JP6858747B2 - 便微生物試料を調製する方法 - Google Patents

Description

本発明は便微生物試料を調製する方法に関する。本発明は、好ましくは小腸内毒素症、特にＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染の治療のための、便微生物の移植における、前記試料の使用に関する。

ヒト小腸微生物叢は、ヒト胃腸管（胃、小腸及び結腸）中で見られる全ての微生物（細菌、酵母及び真菌）の群である。微生物の多様性は、現在、成人の優勢な小腸微生物叢を構成する細菌は約１０^３種類、その量は１０^１４個と推定され、各個人の細菌メタゲノムは２００，０００〜８００，０００遺伝子を表し、これはヒトゲノムの遺伝子数の１０〜５０倍である。

小腸は、子宮内では無菌であり、生後１日で細菌が定着し、個人に特有の細菌叢が発達する。各人が有する細菌は、種の観点では比較的近いが、細菌叢の具体的な組成（種、比率）は、大幅に（種の２／３を上回る）宿主に特異的である。

従って、ヒトの小腸微生物叢は、複雑で各個人に特有の、非常に多様な生態系である。

変化した小腸状態を回復することが可能で、かつ侵入に耐えられる、安定な微生物叢を維持することは、個人の健康にとって必要である。微生物叢の広い多様性を維持することは、その安定性を促進する。しかしながら、幾つかの病理又は治療は、微生物叢のバランスを崩す。例えば、抗生物質、又は炎症性成分を有する疾患、例えば炎症性腸疾患（ＩＢＤ）等は、小腸内の微生物叢の多様性を限定し得る。

抗生物質治療（又は抗生物質療法）は、特に、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ等の病原性微生物の増殖を促進し得る微生物叢の変化を引き起こす。

Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの感染は、院内下痢症の原因となる。この細菌は、従来の抗生物質療法（バンコマイシンやメトロニダゾール等のスペクトルの広いもの）に耐性である。小腸微生物叢を再建し、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ型の感染に対抗し、そしてホメオスタシス（即ち共生）を再建するために、便微生物の移植が想定され、試験されてきた。それは、健康な提供者の便を受容患者の消化管内に導入して、宿主の変化した小腸微生物叢のバランスを取り戻すことによる。この便微生物叢の移植は同種（即ち健康な提供者である個人から患者へ移植する）又は自己（即ち個人からその者自身に移植する）であり得る。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ型の感染に対する使用で得られた結果は有望で、一部の患者は治療に成功した（Ｔａｕｘｅ ｅｔ ａｌ， Ｌａｂ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｗｉｎｔｅｒ ２０１５， ｖｏｌｕｍｅ ４６， Ｎｕｍｂｅｒ １）。

しかしながら、現在の移植方法は経験的なもので、小腸微生物叢の主要な成分である嫌気性細菌の最良の可能な生存率を保つ特段の留意点が無い。更に、便微生物叢移植の有効性は一定ではなく、複数回の治療を要し得る。更に、同種移植は、提供者の便を試験して、受容者に病原菌が移されないことをチェックする必要が有り、また移植の過程でそれを扱うスタッフにとってリスクが存在し得る。

従って、安全で、効果的で、特に産業スケールで実施が容易な、便微生物叢を移植する方法について需要が存在する。更に、最近の生存率が示される便微生物叢を移植する方法について需要が存在する。

本発明は、これらの需要に取り組むものである。

本発明は、提供者に由来する便微生物の試料を調製する方法に関し、当該方法は、以下の工程：
ａ）提供者から１つ以上の便微生物の試料を回収する工程、
ｂ）当該試料回収後５分以内に、工程ａ）で取得した当該試料を、酸素密閉（ｏｘｙｇｅｎ−ｔｉｇｈｔ）回収デバイス中に置く工程、
ｃ）工程ｂ）で取得した試料を、１つ以上の抗凍結剤及び／又は１つ以上の増量剤を含有する１つ以上の生理食塩水と混合する工程、
ｄ）任意で、工程ｃ）で取得した混合物を、特に、直径０．７ｍｍ以下、好ましくは０．５ｍｍ以下の孔を有するフィルターを用いて、濾過する工程、及び
ｅ）工程ｃ）又はｄ）で取得した混合物を、−１５℃〜−１００℃、好ましくは−６０℃〜−９０℃の温度で凍結することにより保存する工程、
を含み、ここで、工程ｂ）〜ｅ）は、嫌気生活下（ｕｎｄｅｒ ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｉｓ）で実施される。

そのような便微生物叢を移植する方法は、実施が容易になり、その有効性は、最初のサンプリング時と当該方法の実施後の微生物集団を比較することによって推定され得る。この有効性を評価するために様々な指標が使用され得、以下の結果が得られた：

