CN114469852B - 一种用于菌群移植的肠道菌群凝胶剂制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种用于菌群移植的肠道菌群凝胶剂制备方法，本制备方法制备出的菌群凝胶剂较于菌液具有黏稠度高、易制备、便于存储的优势。试验表明，在‑20℃条件下保存30天稳定性较好，菌群丰度变化不大。特别是对于菌群移植临床治疗中的一些特殊患者，可以作为一种提高肠道内菌群停留时间的剂型进行推广使用，提高治疗的效果。
Description
技术领域
本发明涉及菌群移植技术领域，尤其涉及一种用于菌群移植的肠道菌群凝胶剂制备方法。
背景技术
人体消化道内生存着约10万亿个微生物，包含1000多种细菌，它们在宿主体内发挥着重要功能，例如阻止病原体入侵，促进消化和营养吸收，合成维生素和激活免疫系统等。另外，肠道和中枢神经通过释放信号分子进行密切的交流互作，因此肠道微生物也具有影响我们大脑发育和行为的潜能。菌群移植作为重建肠道菌群的有效手段，已用于多种菌群相关性疾病的临床治疗和探索性研究，如严重腹泻、CDI、溃疡性结肠炎、肠易激综合征、慢性便秘、炎症性肠炎、功能性便秘等疾病，也可作为一些重大疾病的辅助治疗手段，如肿瘤、糖尿病、自闭症等。菌群移植的方式主要有：口服式菌群胶囊、鼻肠管式以及内镜式(包含胃镜和肠镜)。口服菌群胶囊是一种经上消化道的菌群移植方法；菌群悬液则可以通过多种途径到达十二指肠段以下的小肠，包括经胃镜途径、经鼻空肠管、经内镜肠道植管术，经小肠造口或经皮内窥镜胃空肠造口术等，也可以通过下消化道灌肠、远端回肠造口、结肠造口术、结肠内镜肠道植管术等方式进行移植。
目前，通过菌群悬液进行移植是一种主要的移植方式，然而菌群悬液流动性强，在人体内保留时间较短，菌群无法充分定植，会影响临床的治疗效果。
发明内容
针对上述问题，本发明旨在解决上面描述的问题。本发明的一个目的是提供解决以上问题中的一种用于菌群移植的肠道菌群凝胶剂制备方法，能够制备出黏度较好，并让菌群活性保持较高的肠道菌群凝胶剂，能够满足不同的移植方式需求且在肠道内停留时间长，利于菌群的定植。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
一种用于菌群移植的肠道菌群凝胶剂制备方法，包括以下步骤：
步骤S00菌群制备：收集健康供体新鲜粪便x份，按稀释比例溶解于y份的生理盐水中，再通过粪便分析前处理仪处理去除残渣，得到菌悬液D；
步骤S10凝胶基质制备：将海藻酸钠按照3％的添加量置于开水中使用电动搅拌机1600rpm搅拌30min至完全溶解，再加入营养底物继续搅拌10min至所有试剂完全溶解，后于高压灭菌锅121℃灭菌20min，得到凝胶基质E并冷却待用；
步骤S20凝胶剂制备：将步骤S00中得到的菌悬液D和步骤S10中得到的凝胶基质E按照质量比为5:1的比例混合，通过漩涡震荡仪搅拌均匀得到菌群凝胶剂F；
步骤S30产品获取：将步骤S20中得到的菌群凝胶剂F置于-20℃的冰箱中进行储存。
本发明优选的技术方案在于，还包括步骤S11：将步骤S10中冷却得到的凝胶基质E取样并观察性状，所需观察的性状包括粘度以及流动性。
本发明优选的技术方案在于，在步骤S10中所加入的营养底物包括：5％的葡萄糖、0.02％的维生素C和0.5％的山梨糖醇。
本发明优选的技术方案在于，还包括步骤S21凝胶剂检测：将步骤S20中得到的菌群凝胶剂F取样多份至不同的容器内，进行初始活菌率的测定。
