CN110178787A - 一种运用粪菌移植法建立自闭症大鼠模型的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种运用粪菌移植法建立自闭症大鼠模型的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：制备粪菌液：将来源于临床确诊为儿童自闭症患者的粪便制成粪菌液；模型建立：将粪菌液采用灌肠法注入孕鼠，孕鼠随后分娩得到仔鼠即为自闭症模型鼠。本发明公开的方法可重复性强、成功率高、死亡率低、模型症状更典型、更持久、成本低，具有实际价值和意义。

Description

一种运用粪菌移植法建立自闭症大鼠模型的方法

技术领域

本发明涉及建立动物自闭症模型技术领域，更具体的说是涉及一种运用粪菌移植法建立自闭症大鼠模型的方法。

背景技术

目前，自闭症谱系障碍(ASD)是一种较为严重的神经系统发育障碍性疾病，多发生于婴幼儿时期，其典型特征为交流障碍和想象障碍、社会功能障碍、刻板的重复兴趣和行为、并伴有运动协调障碍。据美国疾病控制中心最新数据显示,至2018年,ASD的发生率已从2014年的1/68上升至1/59。有文献报道我国约有400～1000万自闭症患者,其中儿童患病人数约为100～300万。现阶段研究表面自闭症谱系障碍可能与遗传、感染与免疫、神经发育、环境和心理因素有关，但是其机制不明，发病率又高、无特效药物，因此近年来受到越来越广泛的关注。

动物模型是研究神经精神类疾病的重要手段之一,其发展为探讨疾病的生物学机制提供了广阔的前景。因此建立一种成功的自闭症模型可以帮助我们对自闭症的病理机制进行进一步的准确阐释,同时还可以为自闭症的治疗提供一定的理论依据。但是由于ASD病因复杂，发病机制尚不明确，故也缺乏严格意义的动物模型以供实验研究。从国内外研究现状分析来看，近年来ASD动物模型的建立方法有很多种并且取得了新的进展，但仍存在一些缺陷，如模型制备耗时长、操作过于复杂、可重复性差、科研成本高及科研设备要求严格,不能广泛推广等。大致可以分为以下几类：⑴神经毒理学模型，分为丙戊酸(VPA)模型、丙酸(PPA)模型、抗体模型、七氟醚模型、病毒模型、毛果芸香碱模型；⑵遗传学模型，分为15q11-13染色体异常模型、NRCAM缺失模型、engrailed-2敲除小鼠模型、GABRB3基因缺失模型等；⑶其它还有反复冷冻刺激模型、精液素-1α缺失模型等。

因此，提供一种建立自闭症大鼠模型的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种运用粪菌移植法建立自闭症大鼠模型的方法，该方法可重复性强，成功率高，死亡率低、模型症状更典型、更持久、成本低，具有实际价值和意义。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种运用粪菌移植法建立自闭症大鼠模型的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

(1)制备粪菌液：将来源于临床确诊为儿童自闭症患者的粪便制成粪菌液；

(2)模型建立：将粪菌液采用灌肠法注入孕鼠，孕鼠随后分娩得到仔鼠即为自闭症模型鼠。

上述优选技术方案的有益效果是：本发明公开的建立自闭症大鼠模型的方法操作简单，设备要求低，容易实施；并且，采用本发明公开的方法，仔鼠死亡率低，模型更典型更持久；同时采用本发明公开的方法可为后期自闭症致病机制探讨提供参考。

优选的，所述步骤(1)具体包括如下步骤：

A、将来源于临床确诊为儿童自闭症患者的粪便加入到无菌生理盐水中，搅拌均匀后过滤，得到滤液；

B、将上述得到的滤液进行离心处理，弃上清；

C、将剩余物加入至生理盐水中悬浮得到粪菌液。

上述优选技术方案的有益效果：本发明公开的方法配制的粪菌液浓度适中，移植效果较好；使得到的粪菌液尽可能多的保留样本中的不溶成分。

优选的，所述步骤A在无菌工作台中称量来源于临床确诊为儿童自闭症患者的粪便，然后按照无菌生理盐水：粪便＝4～6mL/g加入至无菌生理盐水中。

优选的，来源于临床确诊为儿童自闭症患者的粪便按照无菌生理盐水：粪便＝5mL/g加入至无菌生理盐水中。

上述优选技术方案的有益效果：本发明在无菌台上操作可以避免粪菌制备过程中混入外来菌；并且，设定无菌生理盐水：粪便＝4～6mL/g可以确保样品中的成分充分溶解，保证经过过滤后滤出液适量，以满足后续操作。

