CN107530280B - 粪便微生物群样品的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于从供者受试者制备粪便微生物群样品的方法,该方法包括下列步骤:a)从供者受试者提取至少一个粪便微生物群样品;b)在取样后少于5分钟的时限内,将在a)中获得的所述样品放置在不透氧气的收集装置中;c)将在b)中获得的样品与至少一种包含至少一种冷冻保护剂和/或填充剂的盐水水溶液相混合;d)任选地,将在c)中获得的混合物进行过滤,尤其是通过包含具有小于或等于0.7mm,优选地小于或等于0.5mm的直径的孔的过滤器;和e)通过在‑15℃至‑100℃的温度下进行冷冻来储存在c)或d)中获得的混合物;其中步骤b)至e)在厌氧生活下进行。
Description
本发明涉及用于制备粪便微生物群样品的方法。本发明还涉及所述样品在粪便微生物群移植中的用途,优选地为了治疗肠道生态失调,尤其是艰难梭菌(Clostridiumdifficile)感染。
人肠道微生物群是存在于人胃肠系统(胃、肠和结肠)中的微生物(细菌、酵母和真菌)的全体。目前,微生物多样性据估计为大约103种构成了成年个体的占优势的肠道微生物群的细菌物种,其中具有1014个细菌的丰度,其代表了在每个个体中200 000至800 000个基因的细菌宏基因组(metagenome),即人基因组的基因数目的10至50倍。
肠道(在子宫中是无菌的)从生命的头几天开始发生菌落移生至向独特的个体微生物群演变。每个人拥有就物种而言相对接近的细菌,但是其微生物群的确切组成(物种、比例)在很大程度上(超过2/3的物种)是宿主所特异的。
因此,人肠道微生物群是一个非常多样化的、复杂的且特异于每个个体的生态系统。
对于个体的健康来说,必要的是维持稳定的微生物群,其同时能够在变化后回到其初始状态和对于侵袭具有抗性。维持微生物群的大的多样性有助于其稳定性。但是,某些病理学状况或治疗使微生物群失衡:例如,抗生素以及具有炎症性组分的疾病(例如慢性炎症性肠病(CIBD))可以限制肠道中微生物群的多样性。
抗生素治疗(或抗生素疗法)尤其导致微生物群的改变,这可以有助于致病生物例如艰难梭菌的增殖。
艰难梭菌感染对于医院内腹泻负有责任;该细菌对于传统的抗生素疗法(广谱的,例如万古霉素或甲硝唑)具有抗性。为了重建肠道微生物群和对艰难梭菌类型的感染作斗争并因此重建内环境稳定(即共生),考虑并测试了粪便微生物群移植。它在于将健康供者受试者的粪便引入到受者患者的消化道中,以便使宿主的经改变的肠道微生物群重新平衡。该粪便微生物群移植可以是同种异体的(即从健康供者个体至患者)或自体的(即从个体至其自身)。对于艰难梭菌类型的感染获得的结果是令人鼓舞的,并且某些患者已被成功地治疗(Tauxe等人,Lab Medicine,2015年冬,第46卷,第1期)。
但是,目前的移植方法是经验性的并且没有采取任何特别预防措施以最好地保存厌氧细菌(其是肠道微生物群的主要组分)的生存力。此外,粪便微生物群移植的功效是可变的,并且可能需要多于一种治疗处置。另外,同种异体移植需要测试供者的粪便,以确保没有任何致病菌将会被移植给受者,或者将会在手术期间对操作其的人员造成危险。
因此,对于拥有安全的、有效的且易于施行的(尤其是以工业规模)的粪便微生物群移植方法的存在需要。此外,对于其中细菌的生存力得到保存的粪便微生物群移植方法存在需要。
本发明使得能够满足这些需要。
因此,本发明涉及用于制备来自供者受试者的粪便微生物群样品的方法,该方法包括下列步骤:
a)提取至少一个来自供者受试者的粪便微生物群样品,
b)在取样后少于5分钟的时限内,将在a)中获得的所述样品放置在不透氧气的收集装置中,
c)将在b)中获得的样品与至少一种包含至少一种冷冻保护剂和/或填充剂的盐水水溶液相混合,
d)任选地,将在c)中获得的混合物进行过滤,尤其是通过包含具有小于或等于0.7mm,优选地小于或等于0.5mm的直径的孔的过滤器,和
e)通过在-15℃至-100℃,优选地-60℃至-90℃的温度下进行冷冻来储存在c)或d)中获得的混合物,