本发明优选的技术方案在于，在步骤S21中，在对初始活菌率进行测定时，先将取样的菌群凝胶剂F稀释若干倍，用LIVE/DEADTM BacLightTM Bacterial Viability Kit染料对样本中的微生物进行染色，使用BD Accuri C6流式细胞仪进行观察并计数，使用BDAccuriTM C6 Plus Software软件分析样本的初始单位菌量和初始单位存活菌量。
本发明优选的技术方案在于，还包括步骤S31：将步骤S30中获取的产品于-20℃储存若干天后取样，于37℃的水浴锅中融化，稀释若干倍，通过流式细胞仪检测分析单位菌量和菌群活性。
本发明优选的技术方案在于，在步骤S31中菌群凝胶剂F取样所保存的天数分别为7天、14天以及30天。
本发明优选的技术方案在于，在步骤S31中同时使用QIAamp Fast DNA StoolMini KIT(QIAGEN)试剂盒提取菌群凝胶剂样本的DNA，基于16S rRNA V3-V4区段进行PCR文库构建，通过Illumina HiSeq2500仪器进行高通量测序，借助生信分析平台通过Usearch进行OTU聚类分析以获得菌群丰度和组成信息。
本发明的有益效果为：
本发明提供一种用于菌群移植的肠道菌群凝胶剂制备方法，本制备方法制备出的菌群凝胶剂较于菌液具有黏稠度高、易制备、便于存储的优势。试验表明，在-20℃条件下保存30天稳定性较好，菌群丰度变化不大。特别是对于菌群移植临床治疗中的一些特殊患者，可以作为一种提高肠道内菌群停留时间的剂型进行推广使用，提高治疗的效果。
参照附图来阅读对于示例性实施例的以下描述，本发明的其他特性特征和优点将变得清晰。
附图说明
并入到说明书中并且构成说明书的一部分的附图示出了本发明的实施例，并且与描述一起用于解释本发明的原理。在这些附图中，类似的附图标记用于表示类似的要素。下面描述中的附图是本发明的一些实施例，而不是全部实施例。对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明海藻酸钠添加量优化性状表；
图2是本发明肠道菌群凝胶剂；
图3是本发明菌群凝胶剂储存不同时间单位菌量(a)及菌群活性(b)比较图；
图4是本发明菌群凝胶剂储存不同时间菌群相对丰度图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互任意组合。
下面结合附图及实施例，进一步的说明本发明的技术方案。
如图1-图4所示，本实施例提供一种用于菌群移植的肠道菌群凝胶剂制备方法，包括以下步骤：
步骤S00菌群制备：收集健康供体新鲜粪便a份，按稀释比例溶解于b份的生理盐水中，再通过粪便分析前处理仪处理去除残渣，得到菌悬液D；
步骤S10凝胶基质制备：将海藻酸钠按照3％的添加量置于开水中使用电动搅拌机1600rpm搅拌30min至完全溶解，再加入营养底物继续搅拌10min至所有试剂完全溶解，后于高压灭菌锅121℃灭菌20min，得到凝胶基质E并冷却待用；
步骤S20凝胶剂制备：将步骤S00中得到的菌悬液D和步骤S10中得到的凝胶基质E按照质量比为5:1的比例混合，通过漩涡震荡仪搅拌均匀得到菌群凝胶剂F；
步骤S30产品获取：将步骤S20中得到的菌群凝胶剂F置于-20℃的冰箱中进行储存。
优选的，还包括步骤S11：将步骤S10中冷却得到的凝胶基质E取样并观察性状，所需观察的性状包括粘度以及流动性。
优选的，在步骤S10中所加入的营养底物包括：5％的葡萄糖、0.02％的维生素C和0.5％的山梨糖醇。
进一步的，还包括步骤S21凝胶剂检测：将步骤S20中得到的菌群凝胶剂F取样多份至不同的容器内，进行初始活菌率的测定。
