CN109679877A - 一种高活性粪菌胶囊的制备方法 - Google Patents

一种高活性粪菌胶囊的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高活性粪菌胶囊的制备方法，高活性粪菌在耐酸性肠溶性胶囊的保护下可以到达患者肠道发挥作用，包括如下步骤：S1、粪菌液的制备；S2、粪菌液活性及菌群结构评估；S3、将步骤S2中所得粪菌液加入冻干保护剂冻存至给患者进行粪菌胶囊移植前，在对受体进行粪菌胶囊移植时，将粪菌液解冻，并离心得到菌体；S4、将步骤S3中的菌体用适当体积的粪菌溶剂进行溶解，将粪菌菌体装入双层耐酸性肠溶性胶囊中。本发明的有益效果是：菌群活性较高，可放于低温长久保存；便于菌群移植的实施，不需要侵入性的实施方式。

Description

一种高活性粪菌胶囊的制备方法
技术领域
本发明涉及粪菌胶囊制备技术领域，具体为一种高活性粪菌胶囊的制备方法。
背景技术
粪菌移植(FMT)就是将健康人粪便中的功能菌群移植到患者胃肠道内，重建具有正常功能的肠道菌群，实现肠道及肠道外疾病的治疗。在国际合作组对此词进行统一之前，少数情况下被译为“粪便移植”、“肠菌治疗”或“肠微生态移植”。
最早将粪便用于治疗人类疾病是中国东晋时期(公元300～400年)的葛洪，在其所著《肘后备急方》中，记载了当时用粪清治疗食物中毒和严重腹泻等，如“绞粪汁，饮数合至一二升，谓之黄龙汤，陈久者佳”。1958年，美国科罗拉多大学医学院Eiseman等首次报道FMT用于治疗人伪膜性肠炎。1983年，瑞典Schwan等首次报道通过灌肠FMT治疗艰难梭菌感染获得很好疗效。1989年，Bennet和Brinkman在《Lancet》杂志上首次报道FMT治疗溃疡性结肠炎，而那位病人就是研究者本人，也取得了很好的疗效。同年，Borody等报道将FMT应用于末端回肠型克罗恩病患者后，症状也得到缓解。
2013年，首项FMT治疗复发性难辨梭状芽孢杆菌性肠炎的临床对照研究证明FMT的疗效显著优于万古霉素。FMT在动物实验和临床试验中均显示出其他治疗方案无法比拟的优越性。《Science》和《TIME》将其评为2013年生物医学的十大突破之一。目前临床上主要通过鼻空肠管，胃镜，肠镜，口服等方式对患者进行粪菌移植，但是通过结肠镜及鼻伺等方式带来的风险及较低的舒适度，直接制约了粪菌移植的大规模实际应用。制备的粪菌样本在室温条件下存放时间短，需要立即进行移植，而将新鲜的粪菌通过甘油在-80℃条件下保存可以维持较好的活性，但解冻及取用等不甚方便。
因此，作为一种舒适、患者体验性好、安全及便利的粪菌移植方式，粪菌胶囊移植方式已经引起了大量临床医生及患者的强烈关注。目前已有报道用粪菌冻干粉制备粪菌胶囊来进行粪菌移植，但是它们没有从整体粪菌菌群活性和菌群组成来分析冻干粉中的菌群结构，这可能对患者实际临床改善情况产生重要的影响。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高活性粪菌胶囊的制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种高活性粪菌胶囊的制备方法，高活性粪菌在耐酸性肠溶性胶囊的保护下可以到达患者肠道发挥作用，包括如下步骤：
S1、粪菌液的制备；
S2、粪菌液活性及菌群结构评估；
S3、将步骤S2中所得粪菌液加入冻干保护剂冻存至给患者进行粪菌胶囊移植前，在对受体进行粪菌胶囊移植时，将粪菌液解冻，并离心得到菌体；
S4、将步骤S3中的菌体用适当体积的粪菌溶剂进行溶解，将粪菌菌体装入双层耐酸性肠溶性胶囊中。
优选的，步骤S1中，粪菌液的制备方法为：
S10、仪器准备：将装有供体捐赠粪便的分离罐用带有螺旋叶片搅拌杆的盖子密闭，将搅拌杆连接到特制的粪便分离机器中；将5个无菌密闭的过滤罐连接依次排放安装到分离机中，起始罐用导管与分离罐相连，末尾罐与收集罐相连，形成一个由搅拌、过滤、收集的完整的密闭系统。分离设备，安全柜使用前紫外灭菌30min；
