CN107106728A - 移植用脏器及脏器结构体 - Google Patents
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Abstract
本发明提供具有肾脏、输尿管和膀胱的移植用脏器、及依次连接有肾脏、第1输尿管、第1膀胱、第2输尿管和第2膀胱的脏器结构体，所述移植用脏器及脏器结构体不仅可产生尿，而且可将产生的尿排泄，因而有用。
Description
技术领域
本发明涉及移植用脏器及脏器结构体。本申请基于于2014年12月19日在日本提出申请的特愿2014-257957号主张优先权，将其内容并入本文。
背景技术
由于老龄化、适应疾病的扩大等，人工透析患者快速增加。虽然通过透析医疗可挽救这些患者的生命，但通过人工透析无法代偿全部的肾功能，因此，存在导致患者的心血管疾病增加，致死率上升的倾向。另外，透析患者的时间的负担、精神的负担非常大，难以重新回到社会的情况也较多。
另外，世界上需要进行肾脏移植的终末期肾病的患者约有2百万人，由于供体脏器不足，该数字存在进一步增加的倾向。因此，终末期肾病是医疗上的重大的问题。
在这样的背景下，随着近年来的再生医学的发展，能够从干细胞形成具有尿产生能力、促红细胞生成素产生能力的肾脏(例如参见非专利文献1、2)。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1:Yokoo T.,等,Human mesenchymal stem cells in rodent whole-embryo culture are reprogrammed to contribute to kidney tissues,PNAS,102(9),3296-3300,2005.
非专利文献2:Yokoo T.,等,Generation of a transplantableerythropoietin-producer derived from human mesenchymal stem cells,Transplantation,85(11),1654-1658,2008.
发明内容
发明所要解决的课题
然而，发明者们发现，即使通过再生肾脏能产生尿，也无法将产生的尿排泄而导致肾积水，无法长期持续肾功能。
因此，本发明的目的在于提供一种不仅能产生尿、而且能将产生的尿排泄的移植用脏器。本发明的目的还在于提供不仅能产生尿、而且能将产生的尿排泄的脏器结构体。
用于解决课题的手段
本发明如下所述。
(1)一种移植用脏器，其具有肾脏、输尿管和膀胱。
(2)根据(1)所述的移植用脏器，其来自与移植对象为不同种类的动物。
(3)根据(2)所述的移植用脏器，其中，前述动物为基因改造非人类动物。
(4)根据(2)或(3)所述的移植用脏器，其中，前述动物为猪。
(5)根据(1)～(4)中任一项所述的移植用脏器，其实质上由人细胞形成。
(6)根据(1)～(5)中任一项所述的移植用脏器，其用于向人移植。
(7)根据(1)～(5)中任一项所述的移植用脏器，其用于向猫移植。
(8)一种脏器结构体，其中，依次连接有肾脏、第1输尿管、第1膀胱、第2输尿管和第2膀胱。
(9)根据(8)所述的脏器结构体，其中，前述肾脏、前述第1输尿管及前述第1膀胱所来自的动物与前述第2输尿管及前述第2膀胱所来自的动物为不同种类。
(10)根据(8)或(9)所述的脏器结构体，其中，前述肾脏、前述第1输尿管及前述第1膀胱所来自的动物为基因改造非人类动物。
(11)根据(8)～(10)中任一项所述的脏器结构体，其中，前述肾脏、前述第1输尿管及前述第1膀胱所来自的动物为猪。
(12)根据(8)～(11)中任一项所述的脏器结构体，其中，前述肾脏、前述第1输尿管及前述第1膀胱实质上由人细胞形成。