また、本発明は、本発明の方法によって得られた提供者由来の便微生物叢の試料の、融解状態での、自己又は同種便微生物叢の移植における使用にも関する。

本発明は、本発明の方法によって得られた提供者由来の便微生物叢の試料の、融解状態での、小腸内毒素症の治療、特にＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの感染、医学的治療により、物理的治療（特に放射線照射）により、外科手術（特に小腸）により、又は栄養の供給により誘導された内毒素症の治療のための使用にも関する。また、本発明は、本発明の方法によって得られた提供者由来の便微生物叢の試料の、融解状態での、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、小腸の機能不全、肥満、代謝疾患（２型糖尿病及び特に代謝症候群）及び自己免疫疾患（特に１型糖尿病）、アレルギー、肝疾患（脂肪肝及び特に肝硬変）、幾つかの神経疾患（特に自閉症）及び幾つかの癌（特に直腸結腸癌）の治療のための使用にも関する。

小腸内毒素症とは、小腸微生物叢のバランスが持続的に崩れることを意味する。小腸微生物叢のバランスが持続的に崩れるとは、何らかの有益な微生物の減少、及び／又は何らかの微生物の多様性の低下、及び／又は何らかの片利共生生物（病原性共生生物）の中での積極的な微生物の発展又は発達、及び／又は何らかの病原性微生物（特にＣ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の増殖を意味する。ヒト小腸微生物叢の持続的な変化は、病理的状態を生じ得る。特に、微生物叢の中での多様性の減少は、腸内毒素症に関連する疾患（特に、肥満、クローン症、糖尿病又はアレルギー）の特徴である（Ｓａｎｓｏｎｅｔｔｉ， Ｃｏｌｌｅｇｅ ｄｅ Ｆｒａｎｃｅ， ２２ Ｊａｎｕａｒｙ ２０１４）。

好ましくは、治療する病理は小腸内毒素症である。

炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、特にクローン症及び潰瘍性結腸炎を意味する。

小腸の機能不全は、特に、過敏性腸症候群及び痙攣性大腸炎を意味する。

従って、本発明に係る提供者から便微生物叢の試料を調製する方法は、提供者から１つ以上の便微生物叢の試料を回収する工程ａ）を含む。

この工程は、好ましくは、提供者から便の試料を回収することによって実施される。実際、便の試料は、提供者由来の便微生物叢を含有する。故に、本発明の方法は、提供者から、便微生物叢を含有する１つ以上の便の試料を回収する工程ａ）を含む。

好ましくは、本発明において、提供者は、健康なヒトの対象である。「健康」とは、小腸微生物叢のバランスが崩れていない、又は医学の専門家によって認識／診断される病理に罹患していない対象を意味する。

好ましくは、便の試料の量は、２０ｇ以上である。

このサンプリング工程に続いて、短時間の内に、即ち試料の回収後５分以内に、好ましくは３分以内、より好ましくは１分以内に、ａ）で取得された試料は、酸素密閉（ｏｘｙｇｅｎ−ｔｉｇｈｔ）回収デバイス中に置かれ：これが工程ｂ）である。

以降の本発明の方法の残りの全ては、嫌気生活下（即ち嫌気性気体中）で実施される。

好ましくは酸素密閉回収デバイスは：
−提供者から便微生物叢の試料を受け取るように設計された内部空間を備えた胴体及び当該胴体の内部空間に開口する連絡路を区切る首部を備えた容器、及び
−取り外しが可能で前記容器の首部に密着してマウント出来ることにより前記首部の連絡路の開口を塞ぎ前記胴体の内部空間を閉鎖出来るように設計されたカバー、
を含む種類の形態を取り、ここで前記容器の胴体は、柔軟なバッグで形成され、１つ以上の容器及びカバーに、前記容器の胴体の内部空間中に含まれるガスの少なくとも一部を排出するために設計された排出部が設けられている。

好ましくは、前記デバイスの排出部は、容器及びカバーの１つを通して設けられた連絡路、及び容器の胴体の内部空間に外的な液体が侵入するのを防ぐために連絡路を閉塞する閉塞部を備える。好ましくは、当該デバイスの排出部は、更に、連絡路中に配置された多孔質フィルター膜を備える。

あるいは、空気密閉回収デバイスは：
−提供者から便微生物叢の試料を受け取るように設計された内部空間を備えた胴体及び当該胴体の内部空間に開口する連絡路を区切る首部を備えた容器、及び
−取り外しが可能で前記容器の首部に密着してマウント出来ることにより前記首部の連絡路の開口を塞ぎ前記胴体の内部空間を閉鎖出来るように設計されたカバー、
を含む種類の形態を取り、ここで前記容器の胴体の内部空間は、酸素を中和する化学デバイスを備え得る。

好ましくは、前記空気密閉回収デバイスは、工程ａ）及びｂ）に使用され：工程ａ）の試料の回収は当該デバイス中、特に容器中で直接実施され、特にカバーによる当該デバイスの閉鎖は、酸素が無い大気下に試料を置く（工程ｂ）。

本発明の方法において、工程ｂ）〜ｅ）は、無酸素大気下で実施される。嫌気生活下では、試料中に存在する便微生物叢を構成する細菌の生存率が保持される。

特に、工程ｂ）で使用する上記デバイスは、工程ｂ）〜ｅ）の全ての工程を嫌気生活下で実施することを可能とする。

試料（工程ａ）で取得されたもの）が酸素密閉回収デバイス中に置かれた後、それは、任意で、３３〜４０℃の温度で、最大７５時間インキュベーションされ得る。好ましくは、このインキュベーション工程は、３５〜３８℃で、２４〜７３時間実施される。理想的には、この工程は、約３７℃で７２時間実施される。あるいは、この試料は、任意で、２〜１０℃で最大７５時間インキュベーションされ得る。好ましくは、このインキュベーション工程は、４〜８℃で、２４〜７２時間実施される。