其中步骤b)至e)在厌氧生活下进行。
如此,这样的粪便微生物群移植方法是易于施行的,并且其功效可以通过将在该方法后获得的微生物群体与初始取样物相比较来进行估计。可以使用各种不同的指数来评价该功效,并且可以获得下面的结果:
本发明还涉及处于解冻状态的能够通过根据本发明的方法来获得的来自供者受试者的粪便微生物群样品在自体或同种异体粪便微生物群移植中的用途。
本发明还涉及处于解冻状态的能够通过根据本发明的方法来获得的来自供者受试者的粪便微生物群样品的用途,所述用途为用于治疗肠道生态失调,尤其是艰难梭菌感染,由药物治疗、由物理治疗(尤其是辐射)、由外科手术(尤其是肠的)或由营养摄入所诱导的生态失调。本发明还涉及处于解冻状态的能够通过根据本发明的方法来获得的来自供者受试者的粪便微生物群样品用于治疗选自下列的病理学状况的用途:慢性炎症性肠病(CIBD)、肠道功能障碍、肥胖症、代谢疾病(尤其是2型糖尿病、代谢综合征)和自身免疫性疾病(尤其是1型糖尿病)、变态反应、肝脏疾病(尤其是脂肪变性、肝硬化)、某些神经学疾病(尤其是孤独症)和某些癌症(尤其是结肠直肠癌)。
“肠道生态失调”是指肠道微生物群的任何持久失衡。“肠道微生物群的持久失衡”是指有益微生物的任何损失,和/或微生物多样性的任何损失,和/或在共生体中的侵袭性微生物(病理生物(pathobiont))的任何扩张或发展,和/或致病微生物(尤其是艰难梭菌)的任何增殖。这是因为,人肠道微生物群的任何持久改变可以引起病理学状态。尤其是,微生物群内多样性的减少是与生态失调相关的疾病(尤其是肥胖症、克罗恩病、糖尿病或变态反应)的特征(Sansonetti,Collège de France,2014年1月22日)。
优选地,待治疗的病理学状况为肠道生态失调。
“慢性炎症性肠病(CIBD)”尤其是指克罗恩病、出血性直肠结肠炎。
“肠道功能性障碍”尤其是指结肠易激惹综合征、痉挛性结肠炎。
因此,根据本发明的用于制备来自供者受试者的粪便微生物群样品的方法包括提取至少一个来自供者受试者的粪便微生物群样品的步骤a)。
该步骤优选地通过提取来自供者受试者的粪便样品来进行。这是因为,粪便样品包含供者受试者的粪便微生物群。因此,根据本发明的方法包括提取至少一个来自供者受试者的粪便样品(其包含粪便微生物群)的步骤a)。
优选地,根据本发明,所述供者受试者为健康的人受试者。“健康的受试者”是指未患有肠道微生物群失衡或由医疗机构诊断/识别出的病理学状况的受试者。
优选地,所述粪便样品具有至少20g的质量。
在该取样步骤后且在非常快(即在取样后少于5分钟,优选地少于3分钟,更优选地少于1分钟)的时限内,将在a)中获得的取样物放置在不透氧气的收集装置中:这是步骤b)。
从此以后,该方法的整个后续部分在厌氧生活下(即在厌氧气氛中)进行。
优选地,所述不透气的收集装置以包含下述部分的类型的形式存在:
-容器,其包含具有适合于接纳来自供者受试者的粪便微生物群样品的内部空间的本体,和界定出进入本体的内部空间的开口的颈部,以及
-盖子,其适合于可拆卸地且密封地安装在所述容器的颈部上以便阻塞颈部的进入开口并封闭本体的内部空间,
其中所述容器的本体由柔软的袋子构成,并且其中所述容器和所述盖子中的至少一个配备有排放机构,其适合于排出包含在所述容器的本体的内部空间中的气体的至少一部分。
优选地,所述装置的排放机构包含通过所述容器和所述盖子之一设置的通道,和用于阻止外部液体渗透入所述容器的本体的内部空间中的阻塞所述通道的元件。优选地,所述装置的排放机构另外还包含布置在所述通道中的微孔过滤膜。
备选地,所述不透气的收集装置以包含下述部分的类型的形式存在:
-容器,其包含具有适合于接纳来自供者受试者的粪便微生物群样品的内部空间的本体,和界定出进入本体的内部空间的开口的颈部,以及
-盖子,其适合于可拆卸地且密封地安装在所述容器的颈部上以便阻塞颈部的进入开口并封闭本体的内部空间,
其中所述容器的本体的内部空间任选地包含中和氧气的化学装置。
优选地,将所述不透气的收集装置用于步骤a)和b):步骤a)的样品提取直接在所述装置中(尤其是在所述容器中)进行,并且所述装置的封闭(尤其是借助于所述盖子)将所述样品置于没有氧气的气氛中(步骤b)。