(13)根据(8)～(12)中任一项所述的脏器结构体，其中，前述第2输尿管及第2膀胱所来自的动物为人。
(14)根据(8)～(12)中任一项所述的脏器结构体，其中，前述第2输尿管及第2膀胱所来自的动物为猫。
发明的效果
通过本发明，可提供不仅能产生尿、而且能将产生的尿排泄的移植用脏器。另外，可提供不仅能产生尿、而且能将产生的尿排泄的脏器结构体。
附图说明
[图1]为说明脏器结构体的一个实施方式的图。
[图2A]为胎生第30天的克隆猪的胎仔的照片。
[图2B]为摘出的猪后肾的照片。
[图2C]为表示后肾向大网膜移植的情形的照片。
[图3]A～L为已移植至猪的后肾的照片。
[图4A]为说明实验例2中的MNB组(移植后肾-尿排泄腔(具有肾脏、输尿管和膀胱的移植用脏器)的组)1～4的实验概要的图。
[图4B]为说明实验例2中的MN组(仅移植后肾的组)1～4的实验概要的图。
[图5]为表示实验例2中的MN组及MNB组的移植后肾的利用Masson三色染色进行的组织学的分析结果的照片。
[图6A]为表示实验例2中的移植后肾病理所见的分析结果的图。
[图6B]为表示实验例2中的移植后肾病理所见的分析结果的图。
[图6C]为表示实验例2中的移植后肾病理所见的分析结果的图。
[图6D]为表示实验例2中的移植后肾病理所见的分析结果的图。
[图7A]为表示实验例2中的移植后肾的获得肾功能的分析结果的照片。
[图7B]为表示实验例2中的移植后肾的获得肾功能的分析结果的图。
[图7C]为表示实验例2中的移植后肾的获得肾功能的分析结果的图。
[图7D]为表示实验例2中的移植后肾的获得肾功能的分析结果的图。
[图8]A～I为表示实验例2中的MNB组的后肾的、从输尿管至膀胱移行部的连续切片的利用Masson三色染色进行的组织学的分析结果的照片。
[图9]A为表示实验例3中的造影CT的结果的照片。B为表示实验例3中的洞部位的肉眼所见的照片。
[图10]A～D为表示实验例3中的输尿管膀胱吻合部的组织学的分析结果的照片。
[图11A]为测定实验例3中的宿主大鼠的血清、从移植后肾排泄的CL膀胱中的尿(CL)及宿主的膀胱内的尿(BL)中的尿素氮浓度的结果。
[图11B]为测定实验例3中的宿主大鼠的血清、从移植后肾排泄的CL膀胱中的尿(CL)及宿主的膀胱内的尿(BL)中的肌酸酐浓度的结果。
[图12]A及B为表示实验例4的结果的照片。C～F为表示实验例5的结果的照片。
具体实施方式
例如，通过将人骨髓来源的间充质干细胞注入到发育中的大鼠胎仔的肾脏产生部位，从而可在胎仔内分化诱导为肾脏系谱，制造肾脏原基。通过在即将进入血管迷走期之前摘出该肾脏原基，并移植至例如大网膜内，从而可制作最终分化型的肾脏。需要说明的是，大网膜是从胃的下侧向下方如围裙般垂下的腹膜。肾脏原基的移植目的地不限于大网膜，例如，也可以是大动脉旁，也可以是腹腔内的其他的任意部位。
然而，发明者们发现，在将再生肾脏、异种后肾移植至机体并使其生长的情况下，即使能产生尿，也无法将产生的尿排泄而导致肾积水，无法长期持续肾功能。
另外，发明者们发现，为了防止肾积水，利用了输尿管的蠕动运动的持续的尿的排出(drainage)是必要的，从而完成了本发明。
[移植用脏器]
在一个实施方式中，本发明提供具有肾脏、输尿管和膀胱的移植用脏器。需要说明的是，本说明书中，术语“肾脏”包括后肾等肾脏原基。另外，术语“膀胱”包括尿排泄腔等膀胱原基。
如后文所述，即使仅移植肾脏，也会导致肾积水化及间质的纤维化。与此相对，若移植具有肾脏、输尿管和膀胱的脏器，则可抑制肾积水化及间质的纤维化。