この工程の後、本方法のこの工程で取得された試料の質を評価するために、目視検査が行われてもよい。この検査が満足する結果であれば、任意で、輸送工程が行われ得る。この輸送工程は、その後の処理及び解析のために、試料を、サンプリングした場所から研究室に持ち帰ることを可能とする。上記目視検査も、当該輸送後に実施され得る。

従って、好ましくは、工程ｂ）の回収デバイス中に置かれた試料は、工程ｃ）の前に、輸送工程に付される。

また、好ましくは、工程ｃ）の回収デバイス中に置かれた試料は、３３〜４０℃、好ましくは３５〜３８℃で、最大７５時間、好ましくは２４〜７３時間、工程ｂ）及びｃ）の間に、インキュベーションされる。好ましくは、当該インキュベーションは、輸送工程の前又は間に行われる。

工程ｃ）が次に行われ：この工程は、ｂ）で取得した試料を、１つ以上の抗凍結剤及び／又は１つ以上の増量剤を含有する１つ以上の生理食塩水と混合することを含む。

輸送工程、及び場合によってはインキュベーション工程が行われる場合、工程ｃ）は、勿論、ｂ）において取得された試料を、輸送及び／又はインキュベーションの後、１つ以上の抗凍結剤及び／又は１つ以上の増量剤を含有する１つ以上の生理食塩水と混合することを含む。

典型的には、本発明の生理食塩水は、水及び生理的に許容される塩を含有する。典型的には、当該塩は、カルシウム、ナトリウム、カリウム又はマグネシウムと、塩化物、グルコン酸、酢酸又は炭酸水素イオンとの塩である。

また、本発明の生理食塩水は、任意で１つ以上の抗酸化剤を含有してもよい。抗酸化剤は、特に、アスコルビン酸及びその塩（アスコルビン酸塩）、トコフェロール（酸α−トコフェロール）、システイン及びその塩形態（特に塩酸塩）、並びにそれらの混合物から選択される。

好ましくは、本発明の生理食塩水は：
−塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、グルコン酸ナトリウム及び酢酸ナトリウムからなる群から選択される１つ以上の塩、及び
−任意で１つ以上の抗酸化剤、好ましくはＬ−アスコルビン酸ナトリウム、トコフェロール、塩酸Ｌ−システイン一水和物及びそれらの混合物から選択される抗酸化剤、
を含有する。

典型的には、塩は、生理食塩水中に、５〜２０ｇ／、好ましくは７〜１０ｇ／Ｌの濃度で存在する。

典型的には、抗酸化剤は、溶液の全体積に対して０．３〜１重量％、好ましくは０．４〜０．６重量％の量で、生理食塩水中に存在する。

好ましくは、抗酸化剤は、Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム及び塩酸Ｌ−システイン一水和物の混合物であり、Ｌ−アスコルビン酸ナトリウムは溶液の全体積に対して０．４〜０．６重量％の量で存在し、塩酸Ｌ−システイン一水和物は溶液の全体積に対して０．０１〜０．１重量％の量で存在する。

好ましくは、本発明の生理食塩水は、１つ以上の抗凍結剤も含有する。抗凍結剤は、特に氷の結晶の形成による凍結によって引き起こされるダメージから試料を保護するのに使用される基質である。

好ましくは、凍結保護剤は、ポリオール、二〜五糖類（即ち二糖類、三糖類、四糖類、五糖類）、ＤＭＳＯ及びこれらの混合物から選択される。好ましくは、凍結保護剤は、ポリオール、三及び二糖類、ＤＭＳＯ並びにこれらの混合物から選択される。より好ましくは、生理食塩水中に存在する凍結保護剤は、二糖類又は三糖類である。

使用され得るポリオールは、特に、グリセロール、マンニトール及びソルビトールに限らず、プロピレングリコール又はエチレングリコールでもあり得る。

使用され得る二〜五糖類として、同一又は異なる糖単位で構成された二量体、三量体、四量体及び五量体を挙げることが出来る。この糖単位は、グルコース、フルクトース、ガラクトース、フルクトース及びＮ−アセチルノイラミン酸から選択され得る。

使用され得る二糖類は、特に、トレハロース又はその類似体の一つ、またはサッカロースであり得る。

最後に、ＤＭＳＯ又はジメチルスルホキシドは、公知の抗凍結剤である。

これらの抗凍結剤は、単独又は混合物として使用され得る。

典型的には、生理食塩水中に存在する抗凍結剤の量は、溶液の全体積に対し３〜３０重量％、好ましくは４〜２０重量％である。

好ましくは、抗凍結剤は、グリセロール、マンニトール、ソルビトール、ＤＭＳＯ、プロピレングリコール、エチレングリコール、トレハロース及びその類似体、サッカロース、ガラクトース‐ラクトース及びこれらの混合物から選択される。好ましくは、抗凍結剤は、ガラクトース‐ラクトース又はトレハロースである。

