CN108396010A - 一种结直肠癌类器官的体外培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种结直肠癌类器官的体外培养方法包括：1)结直肠癌活检组织预处理：对结直肠癌活检组织进行清洗；剪切后进行酶消化；获得结直肠癌单细胞；2)结直肠癌单细胞体外培养：将所述结直肠癌单细胞与基质胶混合；固化后加入结直肠癌类器官培养液进行培养，获得所述结直肠癌类器官。上述方法简便、稳定、成功率高，所得到的结直肠癌类器官具有三维结构，极大保留了病人肿瘤组织特有的形态学特征，与活检组织的病理学特征高度一致。为建立类器官库和开展药物筛选提供了物质基础。
Description
技术领域
本发明涉及细胞工程领域，具体涉及一种从结直肠癌组织样本在体外培养获得类器官的方法。
背景技术
结直肠癌是人类主要的恶性肿瘤之一，威胁着人类健康。其成病机理研究发现，WNT、RAS-MAPK、PI3K、TP53、TGF等信号通路的异常对结直肠癌的发生有关键作用。除此之外，随着结直肠癌基因组研究的进一步深入发现结直肠癌患者具有微卫星DNA不稳定或者染色体不稳定，与其它癌症相比，结直肠癌具有更多基因异常多样性，患者常具有多基因突变或者多重基因异常。因此，只通过有限样本的分析无法评估治疗方案对患者的广普疗效。
对于结直肠癌的研究与治疗往往都是以来源于病人的细胞系作为对象。细胞系来源于病人，具有癌症患者的遗传信息特征，并能够体现癌症细胞的部分生理特征。但是细胞系在长期培养过程中，由于适应了二维生长的环境，从而丢失了体内原有生理特征和肿瘤的异质性。此外，从结直肠癌病人的肿瘤样本中直接建立细胞系的成功率很低，这大大的限定了所能够获得研究样本的遗传多样性。因此非常有必要建立一种全新的结直肠癌样本体外培养系统，为研究和治疗提供新途径。
在体外利用组织存在的干细胞在适宜条件下可以培养获得三维器官结构，此结构被称为类器官(organoid)。类器官由组织分化而来，与组织细胞含有相同的遗传信息特征。由于其三维结构特质，在体外环境下最大限度保留了体内的生理特性。因此，有需要开发一种简便、稳定、成功率高的结直肠癌类器官的体外培养方法。
发明内容
本发明提供了一种结直肠癌类器官的体外培养方法，在一个具体实施方式中，该方法包括：
结直肠癌活检组织预处理：对结直肠癌活检组织进行清洗；剪切后进行酶消化；获得结直肠癌单细胞；
结直肠癌单细胞体外培养：将结直肠癌单细胞与基质胶混合；固化后加入结直肠癌类器官培养液进行培养，获得结直肠癌类器官。
进一步地，结直肠癌类器官培养液至少包括有丝分裂生长因子、Wnt激动剂、ROCK抑制剂、BMP抑制剂、p38激酶抑制剂；有丝分裂生长因子为EGF、FGF中的一种或两种；Wnt激动剂选自Wnt、Wnt-3a、R-Spondin1-4中的一种或多种；ROCK抑制剂为A8301、Y-27632中的一种或两种；BMP抑制剂为Noggin；p38激酶抑制剂是SB202190。
进一步地，结直肠癌类器官培养液为含有45-55ng/mL EGF、90-110ng/mL Wnt-3a、0.8-1.2μg/ml R-Spondin1、450-550nM A8301、15-25μM Y-27632、45-55ng/mL Noggin、10-15μM SB202190、N2、B27、5-15mM HEPES、1-3mM Glutamax、450-550U/mL青霉素、450-550U/mL链霉素、11-14μg/mL两性霉素、8-12％FBS的DMEM/F12培养液。