依照本发明的方法,步骤b)至e)在没有氧气的气氛下进行。因此,在厌氧生活下,构成粪便微生物群且存在于样品中的细菌的生存力得到保存。
特别地,上面提及的在步骤b)中所使用的装置使得能够在厌氧生活下进行所有的步骤b)至e)。
一旦将(在a)中获得的)所述样品放置在不透氧气的收集装置中,就可以任选地将它在33℃至40℃的温度下温育75小时的最大持续时间。优选地,该温育步骤在35℃至38℃的温度下进行24小时至73小时的持续时间。理想地,该步骤在大约37℃的温度下进行72小时。备选地,可以将所述样品任选地在2℃至10℃的温度下温育75小时的最大持续时间。优选地,该温育步骤在4℃至8℃的温度下进行24小时至72小时的持续时间。
在该步骤结束时,可以进行目视检查,以便评价在所述方法的该阶段获得的样品的质量。如果该检查是相符的,那么任选地可以因此进行运输步骤。该运输步骤使得能够将样品从取样点送回到实验室,以用于以后治疗和分析。前面提及的目视检查也可以在运输后进行。
因此,优选地,使放置在步骤b)的收集装置中的样品在步骤c)之前经历运输步骤。
还优选地,在步骤b)和c)之间,将放置在步骤b)的收集装置中的样品在33℃至40℃,优选地35℃至38℃的温度下温育75小时的最大持续时间,优选地24小时至73小时的持续时间。优选地,所述温育在运输步骤之前和期间进行。
然后,进行步骤c):该步骤包括将在b)中获得的样品与至少一种包含至少一种冷冻保护剂和/或填充剂的盐水水溶液相混合。
如果发生运输步骤和任选地温育步骤,那么步骤c)很显然地包括将在b)中获得的样品在运输和/或温育后与至少一种包含至少一种冷冻保护剂和/或填充剂的盐水水溶液相混合。
典型地,根据本发明的盐水水溶液包含水和生理学上可接受的盐。典型地,所述盐为钙、钠、钾或镁与负氯离子、葡糖酸根离子、乙酸根离子或碳酸氢根离子的盐。
根据本发明的盐水水溶液还可以任选地包含至少一种抗氧化剂。所述抗氧化剂尤其选自抗坏血酸及其盐(抗坏血酸盐)、生育酚(尤其是α-生育酚)、半胱氨酸及其成盐形式(尤其是盐酸盐)以及其混合物。
优选地,根据本发明的盐水水溶液包含:
-至少一种盐,其选自氯化钠、氯化钙、氯化镁、氯化钾、葡糖酸钠和乙酸钠,和
-任选地,至少一种抗氧化剂,其优选地选自L-抗坏血酸钠、生育酚、L-半胱氨酸盐酸盐一水合物及其混合物。
典型地,所述盐以5至20g/L,优选地7至10g/L的浓度存在于所述盐水水溶液中。
典型地,所述抗氧化剂以相对于溶液总体积而言0.3至1重量%的量,优选地以相对于溶液总体积而言0.4至0.6重量%的量存在于所述盐水水溶液中。
优选地,当所述氧化剂为L-抗坏血酸钠和L-半胱氨酸盐酸盐一水合物的混合物时,L-抗坏血酸钠以相对于溶液总体积而言0.4至0.6重量%的量存在,并且L-半胱氨酸盐酸盐一水合物以相对于溶液总体积而言0.01至0.1重量%的量存在。
优选地,根据本发明的盐水水溶液还包含至少一种冷冻保护剂。冷冻保护剂是用于保护样品免于由冷冻所引起的(尤其是由于冰晶形成而引起的)损害的物质。
优选地,所述冷冻保护剂选自多元醇、二至五糖(即二糖、三糖、四糖和五糖)、DMSO及其混合物。优选地,所述冷冻保护剂选自多元醇、三糖和二糖、DMSO及其混合物。更优选地,在所述盐水水溶液中存在的冷冻保护剂为二糖或三糖。
在可使用的多元醇中,尤其找到甘油、甘露醇、山梨醇,但也找到丙二醇或乙二醇。
在可使用的二至五糖中,可以提及相同或不同单元的二聚体、三聚体、四聚体和五聚体,所述单元选自葡萄糖、果糖、半乳糖、岩藻糖和N-乙酰神经氨酸。
在可使用的二糖中,尤其找到海藻糖或其类似物,或蔗糖。
最后,DMSO或二甲亚砜是传统的冷冻保护剂。
这些冷冻保护剂可以单独地或以混合物进行使用。
典型地,在所述盐水水溶液中存在的冷冻保护剂的总量为相对于溶液总体积而言3至30重量%,优选地相对于溶液总体积而言4重量%至20重量%。
优选地,所述冷冻保护剂选自甘油、甘露醇、山梨醇、DMSO、丙二醇、乙二醇、海藻糖及其类似物、蔗糖、半乳糖-乳糖以及其混合物。更优选地,所述冷冻保护剂为半乳糖-乳糖或海藻糖。
