CN112458019A - 一种粪菌液及其冻干粉的制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种粪菌液及其冻干粉的制备方法和应用，属于粪菌移植技术领域。本发明公开的一种粪菌液及其冻干粉的制备方法，包括以下步骤：制备原始菌液；离心与洗涤；制备粪菌液；制备粪菌冻干粉。本发明制备的粪菌液及其冻干粉用于制备治疗溃疡性结肠炎的药物。本发明制备的粪菌冻干粉菌群集中，可放于低温长久保存；经过洗涤处理，降低或去除粪菌毒性；采用冻干粉技术，便于菌群移植的实施，操作方便。

Description

一种粪菌液及其冻干粉的制备方法和应用
技术领域
本发明涉及粪菌移植技术领域，更具体的说是涉及一种粪菌液及其冻干粉的制备方法和应用。
背景技术
粪菌移植(FMT)是指从健康者粪便中分离的菌群和天然抗菌物质，通过鼻、胃管或十二指肠管、胃镜或结肠镜、直肠导管灌肠或靶向胶囊口服等方式移植到患者消化道内，重建肠道菌群平衡，修复肠黏膜屏障，实现对特定肠道内及肠道外疾病的治疗。
粪菌移植的安全性是一项非常重要，但目前还未解决的问题。FMT的短期不良事件主要包括发热、腹泻、腹痛、腹胀等。粪便样品不得存在相关的致病菌、寄生虫、耐药菌等。同时，在制备过程中，有研究表明，粪菌通过多次的离心洗涤，可以减少粪菌毒性。
现今粪菌制品还不够成熟，其在医学领域内的推广和应用仍有诸多问题有待解决，特别是制作流程的方法也各不相同。粪菌液未能通过纯化技术手段去除食物来源的未消化残渣，真菌、病毒和细菌等不属于同类的微生物以及肠道的可溶和不可溶性代谢产物，使粪菌液的使用量体积过大。
迄今，国内外均有采用粪菌移植方法成功治愈或缓解难辨梭状芽孢杆菌感染(CDI)、炎症性肠病(IBD)等胃肠道相关性疾病的临床报道。2013年，美国FDA将FMT收录到复发性CDI的标准治疗指南中。然而，粪菌的适应症范围和效果始终没有确定，在除CDI外的治疗效果表现差异较大。FMT在治疗溃疡性结肠炎(UC)的安全性也得到肯定，改善UC的菌群变化的疗效上同样颇具前景：研究结果表明，以灌肠的形式多次给予FMT治疗UC患者后其安全性和有效性得到肯定；单次结肠镜下给予FMT治疗后，慢性活动性、难治性UC患者的肠道菌群组成的变化是显著的，菌群失调得到部分改善。
因此，提供一种粪菌液及其冻干粉的制备方法和应用是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种粪菌液及其冻干粉的制备方法和在制备治疗溃疡性结肠炎药物中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种粪菌液及其冻干粉的制备方法，具体步骤如下：
(1)制备原始菌液
取健康供者新鲜粪便样本50-200g，浸泡于200-1000mL的0.9％无菌NaCl溶液中5-10min，转移至搅拌器中，500-2000r/min，均质2-10min，将液体依次经过直径2.0mm、1.0mm、0.5mm和0.25mm的筛网过滤，获得原始菌液；
(2)离心与洗涤
将步骤(1)获得的原始菌液以3000-8000g，离心5-15min，弃上清液；加入1-8倍体积生理盐水，混合均匀，以3000-8000g，离心5-15min，弃上清，洗涤1-5次，获得沉淀；
(3)制备粪菌液
向步骤(2)洗涤后的沉淀加入冻存剂溶液，混合均匀，获得粪菌液；
(4)制备粪菌冻干粉
将步骤(3)获得的粪菌液置于-80℃冷冻后，转移到冻干机中，冻干18-36h，获得粪菌冻干粉。
进一步，所述筛网为一次性筛网或无菌不锈钢筛网。