优选地，结直肠癌类器官培养液为含有50ng/mL EGF、100ng/mL Wnt-3a、1μg/mlR-Spondin1、500nM A8301、10μM Y-27632、50ng/mL Noggin、10μM SB202190、1X N2、1XB27、10mM HEPES、2mM Glutamax、500U/mL青霉素、500U/mL链霉素、12.5μg/mL两性霉素、10％FBS的DMEM/F12培养液。
使用上述结直肠癌类器官培养液能高度有效地培养结直肠癌类器官，其培养的成功率可以达到90％。
进一步地，将结直肠癌单细胞与基质胶混合时，细胞的密度为1～1.5X104细胞/每40-50μL基质胶；每40-50μL基质胶加入250μl结直肠癌类器官培养液进行培养。在上述细胞密度时，结直肠癌类器官的存活率最高。
进一步地，培养7-10天后进行传代，按1～1.5X103细胞/每40-50μL基质接种，稳定传代即获得所述的结直肠癌类器官。
进一步地，上述基质胶为Matrigel基质。
进一步地，上述清洗为，结直肠癌活检组织使用4℃预冷的PBS漂洗至上清清澈干净；剪切为，将结直肠癌活检组织剪切成4-6mm的组织块。
进一步地，酶消化为在所述组织块中加入酶消化溶液，在37℃孵育50-70分钟，孵育过程中使用摇床进行轻柔混合；酶消化溶液为含有70-80单位/mL的胶原蛋白水解酶、120-130μg/mL中性蛋白酶、2900-3100单位/mL脱氧核糖核酸酶、青酶素链霉素混合液、2-3％FBS的DMEM培养液。
进一步地，酶消化之后，打碎聚团的组织团块，用70μM滤膜过滤，离心收集结直肠癌单细胞，并用细胞洗涤液洗涤和重悬；其中，细胞洗涤液为含有1-3mM Glutamax、5-15mMHEPES、青酶素链霉素混合液的DMEM/F12培养液。
采用本发明的体外培养获得结直肠癌类器官的方法，简便、时间短、稳定、成功率高，可利用来源于病人的结直肠癌活检组织样本在短时间内获得肿瘤类器官。其中，特定的培养基成分及结直肠癌单细胞与基质胶混合时的细胞密度，能有效提高类器官培养成率和存活率，存活率达到90％以上。所得到的结直肠癌类器官具有三维结构，极大保留了病人肿瘤组织特有的形态学特征，与活检组织的病理学特征高度一致。在体外培养环境下，所得到的类器官可以进行增殖扩增。增殖产生的新个体仍然保持肿瘤细胞的遗传信息和生理特征。因此，本发明为癌症研究、在更广泛遗传背景下对肿瘤治疗方案进行筛选和评估、建立类器官库和开展药物筛选提供了良好的基础。
附图说明
图1是本发明的较佳实施例所获得的结直肠癌类器官形态图。
图2是本发明的较佳实施例的所获得的结直肠癌类器官的苏木精-伊红染色切片显示，结直肠癌病人的活检(左)和类器官(右)具有相同的病理表型。
图3是本发明的较佳实施例的结直肠癌类器官的培养存活率图。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明作进一步地说明，应理解这些实施例仅作为例证的目的，不用于限制本发明的保护范围。
在实施例中未注明具体实验温度的条件为室温操作(20-25℃)。实施例中使用的原料及原料配置如下：
1)DMEM、DMEM(Dulbecco’s modified Eagle medium)/F12培养液：购自Gibco，4℃保存；
2)胎牛血清(FBS)：购自Hyclone公司，4℃保存，在使用前与培养液按比例混合；
3)N2：购自Invitrogen公司，100X浓度原液，4℃保存，在使用前加至培养液到终浓度1X。
4)B27：购自Invitrogen公司，50X浓度原液，4℃保存，在使用前加至培养液到终浓度1X。5)HEPES：购自Sigma公司，1M浓度原液，4℃保存。
6)Glutamax：购自Invitrogen公司，200mM浓度原液，4℃保存。
7)Wnt3a：购自R&D system公司，使用PBS溶至10μg/ml浓度原液，-20℃保存。