优选地,根据本发明的盐水水溶液包含至少一种填充剂。
所述填充剂优选地选自淀粉的部分水解产物。淀粉(amidon)(尤其是小麦或玉米淀粉)的部分水解产物以及淀粉(fécule)(例如马铃薯淀粉)的部分水解产物包含大量的麦芽糖糊精。麦芽糖糊精是淀粉部分水解的结果,并且由各种不同的糖(葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、寡糖和多糖)构成,它们的比例随水解程度而变化。
优选地,在所述盐水水溶液中存在的填充剂为麦芽糖糊精的混合物,其中麦芽糖糊精的量为相对于溶液总体积而言4至20重量%。
优选地,根据本发明的盐水水溶液同时包含:
-至少一种上面所描述的冷冻保护剂,即选自多元醇、二至五糖(即二糖、三糖、四糖和五糖)、DMSO及其混合物的冷冻保护剂,和
-至少一种上面所描述的填充剂,即选自淀粉的部分水解产物的填充剂,优选地所述填充剂由麦芽糖糊精构成。
优选地,在该情况下,冷冻保护剂的量为相对于溶液总体积而言3至30重量%,优选地相对于溶液总体积而言4重量%至20重量%;并且填充剂(优选地麦芽糖糊精)的量为相对于溶液总体积而言4至20重量%。
将在b)中获得的样品与至少一种包含至少一种冷冻保护剂的盐水水溶液相混合的步骤c)尤其可以通过搅拌来进行,以便获得均匀的混合物。
优选地,将在b)中获得的样品与所述盐水水溶液以0.5份重量∶10份体积至2份重量∶2份体积的各自的重量/体积比相混合。等于0.5份重量∶10份体积的“样品∶溶液”的重量/体积比意味着,以每10份体积的溶液(例如10ml)采用0.5份重量(例如0.5g)来混合样品。优选地,“样品∶溶液”的重量/体积比等于每4份体积的溶液采用1份重量的样品(1份重量∶4份体积)。
一旦实施了该步骤,就可以进行任选的步骤d)。步骤d)包括将在c)中获得的混合物进行过滤,尤其是通过包含具有小于或等于0.7mm,优选地小于或等于0.5mm的直径的孔的过滤器。这样的过滤使得能够截留粗颗粒和回收在滤液中的目的细菌(其构成粪便微生物群)。
然后,在步骤c)或d)之后,当该后者发生时,通过在-15℃至-100℃的温度下进行冷冻来储存所获得的混合物:这是步骤e)。优选地,冷冻(和因此储存)的温度为-60℃至-90℃;更优选地,它为大约-80℃或大约-65℃。
为了进行冷冻,在步骤c)或d)之后和在步骤e)之前,可以事先将所述混合物分成等分试样,以确保恒定体积的样本。例如,进行等分试样的分配以获得体积等于50ml、100ml、150ml或200ml的样本。优选地,进行等分试样的分配以获得体积等于100ml的样本。
该冷冻和储存步骤使得能够将经处理的样品保存至少2个月的持续时间。此外,经如此储存的样品具有良好的质量,甚至在解冻之后。
优选地,根据本发明的方法包括在厌氧生活下使在e)中获得的经冷冻的样品解冻直至环境温度的步骤f)。该解冻步骤f)可以通过将经冷冻的样品置于温度为35℃至40℃(例如37℃)的水浴中数分钟(典型地,2至10分钟)的持续时间来进行。解冻步骤f)也可以通过将经冷冻的样品置于2℃至10℃(例如4℃至8℃)的温度下10至20小时的持续时间来进行。
然后,可以向受者患者施用处于环境温度下的经如此解冻的样品。
受者患者可以不同于供者受试者,那么所述移植是同种异体的。
受者患者也可以与供者受试者相同,那么所述移植是自体的;可以当受试者(当时是健康的)在其微生物群改变之前给出样品时进行该类型的移植。在这种情况下,将样品按照在本申请中所描述的步骤来进行冷冻,然后移植给该相同的受试者(受者患者),如果后者尤其具有艰难梭菌感染。自体粪便微生物群移植具有避免来自另一个供者的致病因子的传播这样的优点。
本发明还涉及能够通过根据本发明的方法来获得的来自供者受试者的粪便微生物群样品,其用于在自体或同种异体粪便微生物群移植中使用。
本发明还涉及能够通过根据本发明的方法来获得的来自供者受试者的粪便微生物群样品,其用于为了治疗艰难梭菌感染来进行使用。本发明还涉及能够通过根据本发明的方法来获得的来自供者受试者的粪便微生物群样品,其用于为了治疗选自下列的病理学状况来进行使用:慢性炎症性肠病(CIBD)、肠道功能障碍、肥胖症、代谢疾病和自身免疫性疾病、变态反应、神经学疾病和癌症。
