

H2)向所述溶液A中加入磁珠分离液，混合均匀后于磁力架上放置后弃上层液体，用所述溶液A重悬沉淀得到磁珠混悬液；

H3)将所述肿瘤单细胞悬浮液和所述磁珠混悬液混合后进行细胞的分选，去除所述磁珠得到所述肿瘤血管内皮细胞。

其中，所述肿瘤单细胞悬浮液和所述磁珠悬浮液的体积比可为9:1。所述溶液A可为向0.01M PBS中加入BSA得到的溶液，所述溶液A中所述BSA的浓度可为0.1mg/100ml。

上述方法中，所述去除所述磁珠具体可用release buffer去除。

其中，所述release buffer具体可为德国美天旎生物技术有限公司(MACS)产品，货号为130-051-201。

上述方法中，所述方法还包括将所述肿瘤单细胞过筛子进行过滤的步骤。所述筛子具体可为80目的筛子。

上述方法中，所述肿瘤可为恶性肿瘤，如肺癌和/或肝癌和/或肠癌和/或前列腺癌和/或胰腺癌等。所述肿瘤可为人肺腺癌。所述肿瘤具体可为在SCID小鼠上生长的人肺腺癌。

本发明中，所述PBS可为0.01M PBS。

本发明中，所述震荡器可为IKA产品，型号为VORTX1。

本发明中，所述眼科剪也可用其他将肿瘤组织充分剪碎的工具替代。

实验证明，利用本发明的肿瘤血管内皮细胞的提取方法得到的肿瘤血管内皮细胞纯度非常高，肿瘤血管内皮细胞高表达CD105，表达率为97.3％。成管实验结果显示肿瘤血管内皮细胞抱团形成管腔，此为血管内皮细胞的一个重要特征，而Dil-acLDL实验结果也显示肿瘤血管内皮细胞可以吞噬Dil-acLDL，表明肿瘤血管内皮细胞具有内皮细胞的功能，表明利用本发明的肿瘤血管内皮细胞的提取方法得到的细胞为肿瘤血管内皮细胞。本发明的肿瘤血管内皮细胞的提取方法提取血管内皮细胞所需时间短，2-3小时时间即可完成肿瘤血管内皮细胞的提取。实验证明，可利用本发明的肿瘤血管内皮细胞的提取方法提取肿瘤血管内皮细胞。

附图说明

图1为从荷瘤小鼠剥离得到的肿瘤组织。

图2为用眼科剪充分剪碎肿瘤组织得到的剪碎的肿瘤组织。

图3为肿瘤血管内皮细胞的提取过程中用到的振荡器和水浴锅。其中，A为振荡器；B为水浴锅。

图4为将分选得到的肿瘤血管内皮细胞进行培养得到的贴壁的肿瘤血管内皮细胞。

图5为利用本发明的肿瘤血管内皮细胞的提取方法得到的肿瘤血管内皮细胞的CD105的表达率。

图6为利用本发明的肿瘤血管内皮细胞的提取方法得到的肿瘤血管内皮细胞的成管实验结果。

图7为利用本发明的肿瘤血管内皮细胞的提取方法得到的肿瘤血管内皮细胞的Dil-acLDL吞噬实验结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的眼科剪为张家港市大都器械医疗有限公司的型号为YYJ-PT＞10cm的弯剪。该眼科剪头端宽0.4毫米，尖而不锐。

下述实施例中的人肺腺癌A549细胞为ATCC产品，货号为CCL-185。

下述实施例中的SCID小鼠为北京维通利华实验动物技术有限公司产品。

下述实施例中的胎牛血清(FBS)为Gibco产品，货号为10099-141。

下述实施例中的胶原酶Ⅰ溶液为向DMEM完全培养基(Gibco,货号11995-065)中加入胎牛血清(FBS，Gibco公司产品，货号为10099-141)和P/S得到的溶液，其中胎牛血清的体积百分比浓度为10％，P/S的体积百分比浓度为1％。P/S为向超纯水(DDH₂O)中加入胶原酶Ⅰ(北京索莱宝科技有限公司，货号：C8140-100)、青霉素(索莱宝，货号P8420)和链霉素(索莱宝，货号S8290-5)得到溶液，P/S中胶原酶Ⅰ的浓度可为10mg/ml，青霉素的浓度为100u/ml，链霉素的浓度为100u/ml。该胶原酶Ⅰ溶液中胶原酶Ⅰ的浓度为1000mg/ml。