好ましくは、本発明の生理食塩水は、１つ以上の増量剤を含有する。

増量剤は、好ましくは、澱粉の部分加水分解物又は澱粉粉末（ｓｔａｒｃｈｙ ｆｌｏｕｒ）から選択される。好ましくは、澱粉の部分加水分解物は、好ましくは小麦又はトウモロコシ由来であり、或いは、例えばジャガイモ由来の澱粉粉末の部分加水分解物であり、多量のマルトデキストリンを含有する。マルトデキストリンは、澱粉又は澱粉粉末の部分加水分解物の産物であり、様々な糖（グルコース、マルトース、マルトトリオース、オリゴ及び多糖類）で構成され、それらの割合は、加水分解の程度により異なる。

好ましくは、生理食塩水中に存在する増量剤は、マルトデキストリンの混合物であり、マルトデキストリンの含有量は、溶液の全体積に対し４〜２０重量％である。

好ましくは、本発明の生理食塩水は：
‐１つ以上の上記抗凍結剤、即ち、ポリオール、二〜五糖類（即ち二糖類、三糖類、四糖類及び五糖類）、ＤＭＳＯ、並びにこれらの混合物から選択されるポリオール、並びに
‐１つ以上の上記増量剤、即ち、澱粉の部分加水分解物又は澱粉粉末、好ましくは増量剤はマルトデキストリンで構成される、
の両方を含有する。

好ましくは、この場合、抗凍結剤の全量は、溶液の全体積に対し３〜３０重量％、好ましくは４〜２０重量％であり；増量剤、好ましくはマルトデキストリンの全量は、溶液の全体積に対し４〜２０重量％である。

工程ｂ）で得た試料を１つ以上の抗凍結剤を含有する１つ以上の生理食塩水と混合する工程ｃ）は、特に、均一な混合物を取得するために、混練（ｋｎｅａｄｉｎｇ）によって実施されてもよい。

好ましくは、工程ｃ）で得た試料は、生理食塩水と、各重量／体積比が０．５重量：１０体積〜２重量：２体積となるように混合される。試料：溶液の重量／体積比が０．５重量：１０体積であるとは、０．５重量の量（例えば０．５ｇ）の試料が、１０体積（例えば１０ｍｌ）の溶液と混合されることを意味する。好ましくは、この。試料：溶液の重量／体積比は、１試料重量に対し４溶液体積に等しい（１重量：４体積）。

この工程が実施された後、任意の工程ｄ）が実施され得る。工程ｄ）は、特に直径０．７ｍｍ以下、好ましくは０．５ｍｍ以下の孔を有するフィルターを用いて、工程ｃ）で取得した混合物を濾過することを含む。そのような濾過は、粗い粒子を保持して、所望の細菌（便微生物叢を構成するもの）を濾過物中に回収することを可能とする。

次に、工程ｃ）又はｄ）に続いて、後者が想定される場合、取得された混合物は、−１５℃〜−１００℃の温度で凍結保存され：これが工程ｅ）である。好ましくは、凍結（及び保存）温度は、−６０℃〜−９０℃；より好ましくは約−８０℃〜約−６５℃である。

凍結するため、工程ｃ）又はｄ）の後、及びｅ）の前、混合物は、均一な体積の検体となるように分注されてもよい。例えば、分注を実施して、体積が５０ｍｌ、１００ｍｌ、１５０ｍｌ、又は２００ｍｌに等しい検体を取得する。好ましくは、分注は、体積が１００ｍｌに等しい検体を得るために実施される。

凍結及び保存の工程は、処理される試料を、２ヶ月以上の期間維持することを可能とする。この方法で保存された試料は、融解後であっても良好な品質を保つ。

好ましくは、本発明の方法は、工程ｅ）で得た凍結試料を嫌気生活下室温で融解する工程ｆ）を含む。この融解工程ｆ）は、３５〜４０℃、例えば３７℃の温度で数分間（典型的には２〜１０分間）ウォーターバス中に凍結試料を置くことによって実施され得る。また、融解工程ｆ）は、２〜１０℃、例えば４〜８℃の温度で１０〜２０時間凍結試料を置くことによっても実施され得る。

こうして室温で融解した試料は、その後、受容患者に投与され得る。

受容患者は、提供者と異なる者であってもよく、この移植は同種移植である。

受容患者は提供者と同一であってもよく、この移植は自家移植である。この種類の移植は、微生物叢が変化する前に試料を提供するとき、供給者が健康である場合に実施し得る。この試料は、本発明の工程に従って凍結され、供給者が特にＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの感染を呈した場合、同一の供給者（受容患者）に移植される。

便微生物叢の自家移植は、他の供給者から病原体が伝達するのを避けるという利点を有する。

本発明は、自家又は同種便微生物叢の移植における使用のための、本発明の方法によって得られる供給者由来の便微生物の試料にも関する。

本発明は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの感染を治療するための使用における、本発明の方法によって得られる供給者由来の便微生物の試料にも関する。また、本発明は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、小腸の機能不全、肥満、代謝疾患及び自己免疫疾患、アレルギー、神経疾患及び癌の治療のための使用における、本発明の方法によって得られる供給者由来の便微生物の試料にも関する。