现在将会借助于非限制性的下面的实施例来举例说明本发明。
附图的图例如下:
图1:关于种系转录物组特性谱的Pearson相关性
-SB.粗制粪便样品对照(未调节的)
-NaCl.盐水溶液
-MDX.具有15%(w/v)麦芽糖糊精+5%(w/v)海藻糖的盐水
-TR.具有15%(w/v)海藻糖+5%(w/v)麦芽糖糊精的盐水
-AE(红色).需氧的(暴露于空气)
-AN(蓝色).厌氧的(未暴露于空气+抗氧化剂)
图2:代谢物组分析的结果
DM1=MDX15
DM2=TR15
图3:相比于“新鲜粪便”对照而言,在保存一周后关于所测试的各种不同稀释剂的在细菌属水平上的Spearman相关性
DM1=MDX15
DM2=TR15
图4:在小鼠粪便中的拟杆菌属(Bacteroides)和粪便杆菌属(Faecalibacterium)群体的菌落移生(colonisation)动力学。
实施例1:根据本发明的来自供者受试者的粪便微生物群样品的制备
材料与方法:
样品的提取
在连续三天期间,邀请3名参与者(每天一名)提供新鲜粪便样品,这些样品在早晨收集并且借助于IS(Merck-Millipore中的参考号116819)类型的催化剂的添加而被置于厌氧生活下(所述方法的步骤a))。粪便的目视评价和定性按照Bristol表格来进行。
在收集后2小时中,通过在收集袋中手动搅拌,将粪便在厌氧气氛中均质化5分钟(所述方法的步骤b))。将粗制粪便材料(SB,即“粗制粪便”的缩写)的小等分试样(150-200mg)保存用于粗制粪便材料的16S rDNA和16S rRNA的特性谱分析。将一个等分试样(1g)稀释在经浓集的且冷的脑心肉汤培养基中,在4℃下以220 000×g离心1小时,并且将上清液分配成1ml的等分试样以用于粗制粪便水的代谢物组特性谱分析。将用于DNA、RNA和代谢物组特性谱分析的等分试样储存于-80℃。将第三个等分试样(0.4g)稀释在1.6ml的培养肉汤培养基中,并且用于接种3个Kimax培养管(0.5ml的接种物/9.5ml的肉汤培养基,其即时地富含L-抗坏血酸钠和L-半胱氨酸盐酸盐一水合物,分别以0.5%[w/v]和0.05%[w/v]的最终浓度)以用于参照活性测试。
然后,将八个粪便级分转移入Stomacher过滤袋中:4个袋子用于在厌氧条件下在四种稀释剂中进行调节,和四个袋子用于在需氧条件下在相同的四种稀释剂中进行调节。
调节
两个小组平行地进行调节步骤以确保所有样品以相同的方式被处理。
将在每种气氛条件下的4个级分重新悬浮在4份体积的下列水溶液中(所述方法的步骤c)):
-9g/L盐水溶液(标示为“NaCl”),
-在9g/L盐水溶液中的6.25%(v/v)DMSO(标示为“DMSO”),
-在9g/L盐水溶液中的15%(w/v)MDX(麦芽糖糊精)+5%(w/v)TR(海藻糖)(标示为“MDX15”),和
-在9g/L盐水溶液中的5%MDX+15%TR(标示为“TR15”)。
此外,在厌氧气氛中制作的制备物MDX15和TR15通过两种还原剂(L-抗坏血酸钠和L-半胱氨酸盐酸盐一水合物,分别以0.5%(w/v)和0.1%(w/v)的最终浓度)来完成。
重新悬浮通过经由袋子手动混合5分钟来确保。该混合同时确保了过滤,这经由在袋子中存在的纱布(0.5mm的孔洞)来进行(所述方法的步骤d))。
然后,将20ml的每个滤液用移液管转移入两个冷冻袋FreezingBags 50(参考号:Miltenyi Biotec SAS 200-074-400)中,从而对于每个供者提供总共16个(2x NaCl-An,2x DMSO-An,2x MDX15-An,2x TR15-An,2x NaCl-Ae,2xDMSO-Ae,2x MDX15-Ae,2x TR15-Ae),它们被储存于-80℃(所述方法的步骤e))。