下述实施例中的胰酶溶液为向DDH₂O中加入NaCl、NaHCO₃、葡萄糖、EDTA和胰酶得到的溶液，其中，NaCl的浓度为0.8g/ml，NaHCO₃的浓度为0.05g/ml，葡萄糖的浓度为0.1g/ml，EDTA的浓度为0.03g/ml，胰酶的浓度为0.25g/ml。

下述实施例中的release buffer为德国美天旎生物技术有限公司(MACS)产品，货号为130-051-201。

下述实施例中的所述溶液A为向0.01M PBS中加入BSA得到的溶液，溶液A中，所述BSA的浓度为0.1mg/100ml。

下述实施例中的层析柜为北京博医康实验仪器有限公司产品，型号为YC-2。

下述实施例中的磁力架为MACS公司产品，型号为130-092-168。

下述实施例中的振荡器为IKA产品，型号为VORTX1。

下述实施例中的0.01M PBS的配制方法为：将0.2g KCl、0.24g KH₂PO₄、8.0g NaCl和1.44g Na₂HPO₄溶解于1000ml DDH₂O中，得到0.01M PBS。

实施例1、肿瘤血管内皮细胞的提取及鉴定

1、肿瘤血管内皮细胞的提取

肿瘤血管内皮细胞的提取方法，包括S1)和S2)：

S1)用眼科剪剪碎离体的肿瘤组织得到肿瘤单细胞；

S2)分选所述肿瘤单细胞得到所述肿瘤血管内皮细胞。

实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：

1.1 单细胞的制备

取3只4-5周龄SCID小鼠，每只于右侧腋下皮下接种人肺腺癌A549细胞，待肿瘤平均体积长至约1.5×1×1cm³时，得到荷瘤小鼠。将荷瘤小鼠颈椎脱臼处死后浸泡于75％(体积百分比浓度)的乙醇水溶液中3-5min，得到消毒后的小鼠；在超净工作台内，用无菌剪刀和无菌镊子从消毒后的小鼠胸口剪开小鼠皮肤，小心剥离得到肿瘤组织(图1)，做到小鼠不出血。

用眼科剪稍微剪碎肿瘤组织并在0.01M PBS中浸泡(使肿瘤组织完全浸润在0.01M PBS中)2min后将其取出，得到浸泡后的肿瘤组织。用眼科剪在无菌平皿上充分剪碎浸泡后的肿瘤组织(此时的肿瘤组织大小约为0.027-0.125mm³(即(0.3-0.5)mm×(0.3-0.5)mm×(0.3-0.5)mm)，在剪碎浸泡后的肿瘤组织的过程中适时滴加0.01M PBS，保持该肿瘤组织处于湿润状态，得到剪碎的肿瘤组织(图2)。向上述盛有剪碎的肿瘤组织的无菌平皿中胶原酶Ⅰ溶液，用剪过头的1ml枪头吹散肿瘤组织，得到胶原酶Ⅰ-肿瘤组织混合物。