优选的，所述步骤A中过滤时将搅拌后的混合物依次通过孔径为2.0㎜、1.0㎜、0.5㎜和0.25㎜的四种无菌不锈钢滤网。

上述优选技术方案的有益效果是：本发明采用孔径由大到小的筛网逐级过滤可以确保滤过速度和滤过率。

优选的，所述步骤B中离心时将滤液以3000r/min转速离心，然后弃上清液，向剩余物中继续加入生理盐水至原体积，重复离心三次。

上述优选技术方案的有益效果是：本发明通过离心分离可使样本中的菌群彻底从附着物上游离出来；并且可除去除菌群以外的其他物质。

优选的，所述步骤C中将得到的沉淀物称量后加入至生理盐水中悬浮，得到浓度为3～5g/mL的粪菌液。

优选的，所述步骤C中将得到的沉淀物称量后加入至生理盐水中悬浮，得到浓度为5g/mL的粪菌液

上述优选技术方案的有益效果是：本发明得到的3～5g/mL的粪菌液中菌群含量适中，易于移植后的菌群定植；并且，该浓度的粪菌液可使移植量处于宿主的耐受范围。

优选的，所述步骤(1)中粪便来源于确诊为重度儿童自闭症患者。

上述优选技术方案的有益效果是：选择来源于确诊为重度儿童自闭症患者的粪便，可以保证来源粪便具有足量的自闭症特征菌群。

优选的，所述步骤(2)中在受孕0.5d至仔鼠出生后21天断奶期间，将粪菌液采用灌肠法注入孕鼠。

上述优选技术方案的有益效果是：由于胎儿和幼儿肠道菌群主要来自于母亲，本发明在孕期和哺乳期进行菌群移植可以保证仔鼠的肠道内有丰富的自闭症特征菌群定植。

优选的，所述步骤(2)中灌肠法具体是用无菌软导管从肛门缓慢插进8～10cm，然后通过无菌软导管注入粪菌液。

上述优选技术方案的有益效果是：由于大鼠从肛门处到结肠位置的距离约为8-10cm，本发明将无菌软导管从肛门缓慢插进8～10cm可以将粪菌液注入结肠，而菌移植到结肠位置更容易定植。

优选的，所述步骤⑵中粪菌液的灌肠量为0.1～0.5mL/100g，每日两次，隔天进行。

上述优选技术方案的有益效果是：本发明将灌肠量设定为0.1～0.5mL/100g，可以保证移植后的自闭症特征菌群在肠道内有一定存量，易于其繁殖为优势菌群。

优选的，所述步骤(2)中注入粪菌液时边注边向外拔出导管。

上述优选技术方案的有益效果是：本发明在灌肠过程中边注边向外拔出导管可使移植粪菌液在结肠位置均匀喷洒，易于其定植，并且可减轻移植时结肠段的肠壁承受压力，保护肠壁。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种运用粪菌移植法建立自闭症大鼠模型的方法，具有如下有益效果：

(1)本发明公开的方法能够成功的建立自闭症大鼠模型，而且可重复性强，成功率高，模型症状更典型、更持久，具有实用性；

(2)同时，本发明公开的方法建立自闭症大鼠模型死亡率低，而且成本低、操作简单，具有普遍试用性。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例公开了一种运用粪菌移植法建立自闭症大鼠模型的方法，具体包括如下步骤：

(1)制备粪菌液：

A、在无菌工作台中称量来源于临床确诊为儿童自闭症患者的粪便，然后按照无菌生理盐水：粪便＝5mL/g加入至无菌生理盐水中；搅拌均匀后过滤，得到滤液；过滤时将搅拌后的混合物依次通过孔径为2.0㎜、1.0㎜、0.5㎜和0.25㎜的四种无菌不锈钢滤网；

B、将上述得到的滤液进行离心处理，弃上清液；离心时将滤液以3000r/min转速离心15min，然后弃上清液，向沉淀物中继续加入生理盐水至原体积，重复离心三次；

C、将得到的沉淀物称量后加入至生理盐水中悬浮，得到浓度为5g/mL的粪菌液。

(2)模型建立：在受孕0.5d至仔鼠出生后21天断奶期间，将粪菌液采用灌肠法注入孕鼠，孕鼠随后分娩得到仔鼠即为自闭症模型鼠，灌肠法具体是用无菌软导管从肛门缓慢插进8～10cm，然后通过无菌软导管注入粪菌液，注入粪菌液时边注边向外拔出导管；粪菌液的灌肠量为0.1～0.5mL/100g，每日两次，隔天进行。