本発明は、非限定的な下記の例を用いて例示され得る。

図面の簡単な説明を以下に示す。

図１：種族トランスクリプトームシークエンシング（ｐｈｙｌｏ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）におけるピアソン相関； ＵＳ． 無処理便試料（無操作）対照； ＮａＣｌ． 生理食塩水； ＭＤＸ． マルトデキストリン１５％（ｗ／ｖ）＋トレハロース５％（ｗ／ｖ）を含有する生理食塩水； ＴＲ． トレハロース１５％（ｗ／ｖ）＋マルトデキストリン５％（ｗ／ｖ）を含有する生理食塩水； ＡＥ （赤）． 好気条件（大気暴露）； ＡＮ （青）． 嫌気条件（大気暴露無し＋抗酸化剤）

図２：代謝解析の結果ＤＭ１＝ＭＤＸ１５ＤＭ２＝ＴＲ１５

図３：「新鮮な便」対照と比較した、１週間保存した後に試験した異なる希釈物における細菌属のスピアマン相関ＤＭ１＝ＭＤＸ１５ＤＭ２＝ＴＲ１５

図４：マウス糞中のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ及びＦａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍの集団におけるコロニー形成キネティクス

実施例１：本発明の提供者由来の便微生物の試料の調製
材料及び方法：
試料の回収
連続した３日間、３名の参加者（１日１名）を招き、新鮮な便の試料を提供させ、それを朝回収し、嫌気条件下に置き、触媒Ａｎａｅｒｏｃｕｌｔ（登録商標） ＩＳ （Ｍｅｒｃｋ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅよりｒｅｆ １１６８１９）を添加した（本発明の工程ａ））。便の目視検査及び定性は、Ｂｒｉｓｔｏｌ便スケールに従い実施された。

回収２時間後、便を回収バッグ中で手動で混練して、嫌気大気中で５分間ホモジナイズした（本発明の工程ｂ））。無処理便材料の少量（１５０〜２００ｍｇ）の分注物（無処理便をＵＳと表記する）を、無処理便材料の１６Ｓ ｒＤＮＡ及び１６ｓ ｒＲＮＡシークエンシングのために取り置く。１つの分注物（１ｇ）を、冷やした富化脳心臓ブロス中に希釈し、２２００００×ｇ、４℃、１時間で遠心分離し、上澄みを１ｍｌの分注物に分けて、これらを無処理便水のメタボロームシークエンシングに供した。ＤＮＡ、ＲＮＡ及びメタボロームシークエンシングのための分注物は、−８０℃で保存された。第三の分注物（０．４ｇ）を１．６ｍｌの培養ブロス中に希釈し、これを、参照活性試験のために、３Ｋｉｍａｘ培養チューブに播種する（それぞれ最終濃度０．５％［ｗ／ｖ］及び０．０５％［ｗ／ｖ］のＬ−アスコルビン酸ナトリウム及び塩酸Ｌ−システイン一水和物で富化した９．５ｍｌのブロスに播種物０．５ｍｌ）のに使用した。

次に、８個の便フラクションをＳｔｏｍａｃｈｅｒフィルターバッグに移し：４個のバッグは嫌気条件下で４つの希釈剤と接触させる処理に、もう４個のバッグは好気条件下で同じ４つの希釈剤と接触させる処理に用いた。

処理
２つのチームが、並行して処理の工程を実施することにより、全ての試料が同じように処理されることを保証する。

各大気条件下の４つのフラクションを、４容の以下の水溶液中に戻して懸濁した（前記方法の工程ｃ））：
‐生理食塩水９ｇ／ｌ（「ＮａＣｌ」と表記する）、
‐９ｇ／ｌ生理食塩水中ＤＭＳＯ６．２５％（ｖ／ｖ）（「ＤＭＳＯ」と表記する）、
‐９ｇ／ｌ生理食塩水中ＭＤＸ（マルトデキストリン）１５％（ｗ／ｖ）＋ＴＲ（トレハロース）５％（ｗ／ｖ）（「ＭＤＸ１５」と表記する）、及び
‐９ｇ／ｌ生理食塩水中ＭＤＸ５％（ｗ／ｖ）＋ＴＲ１５％（ｗ／ｖ）（「ＴＲ１５」と表記する）。

嫌気性大気下で作製したＭＤＸ１５及びＴＲ１５調製物を、さらに、Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム及び塩酸Ｌ−システイン一水和物の２つの還元剤で補完（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）して、それぞれの濃度を０．５％（ｗ／ｖ）及び０．１％（ｗ／ｖ）とした。

再懸濁は、前記バッグを通じて５分間手動で混合することによって達成された。この混合により、前記バッグの中に存在するガーゼ（０．５ｍｍの孔を有する）を通って、同時に濾過が達成される（前記方法の工程ｄ））。