还将每个滤液的等分试样保存用于16S rDNA、16S rRNA、代谢物组特性谱分析和细菌培养。对于16S rDNA、16S rRNA、代谢物组学,将每个悬浮液的6个1ml的等分试样在4℃下以5000×g离心30分钟;此外,将合并的上清液进行超离心(220 000×g,4℃,1小时)以用于代谢物组学,而将5000×g的潮湿的粒状沉淀保存用于16S rDNA和16S rRNA的特性谱分析。将每个滤液的三个0.5ml的等分试样用于接种3个具有培养肉汤培养基的Kimax培养管,如前面对于粗制粪便材料所描述的那样。整个过程在连续3天内重复3次以管理来自三个不同供者的3种不同粪便。
再调节
为了确保对于3个供者的样品的相同的储存时间,将CryoMACS袋在连续3天内按照每人每天一个袋子进行解冻。所述解冻依照两个不同的实验方案来进行(所述方法的步骤f)):
-在4℃下过夜;
-在水浴中在37℃下进行5分钟。
在解冻后,将样品在经浓集的脑心肉汤培养基中进行培养,并且评价代谢活性。还将在培养前解冻的滤液(未培养的经解冻的滤液)的等分试样保存用于16S rDNA、16S rRNA和代谢物组特性谱分析。
微生物培养
在所述方法的每个关键步骤处,收集样品并用于接种一式三份的培养管,其各包含9.5mL的经浓集的脑心肉汤培养基。所述培养管已经在厌氧室中进行了还原,以去除任何溶解的氧气并允许严格厌氧细菌的生长。
在严格厌氧条件下在37℃下温育48小时后,收获一式三份的培养物,合并在Falcon50管中,并且在4℃下以5000×g离心30分钟。此外,将上清液在4℃下以220 000×g超离心1小时以用于代谢物组特性谱分析(将1ml的分级分离上清液保存于-80℃),而将5000×g的潮湿的粒状沉淀在Sarstedt管中分成三个相等的级分以用于16S rDNA和16SrRNA,其中将所有等分试样保存于-80℃直至分析。
代谢物组分析
然后,进行代谢物组分析以便获得LC-MS特性谱(Q-Exactive ThermofisherScientific),以正和负离子化模式。
系统发生特性谱
提取总DNA。然后,通过焦磷酸测序来对它进行检查和测序。
转录物组特性谱
通过使用下面的方法来提取RNA:简而言之,通过化学和机械处理来裂解细菌;然后使裂解物沉淀并离心;最后通过使用试剂盒High Pure Isolation Kit(Roche)在小型柱上分离和纯化RNA。评价其完整性,并随后使它们经历RT-PCR。
通过焦磷酸测序来对cDNA进行测序,然后使其经历与对于DNA相同的分析。
结果:
系统发生特性谱
主要的区别因素是受试者。这是所预期到的,因为微生物菌群的宿主特异性已被充分地建立。这意味着,无论粪便的调节效果如何,都将遵循宿主特异性。因此,所进行的比较将会是可靠的,并且对于不同个体所保存的行为将会是更有意义的。
然后,使用Pearson和Spearman相关性来评价最有效的调节稀释剂。当比较基于总DNA的系统发生特性谱与基于RNA的种系转录物组特性谱时,进行了相似的观察。下面的图解(图1)突出显示了所获得的主要结果。
再调节程序对于样品完整性的影响
对于打算用于再施用的经冷冻的制备物的再调节所比较的条件为:
-在4℃下过夜;或
-在37℃下进行5分钟。
无论稀释剂(MDX15或TR15)为何,在37℃下的快速解冻看起来对于重构接近初始粪便的微生物群来说是最有利的。
转录物组特性谱
在种系转录物组特性谱之间的Pearson相关性是区分性的和提供信息的,而在种系基因组特性谱之间的Pearson相关性则不是这样。
图1显示了在种系转录物组特性谱之间的Pearson相关性,所述种系转录物组特性谱是从在所制备的不同级分的总RNA中的在细菌科水平上的分布开始来获得的。参照为从粗制粪便材料(SB,即“粗制粪便”的缩写)开始获得的特性谱。
该图指明,包含麦芽糖糊精(MDX)和海藻糖(TR)的混合物的稀释剂相对于盐水溶液(NaCl)而言使得能够更好地保存优势微生物群的完整性。此后,对于DNA进行了相似的观察,这意味着所述方法使得能够保存所述群体以及其功能完整性。
代谢物组分析
代谢物组分析的结果呈现在图2中。