实施例1

本发明实施例1公开了一种运用粪菌移植法建立自闭症大鼠模型的方法，具体包括如下步骤：

(1)粪菌液的制备：

称重后将自闭症患者供体的新鲜粪便置于无菌搅拌器内，按照无菌生理盐水：粪便＝5mL/g加入无菌生理盐水搅拌；将粪汁依次通过孔径2.0mm、1.0mm、0.5mm和0.25mm四种无菌不锈钢滤网得滤过粪汁；

B、把滤过粪汁以3000r/min离心15min，弃上清，加入生理盐水至原体积，混匀再离心，重复此步骤3次，得剩余物；

C、将剩余物称重后再悬浮生理盐水中得到提取物5g/mL粪菌液。

处理总时长≤60min，新鲜粪菌液直接移植或制备成含10％无菌甘油的混合液体，置于﹣80℃冰箱冻存；使用当天将冻存粪菌液置37℃恒温水浴中解冻，并在2h内使用，无反复冻融。

(2)模型建立：

孕鼠受孕0.5d开始至仔鼠出生后21天断奶期间对孕鼠隔天进行粪菌移植(0.2mL/100g)，一天两次。碘伏消毒大鼠的肛门四周和腹部后，捏住大鼠尾巴后三分之一处将鼠倒立，用表面涂抹无菌甘油润滑的2mm无菌软导管从肛门缓慢插进8-10cm，慢慢注入粪菌液后轻轻拔出导管，并使用无菌纱布压肛门3s-5s防止粪菌液倒流，倒立1min后放回笼，灌肠2h后正常饮食。

一、验证无菌生理盐水与粪便比值的影响

1、分组

(1)实验组：

实验组1：实施例1

实验组2：将实施例1中无菌生理盐水：粪便＝5mL/g替换为4mL/g。

实验组3：将实施例1中无菌生理盐水：粪便＝5mL/g替换为6mL/g。

(2)对照组：

对照组1：将实施例1中无菌生理盐水：粪便＝5mL/g替换为3mL/g。

对照组2：将实施例1中无菌生理盐水：粪便＝5mL/g替换为7mL/g。

2、试验过程

取样本(来源于临床确诊为儿童自闭症患者的粪便)处理量50g，然后分别按照对上述实验组1～3和对照组1～2公开的方法将粪便与生理盐水混合，然后按照步骤A的方法进行过滤，得到滤出液，分别测量加入液和滤出液体积，计算滤出液与加入液的比值，得到的结果如下表1所示。

表1

	样本量/g	生理盐水加入液/mL	滤出液/mL	滤出液/加入液
					实验组1	50	250	200	4/5
实验组2	50	200	120	3/5
					实验组3	50	300	250	5/6
对照组1	50	150	100	2/3
					对照组2	50	350	300	6/7

通过上述表1的结果可以明显得知：相比于对比例1，本发明滤出液占加入液比值高，说明过滤时损失明显低于对比例1；且相比于对比例2，本发明实施例1～3得到的滤出液不高于250mL，而当滤出液量大于250mL后处理速度明显降低，所以相比于对比例2本发明实施例1～3处理速度快。

二、验证粪菌液浓度的影响

1、分组

实验组：

实验组1：实施例1

实验组2：将实施例1步骤C粪菌液浓度为5g/mL替换为3g/mL。

实验组3：将实施例1步骤C粪菌液浓度为5g/mL替换为4g/mL。

对照组：将实施例1步骤C粪菌液浓度为5g/mL替换为6g/mL。

二、对上述实施例1、4～5和对比例3公开的方法进行评价

统计上述实施例1、4～5和对比例3制备粪菌液花费的时间，结果如下表2所示。

表2

通过上述表2中的数据可以得知：本发明实施例公开的方法能够成功制备得到粪菌液，而对照组制备困难，无法达到粪菌液浓度，由此证明本发明公开的粪菌液的浓度为3～5g/mL合理。