8)EGF：购自Life Technologies公司，使用PBS溶至100μg/ml浓度原液，-20℃保存。
9)R-Spondin1：购自Peprotech公司，使用PBS溶至1mg/ml浓度原液，-20℃保存。
10)Noggin：购自Peprotech公司，使用PBS溶至50μg/ml浓度原液，-20℃保存。
11)Y-27632：购自sigma公司，10mM浓度原液，-20℃保存。
12)A8301：购自Sigma公司，使用DMSO溶至50mM浓度原液。
13)青霉素-链霉素(Penicillin-Streptomycin)：购于Invitrogen。1000X浓度原液用时加至培养液到1X。
14)两性霉素B(Amphotericin B)：购于Gemini Bio-Products。2000X浓度原液用时加至培养液到1X。
15)SB202190：购于Tocris，使用DMSO溶至30mM浓度原液。
结直肠癌类器官的体外培养方法，包括：
(1)结直肠癌活检组织的体外处理：
利用组织清洗液对结直肠癌活检组织进行清洗，剪切成适宜操作的大小组织块，用酶消化溶液对组织块进行孵育消化，并吹打组织块产生单细胞，过滤后获得结直肠癌单细胞，重悬在细胞洗涤液中。
(2)结直肠癌单细胞体外培养
将结直肠癌单细胞与基质胶混合，固化后加入结直肠癌类器官培养液进行培养，培养7-10天后进行传代，稳定传代即获得所述的结直肠癌类器官。
优选地，基质胶为Matrigel基质；将10000-15000个结直肠癌单细胞与40μl基质胶混合；于37℃培养箱10-20分钟。
其中：
组织清洗液为PBS；
酶消化溶液为含有70-80单位/mL的胶原蛋白水解酶、120-130μg/mL中性蛋白酶、2900-3100单位/mL脱氧核糖核酸酶、青酶素链霉素混合液，并含2-3％FBS的DMEM培养液；
细胞洗涤液为含有1-3mM Glutamax、5-15mM HEPES、青酶素链霉素混合液的DMEM/F12培养液；
结直肠癌类器官培养液至少包括有丝分裂生长因子、Wnt激动剂、ROCK抑制剂、BMP抑制剂、p38激酶抑制剂；有丝分裂生长因子为EGF、FGF中的一种或两种；Wnt激动剂选自Wnt、Wnt-3a、R-Spondin1-4中的一种或多种；ROCK抑制剂为A8301、Y-27632中的一种或两种；BMP抑制剂为Noggin；p38激酶抑制剂是SB202190。
优选地，结直肠癌类器官培养液为含有有丝分裂生长因子、Wnt激动剂、ROCK抑制剂、BMP抑制剂、p38激酶抑制剂、N2、B27、HEPES、Glutamax、青霉素、链霉素、两性霉素、FBS的DMEM/F12培养液；
更优选地，结直肠癌类器官培养液为含有45-55ng/mL EGF、90-110ng/mL Wnt-3a、0.8-1.2μg/ml R-Spondin1、450-550nM A8301、15-25μM Y-27632、45-55ng/mL Noggin、10-15μM SB202190、N2、B27、5-15mM HEPES、1-3mM Glutamax、450-550U/mL青霉素、450-550U/mL链霉素、11-14μg/mL两性霉素、8-12％FBS的DMEM/F12培养液。
实施例1
(1)结直肠癌活检组织的体外处理
结直肠癌活检组织使用4℃预冷的PBS漂洗至上清清澈干净。
在6cm或10cm细胞培养皿中使用一次性手术刀将组织切割成小块，组织块大小在5mm左右即可。
使用20ml酶消化溶液将组织小块转移至50ml Falcon离心管内。酶消化溶液组成为：DMEM+2％FBS、70单位/ml胶原蛋白水解酶、120μg/ml中性蛋白酶、2900单位/ml脱氧核糖核酸酶、1X青酶素链霉素混合液。
密封离心管后将其放于37℃温度条件下孵育50分钟，在孵育过程中使用摇床轻柔混合样品。