そして各濾過物２０ｍｌをピペットで２つのＣｒｙｏＭＡＣＳ（登録商標） Ｆｒｅｅｚｉｎｇ Ｂａｇ ５０ （Ｒｅｆ Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＳＡＳ ２００−０７４−４００）に移し、各提供者から全部で１６個のＣｒｙｏＭＡＣＳ（登録商標）が得られ（２×ＮａＣｌ−Ａｎ、２×ＤＭＳＯ−Ａｎ、２×ＭＤＸ１５−Ａｎ、２×ＴＲ１５−Ａｎ、２×ＮａＣｌ−Ａｅ、２×ＤＭＳＯ−Ａｅ、２×ＭＤＸ１５−Ａｅ、２×ＴＲ１５−Ａｅ）、それらを−８０℃で保存した（前記方法の工程ｅ））。

各濾過物の分注物も、１６ｓ ｒＤＮＡ及び１６ｓ ｒＲＮＡ、メタボロームシークエンシング、及び細菌培養のために取り置かれた。１６ｓ ｒＤＮＡ、１６ｓ ｒＲＮＡ及びメタボロームシークエンシングにおいて、各懸濁物の１ｍｌ分注物６個を３０分間４℃５０００ｘｇで遠心分離し、一纏めにされたそれらの懸濁物を、さらに、メタボロームシークエンシングのために超遠心（２２００００ｘｇ、４℃、１ｈ）にかけられ、一方ｘ５０００ｇで得た湿ペレットは、１６ｓ ｒＤＮＡ及び１６ｓ ｒＲＮＡシークエンシングのために取り置かれた。各濾過物からの０．５ｍｌ分注物３個は、無処理便材料のために、上記のように、培養液を入れたＫｉｍａｘ培養チューブ３本に播種するために使用された。全体のプロセスは連続した３日間で３回繰り返され、３名の異なる提供者からの３つの異なる便が扱われた。

再処理
３名の知恵強者の試料において同一の保存時間を保証するため、前記ＣｒｙｏＭＡＣＳバッグは、１日あたり１名あたり１個のバッグの割合で連続する３日間融解される。融解は、２つの異なるプロトコールを用いて実施される（前記方法の工程ｆ））：
−４℃で一晩；
−３７℃ウォーターバス中で５分間。

融解後、試料を富化脳心臓ブロス中で培養して、代謝活性を測定した。培養前に融解した濾過物の分注物（無培養融解濾過物）も、１６ｓ ｒＤＮＡ、１６ｓ ｒＲＮＡ及びメタボロームシークエンシングのために取り置かれた。

微生物培養
前記方法の各重要な工程において、試料が回収され、それらはそれぞれ９．５ｍｌの富化脳心臓ブロスを入れた３つの培養チューブに播種するために使用された。培養チューブは、予め嫌気チャンバー中で還元されているため溶存酸素はすべて除去されており、細菌の厳格な嫌気性増殖が可能となる。

厳格な嫌気性条件下３７℃４８時間のインキュベーション後、３つの培養物を回収し、Ｆａｌｃｏｎ５０チューブ中に一纏めにし、３０分間５０００ｘｇ４℃で遠心分離した。上澄みをさらにメタボロームシークエンシングのために１時間２２００００ｘｇ４℃で超遠心し（上澄みフラクションを−８０℃で維持する）、一方５０００ｘｇの湿ペレットは、１６ｓ ｒＤＮＡ及び１６ｓ ｒＲＮＡシークエンシングのために取り置かれ、全ての分注物は、解析まで−８０℃で保存された。

メタボローム解析
そしてメタボローム解析が実施され、陽及び陰イオン化モードでＬＣ−ＭＳプロフィール（Ｑ−Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が得られた。

系統発生的プロフィール
全ＤＮＡが抽出された。そしてそれはパイロシークエンシングによってチェック及びシークエンシングされた。

トランスクリプトームシークエンシング
ＲＮＡは、以下の方法によって抽出された：要するに、Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ｒｏｃｈｅ）を用いて、細菌を化学及び機械的処理により溶解し；そのライゼートを沈殿及び遠心分離し；最後にミニカラムでＲＮＡを単離及び精製した。それらの完全性が評価され、そしてそれらは次にＲＴ−ＰＣＲに供された。

パイロシークエンシングによってｃＤＮＡがシークエンシングされ、そしてＤＮＡと同様の解析に供された。

結果
系統発生的プロフィール
主要な識別要素は対象である。これは、微生物叢の宿主の特異性が良く確立している場合に期待された。これは、便に対する処理の効果が何であるかに拘らず、それが宿主の特異性を満足し得ることを意味する。作成された比較は、従って、妥当であり、異なる個人において維持された挙動はより顕著であり得る。

Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｓｐｅａｒｍａｎ相関は、次に、処理のために最も効果的な希釈剤を評価するために使用された。全ＤＮＡに基づく系統発生的プロフィールとＲＮＡに基づくパイロトランスクリプトームシークエンシングとを比較するときに、類似の観察があった。下記図（図１）は、取得された主要な結果を示す。

