CN110066767A - 一种鼻咽癌组织类器官培养基及培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鼻咽癌组织类器官培养基及培养方法，该培养基针对鼻咽癌组织来源细胞的生长特点，实现肿瘤细胞短时间内快速扩增形成类器官，并结合类器官传代技术可以在有限时间内获取足够多的类器官开展研究实验操作。本发明的培养基，可以有效的维持组织细胞特异性，组织形态也高度相似。通过本发明的方法，80％以上的鼻咽癌样本可以成功形成类器官，并且在组织病理学上类器官与原组织高度一致。

Description

一种鼻咽癌组织类器官培养基及培养方法

技术领域

本发明涉及类器官培养领域，进一步涉及鼻咽癌组织类器官培养领域，特别涉及一种鼻咽癌组织类器官培养基及培养方法。

背景技术

类器官(Organoids)是衍生于干细胞或前体细胞的器官特异性细胞集合。体外培养的类器官在细胞成分和组织架构上与对应器官高度相似，并具备相应的功能学特征。类器官培养是对常规细胞生物学技术的重大改革。与常规细跑培养在二维环境中培养单一细胞类群不同，类器官培养是在三维环境中培养出特定组织器官包含的多种细胞类群，其培养体系与体内微环境更为相似。因此，在各种器官生理病理的基础研究、精准医疗、药物筛选和开发、基因治疗、再生医学等方面，显示出巨大的应用前景。

鼻咽癌是指发生于鼻咽腔顶部和侧壁的恶性肿瘤。是我国高发恶性肿瘤之一，主要发生于我国南方五省，发病率为耳鼻咽喉恶性肿瘤之首。鼻咽癌的发病因素是多方面的。多年来临床观察及实验研究表明，以下因素与鼻咽癌的发生有密切关系，包括遗传因素，病毒感染，环境因素。鼻咽癌大多对放射治疗具有中度敏感性，放射治疗是鼻咽癌的首选治疗方法。但是对较高分化癌，病程较晚以及放疗后复发的病例，手术切除和化学药物治疗也是不可缺少的手段。另外，因为西方国家鼻咽癌的发病率很低(世界卫生组织调查报道，全球有80％的鼻咽癌患者在中国)，所有对其研究也较少，因此建立鼻咽癌类器官的培养和药物筛选体系对中国鼻咽癌患者尤其意义重大。

发明内容

本发明目的在于提供一种用于鼻咽癌组织类器官的培养基和培养方法。该方法培养可操作性和重复性好，所用培养基配方价格适中。

本发明采用的技术方案如下：

一种鼻咽癌组织类器官的培养基，培养基的成分如下：氢化可的松、EGF、Insulin，ROCK抑制剂、FBS，Advanced DMEM/F12、青霉素链霉素混合液、两性霉素B。

进一步地，培养基的成分及其含量如下：氢化可的松，10ng/ml～40ng/ml；EGF，0.5ng/ml～5ng/ml；Insulin，2μg/ml～7μg/ml；ROCK抑制剂，5μM～15μM；FBS，1-10％；青霉素链霉素混合液，0.5-5x；两性霉素B，2μg/ml～5μg/ml。

进一步地，培养基的成分及其含量如下：氢化可的松，25ng/ml；EGF，2.5ng/ml；Insulin，4μg/ml；ROCK抑制剂，10μM；FBS，5％；青霉素链霉素混合液，1x；两性霉素B，3.5μg/ml。

进一步地，ROCK抑制剂为RhoA激酶抑制剂。

本发明还公开了一种鼻咽癌组织类器官培养方法，具体步骤为：将鼻咽癌组织预处理，将预处理所得细胞混合Matrigel，滴于细胞培养皿中，放置一段时间，凝固Martigel；加入培养基，进行培养。

进一步地，所述培养方法的具体步骤为：将预处理所得细胞混合Matrigel，约10000细胞每40μl胶滴，滴于6cm细胞培养皿中，放置培养皿至37℃，5％CO₂中20min，凝固Martigel；加入4.5ml培养基，置37℃，5％CO₂，细胞培养箱培养；每间隔4天更换一次培养基。

进一步地，所述鼻咽癌组织预处理步骤如下：将鼻咽癌组织使用Hank's液漂洗，在细胞培养皿中将组织剪成小块；加入组织消化液，将组织块转移至离心管内，摇床孵育消化，用细胞筛网过滤细胞，滤液加入DMEM/F12终止消化，离心，去除上清；细胞计数，置冰待用。