把胶原酶Ⅰ-肿瘤组织混合物转移到50ml离心管中，然后将该离心管进行如下C2)和C3)的处理，C2)和C3)交替进行15次：

C2)将盛有胶原酶Ⅰ-肿瘤组织混合物的50ml离心管在震荡器(图3中A)上进行震荡3min，震荡的频率为1700rpm，得到震荡后的胶原酶-肿瘤组织混合物；

C3)将震荡后的胶原酶-肿瘤组织混合物在37℃水浴锅(图3中B)中孵育2min，得到胶原酶消化后的肿瘤组织A。

将步骤C3)的胶原酶消化后的肿瘤组织A进行如下c1)、c2)和c3)的处理：

c1)将步骤C3)的胶原酶消化后的肿瘤组织于300g下离心6min，弃上清液；

c2)向步骤c1)的沉淀中加入20ml 0.01M PBS，混匀后于300g下离心6min，弃上清液；

c3)向步骤c2)的沉淀中加入20ml 0.01M PBS，混匀后于300g下离心6min，弃上清液，得到胶原酶消化后的肿瘤组织；

向胶原酶消化后的肿瘤组织中加入胰酶溶液，得到胰酶-肿瘤组织混合物，将胰酶-肿瘤组织混合物在震荡器上进行震荡10min(震荡的频率为1700rpm)后，并加入10ml胎牛血清(FBS)终止消化，得到胰酶消化后的肿瘤细胞悬浮液。将胰酶消化后的肿瘤细胞悬浮液倒入80目的筛子中进行过滤，得到过滤后的肿瘤细胞悬浮液。

将过滤后的肿瘤细胞悬浮液进行如下d1)、d2)和d3)的处理：

d1)将过滤后的肿瘤细胞悬浮液于300g下离心6min，弃上清；

d2)向步骤d1)的沉淀中加入20ml 0.01M PBS，混匀后于300g下离心6min，弃上清；

d3)向步骤d2)的沉淀中加入20ml 0.01M PBS，混匀后于300g下离心6min，弃上清，得到胰酶消化后的肿瘤细胞。

向胰酶消化后的肿瘤细胞中加入9ml 4℃预冷的溶液A，得到肿瘤细胞悬浮液。

1.2 磁珠的准备

用1ml移液枪吹打磁珠分离液(磁珠分离液为MACS产品，货号为130-051-201，含有偶联CD105抗体的免疫磁珠)使其混合均匀，吸取100μl的磁珠分离液加至1ml的溶液A中，得到磁珠混悬液A，将磁珠混悬液A再磁力架上放置一分钟，弃液体，向管中加入1ml 0.01M PBS，重悬磁珠，得到磁珠混悬液。

1.3 肿瘤血管内皮细胞的分选

将1ml步骤1.2的磁珠混悬液加入至步骤1.1的9ml肿瘤细胞悬浮液中，混合均匀后于4℃层析柜中旋转孵育30min，得到混合液。

将10ml混合液转移到插在磁力架上的EP管中，等待两分钟，吸去上层液体，得到磁珠-细胞复合物。将磁珠-细胞复合物按照下述步骤进行处理，共重复五次，得到磁珠-阳性细胞混合物：将盛有磁珠-细胞复合物的EP管拿离磁力架，向盛有磁珠-细胞复合物的EP管中加入1.5ml溶液A，用移液枪吹匀后，将该EP管放至磁力架上，吸去上层液体。

用release buffer洗去磁珠-阳性细胞混合物的磁珠，得到肿瘤血管内皮细胞，具体操作步骤如下：向肿瘤血管内皮细胞中加入500μl release buffer重悬磁珠-阳性细胞混合物，室温放置15min，放置于磁力架2min，吸取含阳性细胞的液体，得到肿瘤血管内皮细胞。

将上述肿瘤血管内皮细胞进行培养，培养条件为：ECM内皮细胞培养基(Sciencell公司，货号1001)在37℃，5％CO₂的湿润培养箱培养，得到贴壁的肿瘤血管内皮细胞(图4)。

2、肿瘤血管内皮细胞的鉴定

2.1 肿瘤血管内皮细胞CD105的表达水平检测

用流式细胞仪测定步骤1的肿瘤血管内皮细胞表达CD105的水平。首先将步骤1的肿瘤血管内皮细胞与PE标记的二抗(PE标记的二抗为北京四正柏生物科技有限公司产品，货号为SPP101-500U)在0.01M PBS中4℃反应30分钟，反应结束后以0.01M PBS洗三次，上机分析，结果如图5所示。结果显示肿瘤血管内皮细胞纯度很高，高表达CD105，表达率为97.3％(即表达CD105的肿瘤血管内皮细胞占所检测肿瘤血管内皮细胞的百分比为97.3％)。