在MDX15或TR15中解冻的粪便悬浮液的培养物的代谢特性谱是与相应的新鲜悬浮液的培养物最相似的(绿色箭头),无论是在需氧条件下(Ae)还是在厌氧条件下(An)。在NaCl中在经冷冻的和新鲜的悬浮液的培养物之间获得较低的相关性(红色箭头)。在4℃下过夜或者在37℃下进行5分钟的再调节对于代谢物组特性谱造成很少的差异。总体而言,基于在新鲜粪便材料的培养物、新鲜粪便材料的悬浮液的培养物和经冷冻-解冻的相同悬浮液的培养物之间的代谢特性谱的保存情况,麦芽糖糊精或海藻糖是对于粪便移植来说非常有效的冷冻保护剂和填充剂。
实施例2:在无菌小鼠中微生物群的重构
该程序旨在分析人粪便的调节过程对于在接种到C3H/HeN品系的无菌小鼠中后重构的肠道生态的影响。标准化研究方式包括一个对照组和多个测试组。与接受新鲜收集的粪便的悬浮液的对照组相比,测试组接受从相同粪便开始制作的制备物,其:
-在NaCl中进行冷冻;
-与15%麦芽糖糊精和5%海藻糖(在实施例1中所描述的“MDX15”)一起进行冷冻;或
-与15%海藻糖和5%麦芽糖糊精(在实施例1中所描述的“TR15”)一起进行冷冻。
这些各种各样的条件旨在优化微生物群的保存。在调节和储存1和7周后,在体内施用经冷冻的级分。用在NaCl中配制的、在调节后立即植入的粗制粪便来制作试验对照。该程序要求使用借助于口胃插管经口接受接种物的各种不同制备物的无菌小鼠(0.2mL/小鼠)。对该程序成功的评价基于在组成和活性方面对于微生物群的表征,其中与对照的最大相似度(%)是最初所寻求的。对于每个条件在4只动物上进行该程序,以便测试一套事先通过体外比较分析而验证有效的条件。
取样和分析:在2天、4天和15天后,在进行微生物学分析的那天早晨,对于每只动物收集2至3个新鲜且自发排出的粪便团粒。另外,通过在15天时处死来收集盲肠内容物样品以用于种系基因组和/或转录物组和代谢物组分析。
结果:
这些分析在第一个系列的笼子上进行(“保存1周”对“对照”)。提取DNA,然后就16SrDNA进行测序。对OTU(Operational Taxonomic Unit(操作分类单位))进行鉴定和定量。然后,Spearman统计学相关性使得能够比较所测试的每个样品的分类学内容。结果呈现在图3中。
在各种不同条件之间所计算的Spearman相关性显示,菌落移生有效地进行,其中在制剂DM1和DM2的情况下相比于单独的0.9%NaCl而言具有优势。在D+2,制剂DM1给出了非常接近对照的相似性,而制剂DM2达到等价于D+4的性能水平。在D+4,微生物群稳定下来,并且存在很少的用D+15该点观察到的差异。
在这些试验中最受影响的细菌属(即拟杆菌属和粪便杆菌属)的水平上的深入分析呈现在图4中。
D2至D15的演变充分显示,稀释剂DM1快速地具有比稀释剂DM2更接近新鲜粪便的特性谱。然而,在15天时,这两种稀释剂均具有相似的特性谱。相反地,NaCl有助于拟杆菌属物种(促炎细菌)的强的菌落移生,而损害特别是粪便杆菌属物种,其实际上不能够被植入。然而,对粪便杆菌属进行了许多研究,因为其具有抗炎特性并且促进肠道屏障的功效(Everard,2013;Sokol,2008)。其在人微生物群中的少量存在也与各种不同的病理学状况(克罗恩病、肥胖症、炎症性肠病等)有关。
因此,NaCl的使用无法使得能够重建具有与初始的新鲜粪便相同的质量的菌群,而稀释剂DM1和DM2则能够,其中具有稍微更快的效果(用DM1)以及更低的由箱的高度所表示的个体间的可变性。
在对照组、接受了具有MDX15(DM1)的样品的组和接受了具有TR15(DM2)的样品的组之间,细菌科的分布的演变遵照相同的趋势。
对于在7周的储存后进行的取样和分析观察到相同的趋势(结果未显示)。
因此,得出结论,麦芽糖糊精或海藻糖允许肠道的有效的重新菌落移生,而没有初始微生物群的改变。
Everard,A.,2013.Cross-talk between Akkermansia muciniphila andintestinal epithelium controls diet-induced obesity.Proc Natl Acad Sci U S A,110(22):第9066-71页.