进一步地，所述鼻咽癌组织预处理步骤如下：将鼻咽癌组织使用4℃预冷的Hank's液漂洗至上清清澈干净。在6cm或10cm细胞培养皿中使用一次性剪刀将组织剪成小块，组织块大小在3mm左右即可。加入5ml组织消化液，将组织块转移至15ml离心管内，转移至37℃、220rpm摇床孵育消化1小时。用100μm细胞筛网过滤细胞，滤液加入5ml DMEM/F12终止消化，离心(4℃，250g，2min)，去除上清；细胞计数，置冰待用。

进一步地，所述组织消化液用DMEM/F12配制，包含如下成分：胶原蛋白水解酶、中性蛋白酶、脱氧核糖核酸酶、FBS、青霉素链霉素混合液、两性霉素B。

进一步地，所述组织消化液的成分含量为：胶原蛋白水解酶，200U/ml；中性蛋白酶，2mg/ml；脱氧核糖核酸酶，0.1mg/ml；FBS，2％；青霉素链霉素混合液，1x；两性霉素B，2μg/ml。

本发明还公开了一种鼻咽癌组织类器官传代培养方法，具体步骤为：吸掉类器官培养皿中的培养基，用Hank's液漂洗一次后加入类器官消化液消化；收集消化液及细胞，加入培养基终止消化；离心，去除上清；将所得细胞与Matrigel混合继续培养。

进一步地，视类器官生长情况，一般每10天左右可进行传代培养。传代培养的步骤为：吸掉类器官培养皿中的培养基，用5ml Hank's液漂洗一次后加入5ml类器官消化液置37℃，5％CO₂，细胞培养箱消化10min；收集消化液及细胞至15ml离心管，并加入5ml培养基终止消化；离心(250g，2min)，去除上清；将所得细胞与Matrigel混合继续培养。

进一步地，所述Hank's液含有1x青霉素链霉素混合液。

进一步地，所述类器官消化液包含如下成分：胶原蛋白水解酶，中性蛋白酶，Hank's液，HEPES。

进一步地，所述类器官消化液的成分含量为：胶原蛋白水解酶，300U/ml；中性蛋白酶，1mg/ml；Hank's液，1x；HEPES，1％。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明的鼻咽癌组织类器官的培养基针对鼻咽癌组织来源细胞的生长特点，实现肿瘤细胞短时间内快速扩增形成类器官，并结合类器官传代技术可以在有限时间内获取足够多的类器官开展研究实验操作。本发明的培养基，可以有效的维持组织细胞特异性，组织形态也高度相似。通过本发明的方法，80％以上的鼻咽癌样本可以成功形成类器官，并且在组织病理学上类器官与原组织高度一致。除了满足科学研究的需要，在临床用药指导方面，目前鼻咽癌患者没有合适的靶向药物，活检样本的体外类器官培养为患者的用药指导提供了很好的一个有益的选择。

附图说明

图1，鼻咽癌组织培养6天形成的类器官。

图2，缺少类器官培养基中各成份对类器官形成数量的影响。缺少任一成份都会造成类器官形成数目减少。

图3，鼻咽癌组织类器官与源肿瘤组织的HE染色对比显示两者在组织病理结构上高度一致。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换，均落入本发明保护范围。

材料说明：

EGF:购自R&D公司，表皮生长因子，使用PBS溶至10μg/ml浓度原液，分装，-20℃保存。

ROCK抑制剂：ROCK特异性通路阻断剂，Y-27632 dihydrochloride，购自购买自Tocris Bioscience，-20℃保存

Matrigel：购自Corning公司，分装-20℃保存；使用需提前一天置4℃

胶原蛋白水解酶：购自Worthington Biochemical，-20℃保存

脱氧核糖核酸酶：购自Roche Diagnostics，-20℃保存

胰岛素：购自Sigma公司，-20℃保存

中性蛋白酶：购自Worthington Biochemical，-20℃保存

HEPES：购自Sigma公司，4℃保存

Hank's液：购自GIBCO公司，4℃保存

氢化可的松：购自Sigma公司，-20℃保存

FBS：胎牛血清，购自GIBCO公司，分装-20℃保存；使用需提前一天置4

Advanced DMEM/F12：购自GIBCO公司，4℃保存

DMEM/F12：购自GIBCO公司，4℃保存

青霉素链霉素混合液：购自GIBCO公司，4℃保存

两性霉素B：购自购自GIBCO公司，4℃保存

实施例1

一种鼻咽癌组织类器官培养基，其成分及其含量如下：氢化可的松，25ng/ml；EGF，2.5ng/ml；Insulin，4μg/ml；Y-27632 dihydrochloride，10μM；FBS，5％；青霉素链霉素混合液，1x；两性霉素B，3.5μg/ml。

实施例2

一种组织消化液，用DMEM/F12配制，其成分及其含量如下：胶原蛋白水解酶，200U/ml；中性蛋白酶，2mg/ml；脱氧核糖核酸酶，0.1mg/ml；FBS，2％；青霉素链霉素混合液，1x；两性霉素B，2μg/ml。