2.2 肿瘤血管内皮细胞的成管实验

1)从冰箱中取出冷藏的枪头和μ-Slide Angiogenesis，在μ-SlideAngiogenesis每个孔中加入10μL Matrigel。加入胶时注意保持枪头垂直于孔中间位置，Matrigel一直保持放在冰上。

2)加入Matrigel后，将μ-Slide Angiogenesis放入合适大小的培养皿中，培养皿中加入吸满水的吸水纸，以防止μ-Slide Angiogenesis中水分蒸发。将整个培养皿放入培养箱中，放置30分钟使胶凝固。

3)在Matrigel凝固的过程中，向步骤1的肿瘤血管内皮细胞加入胰蛋白酶溶液(胰蛋白酶溶液为向100ml 0.01M PBS中加入0.25g胰蛋白酶粉(北京索莱宝科技有限公司，货号：T8150)和0.01g EDTA(北京索莱宝科技有限公司，货号：E8030)得到的溶液)消化肿瘤血管内皮细胞后，将细胞悬液浓度调整到2×10⁵个细胞/mL。

4)从培养箱中取出μ-Slide Angiogenesis，每孔加入步骤3)的细胞悬液50μL。

5)μ-Slide Angiogenesis盖上盖子后放入培养箱培养。

6)每隔4-6小时记录实验结果。

实验结果显示细胞抱团形成管腔(图6)。

2.3 肿瘤血管内皮细胞的Dil-acLDL吞噬实验

将步骤1的肿瘤血管内皮细胞铺板于6孔板中，培养24小时，将培养基更换为含Dil-acLDL的内皮细胞培养基，37℃培养箱中孵育3小时，0.01M PBS洗涤2遍，4％多聚甲醛固定，荧光显微镜下观察。实验结果显示肿瘤血管内皮细胞可以吞噬Dil-acLDL(图7中红色荧光)，表明利用本发明的方法得到的肿瘤血管内皮细胞具有内皮细胞的功能。

Claims (10)

1.肿瘤血管内皮细胞的提取方法，包括S1)和S2)：

S1)用眼科剪剪碎离体的肿瘤组织得到肿瘤单细胞；

S2)分选所述肿瘤单细胞得到所述肿瘤血管内皮细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述S1)包括A1)和A2)：

A1)用所述眼科剪剪碎所述离体的肿瘤组织得到破碎肿瘤组织；

A2)向所述破碎肿瘤组织中加入酶进行消化得到所述肿瘤单细胞。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述酶为胶原酶和/或胰酶。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述A2)包括B1)和B2)：

B1)向所述破碎肿瘤组织中加入胶原酶进行消化得到胶原酶消化后的肿瘤组织；

B2)向所述胶原酶消化后的肿瘤组织中加入胰酶进行消化得到所述肿瘤单细胞。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述B1)包括C1)、C2)和C3)：

C1)向所述破碎肿瘤组织中加入胶原酶溶液得到胶原酶-肿瘤组织混合物；

C2)将所述胶原酶-肿瘤组织混合物在震荡器上进行震荡，得到震荡后的胶原酶-肿瘤组织混合物；

C3)将所述震荡后的胶原酶-肿瘤组织混合物在37℃孵育，得到所述胶原酶消化后的肿瘤组织。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：C2)所述震荡的时间为3-5分钟；

和/或，

C3)所述孵育在37℃水浴锅中进行；

和/或，

所述孵育的时间为1-3分钟。

7.根据权利要求4或5或6所述的方法，其特征在于：所述胶原酶为胶原酶Ⅰ。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述B2)包括D1)和D2)：

D1)向所述胶原酶消化后的肿瘤组织中加入胰酶得到胰酶-肿瘤组织混合物；

D2)将所述胰酶-肿瘤组织混合物进行震荡，得到所述肿瘤单细胞。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述提取方法中利用免疫磁珠法分选所述肿瘤单细胞得到所述肿瘤血管内皮细胞。

10.根据权利要求1-9任一所述的方法，其特征在于：所述方法还包括将所述肿瘤单细胞进行过滤的步骤。