S11、启动机器：用加注泵将500ml的0.9％的生理盐水加注到分离罐中，开启搅拌机1000rpm，5min，再注入生理盐500ml，搅拌1000rpm，5min；此过程将粪便与生理盐水完全混合，使肠菌游离在生理盐水中，再开启过滤系统，搅拌的菌液经过5个过滤罐的过滤，将体积较大的食物残渣滤过后，收集到收集罐中；
S12、菌体洗涤：将收集罐中的肠菌分装到2个高压灭菌的ThermoFisher的离心罐中，配平，将分离到的菌液以4000-6000rpm离心3min，肠菌由于重力作用将沉淀在管底，去上清，每离心罐加100ml生理盐水震荡重悬，再以4000-6000rpm离心3min，去上清；
S13、去皮称重：每管加生理盐水20ml加20ml灭菌的50％甘油，最后分成4管或2管，每管40ml，菌量为10-20g；然后在这2-4管中各取1ml至3个无菌的冻存管中，登记捐献者姓名，并置于-80℃冰箱冻存，待流式细胞计数及高通量16S测序所用。
优选的，步骤S10中，100-200g粪便样本加入750-1000ml无菌生理盐水进行溶解。
优选的，步骤S2中，粪菌液活性及菌群结构评估中，利用流式细胞计数来分析冻存过程中活菌的比例，利用16S rDNA测序分析来评估冻存过程中的菌群组成与结构，具体步骤如：
S21、冻存粪菌在37℃水浴锅中解冻；
S22、冻存粪菌的稀释、流式细胞染色及计数观察；
S23、冻存粪菌的DNA提取及16S rDNA测序分析。
优选的，步骤S3中，所述冻干保护剂冻为50％的甘油及0.9％NaCl。
优选的，步骤S4中，所述粪菌溶剂为98-100％的橄榄油。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、菌群活性较高，可放于低温长久保存；
2、便于菌群移植的实施，不需要侵入性的实施方式；
3、本发明使用我们使用经过严格筛查的供体粪菌，使用自动化的粪菌分离仪器以减少外来的污染或人为影响，选用安全的、适合粪菌保存及与胶囊成分兼容的溶剂，在了解粪菌活性及粪菌菌群组成的前提下，进行粪菌胶囊的制备，并尽快给患者进行移植，以达到很好的临床效果。
附图说明
图1粪菌经10％甘油冻存不同时间后的活菌比例的流式细胞计数，其中(A)、(B)、(C)及(D)分别为新鲜、冻存1周、冻存2周及冻存1月后的活菌比例。
图2粪菌经10％甘油冻存不同时间(新鲜、冻存1周、冻存2周及冻存1月)后的粪菌多样性指数(H、chao1和Simpson)比较。
图3粪菌经10％甘油冻存不同时间(新鲜、冻存1周、冻存2周及冻存1月)后的粪菌菌群PCA分析。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
一种高活性粪菌胶囊的制备方法，高活性粪菌在耐酸性肠溶性胶囊的保护下可以到达患者肠道发挥作用，包括如下步骤：
S1、粪菌液的制备；
S2、粪菌液活性及菌群结构评估；
S3、将步骤S2中所得粪菌液加入冻干保护剂冻存至给患者进行粪菌胶囊移植前，在对受体进行粪菌胶囊移植时，将粪菌液解冻，并离心得到菌体；
S4、将步骤S3中的菌体用适当体积的粪菌溶剂进行溶解，将粪菌菌体装入双层耐酸性肠溶性胶囊中。
步骤S1中，粪菌液的制备方法为：
S10、仪器准备：将装有供体捐赠粪便的分离罐用带有螺旋叶片搅拌杆的盖子密闭，将搅拌杆连接到特制的粪便分离机器中；将5个无菌密闭的过滤罐连接依次排放安装到分离机中，起始罐用导管与分离罐相连，末尾罐与收集罐相连，形成一个由搅拌、过滤、收集的完整的密闭系统。分离设备，安全柜使用前紫外灭菌30min；
S11、启动机器：用加注泵将500ml的0.9％的生理盐水加注到分离罐中，开启搅拌机1000rpm，5min，再注入生理盐500ml，搅拌1000rpm，5min；此过程将粪便与生理盐水完全混合，使肠菌游离在生理盐水中，再开启过滤系统，搅拌的菌液经过5个过滤罐的过滤，将体积较大的食物残渣滤过后，收集到收集罐中；