认为这是因为，通过上述移植用脏器的输尿管进行蠕动运动，可使肾脏产生的尿移动至膀胱。以往，对仅移植再生肾脏的情况进行了研究，但通过将输尿管和膀胱与再生肾脏一起移植，从而能产生尿、进而能将产生的尿排泄。
上述的移植用脏器可以来源于与移植对象为不同种类的动物。例如，也可将来源于猪的移植用脏器移植至人、猫等。这是可移植的肾脏不足的现状下的选择之一。
需要说明的是，猫是作为宠物最常见的一种动物，但为慢性肾疾病的罹患率非常高的动物。例如，也报道了猫的死因中的约30％是慢性肾衰竭，50％以上的猫由于肾功能的低下而死亡或被实施安乐死。因此，作为延长罹患肾病的猫的寿命的技术之一，存在潜在的进行肾脏移植的需要。
本实施方式中，移植用脏器可以来源于与移植对象为不同种类的基因改造非人类动物。例如，移植用脏器可以来源于在移植至人、猫的情况下排异反应得以降低的基因改造猪。猪的脏器的大小适于向人等进行移植，基因改造技术也已被确立。
本实施方式中，移植至人的移植用脏器优选实质上由人细胞形成，最优选由患者本人的细胞形成。
此处所谓“实质上”，是指在利用动物的体内制造移植用脏器的情况下等，不排除混入人以外的细胞。换言之，移植用脏器优选90％以上由人细胞形成，更优选95％以上由人细胞形成，特别优选99％以上由人细胞形成。
此处，对移植用脏器的制作进行说明。例如，可通过将哺乳动物来源的间充质干细胞(MSCs)、iPS细胞等多能性干细胞来源的肾脏干细胞移植至妊娠哺乳动物宿主中的胎儿或从妊娠哺乳动物的宿主分离的胎儿并使其分化，而制作移植用脏器。
利用该方法，可制作向例如人、宠物例如猴、牛、绵羊、猪、山羊、马(尤其是赛马)、狗、猫、兔、仓鼠、土拨鼠、大鼠、小鼠等移植的移植用脏器。
作为上述宿主，例如，可举出牛、绵羊、猪、山羊、马等有蹄动物；小鼠；实施了转基因、基因敲除、基因敲入等基因改造的上述的动物等。
间充质干细胞或肾脏干细胞优选为来源于移植对象即受体的间充质干细胞或肾脏干细胞。例如，在受体为人的情况下，可举出从人骨髓、脂肪组织、流血中或脐带血中分取的间充质干细胞等。也可以是从受体本人的骨髓、流血中或脐带血中分取的间充质干细胞。分取法只要是常规的外科的医学方法即可。对于被分取了的细胞，选择最合适条件，优选进行细胞继代培养2～5代。另外，为了一边抑制间充质干细胞的转化一边持续进行培养，可使用Cambrex BioScience公司制的人间充质干细胞专用培养基试剂盒等进行培养。
根据期望，可利用腺病毒或逆转录病毒等向间充质干细胞或肾脏干细胞中导入所期望的基因。例如，为了辅助肾脏形成，可进行基因导入以表达胶质细胞源性神经营养因子(Glial cellline-derived neurotrophic factor-GDNF)。这是因为，这导致即将形成肾脏之前的间充质组织表达GDNF，通过引入表达作为其受体的c-ret的输尿管芽，从而完成肾脏产生的最初的重要的阶段。发明者们确认了通过该转化，使得注入干细胞来源的肾脏的形成率从5.0±4.2％提高至29.8±9.2％。
以下，以制作大鼠的移植用脏器的情况为例进行说明。将上述的间充质干细胞或肾脏干细胞移植至妊娠哺乳动物宿主中的胎儿。通过将间充质干细胞或肾脏干细胞直接移植至生物体内的胎儿，从而可在子宫内形成肾脏。作为移植的方法，可举出常规的外科的医学方法，例如，可在超声波下使用微量移液器等进行。移植的细胞量例如为0.5～1.0×103个。也可通过经子宫途径，直接将间充质干细胞移植至猪等大型的妊娠哺乳动物的生物体内的胚胎中，保持该状态使其在生物体内持续生长，生长成移植用肾脏。另外，也可追加如下所示的“全胚胎培养”或“器官培养”的工序。
可将制备的间充质干细胞或肾脏干细胞移植至从妊娠哺乳动物宿主(子宫)分离的胎儿，然后，利用全胚胎培养，在体外(in vitro)使所述间充质干细胞或肾脏干细胞在胎儿的体内成熟，直至完成移植用肾脏形成的初期阶段，然后，利用器官培养进一步进行培养。另外，也可将移植用肾脏移植至包括人在内的哺乳类的大网膜等。