进一步的，在步骤S21中，在对初始活菌率进行测定时，先将取样的菌群凝胶剂F稀释若干倍，用LIVE/DEADTM BacLightTM Bacterial Viability Kit染料对样本中的微生物进行染色，使用BD Accuri C6流式细胞仪进行观察并计数，使用BD AccuriTM C6 PlusSoftware软件分析样本的初始单位菌量和初始单位存活菌量。
优选的，还包括步骤S31：将步骤S30中获取的产品于-20℃储存若干天后取样，于37℃的水浴锅中融化，稀释若干倍，通过流式细胞仪检测分析单位菌量和菌群活性。
优选的，在步骤S31中菌群凝胶剂F取样所保存的天数分别为7天、14天以及30天。
进一步的，在步骤S31中同时使用QIAamp Fast DNA Stool Mini KIT(QIAGEN)试剂盒提取菌群凝胶剂样本的DNA，基于16S rRNA V3-V4区段进行PCR文库构建，通过Illumina HiSeq2500仪器进行高通量测序，借助生信分析平台通过Usearch进行OTU聚类分析以获得菌群丰度和组成信息。
本实施例中，试验所涉及的器材包括生物安全柜、高压灭菌锅、离心机、冰箱、漩涡震荡仪、水浴锅、移液枪、超纯水仪、恒温烘箱、分析天平、流式细胞仪、电动搅拌机、Illumina HiSeq2500、粪便分析前处理仪及配套耗材。
本实施例中，试验所涉及的材料包括生理盐水、海藻酸钠、葡萄糖、山梨糖醇、维生素C、LIVE/DEADTM BaclightTM Bacterial Viability Kit、QIAamp Fast DNA Stool MiniKIT(QIAGEN)试剂盒等。
本实施例中，x和y的比例为：x为100-200g，y为750-1000mL，并且处理后得到菌悬液D为600-850mL。
本实施例中将海藻酸钠分别按照0.5％、1％、2％、3％、4％、5％的添加量置于开水中，使用电动搅拌机1600rpm搅拌30min至完全溶解，分别加入5％的葡萄糖、0.02％的维生素C、0.5％的山梨糖醇继续搅拌10min至所有试剂完全溶解，后于高压灭菌锅内121℃灭菌20min，冷却后观察不同浓度海藻酸钠凝胶的粘度、流动性等。
通过对海藻酸钠不同添加量的优化，如图1所示，挑选海藻酸钠添加量为3％继续进行凝胶剂实验。临床凝胶剂浓度不宜太稀，否则无法达到增加定植时间的效果；但也不能太粘稠，太粘稠不利于操作，或造成患者便秘等，因此选择3％浓度的海藻酸钠做凝胶剂最适宜，粘度适中。
本实施例中，所制备的菌群凝胶剂颜色为均匀的黄色，流动性适中，无菌沉淀(-20℃条件下保存30d后于37℃解冻5min)，如图2所示。
本实施例中，如图3所示，a为不同存储时间下菌群凝胶剂单位菌量检测图，b为不同存储时间下菌群凝胶剂活性检测图。在-20℃存储条件下，菌群凝胶剂初始单位菌量为1.17*108cfu/ml，初始活菌率为66％；存储7天后单位菌量为1.12*108cfu/ml，菌群活性为53.1％；存储14天单位菌量为1.11*108cfu/ml，菌群活性为52％；存储30天后菌群凝胶剂单位菌量为1.07*108cfu/ml，菌群活性为51.8％。由此可知，-20℃保存条件下，菌群凝胶剂的菌量基本无明显变化(P＞0.05)，与初始凝胶剂活性相比，菌群活性在存储7天后下降19.5％，在存储14天、30天后菌群活性基本没有变化(P＞0.05)，进入稳定期。
其中，P>0.05表示差异性不显著；P<0.05表示差异性显著；P<0.01表示差异性极显著。
本实施例中，高通量测序从菌群丰度上进一步评估菌群凝胶剂30天存储周期内的稳定性。由图4可以看出，与初始菌群的相对丰度相比，存储7天、14天、30天后的菌群丰度变化不大，说明存储期间凝胶剂型对菌群的丰度影响不大。
