CN112176021A - 一种体外构建的精准预测癌症患者用药的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种体外构建的精准预测癌症患者用药的方法，该方法包括如下步骤：1)肠癌类器官的构建，使用结肠癌、直肠癌或结直肠癌患者通过手术或活检得到的癌组织培养成更纯净的肠癌类器官；2)大通量药物筛选试验，以微器官为单位进行高通量药物敏感性检测。本发明的体外构建的精准预测癌症患者用药的方法具有：研磨组织使消化时间缩短，且消化程度一致；温和的消化液减少此步骤对细胞的伤害；不同的孔径过滤，更精确筛选所需细胞；去除免疫细胞，获得更纯净的癌细胞；自制培养基，更符合肠癌类器官生长所需成分，提高培养成功率；以类器官为单位进行药筛，更好的模拟临床用药后体内癌组织的反应。

Description

一种体外构建的精准预测癌症患者用药的方法

技术领域

本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种体外构建的精准预测癌症患者用药的方法。

背景技术

目前，预测癌症患者用药的方法主要有以下几种：

1)基因诊断

临床上出现基因诊断后所用靶向药无效的情况较多，可能由于体内环境复杂，基因突变不是主要致病因素或其他未知原因，所以基因诊断对患者用药的预测性不高。

2)癌症细胞系用药实验

细胞系体外生长环境与体内环境有显著不同，且多为商业化的通用细胞系，个性化程度低，无法准确模拟实际肿瘤对药物的反应，也无法做到个性化，预测性不高。

3)临床人体用药疗效统计分析

临床用药时间周期通常以年为单位，短时间内无法得知所用药物是否对患者有效。

4)类器官技术

目前类器官培养技术仍在不断探索中，培养出生长状态良好且功能接近原病灶的癌症类器官仍是该领域研究者努力的方向。

发明内容

针对现有技术中存在的上述不足，本发明提供了一种体外构建的精准预测癌症患者用药的方法，该方法完善肠癌类器官的培养方法，更精确的模拟癌症器官体内生长状态，使其对药物的敏感性更接近体内癌症细胞对药物的敏感性，更高效和直观的反映有效药物，同时该方法根据患者个体差异获得个性化的有效药物。

为了解决上述技术问题，本发明采用了如下技术方案：

一种体外构建的精准预测癌症患者用药的方法，该方法包括如下步骤：

1)肠癌类器官的构建

使用结肠癌、直肠癌或结直肠癌患者通过手术或活检得到的癌组织培养成更纯净的肠癌类器官；该步骤包括了如下步骤：

a)对癌组织需要进行研磨操作；

b)对癌组织的消化使用PBS和Tryple处理28-32min；

c)对消化液进行不同孔径的过滤；

d)对消化液进行去除免疫细胞及红细胞的操作；

e)使用自制培养基进行培养；

2)大通量药物筛选试验；

以微器官为单位进行高通量药物敏感性检测。

药筛结果可个性化指导提供该癌症组织的患者用药。

作为本发明的一种优选方案，步骤1)中的肠癌类器官的构建具体包括如下步骤：

1.1)清洗：将组织取出放入普通培养皿中用PBS清洗3-4次，至无血性混浊，液体基本无色；

1.2)研磨：洗净后将组织转移至干净的低吸附皿中使用无菌刀片剁碎，使其均匀松散且不粘连；

1.3)消化：取4ml组织消化液(PBS+Tryple)消化剁碎的组织，吹打混匀，并在37℃恒温水浴锅中，消化30min；

1.4)过筛：终止消化后以1200rpm，4℃的条件离心4min，弃上清，用DMEM-F12混悬，依次用70μm和40μm的滤膜过滤；

1.5)去除免疫细胞：将过滤液加入提前准备的低吸附皿中，放入37℃，5％CO₂培养箱，孵育1h后将液体以1200rpm，4℃的条件离心4min，弃上清，若有红细胞残留，则加入500μl红细胞裂解液裂解5min，终止反应后离心，弃上清；

1.6)清洗：加1mlPBS清洗，吹打混匀后取适量计数，余下的部分以1200rpm，4℃的条件离心4min，弃上清；

1.7)铺板：将复融的基质胶与细胞沉淀按2×10⁴-4×10⁴个/μl比例混匀，以50μl/孔加入48孔细胞培养板中，放入37℃，5％CO₂培养箱，凝固20min；

1.8)加培养基：待胶凝固后每孔加入500uL预热的自制培养基，放入37℃，5％CO₂培养箱孵育，每三天更换一次培养基；3代后类器官状态可保持稳定。

作为本发明的另一种优选方案，步骤2)中的大通量药物筛选试验具体包括如下步骤：

2.1)消化：选择状态稳定的类器官，去除培养板中培养基，并使用HBSS清洗1-2次，加入1.5mL传代消化液至培养板中，吹打基质胶，混匀后放入37℃，5％CO₂培养箱15min，终止消化后以1200rpm，4℃的条件离心4min，弃上清；