制备的间充质干细胞或肾脏干细胞向胎儿移植的时机可适当调整。在使用了大鼠的实验中，优选胎生9～12天、例如10～12天、例如10～11.5天。对于作为大型的哺乳动物的猪等而言，也可合适地利用同样的阶段的胚胎。另外，通过对条件进行选择，也可使用上述阶段前后的阶段的胚胎。重要的是，至少在移植时机，宿主的免疫系统仍然是免疫耐受的阶段。
宿主免疫系统在全胚胎培养的上述阶段尚未充分成长。因此，对异种细胞具有耐受性。使用无免疫防御的异种宿主的内在的成长系统，从自身间充质干细胞产生自身器官。
通过使间充质干细胞或肾脏干细胞向胎儿移植的部位为与肾脏产生部位相当的部位，可合适地制作移植用脏器。因此，移植需要在能确定与肾脏产生部位相当的部位的时机进行，优选为肾脏的胚细胞开始发达之前的萌芽状态。例如，通过将间充质干细胞或肾脏干细胞移植至后肾形成间充质，从而能分化成系膜细胞、肾小管上皮细胞、肾小球上皮细胞，通过将间充质干细胞或肾脏干细胞移植至中段中胚层，从而能分化成输尿管芽来源的集合管及输尿管。
此处，对全胚胎培养进行说明。全胚胎培养在将间充质干细胞或肾脏干细胞移植至从妊娠哺乳动物宿主(子宫)分离的胎儿的情况下进行。将子宫从母体分离，从其中将胎儿从包括子宫壁、蜕膜、赖歇特膜的外膜层割离并取出，将间充质干细胞或肾脏干细胞移植至得到的胎儿，将其在培养瓶内等进行培养，由此可进行全胚胎培养。
更具体而言，例如，使用立体显微镜等，在麻醉下从母体摘出子宫。将胎生9～12天、例如10～12天、例如10～11.5天、例如11.5天的大鼠胚胎从包括子宫壁、蜕膜、赖歇特膜的外膜层割离。进而，为了能注入间充质干细胞或肾脏干细胞，打开卵黄囊及羊膜，但将绒膜尿囊胎盘原样保留。在向经离心分离的大鼠血清中添加3mL培养基(葡萄糖、青霉素G、链霉素及两性霉素B)所得的培养瓶内等，培养已确认间充质干细胞或肾脏干细胞注入成功的胚胎。
例如，使用培养箱(incubator)(型号“RKI10-0310”，Ikemoto公司)等，使培养瓶旋转。培养时间可以是例如12小时～60小时、例如24小时～48小时、例如48小时。培养一定时间后，进行形态、功能性评价，确认移植用肾脏的器官原基。也可将器官原基从胎儿分离，进行以下的器官培养。
接着，对器官培养进行说明。将上述器官原基置于过滤器上，在其下方的培养皿中添加DMEM等培养基。而后，将该培养皿在5％CO2培养箱中进行培养。培养时间可以是例如12小时～168小时、例如18小时～72小时、例如24小时～48小时、例如24小时。例如，可在约24小时的时间点，向大网膜移植。培养温度可以是例如20～45℃、例如25～40℃、例如37℃。
接着，对接续培养(relay culture)进行说明。所谓接续培养，是指进行2小时～60小时上述全胚胎培养，然后进行12小时～168小时上述器官培养。此外，可在器官培养后移植至动物的大网膜等。
使器官的大小与宿主动物本来所具有的器官相同。因此，例如，为了形成人的能发挥充分的功能的肾脏，宿主优选为具有与人的脏器近似的大小的哺乳动物。但是，不需要具有完全相同的大小，如果是肾脏，则只要具有整体的十分之一的功能，即可进行充分透析，能足以维持生命。从该理由判断，最合适的宿主是猪，小型猪的脏器的大小就足够了。需要说明的是，在猪的情况下，难以进行上述的全胚胎培养，因此，通过子宫内操作而向胎仔的肾脏产生部位注入间充质干细胞或肾脏干细胞，制作移植用脏器。
对于按照上述方式制作的移植用脏器，在进行了功能确认后，从宿主割离，将其供于受体。移植后的移植用脏器继续进行生物体内成长，完成发挥肾脏功能的克隆肾脏的形成。