三、验证无菌软导管从肛门缓慢插进距离的影响

1、分组

实验组：实施例1

对照组：将实施例1中无菌软导管从肛门缓慢插进8-10cm替换为12cm。

2、结果

按照上述实验组和对照组方法进行实验，发现移植软管从肛门处进入12cm之后，软管进入阻力增大，在此深度移植大鼠出现了腹泻和便血的症状。

并且，解剖图谱显示大鼠直肠长度约为8cm，结肠长度约为10cm。由此证明本发明选择8-10cm的移植深度既可保护肠壁防止刮伤大鼠肠道，又可保证移植物顺利通过直肠。

四、粪菌液移植量的影响

1、分组

实验组1：实施例1公开的方法

实验组2：将实施例1中公开的0.2mL/100g替换为0.4mL/100g(300g大鼠移植量为1.2mL)

实验组3：将实施例1中公开的0.2mL/100g替换为0.5mL/100g(300g大鼠移植量为1.5mL)

对照组1：将实施例1中公开的0.2mL/100g替换为0.6mL/100g(300g大鼠移植量为1.5mL)。

对照组2：将实施例1中公开的0.2mL/100g替换为0.67mL/100g(300g大鼠移植量为2.0mL)。

2、结果

分别按照上述分组进行实验，结果发现实验组1～3移植后大鼠状况良好，未出现异常；对照组1移植后出现部分漏液现象，对照组2移植后全部出现了漏液现象。由此证明，粪菌液移植量为0.1～0.5mL/100g合理。

五、实验效果验证：

1、分组

48只Wistar大鼠(雌雄2:1)随机编号分开适应性喂养7天。利用旷场实验对每只大鼠进行评分，把评分相近的大鼠，在晚20:00每笼2雌1雄合笼喂养。合笼喂养时每晚保证动物房关灯且安静。次日7:00采用阴栓法和阴道图片法检测受孕情况，检查到阴栓或阴道内有精子记为受孕0.5d。把孕鼠随机分为“FMT组”、“VPA组”和“空白组”。

FMT组：采用实施例1公开的方法得到分娩仔鼠

VPA组：孕鼠受孕12.5d，按600mg/kg腹腔注射VPA(VPA用0.9％生理盐水配成浓度250mg/mL的溶液)，随后分娩仔鼠沿用母鼠组别。

空白组：按FMT组移植方法移植等量生理盐水，随后分娩仔鼠沿用母鼠组别。

2、实验验证

(1)发育情况观察

仔鼠断奶前，每日查测并记录仔鼠双眼均睁眼、双耳均张耳和上下均出牙的达标情况，记录每窝雄仔鼠全部达标时间。

(2)社交实验

社交箱为60cm×45cm×25cm的长方形透明测试箱，长边被等分为三份，沿等分点做垂线用隔断板将社交箱分为左中右三个房间。房间隔断中间有一通道，左侧房间被设为社交房间，房间左下角放置一直径为12cm的圆形社交笼，在社交笼周围4cm圆形区域设为社交区域，在右侧房间右上角放置一空笼。每次测试测试者从社交箱长边放入测试鼠，把测试鼠背朝测试者放入房间，每次测试完用酒精清理社交箱。测试鼠在社交房间所待的时间为潜伏社交时间，测试鼠头部在社交区域时间为社交时间。

(3)刻板行为观察实验

将测试鼠置于50cm×50cm×45cm测试箱适应5min后，测试15min，两位测试者同时记录测试鼠梳理身上任何一处毛发的次数和总时间。第三记录者统计结果，若两记录结果理毛次数差值≤5且理毛时间差值≤15s，则采用记录测试结果，反之第三测试者重新测试后取均值。测试区保持环境安静，避免人员走动，更换动物时酒精擦拭测试箱内壁和底面。

(4)旷场实验和Morris水迷宫实验均按常规操作方法。

3、验证结果

(1)各组仔鼠各发育指标每窝雄仔鼠全部达标时间情况

各发育指标每窝雄仔鼠全部达标时间比较(表1)，与空白组比较，两模型组在，睁眼、张耳、出牙、听觉惊跳反射和平面翻正均高于空白组(P＜0.05)。各组全部仔鼠的死亡率为：FMT组2.61％，VPA组29.79％和空白组6.42％。