2.2)铺板：将复融的基质胶与类器官沉淀按15-20个/μl比例混匀，以8μl/孔加入384孔细胞培养板中，放入37℃，5％CO₂培养箱，凝固20min；

2.3)加培养基：待胶凝固后每孔加入20uL预热的自制培养基，放入37℃，5％CO₂培养箱孵育；

2.4)加药换液：培养一天后换为含药培养基，并每隔3天换液1次；2.5)检测：加药6天后，放于22-25℃的室温平衡30min，加入与培养试剂等量的CellTiter-Glo3D检测试剂，在微孔震荡仪上震荡5min，充分混匀，室温放置25min后，使用酶标仪检测发光。

作为本发明的又一种优选方案，步骤2.4)中所用药物及其浓度如下：

药物为：奥沙利铂、5-氟尿嘧啶、卡培他滨、伊立替康、西妥昔单抗、贝伐单抗、瑞戈非尼、雷莫芦单抗、曲氟尿苷、拉帕替尼、曲美替尼、康奈非尼、达拉非尼或拉罗替尼；

浓度为：100μM、25μM、6.25μM、1.56μM或0.39μM。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

1、研磨组织使消化时间缩短，且消化程度一致。

2、温和的消化液减少此步骤对细胞的伤害。

3、不同的孔径过滤，更精确筛选所需细胞。

4、去除免疫细胞，获得更纯净的癌细胞。

5、自制培养基，更符合肠癌类器官生长所需成分，提高培养成功率。

6、以类器官为单位进行药筛，更好的模拟临床用药后体内癌组织的反应。

具体实施方式

一种体外构建的精准预测癌症患者用药的方法，该方法包括如下步骤：

1)肠癌类器官的构建

使用结肠癌、直肠癌或结直肠癌患者通过手术或活检得到的癌组织培养成更纯净的肠癌类器官；该步骤具体包括如下步骤：

1.1)清洗：将组织取出放入普通培养皿中用PBS清洗3-4次，至无血性混浊，液体基本无色；

1.2)研磨：洗净后将组织转移至干净的低吸附皿中使用无菌刀片剁碎，使其均匀松散且不粘连；

1.3)消化：取4ml组织消化液消化剁碎的组织，吹打混匀，并在37℃恒温水浴锅中，消化30min；

1.4)过筛：终止消化后以1200rpm，4℃的条件离心4min，弃上清，用DMEM-F12混悬，依次用70μm和40μm的滤膜过滤；

1.5)去除免疫细胞：将过滤液加入提前准备的低吸附皿中，放入37℃，5％CO₂培养箱，孵育1h后将液体以1200rpm，4℃的条件离心4min，弃上清，若有红细胞残留，则加入500μl红细胞裂解液裂解5min，终止反应后离心，弃上清；

1.6)清洗：加1mlPBS清洗，吹打混匀后取适量计数，余下的部分以1200rpm，4℃的条件离心4min，弃上清；

1.7)铺板：将复融的基质胶与类器官沉淀按2×10⁴-4×10⁴个/μl比例混匀，以50μl/孔加入48孔细胞培养板中，放入37℃，5％CO₂培养箱，凝固20min；

1.8)加培养基：待胶凝固后每孔加入500uL预热的自制培养基，放入37℃，5％CO₂培养箱孵育，每三天更换一次培养基；3代后类器官状态可保持稳定。

2)大通量药物筛选试验

2.1)消化：选择状态稳定的类器官，去除培养板中培养基，并使用HBSS清洗1-2次，加入1.5mL传代消化液至培养板中，吹打基质胶，混匀后放入37℃，5％CO₂培养箱15min，终止消化后以1200rpm，4℃的条件离心4min，弃上清；

2.2)铺板：将复融的基质胶与细胞沉淀按15-20个/μl比例混匀，以8μl/孔加入384孔细胞培养板中，放入37℃，5％CO₂培养箱，凝固20min；

2.3)加培养基：待胶凝固后每孔加入20uL预热的自制培养基，放入37℃，5％CO₂培养箱孵育；

2.4)加药换液：培养一天后换为含药培养基，并每隔3天换液1次；用药物及其浓度如下：

药物为：奥沙利铂、5-氟尿嘧啶、卡培他滨、伊立替康、西妥昔单抗、贝伐单抗、瑞戈非尼、雷莫芦单抗、曲氟尿苷、拉帕替尼、曲美替尼、康奈非尼、达拉非尼或拉罗替尼；浓度为：100μM、25μM、6.25μM、1.56μM或0.39μM。