实施例3

一种类器官消化液，其成分及其含量如下：胶原蛋白水解酶，300U/ml；中性蛋白酶，1mg/ml；Hank's液，1x；HEPES，1％。

实施例4

一种鼻咽癌组织类器官培养方法，具体步骤为：将鼻咽癌组织使用4℃预冷的Hank's液(含有1x青霉素链霉素混合液)漂洗至上清清澈干净。在6cm或10cm细胞培养皿中使用一次性剪刀将组织剪成小块，组织块大小在3mm左右即可。加入5ml实施例2的组织消化液，将组织块转移至15ml离心管内，转移至37℃、220rpm摇床孵育消化1小时。用100μm细胞筛网过滤细胞，滤液加入5ml DMEM/F12终止消化，离心(4℃，250g，2min)，去除上清；细胞计数，置冰待用。

将预处理所得细胞混合Matrigel，约10000细胞每40μl胶滴，滴于6cm细胞培养皿中，放置培养皿至37℃，5％CO₂中20min，凝固Martigel；加入4.5ml实施例1的培养基，置37℃，5％CO₂，细胞培养箱培养；每间隔4天更换一次培养基。鼻咽癌细胞在经过1周左右的培养后可在显微镜下看到类器官形成。

图1为鼻咽癌组织培养6天形成的类器官。图3显示，鼻咽癌组织类器官与源肿瘤组织的HE染色对比显示两者在组织病理结构上高度一致。

实施例5

视类器官生长情况，一般每10天左右可进行传代培养。传代培养的步骤为：吸掉类器官培养皿中的培养基，用5ml Hank's液(含有1x青霉素链霉素混合液)漂洗一次后加入5ml实施例3的类器官消化液置37℃，5％CO₂，细胞培养箱消化10min；收集消化液及细胞至15ml离心管，并加入5ml实施例1的培养基终止消化；离心(250g，2min)，去除上清；将所得细胞与Matrigel混合继续培养。

实施例6

对培养基进行关键成分重要性研究，图2给出缺少类器官培养基中各成份对类器官形成数量的影响。缺少任一成份都会造成类器官形成数目减少。

以上所述仅为本发明的优选实施例，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的相关技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，其中所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种鼻咽癌组织类器官培养基，其特征在于，培养基的成分如下：氢化可的松、EGF、Insulin，ROCK抑制剂、FBS，Advanced DMEM/F12、青霉素链霉素混合液、两性霉素B。

2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，培养基的成分及其含量如下：氢化可的松，10ng/ml～40ng/ml；EGF，0.5ng/ml～5ng/ml；Insulin，2μg/ml～7μg/ml；ROCK抑制剂，5μM～15μM；FBS，1-10％；青霉素链霉素混合液，0.5-5x；两性霉素B，2μg/ml～5μg/ml。

3.根据权利要求2所述的培养基，其特征在于，氢化可的松，25ng/ml；EGF，2.5ng/ml；Insulin，4μg/ml；ROCK抑制剂，10μM；FBS，5％；青霉素链霉素混合液，1x；两性霉素B，3.5μg/ml。

4.根据权利要求1-3任一项所述的培养基，其特征在于，ROCK抑制剂为RhoA激酶抑制剂，优选为Y-27632dihydrochloride。

5.一种鼻咽癌组织类器官培养方法，其特征在于，具体步骤为：将鼻咽癌组织预处理，将预处理所得细胞混合Matrigel，滴于细胞培养皿中，放置一段时间，凝固Martigel；加入权利要求1-4任一项的培养基，进行培养。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述鼻咽癌组织预处理步骤如下：将鼻咽癌组织使用Hank's液漂洗，在细胞培养皿中将组织剪成小块；加入组织消化液，将组织块转移至离心管内，摇床孵育消化，用细胞筛网过滤细胞，滤液加入DMEM/F12终止消化，离心，去除上清；细胞计数，置冰待用。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述组织消化液用DMEM/F12配制，包含如下成分：胶原蛋白水解酶、中性蛋白酶、脱氧核糖核酸酶、FBS、青霉素链霉素混合液、两性霉素B。

8.一种鼻咽癌组织类器官传代培养方法，其特征在于，具体步骤为：吸掉类器官培养皿中的培养基，用Hank's液漂洗一次后加入类器官消化液消化；收集消化液及细胞，加入权利要求1-4任一项的培养基终止消化；离心，去除上清；将所得细胞与Matrigel混合继续培养。

9.根据权利要求8的方法，其特征在于，所述类器官消化液包含如下成分：胶原蛋白水解酶，中性蛋白酶，Hank's液，HEPES。

10.根据权利要求6或8的方法，其特征在于，所述Hank's液含有1x青霉素链霉素混合液。