孵育结束后，使用移液器打碎聚团的组织团块，收集70μM滤膜过滤后的细胞，即结直肠癌单细胞。
离心收集结直肠癌单细胞(1200rpm，5分钟)，将上清小心移除后，将细胞重悬到10ml细胞洗涤液，计数收集到的结直肠癌单细胞。得到的结直肠癌单细胞可以进入到下一阶段的类器官培养。细胞洗涤液组成为：DMEM/F12培养液，1mM Glutamax、5mM HEPES、1X青酶素链霉素混合液。
(2)结直肠癌细胞体外培养
将-20℃冻存保管的基质胶于4℃过夜解冻，并在整个实验过程中保持于冰上。
将所得到的结直肠癌单细胞离心收集后按照10000-15000个细胞每40μl基质胶的比例混合。
取40μl混合好的细胞种入48孔板内，放置于37℃培养箱10分钟固化后加入250μl新鲜配制的结直肠癌类器官培养液。放入37℃培养箱培养。结直肠癌类器官培养液为含有45ng/mL EGF、90ng/mL Wnt-3a、0.8μg/ml R-Spondin1、450nM A8301、15μM Y-27632、45ng/mL Noggin、10μM SB202190、1X N2、1X B27、5mM HEPES、1mM Glutamax、450U/mL青霉素、450U/mL链霉素、11μg/mL两性霉素、8％FBS的DMEM/F12培养液。
培养7-10天后进行传代，按1～1.5X103细胞/孔/每40μL基质种入24孔板内，稳定传代即获得所述的人结直肠癌类器官体。
结直肠癌单细胞在经过1-2周的培养后可以在(10X10)显微镜下看到类器官生成。通过该方法，培养的成功率可以达到90％以上，极大保留了病人肿瘤组织特有的形态学特征。
发明人意外发现，当将结直肠癌单细胞离心收集后按照10000-15000个细胞每40μl基质胶的比例混合后，用含20ng/mL EGF的结直肠癌类器官培养基培养2天，然后添加35ng/mL的EGF继续培养，这种提升浓度的培养，能进一步提高存活率。
实施例2
(1)结直肠癌活检组织的体外处理
结直肠癌活检组织使用4℃预冷的PBS漂洗至上清清澈干净。
在6cm或10cm细胞培养皿中使用一次性手术刀将组织切割成小块，组织块大小在5mm左右即可。
使用20ml酶消化溶液将组织小块转移至50ml Falcon离心管内。酶消化溶液组成为：DMEM+3％FBS、80单位/ml胶原蛋白水解酶、130μg/ml中性蛋白酶、3100单位/ml脱氧核糖核酸酶、1X青酶素链霉素混合液。
密封离心管后将其放于37℃温度条件下孵育70分钟，在孵育过程中使用摇床轻柔混合样品。
孵育结束后，使用移液器打碎聚团的组织团块，收集70μM滤膜过滤后的细胞，即结直肠癌单细胞。
离心收集结直肠癌单细胞(1200rpm，5分钟)，将上清小心移除后，将细胞重悬到10ml细胞洗涤液，计数收集到的结直肠癌单细胞。得到的结直肠癌单细胞可以进入到下一阶段的类器官培养。细胞洗涤液组成为：DMEM/F12培养液、3mM Glutamax、15mM HEPES、1X青酶素链霉素混合液。
(2)结直肠癌细胞体外培养
将-20℃冻存保管的基质胶于4℃过夜解冻，并在整个实验过程中保持于冰上。
将所得到的结直肠癌单细胞离心收集后按照10000-15000个细胞每40μl基质胶的比例混合。
取40μl混合好的细胞种入48孔板内，放置于37℃培养箱20分钟固化后加入250μl新鲜配制的结直肠癌类器官培养液。放入37℃培养箱培养。结直肠癌类器官培养液为含有55ng/mL EGF、110ng/mL Wnt-3a、1.2μg/ml R-Spondin1、550nM A8301、25μM Y-27632、55ng/mL Noggin、15μM SB202190、1X N2、1X B27、15mM HEPES、3mM Glutamax、550U/mL青霉素、550U/mL链霉素、14μg/mL两性霉素、12％FBS的DMEM/F12培养液。