综上所述，本发明的肠道菌群凝胶剂是菌液剂型的一种优化剂型，较于菌液具有黏稠度高、易制备、便于存储的优势。试验表明，在-20℃条件下保存30天稳定性较好，菌群丰度变化不大。特别是对于菌群移植临床治疗中的一些特殊患者，可以作为一种提高肠道内菌群停留时间的剂型进行推广使用，提高治疗的效果。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，仅仅参照较佳实施例对本发明进行了详细说明。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (7)
1.一种用于菌群移植的肠道菌群凝胶剂制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤S00菌群制备：收集健康供体新鲜粪便x份，按稀释比例溶解于y份的生理盐水中，再通过粪便分析前处理仪处理去除残渣，得到菌悬液D；其中x为100-200g，y为750-1000ml；
步骤S10凝胶基质制备：将海藻酸钠按照3%的添加量置于开水中使用电动搅拌机1600rpm搅拌30 min至完全溶解，再加入营养底物继续搅拌10 min至所有试剂完全溶解，后于高压灭菌锅121℃灭菌20 min，得到凝胶基质E并冷却待用；
步骤S20凝胶剂制备：将步骤S00中得到的菌悬液D和步骤S10中得到的凝胶基质E按照质量比为5:1的比例混合，通过漩涡震荡仪搅拌均匀得到菌群凝胶剂F；
步骤S30产品获取：将步骤S20中得到的菌群凝胶剂F置于-20℃的冰箱中进行储存；
在步骤S10中所加入的营养底物包括：5%的葡萄糖、0.02%的维生素C和0.5%的山梨糖醇。
2.根据权利要求1所述一种用于菌群移植的肠道菌群凝胶剂制备方法，其特征在于：
还包括步骤S11：将步骤S10中冷却得到的凝胶基质E取样并观察性状，所需观察的性状包括粘度以及流动性。
3.根据权利要求1所述一种用于菌群移植的肠道菌群凝胶剂制备方法，其特征在于：
还包括步骤S21凝胶剂检测：将步骤S20中得到的菌群凝胶剂F取样多份至不同的容器内，进行初始活菌率的测定。
4.根据权利要求3所述一种用于菌群移植的肠道菌群凝胶剂制备方法，其特征在于：
在步骤S21中，在对初始活菌率进行测定时，先将取样的菌群凝胶剂F稀释若干倍，用LIVE/DEAD™ BacLight™ Bacterial Viability Kit染料对样本中的微生物进行染色，使用BD Accuri C6流式细胞仪进行观察并计数，使用BD AccuriTM C6 Plus Software软件分析样本的初始单位菌量和初始单位存活菌量。
5.根据权利要求1所述一种用于菌群移植的肠道菌群凝胶剂制备方法，其特征在于：
还包括步骤S31：将步骤S30中获取的产品于-20℃储存若干天后取样，于37℃的水浴锅中融化，稀释若干倍，通过流式细胞仪检测分析单位菌量和菌群活性。
6.根据权利要求5所述一种用于菌群移植的肠道菌群凝胶剂制备方法，其特征在于：
在步骤S31中菌群凝胶剂F取样所保存的天数分别为7天、14天以及30天。
7.根据权利要求5所述一种用于菌群移植的肠道菌群凝胶剂制备方法，其特征在于：
在步骤S31中同时使用QIAamp Fast DNA Stool Mini KIT试剂盒提取菌群凝胶剂样本的DNA，基于16S rRNA V3-V4区段进行PCR文库构建，通过Illumina HiSeq2500仪器进行高通量测序，借助生信分析平台通过Usearch进行OTU聚类分析以获得菌群丰度和组成信息。
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