进一步，所述的粪菌液或粪菌冻干粉在制备治疗溃疡性结肠炎药物中的应用。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种粪菌液及其冻干粉的制备方法和应用，具有如下有益效果：
(1)菌群集中，可放于低温长久保存；
(2)采用离心方式，对粪菌进行离心洗涤，可起到降低粪菌毒性的作用，毒性测定符合标准；
(3)采用冻干粉技术，便于菌群移植的实施，操作方便。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种粪菌液及其冻干粉的制备方法，具体步骤如下：
(1)制备原始菌液：将健康供体新鲜粪便样本100g，浸泡于500mL的0.9％无菌NaCl溶液中5min，转移至搅拌器500r/min，均质10min，将液体逐级经过直径2.0mm、1.0mm、0.5mm和0.25mm的不锈钢滤网过滤，以去除食物残渣和小颗粒物质，获得原始菌液。
(2)离心与洗涤：将原始菌液以8000g，离心15min，弃去上清；沉淀加入2倍生理盐水，混匀均匀后，以8000g，离心15min，弃去上清；重复洗涤5次；
(3)制备粪菌液：将洗涤后沉淀，加入10％海藻糖溶液，混合均匀，获得粪菌液；
(4)制备粪菌冻干粉：将粪菌液置于-80℃冷冻后，转移到冻干机中，冻干24h，得粪菌冻干粉。
试验例
1)本发明采用流式细胞仪进行活菌率的测定，进行六组平行实验。
(1)梯度稀释：将样品制备10倍系列稀释样品匀液，选取10-4进行实验。
(2)染色、孵育与检测：将样品稀释液与染液，充分混匀后，置于暗盒常温孵育15min，半小时内进行流式细胞仪检测。
六组平行实验的活菌率结果见表1。
表1活菌率(％)
Figure BDA0002813814690000041
冻干前样品活菌率均值为92.5±1.31；冻干后样品活菌率均值为80.5±1.55。
2)将粪菌冻干粉0.3g装填入胶囊，进行临床试验，对溃疡性结肠炎(UC)进行治疗研究。
(1)所有患者均需签署知情同意书。
(2)患者筛选与入组：根据《炎症性肠病诊断与治疗的共识意见(2018年北京)》，经活检证实为活动性UC，并按改良梅奥Mayo评分标准疾病严重程度型为中、重度的UC患者，见表2；包括因标准药物治疗失败、激素依赖和免疫抑制剂治疗失败的患者。入组一年内未接受过FMT治疗。患者分为2组，分别为FMT治疗组和安慰剂组(生理盐水)，每组各40例。
表2评估溃疡性结肠炎活动性的改良Mayo评分系统
Figure BDA0002813814690000042
注：评分≤2分且无单个分项评分＞1分为临床缓解；3～5分为轻度活动，6～10分为中度活动，11～12分为重度活动。
(3)联合治疗方案：UC病的标准治疗方案照常执行(每次10粒胶囊，1天3次)，给药周期由研究医生根据相应的标准、指导原则或共识制定。FMT治疗组、安慰剂组连续给药服用三个周期，每个周期12天，共36天。
(4)疗效评价：治疗前和治疗后，疗效评定包括以下几个：①完全缓解：临床症状消失，结肠镜复查见黏膜大致正常或无活动性炎症。②有效：临床症状基本消失，结肠镜复查见黏膜轻度炎症。③无效：临床症状、结肠镜复查均无改善。有效定义为评分相对于基线值的降幅≥30％以及≥3分。
治疗前后Mayo评分见表3。
表3治疗前后Mayo评分
Figure BDA0002813814690000051
FMT治疗组的评分降幅≥30％以及≥3分。安慰剂组的评分降幅＜30％以及＜3分。
实施例2
一种粪菌液及其冻干粉的制备方法，具体步骤如下：
(1)制备原始菌液：将健康供体新鲜粪便样本50g，浸泡于200mL的0.9％无菌NaCl溶液中8min，转移至搅拌器1000r/min，均质2min，将液体逐级经过直径2.0mm、1.0mm、0.5mm和0.25mm的不锈钢滤网过滤，以去除食物残渣和小颗粒物质，获得原始菌液。