培养7-10天后进行传代，按1～1.5X103细胞/孔/每50μL基质种入24孔板内，稳定传代即获得所述的人结直肠癌类器官体。
结直肠癌单细胞在经过1-2周的培养后可以在(10X10)显微镜下看到类器官生成。通过该方法，培养的成功率可以达到90％以上，极大保留了病人肿瘤组织特有的形态学特征。
实施例3
(1)结直肠癌活检组织的体外处理
结直肠癌活检组织使用4℃预冷的PBS漂洗至上清清澈干净。
在6cm或10cm细胞培养皿中使用一次性手术刀将组织切割成小块，组织块大小在5mm左右即可。
使用20ml酶消化溶液将组织小块转移至50ml Falcon离心管内。酶消化溶液组成为：DMEM+2.5％FBS、75单位/ml胶原蛋白水解酶、125μg/ml中性蛋白酶、3000单位/ml脱氧核糖核酸酶、1X青酶素链霉素混合液。
密封离心管后将其放于37℃温度条件下孵育60分钟，在孵育过程中使用摇床轻柔混合样品。
孵育结束后，使用移液器打碎聚团的组织团块，收集70μM滤膜过滤后的细胞，即结直肠癌单细胞。
离心收集结直肠癌单细胞(1200rpm，5分钟)，将上清小心移除后，将细胞重悬到10ml细胞洗涤液，计数收集到的结直肠癌单细胞。得到的结直肠癌单细胞可以进入到下一阶段的类器官培养。细胞洗涤液组成为：DMEM/F12培养液，2mM Glutamax、10mM HEPES、1X青酶素链霉素混合液。
(2)结直肠癌细胞体外培养
将-20℃冻存保管的基质胶于4℃过夜解冻，并在整个实验过程中保持于冰上。
将所得到的结直肠癌单细胞离心收集后按照10000-15000个细胞每40-50μl基质胶的比例混合。
取40μl混合好的细胞种入48孔板内，放置于37℃培养箱10分钟固化后加入250μl新鲜配制的结直肠癌类器官培养液。放入37℃培养箱培养。结直肠癌类器官培养液为含有50ng/mL EGF、100ng/mL Wnt-3a、1μg/ml R-Spondin1、500nM A8301、10μM Y-27632、50ng/mL Noggin、12μM SB202190、1X N2、1X B27、10mM HEPES、2mM Glutamax、500U/mL青霉素、500U/mL链霉素、12.5μg/mL两性霉素、10％FBS的DMEM/F12培养液。
培养7-10天后进行传代，按1～1.5X103细胞/孔/每40μL基质种入24孔板内，稳定传代即获得所述的人结直肠癌类器官体。
结直肠癌单细胞在经过1-2周的培养后可以在(10X10)显微镜下看到类器官生成。
通过该方法，培养的成功率可以达到90％以上(图3)。所得到的结直肠癌类器官具有三维结构(图1)，极大保留了病人肿瘤组织特有的形态学特征，与活检组织的病理学特征高度一致(图2)。
对比例
使用常规的结直肠癌类器官培养方法，即：将结直肠癌活检组织用4℃预冷的PBS漂洗直至上清夜干净。用消化液(DMEM，2.5％胎牛血清，青霉素和链霉素，75U/mL胶原蛋白酶IX，125μg/mL中性蛋白酶II)在37℃处理30分钟后离心取上清获得单细胞。1000个单细胞将被包埋在25μL Matrigel中。用的细胞培养液是DMEM/F12，N2，B27，N-乙酰半胱氨酸，55ng/mL EGF、110ng/mL Wnt-3a、1.2μg/ml R-Spondin1、550nM A8301、55ng/mL Noggin、20μM SB202190。大概5天左右传代培养。
上述技术的类器官培养成功率不到80％(图3)。实施例1-3中的方法至少将结直肠癌类器官的存活率提高了10％。
Claims (10)