移植用肾脏向包括人在内的哺乳类的大网膜、大动脉旁等的移植可利用通常的外科的方法等进行。例如，可举出：用锐利的镊子夹捏移植的组织，用镊子尖在大网膜的脂肪组织的表面轻微地制成切口，将组织埋入其中的方法，等等。另外，也可利用内窥镜移植至大网膜、大动脉旁等。
在形成的肾脏内，间充质干细胞或肾脏干细胞来源的细胞和宿主动物来源的细胞混合存在。在将肾脏移植至受体时，混合存在的宿主来源细胞可能引起免疫排斥反应。因此，在肾脏形成后，需要彻底去除宿主来源细胞。
为了不在形成的肾脏中混入宿主来源的抗原性物质，例如，可举出制作可调节性地诱导程序性细胞死亡的宿主动物，将该动物作为宿主而制作肾脏的方法，等等。将间充质干细胞或肾脏干细胞移植至该宿主动物胚胎的该部位，制作肾脏后，特异性地诱导宿主细胞的细胞死亡，由此，可在移植至受体之前的阶段完全地将宿主来源细胞去除。
理论上，例如，通过使由患者本人的细胞制作的iPS细胞等分化，制备间充质干细胞、肾脏干细胞，并其应用于上述方法，由此，可制作来源于患者本人的细胞的再生肾脏。
[脏器结构体]
在一个实施方式中，本发明提供依次连接有肾脏、第1输尿管、第1膀胱、第2输尿管和第2膀胱的脏器结构体。
图1为说明本实施方式的脏器结构体的图。如图1所示，将具有肾脏110、第1输尿管120和第1膀胱130的移植用脏器移植至宿主后，在体内(in vivo)生长，逐渐会产生尿。此处，如图1及后述的实验例所示那样，若将移植用脏器的膀胱130(第1膀胱)与同宿主(host)的膀胱150(第2膀胱)连接的宿主的输尿管140(第2输尿管)连接，则可使所移植的肾脏110所产生的尿移动至宿主的膀胱150。即，通过本脏器结构体，可使所移植的再生肾脏所产生的尿排泄。认为这是由第1输尿管120及第2输尿管140的蠕动运动所导致的。
移植用脏器可移植至例如宿主的大网膜、大动脉旁，也可移植至例如宿主的脾脏(脾动脉的周边)。
本实施方式的脏器结构体中，肾脏、第1输尿管及第1膀胱与上述的移植用脏器对应。肾脏、第1输尿管及第1膀胱(移植用脏器)所来自的动物可以与第2输尿管及第2膀胱所来自的动物(宿主、移植对象)为不同种类。例如，也可将猪来源的移植用脏器移植至人、猫等，形成脏器结构体。这是可移植的肾脏不足的现状下的选择之一。
本实施方式的脏器结构体中，肾脏、第1输尿管及第1膀胱可以来源于与移植对象为不同种类的基因改造非人类动物。例如，肾脏、第1输尿管及第1膀胱可以来源于在移植至人、猫的情况下排异反应得以降低的基因改造猪。
本实施方式的脏器结构体中，肾脏、第1输尿管及第1膀胱优选实质上由人细胞形成，最优选由患者本人的细胞形成。此处所谓“实质上”，与上文中含义相同。
肾脏、第1输尿管及第1膀胱例如可通过向基因改造猪的胎仔注入人的干细胞而制作。另外，第2输尿管及第2膀胱所来自的动物例如可以是人，例如可以是猫。
[治疗方法]
在一个实施方式中，本发明提供一种肾脏的移植方法，所述方法具有下述工序：工序(a)，将具有肾脏、输尿管及膀胱的移植用脏器移植至患者或患畜的体内；工序(b)，在移植后规定期间后，将上述移植用脏器的膀胱与患者或患畜的输尿管连接。作为患者或患畜，可举出例如人、猫。
本实施方式的方法也可以说是肾疾病的治疗方法。作为移植用脏器，可使用上述的脏器。
通过将在上述工序(a)中移植的移植用脏器放置规定期间，从而使移植用脏器生长，开始产生尿。规定期间只要是使移植用脏器充分生长、并且发生肾积水之前的期间即可。规定期间可根据患者或患畜的症状等适当调整，例如可以是1～10周。
接着，在移植后规定期间后实施工序(b)。在工序(b)中，将移植用脏器的膀胱与患者或患畜的输尿管连接。此处，患者或患畜的输尿管与患者或患畜的膀胱连接。