試料の完全性に対する処理手順の影響
再投与のために使用しなければならない凍結調製物の再処理において、以下の条件が比較された：
−４℃で一昼夜；又は
−３７℃で５分間。

希釈剤が何であっても（ＭＤＸ１５又はＴＲ１５）、３７℃での急速な融解が、最初の便に近い微生物叢の再建に最も適しているように見える。

トランスクリプトームシークエンシング
パイロトランスクリプトームプロフィール間のＰｅａｒｓｏｎ相関は識別的かつ情報的（ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｎｇ ａｎｄ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｖｅ）であるが、パイロゲノミックプロフィール間ではそれらはそうではなかった。

図１は、調製された異なるフラクションの全ＲＮＡ中の細菌ファミリーに関する分布に基づいて取得されたパイロトランスクリプトームプロフィール間のＰｅａｒｓｏｎ相関を表す。参照は、無処理便材料（ＵＳと表記する）から得たプロフィールである。

この図は、マルトデキストリン（ＭＤＸ）及びトレハロース（ＴＲ）の混合物を含有する希釈剤が、生理食塩水溶液（ＮａＣｌ）と比較して、優勢な微生物叢の完全性のより良好な保存を可能とすることを示唆する。同様の観察がＤＮＡにおいてもなされ、これは、前記方法が、集団とそれらの機能的完全性が保存されることを可能とすることを意味する。

メタボローム解析
メタボローム解析の結果を図２に示す。

ＭＤＸ１５又はＴＲ１５中の融解した便懸濁物の培養のメタボローム解析は、好気性（Ａｅ）又は嫌気性（Ａｎ）のいずれの条件下でも、対応する便微生物の培養と最も類似していた。ＮａＣｌ中の凍結及び新鮮な懸濁物の培養の間の相関はより弱かった（赤い矢印）。４℃一昼夜又は３７℃５分間での再処理は、メタボローム解析に殆ど相違をもたらさなかった。

従って、新鮮な便材料、新鮮な便材料の懸濁物及び同一の凍結−非凍結懸濁物の間の代謝プロフィールの保存に基づいて、マルトデキストリン又はトレハロースは、便移植に非常に有効な抗凍結剤かつ増量剤である。

実施例２：無菌マウスにおける微生物叢の再建
前記方法は、ヒト便の処理の、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ系統の無菌マウスに播種した後に再建された小腸生態系に対する影響を解析することに関する。標準化されたアプローチは、対照群といくつかの試験群を含む。新鮮な回収された便の懸濁物を受容する対照群と比較して、試験群は同一の便から作製された調製物を受容する：
−ＮａＣｌ中で凍結したもの、
−１５％マルトデキストリン及び５％トレハロースと共に凍結したもの（実施例１のＭＤＸ１５）、又は
−５％マルトデキストリン及び１５％トレハロースと共に凍結したもの（実施例１のＴＲ１５）。

これらの様々な条件は、微生物叢の保存を最適化することを目的とする。凍結フラクションは、処理及び１〜７週間の保存後にインビボで投与される。試験対照は、処理直後に投与される、ＮａＣｌ中で製剤化された無処理便を用いて行われた。この手順は、経口胃（ｏｒｏ−ｇａｓｔｒｉｃ）プローブを用いて（０．２ｍＬ／マウス）、経口で、異なる播種物の調製物を与えた無菌マウスを利用する。

サンプリング及び解析：
２、４及び１５日後、２〜３個の新鮮な及び自然に排泄されたペレットを動物ごとに朝に回収し、それらを微生物学的解析に付した。さらに、１５日目に屠殺して盲腸内容物の試料を回収し、パイロゲノム及び／又はトランスクリプトーム及びメタボローム解析に付した。

結果：
これらの解析は、ケージの第一のシリーズに対して実行された（１週間の保存対対照）。ＤＮＡが抽出され、ｒＤＮＡ １６Ｓに関してシークエンシングされた。ＯＵＴ（操作的分類単位）が同定され、定量された。次のＳｐｅａｒｍａｎ統計相関（Ｓｐｅａｒｍａｎ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ）は、試験された各試料の分類的内容（ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ｃｏｎｔｅｎｔ）を比較することを可能とする。結果を図３に示す。

異なる条件間で計算されたＳｐｅａｒｍａｎ相関は、コロニー化は、０．９％ＮａＣｌ単独と比較して、ＤＭ１及びＤＭ２製剤において有利になされることを示す。Ｄ＋２では、ＤＭ１製剤は、対照と密接な類似を担持し、一方、ＤＭ２製剤は、Ｄ＋４で同等の性能レベルを達成する。Ｄ＋４では、微生物叢は安定化し、Ｄ＋１５との間でほとんど違いは観察されない。

これらの試験において最も影響される細菌種、即ちＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ及びＦａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に関する深い解析を、図４に示す。