1.一种结直肠癌类器官的体外培养方法，其特征在于，所述方法包括：
结直肠癌活检组织预处理：对结直肠癌活检组织进行清洗；剪切后进行酶消化；获得结直肠癌单细胞；
结直肠癌单细胞体外培养：将所述结直肠癌单细胞与基质胶混合；固化后加入结直肠癌类器官培养液进行培养，获得所述结直肠癌类器官。
2.如权利要求1所述的结直肠癌类器官的体外培养方法，其特征在于，所述结直肠癌类器官培养液至少包括有丝分裂生长因子、Wnt激动剂、ROCK抑制剂、BMP抑制剂、p38激酶抑制剂；所述有丝分裂生长因子为EGF、FGF中的一种或两种；所述Wnt激动剂选自Wnt、Wnt-3a、R-Spondin1-4中的一种或多种；所述ROCK抑制剂为A8301、Y-27632中的一种或两种；所述BMP抑制剂为Noggin；所述p38激酶抑制剂是SB202190。
3.如权利要求1所述的结直肠癌类器官的体外培养方法，其特征在于，所述结直肠癌类器官培养液为含有45-55ng/mL EGF、90-110ng/mL Wnt-3a、0.8-1.2μg/ml R-Spondin1、450-550nM A8301、15-25μM Y-27632、45-55ng/mL Noggin、10-15μM SB202190、N2、B27、5-15mM HEPES、1-3mM Glutamax、450-550U/mL青霉素、450-550U/mL链霉素、11-14μg/mL两性霉素、8-12％FBS的DMEM/F12培养液。
4.如权利要求1所述的结直肠癌类器官的体外培养方法，其特征在于，所述结直肠癌类器官培养液为含有50ng/mL EGF、100ng/mL Wnt-3a、1μg/ml R-Spondin1、500nM A8301、10μM Y-27632、50ng/mL Noggin、10μM SB202190、1X N2、1X B27、10mM HEPES、2mM Glutamax、500U/mL青霉素、500U/mL链霉素、12.5μg/mL两性霉素、10％FBS的DMEM/F12培养液。
5.如权利要求1所述的结直肠癌类器官的体外培养方法，其特征在于，将所述结直肠癌单细胞与基质胶混合时，细胞的密度为1～1.5X104细胞/每40-50μL基质胶；每40-50μL基质胶加入250μl结直肠癌类器官培养液进行培养。
6.如权利要求5所述的结直肠癌类器官的体外培养方法，其特征在于，培养7-10天后进行传代，按1～1.5X103细胞/每40-50μL基质接种，稳定传代即获得所述的结直肠癌类器官。
7.如权利要求1所述的结直肠癌类器官的体外培养方法，其特征在于，所述基质胶为Matrigel基质。
8.如权利要求1所述的结直肠癌类器官的体外培养方法，其特征在于，所述清洗为，所述结直肠癌活检组织使用4℃预冷的PBS漂洗至上清清澈干净；所述剪切为，将所述结直肠癌活检组织剪切成4-6mm的组织块。
9.如权利要求6所述的结直肠癌类器官的体外培养方法，其特征在于，所述酶消化为在所述组织块中加入酶消化溶液，在37℃孵育50-70分钟，孵育过程中使用摇床进行轻柔混合；所述酶消化溶液为含有70-80单位/mL的胶原蛋白水解酶、120-130μg/mL中性蛋白酶、2900-3100单位/mL脱氧核糖核酸酶、青酶素链霉素混合液、2-3％FBS的DMEM培养液。
10.如权利要求1所述的结直肠癌类器官的体外培养方法，其特征在于，所述酶消化之后，打碎聚团的组织团块，用70μM滤膜过滤，离心收集结直肠癌单细胞，并用细胞洗涤液洗涤和重悬；其中，细胞洗涤液为含有1-3mM Glutamax、5-15mM HEPES、青酶素链霉素混合液的DMEM/F12培养液。
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