通过用患者或患畜的输尿管将移植用脏器的膀胱与患者或患畜的膀胱连接，从而能使移植用脏器所产生的尿向患者或患畜的膀胱排泄。更详细而言，移植用脏器的肾脏所产生的尿通过移植用脏器的输尿管被排泄至移植用脏器的膀胱，接下来，从移植用脏器的膀胱通过患者或患畜的输尿管被排泄至患者或患畜的膀胱。
通过本实施方式的方法，能将移植用脏器的肾脏所产生的尿向患者或患畜的膀胱排泄。
实施例
接着，示出实验例更详细地说明本发明，但本发明不限于以下的实验例。
[实验例1]
(向猪进行的肾脏移植及移植肾脏的分析)
使用体细胞克隆技术制作克隆猪。接着，摘出胎生第30天的克隆猪的胎仔，在显微镜下，摘出猪后肾(以下，有时称为“MN(metanephroi)”。)。图2A为胎生第30天的克隆猪的胎仔的照片。图2B为摘出的猪后肾的照片。接着，将摘出的后肾移植至同系猪的大网膜。图2C为表示移植的情形的照片。向后肾的大网膜移植3周后、5周后及8周后，在异氟烷麻醉下将猪处死，摘出移植的后肾并进行分析。
图3A～L为移植的后肾的照片。如图3A、B所示，移植的后肾发育良好，在移植后3周，生长至长径为5～7mm左右。另外，如图3C、D所示，根据利用Masson三色染色进行的组织学分析，确认了形成了肾小球、肾小管结构。
另外，如图3E、F所示，在移植后5周，后肾的长径超过10mm，也确认了输尿管的发育及输尿管内的尿的贮留。另外，还确认了宿主猪的血管向移植后肾的侵入。另外，如图3G、H所示，在组织学上与第3周同样地，维持了肾小球、肾小管等肾组织结构，但确认了间质的出血、淤血。
另外，如图3I所示，在移植后8周，后肾的发育进一步进行，生长至长径约为4cm，但即使肉眼也可观察到肾实质薄，肾积水化。另外，如图3J所示，确认了后肾输尿管的扩张。另外，如图3K所示，在组织学上也确认了后肾皮质变薄，间质的纤维化的进行。然而，如图3L所示，移植后肾的输尿管上皮基本保持不变。
根据以上的结果，认为虽然能使克隆猪的后肾巨大化，但为了使后肾的发育持续，必须构建后肾所产生的尿的排泄通路。
[实验例2]
(向大鼠进行的肾脏移植及移植肾脏的分析)
图4A及图4B为说明实验概要的图。作为移植肾脏的宿主大鼠，使用了10周龄的Lewis大鼠(三協ラボサービス公司或日本クレア公司)。
将图4A中照片所示的从胎生第15天的大鼠胎仔摘出的带有膀胱的后肾、即具有肾脏、输尿管及膀胱的脏器(以下，有时称为“CL(Cloaca)”。)移植至如图4A所示那样进行了分组的MNB组1～4的大鼠的主动脉旁区域。
另外，在切断输尿管后，将图4B中照片所示的从胎生第15天的胎仔摘出的膀胱及后肾移植至图4B所示那样进行了分组的MN组1～4的大鼠的主动脉旁区域。
接着，在移植后10天后(组1)、14天后(组2)、21天后(组3)、28天后(组4)，将MNB组及MN组的大鼠处死，摘出移植的脏器并进行分析。
图5、图6A～D及图7A～D为分析结果的图。图5为表示MN组及MNB组的移植后肾的利用Masson三色染色进行的组织学的分析结果的照片。图中的黑线为400μm。MN组中，随着发育的进行，确认了肾小管的扩张。另外，移植后4周的肾小球数少。
图6A～D及图7A～D为表示移植物重量、肾小管的扩张的比例、纤维化区域的比例、肾小球数、尿容量、肌酸酐量、尿素氮量的测定结果的图或照片。测定结果用平均值±标准偏差形式表示。统计学的分析使用软件(商品名“GraphPad Prism 5”，GraphPad Software公司)进行。2标本的平均值的差的显著性利用独立t检验确定。包括3组以上的多重比较利用ANOVA进行分析。
如图6A所示，MNB组及MN组的移植物重量从移植后2周至3周增加，从移植后3周至4周大致达到顶点。另外，在MNB组和MN组之间，未发现发育重量存在显著差异。