Ｄ２からＤ１５の変化は、ＤＭ１希釈剤が、ＤＭ２希釈剤よりも新鮮な便に近いプロフィールを迅速に呈することを示す。しかしながら、１５日では、いずれも類似のプロフィールを有する。対照的に、ＮａＣｌは炎症促進性細菌Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓによる強いコロニー化を促進し、これは特にＦａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍに被害を及ぼし、実際に移植は失敗する。事実として、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属は、抗炎症特性を呈し、小腸障壁の有効性に関与する（Ｅｖｅｒａｒｄ， ２０１３； Ｓｏｋｏｌ， ２００８）ため、よく研究されている。ヒト微生物叢中にそれが少数存在することは、様々な病理（クローン病、肥満、小腸の炎症性疾患等）にも関係する。

従って、ＮａＣｌの使用は、新鮮な初期の便と同じ質のフロラの構築を可能とせず、一方、希釈剤ＤＭ１及びＤＭ２はこれを達成し、ＤＭ１が僅かに早い効果及びより小さい個人間生存率を示し、これは箱の高さで表される。

細菌ファミリーの分布の発達は、対照群、ＭＤＸ１５を用いて試料を受け取った群（ＤＭ１）及びＴＲ１５を用いて試料を受け取った群（ＤＭ２）の間で同一の傾向を辿る。

同一の傾向は、７週間保存後に実施された試料及び解析において観察された（結果無し）。

従って、マルトデキストリン又はトレハロースは、小腸微生物叢を変化させずに、小腸の効果的な再コロニー化を可能とすることを示す。

Everard, A., 2013. Cross-talk between Akkermansia muciniphila and intestinal epithelium controls diet-induced obesity. Proc Natl Acad Sci U S A, pp. 110(22): 9066-71.

Sokol, H., 2008. Faecalibacterium prausnitzii is an anti-inflammatory commensal bacterium identified by gut microbiota analysis of Crohn disease patients. Proc Natl Acad Sci U S A, pp. 105(43):16731-6.

Claims (17)

1. 提供者に由来する便微生物の試料を調製する方法であって、以下の工程：
   ａ）提供者から１つ以上の便微生物の試料を回収する工程、
   ｂ）当該試料回収後５分以内に、工程ａ）で取得した当該試料を、酸素密閉（ｏｘｙｇｅｎ−ｔｉｇｈｔ）回収デバイス中に置く工程、
   ｃ）工程ｂ）で取得した試料を、１つ以上の抗凍結剤及び１つ以上の増量剤を含有する１つ以上の生理食塩水と混合する工程、及び
   ｄ）工程ｃ）で取得した混合物を、−１５℃〜−１００℃の温度で凍結することにより保存する工程、
   を含み、ここで、工程ｂ）〜ｄ）は、嫌気生活下（ｕｎｄｅｒ ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｉｓ）で実施され、
   前記１つ以上の増量剤がマルトデキストリンであり、そして前記１つ以上の抗凍結剤が、グリセロール、マンニトール、ソルビトール、ＤＭＳＯ、プロピレングリコール、エチレングリコール、トレハロース、サッカロース、ガラクトース−ラクトース、及びそれらの混合物から選択される、方法。
2. 工程ｂ）の回収デバイス中に置かれた試料が、工程ｃ）の前に輸送工程（ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｔｉｏｎ ｓｔｅｐ）に付される、請求項１に記載の方法。
3. 工程ｂ）の回収デバイス中に置かれた試料が、工程ｂ）及びｃ）の間に、最長で７５時間、３３℃〜４０℃の温度でインキュベーションされる、請求項１又は２のいずれか１項に記載の方法。
4. 前記抗凍結剤が、トレハロース、ガラクトース−ラクトース及びそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記生理食塩水中に存在する抗凍結剤の全量が、溶液の全体積に対し３〜３０重量％である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記生理食塩水が：
   −塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、グルコン酸ナトリウム及び酢酸ナトリウムからなる群から選択される１つ以上の塩
   を含有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記増量剤がマルトデキストリンの混合物であり、当該マルトデキストリンの量が、溶液の全体積に対して４〜２０重量％である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
8. 工程ｄ）で取得した凍結試料を嫌気生活下で常温に戻して融解する工程ｅ）を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
9. 提供者に由来する便微生物の試料が自己又は同種便微生物の移植用である、請求項８に記載の方法。
10. 提供者に由来する便微生物の試料が小腸内毒素症の治療用である、請求項８に記載の方法。
11. 工程ｃ）の後に混合物を濾過するさらなる工程を含む、請求項１に記載の方法。
12. 工程ｃ）の後に混合物を濾過する前記さらなる工程が、直径０．７ｍｍ以下の孔を有するフィルターで実施される、請求項１１に記載の方法。
13. 工程ｃ）の後に混合物を濾過する前記さらなる工程が、直径０．５ｍｍ以下の孔を有するフィルターで実施される、請求項１１に記載の方法。
14. 工程ｄ）で、凍結温度が−６０℃〜−９０℃である、請求項１に記載の方法。
15. 前記生理食塩水中に存在する抗凍結剤の全量が、溶液の全体積に対して４〜２０重量％である、請求項５に記載の方法。
16. 前記生理食塩水が１つ以上の抗酸化剤をさらに含有する、請求項６に記載の方法。
17. 前記抗酸化剤が、Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム、トコフェロール、塩酸Ｌ−システイン一水和物及びそれらの混合物から選択される、請求項１６に記載の方法。

Images