表1每窝雄仔鼠全部达标时间比较

注：与空白组比较，*P＜0.05

(2)各组雄仔鼠各时间点社交实验评分情况

各组雄性仔鼠在30日龄和60日龄时间点潜伏社交时间和社交时间比较(表2)，与空白组比较，两时间点潜伏社交时间和社交时间两模型组均明显低于空白组(P＜0.05)。与VPA组比较，FMT模型组雄仔鼠在60日龄潜伏社交时间和社交时间均明显降低(P＜0.05)；30日龄时间点社交时间和社交时间无统计学差异。说明与FMT模型组比VPA模型组的社交行为障碍更持久。

表2各时间点社交情况对比

注：与空白组比较，*P＜0.05；与VPA组比较，△P＜0.05

(3)各组45日龄雄仔鼠刻板实验和旷场实验评分情况

各组雄性仔鼠在45日龄时间点刻板行为评价和旷场评分比较(表3)，与空白组比较，理毛次数和理毛总时间两模型组均高于空白组(P＜0.05)；水平得分、垂直得分两模型组雄鼠旷场评分均低于空白组(P＜0.05)。与VPA组比较，FMT模型组水平得分显著降低(P＜0.05)，垂直得分无统计学差异。

表3各组45日龄雄仔鼠刻板实验和旷场实验评分比较

注：与空白组比较，*P＜0.05；与VPA组比较，△P＜0.05

(4)各组50日龄雄仔鼠水迷宫实验评分情况

各组雄仔鼠在50日龄时间点水迷宫实验评分比较(表4)，与空白组比较，穿越目标象限和穿越原平台区次数、在原平台区所待时间和移动距离，两模型组均显著低于空白组(P＜0.05)；FMT组与VPA组比较，无统计学差异。

表4

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.一种运用粪菌移植法建立自闭症大鼠模型的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

(1)制备粪菌液：将来源于临床确诊为儿童自闭症患者的粪便制成粪菌液；

(2)模型建立：将粪菌液采用灌肠法注入孕鼠，孕鼠随后分娩得到仔鼠即为自闭症模型鼠。

2.根据权利要求1所述的一种运用粪菌移植法建立自闭症大鼠模型的方法，其特征在于，所述步骤(1)具体包括如下步骤：

A、将来源于临床确诊为儿童自闭症患者的粪便加入到无菌生理盐水中，搅拌均匀后过滤，得到滤液；

B、将上述得到的滤液进行离心处理，弃上清液；

C、将剩余物加入至生理盐水中悬浮得到粪菌液。

3.根据权利要求2所述的一种运用粪菌移植法建立自闭症大鼠模型的方法，其特征在于，所述步骤A在无菌工作台中称量来源于临床确诊为儿童自闭症患者的粪便，然后按照无菌生理盐水：粪便＝4～6mL/g加入至无菌生理盐水中。

4.根据权利要求3所述的一种运用粪菌移植法建立自闭症大鼠模型的方法，其特征在于，所述步骤A中过滤时将搅拌后的混合物依次通过孔径为2.0㎜、1.0㎜、0.5㎜和0.25㎜的四种无菌不锈钢滤网。

5.根据权利要求2所述的一种运用粪菌移植法建立自闭症大鼠模型的方法，其特征在于，所述步骤B中离心时将滤液以3000r/min转速离心，然后弃上清液，剩余物中继续加入生理盐水至原体积，重复离心三次。

6.根据权利要求2所述的一种运用粪菌移植法建立自闭症大鼠模型的方法，其特征在于，所述步骤C中将得到的沉淀物称量后加入至生理盐水中悬浮，得到浓度为3～5g/mL的粪菌液。

7.根据权利要求1所述的一种运用粪菌移植法建立自闭症大鼠模型的方法，其特征在于，所述步骤(2)中在受孕0.5d至仔鼠出生后21d断奶期间，将粪菌液采用灌肠法注入孕鼠。

8.根据权利要求7所述的一种运用粪菌移植法建立自闭症大鼠模型的方法，其特征在于，所述步骤⑵中灌肠法具体是用无菌软导管从肛门缓慢插进8～10cm，然后通过无菌软导管注入粪菌液。

9.根据权利要求8所述的一种运用粪菌移植法建立自闭症大鼠模型的方法，其特征在于，所述步骤⑵中粪菌液的灌肠量为0.1～0.5mL/100g，每日两次，隔天进行。

10.根据权利要求9所述的一种运用粪菌移植法建立自闭症大鼠模型的方法，其特征在于，所述步骤(2)中注入粪菌液时边注边向外拔出导管。