然而，如图6B所示那样，对于MN组，从移植后3周开始确认到肾小管的扩张(P＜0.05)，在移植后第4周，确认到进一步恶化(P＜0.0005)。与此相对，对于MNB组，未发现肾小管的扩张进行，在移植后4周，MN组与MNB组相比，肾小管显著扩张(P＜0.0001)，如图6C所示，间质的纤维化也进行(P＜0.0005)。需要说明的是，肾小管的扩张的比例及间质的纤维化的比例使用软件(商品名“MetaVue”，モデキュラーデバイス公司)定量。
另外，如图6D所示，移植后4周的后肾的单位面积的肾小球数在MNB组中显著增加(P＜0.05)。
另外，如图7A、图7B所示，对于MNB组，从移植后3周开始尿在后肾膀胱内蓄积，移植后4周的膀胱内的蓄积尿量与MN组相比，显著增加(P＜0.05)。此外，如图7C所示，尿中的肌酸酐排泄量在MNB组中显著增加(P＜0.05)，如图7D所示，尿中的尿素氮排泄量在MNB组中显著增加(P＜0.05)。
由以上的结果表明，带有膀胱的后肾移植进一步抑制随着移植后肾的发育而引起的肾积水化及间质的纤维化，从这方面考虑，比仅后肾的移植优异。
图8A～I为表示MNB组的后肾的从输尿管至膀胱移行部的连续切片的利用Masson三色染色进行的组织学的分析结果的照片。图中，BL表示CL膀胱，U表示CL输尿管，M表示后肾。由该结果表明，MNB组的移植后肾的从输尿管至膀胱移行部充分发育。
认为MNB组与MN组的移植后肾的发育的差异由输尿管及膀胱的功能导致。
[实验例3]
(大鼠的尿排泄通路的构建)
从胎生第15天的大鼠胎仔，摘出带有膀胱的后肾、即具有肾脏、输尿管及膀胱的脏器(CL)，移植至大鼠的主动脉旁区域。接着，在移植4周后，将宿主大鼠的左肾摘出，进行在显微镜下使移植的后肾的膀胱(CL膀胱)与宿主大鼠的左输尿管吻合的手术。
在手术后3～4周后开腹，切开与CL膀胱吻合的宿主输尿管，结果，确认了由发育的后肾产生的尿通过宿主输尿管持续地被排泄。
利用使用了进行了同样的处理的其他大鼠的造影CT(计算机断层摄影)，分析尿的排泄。图9A为表示造影CT的结果的照片。图中，M表示移植后肾，BL表示CL膀胱。利用造影CT进行经静脉的尿路造影，结果，在给予造影剂(オムニパーク，第一三共公司)后10分钟，确认了造影剂在移植后肾的膀胱(CL膀胱)内蓄积。另外，确认了随着时间经过，造影剂从宿主的输尿管向宿主的膀胱排泄。
图9B为表示洞部位的肉眼所见的照片。M表示移植后肾，BL表示CL膀胱，U表示宿主输尿管。
图10A～D为表示输尿管膀胱吻合部的组织学的分析结果的照片。如图10A、B所示，在利用了苏木精-伊红(HE)染色的输尿管膀胱吻合部的组织学的研究中，输尿管膀胱吻合部充分开口。图中，U表示宿主输尿管，AN表示输尿管膀胱吻合部，BL表示CL膀胱，T表示缝合线。
另外，如图10C所示，用山羊抗UPKIII多克隆抗体(sc-15182，サンタクルーズバイオテクノロジー公司)进行尿路移行上皮细胞的免疫染色，结果，确认了移行上皮彼此能吻合。由以上的结果确认了宿主输尿管与后肾膀胱(CL膀胱)可靠地吻合。
另外，如图10D所示，处死时，虽然从后肾移植开始经过了7～8周，但移植后肾中，肾小球、肾小管等肾脏结构被保持。图中，GI表示肾小球，Tu表示肾小管。
图11A为测定了宿主大鼠的血清、从移植后肾排泄的CL膀胱中的尿(CL)及宿主的膀胱内的尿(BL)中的尿素氮浓度的结果。
另外，图11B为测定了宿主大鼠的血清、从移植后肾排泄的CL膀胱中的尿(CL)及宿主的膀胱内的尿(BL)中的肌酸酐浓度的结果。
结果，CL膀胱中的尿与宿主大鼠的血清中的尿素氮浓度、肌酸酐浓度相比已被浓缩，明确了移植后肾具有过滤宿主大鼠的血液并产生尿这样的肾脏的功能。