(2)离心与洗涤：将原始菌液以3000g，离心5min，弃去上清；沉淀加入4倍生理盐水，混匀均匀后，以3000g，离心5min，弃去上清；重复洗涤1次；
(3)制备粪菌液：将洗涤后沉淀，加入10％海藻糖溶液，混合均匀，获得粪菌液；
(4)制备粪菌冻干粉：将粪菌液置于-80℃冷冻后，转移到冻干机中，冻干18h，得粪菌冻干粉。
试验例
本发明采用流式细胞仪进行活菌率的测定，进行六组平行实验。
(1)梯度稀释：将样品制备10倍系列稀释样品匀液，选取10-4进行实验。
(2)染色、孵育与检测：将样品稀释液与染液，充分混匀后，置于暗盒常温孵育15min，半小时内进行流式细胞仪检测。
六组平行实验的活菌率结果见表4。
表4活菌率(％)
Figure BDA0002813814690000061
冻干前样品活菌率均值为92.4±0.99；冻干后样品活菌率均值为80.3±1.84。
实施例3
一种粪菌液及其冻干粉的制备方法，具体步骤如下：
(1)制备原始菌液：将健康供体新鲜粪便样本200g，浸泡于1000mL的0.9％无菌NaCl溶液中10min，转移至搅拌器2000r/min，均质5min，将液体逐级经过直径2.0mm、1.0mm、0.5mm和0.25mm的不锈钢滤网过滤，以去除食物残渣和小颗粒物质，获得原始菌液。
(2)离心与洗涤：将原始菌液以6000g，离心10min，弃去上清；沉淀加入8倍生理盐水，混匀均匀后，以6000g，离心10min，弃去上清；重复洗涤3次；
(3)制备粪菌液：将洗涤后沉淀，加入10％海藻糖溶液，混合均匀，获得粪菌液；
(4)制备粪菌冻干粉：将粪菌液置于-80℃冷冻后，转移到冻干机中，冻干36h，得粪菌冻干粉。
试验例
本发明采用流式细胞仪进行活菌率的测定，进行六组平行实验。
(1)梯度稀释：将样品制备10倍系列稀释样品匀液，选取10-4进行实验。
(2)染色、孵育与检测：将样品稀释液与染液，充分混匀后，置于暗盒常温孵育15min，半小时内进行流式细胞仪检测。
六组平行实验的活菌率结果见表5。
表5活菌率(％)
Figure BDA0002813814690000071
冻干前样品活菌率均值为92.1±1.06；冻干后样品活菌率均值为79.6±2.32。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (3)

1.一种粪菌液及其冻干粉的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)制备原始菌液
取健康供者新鲜粪便样本50-200g，浸泡于200-1000mL的0.9％无菌NaCl溶液中5-10min，转移至搅拌器中，500-2000r/min，均质2-10min，将液体依次经过直径2.0mm、1.0mm、0.5mm和0.25mm的筛网过滤，获得原始菌液；
(2)离心与洗涤
将步骤(1)获得的原始菌液以3000-8000g，离心5-15min，弃上清液；加入1-8倍体积生理盐水，混合均匀，以3000-8000g，离心5-15min，弃上清，洗涤1-5次，获得沉淀；
(3)制备粪菌液
向步骤(2)洗涤后的沉淀加入冻存剂溶液，混合均匀，获得粪菌液；
(4)制备粪菌冻干粉
将步骤(3)获得的粪菌液置于-80℃冷冻后，转移到冻干机中，冻干18-36h，获得粪菌冻干粉。
2.根据权利要求1所述的一种粪菌液及其冻干粉的制备方法，其特征在于，所述筛网为一次性筛网或无菌不锈钢筛网。
3.权利要求1所述的粪菌液或粪菌冻干粉在制备治疗溃疡性结肠炎药物中的应用。
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