Sokol,H.,2008.Faecalibacterium prausnitzii is an anti-inflammatorycommensal bacterium identified by gut microbiota analysis of Crohn diseasepatients.Proc Natl Acad Sci U S A,105(43):第16731-6页.
Claims (14)
1.用于制备来自供者受试者的粪便微生物群样品的方法,该方法包括下列步骤:
a)提取至少一个来自供者受试者的粪便微生物群样品,
b)在取样后少于5分钟的时限内,将在a)中获得的所述样品放置在不透氧气的收集装置中,
c)将在b)中获得的样品与至少一种包含至少一种冷冻保护剂和至少一种填充剂的盐水水溶液相混合,
d)任选地,将在c)中获得的混合物进行过滤,和
e)通过在-15℃至-100℃的温度下进行冷冻来储存在c)或d)中获得的混合物,
其中步骤b)至e)在厌氧生活下进行;
所述至少一种填充剂为麦芽糖糊精;并且
所述至少一种冷冻保护剂选自海藻糖、半乳糖-乳糖及其混合物。
2.根据权利要求1的方法,其特征在于,在步骤d)中,将在c)中获得的混合物通过包含具有小于或等于0.7mm的直径的孔的过滤器进行过滤。
3.根据权利要求1的方法,其特征在于,在步骤d)中,将在c)中获得的混合物通过包含具有小于或等于0.5mm的直径的孔的过滤器进行过滤。
4.根据权利要求1的方法,其特征在于,在步骤e)中通过在-60℃至-90℃的温度下进行冷冻来储存在c)或d)中获得的混合物。
5.根据权利要求1的方法,其特征在于,被放置在步骤b)的收集装置中的样品在步骤c)之前经历运输步骤。
6.根据权利要求1的方法,其特征在于,在步骤b)和c)之间,将被放置在步骤b)的收集装置中的样品在33℃至40℃的温度下温育75小时的最长持续时间。
7.根据权利要求1至6之一的方法,其特征在于,在所述盐水水溶液中存在的冷冻保护剂的总量为相对于溶液总体积而言3至30重量%。
8.根据权利要求1至6之一的方法,其特征在于,在所述盐水水溶液中存在的冷冻保护剂的总量为相对于溶液总体积而言4重量%至20重量%。
9.根据权利要求1至6之一的方法,其特征在于,所述盐水水溶液包含:
-至少一种盐,其选自氯化钠、氯化钙、氯化镁、氯化钾、葡糖酸钠和乙酸钠,和
-任选地,至少一种抗氧化剂。
10.根据权利要求9的方法,其特征在于,所述至少一种抗氧化剂选自L-抗坏血酸钠、生育酚、L-半胱氨酸盐酸盐一水合物及其混合物。
11.根据权利要求1至6之一的方法,其特征在于,所述填充剂为麦芽糖糊精的混合物,其中麦芽糖糊精的量为相对于溶液总体积而言4至20重量%。
12.根据权利要求1至6之一的方法,其特征在于,它包括在厌氧生活下使在e)中获得的经冷冻的样品解冻直至环境温度的步骤f)。
13.通过根据权利要求12的方法来获得的来自供者受试者的粪便微生物群样品,其用于在自体或同种异体粪便微生物群移植中使用。
14.通过根据权利要求12的方法来获得的来自供者受试者的粪便微生物群样品,其用于为了治疗肠道生态失调来进行使用。
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