S12、菌体洗涤：将收集罐中的肠菌分装到2个高压灭菌的ThermoFisher的离心罐中，注生理盐水1000ml能收集到菌液体积为800ml，配平，将分离到的菌液以4000-6000rpm离心3min，肠菌由于重力作用将沉淀在管底，去上清，每离心罐加100ml生理盐水震荡重悬，再以4000-6000rpm离心3min，去上清；
S13、去皮称重，要40g以上：每管加生理盐水20ml加20ml灭菌的50％甘油，最后分成4管或2管，每管40ml，菌量为10-20g；然后在这2-4管中各取1ml至3个无菌的冻存管中，登记捐献者姓名，并置于-80℃冰箱冻存，待流式细胞计数及高通量16S测序所用。
步骤S10中，100-200g粪便样本加入750-1000ml无菌生理盐水进行溶解。
步骤S2中，粪菌液活性及菌群结构评估中，利用流式细胞计数来分析冻存过程中活菌的比例，利用16S rDNA测序分析来评估冻存过程中的菌群组成与结构，具体步骤如：
S21、冻存粪菌在37℃水浴锅中解冻；
S22、冻存粪菌的稀释、流式细胞染色及计数观察；
S23、冻存粪菌的DNA提取及16S rDNA测序分析。
步骤S3中，所述冻干保护剂冻为50％的甘油及0.9％NaCl。
步骤S4中，所述粪菌溶剂为98-100％的橄榄油。
实施例1
粪菌的分离
S10、仪器准备：将装有供体捐赠粪便的分离罐用带有螺旋叶片搅拌杆的盖子密闭，将搅拌杆连接到由南京法迈特公司特制的粪便分离机器中。将5个无菌密闭的过滤罐连接依次排放安装到分离机中，起始罐用导管与分离罐相连，末尾罐与收集罐相连，形成一个由搅拌、过滤、收集的完整的密闭系统。分离设备，安全柜使用前紫外灭菌30min；
S11、启动机器：用加注泵将500ml的0.9％的生理盐水加注到分离罐中，开启搅拌机1000rpm，5min，再注入生理盐500ml，搅拌1000rpm，5min；此过程将粪便与生理盐水完全混合，使肠菌游离在生理盐水中，再开启过滤系统，搅拌的菌液经过5个过滤罐的过滤，将体积较大的食物残渣滤过后，收集到收集罐中；
S12、菌体洗涤：将收集罐中的肠菌分装到2个高压灭菌的ThermoFisher的离心罐中(一般注生理盐水1000ml能收集到菌液体积为800ml)，配平，将分离到的菌液以4000-6000rpm离心3min，肠菌由于重力作用将沉淀在管底，去上清，每离心罐加100ml生理盐水震荡重悬，再以4000-6000rpm离心3min，去上清；
S13、去皮称重，每管加生理盐水20ml加20ml灭菌的50％甘油，最后分成4管或2管，每管40ml，菌量为10-20g。然后在这2-4管中各取1ml至3个无菌的冻存管中，登记捐献者姓名，并置于-80℃冰箱冻存，待流式细胞计数及高通量16S测序所用。
实施例2
冻存过程中粪菌活性评估
1)对实施例1中步骤S13得到的菌体，按照第0天，1周，2周，3周及1个月共5个时间点来分1mL菌液，并置于-80℃条件下保存(新鲜粪菌除外)；
2)取10μl的菌液与990μl的0.9％NaCl溶液混匀，得到粪菌稀释液；
3)取出不同时间点的冻存菌液，按照试剂盒Live/Dead BacLightTM BacterialViability and Counting Kit来制备样品；
3)向2ml的灭菌离心管中加入987μl的0.9％NaCl溶液，1.5μl的SYTO9和1.5μl的PI染料，最后加入10μl的步骤4)中的粪菌稀释液，混匀并于黑暗条件下孵化15min；
4)设置参数，流式细胞计数活菌的比例情况。
冻存过程中活菌比例
1)取出实施例1步骤S13中的菌液，对不同时间的冻存菌液进行相应的DNA提取；
2)对DNA进行PCR V3-V4序列扩增；
3)对测序数据进行分析。
实施例3