由以上的结果表明，通过使用将具有肾脏、输尿管及膀胱的移植用脏器的膀胱、与宿主的输尿管连接的系统(以下，有时称为“Step-wise peristalic ureter(SPWU)system”。)，从而能将移植后肾所产生的尿通过宿主输尿管持续地排泄至宿主膀胱内，可进行此前存在困难的再生肾脏的尿排泄通路的构建。
[实验例4]
(向猪进行的带有膀胱的肾脏移植及移植肾脏的分析)
从胎生第30天的猪胎仔，摘出带有膀胱的后肾、即具有肾脏、输尿管及膀胱的脏器(CL)，移植至同系猪的大网膜。如图12A所示，移植的带有膀胱的后肾与大鼠的实验同样，顺利发育，在移植后3周产生尿。另外，如图12B所示，在移植后5周，进一步巨大化。确认了在CL膀胱内蓄积的尿的尿素氮及肌酸酐被浓缩。
[实验例5]
(猪的尿排泄通路的构建)
使用克隆猪，进行基于SPWU system的尿排泄通路的构建。从胎生第30天的猪胎仔摘出带有膀胱的后肾、即具有肾脏、输尿管及膀胱的脏器(CL)，移植至同系猪的主动脉旁及脾动脉周边。
如图12C所示，在移植后4周，后肾发育至不足3cm，确认了尿在CL膀胱内蓄积。
接着，如图12D所示，摘出宿主猪的左肾，使CL膀胱与宿主输尿管吻合。在吻合后2周处死，对由输尿管吻合有无导致的后肾发育的差异进行研究。
图12E为表示与宿主输尿管吻合的CL的后肾的组织学分析结果的照片。另外，图12F为表示未进行输尿管吻合的CL的后肾的组织学的分析的结果的照片。确认了与宿主输尿管吻合的CL的后肾的间质的出血、肾小管的扩张少，肾小管结构被保持。
由以上的结果表明，使用了克隆猪的基于SPWU system的尿排泄通路的构建在确保再生肾脏的巨大化及尿排泄通路方面是有用的。
产业上的可利用性
通过本发明，可提供不仅能产生尿、而且能将产生的尿排泄的移植用脏器。另外，可提供不仅能产生尿、而且能将产生的尿排泄的脏器结构体。
附图标记说明
110…肾脏、120…第1输尿管、130…第1膀胱、140…第2输尿管、150…第2膀胱。
Claims (14)
1.一种移植用脏器，其具有肾脏、输尿管和膀胱。
2.根据权利要求1所述的移植用脏器，其来自与移植对象为不同种类的动物。
3.根据权利要求2所述的移植用脏器，其中，前述动物为基因改造非人类动物。
4.根据权利要求2或3所述的移植用脏器，其中，前述动物为猪。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的移植用脏器，其实质上由人细胞形成。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的移植用脏器，其用于向人移植。
7.根据权利要求1～5中任一项所述的移植用脏器，其用于向猫移植。
8.一种脏器结构体，其中，依次连接有肾脏、第1输尿管、第1膀胱、第2输尿管和第2膀胱。
9.根据权利要求8所述的脏器结构体，其中，前述肾脏、前述第1输尿管及前述第1膀胱所来自的动物与前述第2输尿管及前述第2膀胱所来自的动物为不同种类。
10.根据权利要求8或9所述的脏器结构体，其中，前述肾脏、前述第1输尿管及前述第1膀胱所来自的动物为基因改造非人类动物。
11.根据权利要求8～10中任一项所述的脏器结构体，其中，前述肾脏、前述第1输尿管及前述第1膀胱所来自的动物为猪。
12.根据权利要求8～11中任一项所述的脏器结构体，其中，前述肾脏、前述第1输尿管及前述第1膀胱实质上由人细胞形成。
13.根据权利要求8～12中任一项所述的脏器结构体，其中，前述第2输尿管及第2膀胱所来自的动物为人。
14.根据权利要求8～12中任一项所述的脏器结构体，其中，前述第2输尿管及第2膀胱所来自的动物为猫。
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