2.5)检测：加药6天后，放于22-25℃的室温平衡30min，加入与培养试剂等量的CellTiter-Glo3D检测试剂，在微孔震荡仪上震荡5min，充分混匀，室温放置25min后，使用酶标仪检测发光。

结果分析：相同药物使用不同患者的样本进行药物敏感性检测所示结果有较大差异。本实例列举其中一位患者样本的检测结果为：对奥沙利铂、5-氟尿嘧啶、卡培他滨、西妥昔单抗、贝伐单抗、雷莫芦单抗、曲氟尿苷、曲美替尼、达拉非尼、拉罗替尼不敏感；对伊立替康、瑞戈非尼、拉帕替尼、康奈非尼敏感。其临床用药为奥沙利铂、氟尿嘧啶和左亚叶酸钙的组合，但用药后疑似转移灶出现增大的症状，据此推测其临床用药无效，所以其预后结果与药筛结果基本一致，表明本发明具有极大的临床价值。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (4)

1.一种体外构建的精准预测癌症患者用药的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

1)肠癌类器官的构建

使用结肠癌、直肠癌或结直肠癌患者通过手术或活检得到的癌组织培养成更纯净的肠癌类器官；该步骤包括了如下步骤：

a)对癌组织需要进行研磨操作；

b)对癌组织的消化使用PBS和Tryple处理28-32min；

c)对消化液进行不同孔径的过滤；

d)对消化液进行去除免疫细胞及红细胞的操作；

e)使用自制培养基进行培养；

2)大通量药物筛选试验

以微器官为单位进行高通量药物敏感性检测。

2.如权利要求1所述的一种体外构建的精准预测癌症患者用药的方法，其特征在于，步骤1)中的肠癌类器官的构建具体包括如下步骤：

1.1)清洗：将组织取出放入普通培养皿中用PBS清洗3-4次，至无血性混浊，液体基本无色；

1.2)研磨：洗净后将组织转移至干净的低吸附皿中使用无菌刀片剁碎，使其均匀松散且不粘连；

1.3)消化：取4ml组织消化液消化剁碎的组织，吹打混匀，并在37℃恒温水浴锅中，消化30min；

1.4)过筛：终止消化后以1200rpm，4℃的条件离心4min，弃上清，用DMEM-F12混悬，依次用70μm和40μm的滤膜过滤；

1.5)去除免疫细胞：将过滤液加入提前准备的低吸附皿中，放入37℃，5％CO₂培养箱，孵育1h后将液体以1200rpm，4℃的条件离心4min，弃上清，若有红细胞残留，则加入500μl红细胞裂解液裂解5min，终止反应后离心，弃上清；

1.6)清洗：加1mlPBS清洗，吹打混匀后取适量计数，余下的部分以1200rpm，4℃的条件离心4min，弃上清；

1.7)铺板：将复融的基质胶与细胞沉淀按2×10⁴-4×10⁴个/μl比例混匀，以50μl/孔加入48孔细胞培养板中，放入37℃，5％CO₂培养箱，凝固20min；

1.8)加培养基：待胶凝固后每孔加入500uL预热的自制培养基，放入37℃，5％CO₂培养箱孵育，每三天更换一次培养基；3代后类器官状态可保持稳定。

3.如权利要求1所述的一种体外构建的精准预测癌症患者用药的方法，其特征在于，步骤2)中的大通量药物筛选试验具体包括如下步骤：

2.1)消化：选择状态稳定的类器官，去除培养板中培养基，并使用HBSS清洗1-2次，加入1.5mL传代消化液至培养板中，吹打基质胶，混匀后放入37℃，5％CO₂培养箱15min，终止消化后以1200rpm，4℃的条件离心4min，弃上清；

2.2)铺板：将复融的基质胶与类器官沉淀按15-20个/μl比例混匀，以8μl/孔加入384孔细胞培养板中，放入37℃，5％CO₂培养箱，凝固20min；

2.3)加培养基：待胶凝固后每孔加入20uL预热的自制培养基，放入37℃，5％CO₂培养箱孵育；

2.4)加药换液：培养一天后换为含药培养基，并每隔3天换液1次；

2.5)检测：加药6天后，放于22-25℃的室温平衡30min，加入与培养试剂等量的CellTiter-Glo3D检测试剂，在微孔震荡仪上震荡5min，充分混匀，室温放置25min后，使用酶标仪检测发光。

4.如权利要求3所述的一种体外构建的精准预测癌症患者用药的方法，其特征在于，步骤2.4)中所用药物及其浓度如下：

药物为：奥沙利铂、5-氟尿嘧啶、卡培他滨、伊立替康、西妥昔单抗、贝伐单抗、瑞戈非尼、雷莫芦单抗、曲氟尿苷、拉帕替尼、曲美替尼、康奈非尼、达拉非尼或拉罗替尼；

浓度为：100μM、25μM、6.25μM、1.56μM或0.39μM。