粪菌胶囊的制备考虑到胶囊的实际需求量，一方面我们利用新分离的粪菌来装胶囊，但如果需求量更大新鲜粪菌的分离及胶囊制备不能放在同一天时，则会经-80℃冻存在10％甘油中的粪菌液解冻再装胶囊；
(1)新鲜粪菌胶囊由于新鲜粪菌里活菌比例最高，为了保持移植的有效性，在实施例1中得到的新鲜菌体加入98-100％的优质橄榄油进行溶解，逐一吸取菌液到安徽黄山0号耐酸型肠溶性胶囊中，再将其置入00号DRcaps胶囊壳，去除发生软化变形的不合格胶囊；将胶囊装入合适的容器，并放置一包1g的干燥剂；和患者进行协商，以确保在当天尽快完成患者的粪菌胶囊移植。
(2)冻存粪菌的粪菌胶囊由于粪菌的分离及高活性粪菌胶囊的制备需要耗费大量时间，所以有时粪菌来不及分装胶囊，就只能暂时放在-80℃冰箱先进行保存，在确定患者移植当天提前进行粪菌胶囊的制备。制备过程如新鲜粪菌胶囊制备方法。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种高活性粪菌胶囊的制备方法，其特征在于：高活性粪菌在耐酸性肠溶性胶囊的保护下可以到达患者肠道发挥作用，包括如下步骤：
S1、粪菌液的制备；
S2、粪菌液活性及菌群结构评估；
S3、将步骤S2中所得粪菌液加入冻干保护剂冻存至给患者进行粪菌胶囊移植前，在对受体进行粪菌胶囊移植时，将粪菌液解冻，并离心得到菌体；
S4、将步骤S3中的菌体用适当体积的粪菌溶剂进行溶解，将粪菌菌体装入双层耐酸性肠溶性胶囊中。
2.根据权利要求1所述的一种高活性粪菌胶囊的制备方法，其特征在于，步骤S1中，粪菌液的制备方法为：
S10、仪器准备：将装有供体捐赠粪便的分离罐用带有螺旋叶片搅拌杆的盖子密闭，将搅拌杆连接到特制的粪便分离机器中；将5个无菌密闭的过滤罐连接依次排放安装到分离机中，起始罐用导管与分离罐相连，末尾罐与收集罐相连，形成一个由搅拌、过滤、收集的完整的密闭系统；分离设备，安全柜使用前紫外灭菌30min；
S11、启动机器：用加注泵将500ml的0.9％的生理盐水加注到分离罐中，开启搅拌机1000rpm，5min，再注入生理盐500ml，搅拌1000rpm，5min；此过程将粪便与生理盐水完全混合，使肠菌游离在生理盐水中，再开启过滤系统，搅拌的菌液经过5个过滤罐的过滤，将体积较大的食物残渣滤过后，收集到收集罐中；
S12、菌体洗涤：将收集罐中的肠菌分装到2个高压灭菌的ThermoFisher的离心罐中，配平，将分离到的菌液以4000-6000rpm离心3min，肠菌由于重力作用将沉淀在管底，去上清，每离心罐加100ml生理盐水震荡重悬，再以4000-6000rpm离心3min，去上清；
S13、去皮称重：每管加生理盐水20ml加20ml灭菌的50％甘油，最后分成4管或2管，每管40ml，菌量为10-20g；然后在这2-4管中各取1ml至3个无菌的冻存管中，登记捐献者姓名，并置于-80℃冰箱冻存，待流式细胞计数及高通量16S测序所用。
3.根据权利要求2所述的一种高活性粪菌胶囊的制备方法，其特征在于，步骤S10中，100-200g粪便样本加入750-1000ml无菌生理盐水进行溶解。
4.根据权利要求1所述的一种高活性粪菌胶囊的制备方法，其特征在于，步骤S2中，粪菌液活性及菌群结构评估中，利用流式细胞计数来分析冻存过程中活菌的比例，利用16SrDNA测序分析来评估冻存过程中的菌群组成与结构，具体步骤如：
S21、冻存粪菌在37℃水浴锅中解冻；
S22、冻存粪菌的稀释、流式细胞染色及计数观察；
S23、冻存粪菌的DNA提取及16S rDNA测序分析。
5.根据权利要求1所述的一种高活性粪菌胶囊的制备方法，其特征在于，步骤S3中，所述冻干保护剂冻为50％的甘油及0.9％NaCl。
6.根据权利要求1所述的一种高活性粪菌胶囊的制备方法，其特征在于，步骤S4中，所述粪菌溶剂为98-100％的橄榄油。
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